MX2010006539A - Secrecion de acidos grasos por parte de microorganismos fotosinteticos. - Google Patents
Secrecion de acidos grasos por parte de microorganismos fotosinteticos.Info
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Abstract
Microorganismos fotosintéticos recombinantes que convierten carbono inorgánico a ácidos grasos secretados se describen. Métodos para recuperar los ácidos grasos secretados a partir del medio de cultivo sin la necesidad de cosecha celular también se describen.
Description
SECRECIÓN DE ÁCIDOS GRASOS POR PARTE
MICROORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS
o Técnico
Esta invención se refiere a microorganismos s que convierten carbono inorgánico en ácidos gr etan en un medio de cultivo, métodos de producció os usando tales organismos, y sus usos. Los ci en ser usados directamente o pueden ser modificad ente en formas alternas tales como ásteres, formas s como alcoholes, o hidrocarburos, para aplic rentes industrias, incluyendo combustibles y icos .
ica Antecedente
Microorganismos fotosintéticos , incluye riontes se cultivan bajo condiciones repletas de a que una cierta densidad celular se logra, des las células se someten a crecimiento bajo c cientes de nutrientes, lo cual frecuentemente ulación de lípidos neutros. Las células ent enadas por varios medios (v.gr. , asentamiento, qu itar por la adición de floculantes, seguido por ) , secadas, y después los lípidos son extraíd las por el uso de varios solventes no polares . La células y extracción de los lípidos son pasos i os . Sería deseable obtener lípidos a partir de mic fotosintéticos sin el requerimiento de cosecha y lares .
Los números de publicación PCT WO 2007/1 /119082 describen la producción de componente ustible usando microorganismos. Estos documentos
eniendo carbono inorgánico como la fuente p ono. La presente invención toma ventaja de la efi ismos fotosintéticos al secretar ácidos grasos O para recuperar estos compuestos valiosos.
La invención incluye la expresión de genes cil-ACP tioesterasa (TE) en microbios fotosintétic stos genes, junto con su uso para alterar meta dos en semillas de aceite, han sido previamente S que codifican a las proteínas que catalizan vari íntesis y metabolismo adicional de ácidos grasos descrito de manera extensa.
Las dos clases funcionales de acil-ACP tioe tas {FatA que reconoce ácidos grasos insaturados reconoce ácidos grasos saturados) pueden agrupars lineaciones de secuencia de aminoácidos así como f muestran preferencia marcada por 18:1-ACP con cetil-CoA, para formar acetoacetil-ACP, liberan oacetil-ACP entonces se reduce, se deshidrata, y ionalmente a butiril-ACP que puede entonces po ensarse con malonil-ACP, y el ciclo repetirse, añ ad de 2 carbonos en cada vuelta. La producción os libres por lo tanto se acrecentaría por una t se liberaría al propio ácido graso a partir de ACP, iclo. Esto es, se previene que la acil-ACP re o. Producción del ácido graso también se alient centar los niveles de sintetasa de ácido graso quier enzima que resulta en degradación o ional del ácido graso.
La figura 2 presenta una descripción mas de ormación secuencial de acil-ACPs de cadenas mas y se muestra, las enzimas tioesterasas listadas e beran al ácido graso del tioéster de ACP.
ty acid biosynthesis redirected to médium chains i oilseed plants" . Voelker, T. , y Davies, M. , eriology (1994) 176:7320-7327, describe "Alterat ificity and regulation of fatty acid synthesis of by expression of a plant médium- chain acyl-ac ein thioesterase" .
