MX2010012542A - Metodos para evaluar el cancer colorrectal y composiciones para usar en el. - Google Patents

Abstract

En la presente especificación se revela un método para determinar la etapa de cáncer colorrectal mediante la observación de cambios regulatorios en secuencias de miARN selectas. Estas secuencias podrían incluir hsa-miR-143, hsa-miR-145, sus respectivos precursores y combinaciones de estas secuencias.

Description

METODOS PARA EVALUAR EL CANCER COLORRECTAL Y COMPOSICIONES PARA USAR EN ÉL REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS, UN CUADRO O UN LISTADO DE PROGRAMAS La presente solicitud se refiere a un "listado de secuencias" que figura a continuación, el cual se proporciona como un documento electrónico titulado "Sequence3035191.txt" (nombre en inglés y con 9 kb, creado el 29 de 'octubre de 2008), el cual se incorpora en la presente descripción en su !totalidad como referencia CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en una modalidad, con un método para detectar y/o monitorear el cáncer colorrectal (CCR) mediante la observación de cambios regulatorios en la producción de secuencias de microARN (miARN) selectas. Mediante la observación de los cambios de regulación por aumento o disminución de secuencias especificadas podría determinarse tanto la presencia de células cancerosas como la etapa del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN i i !por etapas descriptivos que usan la morfología e histopatología del tumor. Sin jembargo, incluso los tumores morfológicamente similares pueden diferir en ¡sus cambios moleculares subyacentes y su potencial tumorigénico. El desarrollo de CCR a partir de células epiteliales normales a carcinomas malignos involucra un proceso de múltiples etapas con acumulación tanto de cambios genéticos como epigenéticos, lo que lleva a una activación temporal de oncogenes y desactivación de genes supresores de tumores que confieren una ventaja selectiva a las células que contienen estas alteraciones. j Se han realizado varios estudios de perfilado de expresión de i ¡CCR en genes que codifican proteínas para resolver de mejor manera las rutas moleculares subyacentes y para diseccionar aún más las diferentes etapas del CCR. Más recientemente, se ha identificado una clase recién descubierta de ARN no codificantes cortos, de 22 nucleótidos (nt), llamados microARN (miARN), y se los ha implicado en la iniciación y la progresión del cáncer. La biogénesis de estos ARN pequeños incluye la transcripción por ARN polimerasa II y el procesamiento del transcrito primario por la lendonucleasa Drosha para producir miARN precursores de 60-70-nt (pre-miARN) con estructuras en horquilla imperfectas. El pre-miARN se transporta jal citoplasma a través de exportin 5, en donde la enzima ARNsa II Dicer lo procesa para producir miARN maduros que, después, se incorporan a un complejo multiproteico. Se ha mostrado que estos complejos que contienen miARN se unen a la región no traducida 3' (UTR) de múltiples ARNm a |través de la complementariedad entre la cadena de miARN residente y la ¡secuencia objetivo y, sobre la base del grado de homología, dirigen la inhibición traduccional o la degradación de ARNm. Hasta la fecha se han ¡identificado 678 miARN humanos (Base de datos de secuencias miRBase - Versión 1 1 ) y, a través de modelos computacionales, se ha sugerido que podrían haber más de 1000 genes de miARN, que comprenden aproximadamente 3 % de los genes conocidos actualmente en el genoma ¡humano. Además, los análisis bioinformáticos estiman que los miARN podrían regular tanto como 30 % de los genes humanos que codifican ¡proteínas, lo que sugiere que estos ARN pequeños podrían actuar para coordinar la interacción entre rutas de transducción de señales complejas.

Se identificaron varios miARN como expresados diferencialmente entre tejidos normales y tumorales o líneas de células de cáncer. (Calin, G. A. y Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cáncer, 6: 857- 866, 2006; Bandres, E., Cubedo, E., Agirre, X., Malumbres, R., Zarate, R., Ramírez, N., Abajo, A., Navarro, A., Moreno, I., Monzo, M. y Garcia-Foncillas, J. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially ¡expressed in colorréctal cáncer and non-tumoral tissues. Mol Cáncer, 5: 29, I 2006; Cummins, J. M., He, Y., Leary, R. J., Pagliarini, R., Díaz, L. A., Jr., jSjoblom, T., Barad, O., Bentwich, Z., Szafranska, A. E., Labourier, E., ¡Raymond, C. K., Roberts, B. S., Juhl, H., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. y jVelculescu, V. e. The colorréctal microRNAome. Proc Nati Acad Sci U S A, 103: |3687-3692, 2006; Michael, M. Z., SM, O. C, van Holst Pellekaan, N. G., Young, G. P. y James, R. J. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorréctal neoplasia. Mol Cáncer Res, 1: 882-891 , 2003; Lanza, G., Ferracin, M., Gafa, R., Veronese, A., Spizzo, R., Pichiorri, F., Liu, C. G., Calin, G. A., Croce, C. M. y Negrini, M. mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorréctal cáncer. Mol Cáncer, 6: 54, 2007).

Se han realizado estudios limitados por medio de la evaluación de los patrones de expresión de miARN en CCR. El primer estudio que mostró desregulación de miARN registró regulación por disminución de miR- ¡ 143 y miR-145 en la etapa pre-pólipo adenomatoso, lo que sugiere una posible actividad para estos miARN en las etapas tempranas del CCR.

Subsiguientemente, se identificó un grupo de 13 miARN que muestran expresión diferencial en tumores de CCR con el nivel de expresión de miR- 31 en correlación con la etapa de tumor de CCR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención comprende, en una forma, un método para detectar la presencia de cáncer colorrectal en una muestra de células. En otra forma, la invención es un método para diagnosticar la etapa de cáncer colorrectal en una muestra de células. Los solicitantes descubrieron ciertos miARN que se regulan diferencialmente en cánceres colorrectales comparados con células silvestres. Mediante la determinación del grado de cambios regulatorios en los miARN puede determinarse si una muestra de tejido incluye células de cáncer colorrectal. Los solicitantes descubrieron ciertos miARN diferentes que se regulan diferencialmente en cánceres colorrectales de etapa tardía (etapa III y IV) comparados con cánceres colorrectales de etapa temprana (etapa I y II). Mediante el monitoreo de estos miARN puede diferenciarse una muestra de tumores de etapa tardía de una muestra de tumores de etapa temprana sin necesidad de valerse de identificadores menos confiables, tales como la morfología de las células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS I Figura 1. Agrupamiento jerárquico bidireccional de tejido i ¡colorrectal normal y CCR mediante el uso de 41 miARN expresados i diferencialmente. El medio geométrico de la intensidad de la señal Log2 se calculó entre todas las muestras, mediante el uso de una métrica de distancia Euclidiana con enlace completo. El rojo y el azul indican miARN expresados a i un nivel relativamente alto o bajo, respectivamente. Los grupos miR-143-145 y miR-17-92 se indican mediante barras verticales azules y rojas, i respectivamente. Las muestras se agrupan en tres grupos principales: el Grupo i representa principalmente tejido colorrectal normal y los Grupos II y III representan muestras de CCR. Las muestras duplicadas se indican con el sufijo I I ¿ - Figura 2. Correlación de la expresión de miARN comparando ! Figuras 3A-3B. Expresión de miARN en muestras de CCR i ¡congeladas frescas en comparación con muestras de CCR fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés). (Figura |3A) Se realizaron ensayos de expresión de miARN TaqMan® sobre 26 miARN de 4 muestras congeladas frescas y FFPE coincidentes. (Figura 3B) Comparación de la expresión de 18 miARN de 2 muestras congeladas frescas y FFPE coincidentes mediante el uso del ensayo mirVana™ i Bioarray.

Figuras 4A-4B. Expresión de los niveles de miARN específicos por etapa de enfermedad. (Figura 4A) Los gráficos de puntos de m¡R-1 , miR- 133a, miR-143 y miR-145 muestran una expresión reducida a partir de tejido i colorrectal normal en CCR de etapa temprana (I y II) y etapa tardía (III y IV).

¡(Figura 4B) Los análisis de la membrana de transferencia puntual de miR-31 , I im¡R-21 , miR-20a y miR-106a muestran expresión aumentada a partir de tejido colorrectal normal en CCR de etapa temprana (I y II) y etapa tardía (III y IV).

I Figura 5. Expresión de 22 miARN en 8 líneas de células de CCR y ARN total de colon normal. Se realizaron análisis de la membrana de Northern usando ARNnp U6 como control de normalización.

Figuras 6A-6D. La sobreexpresión de miR-145 en la línea de células SW620 afecta la morfología y la proliferación de células. (Figura 6A) La i región genómica que rodea el gen miR-145 se amplificó por PCR y se clonó en i pSilencer™ 4.1 bajo control del promotor de CMV. Se detectó miR-145 maduro por análisis Northern en una población agrupada de células SW620 después de la transfección. Se usó ARNnp U6 como control de carga. (Figura 6B) Una característica distintiva importante de la población de células que sobreexpresa imiR-145 fue el cambio en la morfología de células sencillas redondeadas de jsW620 a células alargadas con procesos extensos típicos de células parecidas «i ja fibroblastos. (Figura 6C) El miR-145 que expresa población de células SW620 mostró un aumento de dos veces en el crecimiento independiente del anclaje cuando se cultivaron en presencia de suero, y un aumento de más del 50 % en la actividad metabólica/de proliferación de células cuando se cultivaron en presencia (barras sólidas) o ausencia (barras abiertas) de suero, p<0.001. (Figura 6D) El análisis Western de las células SW620/miR-145 y de las células de control muestra que los niveles en estado estable de E-cadherina eran 50 % menores en la célula SW620 que expresa el miR-145 maduro.

Figuras 7A-7B. Reversión mediada por antisentido de proliferación inducida por miR-145. (Figura 7A) El ARN total de las muestras tratadas mostró una reducción del miR-145 en las células que recibían el 2'Ome ARN antisentido específico de miR-145, pero no en los controles miR-145 tratados con sentido o con tratamiento simulado. (Figura 7B) Como se esperaba, los conjuntos que expresan SW620/miR-145 mostraron una proliferación aumentada en comparación con los controles de vectores en presencia (barras sólidas) o ausencia (barras abiertas) de suero. Cuando se trataron con ARN antisentido de miR-145, se vio una reducción en la proliferación en los conjuntos SW620/vector y SW620miR-145. Se realizaron tres experimentos independientes, p<0.05; p<0.01 ; p<0.001.

Figuras 8A-8D. La sobreexpresión de miR-143 en la línea de células SW620 afecta la morfología y la proliferación de las células. (Figura 8A) ¡Se clonó ADN genómico de miR-143 bajo el control del promotor U6 (en ipSilencer™ 2.1) y se transfectó en células SW620. Se identificaron siete clones estables de SW620 que expresaban miR-143 (A4, B3, B5, B6, C1 , C5 y D2). Se usó ARNnp U6 como control de carga. (Figura 8B) Se analizó la morfología de ¡las células de los siente clones de SW620/miR-143 en comparación con el control de vectores. (Figura 8C) El análisis Western de los clones de SW620/miR-143 y las células de control muestra los niveles en estado estable de E-cadherina. Se calcularon los índices de E-cadherina usando ß-actina como un i j control de normalización. (Figura 8D) Se realizaron ensayos sobre siete clones de SW620/m¡R-143 para analizar la actividad metabólica/de proliferación en 'comparación con el control de vectores, cuando se cultivan en ausencia (barras I abiertas) o presencia de suero (barras sólidas). (E) Se analizaron los mismos Jolones para evaluar el crecimiento celular independiente del anclaje en el ensayo rápido de agar suave en presencia de suero. Se realizaron dos experimentos I ! independientes, p<0.01 , p<0.001.

' Figura 9. Correlación entre la expresión de miR-143 y miR-145. jSe realizó el análisis de regresión lineal comparando la intensidad de expresión normalizada (log2) para los genes miR-143 y miR-145. La i correlación entre los miARN fue 0.95.

¡ Figura 10. Muestra el mapa de interacción para miR-17-92.

