MX2010013988A - Cepa de lactococcus lactis productora de nisina y empaque activo biodegradable comestible que comprende dicha nisina. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe y reclama una cepa de Lactococcus lactis productora de nisina y un empaque activo biodegradable comestible a base de proteínas de suero de leche con dicha nisina incorporada, así como el uso de dicho empaque en la conservación de alimentos.

Description

Cepa de Lactococcus lactis productora de nisina y empaque activo bíodegradable comestible que comprende dicha nisina.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención pertenece al campo de la biotecnología, especialmente de la biotecnología de alimentos. Se refiere a una cepa novedosa de Lactococcus laciis productora de nisina y a un empaque activo bíodegradable que contiene dicha nisina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La higiene en el manejo de alimentos perecederos ha sido una preocupación constante en el campo de la química de alimentos, ya que hay que preservar las características organolépticas de los mismos y dar protección al producto sin afectar la salud del consumidor.

En este sentido, existen muchos métodos para preservar alimentos, que van desde la esterilización, la pasteurización o la adición de productos químicos.

Sin embargo, se han tratado de desarrollar nuevas formas de conservación de alimentos que resulten inocuas para el consumidor y aumenten la vida de anaquel del producto sin afectar sus propiedades o apariencia. Así, se ha investigado en el campo de sustancias químicas con propiedades antimicrobianas. Dentro de estas sustancias se encuentran los lantibióticos como sustancias activas derivadas de microorganismos. Entre los microorganismos productores de lantibióticos, las bacterias ácido lácticas (BAL) tienen un papel muy importante. Las BAL son comúnmente encontradas en los alimentos: productos cárnicos, lácteos, vegetales, frutas, vegetales en descomposición, y en el tracto respiratorio, intestinal y genital de humanos y animales. El ácido láctico es el principal y más abundante agente antimicrobiano producido por BAL, sin embargo también son capaces de sintetizar otras sustancias tales como substancias inhibitorias además de los ácidos orgánicos: por ejemplo, etanol, peróxido de hidrógeno, diacetilo, reuterina y bacteriocinas (O'Sullivan y col., 2002) .

Los lantibióticos son una clase de bacteriocinas, agentes antimicrobianos de naturaleza proteica. La nisina es un lantibiótico, y es producido por diversas cepas bacterianas, entre ellas algunas de Lacrococcus lactis. Asimismo, la nisina ha sido usada como conservador en la industria alimentaria desde hace más de 50 años en más de 80 países. Una de las características más importantes de la nisina, es que no se han generado cepas bacterianas resistentes a ellas, por lo que sigue siendo ampliamente utilizada en el campo de los alimentos.

Recientemente se han desarrollado nuevas tecnologías para preservación de alimentos que involucran tratamientos no térmicos, como el uso de altas presiones (HPP), que pueden evitar la pérdida y biodisponibilidad de los componentes de los mismos. Estos métodos se han estudiado en combinación con agentes antimicrobianos naturales como las bacteriocinas (nisina), para incrementar su efectividad (Avery y Buncic, 1997; Zapico y col., 1998; Chunk y col., 2005).

Actualmente, para conservar los alimentos se cuenta con una tecnología que se basa en la combinación de varios factores de conservación, en donde la interacción de estos factores constituye la llamada "Tecnología de las Barreras Múltiples" cuyo objetivo es asegurar la calidad e inocuidad de los alimentos sin menosprecio de su calidad sensorial (Leistner y Gorris, 1995; Leistner, 2000). La tecnología de las barreras múltiples combina diferentes métodos de conservación para inhibir el crecimiento microbiano. El efecto combinado de varios mecanismos de acción puede evitar la presencia de microorganismos resistentes; entre estas barreras se pueden incluir los métodos de conservación biológica, como el uso de las bacterias ácido lácticas, sus metabolitos o ambos.

Las bacteriocinas no pueden, sin embargo, por sí solas asegurar la inocuidad de los alimentos. Se ha sugerido que la aplicación de bacteriocinas en combinación con otros agentes antimicrobianos y mediante el uso de nuevas tecnologías, como los materiales de empaque activos puede resultar en un aumento de la actividad antimicrobiana, reduciendo tratamientos severos, extendiendo la vida de anaquel y asegurando la inocuidad de los alimentos. Además las BAL y muchos de sus metabolitos poseen estatus GRAS (generalmente reconocidos como seguros) según la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EUA, por lo que han sido ampliamente utilizadas en la bioconservación de los alimentos (FDA, 2006).