igación de la Invención
La presente invención se dirige a la pro oorganismos fotosintéticos recombinantes que son etar ácidos grasos derivados de carbono inorgánic O de cultivo. Métodos para remover los áci etados a partir del medio de cultivo sin la nec cha de células también son provistos. Se anticipa ras llevarán a menores costos para producir comb de lípidos y químicos a partir de microorganismos S . Además, esta invención permite la producción
rial de alimentación de carbono primario, sino sol ezcla o vehículo (por ejemplo, emisiones de plant ustible (v.gr., etanol) , plantas de energía, re de petróleo, así como fuentes atmosféricas y subt
Una forma de realización de la invención se ultivo de microorganismos fotosintéticos reco os organismos comprendiendo por lo menos un esión recombinante que codifica por lo menos un sterasa exógena, donde la por lo menos una acil-AC exógena de preferencia libera cadenas de á eniendo 6 a 20 carbonos a partir de estos tioés os grasos se forman a partir del carbono inorgáni te de carbono y el cultivo contiene sustancialment ono inorgánico como una fuente de carbono. La pres sterasa exógena incrementará los niveles de se os grasos deseados por al menos 2-4 veces.
a fuente de carbono y donde dicho microorganismo o graso liberado por la acil-ACP tioesterasa haci formas de realización alternativas, la tioes erencia libera una cadena de ácido graso que cont , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 car
En otros aspectos, la invención se dirige a producir ácidos grasos de longitudes de caden ante incubar estos cultivos y recuperar estos áci etados a partir de los cultivos . En una forma de re ecuperación emplea adsorbentes sólidos en partí char los ácidos grasos secretados. Los ácidos perados pueden modificarse adicionalmente de maner arse directamente como componentes de bio-comb icos .
e Descripción de los Dibujo»
La figura 1 es un diagrama de la tray La figura 5 muestra un sistema experimental principios de la figura 4.
La figura 6 muestra acil-ACP tioesterasa repr rtir de una variedad de orgcinismos.
s para Llevar a Cabo la Inv€inción
La presente invención proporciona micro sintéticos que secretan ácidos grasos hacia el ivo, junto con métodos para adsorber los ácido ir del medio de cultivo y recolectarlos para p a combustibles y químicos. La invención por ende rmente reduce la necesidad por cosechar y e las, resultando en costos de producción susta cidos.
La figura 2 es un resumen de un aspecto de . Como se muestra en la figura 2, dióxido de ierte a acetil-CoA usando los múltiples pasos en ersiones adicionales a ácidos grasos de cadena ren en esta forma de realización, la biomasa cel charse también. Los ácidos grasos secretados pued e a varias otras formas incluyendo, por ejem res, alcanos, alquenos, alf -olefinas y alcoholes
Tioesterasas (Acil-ACP Tes)
Para efectuar secreción de los ácidos grasos ee al organismo con por lo menos un sistema de exp lo menos una tioesterasa que opera preferenciali rar ácidos grasos de la longitud deseada. Muchos fican tales tioesterasas están disponibles en l as de estas son sujeto de patentes US como sigue
Ejemplos incluyen la patente US 5,298,421 t medium-chain-preferring acil-ACP thioesterases ods" , que describe el aislamiento de una acil-ACP t gen que la codifica a partir de semillas in , la patente US 5,667,997, titulada "C8 and CIO me esterases in plants" , la patente US 5,723,761, nt acyl-ACP thioesterase sequences", la patente US lada "Plant thioesterases and use for modificatio composition in plant seed oils" , la patente US lada "Production of myristate in plant cells" , la 0,631, titulada "Middle chain-specific thioeste Cuphea lanceolata" , la patente US 5,945,585, cific for palmitoyl, stearoyl and oleoyl-alp eic acid fragments encoding acyl-ACP thioesterase se of these fragments in altering plant oil compos nte US 5,955,329, titulada "Engineering plant thi altered substrate specificity" , la patente US lada "Nucleotide sequences of canola and soybean thioesterase genes and their use in the regulatio content of the oils of soybean and canola pla ession in Escherichia coli of a cDNA cocling for t carrier protein thioesterase from coriander ( vum L . ) " . Filichkin, S,, et al., European Journa nce and Technology (2006) 108:979-990, describe esterases from a high-laurate Cuphea species: Func lementation analyses" . Jones, A., et al., Plant C 9-371, describe "Palmitoyl-acyl carrier prot esterase and the evolutionary origin of plan esterases" . Knutzon, D. S., et al., Plant Physiol 1751-1758, describe "Isolation and characterizat lower oleoyl-acyl carrier protein thioesterase cD augh, M . , et al., The Plant Journal (1998) i ribe "Condensing enzymes from Cuphea wrightii asso um chain fatty acid biosynthesis" .
