MX2011001900A

MX2011001900A - Metodo para controlar metastasis de cancer o migracion de celulas de cancer modulando el nivel celular de lisil-tarn sintetasa.

Info

Publication number: MX2011001900A
Application number: MX2011001900A
Authority: MX
Inventors: Sunghoon Kim; Jin Woo Choi
Original assignee: Seoul Nat Univ Ind Foundation
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2011-08-17
Also published as: US20170108489A1; JP5628807B2; BRPI0823016A2; EP2334791A1; KR20110046521A; EP2334791B1; US20110189195A1; CA2734892A1; EP2334791A4; AU2008360729A1; US10139394B2; WO2010021415A1; CN102124104A; JP2012500256A; US9511085B2; KR101453141B1

Abstract

La presente invención se refiere a una función novedosa de lisil-tARN sintetasa (KRS) que incrementa la migración de células tumorales y afecta la metástasis de cáncer vía interacción de KRS con receptor de laminina (671R) por su traslocación a la membrana. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para modular metástasis o migración de cáncer, que comprende regular los niveles intracelulares de KRS; una composición para prevenir o tratar cáncer; uso de vector de expresión para inhibir la expresión de KRS; un método para prevenir o tratar cáncer, uso de un agente para inhibir una actividad de KRS; un método para tamizar un agente que modula metástasis o migración de cáncer; y un método para tamizar un agente que inhibe la interacción de KRS con 67RL, mediante dicha función novedosa. Este KRS puede modular metástasis o migración de cáncer y además, puede modular el metabolismo intracelular relacionado con 67LR. La interacción entre KRS y 67LR puede usarse efectivamente para tratar, prevenir y/o diagnosticar varias enfermedades o trastornos relacionados con la interacción.

Description

METODO PARA CONTROLAR METASTASIS DE CANCER O MIGRACION DE CÉLULAS DE CÁNCER MODULANDO EL NIVEL CELULAR DE LISIL-tARN SINTETASA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una función novedosa de lisil tARN sintetasa. Más específicamente, se refiere a un método para controlar la metástasis del cáncer o migración de células cancerosas mediante la modulación de un nivel celular de lisil tARN sintetasa, uso de un vector de expresión que comprende una construcción de expresión de KRS inhibición para prevenir o tratar el cáncer, el uso de un agente inhibidor actividad de KRS para prevenir o tratar el cáncer, un método para la detección de un agente que modula la metástasis del cáncer o migración de las células de cáncer, un método para la detección de un agente inhibidor de una interacción entre KRS y 67LR.

TÉCNICA ANTERIOR Un tumor se desarrolla por proliferación de células anormales desordenado incontrolable. Sobre todo, si este tumor muestra un crecimiento destructivo, invasividad y metástasis, que es considerado como un cáncer maligno. La invasividad es una característica para infiltrar o destruir los tejidos circundantes, y en particular, una capa basal que forma un limite de los tejidos es destruida por la caracteristica, lo que da como resultado la propagación local y, a veces influjo de un tumor a través del sistema circulatorio. Metástasis significa la difusión de células tumorales en el lugar de nacimiento original a otras áreas a través de los vasos linfáticos o sangre. En un sentido amplio, la metástasis también significa la concesión directa de las células tumorales a través de la cavidad del cuerpo seroso u otro espacio.

En la actualidad, la operación quirúrgica radioterapia y quimioterapia se utilizan ampliamente para el tratamiento del cáncer por separado o conjuntamente. La intervención quirúrgica es una manera de remover los tejidos enfermos. Asi, los tumores en regiones especificas tal como el de mama, colon y piel se puede remover con eficacia por la intervención quirúrgica. Sin embargo, un tumor en la vértebra o un tumor de dispersión como la leucemia, no puede ser tratado adecuadamente por la operación quirúrgica.

La quimioterapia bloquea la replicación celular o el metabolismo y se ha utilizado para el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer testicular. Aunque, los pacientes con cáncer que han recibido tratamiento de quimioterapia han sufrido gravemente los efectos secundarios de la quimioterapia sistémica. Los mareos y vómito son ejemplos comunes pero graves de todos. Los efectos secundarios de la quimioterapia pueden incluso afectar la vida de un paciente, ya que podría disminuir la capacidad de adaptación de un paciente con rapidez. Además, DLT (toxicidad limitante de dosis) es también uno de los principales efectos secundarios de la quimioterapia, que produce una especial atención en la administración de un medicamento. La mucositis es un ejemplo de DLT contra los agentes anticancerígenos como 5-fluorouracilo, que es un agente citotóxico antimetabólico, y metotrexato, así como antibióticos contra el cáncer, tal como doxorrubicina . Si un paciente sufre gravemente de los efectos secundarios de la quimioterapia, deberá ser hospitalizado y se le deberá administrar calmante para reducir el dolor. Así, los efectos secundarios de quimioterapia y radioterapia son el mayor problema para el tratamiento de pacientes con cáncer.

La terapia de genes es un método para tratar o prevenir las enfermedades causadas por variación genética en las células humanas, por ejemplo, diversos trastornos genéticos, cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes, tomando ventaja de la técnica de recombinación del ADN, es decir, un gen terapéutico se inserta en un paciente para corregir defectos genéticos o promover o agregar funciones de las células. Más precisamente, la terapia de genes trata una enfermedad mediante el envío de un gen terapéutico a un órgano blanco con el fin de inducir la expresión de la proteina terapéutica o normal en las células dañadas. La terapia de genes tiene ventajas tales como excelente especificidad y mejor régimen de recuperación y velocidad, que es difícil que sean regulados por otro medicamento, lo cual permite la administración a largo plazo. La terapia de genes no es para tratar los síntomas de una enfermedad, sino para curar o eliminar la causa de la enfermedad. Para el éxito de la terapia, es importante ofrecer un gen terapéutico a una célula blanco con el fin de mejorar su tasa de expresión, que es una técnica esencial en la terapia de genes .

Un portador del gen es un mediador necesario para la inserción de un gen terapéutico a una célula blanco. Un portador del gen ideal tiene que ser no perjudicial para el consumo humano, producido en masa, tiene que llevar a un gen a una célula blanco de manera eficiente y ha de expresar el gen de forma continua. La preparación de un portador del gen es una técnica fundamental en la terapia de genes. La mayoría de los portadores del gen representante ampliamente utilizado actualmente para la terapia de genes son portadores virales como adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y los transportadores no virales como liposoma, polietilenamina, Dado que las estrategias de terapia de genes para el control de las células tumorales, se han utilizado métodos para usar un gen supresor de tumores, usando un virus oncolítico competente de replicacion, utilizando un gen suicida y el uso de un gen inmunomodulador, etc.. El método de uso de un gen supresor de tumor es para el tratamiento del cáncer mediante el suministro de un gen supresor de tumores tal como p53 en un paciente concreto, donde el gen es defectuoso o deforme. Además, el método de usar un virus oncolitico competente de replicacion es para tratar el cáncer mediante la explotación de la actividad dañada del gen supresor de tumores en los tejidos tumorales mediante la transferencia de un portador del gen viral que puede estar creciendo especialmente en las células tumorales a un cuerpo humano. Estos dos métodos son las estrategias para eliminar directamente las células del tumor. Alternativamente, el método de uso de un gen suicida está incluido en esta categoría. Un ejemplo representativo de una terapia de genes suicida es para tratar la enfermedad mediante el suministro de un gen HSV-TK y agentes químicos contra el cáncer, tales como el ganciclovir, que puede inducir la muerte de las células tumorales. Por el contrario, el método para introducir un gen inmunorregulador es un tipo de estrategia de tratamiento indirecto, que lleva uno o varios de los genes, tales como la interleucina 12, interleucina 4, interleucina 7, el interferón gamma y factor de necrosis tumoral, etc., en un cuerpo vivo para provocar las células T para reconocer las células tumorales o inducir apoptosis mediante el bloqueo de una proteina del tumor en desarrollo. Por otro lado, el método para matar las células tumorales al impedir el suministro de nutrientes al expresar factores inhibidores de la angiogénesis como angiostatina o endostatina, etc., también se incluye en la categoría de estrategias de tratamiento indirecto.

La propagación metastásica es una determinante critico de la letalidad del cáncer. Los receptores de laminina 67kDa (67LR) es receptor de tipo sin integrina incrustado en la membrana plasmática y se asocia con la invasión y metástasis del cáncer (Nelson, J. y otros The 67 kDA laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR se genera a partir de la dimerizacion de su precursor 37kDa (37LRP) , aunque los detalles moleculares de este proceso de conversión no se entienden. 37LRP es idéntico a la subunidad ribosomal p40 que participa en la formación de polisomas (Auth, D. & Brawerman, G. A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor: component of translation machinery. Proc Nati Acad Sci USA 89, 4368-4372 (1992)). 67LR se observa a menudo a un alto nivel en una variedad de cánceres (Nelson, J. y otros The 61 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S., Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel, M. E. New insights into the metastasis-associated 67 kD laminin receptor. J. Cell. Biochem. 67, 155-165 (1997)). Sin embargo, el regulador y el mecanismo molecular de la residencia de la membrana de 67LR no se han determinado todavía. En este trabajo, los presentes inventores encontraron que lisil-tRNA-sintetasa (KRS) aumenta la migración celular y metástasis del cáncer mediante la estabilización de 67LR en la membrana plasmática.

KRS pertenece al aminoacil-tRNA sintetasa (ARS) que liga sus ácidos aminados afines tARN para la síntesis de proteínas. Estas enzimas muestran funciones pleyotrópicas antiguas, además de sus actividades catalíticas (Park, S. G., Ewalt, K. L. & Kim, S. Functional expansión of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers . Trends Biochem. Sci. 30, 569-574 (2005)). Además, varios ARS de mamíferos incluyendo KRS forman un complejo macromolecular (Lee, S. W. , Cho, B. H., Park, S. G. & Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell. Sci. 111, 3725-3734 (2004); Han, J. M . , Kim, J. Y. & Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 985-993 (2003)), que sirven como reservorio molecular (Ray, P. S., Arif, A. & Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)), para controlar múltiples funciones de las proteínas de los componentes. Los KRS humanos contienen una extensión única N-terminal que participan en las interacciones con el ARN y otras proteínas (Rho, S. B. y otros Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex. Proc . Nati. Sci. Acad. USA 96, 4488-4493 (1999); Francin, M . , Kaminska, M . , Kerjan, P. & Mirande. M. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol. Chem. 277, 1762-1769 (2002) ) .

DESCRIPCIÓN PROBLEMA TÉCNICO Para determinar la importancia de este péptido en relación con la versatilidad funcional de KRS humanos, los inventores actuales aislaron el péptido N-terminal de 116 aa de KRS humanos y lo usaron como cebo para la proyección de sus proteínas de unión de la biblioteca de células de cADN HeLa utilizando el sistema de dos híbridos de levadura. A partir del tamizado,- los inventores de la presente identificaron 37LRP/p40 como una de las proteínas de unión potenciales e investigaron la implicación funcional de la interacción entre KRS y receptor de laminina en este trabajo. Para determinar la importancia de este péptido en relación con la versatilidad funcional de KRS humanos, los inventores actuales aislaron el péptido 116 aa N-terminal de los aminoácidos de KRS humanos y los utilizó como cebo para la proyección de sus proteínas de unión de la biblioteca de cADN de células HeLa utilizando el sistema de dos híbridos de levadura. A partir del tamizado, los presentes inventores identificaron 37LRP/p40 como una de las proteínas de unión potencial e investigaron la implicación funcional de la interacción entre KRS y receptor de laminina en este trabajo.

Como resultado, los inventores de la presente revelaron que lisil-t-RNA-sintetasa (KRS) aumenta la migración celular y metástasis tumoral para estabilizador 67LR en la membrana plasmática lo cual tiene un efecto sobre la metástasis del cáncer o migración de las células del cáncer a través de un receptor de laminina en la membrana del plasma, completando así la presente invención.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo uso de lisil-t-RNA-sintetasa con respecto a metástasis del cáncer o migración de células cancerosas .

Para lograr el objetivo anterior, la presente invención proporciona un método para controlar la metástasis del cáncer mediante la modulación a nivel celular de lisil tARN sintetasa.

Para lograr otro objetivo, la presente invención proporciona un método para controlar la migración de células cancerosas mediante la modulación a nivel celular de lisil tARN sintetasa.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona una composición para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleotido operativamente vinculados al mismo, o un anticuerpo contra KRS como un ingrediente eficaz, en donde el polinucleotido es la codificación o ARN en contrasentido del siARN contra el polinucleotido de KRS.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona un método para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleotido operativamente vinculados al mismo, o un anticuerpo contra el KRS, en donde el polinucleotido codificado ARN de contrasentido del siARN contra el polinucleotido de KRS.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona un uso de un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleotido operativamente vinculados al mismo, o un anticuerpo contra KRS para la preparación de un agente anti-cancerigeno, en donde el polinucleótido codifica ARN en contrasentido del siARN contra el polinucleótido de KRS.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona una composición para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende una actividad de un agente que inhibe KRS como un ingrediente activo.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona un método para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un agente que inhibe la actividad de KRS.

Para lograr aún otro objetivo, la presente invención proporciona el uso de un agente que inhibe KRS para la preparación de un agente terapéutico del cáncer.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tamizar un agente que modula la metástasis de cáncer o migración de células cancerosas que comprende: (a) ponerse en contacto con un agente de la prueba con KRS en presencia del agente de prueba; (b) medir la actividad de KRS y la selección de un agente de las pruebas que cambia la actividad de KRS, y (c) comprobar si el agente seleccionado regula o no la metástasis del tumor o la migración de células cancerosas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la detección de un agente inhibidor de una interacción entre KRS 67LR y que comprende: (a) ponerse en contacto con un agente de prueba con KRS y el receptor de laminina (67LR) en presencia del agente de análisis, y (b) comprobar si el agente seleccionado regula la interacción entre KRS y el receptor de la laminina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón o cáncer de mama que comprende : (a) analizar la sobreexpresión de 67LR en una muestra, y (b) analizar la sobreexpresión de KRS en la muestra sobre-expresada de 67LR.

Solución técnica En lo sucesivo, la presente invención se describe en detalle.

En la presente invención, los presentes inventores identificaron por primera vez que KRS tiene un efecto sobre la metástasis del cáncer o migración de células cancerosas. Es decir, el inventor identificó que KRS tiene un efecto sobre la metástasis del cáncer o migración de las células del cáncer a través de un receptor de laminina en la membrana plasmática .

Definición A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton y otros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. Además, las definiciones siguientes se proporcionan para ayudar al lector a la práctica de la invención.

Una "expresión", como se usa en la presente, se refiere a la formación de proteínas o ácidos nucléicps en las células .

Una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere a una célula procariota o eucariota que contiene ADN heterólogo que se ha introducido en la célula por cualquier medio, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección, transformación, infección viral y/o similares.