El interés en nuevos métodos biológicos de conservación ha aumentado recientemente, basado en investigaciones que indican que microorganismos antagonistas como las BAL o sus metabolitos antimicrobianos pueden tener cierto potencial como conservadores naturales para controlar el crecimiento de bacterias patógenas en alimentos. (Delves-Broughton, 1990;. Cintas y col., 1995; Schillinger y col., 1996; Doyle, 2002).

Así, de acuerdo a lo anterior, pueden considerarse varias estrategias para la aplicación de bacteriocinas en la conservación de alimentos: inoculación de BAL bacteriocinogénicas como cultivo iniciador (producción ¡n s/tu); adición de la bacteriocina pura o semi-pura (nisina); o uso de un producto fermentado previamente con cepas BAL productoras de bacteriocinas (libre de células), en polvo, como ingrediente en el procesamiento de alimentos (Schillinger y col., 1996) La eficiencia de la actividad antimicrobiana de las bacteriocinas depende de la forma de uso y el vehículo que se utilice en los alimentos. Chi-Zhang y col. (2004), investigaron la actividad antimicrobiana de la nisina, usando dos métodos de uso. Una de ellas fue adición directa y la otra liberación gradual (simulando la liberación de materiales de empaque activos) y finalmente un sistema combinado de ambos. Se concluyó que el uso combinado de suministro directo y gradual en un alimento puede ser una mejor manera de prevenir el crecimiento de L. monocytogenes.

Uno de los conceptos innovadores respecto a esta última estrategia que han sido introducidos ppra el control de microorganismos indeseables en alimentos, es a través del uso de empaques activos como una respuesta para brindar seguridad y detener la descomposición. El uso de películas como empaques activos que contienen sustancias antimicrobianas pueden ser eficientes en la reducción de la tasa de crecimiento, la extensión de la fase de adaptación (lag) o en la inactivación de microorganismos patógenos (Sebti y col., 2003).

El uso de agentes antimicrobianos se ha enfocado a la adición directa a coberturas para alimentos o empaques. También pueden incorporarse agentes antimicrobianos a la estructura del material de empaque en forma de película lo cual permite el contacto con la superficie del alimento que puede ayudar al control de crecimiento de patógenos (Padgett y col., 1998) .

Se han utilizado conservadores directamente en la superficie de alimentos o por inmersión directa con agentes tales como sorbato de potasio. Los compuestos naturales, tales como nisina y lisozima, se han estudiado como conservadores potenciales (Padgett y col., 1 998) .

Con respecto a las películas activas, se han realizado esfuerzos para encontrar nuevos usos para las proteínas del suero de leche, incluyendo su uso para formar películas comestibles y biodegradables. Las películas tienen potencial para ser utilizadas como coberturas para alimentos, resultando un empaque biodegradable con propiedades mecánicas y de barrera (Lin y Krochta, 2003). Las películas a base de aislados proteínico de suero (APSI), son transparentes, suaves, flexibles, con excelente fuerza mecánica y barreras al oxígeno, lípidos y aroma (Pérez-Gago y Krochta, 1999, Regalado y col., 2006). Para impartir mayor flexibilidad es necesaria la incorporación de plastificantes como el glicerol y el sorbitol. Sin embargo, en un estudio de McHugh y col. ( 1 94) acerca de los materiales de empaque a base de APS, y observaron que usando glicerol los materiales eran más permeables al oxígeno que los que contenían sorbitol, en concentraciones similares. Los autores reportaron que materiales a base de APS, tienen una gran permeabilidad al vapor de agua debido a su carácter hidrofílico, lo que puede propiciar varias reacciones de deterioro en carnes empacadas con este sistema. Sin embargo la incorporación de compuestos hidrofóbicos como la cera de abeja pueden reducir en ordenes de hasta diez veces esta propiedad.