Genes adicionales, no aislados previam fican estas acil-ACP TEs pueden aislarse de p Los acil-ACP TEs conocidos de plantas puede os clases principales, con base en sus sec oácidos y su especificidad para acil-ACPs de itudes de cadena y grados de insaturación. El tip -ACP TE de plantas tiene actividad preferencial so con ello liberando ácido oleico, un ácido gr onos con un solo doble enlace a nueve carbonos de grupo carboxilo. El tipo "FatB" de acil-ACP TE e actividad preferencial sobre acil-ACPs saturado r especificidades de longitud de cadena amplias o ejemplo, enzimas FatB a partir de diferentes e ea se han mostrado liberando ácidos grasos varia onos de longitud a dieciséis carbonos de longitud acil-ACPs correspondientes. Listados mas adelante tán varios acil-ACP TEs de plantas junto con sus p sustrato. (Ácidos grasos se designan por nota Tabla 1
-ACP Tioest€irasa de Plant
Garcinia mangostana FatA 18 :1 y 18 : 0
Carthamus tinctorius FatA 18 :1
Coriandrum sativum FatA 18 :1
Cuphea hookeriana FatBl 16 :0
Cuphea hookeriana FatB2 8: 0 y 10: 0
Cuphea wrightii FatBl 12 : 0 a 16 : 0
Cuphea palustris FatBl 8 : 0 y 10: 0
Cuphea palustris FatB2 14 :0 y 16 : 0
Cuphea calophylla FatBl 12 :0 a 16 : 0
Ümbellularia californica FatBl 12 : 0
ülmus americana FatBl 8 : 0 y 10: 0
Las enzimas listadas en la Tabla 1 son ej os genes adicionales que codifican acil-ACP arse y usarse en esta invención, incluyendo pero es tales como aquellos que codifican a las siguie 3870.1, AAD42220.2, AAG35064.1, AAG43857 1 P 3859 .1, AAG43860 ¦ 1, AAG43861 .1, AAL15645 .1, ? 7445 .1, AAL79361 .1, AAM09524 .1, AA 17328 .1, A 8223 .1, AAX51636 .1, AAX51637 .1/ ABB71579 A 7311 .1, ABD83939 1 ABE01139 .1, ABH11710 .1/ A 0759 .1, ABI20760 .1, ABL85052 .1, ABU96744 .1, E 6874 .1, EAY86877 .1, EAY86884 -1, EAY99617 ¦ 1, E 9668 .1, EAZ12044 .1 EAZ23982 .1, EAZ37535 .1, E 010475.67.1, NP_001056776.1 , NP_001057985.1 , NP__00 01068400.1, NP_172327.1, NP_189147.1, NP 01415703.1, Q39473, Q395I3, Q41635, Q42712, 89147.1, AAC49002, CAA52070.1, CAA52069.1, 9106, CA017726, AAC72883, AAA33020, AAL79361, A 1523, AAL77443, AAA33019, AAG35064, y AAL77445.
Fuentes adicionales de acil-ACP TEs que son presente invención incluyen: Arabidopsis thal tes .
En una forma de realización, la presente empla la producción específica de una longitud ind os grasos de cadena media, por ejemplo, predomi uciendo ácidos grasos C8 en un cultivo de micro sintéticos recombinantes . En otra forma de reali enté invención contempla la producción de una comb o mas ácidos grasos de diferente longitud, po os grasos tanto C8 y CIO en un cultivo de micro sintéticos recombinantes .