Figuras 1 1A-1 1 D. La sobreexpresión del grupo miR-17-92 y del miR-20a solo en la línea de células SW620 afecta la morfología y la proliferación de las células. Se amplificaron por PCR las regiones genómicas que contienen el grupo de miR-17-92 basado en el cromosoma 13 y la región genómica que contiene el pre-miARN de miR-20a, se clonaron bajo el control del promotor de CMV en el vector retroviral pQCXIN y se suministraron a la línea de células de cáncer de colon HCT1 16. (Figura 1 1A) los clones del grupo HCT1 16/miR-17-92 (4-1 y 4-17) se analizaron en búsqueda de la sobreexpresión de miR-20a, miR-92, miR-18a y miR-19a usando el análisis i de la membrana de Northern. También se analizaron los clones que sobreexpresan miR-20a solo (9-3,9-9,9-12 y 9-13) en búsqueda de la I I . 0 I I expresión de estos componentes del grupo. (Figura 11 B) Histograma de los riiveles de expresión de miARN del componente miR-17-92 calculados a partir de la membrana de Northern. Los niveles de expresión se normalizaron a ARNnp U6. (Figura 11 C) Se analizaron varios clones HCT116 que jsobreexpresan miR-20a (9-3, 9-9, 9-12, 9-13) o el grupo miR-17-92 (4-1 ,4-7) en busca de actividad metabólica/de proliferación en presencia (barra sólida) i jo ausencia de suero (barra abierta). (Figura 11 D) Se analizaron los mismos clones en busca de crecimiento celular independiente del anclaje en el 'ensayo rápido de agar blando (en presencia de suero), p<0.05, p<0.01 , |p<0.001.

| DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN i j Los mircroARN (miARN) son ARN cortos no codificantes que 'controlan la expresión de las proteínas a través de varios mecanismos. Se ha ^ mostrado que su expresión alterada está asociada con varios cánceres. En la ¡presente descripción se describe un método que perfila la expresión de ¡miARN en CCR y analiza la función de mrARN específicos en células de CCR. i ¡Se usaron miARN mirVana™ Bioarrays para determinar el perfil de expresión ¡de miARN en ocho modelos de líneas de células de CCR, 45 muestras ¡ humanas de CCR en distintas etapas y cuatro muestras de tejido de colon ¡ normal. Se identificaron 11 miARN comunes que se expresaron jdiferencialmente entre colon normal y CCR tanto en los modelos de líneas de ¡células como en las muestras clínicas. Ahora se ha mostrado que muchos de estos miARN se relacionan con diferentes etapas de la progresión de tumores de CCR que incluyen miR-145, el cual se reduce significactivamente en CCR.

¡ La información in vitro indicó que miR-143 y miR-145 funcionan opuestamente i para inhibir o aumentar la proliferación de células dependiendo del contexto jcelular. Varios miARN también se sobreexpresaron en CCR, que incluyen jm¡R-31 y el grupo de miR-17-92. El aumento de m¡R-17-92 en células de CCR ^SW620 redujo la proliferación de células pero aumentó el crecimiento 'independiente del anclaje. La disección del grupo de miARN sugirió que miR-|20A era un componente activo. Por lo tanto, los miARN pueden ser destino de ¡terapias de CCR y analitos de pronóstico y diagnóstico.

Se compararon las características de los miARN de expresión en 45 muestras clínicas de CCR, cuatro tejidos colorrectales normales coincidentes y ocho modelos de líneas celulares. Se identificaron 11 miARN i ¡que cambiaron comúnmente en niveles de expresión entre colon normal y líneas de células y muestras clínicas. Algunos de los miARN se restringen en ¡patrones de expresión a diferentes etapas de CCR y podrían proporcionar ¡marcadores potenciales de pronóstico y diagnóstico para este cáncer. La re-jexpresión de miR-143 o miR-145 en una línea de células de CCR modelo i Jafecta la diferenciación y la proliferación de células de maneras opuestas.

I Además, el aumento en la expresión del grupo de miR-17-92 redujo la i proliferación de células, pero aumentó el crecimiento independiente del ¡anclaje. La disección de este grupo muestra que miR-20a es un componente í activo de estos efectos dependientes del contexto celular.

Un biomarcador es cualquier marca distintiva del nivel de expresión de un gen marcador indicado. Las marcas distintivas pueden ser directas o indirectas y miden la sobre o subexpresión del gen dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control interno, tejido normal u ¡otro carcinoma. Los biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, ácidos i ¡nucleicos y proteínas (tanto de sobreexpresión y subexpresión como directos e indirectos). El uso de ácidos nucleicos como biomarcadores puede incluir ¡cualquier método conocido en la materia que incluye, pero no se limita a, medir la amplificación de ADN, ARN, microARN, pérdida de heterocigosidad (LOH, por sus siglas en inglés), polimorfismos de nucleótidos simples (SNP, por sus jsiglas en inglés), ADN microsatélite, hipo o hipermetilación de ADN. El uso de proteínas como biomarcadores comprende cualquier método conocido en la materia que incluye, pero no se limita a, cantidad medida, actividad, modificaciones tales como glicosilación, fosforilación, ribosilación de ADP, (ubiquitinación, etc., o inmunohistoquímica (IHC). Otros biomarcadores incluyen diagnóstico por imágenes, conteo celular y marcadores de la apoptosis.

Los miARN o genes indicados que se proporcionan en la presente son aquellos asociados con un tipo de tejido o tumor particular. En a materia se conoce una gran cantidad de genes asociados con uno o más cánceres. La presente invención proporciona los genes marcadores jpreferidos y las combinaciones de genes marcadores aún más preferidas. Estos se describen detalladamente en la presente descripción.

Un gen marcador corresponde a la secuencia designada mediante una sec. con núm. de ident.: cuando contiene dicha secuencia o su complemento. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen cuando contiene una porción de la secuencia de referencia o su ¡complemento en forma suficiente para distinguirla como la secuencia del gen. i lUn producto de expresión de gen corresponde a tal secuencia cuando su ARN, ¡ARNm, miARN o ADNc híbrida con la composición que tiene esa secuencia (por ejemplo, una sonda) o, en el caso de un péptido o una proteína, se encuentra codificado por el ARNm. Un segmento o fragmento de producto de expresión de gen corresponde a la secuencia del gen o del producto de expresión del gen cuando contiene una porción del producto de expresión del gen de referencia o de su complemento suficiente para distinguirla como la ¡secuencia del gen o del producto de expresión del gen. Los métodos novedosos, las composiciones, los artículos y los estuches descritos y reivindicados en esta especificación incluyen uno o más genes marcadores. El término "marcador" o "gen marcador" se usa en esta descripción para hacer ¡referencia a genes y productos de expresión de genes que concuerdan con cualquier gen cuya sobre o subexpresíón se asocia con un tipo de tejido o tumor. Los genes marcadores preferidos se describen con más detalle en la presente descripción. Todas las secuencias tratadas aquí se describen en la presente y se proporcionan en el listado de secuencias. La presente invención también proporciona estuches para conducir un ensayo de conformidad con los métodos proporcionados en la presente descripción y también contiene reactivos para detección de biomarcadores. La presente invención también proporciona micromatrices o chips de genes para llevar a cabo los métodos descritos en la presente descripción. La presente invención proporciona, adicionalmente, portafolios de diagnóstico/pronóstico que contienen secuencias ¡de ácido nucleico aisladas, sus complementos o partes de ellos de una ¡combinación de genes como se describe en la presente descripción, en donde la combinación es suficiente para medir o caracterizar la expresión de genes en juna muestra biológica que tiene células metastásicas en comparación con ¡células de distintos carcinomas o de tejido normal.

Cualquier método descrito en la presente invención también ipuede incluir medir la expresión de al menos un gen expresado constitutivamente en la muestra.

La invención también proporciona un método para proporcionar la dirección de la terapia mediante la determinación del estado de un CCR ¡de conformidad con los métodos descritos en la presente descripción, y la .identificación del tratamiento adecuado para él. i La invención también proporciona un método para proporcionar un pronóstico mediante la determinación del estado de un CCR de conformidad con los métodos descritos en la presente descripción, y la pronóstico adecuado para él. invención también proporciona composiciones que comprenden al menos una secuencia aislada seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 1-34. i La invención también proporciona estuches, artículos, |micromatrices o chips de genes, portafolios de diagnóstico/pronóstico para llevar ja cabo los ensayos descritos en la presente descripción, e informes de pacientes para notificar los resultados obtenidos mediante los presentes métodos.

I ¦ Sólo en raras ocasiones la mera presencia o ausencia de 'secuencias de ácido nucleico particulares en muestras de tejido demostró tener valor diagnóstico o pronóstico. Por otro lado, la información acerca de la expresión de diferentes proteínas, péptidos, miARN o ARNm se considera cada vez más importante. La mera presencia de las secuencias de ácido ¡nucleico con potencial de expresión de proteínas, péptidos o ARNm (estas secuencias se denominan "genes") dentro del genoma no determina si una proteína, un péptido o ARNm se expresa en una célula dada. La expresión o falta de expresión de un gen determinado que es capaz de expresar esos jproductos y el grado en que dicha expresión se produce, en caso de ¡producirse, se determina mediante una amplia variedad de factores ! ¡complejos. Independientemente de las dificultades en la comprensión y la evaluación de estos factores, el análisis de la expresión génica puede proporcionar información útil acerca de la frecuencia de eventos importantes tales como tumorogénesis, metástasis, apóptosis y otros fenómenos ! clínicamente relevantes. Es posible encontrar indicaciones relativas del jgrado en que los genes están activos o inactivos en los perfiles de expresión génica. Los perfiles de expresión génica de la presente invención se usan para proporcionar un diagnóstico y para tratar pacientes con CCR.

La preparación de las muestras requiere la recolección de las ¡muestras de pacientes. Las muestras de pacientes usadas en el método novedoso son aquellas sospechadas de contener células enfermas, tales como células sacadas de un nodulo en una aspiración con aguja fina (FNA, por sus Isiglas en ingles) de tejido. También pueden usarse preparaciones de tejido en jvolumen obtenido a partir de una biopsia o un espécimen quirúrgico y la (microd ¡sección por captura láser (LCM, por sus siglas en inglés). La tecnología ¡de LCM es un método para seleccionar las células que se desean analizar, que I ¡permite minimizar la variabilidad provocada por la heterogeneidad del tipo de ¡ j célula. En consecuencia, pueden detectarse fácilmente los cambios pequeños o | moderados en la expresión del gen marcador entre células normales o J benignas y cancerosas. Las muestras también pueden comprender células ¡epiteliales extraídas de la sangre periférica. Estas pueden obtenerse de i ¡ conformidad con numerosos métodos, pero el método más preferido es la i ¡ técnica de separación magnética descrita en la patente de los Estados Unidos I ¡ núm. 6,136, 182. Una vez que se obtuvo la muestra que contiene las células de ¡ interés, se obtiene un perfil de expresión génica usando un biomarcador, para i | los genes de los portafolios adecuados. i ¡ Los métodos preferidos para crear perfiles de expresión génica incluyen la determinación de la cantidad de ARN producido por el ARNm o miARN de un gen. Esto se logra mediante PCR con transcripción inversa (RT- PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de visualización diferencial, análisis de la membrana de Northern y otras pruebas relacionadas.