El término "aislado" significa que el material se extrae de su entorno original (por ejemplo, medio ambiente natural si está presente en la naturaleza) . Por ejemplo, un ácido nucléico presente en la naturaleza, polipéptido, o células presentes en un animal vivo, no están aislados, pero el mismo polinucleótido, polipéptido, o célula separada de todos o algunos de los materiales que coexisten en el sistema natural, se encuentran aislados, aunque posteriormente son reintroducidos en el sistema natural. Tales ácidos nucléicos pueden ser parte de un vector y/o dichos ácidos nucléicos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún así estar aislados en este vector o composición que no es parte de su entorno natural.

El término "modulación" con respecto a bioactividades de KRS se refiere a un cambio en el nivel celular de KRS. La modulación de bioactividades de KRS puede ser sobre regulación (por ejemplo, activación o estimulación) o regulación descendente (es decir, inhibición o supresión) . Por ejemplo, la modulación puede provocar un cambio en el nivel celular de KRS, estabilidad de la proteína, modificación enzimática (por ejemplo, la fosforilación) de KRS, las características de unión (por ejemplo, la unión a un elemento regulador de la transcripción de destino) , o cualquier otro agente biológico funcional, o propiedades inmunológicas de KRS. El cambio en la actividad puede surgir, por ejemplo, de un aumento o disminución en la expresión del gen de KRS, estabilidad del ARNm que codifica la proteina KRS, eficacia de traducción, o de un cambio en bioactividades diferentes del factor de transcripción de KRS (por ejemplo, regulación de la expresión de un gen responde a KRS) . El modo de acción de un modulador de KRS puede ser directo, por ejemplo, a través de la unión a la proteina de KRS o a los genes que codifican la proteina de KRS. El cambio también puede ser indirecto, por ejemplo, a través de la unión y/o modificación (por ejemplo, por vía enzimática) otra molécula que de otro modo modula de KRS (por ejemplo, una quinasa que fosforila específicamente KRS) .

El término "polipéptido" se utiliza indistintamente en este documento con los términos "polipéptidos" y "proteina (s)", y se refiere a un polímero de aminoácidos, por ejemplo, como típicamente se encuentran en las proteínas en la naturaleza .

El término "polipéptido de KRS," se refiere a un polipéptido llamado tARN lisil sintetasa. Dicho polipéptido de KRS puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 (GenBank Acceso no: NP_005539.1 ) . Y la KRS de la invención incluye equivalentes funcionales de los mismos.

El término "equivalente funcional" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de homología de secuencia de aminoácidos (es decir, identidad) , de preferencia al menos el 80%, y preferiblemente por lo menos el 90%, por ejemplo, 70%, 71 %, 72%, 73%, 741, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100% de homología de secuencia de aminoácidos, que presentan actividad fisiológica sustancialmente idéntica al polipéptido de SEC ID NO: 1. La "actividad fisiológica sustancialmente idéntica" significa la interacción con el receptor de la laminina de la membrana plasmática y la regulación de metástasis del tumor o la migración de células tumorales. Los equivalentes funcionales pueden incluir, por ejemplo péptidos producidos por como resultado de la adición, sustitución o supresión de algunos aminoácidos de la SEC ID NO: 1. Las sustituciones de los aminoácidos son sustituciones preferiblemente conservadoras. Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales son los siguientes: los aminoácidos alifáticos (Gly, Ala, Pro), aminoácidos hidrofóbicos (lie, Leu, Val), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) , aminoácidos ácidos (Asp, Glu) , aminoácidos básicos (His, Lys, Arg, Gln, Asn) y aminoácidos que contienen azufre (Cys, Met) . Por otra parte, los equivalentes funcionales también incluyen variantes con la supresión de algunas de las secuencias de aminoácidos de KRS de la invención. La supresión o sustitución de los aminoácidos se localizan preferiblemente en regiones que no están directamente involucradas en la actividad fisiológica del polipéptido de la invención. Y la supresión de los aminoácidos es preferiblemente en las regiones que no están directamente involucradas en la actividad fisiológica de KRS. Además, los equivalentes funcionales también incluyen variantes con la adición de varios aminoácidos en ambos extremos terminales de la secuencia de aminoácidos de KRS o en la secuencia. Por otra parte, los equivalentes funcionales de la invención también incluyen derivados de polipéptido que tiene la modificación de algunos de la estructura química del polipéptido de la invención, manteniendo la columna vertebral y fundamental de la actividad fisiológica del polipéptido de la invención. Ejemplos de esta modificación incluyen modificaciones estructurales para el cambio de la estabilidad, almacenamiento, volatilidad o solubilidad del polipéptido de la invención.

La identidad de secuencia u homología se definen aquí como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia de candidatos que son idénticos con la secuencia de aminoácidos de KRS (SEC ID NO: 1), después de alinear las secuencias y la introducción de las lagunas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerar las sustituciones conservadoras (como se describió anteriormente) como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de extensiones N-terminales, C-terminales , o internas, eliminaciones o inserciones en la secuencia de aminoácidos de KRS se interpretará como que afecta la identidad de secuencia o la homología. Por lo tanto, la identidad de secuencia puede ser determinada por métodos estándar que se utilizan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos . El uso de un programa de ordenador como BLAST o FASTA, dos polipéptidos se alinean para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo largo de toda la longitud de una o dos secuencias o a lo largo de una porción predeterminada de una o dos secuencias) . Los programas proporcionan una penalizacion por apertura por omisión y una penalizacion por espacio por omisión y una matriz de clasificación tal como PAM 250 (una matriz de clasificación estándar; véase Dayhoff y otros, en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)) se puede utilizar junto con el programa de computadora. Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede calcular como el seguimiento. El número total de partidos idénticos, multiplicado por 100 y luego se divide por la suma de la longitud de la secuencia más larga en el lapso encontrados y el número de huecos introducidos en las secuencias más largo a fin de alinear las dos secuencias.

El polipéptido de acuerdo con la presente invención puede ser preparado por la separación de la naturaleza de los materiales o métodos de ingeniería genética. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica la KRS o sus equivalentes funcionales (por ejemplo: SEC ID NO: 2 (GenBank No. Acceso D32053)) se construye de acuerdo con cualquier método convencional. La molécula de ADN puede sintetizarse mediante la realización de PCR utilizando los iniciadores adecuados. Por otra parte, la molécula de ADN también puede ser sintetizada por el método estándar conocido en la materia, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automático (disponible en el mercado de Biosearch o Applied Biosystems) . La molécula de ADN construida se inserta en un vector que comprende al menos una secuencia de control de la expresión (por ejemplo: promotor, potenciador) que está operativo vinculados a la secuencia de ADN con el fin de controlar la expresión de la molécula de ADN y las células del huésped se transforman con el resultado vector de expresión recombinante . Las células transformadas se cultivan en un medio y condiciones adecuadas para expresar la secuencia de ADN, y un polipéptido sustancialmente pura codificado por la secuencia de ADN se recoge del medio de cultivo. La recolección del polipéptido puro se puede realizar usando un método conocido en la materia, por ejemplo, cromatografía. En este sentido, el término "polipéptido sustancialmente puro", significa el polipéptido de la invención que no contiene sustancialmente otras proteínas derivadas de las células huésped. Para el método de ingeniería genética para la síntesis del polipéptido de la invención, el lector puede referirse a las siguientes literaturas: Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook y otros, Sambrook et al , Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif. 1991; and Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. , 255, 12073-12080 1990.

Alternativamente, el polipéptido de la invención puede ser sintetizado químicamente de manera sencilla de acuerdo con cualquier técnica conocida en la materia ( (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principies, W. H. Freeman and Co . , NY, 1983). Como una técnica típica, no se limitan a, sino que incluyen síntesis en fase sólida o líquida, la condensación de fragmentos, MOC-F o la química de T-BOC, Inglaterra, 1989) .

El receptor de la laminina de la invención (67LR) de 67kDa es embebido en la membrana plasmática, el receptor sin integrina y, por ejemplo, puede tener una secuencia de nucleótidos o aminoácidos cualquiera descrito en Genbank adhesión No. NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP 370865, XP 001083023.

Los términos "ácido nucléico", "secuencia de ADN" o "polinucleótido" se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos ya sea en forma cadena sencilla o doble, y a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos de los nucleótidos naturales que hibridizan a los ácidos nucléicos en forma similar a la de los nucleótidos naturales. El término "KRS codificación de nucleótidos o sus equivalentes funcionales de los mismos" puede tener un ácido nucléico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 o un polipéptido que tiene la homología de secuencia de aminoácidos de al menos 70% para el polipéptido. El ácido nucléico que incluye ADN, DNA o RNA. El polinucleótido puede tener una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: l o una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% a la SEC ID NO: 1. Preferiblemente, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO. 2. El ácido nucléico puede ser aislado de una fuente natural o ser preparado por un método de ingeniería genética conocida en la materia.

El término "análogo" se utiliza aquí para referirse a una molécula que estructuralmente se parece a una molécula de referencia, pero que ha sido modificada de forma dirigida y controlada, mediante la sustitución de un sustituto especifico de la molécula de referencia con un sustituto alterno. En comparación con la molécula de referencia, se puede esperar que un análogo, por un experto en la materia, exhiba la misma utilidad, similar o mejorada. La síntesis y evaluación de los análogos, para identificar las variantes de compuestos conocidos que tienen mejores características (tales como una mayor afinidad de unión de una molécula objetivo) es un enfoque que es bien conocido en la química farmacéutica .

El término "homólogos" cuando se refiere a las proteínas y/o secuencias de proteínas indica que se derivan, natural o artificialmente, de una proteína ancestral común o la secuencia de la proteína. Del mismo modo, los ácidos nucléicos y/o secuencias de ácidos nucléicos son homólogos cuando se derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucléico ancestral común o secuencia de ácidos nucléicos.

Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad que muestra un efecto de la bioactividad de KRS de modulación (por ejemplo: niveles de celulares, etc.) de manera diferente a las células normales, los tejidos o la inhibición de la ubiquitinación de KRS.

Como se usa aquí, "en contacto" tiene su significado normal y se refiere a la combinación de dos o más agentes (por ejemplo, dos polipéptidos ) o la combinación de agentes y células (por ejemplo, una proteina y una célula) . El contacto puede producirse in vitro, por ejemplo, la combinación de dos o más agentes o la combinación de un agente de prueba y una célula o un lisado de células en un tubo de ensayo u otro recipiente. El contacto también puede ocurrir en una célula o in situ, por ejemplo, el contacto con dos polipéptidos en una célula de co-expresión en la célula de polinucleotidos que codifican las dos polipéptidos recombinantes, o en un lisado celular.

El término "agente" o "agente de prueba" incluye toda sustancia, molécula, elemento, compuesto, entidad, o una combinación de los mismos. Esto incluye, pero no es limitado a, por ejemplo, proteínas, polipéptidos, molécula orgánica pequeña, polisacáridos, polinucleótido, y similares. Puede ser un producto natural, un compuesto sintético, o un compuesto químico, o una combinación de dos o más sustancias. A menos que se especifique lo contrario, los términos "agente", "sustancia" y "compuesto" se pueden utilizar indistintamente. Más concretamente, los agentes de pruebas que se pueden identificar con los métodos de la presente invención son polipéptidos, imitadores de ciclos beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas , esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas, oligocarbamatos, polipéptidos, glúcidos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pinmidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Algunos agentes de prueba son moléculas sintéticas y otras moléculas naturales. Los agentes de prueba se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes, incluyendo las bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Las bibliotecas combinatorias se pueden producir muchos tipos de compuestos que pueden ser sintetizados en un paso a paso. Grandes bibliotecas combinatorias de compuestos pueden ser construidas por el método de codificación de bibliotecas sintéticas (ESL) descrito en el documento WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 y WO 95/30642. Las bibliotecas de péptidos también pueden ser generados por los métodos de visualización de fagos (véase, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980) . Las bibliotecas de compuestos naturales en forma de bacterias, hongos, plantas y extractos animales pueden obtenerse de fuentes comerciales o recopilarse en el campo. Los agentes farmacológicos conocidos pueden estar sujetos a modificaciones químicas dirigidas o al azar, como acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales.

Los agentes de prueba pueden ser proteínas naturales o sus fragmentos. Los agentes de esta prueba se pueden obtener de una fuente natural, por ejemplo, un lisado de células o tejidos. Las bibliotecas de los agentes de polipéptidos también se pueden preparar, por ejemplo, de una biblioteca de ADNc disponibles en el mercado o generados con los métodos de rutina. Los agentes de la prueba también pueden ser péptidos, por ejemplo, los péptidos de aproximadamente 5 a 30 aminoácidos, con alrededor de 5 a 20 aminoácidos que es preferido y de cerca de 7 a cerca de 15 que es particularmente preferido. Los péptidos se pueden digerir de forma natural de las proteínas, péptidos aleatorios, o péptidos aleatorios "impulsados".

Los agentes de pruebas también pueden ser "ácidos nucléicos". Los agentes prueba de ácidos nucléicos pueden presentarse naturalmente, ser ácidos nucléicos aleatorios, o ácidos nucléicos aleatorios "parciales". Por ejemplo, la digestión de los genomas eucariotes o procariotes, también se puede utilizar como se describe anteriormente para las proteínas .

En algunos métodos preferidos, los agentes de pruebas son moléculas pequeñas (por ejemplo, las moléculas con un peso molecular de no más de alrededor de 1, 000). Preferiblemente, los ensayos de alto rendimiento se han adaptado y utilizado para el · tamizado de tales moléculas pequeñas. Un número de ensayos disponibles para realizar este tamizado, por ejemplo, como se describe en Schultz (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; The present inventorsller (1997) Mol Divers. 3:61-70; Fernandes (1998) Curr Opin Chem Biol 2:597-603; y Sittampalam (1997) Curr Opin Chem Biol 1:384-91.

Las bibliotecas de los agentes de prueba para ser tamizados con métodos de la presente invención también pueden ser generadas con base en estudios estructurales del KRS, sus fragmentos o sus análogos. Estos estudios permiten, la identificación de los agentes de prueba que es más probable que se unan a la KRS. Las estructuras tridimensionales de KRS pueden ser estudiadas en un número de maneras, por ejemplo, la estructura cristalina y modelada molecular. Los métodos de estudio de estructuras de proteínas mediante cristalografía de rayos X son bien conocidos en la literatura. Ver Physical Bio-chemistry, Van Holde, KE (Prentice-Hall, New Jersey, 1971), pp 221 a 239, y Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg & D. C. Crothers (Benjamín Cummings, Menlo Park 1979) . El modelado por computadora de las estructuras de KRS proporciona otro medio para el diseño de agentes de pruebas de detección de KRS. Los métodos de modelización molecular se han descrito en la literatura, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,612,894, titulada "System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor", y Patente de E.U.A. No. 5,583,973 titulada "Molecular modeling method and system" . Además, las estructuras de la proteína también pueden ser determinadas por difracción de neutrones y resonancia magnética nuclear (R N) . Véase, por ejemplo, Química Física, 4 a ed. Moore, J Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J. ( Prentice-Hall, New Jersey 1972) , and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interscience, New York 1986) .