Ilustradas a continuación son manipulacione s conocidos en la materia para construir si esión adecuados que resultan en la producción de tivas de las tioesterasas en organismos foto mbinantes seleccionados. En tales construcciones, able remover la porción del gen que codifica la l hospedero fotosintético se pueden hacer. Por e edero puede modificarse para incluir un sistema de un gen heterologo que codifica una ß-cetoacil sin preferencialmente produce acil-ACPs teniendo lon a media. Tales enzimas KAS han sido descritas a as plantas, incluyendo varias especies de Cuphea. et al., The Plant Journal (1998) 15:383-390, des a 3-ketoacyl-ACP synthase from Cuphea sp. is a me ific condensing enzyme" Slabaugh, M. , et al., al (1998) 13:611-620, y serviría para incre mibilidad de moléculas de acil-ACP de la longitud reconocimiento y separación por la acil-ACP TE a heteróloga,. Otro ejemplo es que la célula sintética conteniendo un gen de acil-ACP TE heteró ficarse adicionalmente para incluir un sistema de un gen heterologo que codifica una acetil-CoA C o, o las propias enzimas pueden inhibirse. Esto pr adación de ácidos grasos liberados de acil-ACPs rando el rendimiento de ácidos grasos secretados e los productos deseados son ácidos grasos de cad esactivación o regulación hacia abajo de genes qu mas acil-CoA sintetasa y/o acil-CoA oxidasa que d usan estas longitudes de cadena como sustra ficas. Mutaciones en los genes que codifican enzim etasa especifica de cadena media y/o acil-C cífica de cadena media tal que la actividad de las inuya también serían efectivas para incrementar el de ácidos grasos secretados. Una modificación ctiva o regula hacia abajo al gen de acil-ACP s ctiva al gen o proteína. Mutaciones en los genes oducir por métodos ya sea recombinantes o no reco s enzimas y sus genes son bien conocidos, y puede El microorganismo fotosintético también ficar tal que uno o mas genes que codifican ectoría de biosíntesis de carbohidratos o polihidro PHA) de almacenamiento se han desactivado o regu o, o las propias enzimas pueden inhibirse. Ejempl mas involucradas en síntesis de glicógeno, olaminarina, incluyendo glucano sintasas y e ficación. Otros ejemplos incluyen enzimas invol íntesis de PHA tales como acetoacetil-CoA sint asa.
Sistemas de Expresión
Expresión de genes heterólogos en cianob s eucariotas se habilita por la introducción de v esión apropiados. Para transformación de cianobac edad de promotores que funcionan en cianobacte izarse, incluyendo, pero no limitado a los promo uyen los siguientes:
secA (secreción; controlada por el estado r célula)
rbc (operón Rubisco)
psaAB (proteínas de centro de reacción PS I; por luz)
psbA (proteína DI de PS II; inducible por l De manera similar, una amplia variedad de te ranscripción se pueden usar para construcción de esión. Ejemplos de terminadores posibles incluyen, tan a, psbA, psaAB, rbc, secA, y proteína de rev
Vectores de expresión se introducen dentro d obacterianas por métodos estándar, incluyendo, tados a, captación de ADN natural, conjugación, el , bombardeo de partículas, y abrasión con perlas otores y termxnadores de genes que funcionan en al en utilizarse, incluyendo, pero no limitado a pr inadores de Chlamydo onas y otras algas, pr inadores de virus, y promotores y terminadores si
Vectores de expresión se introducen dentro d lgas verdes por métodos estándar, incluyendo tados a, electroporación, bombardeo de partículas, perlas de vidrio, fibras SiC, u otras partí ores pueden ser 1) apuntados para integración esp O hacia el cromosoma de cloroplasto de alga verd uir secuencias de flanqueo que permiten rec 1oga hacia el cromosoma, o 2) apuntados para i a el cromosoma celular (localizado en núcleo) .
Para transformación de diatomeas, una v otores de genes que funcionan en diatomeas puede tos vectores de expresión, incluyendo, pero no l ID NO: 6). Estas secuencias se deducen a part encias genómicas de los organismos relevantes disp S de datos públicas y son meramente ejemplares de edad de promotores que se pueden usar. Los te iados con estos y otros genes, o genes heterólogos ueden usarse para detener la transcripción y prop l apropiada por poliadenilación y pueden deriva ra similar o se conocen en la materia.