I 17 Si bien es posible aplicar estas técnicas al usar reacciones individuales de 3CR, es mejor ampliar el ADN complementario (ADNc) o el ARN complementario (ARNc) producido a partir de ARNm o miARN y analizarlo i mediante una micromatriz u otro método adecuado. Aquellos con experiencia i en la materia conocen varias configuraciones de matrices y métodos diferentes para su producción, como se describen, por ejemplo, en las publicaciones núms. 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672; 5527681 ; 5529756; 5545531 ; 5554501 ; 5561071 ; 5571639; 5593839; 5599695; 5624711 ; 5658734; y 5700637. j La tecnología de micromatrices permite la medición del nivel de ARNm en estado estable de miles de genes en forma simultánea, lo que proporciona una herramienta poderosa para la identificación de los efectos tales i como la aparición, detención o modulación de la proliferación celular no controlada. En la actualidad se usan varias tecnologías de micromatriz, mirVana™ Bioarray, matrices de ADNc y matrices de oligonucleótidos. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, prácticamente todos los análisis de datos corriente abajo y resultados son los mismos. El producto de estos análisis son, típicamente, mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda etiquetada que se usa para detectar una secuencia de ADNc de I la muestra que se híbrida con una secuencia de ácido nucleico en una ubicación conocida en la micromatriz. Típicamente, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc y, por consiguiente, de ARNm o miARN que se expresa en las células de muestra. Una gran cantidad de dichas técnicas i están disponibles y resultan de utilidad. Los métodos preferidos para determinar la expresión génica se pueden encontrar en las publicaciones núms. 6,27 ,002; jB,218,122; 6,218,114; y 6,004,755.

El análisis de los niveles de expresión se realiza al comparar dichas intensidades de señal. Se logra una mayor eficacia mediante la generación de luna matriz de relación de las intensidades de expresión de los genes en una muestra de prueba en comparación con aquellas en una muestra de control. Por ejemplo, las intensidades de la expresión génica de un tejido enfermo se pueden jcomparar con las intensidades de expresión generadas a partir del tejido benigno ¡o normal del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica el cambio múltiplo en expresión génica entre las muestras de prueba y de control.

La selección se puede basar en pruebas estadísticas que producen listas clasificadas relacionadas con las pruebas de importancia jpara la expresión diferencial de cada gen, entre factores relacionados con la i |tumorigénesis. Los ejemplos de estas pruebas incluyen ANOVA y Kruskal-IWallis. Las clasificaciones se pueden usar como ponderaciones en un modelo diseñado para interpretar la suma de dichos pesos, hasta un valor límite, como la preponderancia de evidencia en favor de una clase sobre la otra. Según se describe en la bibliografía, la evidencia previa también se puede usar para ajusfar las ponderaciones.

! Los perfiles de expresión génica se pueden visualizar de I diversas maneras. La más común es ordenar las intensidades de fluorescencia en bruto o la matriz de relación en un dendograma gráfico, en I donde las columnas indican las muestras de prueba y las filas indican los I genes. Los datos se ordenan de manera tal que los genes que tienen perfiles de expresión similares sean proximales entre si. El índice de expresión para cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, un índice menor que uno (regulación por disminución) aparece en la porción azul del espectro, mientras que un índice mayor que uno (regulación por aumento) aparece en la porción roja del espectro. Se encuentran disponibles comercialmente programas de computadora para mostrar esa información, que incluyen "GeneSpring" (Silicon Genetics, Inc.), "Discovery" e "Infer™" (Partek, Inc.) Las mediciones de la abundancia de especies de ARN únicas se obtienen a partir de tumores primarios o tumores metastásicos de muestras biológicas. Estas lecturas junto con registros clínicos que incluyen, pero no se limitan a, la edad de un paciente, el género, el lugar de origen del tumor primario y el lugar de metástasis (si corresponde) se usan para generar una base de datos relacional. La base de datos se usa para seleccionar transcritos ele miARN y factores clínicos que pueden usarse como variables de marcadores para determinar la presencia, el pronóstico o el estado del CCR.

I i En el caso de la medición de los niveles de proteína para I determinar la expresión génica, cualquier método conocido en la materia ¡ resulta adecuado, siempre que sus resultados tengan una especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, los niveles de proteína se pueden medir mediante el enlace de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína y la medición de la cantidad de proteína unida al anticuerpo.

Se pueden etiquetar los anticuerpos mediante reactivos radioactivos, fluorescentes u otros reactivos detectables para facilitar la detección. Los métodos de detección incluyen, pero no se limitan a, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y técnicas de inmunotransferencia.

Los genes modulados que se usan en los métodos de la invención i se describen en los ejemplos. Los genes que se expresan diferencialmente se regulan por aumento o disminución en pacientes con CCR comparados con ^aquellos sin CCR o en distinto estado o progresión de CCR. La regulación por Jaumento y por disminución son términos relativos que significan que existe una |diferenc¡a detectable (más allá de la contribución del ruido en el sistema que se usa para su medición) en la cantidad de expresión de los genes en relación con ¡ciertos valores iniciales. Los genes de interés en las células enfermas se regulan, posteriormente, por aumento o por disminución en relación con el nivel de I valores iniciales mediante el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración en el estado de un cuerpo que interrumpe o altera, o tiene el potencial de alterar el desempeño adecuado de las funciones 'corporales, como es el caso de la proliferación celular no controlada. A una persona se le diagnostica una enfermedad cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona concuerda con la presencia de la enfermedad.

La realización de un diagnóstico o pronóstico podría incluir la determinación de los problemas relacionados con la enfermedad o el estado, i tales como determinar la probabilidad de una recaída, el tipo de tratamiento I i y su seguimiento. En el seguimiento del tratamiento los juicios clínicos se realizan respecto del efecto de un curso determinado de tratamiento I ¡mediante la comparación de la expresión de genes a través del tiempo, a fin ¡de determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están ¡cambiando a patrones más consistentes con el tejido normal.

Se pueden agrupar los genes de manera que la información obtenida acerca del conjunto de genes en el grupo proporcione una base sólida para realizar un juicio clínicamente relevante, tal como un diagnóstico, un pronóstico o la elección de un tratamiento. Estos conjuntos de genes conforman las carteras de la invención. Al igual que en la mayoría de los marcadores diagnósticos, frecuentemente, resulta conveniente usar la menor cantidad posible de marcadores siempre que resulten suficientes para realizar un juicio médico correcto. Esto evita que se produzca una demora en jel tratamiento por causa de la realización de análisis adicionales, así como el :uso improductivo del tiempo y los recursos. i El proceso de seleccionar un portafolio también puede incluir la i aplicación de reglas heurísticas. Preferentemente, se formulan estas reglas jcon base en la biología y una compresión de la tecnología usada para I producir resultados clínicos. Con mayor preferencia, se aplican para una ! salida del método de optimización. Por ejemplo, el método de varianza media ¡de la selección del portafolio se puede aplicar a los datos de las micromatrices ¡ para una cantidad de genes diferencialmente expresados en sujetos con cáncer. El resultado del método sería un conjunto optimizado de genes que podrían incluir algunos genes expresados en la sangre periférica, así como ¡también en el tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba jse obtienen a partir de sangre periférica y ciertos genes diferencialmente I ^expresados en instancias de cáncer podrían también estar diferencialmente jexpresados en la sangre periférica, se puede aplicar una regla heurística, en ¡donde se selecciona un portafolio a partir de la frontera eficaz sin incluir los ¡genes diferencialmente expresados en la sangre periférica. Además, la regla jse puede aplicar antes de la formación de la frontera eficaz mediante, por 'ejemplo, la aplicación de esta regla durante la preselección de datos. ¡ i i Un método para establecer las carteras de expresión génica es I mediante el uso de algoritmos de optimización, tal como el algoritmo de varianza media, ampliamente usado para establecer las carteras de acciones. Este método se describe en detalle en la publicación nurn. 20030194734. Prácticamente, el método se relaciona con el establecimiento de un conjunto de entradas (acciones en aplicaciones financieras, y expresión calculada según la intensidad en la presente) que optimizarán el retorno (por ejemplo, la j señal generada) que se recibe como consecuencia de su utilización, a la vez | que minimiza la variabilidad de este. En el mercado existen numerosos ¡ programas informáticos disponibles para realizar estas operaciones. Se prefiere el "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application," denominado "Wagner Software" a lo largo de esta especificación. Se prefiere j el uso de este programa, que incluye funciones de la "Wagner Associates | Mean-Variance Optimization Library" para determinar una frontera eficaz y portafolios óptimos en el sentido presentado por Markowitz. Markowitz (1952). i El uso de este tipo de programas requiere convertir los datos de las micromatrices de manera que puedan tratarse como entradas, del mismo i modo en que se usan el retorno sobre las acciones y las mediciones de riesgo ¡ cuando el programa se aplica para sus fines de análisis financiero.

El proceso de seleccionar un portafolio también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferentemente, se formulan estas reglas con base en la biología y una compresión de la tecnología usada para I producir resultados clínicos. Con mayor preferencia, se aplican para una salida del método de optimización. Por ejemplo, el método de varianza media I de la selección de la cartera se puede aplicar a los datos de las micromatrices para una cantidad de genes diferencialmente expresados en sujetos con Cáncer. El resultado del método sería un conjunto optimizado de genes que podrían incluir algunos genes expresados en la sangre periférica, así como también en el tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba |se obtienen a partir de sangre periférica y ciertos genes diferencialmente expresados en instancias de cáncer podrían también estar diferencialmente expresados en la sangre periférica, se puede aplicar una regla heurística en donde se selecciona un portafolio a partir de la frontera eficaz, sin incluir los genes diferencialmente expresados en la sangre periférica. Asimismo, la regla se puede aplicar antes de la formación de la frontera eficaz medíante, por ejemplo, la aplicación de esta regla durante la preselección de datos. j Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no están necesariamente relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, es posible aplicar una regla para que únicamente un porcentaje específico de la cartera se pueda representar mediante un gen o grupo de genes determinados. Los programas disponibles en el mercado, tal como el Wagner Software, se ajustan de inmediato a estos tipos de heurística. Por ¡ejemplo, esto puede ser de utilidad cuando factores que no son la exactitud y la precisión (por ejemplo, cargos de licencia anticipados) tienen un impacto isobre la conveniencia de incluir uno o varios genes.

Los perfiles de expresión génica de esta invención también se pueden usar en conjunto con otros métodos diagnósticos no genéticos útiles para !el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en ciertas circunstancias resulta beneficioso combinar el poder diagnóstico de los métodos basados en la expresión génica descritos anteriormente con datos obtenidos a partir de marcadores convencionales, tal como marcadores de proteína en suero (por ejemplo, antígeno de cáncer 27.29 ("CA 27.29")). Existe una amplia variedad de dichos marcadores, que incluyen analitos como CA 27.29. En un método de estas características se extrae sangre periódicamente a ¡un paciente tratado y, después, se la somete a un inmunoensayo enzimático para uno de los marcadores en suero descritos anteriormente. Cuando la Jconcentración del marcador sugiere el regreso del tumor o el fracaso del ¡tratamiento, se toma una fuente de muestra sujeta al análisis de expresión génica. Cuando existe una masa sospechosa, se realiza una aspiración con aguja fina (FNA) y se analizan, posteriormente, los perfiles de expresión génica de las células extraídas de la masa, según se describió anteriormente. i i Alternativamente, se pueden tomar muestras de tejido de las áreas adyacentes al ¡tejido del que se extirpó previamente el tumor. Este enfoque puede resultar especialmente útil cuando otras pruebas producen resultados ambiguos.

Los kits fabricados de conformidad con la invención incluyen ensayos adaptados para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar los ¡ensayos, tales como reactivos e instrucciones y un medio en el que se realiza el ensayo de los biomarcadores.

Los artículos de esta invención incluyen representaciones de os perfiles de expresión génica útiles para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico y cualquier otra forma de evaluación de enfermedades. Estas representaciones perfilares se reducen a un medio que puede leerse automáticamente mediante una máquina, tal como en medios informáticos i (magnéticos, ópticos y similares). Los artículos también pueden incluir instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en dicho medio.

Por ejemplo, los artículos pueden incluir un CD-ROM con instrucciones de I computadora para la comparación de los perfiles de expresión génica de las i carteras de genes descritas anteriormente. Los artículos también pueden I tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente en ellos, de ¡manera que se puedan comparar con los datos de expresión génica de las ¡muestras de pacientes. Como alternativa, los perfiles se pueden registrar en ¡diferentes formatos de representación. Un registro gráfico es uno de estos I formatos. Los algoritmos de agrupación, tales como aquellos incorporados jen los programas "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencionados [anteriormente, pueden proporcionar una mejor visualización de dichos datos.