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle.

Los presentes inventores revelaron que el KRS de la invención interactúa con 67LR a través de la translocación de KRS en la membrana plasmática, y así mejora la migración de células tumorales (o cáncer) , lo cual produce un efecto sobre la metástasis del cáncer. Además, también reveló que la sobreexpresión de KRS o inhibición de la expresión KRS puede modular la metástasis de células tumorales (o cáncer) a través de experimentos in vivo con ratones.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para controlar la metástasis del cáncer mediante la modulación a nivel celular de lisil tARN sintetasa.

Para explicar más en detalle, si el nivel celular del lisil tARN sintetasa de la invención es reducido, la metástasis del cáncer puede ser suprimida y si el nivel celular del lisil tARN sintetasa de la invención se incrementa, la metástasis del cáncer puede ser estimulada.

La reducción o aumento del nivel celular se regula con diversos métodos bien conocidos en la materia como se describió anteriormente. Por ejemplo, pero no limitante, el nivel celular puede ser controlado mediante la regulación de la transcripción o la regulación post-transcripcional . La regulación de la transcripción se puede realizar por el método de mejora de una expresión de los genes conocidos en la materia, por ejemplo, el método de mejora de la expresión de genes mediante la preparación de un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica KRS o su equivalente funcional del mismo unido operativamente a un promotor, o el método para insertar una secuencia de expresión regular para mejorar la expresión de un gen que codifica KRS o su equivalente funcional de la misma en todo el gen, o el método para inhibir la expresión de genes, por ejemplo, el método de la actividad del promotor o la inhibición de la función de proteínas mediante la inducción de mutaciones en la región promotora del gen o , el método para la expresión de genes en contrasentido, o siARN o microARN .

La regulación post-transcripcional se puede realizar por el método para mejorar o suprimir expresión de la proteína conocido en la materia, por ejemplo, el método para mejorar la estabilidad o la supresión de ARNm del gen que codifica KRS o su equivalente funcional del mismo, el método para mejorar la estabilidad o la supresión de la proteína o polipéptido, o el método paira mejorar la actividad o la supresión de la proteína o polipéptido.

Para ejemplo concreto de los métodos mencionados anteriores, puede inducir la co-supresión a través de la transformación mediante la secuencia de ADN que codifica ARN accionando al ARNm tal el tipo de un intrón, tipo de ARN Rl, tipo de martillo o el tipo de horquilla o tipo micro ARN, y transformación, mediante ADN con la mismo secuencia o similar a la de un gen blanco.

Preferiblemente, en la presente invención, el método para controlar el nivel celular de KRS o un equivalente funcional de la misma puede ser realizado por el método para mejorar o suprimir la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido. El método para mejorar o suprimir podrán ser utilizados por personas expertas en la materia, por ejemplo, a través de la preparación de un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido que codifica KRS o un equivalente funcional del mismo unido operativamente a un promotor para mejorar la expresión del polinucleótido, o mediante la preparación de un vector de expresión recombinante que comprende polinucleótido en contrasentido de ARN o polinucleótido siARN contra el polinucleótido de KRS que codifica o un equivalente funcional del mismo unido operativamente a un promotor para suprimir la expresión del polinucleótido. El polinucleótido de KRS que codifica o un equivalente funcional del mismo puede tener la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID. No. 2, de preferencia.

Además, la presente invención proporciona un método para controlar la migración de células cancerosas mediante la modulación a nivel celular de lisil tARN sintetasa, y la modulación a nivel celular es el mismo que el descrito anteriormente .

Además, cuando se suprime la expresión de KRS de la invención, la metástasis de tumor (o cáncer) , la presente invención proporciona una composición para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende un vector de expresión que comprende un promotor y expresión de supresión de gen estructural de un KRS operativamente vinculado al mismo, o un anticuerpo contra KRS como un ingrediente eficaz. La expresión de los genes estructurales de la supresión de KRS puede ser ARN en contrasentido o siARN contra un polinucleótido que codifica KRS.

Las enfermedades en las que se puede aplicar la composición de la invención pueden ser cáncer. Los tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, el cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer cervical, el carcinoma de endometrio, cáncer de coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, tumor de cerebro, cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma, anemia aplásica.

El "promotor" es una secuencia de ADN que regula la expresión de la secuencia de ácido nucléico unido operativamente al promotor en una célula huésped especifica, y el término "unido operativamente" significa un fragmento de ácido nucléico que está relacionada con otro fragmento de ácido nucléico para que la función su manifestación y expresión se vea afectada por el fragmento de otro ácido nucléico. Además, el promotor puede incluir una secuencia de operador para el control de la transcripción, una secuencia que codifica un sitio propicio de unión de ribosoma de ARNm, y las secuencias de control de la terminación de la transcripción y traducción. Además, puede ser promotor constitutivo que constitutivamente induce la expresión de un gen blanco, o el promotor inducible que induce la expresión de un gen blanco en un lugar especifico y un tiempo especifico, y ejemplos de los mismos incluyen un promotor de SV40, promotor de CMV, promotor del CAG (Hitoshi Niwa y otros, Gene, 108:193-199, 1991; onahan y otros, Gene Therapy, 7:24-30, 2000; promotor CaMV 35S (Odell y otros, Nature 313:810-812, 1985), promotor Rsyn7 (Solicitud de Patente de E.U.A. No. 08/991,601), promotor de actina de arroz (McElroy y otros, Plant Cell 2:163-171, 1990), promotor de Ubiquitina (Christensen y otros, Plant Mol. Biol . 12:619-632, 1989), promotor de ALS (Solicitud de Patente de E.U.A. No. 08/409,297). También los promotores útiles de la Patente de E.U.A. No. 5, 608, 149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; y 5,608,142, etc.).

Mientras tanto, la presente invención proporciona un método para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un vector de expresión que comprende un promotor y una expresión de los genes estructurales de la supresión de KRS operativamente vinculados al mismo, o un anticuerpo contra KRS. Como el gen de la estructura se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona un método para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un vector de expresión que comprende además promotor y un polinucleótido unido operativamente, o un anticuerpo contra KRS como un ingrediente eficaz, en donde el polinucleótido es la codificación o ARN en contrasentido del siARN contra el polinucleótido KRS. Tal como se utiliza en este documento, la "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de vector de expresión inventiva eficaz en el tratamiento del tumor, y el "sujeto" se refiere a los animales, de preferencia, que comprende los animales humanos y que pueden ser células, tejidos, órganos provenientes de los animales. El sujeto puede ser paciente en necesidad de tratamiento .

Además, la presente invención proporciona un uso de un vector de expresión que comprende un promotor y un gen estructural de la supresión de la expresión de KRS operativamente vinculados al mismo, o un anticuerpo contra KRS para la preparación de un agente anti-cancerigeno . Más concretamente, la presente invención proporciona un uso de un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleótido operativamente vinculado al mismo, o un anticuerpo contra KRS para la preparación de un agente anticancerígeno, en donde el polinucleótido es la codificación o ARN en contrasentido del siARN contra el polinucleótido de KRS. En cuanto al promotor anterior, KRS, vector de expresión, cánceres aplicados como tales pueden observarse a partir de lo anterior.

El anticuerpo anticuerpo contra KRS como se usa en la presente significa una molécula de proteína específica que indica una región antigénica que se refiere a región antigénica de KRS. Con respecto a los objetivos de la presente invención, el anticuerpo se refiere a un KRS de unión específica a anticuerpos e incluye todos los anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes .

Los anticuerpos contra el KRS pueden ser fácilmente preparados de acuerdo con las tecnologías convencionales conocidas por los expertos en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar por un método ampliamente conocido en la materia, que incluye la inyección de la proteína KRS en un animal y la recolección de muestras de sangre de los animales para la obtención de anticuerpos en suero que contiene. Tales anticuerpos policlonales pueden prepararse a partir de una serie de animales determinados, tales como cabras, conejos, ovejas, monos, caballos, cerdos, vacas y perros.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser elaborados por un método ampliamente conocido en la materia, como un método de hibridoma (Kohler and ilstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)) o una técnica de anticuerpos colección de fagos (Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); y Marks et al, J. Mol. Biol . , 222:58, 1-597 (1991) ) .

El método de hibridoma emplea células de un animal huésped inmunológicamente adecuado inyectado con una proteína marcadora de diagnóstico de cáncer de pulmón como un antígeno, como ratones, y un cáncer o una línea celular de mieloma como otro grupo. Las células de los dos grupos se fusionan entre sí por un método ampliamente conocido en la técnica, por ejemplo, el uso de polietilenglicol y las células productoras de anticuerpos proliferan por un método de cultivo de tejidos estándar. Después se obtienen colonias uniformes de células por subclonación utilizando una técnica de dilución limitada, hibridomas capaces de producir un anticuerpo especifico para la proteina marcadora de diagnóstico para cáncer de pulmón se cultivan a gran escala in vitro o in vivo de acuerdo con una técnica estándar. Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas se pueden utilizar en una forma no purificada, pero se utilizan preferiblemente después de haber sido altamente purificadas mediante un método ampliamente conocido en la materia a fin de obtener mejores resultados. El método de biblioteca de anticuerpo de fagos incluye la construcción de una biblioteca de anticuerpos de fagos in vitro mediante la obtención de genes de los anticuerpos (variable de un solo fragmento de la cadena (scFv) ) a una variedad de marcadores intracelulares de cáncer de pulmón y los expresa en una forma de proteina de fusión en la superficie de fagos y aisla los anticuerpos monoclonales de unión a proteínas específicas del cáncer de pulmón, de la biblioteca. Los anticuerpos preparados por los métodos anteriores se aislan mediante electroforesis en gel, diálisis, salinización, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc.

Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen formas completas, que tienen dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, así como fragmentos de moléculas de anticuerpos. Los fragmentos de moléculas de anticuerpos se refieren a fragmentos que retienen por lo menos una función de unión al antigeno, e incluyen Fab, F(ab'), F(ab')2 y Fv.

Además, el inventor de la presente describió que en el caso de disminuir el nivel celular de KRS, se suprime la metástasis del cáncer, con lo se previene y trata el cáncer y la presente invención proporciona una composición para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende un inhibidor de la actividad de KRS como un ingrediente eficaz. Además, la presente invención proporciona un método para la prevención y el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de la actividad KRS y el uso de un inhibidor de la actividad KRS para la preparación de agente anticancerigeno . El tipo de cáncer, el sujeto, cantidad efectiva y asi sucesivamente son los mismos como se describieron anteriormente.

El inhibidor de la actividad de KRS significa que el agente de la supresión de la expresión de KRS, es decir, la supresión de la expresión en el nivel de ARNm o proteina, por ejemplo, puede ser ARN en contrasentido o siARN contra KRS, o un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo de la supresión de la actividad de KRS expresado, por ejemplo, los anticuerpos contra el KRS, pero no de forma limitada .

En caso de disminuir el nivel celular de KRS, ya que inhibe la metástasis del cáncer para prevenir y tratar el cáncer, la composición de la invención, el método y el uso se pueden aplicar tal cual, asi como se pueden aplicar como combinaciones con el método conocido para prevenir y tratar el cáncer en la materia. Es decir, dado que la composición del método de la invención, etc. puede suprimir la metástasis del cáncer, si se aplica junto con medicamentos contra el cáncer conocidos o métodos para la prevención y el tratamiento del cáncer, se suprime la metástasis del cáncer y seria eficaz para la recuperación total a través del tratamiento de la región de tumor principal.

El agente antitumoral o el método para la prevención y el tratamiento que se pueden utilizar en combinación con el polipéptido de la invención puede ser cualquiera que se utiliza para el tratamiento de un tumor. Por ejemplo, el paclitaxel, doxorrubicina, vincristina, daunorrubicina, vinblastina, daunorrubicina D, docetaxel, etopósido, tenipósido, bisantrene, homoharringtonine, Gleevec (STI-571), cisplatino, 5-fluorouracilo, adriamicina, metotrexato, busulfán, clorambucil, ciclofosfamida, melfalán, la mostaza de nitrógeno, nitrosourea, etc., pueden ser incluidos. La cantidad de péptido de la invención en la composición de la presente invención puede ser diferente dependiendo del tipo y cantidad del fármaco contra el cáncer al cual se une el péptido.

Las combinaciones entre los agentes y la composición o el método de la presente invención se pueden realizar en función del tipo y la cantidad del fármaco contra el cáncer adecuadamente por la persona experta en la materia.

El vector de expresión de la invención, la inhibición de actividades de los agentes de anticuerpos contra KRS o KRS puede administrarse por via oral o parenteral. La administración oral puede abarcar método hipogloso. Los métodos de administración parenteral no se limitan, sino que incluyen los métodos de inyección, tales como, hipodérmico, intramuscular e intravenoso, y el método de goteo. El vector de expresión de la invención, la inhibición de actividades de los agentes de anticuerpos contra KRS o KRS se pueden preparar en diversos tipos de composiciones farmacéuticas al mezclarse con vehículos farmacéuticamente aceptables. Tal como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que es fisiológicamente aceptable y, cuando se administra a los seres humanos, por lo general no causa reacciones alérgicas, tales como el trastorno gastrointestinal y mareos, o sus reacciones similares. En el caso de una formulación oral, un agente aglutinante, un lubricante, un formador de soluciones, un excipiente, un solubilizante, un agente de dispersión, un estabilizador, un agente de suspensión, un colorante y un saborizante puede ser utilizado. En el caso de una formulación inyectable, una solución reguladora de pH, un preservativo, un agente sin dolor, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizador se puede utilizar y en el caso de una formulación o parenteral, una base, un excipiente, un lubricante y un conservador puede ser utilizado. La composición farmacéutica que comprende el vector de expresión de la invención, las actividades de agente inhibidor de anticuerpos contra KRS o KRS se puede preparar en diversos tipos de mezcla con vehículos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, en el caso de una formulación oral, puede ser formulado en tabletas, pastillas, cápsulas, elixires, suspensión, jarabe y oblea y en el caso de la formulación de la inyección, ya que puede ser preparada en una ampolleta de dosis única o múltiple una dosis de la ampolla .