Vectores de expresión se introducen en la omeas por métodos estándar, incluyendo, pero no li troporación, bombardeo de partículas, y abrasión idrio, fibras SiC, u otras partículas. Los vecto
1) apuntados para integración específica de siti osoma de cloroplasto de diatomea mediante incluir flanqueo que permiten recombinación homologa osoma, o 2) apuntados para integración hacia el obacterias (algas verdeazuladas) . Algas repre uyen algas verdes (clorofitos) , algas rojas, inofitos, glaucofitos, cloraracniofitos , eug ofitos, y dinoflagelados . Un número de especies c as se conocen y se han manipulado usando técnicas culares, incluyendo las cianobacterias unicelul ystis sp. PCC6803 y Synechococcus elongates PCC7 mas han sido completamente secuenciados .
Los siguientes géneros de cianobacterias pue rupo incluye
aesiphon Dactylococcopsis Prochlorococc coccus Gloeobacter Prochloron obacterium Gloeocapsa Synechococcus obium Gloeothece Cynechocystis othece Microcystis
Otro grupo incluye
olyngbya Prochlorothrix Tychonema
Aun otro grupo incluye
aena Cyanospira Nostoc
aenopsis Cylindrospermopsis Rivularia nizomenon Cylindrospeirmum Sytonema thrix Nodularia Tolypothrix
Y otro grupo incluye
rogloeopsis Geitleria Nostochopsis herella lyengariella Stigonema
Además, varias algas, incluyendo diatomea es pueden emplearse.
Cualidades deseables de la cepa hospedera in de crecimiento potencial y productividad de líp
I
, alta tolerancia á intensidad de luz, crecimien bre o salina, es decir, en amplio rango de tipo stencia a inhibición de crecimiento por altas conce ema de restricción y recombinación homologa efici de que se requiera de genes o derribo
Adsorción, Remoción, y Recuperación de Acid Los ácidos grasos secretados hacia el medio los microorganismos fotosintéticos. recombinantes riormente se pueden recuperar en una variedad de do de aislamiento directo por partición usando ibles puede emplearse. En una forma de realizació adsorbentes en partículas pueden emplearse. Estas ículas lipófilas o resinas de intercambio de ion do del diseño del método de recuperación. Pu ulando en el medio separado y después colectarse, e pasarse sobre una columna de lecho fijo, por ej mna cromatográfica que contiene estas partículas. os entonces son extraídos de los adsorbentes en el uso de un solvente apropiado. Evaporación del acrilatos y derivados, silicona y derivados, y pol rivados . Ciertos materiales de vidrio y cerámicos en usar como un componente de soporte sólido de l adsorben grasa. Las supeirficies de los adso ículas pueden modificarse teil que sean mas capace os grasos y lipidos. Un ejeimplo de tal modifica oducción de los grupos alquilo enlazados a éte as longitudes de cadena, de preferencia 8-30 ca ejemplo, cadenas de acilo de varias longitudes pu superficie de los objetos que adsorben gras ces de éster, tioéster, o amida.
En una forma de realización, los adso ículas son revestidos con compuestos inorgánicos ligar ácidos grasos y lipidos. Ejemplos de tales uyen pero no se limitan a hidróxido de aluminio acita, y sílice.
mna regenerada. El solvente conteniendo a los áci eltos entonces se evapora, dejando a los ácidos g do purificado para conversión adicional a q ustibles. Los adsorbentes en partículas pueden dis eutramente boyantes o positivamente boyantes para ulación en el medio de cultivo. Un ciclo continuo uperación de ácidos grasos puede implementarse me asos delineados anteriormente. Los ácidos grasos r en convertirse a compuestos orgánicos alternativ etamente, o mezclarse con otros componentes. Métod tales conversiones son bien entendidos en la i rrollos de métodos biológicos para tales conversió ontemplan.