¡ Los kits fabricados de conformidad con la invención incluyen i jensayos adaptados para determinar los perfiles de expresión génica. Estos ¡pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar los I ensayos, tales como reactivos e instrucciones y un medio en el que se realiza el ensayo de los biomarcadores.

I Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los ¡perfiles de expresión génica útiles para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico jy cualquier otra forma de evaluación de enfermedades. Estas representaciones perfilares se reducen a un medio que puede leerse automáticamente mediante una máquina, como por ejemplo en medios informáticos (magnéticos, ópticos y similares). Los artículos también pueden | incluir instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en dicho medio. Por ejemplo, los artículos pueden incluir un CD-ROM con instrucciones jde computadora para la comparación de los perfiles de expresión génica de las carteras de genes descritas anteriormente. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión génica registrados digitalmente en ellos, de j manera que se puedan comparar con los datos de expresión génica de las muestras de pacientes. Como alternativa, los perfiles se pueden registrar en j diferentes formatos de representación. Un registro gráfico es uno de estos ¡ formatos. Los algoritmos de agrupación, tales como aquellos incorporados en ¡ los programas "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencionados anteriormente, pueden proporcionar una mejor visualización de dichos datos.

Los diferentes tipos de artículos de fabricación de conformidad con la Invención son medios o ensayos adaptados en su forma que se usan para revelar los perfiles de expresión génica. Pueden comprender, por ejemplo, micromatrices en donde los complementos o sondas de secuencia están ¡ligados a una matriz en la que se combinan las secuencias Indicativas de los genes de interés, lo que crea un factor determinante legible de su presencia. O bien, los artículos de conformidad con la invención se pueden modelar como |estuches de reactivos para realizar hibridación, ampliación y generación de una I jseñal indicativa del nivel de expresión de los genes de interés. i Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la presente invención. Todas las referencias citadas en la presente se I incorporan a modo de referencia.

EJEMPLO 1 Métodos Líneas de células Las líneas de células SW620, SW480, HCT1 16 y HT29 se i obtuvieron del ATCC. Las M20L2 y M12C fueron proporcionadas por el NCI- rederick Cáncer DCT Tumor Repository, mientras que las líneas de células <M20 y KM12SM fueron proporcionadas por Dr. Isaiah J. Fidier (The University of Texas MD Anderson Cáncer Center). Las células SW620 y SW480 se cultivaron en medio Dulbecco modificado Eagle (D-MEM) (Gibco). Las células HCT116 se cultivaron en medios McCoy 5A (Gibco) y las células KM20, KM20L2, KM12C, KM12SM y HT29 se cultivaron en medios RPMI 1640 (Gibco). Todos los medios se complementaron con 10 % de suero fetal bovino (JRH Biosciences), 2 mm de L-glutamina (Gibco) y solución de penicilina-i [estreptomicina (0.1 U/ml de penicilina y 0.1 pg/ml de estreptomicina) (Gibco), ¡excepto para las células HT29 que se cultivaron en 0.72 mm de L-glutamina.

Muestras clínicas En total, se obtuvieron 49 muestras de CCR congeladas instantáneamente de Genomics Collaborative Inc. (GCI, Cambridge MA) o Clinomics Bioscience, Inc. (Pittsfield, MA), que incluyen 4 de colon normal, 4 jde etapa I, 19 de etapa II, 20 de etapa III y 2 de etapa IV (cuadro 1 ). ¡Además, se obtuvieron 8 muestras coincidentes fijadas con formalina e ¡infiltradas en parafina (FFPE) (3 de etapa II, 4 de etapa III y 1 de etapa IV).

¡ El contenido tumoral medio de todas las muestras de CCR fue de 70 % y no se presentó una diferencia importante en el contenido tumoral entre la enfermedad de etapa temprana (I y II) y de etapa tardía (III y IV).

Cuadro 1. Características de las muestras clínicas jídéht de Íímúestrá.¾ . í Etapa: . . ' ,'MAC ¾·· uke Sexo 'Raza " Fuente 1YRNPAB I A A 73 F Africana GCI CI09 1 A A NA NA NA Clinomics CI IO I A A NA NA NA Clinomics Cl 13 1 A A NA NA NA Clinomics EÍBU9AM5 1 Bl A 61 F Caucásica GCI IHDNLAK.U I Bl A 75 F Caucásica GCI 5CYDKA5B II B B 44 M Caucásica GCI 9S9RNAI4 HA B2 B 81 F Caucásica GCI ACGL2AN4 HA B2 B 65 M Asiática GCI ARA7PAQE 11 B B 63 F Caucásica GCI B7AYIA8V HA B2 B 36 M Caucásica GCI Cl 15 II B B NA NA NA Clinomics Cl 18 II B B NA NA NA Clinomics FNJUHAU3 IIA B2 B 74 M Caucásica GCI KDSZBAN1 HA B2 B 86 F Caucásica GCI KF YAJU HA B2 B 45 M Asiática GCI K.SH3JALQ HA B2 B 73 F Caucásica GCI LAQA6A8Q II B B 75 Caucásica GCI N8KVIA3S II B B 71 M Caucásica GCI QLKH5A50 HA B2 B 78 M Caucásica GCI S6TRKAX6 IIA B2 B 37 M Asiática GCI TUUKWA2Q HA B2 B 67 F Asiática GCI ZYKTYATN HA B2 B 74 F Caucásica GCI 7NUSVAH3 ?? c c 80 F Caucásica GCI 8Q9TRAEE III c c 69 Caucásica GCI 9VMYRAAB IHB C2 c 28 F ¦ Asiática GCI AJOJHAGP III c c 50 F Asiática GCI B8TM AN5 ??? C2 c 72 F Asiática GCI BDGFCA A IIIA Cl c 60 Asiática GCI BLUW6AJB IHB C2 c 64 F Caucásica GCI DFVJAACX IHB C2 c 54 M Caucásica GCI EL C6A62 III c c 52 F Caucásica GCI FQFE7A5W II IB C2 c 69 F Asiática GCI HIKQCAAS IIIA Cl c 72 M Caucásica GCI HQIU5AYO ???3 C2 c 64 M Caucásica GCI MIL04AF8 III c c 48 F Asiática GCI NLKEIAE3 uro C2 c 48 F Asiática GCI NN29GABN IIIB C2 c 61 M Africana GCI 03PJ AU4 [(I c c 78 F Caucásica GCI POELPAF3 III c c 48 F Asiática GCI VYAE AJF III C C 64 F Asiática GCI ZEROIAZP III C C 42 F Asiática GCI ZIPBBA2E [IIB C2 C 60 Caucásica GCI IJNQZAQZ IV D D 62 F Caucásica GCI ZWM3AK.E IV D D 32 F Caucásica GCI i MAC= clasificación Astier-Coller modificada, NA=perfil de miARN no disponible i i j Se empleó mirVana™ Bioarray (Ambion, versión 1) que contiene (287 sondas de miARN humano para identificar patrones de miARN de CCR. ¡Shingara y otros (2005). Se aisló miARN a partir 5 pg de ARN total de muestras colorrectales usando el estuche de aislamiento mirVana™ (Ambion) para muestras congeladas instantáneamente y el estuche de aislamiento de ácido nucleico total RcoverAII™ para muestras FFPE (Ambion). Después, se ! ¡fraccionaron todas las muestras mediante electroforesis de gel de poliacrilamida (flashPAGE™, Ambion) y se recuperaron ARN pequeños (< 40 nt) mediante precipitación de etanol con acriiamida lineal. La RT-PCR cuantitativa (QPCR) de miR-16 se usó para confirmar el enriquecimiento de miARN antes del análisis de la matriz de miARN.

' Los ARN pequeños de todas las muestras se sometieron a jreacción poli(A) polimerasa, en donde se incorporaron uridinas de amina modificada (Ambion). Después, las muestras se etiquetaron fluorescentemente usando la amina reactiva Cy3 o Cy5 (Invitrogen). Se realizaron hibridaciones con juno o dos colores para los experimentos de perfilado de CCR clínico o de líneas jde células, respectivamente. Para los experimentos de 2 colores, el miARN de la i línea celular se comparó directamente con el ARN de colon normal (Ambion). Los jARN etiquetados fluorescentemente se purificaron mediante el uso de filtro de ! fibra de vidrio y se eluyeron (Ambion). Después, cada muestra se hibridó con las i láminas Bioarray durante 14 horas a 42 °C (Ambion). Después, se lavaron las matrices y se exploraron por medio del uso de un explorador de micromatrices confocal láser (Agilent), y se obtuvo información mediante el uso del programa de computadora para análisis de expresión (Codelink, versión 4.2).

! El análisis de la membrana de Northern de miARN específicos se realizó como se describió en el Ejemplo 2.

Análisis estadístico La información se analizó mediante el uso del paquete de programas de computadora R. La información se normalizó por cuantil antes de I /' determinar la expresión génica diferencial. Las muestras duplicadas y los valores de sonda se promediaron y se realizó la prueba t de Student para encontrar los genes que varían significativamente entre los grupos de muestra. Se seleccionaron los genes si la mediana de la intensidad de señal normalizada era mayor que 100 (75° de percentiles de mediana de señal) para al menos un grupo, con un cambio de la media > 1.5 veces y un valor p < 0.05. Se usó un ¡ I ANOVA unidireccional para evaluar el nivel de expresión de miARN. Se realizó i QPCR mediante el uso de reactivos de miARN ABI TaqMan® para verificar los perfiles de expresión del miARN. Chen y otros (2005). Se convirtieron diez (10) ng de ARN total en ADNc mediante el uso del estuche de archivo de ADN de alta capacidad y 3 µ? de cebador de RT 5x, de conformidad con las instrucciones del fabricante (Ambion). Las reacciones de 15 µ? se incubaron en un termociclador durante 30 minutos a 16 °C, 30 minutos a 42 °C, 5 minutos a 85 °C y se mantuvieron a 4 °C. Ninguna de las reacciones de transcriptasa inversa (RT) incluyó controles de plantilla. Se realizó QPCR mediante el uso de un protocolo de estuche de PCR TaqMan® sobre un sistema de detección de secuencias 7900HT de Applied Biosystems La reacción de PCR de 10 pl incluyó 0.66 pl de producto de RT, 1 µ? de cebador de ensayo de microARN TaqMan® y mezcla de sonda, 5 µ? de mezcla maestra de PCR universal TaqMan® 2x (sin amperasa UNG) y 3.34 µ? de agua. Las reacciones se incubaron en una placa de 384 | pocilios a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 j segundos y 60 °C durante 2 minutos. Todas las reacciones de QPCR incluyeron I | un control sin ADNc y todas las reacciones se realizaron por triplicado.