La cantidad efectiva total del vector de expresión de la invención, las actividades de agente inhibidor de anticuerpos contra KRS o KRS se puede administrar a un sujeto en una sola dosis, o puede ser administrado mediante un protocolo de tratamiento fraccionado, en los que las dosis múltiples son administradas por un período más prolongado de tiempo. La composición que comprende el vector de expresión de la invención, las actividades de agente inhibidor de anticuerpos contra KRS o KRS puede variar en la cantidad de componente eficaz en función de la gravedad y/o el objeto de la enfermedad, pero por lo general, se puede administrar un 0.1 pg a 100 mg y, preferiblemente, una g a 10 mg y varias veces al día. Sin embargo, expertos en la materia se podría saber que la concentración del vector de expresión o la actividad inventiva agente inhibidor de KRS necesarios para obtener una dosis efectiva en un sujeto depende de muchos factores incluyendo la edad, peso corporal, estado de salud, gravedad de la enfermedad, la dieta y la excreción de este asunto, la vía de administración, el número de tratamientos que se administrarán, y así sucesivamente. Teniendo en cuenta estos factores, cualquier persona experta en la materia puede determinar la dosis adecuada efectiva del vector de expresión de la invención o el agente de la inhibición de las actividades de KRS. Ninguna limitación particular, se impone a la formulación, vía de administración y modo de administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando la composición muestra los efectos de la presente invención.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas a pacientes con la cantidad que es eficaz para prevenir la enfermedad. Generalmente, la cantidad efectiva de la composición de la invención es de 0.0001 a 100 mg/kg peso corporal/día. Preferiblemente 0.01 a 1 mg/kg de peso corporal el peso actual/día. Puede ser debidamente determinada con base en diversos factores, tales como la edad, peso corporal, estado de salud, sexo, gravedad de la enfermedad, la dieta y excreción de un sujeto que necesita el tratamiento, asi como el tiempo de administración y vía de administración.

Mientras tanto, el vector de expresión puede ser introducido en una célula de destino por cualquier método conocido en la materia, como la infección, la transfección o transducción.

Un método de transferencia de genes utilizando un vector plásmido de expresión es un método de transferencia de un plásmido de ADN directamente a las células de mamíferos, que es un método aprobado por la FDA aplicable para los seres humanos (Nabel, EG, y otros, Science, 249:1285-1288, 1990). A diferencia de vectores virales, el ADN de plásmido tiene la ventaja de ser homogéneamente purificado. El vector de plásmido de expresión que puede ser utilizado en la presente invención incluye plásmidos de expresión de mamíferos conocidos en la técnica pertinente. Por ejemplo, no se limitan a, pero por lo general incluyen pRK5 (Patente Europea No. 307,247), pSVl6B (Publicación de PCT No. 91/08291) y pVL1392 (PharMingen) . El vector de expresión del plásmido que contiene dicho polinucleótido puede introducirse en las células blanco por cualquier método conocido en la materia, incluyendo pero no limitado a, la transfección transitoria, microinyeccíón, transducción, fusión celular, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por liposomas, transfeccion mediada por dextrano DEAE, transfeccion mediada por polibreno, electroporación, métodos de disparo de genes y otros métodos conocidos para la introducción de ADN en las células (Wu y otros, J. Bio Chem, 267:963-967, 1992; Wu y Wu, J . Bio. Chem., 263:1 621-14624, 1988).

Además, los vectores de virus de expresión que contienen dicho polinucleótido incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus Avipox y asi sucesivamente. El vector retroviral es construido de manera que las proteínas virales no se pueden producir dentro de las células infectadas por el vector viral en el que los genes del virus son eliminados o modificados. Las principales ventajas de los vectores retrovirales para terapia de genes son aquellos que transfieren una gran cantidad de genes en las células de replicación, precisamente integra los genes transferidos en el ADN celular y no provoquen infecciones continuas después de la transfeccion de genes (Miller, A.D., Nature, 357: 455-460, 1992). El vector retroviral aprobado por la FDA fue preparado con células empacadoras de retrovirus anfotrópico PA317 (Miller, AD y Buttimore, C, Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). Los vectores retrovirales no son adenovirus como se describió anteriormente (Rosenfeld y otros, Cell, 68:143-155, 1992;.

Jaffe y otros, Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand y otros, Proc Nati. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). Las principales ventajas de adenovirus es que transfiere una gran cantidad de fragmentos de ADN (36kb genomas) y es capaz de infectar a las células no replicativa, a un titulo muy alto. Por otra parte, el virus del herpes puede también ser útil para la terapia genética humana (Wolfe, J.H., y otros Nature Genetics, 1:379-384, 1992). Además, se pueden utilizar otros vectores virales convenientes conocidos.

Además, un vector capaz de expresar la inhibición de la expresión de KRS puede ser administrado por un método conocido. Por ejemplo, el vector puede ser administrado a nivel local, por vía parenteral, por vía oral, intranasal, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, u por otras vías adecuadas. En particular, el vector puede ser inyectado directamente en un cáncer de destino o de células tumorales en una cantidad eficaz para el tratamiento de las células tumorales de un tejido blanco. En particular, para un cáncer o un tumor presente en una cavidad del cuerpo como los ojos, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario, sistema pulmonar y bronquial y así sucesivamente, la composición farmacéutica de la invención puede ser inyectada directamente en el órgano hueco afectado por el cáncer o un tumor con una aguja, un catéter o los demás tubos de suministro. Cualquier dispositivo de imágenes eficaz, tal como rayos X, ecografía, o sistema de visualización de fibra óptica, se puede utilizar para localizar el tejido objetivo y guia la aguja o catéter. Además, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada en el sistema de circulación de la sangre para el tratamiento de un cáncer o un tumor que no puede ser alcanzado directamente o aisladas anatómicamente.

La presente invención también proporciona un método para la detección de un agente que modula la metástasis del cáncer o migración de células cancerosas que comprende: (a) ponerse en contacto con un agente de la prueba con KRS en presencia del agente de prueba; (b) medir la actividad de KRS y la selección de un agente de las pruebas que cambia la actividad de KRS, y (c) comprobar que el agente seleccionado regula la metástasis del tumor o la migración de células del cáncer.

Varias técnicas o ensayos bioquímicos y de biología molecular bien conocidos en la técnica se pueden emplear para la práctica de la invención. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, de Cold Spring Harbor Press, NY, (1989) y Tercera Edición (2000) y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1999) .

Preferiblemente, el agente de prueba por primera vez analizado por su capacidad para modular la actividad biológica de KRS (primer paso de ensayo) . En particular, en el primer paso, modulando los agentes que modulan la actividad biológica de un polipéptido puede ser identificado analizando una actividad biológica de KRS aislada en presencia de un agente de prueba. Preferiblemente, la presente invención puede comprender: (a) ponerse en contacto con agentes de prueba con KRS en presencia de un agente de prueba, y (b) medir la actividad de KRS y la selección de un agente de las pruebas que cambia la actividad de KRS.

La modulación de diferentes actividades biológicas de KRS se puede probar en el primer paso. Por ejemplo, un agente de prueba se puede probar para la actividad que modula el nivel de expresión de KRS, por ejemplo, la transcripción o traducción. El agente de prueba también se puede probar para las actividades en la modulación de nivel celular o la estabilidad de KRS, por ejemplo, la modificación posterior de la traducción o la proteólisis. Prueba de agentes que aumentan la actividad biológica de KRS por el paso de primer ensayo son identificados, los agentes de prueba se someterán a ensayos adicionales a la capacidad de modular la actividad del receptor de la laminina (67LR), en presencia de KRS (el segundo paso de prueba) . Por ejemplo, los agentes de pruebas se someterán a ensayos adicionales a la capacidad de modular la metástasis del cáncer o migración de células tumorales.

Como se señaló anteriormente, los agentes de KRS identificados por la presente invención son capaces de modular la metástasis del cáncer o migración de células tumorales. Si un agente de prueba identificado en el primer paso de la prueba modula el nivel celular (por ejemplo, mediante la alteración de la actividad de transcripción) de los agentes de modulación de KRS, que modulan la metástasis del cáncer o migración de células tumorales.

Por otro lado, si un agente de prueba modula una actividad distinta de nivel celular de KRS, entonces se necesita el paso de pruebas adicionales para confirmar que su efecto modulador sobre el KRS daria lugar a la modulación de la metástasis del cáncer o migración de células tumorales. Por ejemplo, un agente de prueba, que modula la actividad de fosforilación de KRS, necesita probarse además con el fin de confirmar la modulación de la actividad de fosforilación de KRS que puede dar lugar a la modulación de la metástasis del cáncer o migración de células tumorales.

Tanto en el primer paso y como en el segundo paso, se puede utilizar un KRS intacto y las subunidades o fragmentos de ellos, los análogos o derivados funcionales. Los fragmentos que pueden ser empleados en estos ensayos suelen mantener una o varias de las actividades biológicas de KRS. Preferiblemente, los fragmentos de AIMP2 pueden abarcar del lo. al 72o. residuos de aminoácidos de la SEC. ID NO: 1.

Y las proteínas de fusión que contienen dichos fragmentos o análogos también pueden ser utilizadas para la detección de agentes de pruebas. Los derivados funcionales de KRS generalmente tienen supresiones y/o inserciones y/o sustituciones de aminoácidos, mientras que mantiene una o más de los bioactividades y por lo tanto también se pueden utilizar en la práctica de los procedimientos de análisis de la presente invención.

Una variedad de técnicas bien conocidas se pueden utilizar para identificar a los agentes de pruebas que modulan KRS. Preferiblemente, los agentes de pruebas son evaluados con un sistema de ensayo basado en células. Por ejemplo, en un ensayo basado en células típicas de base (es decir, el segundo paso de detección) , la actividad del gen reportero (es decir, la actividad enzimática) se mide en presencia del agente de prueba y luego se compara la actividad del gen reportero en ausencia del agente de prueba. El gen reportero puede codificar cualquier polipéptido detectable (polipéptido de respuesta o reportero) , conocido en la materia, por ejemplo, detectable por fluorescencia o fosforescencia o en virtud de que posee una actividad enzimática. El polipéptido de respuesta detectable puede ser, por ejemplo, luciferasa, alfa-glucuronidasa, alfa-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, proteína verde fluorescente, aumento de la proteina verde fluorescente y fosfatasa alcalina segregada a humanos.

En los ensayos basados en células, el agente de prueba (por ejemplo, un péptido o polipéptido) también se puede expresar de un vector diferente que también está presente en la célula huésped. En algunos métodos, una colección de agentes de pruebas está codificada por una colección de vectores de los mismos (por ejemplo, una biblioteca de cADN, véase el ejemplo a continuación) . Estas bibliotecas se pueden generar usando métodos bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y otros y Ausubel y otros, supra) u obtenidos de una variedad de fuentes comerciales .

Además de ensayos basados en células descritas anteriormente, también pueden ser examinados con métodos no basados en células. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los ensayos de cambio de movilidad de unión al ADN, la metilación y ensayos de interferencia de uracilo, DNasa y análisis de huellas de radicales hidroxi, la polarización de la fluorescencia, y entrelazamiento de UV o químicos entrelazados. Para una visión general, véase, por ejemplo, Ausubel y otros, Supra (capitulo 12, DNA-Protein Interactions ) . Una técnica para aislar co-asociación de las proteínas, incluyendo ácidos nucléicos y el ADN y las proteínas de unión al ARN, incluye el uso de entrelazamiento de UV o químicos entrelazantes, incluidos, por ejemplo, entrelazadores de división de ditiobis (succinimidilpropionato) y 3, 3 ' -ditiobis ( sulfosuccinimidil-propionato) , véase, por ejemplo, McLaughlin, Am. J. Hum. Genet, 59:561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996; Lingner, Proc. Nati. Acad. Science. USA, 93:10712, 1996, y Chodosh, Mol. Cell . Biol., 6:4723-4733 de 1986.

Primer paso de análisis : agentes de prueba de tamizado que modulan KRS Un número de sistemas de ensayo puede ser empleado para tamizar los agentes de pruebas de moduladores de KRS. Como se señaló anteriormente, la proyección puede utilizar un sistema de ensayo in vitro o un sistema de ensayo basado en células. En esta etapa de depuración, los agentes de pruebas pueden ser examinados por la unión a KRS, alterando el nivel celular de KRS, o la modulación de otras actividades biológicas de KRS. 1) Revisión de los agentes de prueba que se unen KRS En el primer examen de paso algunos de los métodos, se determina la unión de un agente de prueba para KRS. Por ejemplo, puede ser probado por un número de métodos que incluyen, por ejemplo, etiquetados en ensayos in vitro de la proteína de unión a proteínas, ensayos de cambio de movilidad de electroforesis , el inmunoanálisis de ensayos de unión a proteínas, funcionales (ensayos de fosforilación, etc.), y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,366,241, 4,376,110, 4,517,288 y 4,837,168; y Bevan y otros, Trends in Biotechnology 13:115-122, 1995; Ecker y otros, Bio/Technology 13:351-360, 1995; y Hodgson, Bio/Technology 10:973-980, 1992. El agente de prueba puede ser identificado mediante la detección de un enlace directo a KRS, por ejemplo, co-inmunoprecipitación con KRS por un anticuerpo dirigido a KRS. El agente de prueba también se puede identificar mediante la detección de una señal que indica que el agente se une a KRS, por ejemplo, la extinción de fluorescencia .

Los ensayos de competencia proporcionan un formato adecuado para la identificación de agentes de pruebas que se unen específicamente a KRS. En estos formatos, los agentes de la prueba se proyectan en la competencia con un compuesto que se sabe que se unen a KRS. El compuesto de unión conocido puede ser un compuesto sintético. También puede ser un anticuerpo, que reconoce específicamente polipéptido KRS, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra KRS. Si el agente de prueba inhibe la unión de la sustancia que se une a KRS, entonces el agente de prueba también se une a KRS.

Numerosos tipos de ensayos de unión competitivos son conocidos, por ejemplo: radioinmunoensayo en fase sólida, inmunoensayo enzimático en fase sólida directa o indirecta (RIA) , ensayo de emparedado de competencia directa o indirecta (EIA) (véase Stahli y otros, ethods in Enzymology 9:242-253 (1983)), EIA de biotina-avidina en fase sólida directa (véase Kirkland y otros, J. Immunol 137:3614-3619 (1986)); ensayo marcado en fase sólida directa, ensayo de emparedado de marcado en fase sólida directa (ver Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcado directo en fase sólida utilizando marcado sup.1251 (ver Morel y otros, Mol. Immunol. 25 (1):7-15 (1988)); EIA biotina-avidina de fase sólida directa (Cheung y otros, Virology 176:546-552 (1990)), y RIA de marcado directo (Moldenhauer y otros, Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Por lo general, dado que un enasayo implica el uso de unión de polipéptido purificado a una superficie sólida o células que tienen por lo menos estas, un agente de prueba no marcado y un compuesto de referencia marcado. La inhibición competitiva se midió determinando la cantidad de marca unida a la superficie sólida o células en presencia del agente de prueba. Usualmente, el agente de prueba está presente en exceso. Los agentes moduladores identificados por el análisis de competencia incluyen agentes que se unen al mismo epitope como el compuesto de referencia y los agentes que se unen a un epitope adyacente suficientemente proximal al epitope único por el compuesto de referencia para que ocurra bloqueo estérico. Usualmente, cuando está presente un agente de competencia en exceso, inhibirá la unión especifica de un compuesto de referencia a un polipéptido blanco común por lo menos por 50 o 75%.