La presente invención además contempla una osiciones que comprenden los ácidos grasos produci oorganismos fotosintéticos recombinantes descri o. El bio-crudo puede procesarse por refinerías qu los compuestos de la composición a varios ree óleo y petroquímicos , incluyendo alcanos, o áticos a través de procesos que incluyen hidrotr arboxilación, isomerización y desintegración ( rmación catalíticas. El bio--crudo puede también c mbustibles a base de éster, tales cómo metil ste 0 (comercialmente conocido como bio-diesel) , a esos químicos establecidos incluyendo trans-ester rificación.
Además, un técnico en la materia podría cont edad de otros usos para los ácidos grasos de l ción, y derivados de los mismos, que son bien co ateria, por ejemplo, la producción de químicos ioactivos, detergentes, lubricantes, nutracéuticos , S, cosméticos, etc. Por ejemplo, derivados de ezcla de diferentes compuestos producidos biológi san como un material de alimentación para ref plazo de, o en complemento de, aceite crudo u otra óleo. En general, pero no necesariamente, estos ma entación han sido pre-procesados a través d ógicos, químicos, mecánicos o térmicos para es do líquido que es adecuado para introducción en un etróleo .
Los ácidos grasos de la presente invención io-crudo, y además procesarse a una composici ustible. El bio-combustible puede entonces desemp ombustible terminado o un aditivo de combustible.
"Combustible terminado" se define como un ico o una mezcla de compuestos químicos (producid utas químicas, termoquímicas o biológicas) que do químico y físico adecuado para usarse directa ndido por compresión (diesel) , combustible para a usado en una turbina de avicLción, petróleo combus se en una caldera para generar vapor de agua o en istión externa, etanol para usarse en un motor de c ible. Ejemplos de especificaciones de combus ndares ASTM, principalmente usados en los Estados estándares EN, principalmente usados en Europa.
"Aditivo de combustible" se refiere a un c osición que se usa en combinación con otro combu variedad de razones, que incluyen pero no se lir con mandatos en el uso de bio-combustibles , umo de productos derivados de combustibles fósile esempeño de un combustible o motor. Por ejemplo, a ustible pueden usarse para alterar el punto d /gelación, punto de nebulosidad, lubricidad, v bilidad oxidativa, calidad de ignición, nivel de osión.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilu ara limitar la invención,
pio 1
eción de Ácidos Grasos por Cepas Derivadas de la C Fotoautotrófica Unicelular Synechococcus elongat
El gen FatB2 de Cuphea hookeriana que co ma de acil-ACP tioesterasa (ChFatB2) se modi esión optimizada en Synechococcus elongatus ero, la porción del gen que codifica la región de sito de plástido de la proteina ChFatB2 nativa se o de la región de codificación entonces fue opt n usando el programa de software "Gene Designer 4.1) provisto por DNA2.0 , Inc. La secuencia de nuc derivado del gen ChFatB2 (posteriormente ChFatB ista como SEQ ID NO: 7. La secuencia de proteínas
eínas eucariotas en E. coli y también es inducible
Los fragmentos de fusión de ChFatB2-7942 ativamente a trc o trcE, junto con el gen laclq, s a el vector de lanzadera Pam2314 (Mackey, S. R. ods Mol. Biol. (2007) 362:115-129), que permite la ?? de 5. elongatus PCC 7942 mediante integración m mbinación homologa doble hacia el sitio "NSl" del lásmido construido conteniendo al cartucho de : : ChFatB2-7942 y el gen laclq es designado pSGI-Y representa la secuencia entre e incluyendo los mbinación NSl de pSGI-YCOl. El plásmido construido l cartucho, de expresión trc : : ChFatB2-7942 y ge gna pSGI-YC09. SEQ ID NO: 10 representa la secuenc uyendo a los sitios de recombinación NSl de pSGI- Cada uno de los plásmidos pSGI-YCOl y pSGI-el vector de control pA 2314, se introducen en las aces ele 250 mL y se indujeron mediante añadir ? l=l mM) si aplicable. Se tomaron muestras de cul
96, y 168 horas después de inducción de IPTG y raron a través de filtros Whatman GF/F usando un m ro al vacío. Filtrados se colectaron en tubos de roscada para análisis cromatográfico de gases (G
Ácidos grasos libres (FFAs) se separaron d lares filtrados usando extracción líquido- líquido filtrado se mezclaron con 125 µL de H3P03 1M y 0.25 seguido por adición de 2 mL de hexano y mezclado análisis GC-FID, uña muestra de 0.2 µ? de hexano do una relación de división de 40:1 sobre una colun Scientific, 15 m x 250 µ?t? x 0.25 µt?) , con un eraturas comenzando en 150 °C por 0.5 minutos, lueg 15°C/min hasta 230°C y manteniendo por 7.1 mi in He) .