! Constructos de plásmidos I El plásmido pSilencer™ 2.1 (Ambion) se modificó dentro del sitio de clonación múltiple para introducir sitios únicos de restricción y un terminador transcripcional de ARN polimerasa III ( l i l i l í ). Se sintetizaron los ¡ siguientes oligonucleótidos (Sigma), se recocieron y se ligaron al pSilencer™ 2.1 , se predigirieron con BamHI y Hindlll, para producir pSilencer™ 2.1Term: pSilU6upper 5'GATCCCTCGAGTCTAGA I I I I I i GGAAA (sec. con núm. de ident.: 1) y pSilU6lower S'AGCTTTTCCAAAAAATCTAGACTCGAGG (sec. con iúm. de ident.: 2). El pre-miR-143 o pre-miR- 45 que codifica ADN se lamplificó por PCR a partir de ADN genómico humano mediante el uso de los I ¡cebadores 143F (5'CGGGATCCCGGAGAGGTGGAGCCCAGGTC (sec. con 'núm. de ident.: 3)) y 143R (5'GCTCTAGACAGCATCACAAGTGGCTGA (sec. |con núm. de ident.: 4)), se digirió con BamHI y Xbal y se ligó a pSilencer™ Í2.1Term para producir el plásmido ae expresión miR-143. Para miR-145 se I recuperó ADN genómico como un amplicón de PCR mediante el uso de los ¡cebadores 145F (5'CGGGATCCCAGAGCAATAAGCCACATCC (sec. con ¡núm. de ident.: 5)) y 145R (5'GCTCTAGACTCTTACCTCCAGGGACAGC (sec. Icón núm. de ident.: 6)), se digirió con BamHI y Xbal, y se ligó en pSilencer™ 4.1 bajo el control del promotor de CMV. Para construir los vectores de expresión retroviral que codifican miR-20a o el grupo miR-17-92, se amplificaron por PCR regiones de ADN genómico, se digirieron con BamHI y EcoRI y se clonaron en pQCXIN (BD Biosciences). Los cebadores de PCR |que se usaron para miR-20a fueron miR-20F I j (5'CGGGATCCCGATGGTGGCCTGCTATTTCC (sec. con núm. de ident.. 7)) y miR-20aR (5'CGGAATTCTCACACAGCTGGATGCAAA (sec. con núm. de 'ident.: 8)), mientras que los que se usaron para el grupo miR-17-92 fueron !miRcF (5'CGGGATCCCGTCCCCATTAGGGATTATGC (sec. con núm. de ¡ident.: 9)) y miRcR (5'CGGAATTCCCAAATCTGACACGCAACC (sec. con !núm. de ident.: 10)). Generación de líneas de células estables para generar J clones estables mediante el uso de plásmidos pSilencer™ 2.1 (miR-143) y IpSilencer™ 4.1 (miR145), se plantaron 1-5x106 de células (HCT116, SW480, |SW620) en un único pocilio de una placa de 6 pocilios. Al alcanzar 80-90 % de 'confluencia, las células se transfectaron con 4 de ADN plásmido mediante jel uso de Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las células se diluyeron y se colocaron en placas jen medio fresco con 500 pg/ml de higromicina. Después de 14 días de selección, los clones independientes se recolectaron, se expandieron y se exploraron en busca de la expresión del/de los miARN específico/s codificado/s por el plásmido transfectado (Ejemplo 2). j Para producir clones estables de células HCT116 mediante el 'uso de transducción retroviral, se mezclaron líneas de células de ¡empaquetamiento retroviral Amphopack™ HEK 293 (BD Biosciences) y PG13 i \a una relación de 10:1 antes de la transfección con 10 g de vectores basados i !en pQCXIN, mediante el uso de fosfato cálctco. 24 horas después de la transducción, se cosecharon los medios que contenían virus y se usaron para Itransducir células HCT116. Después de la dilución y recuperación de células, Ise adicionaron 400 g/ml de G418 al medio de cultivo y se seleccionaron Í clones durante dos semanas. La caracterización de los clones independientes |fue como se describió anteriormente para la transfección de plásmidos.

! Experimentos antisentido j Se suministró ARN miR-145 antisentido 2'-0-metil biotinilado o j controles a SW620 mediante el uso de Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) como j se detalló en el Ejemplo 2. La eficacia de la transfección fue de al menos 80 % en i | todos los experimentos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Se i horas. Se midió la fluorescencia mediante el uso del lector de microplacas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech). Para realizar el análisis libre de suero, el día I j1 se cambió el medio a un medio libre de suero. El medio Dulbecco modificado Jde Iscove 2X (IMDM, por sus siglas en inglés) (Gibco) del ensayo rápido de agar ¡blando se complementó con 0.6 % de bicarbonato de sodio, 20 % de suero fetal ! bovino (JRH Biosciences), 4 mm de L-glutamina (Gibco), Solución de i aminoácidos no esenciales 2X, 2 % de piruvato sódico (Gibco) y solución de penicilina-estreptomicina (0.1 U/ml de penicilina y 0.1 g/ml de estreptomicina) (Gibco). El IMDM 2X se mezcló a una relación de 1 :1 con 1.2 % de agar bacto (55 °C) y se adicionó 50 µ? por pocilio a una placa de 96 pocilios para producir una precapa para el ensayo. Se mezclaron 10 µ? de suspensión de células que ¡contiene células SW620 (3x103) o células HCT116 (2x103), 20 µ? de IMDM 2X y 30 µ? de agar bacto al 0.8 % (55 °C) y se transfirieron a la precapa solidificada en jcada pocilio. La capa alimentadora semisólida se preparó al mezclar 25 µ? de IMDM 2X y 25 µ? de agar bacto al 1.2 % (55 °C) y se colocó en capas en la parte superior de la precapa solidificada. Se dejó que las células crecieran en una incubadora CO2 a 37 °C durante 7 días. Se evaluó la proliferación y viabilidad de i las células mediante el uso del reactivo CelITiter-Blue™ (Promega). Tratamiento de imágenes de células vivas j El microscopio biológico Diaphot de Nikon y la cámara digital i É995 de Nikon se usaron para capturar imágenes de la morfología de las células. RESULTADOS del perfilado de miARN en muestras de CCR clínico Inicialmente, se perfilaron 49 muestras colorrectales humanas |(4 de colon normal, 4 de CCR de Etapa I, 19 de Etapa II y 2 de Etapa IV) para estudiar la expresión de miARN diferencial entre tejidos normales y j humorales, y también entre enfermedad de etapa temprana y tardía (cuadro 1 ). Se identificó un total de 37 miARN expresados diferencialmente entre ¡CCR y tejido de colon normal (cuadro 2).

I Cuadro 2. miARN expresados diferencialmente entre CCR y tejido de colon Cambio miARN Normal' ..CRC, Valor p : Ubicación1 Sitio frágil de CCRd * múltiplob hsa-m¡R-20a 9.2 10.3 2.0E-03 2.1 13q31.3 Aumento hsa-m¡R-i 8 a . 7.6 . ei . " 2.9?-03 i, 2.0 13q31.3 Aumento hsa-m¡R-19a 7.7 8.7 2.3E-03 1.9 13q31.3 Aumento hsa-rp¡R-Í7r->p ?0.5 ; 11. 1.5E-03 T 1.9 13q31.3 Aumento hsa-m¡R-19b 11.0 11.8 3.4E-03 1.8 13q31.3 Aumento 2;6 , ' ~ \ 14q32.33 " '. ' Pérdida hsa-m¡R-21 13.0 14.5 6.0E-06 2.9 17q23.2 Aumento hsaTmiR-34a . . 10.3 ¾E-02 1p36.22 . Pérdida sa-miR-181 b 8.5 9.2 2.2E-04 1.7 1q31.1 o 9q33.3 Aumento (1 q) hsa-m¡R-29b :.. '¡ . ??.5· ' 9E÷03 " 1.8 1q32.2 o 7q32.3 Aumento hsa-m¡R-130b 7.1 7.8 1.2E-03 1.7 22q11.21 Pérdida 6 8 ;¾?1JE,02:, , 1.6 4p16.1 Pérdida hsa-m¡R-106b 9^5 10.3 1 OE-04 1.7 7q22.1 Aumento '. ' ""¦: . 7q22.1 Aumento j a. Med ana de intensidad de la señal normalizada (log2) j b. Cáncer: normal c. La ubicación cromosomica de algunos miARN es dudosa ya que mirVana™ Bioarray no discrimina entre precursores de pre-miARN. Pérdidas o aumentos cromosómicos frecuentes en CCR tal como se resumió de Staub y otros (2006).

I . La mayoría de estos miARN se asocian con regiones cromosómicas que se sabe tienen aumentos o pérdidas frecuentes en CCR. iStaub y otros (2006). El agrupamiento jerárquico mostró que muchos de estos ¡miARN se expresaron de forma coordinada, incluso los grupos miR-1 3-145 y miR-17-92, los cuales se regularon por disminución o por aumento j(respectivamente) de forma consistente en CCR (Fig. 1). Curiosamente, el ¡grupo miR-1-133a demostró estrecha coordinación transcripcional con el grupo ! ÍmiR-1 3-145, aun cuando estos dos grupos residen en distintos cromosomas. para pruebas de diagnóstico. La expresión de miARN se encuentra asociada con la etapa de CCR. Identificamos 22 miARN que se expresaron j diferencialmente entre normal y CCR de etapa temprana (Etapa I y II) (cuadro ¡ 3) y 6 miARN que mostraron una expresión diferencial significativa entre enfermedad de etapa temprana y tardía (Etapa III y IV) (cuadro 4). La expresión jde miR-31 aumentó en las etapas tardías mientras que el miR133a se redujo I ¡significativamente (Fig.4A y 4B). Por lo tanto, estos miARN se asocian con la progresión del CCR y podrían actuar como biomarcadores potenciales para la ! clasificación del CCR por etapas. i I i Cuadro 3. miARN expresados diferencialmente en colon normal y CCR de etapa temprana (Etapas I y II) miARN Normal Etapa l/ll Cambio de pliegue Valor p hsa-m¡R-224 6.89 8.67^ 3.45 1.80E-02 hsa-miR-21 1302 r 14*49*'"" 278 152E-04 hsa-miR-34a 9.48^ t 10.43 ¿ .92 1.92E-02 hsa-miR-106a 1068 J_11~57 r" 185 2-88E-02 hsa-miR-18a 7.5Í 8.3¿T ..Jl 3_ ....332E:02 hsa-m¡R-19 b 10.84 11.69 l ó 2.77E-02 hsa-miR-1,06¿ 345 , 02¿ 6 137E-02 hsa-miR-20a 9.28 10.06 _ 1.72 *3J5E-02 hsá-rriiR-29Í, .J¾ l ¾89l" ? 68 * ' 984E-04 hsaJmiR_J81b ? 911 163 - _9-47E-°2 i hg-mÍR-ík, >78^ ?45^ " 160T . " 2~58E-02 ¡hsa-miR-95 6.12 6.79 1.59 3.33E-02 hsa-miR-516-3p4.87 . 5*5?; 157 . 320E-02 hsa-miR-378* 7.53 6.85 0.62 1.87E-03 hsa miR-422b_10„88 10.021. 055 k 491ET03 hsa-miR-422a 10.05 9.19 0.55 _ .57E-03 ¾§Sr¾Í^Í^I¾^¾^^^¾¾^^' ' f¾¾g¾Í ¡Cuadro 4. miARN expresado diferencialmente en enfermedad de etapa temprana ¡(I y II) contra enfermedad de etapa tardía (III y IV). a Etapa 1/ I Etapa lll/l V Cambio c le pliegii le Valor p hsa-miR-31 9.97 7.22 1 53E-03 hsa-miR-7 7.77 8.85 2.l 1.96E-02 hsa-miR-99b 8.74 8.12 0.65 3.64E-03 hsa-miR-378* ¦ 6:85 3:02 Ér02 hsa-miR-133a 7.64 6.96 0.63 í .64E-02 r:;r¾ÍR¾Í¾Í|i¾? 10.64 ' 9.76 2;69É-0 Cambio múltiplo = Etapa lll/IV: Etapa l/ll Obtención de perfiles de miARN en lineas de células de CCR I A fin de identificar una línea de células de CCR para el análisis ,'funcional de miARN expresados diferencialmente y a fin de examinar la ¡relación entre la expresión de miARN en muestras clínicas y líneas de ¡células, comparamos la expresión del miARN entre células epiteliales jcolónicas normales y cuatro modelos de líneas de células de CCR (SW480, i |SW620, KM12C, KM12SM) mediante el uso de las mirVana™ Bioarrays. A i I 'Cuadro 5. miARN expresados diferencialmente en cuatro líneas de células i Ide CCR contra tejido colorrectal normal. hsa-m;R 55¾ 2.14 5.46 1.B9 1.46 aumento s^m:R-18a 0.5S 2.22 2.18 1 79 aumento f!S8-ra:fM92 0.O2 Q.08 0.18 0.28 disminución -miR-193 0.59 2.43 1.76 1.2S aumento hsa-mlRZOOe 0.2¾ 0.97 1.58 1.83 aumento dismonución miARN en negritas fueron validadas por el análisis Northern i A fin de validar la información de la micromatriz y expandir el j número de líneas de CCR exploradas, se realizaron análisis de membrana I de Northern sobre 22 de estos miARN en ocho líneas de células CCR (Fig. 5). De esos miARN que se identificaron en las muestras clínicas, 11 eran en I común con los 43 desregulados en los modelos de líneas de células, que incluyen miR-31 , miembros del grupo miR-17-92, miR-1 , miR-143 y miR 145 ¡(cuadro 6). Por lo tanto, se realizaron estudios funcionales en un subgrupo ¡de estos miARN para determinar si la elevación de la expresión de estos miARN impactaba sobre el fenotipo celular del CCR. cuadro 6. miARN jcomúnmente desregulados en muestras clínicas de CCR y líneas de células Cuadro 6. miARN comúnmente desregulados en muestras clínicas de CCR y ¡líneas de células de CTC.