Los análisis de tamizado pueden estar en formatos insolubles o solubles. Un ejemplo de los ensayos insolubles es inmovilizar KRS o sus fragmentos en una matriz en fase sólida. La matriz en fase sólida se pone en contacto con los agentes de prueba, durante un intervalo suficiente para permitir que se unan los agentes de prueba. Después del lavar cualquier material no unido de la materia en fase sólida, la presencia del agente unido a la fase sólida permite la identificación del agente. Los métodos además pueden incluir el paso de elución del agente vinculado de la fase de la matriz sólida, con lo que se aisla el agente. Por otra parte, diferente a KRS de inmovilización, los agentes de prueba están unidos a la matriz sólida y entonces se agrega KRS.

Los ensayos solubles incluyen algunas de las bibliotecas combinatorias que tamizan los métodos descritos anteriormente. Bajo el formato de ensayos solubles, ni los agentes de pruebas ni KRS están destinados a un soporte sólido. La unión de KRS o fragmento de la misma a un agente de prueba se puede determinar, por ejemplo, por cambios en la fluorescencia de cualquiera de KRS o los agentes de prueba, o ambas cosas. La fluorescencia puede ser intrínseca o conferida, mediante el marcado de algún componente con un fluoroforo .

En algunos ensayos de unión, ya sea KRS, el agente de prueba, o una tercera molécula (por ejemplo, un anticuerpo contra KRS) se puede proporcionar como entidades marcadas, es decir, unida covalentemente o ligada a un marcador o grupo detectable, o grupo entrelazable, para facilitar la identificación, la detección y cuantificación del polipéptido en una situación dada. Estos grupos detectables pueden abarcar un grupo de polipéptido detectable, por ejemplo, una enzima que puede analizarse o epítope del anticuerpo. Por otra parte, el grupo detectable se puede seleccionar entre una variedad de otros grupos detectables o marcados, tales como radioetiquetas (por ejemplo, 125I, 32P, 35S) o un grupo quimioluminiscente o fluorescente. Del mismo modo, el grupo puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor o ligando de afinidad . 2) Tamizar agentes de prueba que modulan otras actividades de KRS La unión de un agente de prueba para KRS proporciona una indicación de que el agente puede ser un modulador de KRS. También sugiere que el agente puede modular la actividad del receptor de la laminina para modular la metástasis del cáncer o migración de células tumorales. Por lo tanto, un agente de prueba que se une a KRS puede someterse al ensayo de capacidad para modular la actividad del receptor de la laminina.

Por otra parte, un agente de prueba que se une a KRS puede ser examinado para determinar su actividad en KRS. La existencia, naturaleza y alcance de dicha actividad puede ser probada por un ensayo de actividad. Este ensayo de actividad puede confirmar que el agente de prueba que se une a KRS además tiene una actividad moduladora de KRS. Más a menudo, estos ensayos de actividad pueden usarse de forma independiente para identificar los agentes de prueba que modulan la actividad de KRS (es decir, sin ensayar su capacidad para unirse a KRS) . En general, estos métodos implican la adición de un agente de prueba a una muestra que contiene KRS en presencia o ausencia de otras moléculas o de los reactivos que son necesarios para probar una actividad biológica de KRS y determinar una alteración en la actividad biológica de KRS. Además de los ensayos de detección de agentes biológicos que modulan las actividades enzimáticas o de otro tipo de KRS, la actividad de análisis también incluye la selección in vitro e in vivo de detección de alteraciones en la expresión o el nivel celular de KRS.

Segundo paso de prueba: los agentes de detección que modulan la metástasis del tumor o la migración de células tumorales Una vez que un agente modulador se ha identificado que se une a KRS y/o para modular la actividad biológica (incluido el nivel celular) de KRS, puede probarse además para capacidad de modular la metástasis del tumor o la migración de células tumorales. La modulación de la metástasis del tumor o la migración de células tumorales por el agente de la modulación se suele probar en presencia de KRS. Cuando se emplea un sistema de selección basado en células, KRS se puede expresar de un vector de expresión que se ha introducido en una célula huésped. Por otra parte, KRS se puede suministrar endógenamente por la célula huésped en el sistema de detección.

La presente invención también proporciona un método para la detección de un agente inhibidor de una interacción entre KRS67LR y que comprende: (a) ponerse en contacto con un agente de la prueba con KRS y el receptor de la laminina (67LR) en presencia del agente de análisis, y (b) comprobar si el agente seleccionado regula la interacción entre KRS y el receptor de la laminina.

Dicho agente puede ser lo que estimula o refuerza la interacción entre KRS y el receptor de la laminina (67LR), o al contrario, puede ser lo que inhibe o agrava la interacción .

El paso (b) puede abarcar la detección de un cambio relativo del nivel de interacción entre polipéptido KRS y 67LR en la célula o célula del lisado de su contacto con el agente de prueba en comparación con el nivel de interacción entre KRS y 67LR en la célula o célula del mismo sin el lisado ponerse en contacto con el agente de prueba.

El método para la identificación puede ser realizado por cualquier método convencional conocido en la técnica como marcación in vitro de la unión de proteína-proteína (en ensayos descendentes completamente in vitro) , EMSA (ensayos de cambio de movilidad electroforética) , inmunoensayos de unión a proteínas, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.), levadura de dos híbridos de ensayo, ensayos de inmunoprecipitaciones no inmunes, inmunoprecipitación/análisis Blot severo, ensayos de inmuno-co-localización .

Por ejemplo, análisis de dos híbridos de levadura puede llevarse a cabo utilizando la levadura que expresa AI P2 y p53, o partes u homólogos de las proteínas, fusionándose con el dominio de unión al ADN de LexA represor de bacterias o GAL4 de levadura y el dominio de transactivación de la proteína de levadura GAL4, respectivamente (Kim, M.J. y otros, Nat. Gent., 34:330-336, 2003) . La interacción entre AIMP2 y p53 reconstruye un transactivador que induce la expresión de un gen reportero bajo el control de un promotor que tiene una secuencia de reglamentación obligatoria para el dominio de unión al ADN de la serie LEXA o GAL4.

Como se describió anteriormente, el gen reportero puede ser cualquier gen conocido en la técnica que codifica un polipéptido detectable. Por ejemplo, se pueden usar cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , la luciferasa, ß-galactosidasa, ß-glucosidasa, fosfatasa alcalina, proteina verde fluorescente (GFP) , etc.. Si la interacción entre AIMP2 y p53, o partes u homólogos de las proteínas se facilita o mejora por un agente de prueba, la expresión del gen reportero que aumenta en una condición normal. Por el contrario, si la interacción es inhibida o reducida por un agente de prueba, el gen reportero no se expresa ni se expresa menos en una condición normal.

Además, puede seleccionarse un gen reportero que codifica una proteína, que permite el crecimiento de la levadura (es decir, si el gen reportero no se expresa, el crecimiento de la levadura se inhibe) . Por ejemplo, se pueden usar los genes que codifican enzimas auxotrópicas implicadas en la biosíntesis de obtención de aminoácidos o bases nitrogenadas (por ejemplo, genes de la levadura como ADE3, HIS3 etc. o genes de otras especies similares). Si la expresión de AIMP2 y p53, o partes u homólogos de las proteínas es inhibida o reducida por un agente de prueba, el gen reportero no se expresa ni se expresa menos. En consecuencia, en tal condición, el crecimiento de la levadura se ha detenido o retardado. Tal efecto en la expresión del gen reportero se puede observar con los ojos o el uso de dispositivos (por ejemplo, un microscopio) .

Además, como los resultados de análisis de la sobreexpresion de 67LR y KRS se realiza para el cáncer de pulmón o cáncer de mama, se comprueba que, la relación entre la sobreexpresion de KRS y cáncer de pulmón o cáncer de mama es alto en caso de 67LR es sobre-expresado (tabla 1). En consecuencia, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón o cáncer de mama que consiste en: (a) análisis de la sobreexpresion de 67LR en una muestra, y (b) análisis de la sobreexpresion de LRS en la muestra 67LR sobre-expresada.

El muestreo para el diagnóstico y el tratamiento para el diagnóstico y el análisis de sobe-expresión de 67LR y KRS puede utilizar técnicas de biología molecular que son bien conocidas en la materia y son descritas anteriormente.

A partir de ahora, se describen las cifras de la presente invención.

Las Figuras 1 a 6 muestran la interacción específica entre KRS humanos y el receptor de la laminina. En la Figura 1, la interacción entre cuerpo entero KRS humanos y 37LRP/p40 se determinó por análisis de dos híbridos de levadura, AIMP1 y AIMP2, los dos componentes del complejo multi-ARS, se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. La interacción positiva es indicada por la formación de colonias azules en medio de levadura que contiene X-gal. En la Figura 2, 37LRP fue sintetizado por la traducción in vitro en presencia de metionina [35S] y sometido a tracción con GST-KRS o GST. Se detectótó 37LRP co-precipitó con GST-KRS por autorradiografía . En la Figura 3, las regiones peptídicas de KRS y 37LRP implicadas en su interacción se determinó por análisis de dos híbridos de levadura como antes. 37LRP contiene 296 aminoácidos en los que los dominios citoplasmático N-terminal (aminoácidos 54-113) y extracelular C-terminal (aminoácidos 137-210) están divididos por dominio de transmembrana (aminoácidos 113-137) . La única extensión N-terminal (cerca de 70 aminoácidos) de KRS humanos (597 aminoácidos) es seguida de unión anticodón OB veces (aminoácidos 70-214) y los dominios catalíticos (aminoácidos 220-574). En la Figura 4, las células A549 transíectadas con Myc-KRS fueron analizadas y sometidas a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-Myc y receptor de anticuerpos anti laminina. KRS-myc se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-Myc y 67LR y 37LRP co-precipitados se determinaron por inmunotransferencia . Para el análisis especifico de 37LRP y 67LR, los presentes inventores utilizan anticuerpos policlonales , H-141 y F-18 (Santacruz) , respectivamente (WCL: lisado de células enteras). En la Figura 5, los lisados de células A549 transíectadas con Myc-KRS fueron objeto de análisis Western Blot con los anticuerpos indicados. Las células se separaron en fracciones citoplasmáticas y de membrana y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Myc y la co-precipitación de 37LRP y 67LR fue determinada por Western Blot. IgG se utilizó como control. En la Figura 6, cuando son tratados con 10 ug/ml de laminina durante 1 hora, los presentes inventores confirmaron que la unión de 67LR y KRS se incrementó. Para identificarlo, la inmunoprecipitación se llevó a cabo con anticuerpos de reconocimiento de 67LR (abcam, cat # ab2508) y el nivel de IgG de la izquierda es de un IgG total de conejo y se utilizó como control. Después de que SDS-PAGE se llevó a cabo, a continuación, se trasladó a la membrana de PVDF y se realizó inmunoanálisis con KRS 67LR y el reconocimiento de anticuerpos, respectivamente.

Las Figuras 7 a 12 muestran la translocación de membrana inducida por laminina y fosforilación de KRS. En la Figura 7, se trataron las células A549 con laminina (10 ug/ml) y el nivel de 67LR, 37LRP y KRS se determinó mediante análisis Western Blot en los tiempos indicados. Hsp90 y Cadherina fueron utilizados como marcadores de citoplasma y membrana, respectivamente. En la Figura 8, las células A549 no tratadas o tratadas con laminina durante 1 h fueron sometidas a tinción de inmunofluorescencia con anti-67LR (MLuC5, Santacruz, sc-59732) (rojo) y anticuerpos KRS (verde). En la Fig. 9, las células A549 fueron tratadas con U73122 (U), estaurosporina (ST) y LY294002 (LY) que inhiben la PLC-gamma, PKC y PI3K, respectivamente, durante 3 horas, luego con la laminina durante 1 hora y se comprueba cómo estos inhibidores de quinasa afectan al nivel de la membrana citoplasmática y de 67LR y KRS. En la Figura 10, las células A549 fueron transfectadas con KRS- yc y se incubaron durante 24 h. Las células fueron tratadas con los productos químicos que se indica a continuación, con la laminina como antes. KRS-myc se inmunoprecipitaron e inmunoanalizaron con anticuerpos anti-p-Thr, -Ser, y anticuerpos Tyr. En la Figura 11, las células A549 fueron trans ectadas con KRS-Myc y cultivadas durante 24 horas. Los transfectantes fueron pre-tratados con LY294002 durante 3 horas y después se trataron con laminina durante 1 h. KRS-myc se immunoprecipitó y la co-precipitación de 67LR fue determinada por análisis Western Blot. IgG se utiliza como un control para la inmunoprecipitación. En la Figura 12, las células A549 fueron cultivadas en ausencia y presencia de laminina y LY294002 como se indica. EPRS (glutamil-prolil-tARN sintetasa) se inmunoprecipitó con su anticuerpo especifico (AbCam) y la co-inmunoprecipitación de KRS fue determinada por análisis Western Blot (superior) . El sistema inmune agotado sobrenadante (ID) fueron sometidos a análisis Western Blot con anti-anticuerpos y KRS-EPRS.

Las Figuras 13-17 muestran que KRS estabiliza la membrana 67LR. En la Figura 13, las células A549 fueron transfectadas con si-control o si-KRS y se incubaron en ausencia y presencia de laminina. Las células fueron separadas en fracciones de citoplasma y membrana y los niveles de 67LR y KRS en cada fracción se determinaron por análisis Western Blot. Cadherina (cad) y hsp90 fueron utilizados como marcadores de la membrana plasmática y citoplasma, respectivamente. En la Figura 14, el nivel de 67LR unido a la membrana en las células A549 fue supervisado por citometria de flujo utilizando anticuerpos anti-LR (MLuC5) . Las células fueron transfectadas con el vector vacio o plásmido de KRS y se incubaron durante 24 h (superior) . Para ver el efecto de la supresión de KRS nivel 67LR, las células fueron transfectadas con si-KRS o si-control y se incubó durante 48 horas (bajo) . En la Figura 15, las células A549 transfectadas con EV o KRS se han seleccionado con el G418 durante una semana y la distribución celular de 67LR se determinó por inmunofluorescencia con anticuerpos anti-LR (MLuC5) . La LR localizada en la membrana se resaltó con flechas blancas. En la Figura 16, las células A549 fueron tratadas con cicloheximida para inhibir la síntesis de nuevo de proteínas y el efecto de los niveles de KRS en el nivel 67LR de la membrana y el citoplasma se determinó mediante análisis Western Blot. En la Figura 17, la importancia de KRS para la estabilidad celular de 67LR se determinó por el experimento de pulso-caza. 293 células fueron transíectadas con KRS-si o si el control y la metionina radiactivos se incorporó durante lh. 67LR immunoprecipitado con el anticuerpo reconoce específicamente 67LR (18-F, Santacruz) , se separaron por SDS-PAGE y autorradiografiaron . La represión de KRS con su siARN específico fue confirmada por análisis Western Blot y tubulina es un control de carga.