Tabla 1-1
reción de ácidos grasos de cadena media en varias
S. elorigatus
Plásmido Ácidos 9 pa Cepa Madre _ , . , Transgenes
Añadido 8 : 0
YC2-5 PCC 7942 pAjM2314 ninguno ND
YC1-2 PCC 7942 pSGI-YCOl trcE: :ChFatB2-7942 1.5
C14-4 PCC 7942 pSGI-YC09 trc : :ChFatB2-7942 5.1 ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
pio 2
eción de Ácidos Grasos por Cepas Derivadas de la C Fotoheterotrofica Unicelular Synechocystis sp. PC
Los fragmentos de fusión trcE::ChFat : ChFatB2-7942 , junto con el gen laclq, se clonaro or de lanzadera pSGÍ-YC03 (SEQ ID NO: 11), el cual sformación de Synechocystis sp. PCC 6803 mediante i ada por recombinación homologa doble hacia el siti or de control pSGI-YC03, se introducen en las chocystis PCC 6803 de tipo silvestre, como se de , X. et al., J. Microbiol. (2007) 45:241-245. C mbinantes y de control se pre-cultivaron en 100 m l suministrado con kanamicina (10 mg/L) a fase de ío (OD730nm=l .0) en un agitador giratorio (150 rpm) inación constante (60 µ?-m"2 s"1) . Cultivos enton cultivados a una OD730nm=0. - 0.5 inicial en B ivaron durante la noche a OD730nm=0.7-0.9. Para e o de tiempo, alícuotas de 60 mL del cultivo se tra traces de 250 mL y se indujeron mediante añadir I l=l mM) cuando sea aplicable . Se tomaron muestras 72, y 144 horas después de inducción de IPTG y raron a través de filtros Whatman GF/B usando un ro de vacío Millipore. Filtrados se recolectaron ivo de tapa roscada para análisis cromatográfic
Resultados de análisis de GC indicando los de cadena media (8:0 y 10:0) en cultivos 144 hor nducción de IPTG se muestran en la Tabla 2-1.
Tabla 2-1
reción de ácidos grasos de cadena media en varias
Synechocystis
Plásmido Ácidos
Cepa Madre , Transgenes
Añadido 8:0
YC9-8 PCC 6803 pSGI-YC03 ninguno ND
YC10-5 PCC 6803 pSGI-YC08 trcE : : ChFatB2-7942 61.3
YC16-2 PCC 6803 pSGI-YC14 trc : : ChPatB2- 7942 2.7 ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
ipio 3
eción de Ácidos Grasos por Cepas Derivadas de las Filamentosas AnaJbaena variabilis ATCC 29413
Los fragmentos de fusión trc : : ChFat ectivamente .