El uso de agentes antimicrobianos se ha enfocado a la adición directa a coberturas para alimentos o empaques. También pueden incorporarse agentes antimicrobianos a la estructura del material de empaque en forma de película lo cual permite el contacto con la superficie del alimento que puede ayudar al control de crecimiento de patógenos (Padgett y col., 1998, Quintero-Salazar y col., 2005). Sin embargo, al momento de agregar la bacteriocina, se ha visto que pierden las características mecánicas de flexibilidad y flexibilidad, por lo que existe la necesidad de contar con una bacteriocina que no afecte la estructura de dichas películas.

El estudio de nuevas bacteriocinas grado alimenticio como conservadores, así como el desarrollo de sistemas apropiados de su incorporación en materiales de empaque de alimentos, son aspectos importantes de la aplicación de la microbiología y la biotecnología para la implementación y mejora de una eficiente tecnología de barreras en la conservación de los alimentos de nuestro país.

Así, uno de los problemas no resueltos dentro del estado de la técnica es la obtención de una bacteriocina que sea estable y que se pueda incorporar a una película o empaque para alimentos sin afectar las características del mismo, lo cual no ha sido posible debido a que la nisina comercial provoca la cristalización del empaque activo afectando la flexibilidad y las propiedades mecánicas y físicas de los materiales, por lo que no ha sido posible obtener un empaque estable, flexible y con la cantidad de nisina adecuada para la conservación de alimentos.

De tal forma, la presente invención describe y reclama una cepa de Lacfococcus lactis capaz de producir una nisina que al ser incorporada dentro de un empaque activo no solo no afecta las propiedades mecánicas y físicas del empaque, sino que permanece activa y estable por largos periodos de tiempo, siendo estos de al menos dos años. Por lo que se considera que por medio de la presente invención se soluciona la problemática de obtención de un empaque activo realmente útil y estable para la industria de la preservación de alimentos, tal como lácteos, cárnicos o vegetales, entre otros.

Dentro del estado de la técnica, se han descrito diversas cepas de Lactococcus lactis para usos muy particulares, tales como preparación de biopolímeros de glucosa (US 2007141 667 (Al )), producción de bacteriocinas para proteger ciertos alimentos (KR 20020091 98 (A), WO 2006033352 (Al ), JP 2005341844 (A), JP 20051 10566 (A), US 691 6647 (Bl ), US 5817362, JP 7039355 (A)) o proveer cierta característica particular a los alimentos (US 2003186392 (Al )) o combinación de diferentes especies bacterianas para preservar alimentos.

Ahora bien, en cuanto al estado de la técnica en cuanto a empaques activos, podemos citar a manera de ejemplo los siguientes documentos, mismos que no representan arte previo para la presente solicitud: los documentos CN 1912245 .y CN 1539333 describen empaques activos para preservar pescado, el cual tiene ingredientes totalmente diferentes al de la presente invención y no incluye ningún activo antimicrobiano. El documento KR 20000065347 describe un empaque activo hecho con proteína de leche, el cual no contiene los mismos elementos de la presente invención ni un agente antimicrobiano que inhiba el crecimiento de microorganismos.

De la revisión anterior concluye que los anteriores documentos no afectan la patentabilidad de la presente invención, toda vez que se trata de ejemplos particulares de especies bacterianas con características propias, mismas que no son iguales a la de la cepa de la presente solicitud, ya que la bacteriocina de la especie de Lactococcus lactis aquí descrita y reclamada es estable y activa durante al menos un año en diversas condiciones y es ¡ncorporable a una película de empaque biodegradable sin afectar las características físicas y mecánicas de dicha película de empaque, ya que no forma cristales que desestabilicen la estructura y aún así conservar sus características físicas, químicas y antimicrobianas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS FIGURA 1. Microscopía electrónica de barrido (MEB) de las diferentes formulaciones de películas a base de aislado de proteína de suero . A) Incorporación de sorbitol a i) xl 0,000 y ii) x2,000 sección transversal. (APSS) B) Incorporación de suero de abeja a i) xl 0,000 y ¡i) x5,000 sección transversal. (APSSC) C) Incorporación de nisina a i) xl 0,000 y ii) x5,000 sección transversal. (APSSCN).

FIGURA 2. Tamaño de partícula de la solución filmogénica a base de aislado de proteína de suero incorporado con nisina.