Las Figuras 18-22 muestran que KRS aumenta la migración celular y metástasis del cáncer a través de 67LR. En la Figura 18, las células A549 fueron transfectadas con los plásmidos indicados, se incubaron en ausencia y presencia de laminina y su efecto en la migración celular se determinó mediante la medición de la migración celular en la cámara Transwell como se describe. Los números de las células que pasan a través de la membrana se contaron y se muestran en cada panel. Los experimentos se realizaron en tres ocasiones. En la Figura 19, las células tratadas como antes se utilizaron para determinar la actividad de MMP-2 y el nivel de zimografia y Western Blot, respectivamente. En la Figura 20 de 4T de carcinoma de mama-1 las células fueron transfectadas con el siARN inyectado por vía subcutánea y se indican en la parte posterior de ratones Balb/C. Después de 21 dias, los pulmones del ratón se aislaron y los nodulos tumorales más de 1 mm de diámetro fueron contados. En la Figura 21, dos 4T diferentes células que expresan una forma estable exógena KRS introducido (KRS-I y -2) se inocularon también como antes y los nodulos tumorales se contaron 30 dias después de la inyección. 4T-1 en las células con el vector vacio se utilizaron como control. En la Figura 22, los niveles de expresión de KRS 67LR y en tejidos de cáncer de pulmón (superior) y de mama (bajo) se compararon mediante la tinción inmunohistoquímica con sus respectivos anticuerpos. 39 tejidos de cáncer de pulmón y 40 tejidos de cáncer de mama fueron sometidos a tinción inmunohistoquímica con anti-KRS y los anticuerpos anti-67LR y sus niveles de expresión se compararon con los de los tejidos normales (9 muestras de cada tejido). Aquí se presentan los pares de representantes de los pacientes de cáncer que se demuestra el sobreexpresión de KRS y 67LR. El resultado del análisis estadístico de la correlación entre KRS 67LR y el nivel se muestra en el cuadro 1.

La Fig. 23 muestra el nivel de la membrana de 67LR que depende de la expresión KRS. 293 células transfectadas con los plásmidos indicados fueron separadas a las fracciones citoplasmáticas y membrana, y los niveles de 67LR, 37LRP y KRS en cada fracción se determinaron mediante análisis Western Blot con los anticuerpos correspondientes.

Las Figuras 24-27 muestran el efecto de presentación de KRS intracelular y extracelular en la migración celular, la síntesis de proteínas y el ciclo celular. En la Figura 24, las células A549 migrantes se incubaron en ausencia de laminina se determinaron mediante la medición de las células migrantes en la cámara Transwell. En la Figura 25, para ver la actividad quimiotáctica de KRS, el medio libre de suero que contiene la concentración indicada KRS fue colocado en la cámara baja y las células A549 se incubaron en la cámara alta en la cámara Transwell. Después de 6 horas de incubación, se contaron las migrantes. En la Figura 26, el nivel KRS en 7A549 fue desregulado y regulado ascendentemente por la introducción de siARN y KRS exógenos (paneles inferiores de las Figuras 26 y 27). Las células transfectadas se incubaron durante 48 y 24 h, respectivamente, y dejaron en ayunas en medio de metionina libre durante 1 hora y la metionina marcada radiactivamente se incorporó durante 2 horas. Después del lavado, las células fueron incubadas durante 4 horas y analizadas en solución de lisis con 0.5% tritón X-100, y la radiactividad incorporada se determinó por recuento de centelleo líquido. En la Figura 27 las células A549 transfectadas como se indica fueron fijadas y teñidas con yoduro de propidio y su ciclo celular se determinó por citometría de flujo.

Las Figuras 28 a 30 muestran el efecto de la supresión de KRS en metástasis del cáncer. En la Figura 28, el efecto de la si-KRS-DRS y en la expresión de sus proteínas blanco fue determinado por análisis Western Blot. La tubulina se utilizó como control de carga. En la Figura 29, la células siARN (lxlO6) transfectadas fueron inyectadas como se describe en los métodos y el efecto de KRS y supresión DRS en el crecimiento del tumor primario se determinó midiendo el peso del tumor y los volúmenes de 21 días después de la inoculación. Cada grupo contiene 5 ratones. En la Figura 30, los pulmones aislados fueron fijados en formol a 10%. Se muestran El número y el tamaño de los nodulos tumorales y metastásicas .

Las Figuras 31 a 33 muestran el efecto de la sobreexpresión de KRS en metástasis del cáncer. En la Figura 31, la sobreexpresión de líneas celulares KRS-1 y -2 fue determinada por análisis Western Blot. En la Figura 32, el efecto de la sobreexpresión de KRS en el crecimiento del tumor primario se comparó también como antes. En la Figura 33, el efecto de la sobreexpresión de KRS en metástasis del cáncer se determinó 30 días después de la inoculación. Cada grupo contuvo 4 ratones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es el resultado de la confirmación de la interacción entre humanos y KRS levadura 37LRP/p40 mediante dos análisis de híbridos.

La Fig. 2 es el resultado de la confirmación de la interacción entre humanos y KRS 37LRP utilizando ensayo desplegable .

La Fig. 3 es el resultado de la confirmación de la región de interacción entre humanos y KRS 37LRP.

La Fig. 4 es el resultado de los análisis de inmunoanálisis para confirmar la unión de KRS a 67LR y 37LRP en las células A549 transfectadas con yc-KRS utilizando anti-Myc y los anticuerpos anti-receptores de la laminina.

La Fig. 5 es el resultado del análisis de Western Blot para confirmar la unión de KRS a 67LR y 37LRP en los lisados de las células-Myc KRS A549 transfectadas .

La Fig. 6 es el resultado de la inmunoprecipitación para confirmar la unión de 67LR y KRS en función del tratamiento con laminina.

La Fig. 7 es el resultado de Western Blot para confirmar el nivel de 67LR, 37LRP y KRS en función del tratamiento con laminina.

La Fig. 8 es el resultado de la tinción de inmunofluorescencia para examinar un nivel de expresión de 67LR y KRS según el tratamiento con laminina en las células A549.

La Fig. 9 es el resultado que confirma el efecto de los inhibidores de quinasa en el nivel de expresión y la membrana citoplasmática de 67LR y KRS.

La Fig. 10 es el resultado de inmunoanálisis para medir el nivel de fosforilación en células que expresan KRS-A549 cuando laminina y el inhibidor de la cinasa fueron tratados con anticuerpos anti-p-Thr, -Ser, y -Tyr acerca de la fosforilación.

La Fig. 11 es el resultado de análisis Western Blot para determinar la unión de KRS fosforilado a 67LR en el KRS que expresan las células A549.

La Fig. 12 es el resultado de análisis Western Blot para confirmar el efecto de la laminina en la unión de KRS y reacciones extrapiramidales .

La Fig. 13 es el resultado de análisis Western Blot para confirmar 67LR y los niveles de KRS en la célula A549 transfectadas con si-control o si KRS-.

La Fig. 14 es el resultado de la citometria de flujo para confirmar el nivel 67LR unido a la membrana en las células A549.

La Fig. 15 es el resultado de la tinción de inmunofluorescencia para confirmar la distribución celular de 67LR en la célula A549 con EV (vector vacio) o KRS.

La Fig. 16 es el resultado de Western Blot para confirmar el efecto de los niveles de KRS en 67LR nivel de la membrana y el citoplasma de las células A549 inhibe la síntesis de proteínas de nuevo.

La Fig. 17 es el resultado del experimento de pulso-caza que confirma la importancia de KRS para la estabilidad celular de 67LR.

La Fig. 18 es el resultado que confirma el efecto de la migración celular, cuando las expresiones de KRS y/o 67LR inhibido.

La Fig. 19 es el resultado de zimografía y análisis Western Blot para determinar la MP-2 y el nivel de actividad cuando las expresiones de KRS y/o 67LR inhibido.

La Fig. 20 muestra el número de nodulos tumorales cuando las expresiones de KRS se inhiben en ratones trasplantados con 4T-1 en las células.

La Fig. 21 muestra el número de nodulos tumorales cuando las expresiones de KRS se han mejorado en ratones trasplantados con 4T-1 en las células.

La Fig. 22 es el resultado de la tinción inmunohistoquímica para confirmar los niveles de expresión de KRS 67LR y en los pulmones y los tejidos de cáncer de mama.

La Fig. 23 es el resultado de análisis Western Blot para confirmar el nivel de la membrana de 67LR depende de la expresión KRS.

La Fig. 24 es el resultado de la medición de la migración de las células A549 en ausencia de laminina .

La Fig. 25 es el resultado de la medición de la actividad quimiotáctica de KRS en la migración celular.

La Fig. 26 es el resultado de confirmar el nivel KRS y la síntesis de proteínas totales en las células A549 por la introducción de siARN y KRS exógenos.

La Fig. 27 es el resultado de confirmar el nivel y KRS Cyle celular en las células A549 por la introducción de siARN y KRS exógenos.

La Fig. 28 es el resultado de análisis Western Blot para confirmar el efecto de la si-KRS-DRS y si en la expresión de las proteínas de su objetivo.

La Fig. 29 es el resultado de confirmar el efecto de KRS DRS y la supresión en el crecimiento del tumor primario en el trasplante de células tumorales.

La Fig. 30 es el resultado de confirmar el número y el tamaño del nodulo tumoral metastásico en el trasplante de células tumorales.

La Fig. 31 es el resultado de análisis Western Blot para confirmar la sobreexpresión de KRS en KRS-1 y -2 líneas celulares .

La Fig. 32 es el resultado de confirmar el efecto de la sobreexpresión de KRS en el crecimiento del tumor primario en el trasplante de células tumorales.

La Fig. 33 es el resultado de confirmar el número y el tamaño del nodulo tumoral metastásico en el trasplante de células tumorales.

MODO DE LA INVENCIÓN En lo sucesivo, la presente invención será descrita en detalle por los ejemplos. Es de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son para fines ilustrativos y no son construidos para limitar el alcance de la presente invención.

MÉTODO EXPERIMENTAL 1. Cultivo de células y materiales A549 y HEK293 se adquirieron de ATCC . La linea celular carcinoma mamario-1 de Ratón 4T fue proporcionada amablemente por el Dr. Seong Jin Kim (Gachun Medical School) . RPMI (para células A549 y 4T-1) y medio Eagle modificado con Dulbecco (para las otras lineas celulares) , que contiene 10% de suero fetal de bovino y 1% antibióticos se utilizan para el cultivo de células. pcADN3.1 que codifica 37LRP fue una especie de regalo del Dr. Hirofumi Tachibana (Universidad de Kyushu) . Se clonaron KRS humanos marcados con Myc y DRS en el sitio EcoRI/Xhol de pcADN3. Los cADN de KRS Murino se obtuvieron por RT-PCR y se clonaron en sitio HindIII/Xhol de pcADN3.1. Los siARNs dirigidos KRS murinos y humanos y DRS fueron adquiridos de Invitrogen. Las secuencias de siARNs estuvieron disponibles bajo petición. El Gen Portero (GTS) y Lipofectamina 2000 (Invitrogen) se usaron como reactivo de transfección . LY294002, U73122 y estaurosporina se compraron de Calbiochem y cicloheximida y laminina (sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm) de Sigma. 2. Inmunoprecipitación y análisis Blot severo.

Las células se lisaron con 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) que contuvo 150 mM NaCl, 0.5% TritonX-100, 0.1% SDS y el inhibidor de proteasa. Los extractos proteicos se incubaron con IgG normal y proteina G agarosa durante 2 horas y luego se centrifuga para eliminar las proteínas de unión de IgG no específica. Los presentes inventores luego se mezclan el sobrenadante con anticuerpos purificados 67LR (F-18, Santacruz) , se incubaron durante 2 horas a 4°C con agitación y se agregó la proteína A de agarosa. Después de lavar tres veces con la solución reguladora de lisis helada, los precipitados se disolvieron en la solución reguladora de muestra de SDS y se separaron por SDS-PAGE. Para determinar la unión de KRS y LR en fracciones celulares diferentes, los presentes inventores transfectaron pcADN3.1-Myc-KRS y separaron la membrana plasmática y el citoplasma de las fracciones utilizando el kit de proteoextracción (Calbiochem) siguiendo las instrucciones del fabricante y la co-inmunoprecipitación se realizó como antes. Para analizar los niveles de proteína, las proteínas extraídas de las células fueron separadas por SDS-PAGE al 10%. El anticuerpo anti-LR (Abcam, ab2508) se utilizó para inmunotransferencia simultánea de 37LRP y 67LR a menos que se especifique lo contrario. Los anticuerpos para hsp90 y Pan-cadherina se compraron de Santacruz. 3. Citometría de flujo Para abordar el ciclo celular, las células cultivadas fueron transíectadas o tratadas con el vector indicado o productos químicos, fijadas con etanol al 70% durante 1 hora a 4°C y se lavaron con agua helada de PBS dos veces. Las células fueron teñidas con yoduro de propidio (50 ug/ml), citrato de sodio al 0.1%, 0.3% NP40 y RNaseA (50ug/ml) durante 40 min y se sometió a la citometría de flujo (FACS Calibur, Beckton-Dickinson ) . Para cada muestra, 20.000 células se analizaron mediante el software Cell Pro Quest. Para el análisis de la cantidad de 67kD LR en la superficie celular, IxlO6 células fueron incubadas con IgG o anticuerpo anti-LR (estirón MLuC5) que el reconocimiento del dominio extracelular del 67LR y luego con anticuerpos FITC secundarios. Después de lavar con PBS, las muestras fueron analizadas por FACS. 4. Inmunofluorescencia y tinción inmunohistoquimica Las células A549 en una funda de cubierta de 9 mm fueron fijadas con alcohol metílico al 70% y se lavaron brevemente con solución reguladora de fosfato salino frío (PBS) . Después de la incubación con la solución reguladora de bloqueo con un 1% CAS, 3% de BSA y 0.5% TritonX-100 durante 30 minutos, las células se incubaron contra anticuerpos KRS (Abcam) , y MLuC-5 (Santacruz) durante 1 hora. Alexa488 y 568 (Invitrogen) se agregaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS frío durante 30 minutos, las muestras fueron observadas por microscopía de barrido láser. El arreglo de diapositivas de tejido de cáncer de mama y pulmón fueron adquiridos de Super-biochip (Corea) y se sometieron a tinción inmunohistoquimica para determinar el nivel de expresión de 67LR y KRS con sus respectivos anticuerpos como se describe (Park, S. G. y otros, Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc . Nati. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6351 (2005) ) . Los análisis estadísticos se realizaron con el de Pearson ?2 y la prueba t de Student para evaluar la correlación y expresión entre KRS y 67LR. Los valores de p <0.05 se consideraron significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS vil.5 (SPSS, Chicago, 111) . 5. Experimento de búsqueda de pulso 293 células fueron transfectadas con si-KRS o si-control (Invitrogen) con lipofectamina 2000. Las células se incubaron con medio libre de metionina durante 1 hora, y [35S] metionina (50 Ci/mL) y se incubó durante 1 h. Después del lavado de la metionina radiactiva con medio fresco, 67LR fue inmunoprecipitado con su anticuerpo específico (Santacruz), separado por 12% SDS-PAGE y sometido a autorradiagrafia con BAS (FLA-3000, Fujifilm). La cantidad de 67LR se cuantificó por programa de calibre múltiple (V3.0, Fuji Film). 6. Análisis de dos híbridos de levadura Los cADN que codifican diferentes fragmentos de KRS humanos fueron obtenidos por PCR con los iniciadores correspondientes. El producto de PCR para KRS fue digerido con EcoRI y Xhol, y se ligó a los sitios correspondientes de pEG202 (para la construcción de las proteínas de la serie LEXA-fusión) y pJG4-5 (para la construcción de las proteínas de fusión-B42) . El ADNc que codifica fragmentos de 37LRP fueron amablemente proporcionados por la Dra. Barbara J. Ballermann (Universidad de Alberta) , y se subclonaron en los sitios EcoRI y Xhol de pJG4-5. Las interacciones entre la serie de dos proteínas de fusión fueron analizadas por la formación de colonias azules en el X-gal-medio que contienen la levadura. 7. Ensayo de unión in vitro.