! * Resumido de Tsafrir y otros (2006); Paredes-Zaglul y otros (1998); y Rooney y otros (2001 ). El I aumento del miR-145 en células de CCR altera la morfología y proliferación celular.

A fin de examinar el rol funcional de miR-145 en CCR, se expresó ¡ectópicamente el miR-145 maduro en células SW620. Después de la estables agrupadas se miR-145. La población agrupada expresó altos niveles en estado estable de miR-145 maduro I (designado SW620/miR-145) (Fig. 6A), pero ninguno de los 12 clones aislados expresó niveles detectables de este miARN. Varios intentos de aislar clones independientes fallaron en producir alguno que expresara el m¡R-146 maduro.

Una característica distintiva importante de la población de células SW620/miR-145 fue el cambio de células sencillas redondeadas de SW620 a células alargadas con procesos extendidos típicos de células parecidas a fibroblastos (Fig. 6B). Las células SW620/miR-145 también mostraron un aumento de 50 % a 95 % en la actividad metabólica/proliferación de células, cuando se cultivaron en presencia o ausencia de suero, respectivamente (Fig. |6C). También se observó un aumento de dos veces en el crecimiento i . independiente del anclaje, cuando se cultivaron en presencia de suero (Figura ' 6C). El marcador de células epiteliales E-cadherina también se redujo un 50 % en células SW620/miR-145 comparadas con las de control (Fig. 6D), lo cual es consistente con la morfología de las células parecidas a las mesenquimales y la proliferación aumentada que se observó para células ¡ SW620/miR-145. Sin embargo, a diferencia del aumento en el crecimiento in vitro observado, la sobreexpresión de miR-145 en células SW620 no alteró el perfil de crecimiento de tumores en un modelo in vivo de ratón.

A fin de confirmar que los cambios en las células SW620/miR- 145 se debían a la expresión del miR-145, se realizaron experimentos de silenciamiento génico de 2'0-metil (2'Ome) ARN antisentido específico de I miR-145. Se eliminó el miR- 145 en células SW620/miR-145 que recibieron el i 2'0me ARN antisentido específico de miR-145, pero no en el control sentido (Fig. 7A). Como se vio en el experimento anterior (Fig. 6C), la sobreexpresión de miR-145 en presencia de ARN sentido de control resultó en un aumento en la proliferación de células en suero y, más marcadamente, en medio libre de !suero (Fig. 7B). Sin embargo, cuando el miR-145 antisentido se coexpresó en SW620/miR-145, hubo una reversión del alto potencial proliferativo de las células (Fig. 7B). Estos resultados indicaron que la expresión ectópica específica de miR-145 indujo cambios en la diferenciación celular con un aumento asociado en el potencial proliferativo. La expresión de miR-143 en células de CCR cambia la morfología y proliferación celular.

Dado que el miR-145 se expresa a partir del mismo locus genómico que el miR-143 y que el último miARN también se reguló por j disminución en CCR, se investigó el fenotipo de las células SW620 de CCR que sobreexpresan miR-143 (Figuras 8A-8D). Se aislaron siete clones ¡ estables que expresaban miR-143 y cada uno mostró morfología alterada, la cual se asoció con la expresión aumentada de la proteína E-cadherina (Figuras 8A-8C). No se observaron diferencias en la velocidad de proliferación i i celular, sin embargo, se demostró un crecimiento independiente del anclaje reducido en todos los clones (Fig. 8D). Esta información sugiere que la ! sobreexpresión de miR-143 tiene el efecto opuesto sobre el crecimiento celular independiente del anclaje que el de las células que expresan miR-145 de forma ectópica. Se sugiere que la expresión coordinada es importante para evitar la inhibición del crecimiento potencial mediado por miR-143.

Claramente, la correlación entre la expresión de miR-143 y miR-145 en las 49 muestras de CCR clínico perfiladas fue 0.95, lo cual es consistente con su proximidad genómica (Fig. 1 , Fig. 9). No se logró generar células estables que i jsobreexpresaran el locus genómico de miR-143-145 y, por lo tanto, no se ¡pudo investigar el fenotipo celular de CCR cuando ambos miARN se ! ¡sobreexpresaron coordinadamente. La sobreexpresión del grupo m¡R-17-92 Jafecta los miARN de los perfiles de crecimiento de CCR del grupo miR-17-92 y sus parálogos ubicados en los cromosomas X y 7 se expresaron a un nivel en estado estable más alto en CCR, comparado con tejido de colon normal (Fig. 1 , cuadros 2, 5 y 6). La expresión diferencial de miR- 7-92 y los !miembros del grupo parálogo proporcionaron la base para analizar un posible papel de estos miARN en la transición de células de cáncer de colon normales ¡a tumorigénicas. La Figura 10 muestra un mapa de interacción para miR-17-¡92. Blenkiron y otros (2007). j Se amplificó por PCR la región genómica que contiene el grupo !miR-17-92 basado en el cromosoma 13 y se clonó bajo el control del ¡promotor de CMV en el vector retroviral pQCXIN y se suministró a la línea de células de cáncer de colon HCTI 16. Se eligió el HCTI 16 dado que mostró |niveles endógenos bajos de los miembros del grupo miR-17-92 comparado |con otras líneas de células exploradas (Fig. 5). Se aislaron dos clones de ¡HCTI 16/miR- 17-92, 4-1 y 4-7, y mostraron un aumento concomitante de 4 a |5 veces en miR-20a, miR-18a, miR-19a y miR-92 maduros (Figuras 11A y |1 1 B).

¡ Los clones que sobreexpresan el m¡R-17-92, 4-1 y 4-7, ¡mostraron 50 % a 60 % de reducción en la actividad metabólica/proliferación celular cuando se cultivaron en medio libre de suero (Fig. 1 1 C). Sin embargo, cuando se cultivaron en presencia de suero, se encontró una ! reducción menos significativa en la proliferación. No se encontró ninguna i j alteración en la morfología celular de los clones que sobreexpresan el grupo ¡ miR-17-92. A diferencia de otros estudios, los resultados expuestos ' anteriormente sugieren que los mayores aumentos en la expresión del grupo j miR-17-92 pueden reducir la actividad metabólica/proliferación celular en las i células, cuando se cultivan en ausencia de suero. 1 El miR-20a es un componente activo del grupo miR-17-92 ¡ A fin de caracterizar aún más el/los componente/s del grupo miR- I ! 17-92 que confiere/n la desventaja en el crecimiento o la actividad metabólica ¡ reducida por la sobreexpresión del grupo, analizamos el efecto de la sobreexpresión del miR-20a solo. Generamos 4 clones de HCT116/m¡R-20a que mostraron un aumento en miR-20a y tres de éstos mostraron aumentos de ! 10 a 12 veces reproducibles, comparados con el control de vector (9-3, 9-9 y 9- I 12). No se descubrió ninguna alteración de expresión de otros tres miembros de j miARN del grupo miR-17-92 endógeno (Fig. 1 1A y 1 1 B). Ninguno de los clones j de HCT1 16/miR-20a mostraron morfología celular alterada. Sin embargo, como i en los clones de HCT116/miR-17-92, todos los clones de miR-20a mostraron | una reducción significativa en la actividad metabólica/proliferación celular en I I medio libre de suero (Fig. 11C). Este fenotipo fue menos marcado (alcanzando ! I significancia sólo en dos clones) cuando los clones se cultivaron en presencia j de factores de crecimiento a base de suero. i I ! Dos de los clones que expresan m¡R-20a y uno de los clones del grupo miR-17-92 mostraron aumentos significativos en el crecimiento independiente del anclaje, lo que indica que el efecto de la expresión de miR-17-j 92 en el crecimiento de las células depende del contexto celular (Fig. 1 1 D). Estos ¡ resultados también sugieren que lo más probable es que la modulación de la ' proliferación de HCT116 se haya dirigido a través del miR-20a. Sin embargo, ! dada la afinidad de secuencia de las semillas en otros miembros del grupo, no ! podemos descartar un papel de estos otros miARN en el fenotipo del CCR. j ANÁLISIS I Se realizó un perfilado de la expresión de miARN en las líneas de células y muestras de pacientes con CCR y se encontró una serie de miARN específicos que mostraban expresión diferencial entre colon normal y diferentes etapas de CCR. También se demostró que la reexpresión de miR-143 o m¡R-145 en una línea de células de CCR, representativa de enfermedad metastásica de | etapa tardía, modificaba el estado de diferenciación de las células de distintas maneras e impactaba sobre la proliferación celular de formas opuestas. A diferencia de la mayoría de los informes anteriores sobre cáncer, la expresión aumentada de miR-17-92 en estas células de CCR avanzado se asoció con un | aumento en el crecimiento independiente del anclaje y una proliferación celular j reducida. Una disección mayor del grupo reveló que el miR-20a es al menos un j componente activo de miR-17-92 que confiere estos cambios.

I Entre las muestras de CCR clínico, 37 miARN sufrieron I j alteración de la expresión comparado con colon normal y 1 1 de estos miARN i mostraron el mismo patrón de expresión en las líneas de células de CCR. ^sto indicó que las líneas de células retienen algunos de los patrones de ^expresión del miARN observado en tumores primarios y pueden actuar como rnodelos adecuados para el análisis funcional de miARN específicos. Nuestra observación de que miR-143 y miR-145 se regulaban por 'disminución en CCR confirmó los informes anteriores. Akao y otros (2006); ¡Bandres y otros (2006); Cummins y otros (2006); Michael y otros. (2003); y Lanza y otros (2007). También verificamos la regulación por disminución de miR-30a-3p informada anteriormente (Bandres y otros (2006)), miR-10b, ¡m¡R-30c, miR-125a, miR-1 , m¡R-133a y miR- 195. Lu y otros (2005).

| Curiosamente, los miARN específicos de músculo, miR-1 y m¡R- 133a, se expresaron altamente en la mucosa de colon normal, pero se regularon i ¡significativamente por disminución en CCR. Aunque no se puede descartar por completo la contaminación a partir de la capa muscular de la mucosa en las ¡muestras normales, se cree que nuestras observaciones son auténticas por las siguientes razones. Primero, la proporción de capa muscular de la mucosa en el colon normal es mínima y es poco probable que de cuenta del alto nivel de expresión de miR-l-133a en estas muestras. Segundo, hubo expresión más elevada en la enfermedad de etapa temprana en comparación con la enfermedad jde etapa tardía, y tercero, este grupo se expresó coordinadamente con el grupo jde miARN específico de CCR m¡R-143-145. Además, a nuestro entender, no ha ¡habido ninguna comparación directa entre la expresión de miR-l-133a en músculo y epitelio de la mucosa de colon normal y, por lo tanto, estos miR i podrían no ser completamente específicos de músculo. Chen y otros (2006).

Se mostró que m¡R-31 , miR-21 y miembros del grupo miR-17-92 y sus parálogos se regulaban por aumento en CCR. El aumento en miR-31 se informó previamente, pero no se encontró en muchos otros estudios de i expresión de miARN en CCR. Bandres y otros (2006); Cummins y otros (2006); ? Lu y otros (2005); y Volinia y otros (2006). Se desregularon un total de 22 miARN entre muestras clínicas de etapa temprana (Etapas I y II) y el colon normal, mientras que 6 miARN mostraron diferentes niveles de expresión entre muestras de etapa temprana y etapa tardía. Estos miARN pueden ser Diomarcadores novedosos para clasificar el CCR por etapas. Con este fin, [ambién se demostró la detección reproducible de miARN en muestras de CCR I FFPE, lo que indica que los miARN son estables en este material poco jconservado. La capacidad de detectar miARN de manera reproducible en muestras de CCR FFPE confirma los resultados recientes de Xi y otros (2007).