FIGURA 3. Evaluación de la actividad antimicrobiana de los materiales de empaque incorporados con nisina. l a) Brochotríx thermospacta I b) Brochotríx thermospacta y empaque con nisina. 2a) Usteria monocytogenes 2b) Usteria monocytogenes y empaque con nisina. 3 a) Sthapylococcus aureus 3b) Sthaphylococcus aureus y empaque con nisina. 4 a) Micrococcus luteus 4b) Micrococcus luteus y empaque con nisina.

FIGURA 4. Empaque activo biodegradable comestible a base de proteínas de suero sobre carne de cerdo. C: Control sin empaque I: Inoculada con B. thermosphacta 105 ufc/cm2 sin recubrimiento. R: Recubierta sin nisina de Lacfococcus lactis NRRL B-50307 e inoculada con 105 ufc/cm2 de B. thermosphacta. A: Recubierta con nisina de Lacfococcus lactis NRRL B-50307 e inoculada con 105 ufc/cm2 de B. thermosphacta .

FIGURA 5. Efecto del empaque activo biodegradable a base de proteínas de suero de leche adicionada con nisina sobre carne de cerdo empacada al vacío inoculada con B. thermosphacta y almacenada a 4°C.

- ·- C: control-sin recubrimiento, sin inocular; -T- I: Inoculada-sin recubrimiento; -¦- R: Recubierta-sin nisina de Lactococcus lactis NRRL B-50307; -?- A: Recubierta, con nisina de Lactococcus lactis NRRL B-50307.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De acuerdo con las modalidades de la presente invención se describe y reclama una cepa de Lactococcus lactis UQX, la cual fue depositada con el número de acceso NRRL B-50307, misma que produce una bacteriocina, a saber nisina.

. Dicha nisina aislada de la cepa antes mencionada es incorporada a un empaque activo biodegradable que comprende aislado de proteína de suero, sorbitol y cera de candelilla, que comprende de 6 a 14 % p/v de dicho aislado de proteína de suero, de 5 a 14% p/v de dicho sorbitol, de 0.5 a 2.5% p/v de dicha cera de candelilla y en donde dicha nisina está en una cantidad de entre 100 a 5000 Ul/ml de dicha nisina.

En otro aspecto de la invención, se describe y reclama un método para preparar el empaque activo biodegradable, caracterizado porque comprende los pasos de: a) disolver aislado de proteína de suero y sorbitol en agua destilada; b) ajustar el pH de la solución a 6.0 a 9.0; c) calentar la • solución a una temperatura de entre 60 y 90°C durante de 20 a 40 minutos; d) incorporar la cera de abeja o candelilla; e) homogenizar la mezcla; e) incorporar la nisina producida por la cepa de Lactococcus ¡aclis NRRL B- 50307; f) desgasificar; g) vaciar y h) secar.

Por último, es una modalidad adicional de la presente invención describir y reclamar el uso de dicho empaque activo biodegradable para recubrir alimentos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Obtención de la cepa Lactococcus Iactis UQX La cepa de Laciococcus ¡aclis UQX fue aislada de un queso fresco artesanal tipo panela, sin cultivos iniciadores, elaborado en el estado de Querétaro. La cepa fue caracterizada inicialmente por su perfil bioquímico, mediante el sistema API 50 CHL, y posteriormente por la similitud en la secuencia de 1 ,500 nucleotidos de la fracción 1 6S rRNA ribosomal (Midilabs, DE, EUA), mostrando una similitud de más de 99% para identificar la cepa del género Lactococcus y de especie ¡aclis.

Algunas de sus características bioquímicas son: Bacteria Gram- positiva, catalasa-negativa, homofermentativa, tolerancia hasta 6.5% de sal (NaCI), con crecimiento a 10°C, y 45°C. Produce ácido a partir de lactosa, ribosa, pero no de manitol, rafinosa, ramnosa y sorbitol.

En el estudio de su espectro de inhibición todos los microorganismos Gram-positivos estudiados fueron sensibles a la bacteriocina producida por L lactis UQX.

Dadas las características bioquímicas de la cepa aislada y su espectro de inhibición de microorganismos, esta cepa fue elegida para el aislamiento de su bacteriocina y su posterior estudio.