Los presentes inventores expresaron KRS-GST o GST en cepa de Escherichia coli Rosetta (DE3), mezcló los extractos proteicos de glutatión-sefarosa en la solución reguladora de PBS que contenia 1% Tritón X-100 y 0.5% N-laurilsarcosina a 4°C durante 2h. La presente invención sintetizó 37LRP humanos por parte de la traducción in vitro en presencia de [35S] metionina utilizando pcADN3-37LRP como la plantilla con transcripción rápida de TNT acoplada al sistema de traducción (Promega) . El 37LRP sintetizada se añadió a la mezcla de proteínas GST anterior, se incubó a 4°C durante 4 horas con la rotación en la solución reguladora PBS que contiene 1% Tritón X-100, 0.5% N-laurilsarcosina, 1 mM DTT, 2 mM EDTA y 300 M fluoruro de fenilmetilsulfonilo y se lavó seis veces con la misma solución reguladora que contiene 0.5% de Tritón X-100. Los presentes inventores luego enjuagaron las proteínas unidas a perlas de Sepharosa con la solución reguladora de muestra de SDS, lo separaron por SDS-PAGE y autorradiografiaron . 8. Ensayo de la migración celular La migración celular fue determinada mediante el uso de 24 cámaras Transwell con membranas de policarbonato (tamaño de poro 80 um, Costar) como se describió previamente (Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreteó to trigger proinflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 6356-6361 (2005)). Las células A549 se suspendieron en RPMI libre de suero y se agregó a la cámara alta en lxlO5 células por pozo. Cada uno de los KRS humanos purificados en las concentraciones indicadas, laminina (10 mg/ml) o gelatina (10 mg/ml) fue colocado en el pozo inferior y a las células se les permitió emigrar durante 6 horas a 37 °C en incubadora con C02. Las células fueron fijadas con alcohol metílico al 70% en PBS durante 30 min y se lavaron con PBS tres veces. Las células se tiñeron con hematoxilina (Sigma) durante 10 minutos y se lavaron con agua destilada. Las células no-migrantes fueron retiradas de la cara superior de la membrana con un hisopo de algodón. Las membranas fueron extirpadas de la cámara y montadas con Gel Mount (Biomeda, Foster City, CA) . Las células migrantes (unidas a la cara inferior de la membrana) se contaron en cuatro ámbitos seleccionados al azar en campos de alta potencia (x20) . 9. Zimografia Las células A549 transíectadas con plásmidos que codifican los siARNs indicados y KRS recombinantes (o DRS) se incubaron durante 48 y 24 h, respectivamente, y fueron sembradas (lxlO5 células/pozo) en RPMI que contiene 10% de SFB. Después someter a ayuno a las células en RPMI libre de suero durante 2 horas, se agregó laminina y se incubaron durante 24 horas a 10 mg/ml. 20 1 del medio de cultivo se mezclaron con solución reguladora DU 5x (0.125M Tris-HCl, pH 6.8, que contiene 4% SDS, 20% de glicerol y 0.01% de azul de bromofenol) y se sometieron a SDS al 10%-PAGE que contiene 1 mg/ml de gelatina. El gel se lavó con 2.5% Tritón X-100 dos veces por cada 20 minutos, luego con agua destilada dos veces por cada 20 min y se incubaron con la solución reguladora de reacción (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, que contiene 10 m CaCl2, 150 mM de NaCl, 1M de ZnCl2, 1% Tritón X-100, 0.002% azida sódica) durante 24 horas a 37 °C. El gel se lavó con agua destilada y se tiñeron con azul de Coomassie R250 y decolorados con 35% de metanol. 10. Experimento de metástasis de cáncer in vivo Las células de carcinoma mamario de ratón 4T-1 fueron transfectadas con si-KRS-DRS o si-control y se incubaron durante 24 horas. Las células (lxlO6) fueron inoculadas por via subcutánea en la parte posterior de ratones hembra de 6 semanas de edad c/Balb. El efecto de siARNs a su expresión de destino ha sido probado en las células restantes 48 horas después de la transfección y también en los tumores primarios de 3 a 10 días a intervalos de 2 días después de la inoculación a través de análisis Western Blot con los anticuerpos correspondientes. El crecimiento del tumor fue supervisado por el tamaño del tumor medido tres veces por semana. El peso de todo el cuerpo también se midió al mismo tiempo. Los ratones se sacrificaron 21 dias después de la inoculación y los tumores primarios y los pulmones se extrajeron de los animales. Los pulmones se fijaron en formol al 10% durante veinticuatro horas. El número y el tamaño de los nodulos del tumor metastásico en los pulmones fueron contados y los nodulos tumorales de tamaño superior a 1 mm de diámetro se documentaron por separado. Los tumores primarios también fueron pesados. Para examinar el efecto de la sobreexpresion de KRS en metástasis del cáncer, el vector o vectores vacíos de KRS de murinos se transíectaron en las células 4T-1 y los transíectantes estables fueron seleccionados por la incubación en presencia de G418 durante 3 semanas. Los presentes inventores a continuación, tomaron varias colonias individuales y midieron el nivel de expresión en comparación de KRS por análisis Western Blot. Dos diferentes colonias (KRS-1 y -2) que expresa KRS un nivel superior al de las células de control fueron elegidas y utilizadas para la inoculación. Todos los procedimientos se llevaron a cabo como antes, excepto que los ratones se sacrificaron 30 días después de la inoculación.

Resultado de la experimentación y discusión La interacción específica entre la longitud total y KRS 37LRP fue confirmada por análisis de dos híbridos de levadura. LexA de KRS generaron colonias azules cuando se combinaron con B42-37LRP así como AIMP2, el socio conocido de KRS (Kim, J. Y. y otros. p38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)), pero no con AIMP1 (Fig. 1) . En el enlace de ensayo in vitro, metionina marcada [36S] 37LRP se mezcló con GST-KRS o GST, se precipitó con glutatión-Sepharosa y se sometieron a autoradiografía . 37LRP fue co-precipitada con GST-KRS, pero no con GST (Fig. 2) . dosel mapeo de supresión por dos análisis de levadura de híbridos determinó que la extensión N-terminal de KRS humanos y el dominio extracelular C-terminal de la LR participan en su asociación (Fig. 3) .

Dado que 37LRP citoplasmático se convierte en la membrana integrada 67LR, los presentes inventores comprobaron que KRS se une de manera diferente entre 37LPR y 67LR. KRS-myc fue introducido en células de pulmón y el carcinoma A549 se inmunoprecipitó con el anticuerpo anti-Myc. El análisis Blot presente del lisato de células completas demostró que 67LR existe a un nivel inferior que 37LRP (Fig. 4 a la derecha) . Sin embargo, KRS-Myc se unieron predominantemente a 67LR que a 37LRP (Fig. 4 a la izquierda) . En la presente invención se separaron las células A549 en fracciones de membrana citoplasmática y de plasma y se determina la interacción de yc-KRS con 67LR y 37LRP. 37LRP y 67LR se detectaron principalmente en la membrana citoplasmática y plasma, respectivamente (Fig. 5 derecha) , mientras que KRS existia en ambas fracciones, aunque una parte importante se observó en el citoplasma. Cuando ambas fracciones se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-Myc, la unión de 67LR a la membrana se debe principalmente a al coprecipitación con KRS aunque una baja cantidad de 37LRP en el citoplasma también fue precipitada (Fig. 5 izquierda), lo que indica la interacción preferencial entre 67LR residente en la membrana y KRS. Los presentes inventores entonces analizaron si la distribución celular de KRS se cambia por el tratamiento de laminina en las células A549 por fraccionamiento celular y tinción de inmunofluorescencia . Después del tratamiento con laminina, el nivel de la membrana de KRS y 67LR se incrementó gradualmente con pequeños cambios en el citoplasma y el nivel de KRS y 37LRP o su expresión (Fig. 7 y los datos no mostrados). La tinción de inmunofluorescencia también demostró el cambio de 67LR y KRS hacia el lado de la membrana por el tratamiento laminina (Fig. 8, rojo y verde, respectivamente) . Los presentes inventores entonces analizaron si la translocación de la membrana de KRS implica la modificación post-traduccional. A pocas quinasas diferentes, tales como fosfoinositidos 3-0H-quinasa (PI3K) (Shaw, L. M. , Rabinovitz, I., Wang, H. H., Toker, A. & Mericurio. A.M. Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasión. Cell 91, 949-960 (1997)), la proteína quinasa C (PKC) (Li, Y. Q. et al. Protein kinase C mediates the signal for interferon- gamma mRNA expression in cytotoxic T cells after their adhesión to laminin. Immunology 93, 455-461 (1998)) y gamma fosfolipasa C (PLC-gamma) (Vossmeyer, D. , Hofmann, W., Loster, K. , Reutter, W. & Danker, K. Phospholipase C-gamma binds alphalbetal integrin and modulates alphalbetal integrin-specific adhesión. J. Biol. Chem. 277, 4636-4643 (2002); Kanner, S. B., Grosmaire, L. S., Ledbetter, J. A. & Damle, N. K. Beta 2- integrin LFA-I signaling through phospholipase C-gamma 1 activation. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90, 7099-7103 (1993)) se sabe que son activadas por la laminina. Para ver si alguna de estas quinasas están involucradas en la translocación de membrana dependiente de laminina de KRS, los presentes inventores bloquearon cada una de estas quinasas con sus inhibidores específicos y comprobaron cómo estos tratamientos que afectan a la translocación de la membrana de KRS. Se aumentó KRS dependiente de laminina 67LR y en la fracción de la membrana se bloqueó en presencia de LY294002, el inhibidor de PI3K, mientras que las células tratadas con U73122 o estaurosporina todavía mostraron la inducción dependiente de laminina 67LRS como el control de las células (Fig. 9 superior y los datos no se muestran) . Ninguna de estas quinasas afectaron el nivel citoplasmático de KRS (Fig. 9 inferior). Estos resultados implican que PI3K debe participar en la fosforilación inducida por laminina de KRS. De hecho, KRS es fosforilado en treonina y serina, pero no en tirosina se incrementó en un tratamiento de laminina, pero se bloqueó en presencia de LY294002 mientras estaurosporina no ha dado ningún efecto (Fig. 10). Los inventores presentes a continuación, comprobaron si la fosforilación inducida por laminina de KRS seria necesaria para su interacción con el 67LR. El tratamiento de LY294002 suprimió la inducción de laminina de KRS en asociación 67LR (Fig. 11) . Dado que la KRS citoplasmática está anclada al complejo multi-ARS, los presentes inventores comprobaron también si la fosforilación de la KRS dependiente de laminina afectaría a su asociación con el complejo multi-ARS, por co-inmunoprecipitación de KRS con glutamil-prolil-tRNA sintetasa (EPR) , otro componente de la enzima del complejo. En ausencia del compuesto LY, el tratamiento de laminina disminuyó la asociación de KRS con EPRS con el aumento simultáneo de KRS en la fracción soluble inmuno-agotada (Fig. 12 líneas de la izquierda en los paneles superior e inferior) . Por el contrario, la unión de KRS a EPRS no se vio afectada por el tratamiento con laminina cuando las células fueron pre-tratadas con el compuesto LY294002 (Fig. 12 líneas de la derecha en los paneles superior e inferior) , lo que sugiere que en la fosforilación de KRS es necesario la disociación de KRS dependiente de laminina del complejo.

Los inventores presentes a continuación, comprueban si KRS afectaría el nivel de la membrana de las células A549 en 67LR. El nivel de 67LR se incrementó por laminina, pero el efecto de laminina fue abolido cuando KRS fue suprimido con siARN (Fig. 13 izquierda), lo que indica la importancia de KRS en el aumento dependiente de laminina de 67LR. La presente invención también supervisó 67LR unido a la membrana por citometría de flujo. El nivel de 67LR en la membrana aumenta y disminuye cuando las células fueron transíectadas con KRS y si-KRS, respectivamente (Fig. 14). La distribución celular del receptor de la laminina se comparó entre células A549 transfectadas con EV o KRS por tinción de inmunoflurescencia . El receptor de laminina fue teñido más densamente en las regiones de membrana plasmática en las células que sobreexpresan KRS comparado con la de las células control (Fig. 15). La correlación positiva entre el nivel de 67LR y KRS se confirmó mediante la medición de 67LR en la membrana y el citoplasma de acuerdo con la variación del nivel de KRS (Fig. 23) .