En nuestro estudio, la reexpresión de miR-143 redujo la formación í 'de colonias y reguló por aumento la E-cadherina (un marcador de diferenciación de células epiteliales), lo que sugiere que el miR-143 presentó efectos supresores de tumor en células CCR bajo estas condiciones. Consistentemente con nuestras observaciones, Akao y otros (2006) informaron una reducción dosis-dependiente en la viabilidad de las células luego de suministrar miR-143 'sintético a líneas de células de CCR SW480 o DLDI. De forma similar, Borralho |y otros (2007) informaron que la sobreexpresión de miR- 143 en células HCTI 16, LoVo, SW480 y SW620 resultó en viabilidad celular reducida y apoptosis I I ¡aumentada, lo que sugiere que el miR-143 cumple un rol proapoptótico en la mucosa normal. Este último estudio incluyó la expresión del precursor más grande del gen miR-143 y es más comparable con la estrategia de reexpresión jusada en este trabajo. En contraste, miR-145 aumentó la proliferación celular y ¡el crecimiento independiente del anclaje, y redujo los niveles de E-cadherina.

¡Estos efectos se incrementaron cuando las células se cultivaron en un medio libre de suero, lo que sugiere que los factores de crecimiento celular podrían jafectar la actividad de estos miARN. Estos resultados sugieren que la expresión 'del miR-145 en una línea de células de CCR de etapa tardía promueve la | proliferación celular y/o actúa para bloquear los signos normales de apoptosis. Curiosamente, nuestras observaciones acerca de la reexpresión de miR-145 difieren del único estudio que analiza un papel funcional para este miARN, el cual informó pérdida de viabilidad celular en células DLDI o SW480 después de la introducción del pre-m¡R-145 sintético. Akao y otros (2006). Además del i método de introducción de miR-145, nuestro estudio también difiere en que se usaron células de CCR de etapa tardía y fueron incapaces de lograr altos niveles de expresión estable de miR-145.

Nuestra incapacidad de generar clones sencillos que expresaran niveles altos del miR-145 maduro sugirió que el crecimiento celular no puede j mantenerse cuando el miR-145 se expresa más allá de un umbral específico, j Sin embargo, una población agrupada de células que expresan miR-145 ¡ mostró consistentemente proliferación aumentada en líneas de células de i CCR. La información proveniente de nuestro laboratorio y de otros indica que él m¡R-143 reduce el crecimiento de células de CCR cuando se sobreexpresa i independientemente de miR-145. Dado que ambos miARN ocupan el mismo ocus genómico (5q23), hipotetizamos que miR-143 y miR-145 actúan de una manera coordinadamente opuesta como potenciales supresores tumorales y oncogenes, respectivamente. Cuando se expresan independientemente, entonces cada uno de estos miARN exhibe su respectivo rol como oncogen y supresor de tumores. Podría ocurrir que miR-143 pueda expresarse a niveles altos en clones sencillos, pero lograr niveles de expresión fisiológica de m¡R- !l 45 requiere la coexpresión con miR-143. De manera importante, nuestros I resultados también destacan que el suministro de miR-143, solo, puede ser i una estrategia terapéutica potencial para CCR. i j Una observación particularmente interesante en este estudio ¡fue que la sobreexpresión adicional del policistron miR-17-92 o miR-20a solo resultó en una reducción en la proliferación celular en ausencia de factores de crecimiento séricos. Estos resultados sugieren que miR-17-92 y miR-20a I pueden actuar como un supresor de tumores cuando se sobreexpresan en i jcélulas HCT1 16 de división rápida. Por el contrario, se vio un aumento en el crecimiento independiente del anclaje en algunos clones de miR-17-92 y íri¡R-20a. Estas observaciones discordantes son coherentes con los roles l ¡informados para miR- 17-92 en cáncer. j Varios estudios han implicado al miR-17-92 como un oncogen. Este i grupo está asociado con una región genómica (13q) amplificada con frecuencia en diferentes clases de linfoma y CCR. Ota y otros (2004); y Tsafrir y otros (2006). Los miARN codificados por este grupo también se expresan altamente en I I linfoma y cánceres de colon, pulmón, páncreas y próstata. Volinia y otros (2006); i Hayashita y otros (2005); y He y otros (2005). Wang y otros (2006) identificaron al i miR-17-92 como un potencial oncogen mediante el uso de mutagénesis retroviral en ratones, lo cual resultó en la formación de linfoma. Además, se mostró que la sobreexpresión del grupo miR- 17-92 acelera el linfoma de célula B en un modelo ¡de ratón y aumenta la proliferación de células in vitro en una línea de células de ¡cáncer de pulmón. Hayashita y otros (2005); y He y otros (2005). También í existen pruebas que indican que el grupo miR- 17-92 puede actuar como un ;supresor de tumores ya que la pérdida de heterocigosidad en 13q31-32 en i distintos tipos de cáncer puede llevar a un pronóstico pobre. Eiriksdottir y otros (1998); Lin y otros (1999); y Tsang y otros (1999). Además, Hossain y otros (2006) mostraron que la reintroducción de miR-17-5p en líneas de células de jcáncer de mama disminuye la proliferación celular y el crecimiento independiente ¡del anclaje, lo que confirma que los miembros de este grupo pueden mostrar cualidades de tipo supresor de tumores. Es probable que los diferentes efectos ¡ biológicos para cualquier miARN específico sean dependientes del contexto y ! controlados por el repertorio de genes destino expresados en distintos tipos de | células. Nuestros resultados muestran que el efecto supresor de tumor en ' ausencia de suero, y factores de crecimiento asociados, podría reflejar | complicados mecanismos regulatorios de retroalimentación negativa y positiva I sobre miR-17-92, y particularmente miR-20a, en CCR.

| En resumen, hemos explorado un gran conjunto de muestras de ! I I pCR clínico y tejido colorrectal normal coincidente para la expresión de miARN. pe descubrieron treinta y siete miARN expresados diferencialmente entre I normal y CCR de etapa temprana o tardía y la desregulación de 11 de estos miARN se confirmó en un panel de modelos de líneas de células de CCR. Por lo tanto, estos miARN candidatos son objetivos terapéuticos potenciales en esta ¡enfermedad. Específicamente, la adición de miR-143, pero no de miR-145, ! ¡puede considerarse como una aplicación terapéutica en CCR. i Un total de 100 nm de 2'-0-metil ARN antisentido de miR-145 biotinilado (5AAGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC3' (sec. con núm. de ident.: 1 )) (IDT) o el control inverso (5'CAGGUCAAAAGGGUCCUUAGGGAAS' (sec.

I cón núm. de ident.: 12)) (IDT) se transfectaron con Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) en 2x106 de células SW620/miR-145. 48 horas después de la j transfeccion, las células se cosecharon y se extrajo el ARN total mediante el uso I de TRIzol® (Invitrogen) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se | sometieron 100 pg de ARN total a tres reducciones secuenciales mediante el uso ' de 250 pg de bolillas magnéticas recubiertas con estreptavidina Dynabeads M-1 280 (Invitrogen). Cada reducción involucró el lavado de las bolillas dos veces con j 0.1 M de NaOH, 0.05 M de solución de NaCI y, después, una vez con 0.1 M de j NaCI. Las bolillas se volvieron a suspender en 0.1 M de NaCI y se adicionaron ! 250 pg de bolillas a la muestra de ARN. La muestra se agitó durante 20 minutos a 4 °C. Las bolillas se separaron de la solución de ARN mediante el uso de un aparato de separación magnética (Promega) y la solución (que contiene el ARN reducido) se quitó de las bolillas. El ARN reducido se precipitó con etanol y se analizó en busca de expresión de miR-145 y ARNnp U6 mediante análisis Northern. La eficacia de transfección del oligonucleótido de ARN antisentido 2?-metilo de miR-145 etiquetado FAM se condujo en paralelo con los experimentos de reducción. Se transfectó un total de 100 nM de ARN antisentido 2'0-metilo de miR-145 etiquetado FAM (IDT) con Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) en 1.2x105 de células SW620 que expresan miR-145. 48 horas después de la transfección, las células se cosecharon y se sometieron a análisis FACS.

Northern para miARN La extracción TRIzol® del ARN total se llevó acabo de conformidad con las especificaciones del fabricante (Invitrogen). En resumen, Mas células se lavaron con PBS y se adicionaron 5 mi de reactivo TRIzol®, y las j células se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de j adicionar 1 mi de cloroformo, las células se agitaron vigorosamente durante 15 | segundos a mano. Las muestras se centrifugaron y la capa acuosa se transfirió ' a un tubo falcon de 15 mi con 2.5 mi de isopropanol. Las muestras se incubaron ! a temperatura ambiente durante 20 minutos, se centrifugaron como se mencionó anteriormente para sedimentar el ARN y se volvieron a suspender con 1 mi de EtOH al 75 %. El ARN se sedimentó por centrifugación, se secó con aire y se volvieron a suspender en 50 µ? de agua DEPC (Ambion).

El análisis Northern se condujo mediante el uso de 15 % de geles I I F AGE-Urea, preparados mediante el uso del sistema de secuenciación SequaGel® (National Diagnostics), y se llevó a cabo electroforesis mediante el úso del aparato de electroforesis en gel MimProtean® II (BioRad). Se adicionó un i tjotal de 40 pg de ARN a 10 pl de tinte de carga de ARN (solución 2X de 95 % de fprmamida, 18 mM de EDTA y 0 025 % de dodecil sulfato sódico, xilen cianol y azul de bromofenol) y se incubó a 65 °C durante 10 minutos. Las muestras se cargaron en el gel PAGE-Urea/TBE al 15 % y se les realizó electroforesis en 1X TBE a 100 V hasta que el tinte azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel. El ARN se transfirió a la membrana Hybond-N+ (GE Healthcare) mediante el uso de a celda de transferencia electroforética Mini Trans-Blot (BioRad) en amortiguador TBE 0 5X con 80 V durante 1 hora. El ARN se retículo a la membrana mediante el uso del UV Stratahnker® 1800 (1200 joule) (Stratagene) I Las membranas se hibridaron previamente en 10 mi de solución I ide hibridación Express (Clontech) a 37 °C. La sonda de oligonucleótidos Starfire® se hirvió durante 1 minuto y, después, se adicionó a la solución de hibridación. Después de la hibridación durante toda la noche a 37 °C, la membrana se enjuagó tres veces con 2X SSC/0 1 % dodecil sulfato sódico y i i ¡se lavó aún más con solución 2X SSC/0 1 % dodecil sulfato sódico a 37 °C, ¡durante 15 minutos. La membrana se expuso a una pantalla de ¡almacenamiento de fósforo (GE Healthcare) durante la noche y se crearon imágenes mediante el uso de la máquina Typhoon Trio (GE Healthcare). La membrana se quitó de la sonda unida vertiendo 0 1 % dodecil sulfato sódico, hirviendo, directamente sobre la membrana y, después, permitiendo que la I solución se enfríe lentamente durante un período de 30 minutos.

Se sintetizaron sondas de oligonucleótidos personalizadas Starfire® mediante tecnologías de ADN integradas (IDT, por sus siglas en inglés). Las sondas de oligonucleótidos liofilizadas se disolvieron a 100 µ? de solución madre en IX TE pH 8.0 La reacción de etiquetado incluía amortiguador de reacción exo (NEB), 1 µ? de olígonucleótido de plantillé universal Starfire® (IDT) y 0.5 pmol de sonda de oligonucleótidos Starfire®. La mezcla de reacción se hirvió durante 1 minuto y se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de adicionar 50 µ?? a-32P-dATP (10 mCi/ml, i 6000 Ci/mmol) (Perkin-Elmer) y 5 U de ADN-polimerasa exo Klenow (NEB), y ¡ de incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos. La reacción se detuvo sor la adición de 40 µ? de EDTA 10 mM. El a-32P- dATP no incorporado se eliminó de la mezcla de reacción mediante el uso de columnas MicroSpin G- 25 (GE Healthcare) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Antes I ie usarse, la sonda se hirvió durante 1 minuto.