Así, la cepa de Lactococcus lacfis antes mencionada ha sido depositada bajo los términos del Tratado de Budapest, en el Agricultural Research Service Culture Collection [ARS Patent Cultura Collection, 1815 North University St, Peoría, IL, 61 604, Estados Unidos de Norteamérica) . Los números de acceso indicados se asignaron después de la verificación de la viabilidad de las cepas, y se han pagado los impuestos de requisición. El acceso a dichas cepas será posible durante el trámite de la solicitud de patente. Todas las restricciones sobre la disponibilidad de dichas cepas al público se removerán irrevocablemente una vez que se acepte la patente basándose en la solicitud. Además, los depósitos designados se mantendrán por un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o cinco (5) años después de la última requisición para el depósito, o para la vida de cumplimiento de la patente mexicana, cuan larga sea. Si la cepa se vuelve no viable o inadvertidamente es destruida, será reemplazada con cepas viables. Así, la cepa descrita y reclamada en la presente invención, corresponde a lo mostrado en la siguiente tabla 1 : Ahora bien, un objetivo adicional de la presente invención es obtener un empaque activo biodegradable comestible a base de proteínas de suero incorporando nisina. Para tal fin, se utilizó la bacteriocina aislada de la cepa de Lactococcus lactis NRRL B-50307 objeto de la presente invención.

Dicha bacteriocina fue aislada de la siguiente forma: La cepa de Lactococcus lactis NRRL B-50307 fue cultivada utilizando un medio a base de suero lácteo suplementado. El uso de este medio resultó en un título de actividad de la bacteriocina de hasta al menos 12,800 UA/mL después de 8 h de incubación; la actividad disminuyó a por lo menos 6,400 UA/mL después de 10 h y se mantuvo constante hasta el final de la fermentación de 24 h. Un extracto libre de células con actividad inicial de 6,400 UA/ml, se sometió a 30 min de calentamiento a 80 °C y 100 °C, manteniendo su actividad residual igual. Sin embargo, al calentar a 121 °C por 15 min se obtuvo una actividad de 3,200 UA/mL. La estabilidad térmica de los agentes antimicrobianos presentes en el fermentado libre de células permitió su secado por aspersión sin que hubiera pérdida de la actividad antimicrobiana. Un título inicial de 6,400 UA/mL se incrementó a 1 ,556,400 UA/g, y se recuperaron 14.2 g en polvo de un cultivo fermentado de 2 L.

Caracterización bioquímica de la bacteriocina producida por la cepa Lactococcus lactis NRRL B-50307 Se realizó una electroforesis a partir del extracto celular de la cepa de Lacfococcus laciis NRRL B-50307, usando un sistema tris-tricina. Uno de los carriles sin teñir de la electroforesis se cortó y se utilizó para valorar la actividad antimicrobiana de cada banda, usando Micrococcus luteus como microrganismo indicador, observándose que sólo la banda de menor tamaño tenía actividad. Se realizó además un ¡soelectroenfoque, y de igual forma se evaluó su actividad antimicrobiana a una banda sin teñir. La zona de inhibición indicó la presencia de un péptido de pl> 9.0. Otras bacteriocinas que se han reportado como producidas por L lactis, y que han sido caracterizadas son las lacticinas 481 y 3147. La primera tiene un peso molecular de 2.9 kDa, pero un pl de 7.0 (Piard y col., 1 993), mientras que la segunda es un sistema de dos componentes con bacteriocinas de peso molecular de 3.3 kDa y 2.9 kDa respectivamente, pero con pl de cerca de 7.0 para cada péptido (Martínez-Cuesta y col., 2000) .

Los resultados anteriores, además del espectro de inhibición indican que el agente antlmicrobiano producido por la cepa Lacfococcus lactis NRRL B-50307 es nisina debido a su peso molecular entre 3.5 y 6.5 KDa, su pl >10 y su elevada estabilidad térmica. Posteriormente, se secuenció el péptido obtenido y se comprobó molecularmente que la cepa Lacfococcus lactis NRRL B-50307 era productora de nisina.

PREPARACION DE LOS MATERIALES DE EMPAQUE.

Una vez obtenida la nisina, se procedió a la preparación de un empaque activo biodegradable comestible hecho a partir de proteínas de suero incorporando dicha nisina obtenida específicamente a partir de la cepa Lactococcus lactis NRRL B-50307 y estudiar las características fisicoquímicas del empaque y comprobar su estabilidad y flexibilidad.