Los inventores de la presente han investigado cómo KRS mejora el nivel de membrana 67LR. KRS puede estimular la síntesis 67LR a través de la transcripción o la conversión de 37LRP. Sin embargo, la transfección de KRS no aumentó la transcripción LR (datos no mostrados) , con exclusión de su posible papel en la regulación de la transcripción LR. Además, dado que KRS mostró unión pobre a 37LRP en el citoplasma (Fig. 4 y 5) , es poco probable que estimule el proceso de conversión de 37LRP a 67LR. Los inventores de la presente también revisaron si KRS puede mediar acilación grasa de 37LRP dado que esta modificación se sabe que es un prequisito para la conversión de 37LRP a 67LR (Landowski, T. H., Dratz, E., A. & Starkey, J. R. Studies of the structure of the metastasis-associated 67 kDa laminin binding protein: fatty acid acylation and evidence supporting dimerization of the 32 kDa gene product to form the mature protein. Biochemistry 34, 11276-11287 (1995); Buto, S. y otros, Formation of the 67- kDa laminin receptor by acylation of the precursor. J. Cell. Biochem. 69, 244-251 (1998)). En nuestro análisis, KRS no afectó la acilación grasa de 37LRP (datos no mostrados) . Dado que KRS puede extender la estabilidad celular de 67LR unido a membrana, los inventores de la presente revisaron si KRS podría interferir con endocitosis de 67LR unido a membrana. Para ver esta posibilidad, los inventores de la presente disminuyeron la síntesis de proteína de nuevo con cicloheximida y examinaron si KRS podría afectar el nivel de 67LR en membrana y citoplasma. Cuando la expresión de KRS se suprimió con su siARN específico, el nivel de membrana de 67LR se disminuyó con el incremento concurrente de 67LR en la fracción citoplásmica (Fig. 16 izquierda) Inversamente, la sobre-expresión de KRS incrementó el nivel de membrana de 67LR como antes (Figura 16 derecha) . Con base en estos resultados, KRS parece extender la residencia de membrana de 67LR bloqueando su reentrada al citoplasma. Los inventores presentes investigaron además el efecto de KRS sobre el cambio de 67LR por experimento de búsqueda de pulsos. La síntesis de proteína naciente se marcó con metionina radioactiva y luego se bloqueó con cicloheximida . Luego, se monitoreó la desaparición de 67LR por autoradiografía en intervalos de tiempo. 67LR disminuyó rápidamente cuando KRS se suprimió con su siARN mientras que su nivel se sostuvo bien en células de si-control durante este marco de tiempo (Figura 17). Por lo tanto, parece que KRS extiende su vida media de 67LR a través de su asociación con 67LR en membrana de plasma, inhibiendo así la endocitosis de 67LR aunque el proceso de degradación de 67LR necesita investigación adicional.

Los inventores de la presente han investigado si el nivel de expresión de KRS podría afectar la migración de células A549 dependiente de laminina usando análisis de membrana Transwell. La migración de las células de control se incrementó aproximadamente 6 veces en promedio por tratamiento de laminina (Figura 24 y Figura 18). Sin embargo, la migración de células que dependen de laminina se redujo cuando KRS se suprimió con su siARN especifico (Figura 18, si-control y si-KRS) . Inversamente, el efecto de KRS en la migración celular disminuyó cuando el receptor de laminina se suprimió con su siARN (Figura 18 si-LR, panel inferior) . Dado que KRS también se secretó en algunas células de cáncer como citoquina (Park, S. G. y otros, Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102, 6356-6361 (2005)), los inventores de la presente revisaron si KRS extracelular puede afectar la migración celular. Cuando las células A549 fueron tratadas con KRS purificado a diferente concentración, la migración celular fue afectada poco (Figura 25), excluyendo el efecto extracelular de KRS en este análisis. Además, la síntesis de proteína celular y el ciclo celular o se influencio por supresión o sobre-expresión de KR durante el período de experimentos (Figura 26 y 27), indicando que la migración de células dependiente de KRs no resultó de su efecto de estos procesos. Dado que el tratamiento de alúmina da como resultado la activación de MMP-2 (metaloprotenasa-2 de matriz) (Givant-Horwit z, V., Davidson, B. & Reich, R. Laminin-induced signaling in tumor cells; the role of the M(r) 67,000 laminin receptor. Cáncer Res. 64, 3572- 3579 (2004)), los inventores de la presente revisarn el efecto de kRS sobre la activación dependiente de laminina de MMP-2 usando análisis de zimografia in vitro. La actividad de MMP-2 se mejoró por laminina, que se bloqueó en presencia de si-KRS (Figura 19 izquierda), pero se incrementó por sobre-expresión de KRS (Fig. 19 derecha) . El nivel de expresión de MMP-2 no fue afectado por KRS (Figura 19 inferior) .

Dado que KRS puede inducir la migración celular vía 67LR que está implicada en metástasis de cáncer, los inventores de la presente examinaron si la metástasis de cáncer también se afectaría por el nivel de expresión de KRS usando células de carcinoma mamario de ratón 4T-1 que son altamente metastásicos para el pulmón. Los inventores de la presente suprimieron KRS o DRS (aspartil-tARN sintetatasa) , otro componente de complejo multi-ARS, con su siARN específico y se comparó como la des-regulación de KRS y DRS puede afectar la metástasis de cáncer. Después de confirmar el efecto de supresión de si-KRS y -DRS por Análisis Western (Figura 28), cada una de estas células y las células con si-control se inyectó subcutáneamente en la piel posterior de ratón Balb/c. las tres células inyectadas desarrollaron tumores que a vista del inventor se ven similares y tienen volumen similar (Figura 29), sugiriendo que el nivel de KRS no afecta el crecimiento de tumores primarios. Los pulmones se aislaron 21 días después de la inoculación y los números de los nodulos del tumor metastásico (mayor a 1 mm de diámetro) se compararon ente los tres grupos. El número de nodulos metastásicos disminuyó significativamente por la supresión de KRS comparado con los obtenidos de las células de control y suprimidas por DRS (Figura 21 y Figura 33) . Inversamente, los inventores de la presente examinaron si la sobreexpresion de KRS podría incrementar la metástasis de cáncer usando el mismo método que antes. Los inventores de la presente establecieron primero que las líneas de células 4T-1 sobreexpresan establemente KRS por transfección de plásmido que codifica KRS y tamiz de G 18. La sobreexpresion de KRS en las líneas celulares establecidas se confirmaron por análisis Western y los inventores presentes aleccionaron las dos células adherentes (KRS-1 y KRS-2) expresando KRS a una cantidad superior que las transfectadas con el vector vacío (Figura 31) . Estas células también generaron tumores primarios de peso y tamaño similar (Figura 32). Cuando los inventores de la presente examinaron los pulmones s en 30 días después de la inoculación de las células, las células que sobreexpresan KRS generaron más módulos comparado con las células de control (Figura 21 y Figura 33) . Los resultados sugieren que KRS puede inducir metástasis de cáncer in vivo.

Dado que la sobreexpresion específica para cáncer de receptor de laminina se ha observado frecuentemente (Fontanini, G. y otros, 67-Kilodalton laminin receptor expression correlates with worse prognostic indicators in non-small cell lung carcinomas. Clin. Cáncer Res. 3, 227-231 (1997), Viacava, P. y otros, The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression. J. Pathol. 182, 36-44 (1997), los inventores de la presente analizaron y la sobreexpresión de 67LR también se asoció con el de KRS por tinción inmunohistoquimica de 67RL y KRS en cánceres de pulmón y mama como los ejemplos. Entre los tejidos de cáncer de pulmón examinados, la sobreexpresión de 67LR se observó en 21 casos (54%) , en los cuales el nivel de KRS también se incrementó en 19 casos (aproximadamente 90%) (Tabla 1 y Figura 22 superior) . De la misma manera, los 21 caso de los 40 pacientes con cáncer de mama examinados mostraron sobre-expresión de 67LR. En estos casos, los 21 casos también mostraron nivel incrementado de KRS (Tabla 1 y Figura 22 inferior) . En ambos casos, la unión hermética entre las expresiones de las dos proteínas se muestra aunque será determinado si su coexpresión en cáncer está implicada realmente en metástasis.

Tabla 1 En este momento, se puede hacer referencia como sigue con respecto a la Tabla 1. La Tabla 1 es la correlación entre expresión de 67LR y KRS en tejidos de cáncer. Para probar si el nivel de expresión de 67LR se asocia con el de KRS, los microanálisis de tejido de pacientes con cáncer de pulmón y mama se sometieron a tinción inmunohistoquimica con sus anticuerpos respectivos y se determinaron los niveles de expresión relativos de las dos proteínas. El anticuerpo MluC5 se usó para inmunodetección de 67LR. El nivel de expresión se determinó por intensidad de tinción de espécimen y se clasificó en 4 grupos (clasificación 0, 1, 2, y 3) . En la evaluación final, las muestras se dividieron en el grupo normal (con una calcificación de 0 ó 1) y de sobreexpresión (con una clasificación de 2 ó 3) . Se realizaron análisis estadísticos usando la prueba Pearson x2 y Prueba Estudiante t para evaluar la correlación entre la expresión de 67LR y KRS . Los valores P < 0.05 se consideraron importantes. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando software SPSS vil.5 (SPSS, Chicgo, 111).

Muchos factores traslacionales incluyendo componentes ribosomales son peliotrópicos (Wool, I. G. Extraribosomal functions of ribosomal proteins Trends Biochem. Sci . 21, 164-165 (1996)) y se asocia con varios tumorigénesis (Lee, S. W., Kang, Y. S. & Kim, S. Multifunctional proteins in tumorigénesis: Aminoacyl-tRNA synthetases and translational components. Curr. Proteomics 3, 233-247 (2006) ) . Los inventores de la presente demostraron que dos factores traslacionales, KRS y p40/37LRP, trabajan juntos para la migración celular y metástasis de cáncer in vivo (Figura 18 y 22). En este momento, los inventores de la presente no conocen si la asociación potencial de estas dos proteínas es la coincidencia evolutiva o tiene otra razón fisiológica en la síntesis de proteína que necesita entenderse en el futuro. Entre los componentes del complejo multi-ARS, KRS es la proteína más estale y requerida para la estabilidad de otros componentes (Han, J. M. y otros, Hierarchical Network between the components of the multi-tRNA synthetase complex: Implications for complex formation. J. Biol. Chem. 281, 38663-38667 (2006)), implicando su potencial para estabilizar las proteínas asociadas. Los inventores de la presente mostraron que KRS también extiende la estabilidad celular de 67LR (Figura 17).

La asociación de KRs con 67LR puede tener diferentes implicaciones funcionales. Bajo condición fisiológica, una porción de KRS citoplásmica se fosforila y moviliza a la membrana de plasma por varias señales que estimulan el crecimiento o de supervivencia para unirse a 67LR que media la señal de laminina. En las células de cáncer, el nivel de membrana de KRS puede incrementarse anormalmente ya sea debido a su sobreexpresión o su traslocación de membrana constitutiva resultado de las cinasas corriente arriba hiperactivadas tales como PI3K. Tal vez, estos KRS en exceso pueden dirigirse a la membrana plasmática que se recluta a 67LR o se secreta. Además, no importa si la activación desregulada de PI3K con frecuencia se asocia con el crecimiento tumoral y metástasis (Wymann, M. P. & Marone, R. Phosphoinositide 3-kinase in disease: timing, location, and scaffolding. Curr. Opin. Cell Biol . 17, 141-149 (2005) ) y la laminina promueve invasión de cáncer vía PI3K (Baba, Y. y otros, Laminin-332 promotes the invasión of oesophageal squamous cell carcinoma via PI3K activation. Br. J. Cáncer 98, 974-980 (2008)). La activación constitutiva de PI3K puede conducir a la fosforilación de KRS que podría ser movilizada a la membrana. Cualquiera o ambas condiciones podría contribuir al incremento de 67LR en la membrana de plasma, amplificando si el señalamiento de laminina para metástasis de cáncer. Se ha investigado bastante para controlar la difusión metastásica de cáncer. A este respecto, la actividad de KRS en metástasis de cáncer vía 67LR puede proveer una ventana previamente no explorada para diagnóstico de cáncer y terapia.

APLICACIÓN INDUSTRIAL Como se puede observar de lo anterior, los inventores de la presente describieron que KRS de la invención interactúa con 67LR a través de la traslocación de KRS en membrana de plasma y por lo tanto incrementa la migración de células tumorales (o de cáncer), teniendo asi un efecto sobre metástasis de cáncer. Además, también se describe que la sobreexpresión de KRS o inhibición de la expresión de KRS puede modular la metástasis de células tumorales (o cancerígenas) a través de experimentos in vivo usando ratones. Consecuentemente, la metástasis de cáncer y migración de células de cáncer puede controlarse usando KRS de la invención, además se puede controlar el metabolismo celular relacionado con el receptor de laminina (67LR) de la membrana de plasma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un método para controlar metástasis de cáncer modulando un nivel celular de lisil tARN sintetasa (KRS) .

2. - El método para controlar metástasis de cáncer de la reivindicación 1, que inhibe metástasis de cáncer mediante la reducción de un nivel celular de lisil tARN sintetasa .

3. - El método para controlar metástasis de cáncer de la reivindicación 1, que incrementa la metástasis de cáncer incrementando un nivel celular de lisil tARN sintetasa .

4. - El método para controlar metástasis de cáncer de la reivindicación 1, en donde la lisil tARN sintetasa consiste de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1.

5. - Un método para controlar migración de células de cáncer modulando un nivel celular de lisil tARN sintetasa (KRS) .

6. - El método de la reivindicación 5, que inhibe la migración de células de cáncer mediante la reducción de un nivel celular de lisil tARN sintetasa.

7. - El método de la reivindicación 5, que inhibe la migración de células de cáncer mediante el incremento de un nivel celular de lisil tARN sintetasa.

8. - El método de la reivindicación 5, en donde la lisil tARN sintetasa consiste de la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 1.

9. - Una composición para prevenir y tratar cáncer que comprende un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleotido ligado operablemente al mismo, o un anticuerpo contra KRS como un ingrediente efectivo, en donde el polinucleotido codifica ARN en contrasentido o siARN contra el polinucleotido de KRS.

10. - La composición de la reivindicación 9, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de la vesícula biliar, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer cervical, el carcinoma de endometrio, cáncer de coriocarcinoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de tiroides, tumor de cerebro, cabeza o cuello, melanoma maligno, linfoma, anemia aplásica

11. - Un método para prevenir y tratar cáncer que comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad efectiva de un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleótido ligado operablemente al mismo, o un anticuerpo contra KRS, en donde el polinucleótido codifica ARN en contrasentido o siARN contra el polinucleótido de KRS.

12. - Uso de un vector de expresión que comprende un promotor y un polinucleótido ligado operablemente al mismo, o un anticuerpo contra KRS para la preparación de un agente anticancerígeno, en donde el polinucleótido codifica ARN en contrasentido o siARN contra el polinucleótido de KRS .

13. - Un método para tamizar un agente que modula metástasis de cáncer o migración de células de cáncer que comprende : (a) poner en contacto un agente de prueba con KRS en presencia del agente de prueba; (b) medir actividad de KRS y seleccionar un agente de prueba que cambia actividad de KRS; y (c) probar si el agente seleccionado regula metástasis tumoral o migración de células de cáncer.

14. - Un método para tamizar un agente que inhibe una interacción entre KRS y 67LR comprendiendo: (a) ponerse en contacto con un agente de prueba con KRS y receptor de laminina (67LR) en presencia del agente de prueba; y (b) probar si el agente seleccionado regula una interacción entre KRS y receptor de laminina.

15.- Un método para diagnosticar cáncer de pulmón o cáncer de mama que comprende : (a) analizar la sobreexpresion de 67LR en una muestra; y (b) analizar la sobreexpresion de KRS en la muestra sobre-expresada de 67LR.