Secuencias de sondas Starfire® usadas íníR-l ' TACATACTTCTTTACATTCCA 3* (Sec. con núm. de ident. : 13) míR-126 5' OCATTATTA TCAOGOTACGA 3' (Sec. con núm. de ident. : 14) jmR1 a 5' TCAGTTTTGCATAGATTTGCACA 3' (Sec. con núm de ident : 15) rtu'R-22! 5' GAAACCCAGCAO ACAÁTGTAQCT 3' (Sec. con núm. de ident.:16) iniR-% J 5" GCAAAAATGTGCTAüTGCCAAA 3' (Sec. con núm. de ident.:17) rt.iR-182 5" imOAG'nCTA CATTrOCCAAA 3' (Sec. con núm. de ident.:18) raiR-145 5' AA jGArrOTGGOAAAACTGGAC 3* (Sec. con núm. de ident.:19) miR-30b 5" GCTGAG GTAGGATGTTTACA 3' (Sec. con núm de ident. 20) niR-194 5' TCCACATGGAGTTGC GTTACA 3' (Sec. con núm. de ident.:21 ) miR-t «ta 5* ACTCÁ<XXJACA< XJTTGAATGTT 3' (Sec. con núm de ident.:22) míR-1 3 5» TGAGCTACAÚTGCTTCATCTCA 3' (Sec. con núm. de ident.:23) jnÍR-26* 5* AC ^CTATOCTGGATT ACTTG AA 3* (Sec. con núm. de ident.:24) miR-27* 5* GG(X3GAACTTA<K*CÍACTG GAA 3' (Sec. con núm. de ident.:25) «ÓR-I03 y TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT 3' (Sec. con núm. de ident.:26) icriR-7 5* AACAAAATCACTAGTCT CXA 3' (Sec. con núm. de ident.:27) td-7a 5' AACTATACAACCTACTACCTCA 3' (Sec. con núm. de ident.:28) lnfl¾.-2ík 51 C ACC GCA 'ATAAGCA.CTrTA 3* (Sec. con núm. de ident.:29) raíR*25 5* TCAGA(X;GAGACAAGTGCAATG 3' (Sec. con núm. de ident.:30) miR^125b 5* TCACAAGTTAGGGTCrrCAGGGA 3' (Sec. con núm. de ident.:31 ) I miR- 155 5* CCCCTATCACGATTAGCATTAA ' (Sec. con núm. de ident.:32) míR-l 00 5' CACAAGTTCGGATCTACGCGTT 3' (Sec. con núm. de ident.:33) Se realizó mareaje terminal de la sonda de oligonucleótidos de ARNnp U6 (5' AACGCTTCACGAATTTGCGT 3' (sec. con núm. de ident.: 34)) mediante el uso de 20 pmole de sonda de oligonucleótido, amortiguador de polinucleótido IX T4 (NEB), 50 pCi Y-32P-dATP (10 mCi/ml, 6000 Ci/mmol) (Perkin Elmer) y 10 U de polinucleótido quinasa T4 (NEB), en un volumen final de 20 µ?. La sonda se incubó durante 30 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo por la adición de 40 µ? de EDTA 10 mm. Se quitó el y- 32P-dATP ! no incorporado de la mezcla de reacción mediante el uso de columnas ! MicroSpin G-25 (GE Healthcare), de conformidad con las instrucciones del j I fabricante. Antes de usarse, la sonda se hirvió durante 5 minutos.

Nombre ! Secuencia 1 pSilU6upper jGATCCCTCGAGTCT AG ATTTTTT GGAAA 2 pSilUeiower AGCTTTTCCAAAAAATCTAGACTCGAGG 3 143F jCGGGATCCCGGAGAGGTGGAGCCCAGGTC 4 43R jGCTCTAGACAGCATCACAAGTGGCTGA 5 145F ICGGGATCCCAGAGCAATAAGCCACATCC 6 145 R iGCTCTAGACTCTTACCTCCAGGGACAGC 7 míR-20F ICGGGATCCCGATGGTGGCCTGCTATTTCC 8 miR-20aR sCGGAATTCTCACACAGCTGGATGCAAA 9 miRcF jCGGGATCCCGTCCCCATTAGGGATTATGC 10 miRcR iCGGAATTCCCAAATCTGACACGCAACC 11 mtR-145 iAAGGGAUÜCCUGGGAAAACUGGAC antisentido 12 miR-1 5 AGGUCAAAAGGGUCCUUAGGGAA Control Inverso 13 miR-1 iTACATACTTCTTTACATTCCA 14 mtR-126 ÍGCATTATTACTCACGGTACGA 15 miR19a il CAG I \ I I GCA I AGA I i I GCACA 16 míR-221 ÍGAAACCCAGCAGACAATGTAGCT 17 miR-96 ÍGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA 18 miR-182 !TGTGAGTTCTACCATTGCCAAA 19 miR-145 ÍAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC 20 miR-30b ÍGCTGAGTGTAGGATGTTTACA 21 miR-194 jTCCACATGGAGTTGCTGTTACA 22 mtR- 81a CTCACCGACAGCGTTGAATGTT 23 miR-143 iTGAGCTACAGTGCTTCATCTCA 24 míR-26a GCCTATCCTGGATTACTTGAA 25 miR-27a IGGC GG AACTTAGCC ACTGTG AA 26 miR- 03 iTCATAGCCCTGTACAATGCTGCT 27 miR-7 iAACAAAATCACTAGTCTTCCA 28 iet-7a ÍAACTATACAACCTACTACCTCA i 29 miR-20a PTACCTGCACTATAAGCACTTTA 30 miR-25 TCAGACCGAGACAAGTGCAATG 31 m¡R- 25b rrCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA 32 miR-155 CCCCTATC AC GATT AGC ATT AA 33 miR-100 jCACAAGTTCGGATCTACGGGTT 34 U6 snR A ÍAACGCTTCACGAATTTGCGT 35 hsa-leí~7a iUGAGGÜAGUAGGUUGUAUAGUU 36 hsa-let-7e PGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 37 hsa-let-7f-1 jUGAGGÜAGUAGAUUGUAUAGUU 38 hsa-let-7f-2 lUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 39 hsa-miR- iUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 40 hsa-m¡R-100 ÍAACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 41 hsa-m¡R-103 AGCAGCAUÜGUACAGGGCUAUGA hsa-miR-106a lAAAAGUGCUUACAGÜGCAGGUAG hsa-miR- 06b ¡UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU hsa-miR-107 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA hsa-m¡R-10a [UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG hsa-miR~10b lUACCCÜGUAGAACCGAAUUUGUG hsa-miR-1223 lUGGAGUGUGACAAUGGUGUÜUG hsa-m¡R-125a IUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA hsa-miR-125b luCCCUGAGACCCUAACUUGUGA hsa-miR-126 luCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG hsa-miR-130b ¡CAG U GCAAUGAU GAAAGGGCAU hsa-miR- 333 lUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG hsa-miR-139 jUCUACAGUGCACGUGUCUCCAG jhsa-miR-140 AGUGGUUUUACCCUAUGGUAG jhsa-miR-141 jUAACACUGUCUGGUAAAGAUGG ¡hsa-miR-143 lUGAGAUGAAGCACUGUAGCUC jhsa-rniR-1 5 IGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU íhsa-miR-150 lUCUCCCAACCCUUGUACCAGUG jhsa-miR- 151 -3p|CU AGACUGAAGCUCCUÜGAGG jhsa-miR-155 iUUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU |hsa-rniR-15b lUAGCAGCACAUCAUGGUUUACA !hsa-miR-17-5p |C AAAGUGCU UACAGU GC AGGU AG |hsa-miR-181a jAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU ¡hsa-miR-181b AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU ihsa-mÍR-182 iU UU GGCAAUGGU AGAACUCAC ACU hsa-miR-183 lUAUGGCACUGGUAGMUUCACU ihsa-miR-186 iCAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU |hsa-miR-188 !CAUCCCU UGCAU GGUGGAGGG |hsa-miR- 8a jUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG |hsa-m¡R-192 CUGACCUAUGAAUUGACAGCC |hsa-m¡R-194 DGU AAC AGCAACUCCAU G UGGA | sa-m¡R-195 IJAGCAGCACAGAAAU AU UGGC ¡hsa-miR-19a UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA jhsa-miR- 9b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA |hsa-miR-200a UAACACUGUCUGGÜAACGAUGU ¡hsa-m¡R-200b UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA Jhsa-miR-203 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG hsa-miR-20a JUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG jhsa-miR-21 (UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA hsa-miR-215 lAUGACCUAUGAAUUGACAGAC hsa-miR-22 |AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU hsa-míR-221 ÍAGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC hsa-miR-224 ICAAGUCACUAGUGGUUCCGUU hsa-miR-25 ¡CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA hsa-miR-26a IUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCÜ hsa-miR-27a [UUCACAGUGGCUMGUUCCGC jhsa-miR-298 IAGCAGAAGCAGGGAGGU UCUCCCA ihsa-míR-29a IUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN ! REIVINDICACIONES j
1. ' 1.- Un proceso para determinar la etapa de cáncer colorrectal en humanos; el proceso comprende las etapas de: observar un cambio de regulación de un microARN de ARN extraído en relación con el mismo ¡microARN en una muestra de tejido colorrectal silvestre, en donde el microARN I se selecciona del grupo consistente de sec. con núm. de ident.: 56, sec. con núm. de ident.: 57, y combinaciones de las mismas; determinar la etapa de cáncer colorrectal sobre la base del cambio de regulación observado.
2. 2.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque también comprende la etapa de extraer ARN de una muestra de tejido antes de la etapa de observar un cambio de regulación. i
3. 3.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la etapa de observar un cambio de regulación i observa una regulación por aumento en la sec. con núm. de ident.: 56.
4. 4.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la etapa de observar un cambio de regulación j observa una regulación por disminución en un microARN seleccionado del j grupo que consiste de sec. con núm. de ident.: 56, sec. con núm. de ident.: , 57, y combinaciones de las mismas.
5. 5. - El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microARN incluye la sec. con núm. de ident.: 109 y la etapa de observar un cambio de regulación observa una regulación por aumento en la sec. con núm. de ident.: 109 y la sec. con núm. de ident.: 56.
6. 6. - El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el microARN incluye la sec. con núm. de ident.: 57 y se determina que la etapa de cáncer colorrectal es la etapa III o más tardía si hay una regulación por aumento de dos veces o más de la sec. con núm. de ident.: 57. j
7. 7.- Un proceso para diagnosticar la etapa de cáncer colorrectal ¡ en humanos, el proceso comprende las etapas de: extraer ARN de una célula | colorrectal; observar un cambio de regulación de al menos dos microARN del ARN extraído en relación con los mismos microARN en una muestra de tejido colorrectal, caracterizado porque el microARN se selecciona del grupo consistente de la sec. con núm. de ident.: 56, la sec. con núm. de ident.: 57, y combinaciones de las mismas; determinar la etapa de cáncer colorrectal sobre la base del cambio de regulación observado.
8. 8. - El proceso de conformidad con la reivindicación 7, 1 caracterizado además porque los al menos dos de los microARN incluyen la sec. con núm. de ident.: 109 y la sec. con núm. de ident.: 110.
9. 9. - Un proceso para diagnosticar la etapa de cáncer colorrectal en humanos; el proceso comprende las etapas de: observar un cambio de regulación de al menos dos microARN que incluyen la sec. con núm. de ident.: 56 y la sec. con núm. de ident.: 57; determinar la etapa de cáncer ¡colorrectal sobre la base del cambio de regulación observado.