Para tal fin, las soluciones filmogénícas para preparar el empaque requieren aislado de proteína de suero (APS) en aproximadamente 6 a 1 4% p/V, el cual es disuelto completamente por agitación y se agrega de entre 5 a 1 4% de sorbitol no cristalizable. Después de mezclar los ingredientes anteriores en agua destilada, se ajusta el pH de entre 6 a 9 con hidróxido de 'sodio, calentando la solución hasta un máximo de 90 °C durante al menos 20 minutos en baño maría. Antes de retirar la mezcla del baño maría se adiciona cera de abeja o cera de candelilla en una cantidad de entre 0.7 a 1 .4%, mezclándose en un homogenizador. La solución se filtra y desgasifica durante el tiempo necesario, incorporando la nisina ( 1 00- 5000 Ul/ml o de 2.5 a 1 25 pg/ml) obtenida a partir de la cepa Lactococcus lactis NRRL B-50307. Las películas de empaque activo biodegradable se vacían en placas de vidrio y se dejan secar durante al menos 1 2 horas a una temperatura de entre 20 y 50 °C.

Al evaluar las propiedades mecánicas, de permeabilidad al vapor de agua y antimicrobianas de las películas comestibles se obtienen los siguientes resultados (ver Tabla 2) : TABLA 2. Resumen de las propiedades mecánicas y antimicrobianas del empaque activo biodegradable comestible incorporado con nisina.

Los datos de la tabla 2 indican que el empaque activo biodegradable comestible de la presente invención posee una excelente flexibilidad y buena elongación, aunque una resistencia a la tensión regular y permeabilidad al vapor de agua regular, siendo esencialmente insoluble en agua, por lo cual es útil como recubrimiento de alimentos con alta humedad relativa o bien que presenten sinéresis como el queso fresco.

Asimismo, otra característica importante del empaque es su topografía y homogeneidad a nivel superficie, ya que los empaques producidos con nisina comercial y que entran dentro del estado de la técnica de la presente invención son poco flexibles y quebradizos, por lo que no constituyen un empaque efectivo ni útil para la conservación de alimentos.

La homogeniedad de las soluciones filmogénicas de los materiales de empaque se analizaron mediante la medición de tamaño de partícula (Malvern Instruments, Malvern, United Kingdom). Además, la microestructura con las diferentes formulaciones fue analizada mediante microscopía electrónica de barrido (MEB). Se analizaron las formulaciones que contenían aislado de proteína de suero con el agente plastificante (sorbitol) APS+S (APSS), ambos ingredientes con cera de abeja APS+S+C (APSSC), y todos los anteriores incluyendo la nisina APS+S+C+N (APSSCN). Las muestras se acondicionaron a una humedad relativa constante (75% HR), a temperatura ambiente por 48 h. Posteriormente, las películas se recubrieron con oro (Techno Trade BALTEC, Mod. SCDO50, Manchester, NH, USA) . Finalmente, las muestras se analizaron al microscopio (Cari Zeiss, DSM940-A, Oberkochen, Germany), usando una ampliación frontal de ? ?,????, y de sección transversal 500X-5,000X.

En todos los casos las muestras formuladas no mostraron formación de cristales. Esta es una propiedad importante conferida por el uso de la nisina producida por la cepa de Lactococcus /acto NRRL B-50307. Grower et al. (2004), encontraron en películas a base de LDPE con recubrimiento a base de soluciones de celulosa con nisina, que mostraban una apariencia opaca. Además, cuando se incorporó nisina comercial en concentraciones (2,500 y 1 0,000 Ul/cm2), y las películas fueron analizadas, mostraron cristales en su superficie que fueron identificados como cloruro de sodio.

Las formulaciones de películas analizadas mediante microscopía (Figura 1 ) , mostraron que aquella con sorbitol (APSS) fue lisa y completamente dispersa. Al incorporar la cera (APSSC) se observa más rugosidad y una sección transversal más heterogénea. Finalmente, el efecto combinado de la cera y nisina muestra alta rugosidad y una mayor heterogeneidad en la sección transversal (APSSCN). La cantidad de nisina incorporada a la película es menor que el consumo diario recomendado por la FAO que es de 33,000 Ul/kg de peso corporal, o no más de 500,000 Ul/kg de alimento.

En una solución conteniendo una formulación típica (APS 10% p/v; S 9% p/v; CA 1 .4% p/v, N 1 .8% p/v), se llevó a cabo el análisis de tamaño de partículas (Mastersizer Micro, Malvern Instruments Ltd. Malvern. Reino Unido) . La medición D (v,0.5) de 58.39 µ??, conocido como la Mediana del Diámetro en Masa (MMD), es el tamaño de partícula al cual 50% de la muestra es igual o más pequeña y 50% es igual o mayor a este valor. D (v, 0.1 ) de 1 .97 µ?? es el tamaño de partícula al cual 10% de la muestra es menor a este tamaño. D (v, 0.9) de 1 56.4 µ?? representa el valor del diámetro al cual 90% de la muestra es menor. D [4.3] , de 70.50 µ?t?, es el Diámetro promedio en base al volumen, mientras que D [3,2] , de 6.02 µ??, es el Diámetro promedio relativo al área superficial y es conocido también como Diámetro Sauter. Esto implica una solución completamente homogénea y monodispersa ya que solamente hubo un pico en la figura de distribución de tamaños de partícula contra el diámetro (Figura 2) .

Medición de la actividad antimicrobiana Segmentos de las películas a base de APS se evaluaron mediante la técnica de difusión en agar, para evaluar su capacidad antimicrobiana. Se utilizaron microorganismos patógenos y deterioradores de los alimentos como: Brochofrix thermosphacfa ATCC 1 1 509, Pseudomona aeruginosa, Listeria monocyfogenes Scott A, Siaphylococcus aureus 8943, Micrococcus Iufeus NCIBM 81 66. (ver Figura 3) La prueba muestra que la nisina proveniente de la cepa de Lacfococcus lacfis NRRL B-50307 incorporada en el material de empaque biodegradable de la presente invención tiene la capacidad de difundir dentro de dicho material, por lo que tiene un efecto antimicrobiano en la superficie del mismo, cumpliéndose así la característica requerida dentro del área técnica de la conservación de alimentos.

Aunado a lo anterior, en relación a la estabilidad de la actividad antimicrobiana y de la estructura de las películas, se midió la actividad después de un año de almacenamiento en refrigeración. Inicialmente la película de empaque tuvo una actividad contra M. Iufeus equivalente a 37.5 mm de halo de inhibición, observándose una actividad de 21 .7 mm después de un año, equivalente a una actividad residual del 60%. Por lo tanto la nisina proveniente de la cepa de Lacfococcus lacfis NRRL B-50307 fue exitosamente añadida a las películas, manteniendo una alta actividad antimicrobiana después de un año de almacenamiento. Este resultado indica que las películas comestibles antimicrobianas desarrolladas son útiles para mejorar la inocuidad microbiana manteniendo una alta calidad de una variedad de alimentos durante su almacenamiento.

A continuación se muestran modalidades de la presente invención a manera de ejemplos, mismos que no limitan el alcance de la misma sino que únicamente se incorporan a manera de enseñar algunas de las mejores maneras de llevar a cabo la presente invención, así como modalidades preferidas de la misma.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación del material de empaque.

Se disolvió 10% de APS (aislado de proteína de suero, 90% proteína, Davisco, Le Sueur, MN, EUA) adicionando sorbitol no cristalizable con agitación en agua destilada. Después de mezclar se ajustó el pH a 8.0 con hidróxido de sodio 5N, calentando la solución a 80°C durante 30 minutos en baño maría. Durante los últimos 5 minutos de calentamiento se adicionó la cera de abeja (Grupo Aselac, México). La mezcla fue homogeneizada a una velocidad de 21 ,500 rpm mediante un homogenizador Ultra-Turrax T-25 (IKA-Works, Wilmington NC, USA) . Posteriormente se incorporó la nisina proveniente de la cepa de Lacfococcus lactis NRRL B-50307 y la solución se filtró y desgasificó durante 30 minutos. Para elaborar las películas, la solución se vació en placas de vidrio recubiertas y se dejaron secar por 24 horas a 30 °C.

Ejemplo 2. Preparación de materiales de empaque adicionales.

La siguiente tabla 3 resume modalidades preferidas con los rangos de ingredientes de la película de empaque activo biodegradable producto de la siguiente invención, útiles para la preparación del mismo y con los cuales se han obtenido películas con propiedades fisicoquímicas, mecánicas y antimicrobianas efectivas para la fabricación de la película y la conservación de alimentos.

EJEMPLO 3. Uso del empaque activo biodegradable comestible en carne de cerdo.

Para ejemplificar la utilidad y la efectividad del empaque activo biodegradable comestible con nisina incorporada de la presente invención, se procedió a probar diversas formulaciones en carne de cerdo.

En la figura 4 se ejemplifica el uso del empaque activo biodegradable comestible a base de proteínas de suero sobre carne de cerdo, en donde se muestran distintos ejemplares de carne de cerdo con diversos tratamientos, a saber: C: Control sin empaque I: Inoculada con B. fhermosphacfa 1 05 ufc/cm2 sin recubrimiento. R: Recubierta sin nisina de Lacfococcus lacfis NRRL B-50307 e inoculada con 1 05 ufc/cm2 de B. fhermosphacfa. A: Recubierta con nisina de Lacfococcus lacfis NRRL B-50307 e inoculada con 105 ufc/cm2 de B. fhermosphacfa.

En la figura 5 se ve el nivel de inhibición del crecimiento de B thermosphacta sobre las distintas muestras de carne de cerdo. Como se puede apreciar, el control sin empaque mostró un nivel de crecimiento de 1 x1 05 UFC/cm2, mientras que la muestra inoculada con B. fhermosphacfa (muestra I) tuvo un crecimiento de casi 1 x1 08 UFC/cm2. Asimismo, la muestra R recubierta con empaque sin nisina e inoculada con 6. fhermosphacfa mostró un crecimiento de 1 x1 05 UFC/cm2 y la muestra A recubierta con nisina e inoculada con B. fhermosphacfa mostró una clara inhibición del crecimiento microbiano para alcanzar una cantidad de UFC/cm2 similar al control sin inocular.

Los resultados anteriores muestran que el empaque activo biodegradable comestible con nisina de la cepa NRRL B-50307 de L. lactis no solo protege a los alimentos, en este caso específico carne de cerdo, sino que además inhibe el crecimiento de microorganismos dañinos para la conservación de los mismos.

Por lo tanto, a partir de los resultados mostrados tanto en la descripción como en los ejemplos de la presente solicitud, se comprueba la novedad, actividad inventiva y aplicación industrial de la materia aquí descrita, ya que supera ampliamente a los productos del estado de la técnica actual y soluciona la problemática de tener un empaque activo biodegradable que sea físicamente y mecánicamente estable, flexible y maleable para envolver alimentos, y además es capaz de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos durante al menos 1 año, sin perder actividad antimicrobiana significativamente ni las propiedades mecánicas óptimas.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Una cepa de Lactococcus loctis con el número de acceso NRRL B- 50307.

2.- La cepa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque produce una bacteriocina.

3. - La cepa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha bacteriocina es nisina.

4. - Un empaque activo biodegradable que comprende aislado de proteína de suero, sorbitol y cera de candelilla, caracterizado porque comprende la nisina aislada de la cepa reclamada de conformidad con la reivindicación 1 .

5. - El empaque activo biodegradable de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende de 6 a 1 4 % p/v de dicho aislado de proteína de suero.

6. - El empaque activo biodegradable de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende de 5 a 14% p/v de dicho sorbitol.

7. - El empaque activo biodegradable de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende de 0.5 a 2.5% p/v de dicha cera de candelilla.

8. - El empaque activo biodegradable de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende de 100 a 5000 Ul/ml de dicha nisina.

9. - Un método para preparar un empaque activo biodegradable, caracterizado porque comprende los pasos de: a) disolver aislado de proteína de suero y sorbitol en agua destilada; b) ajustar el pH de la solución a 6.0 a 9.0; c) calentar la solución a una temperatura de entre 60 y 90°C durante de 20 a 40 minutos; d) incorporar la cera de abeja o candelillare) homogenizar la mezcla; e) incorporar la nisina producida por la cepa de Lactococcus lacfis NRRL B-50307; f) desgasificar; g) vaciar y h) secar.

10. - El uso de un empaque activo biodegradable como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, para recubrir alimentos.