Cada uno de los plásmidos pSGI-YC69, pSGI-Y el vector de control pEL17, se introducen en las ariabilis ATCC 29413 de tipo silvestre mediante c parental, como se describe por Elhai y Wolk (Met o 8) 167:747-754). Cepas tanto recombinantes y de c cultivadas en 100 mL de medio BG-11 suministrado espectinomicina (3 mg/L) a fase de logari 0nm=l .0) en un agitador giratorio (150 rpm) a inación constante (60 µ?-m-2 s"1) . Cultivos enton cultivados a una OD730nm=0.4-0.5 inicial en B ivaron durante la noche a OD730nm=0.7-0.9. Para e o de tiempo, alícuotas de 60 mL del cultivo se tra traces de 250 mL y se indujeron mediante añadir I 1=1 mM) cuando sea aplicable. Se tomaron muestras 72 horas y después se filtraron a través de filt rrumpió mediante reemplazar una porción 422 -bp in ?? de codificación: con una secuencia de ADN d ando el gen marcador de resistencia a cloramfenico fica cloramfenicol acetiltransferasa) . Pares cebad ID NO: 16) /918-13 (SEQ ID NO: 17) y 918-25 (SEQ ID N SEQ ID NO: 19) se usaron para amplificar dos fragme espondientes a una :porción 5' (1-480 bp) y una -1,521 bp) de la región de codificación de synpcc ectivamente . El fragmento cat se amplificó a mido pAM1573 (Mackey et al., Methods Mol. Biol. 3 do PCR con cebadores NS21-3Cm (SEQ ID NO: 20) y te O:21), que traslapan cebadoires 918-13 y 918-25, e. La técnica de PCR quimérica recombinante enton . amplificar el cartucho de interrupción completo c mentos de PCR anteriormente mencionados, así como 15 y 918-23. El fragmento de PCR de extremo chato e llevan a cabo como se describe en el ejet itado de los análisis de GC indicando los niveles ivos de varias cepas de S, elongatus 168 horas cción de IPTG se muestran en la Tabla 4-1. Es p ctivación del gen de acil-ACP sintetasa tenga r sobre la secreción de ácidos grasos de cadena e la secreción de ácidos grasos de cadena media.
Tabla 4-1
reción de ácidos grasos de cadena media en varias
S. elongr tus
Ácidos
Cepa Plasmido
pa . Transgenes Supresiones
Madre Añadido
8:0 10
C2-5 PCC 7942 pSGI-YC03 ninguno ninguna ND ND
trcE : : ChFatB2 - C1-2 PCC 7942 pSGI-YC08 ninguna 1.4 4.
7942
tre : : ChFatB2- synpcc7942
C4-7 SGC-YC1-2 Psgi-YC14 - 1.0 3,
3 7942 0918
ND representa "no detectado" (<1 mg/L)
a el vector pCR2.1 (Invitrogen) para producir plás y subsecuentemente se cortó con la enzima de r . Un cartucho de marcador de resistencia de clo eniendo al gen cat y secuencias de control re iadas se amplificó a partir del plásmido pAM1573 l. , Methods Enzymol. (2000) 305:527-542) contenie estricción Mfel de flanqueo usando PCR con cebad ID NO:25) y NB011 (SEQ ID NO:26). El cartucho de en cat se insertó hacia el sitio Mfel de pSG ucir pSGI-NB5 (SEQ ID NO:27).
El vector pSGI-NB5 se transformó hacia l chocystis SGC-YC10-5 conteniendo trcE : : ChFatB2-plo 1) de acuerdo con Zang et al., J. Microbíol 41-245. Inserción del marcador de resistencia de e hacia el gen Slrl609 a través de recombinación h fico por análisis y selección por PCR de inserto baron durante la noche. 45 mL de cultivo durante se añadieron a matraces de 250 mL nuevos, on IPTG 1 mM o usando controles no inducidos. Mué e tomaron a 0, 72 y 144 horas post- inducción y se se describe en el ejemplo 2.
Ácidos grasos libres (FFAs) se separar ciones de sobrenadante de cultivos filtrados por ido- líquido para análisis GC/FID (detector de ion a) . Para cada muestra, 2 mL de cultivo filtrado una mezcla de 50 yL de ácido fosfórico (1M) , 100 y 2 mL de hexano. Una muestra de 0,2 µ? se inye relación de división de 40:1 sobre una columna DB ntific, 15 m x 250 µp? x 0.25 µt?) , con un perfil de comenzando en 150 °C por 0.5 minutos, luego ca l/min hasta 230°C y manteniendo por 7.1 minutos ( Tabla
reción de ácidos grasos de cadena media en varias
Synechocystis
Nota: ND representa "no detectado" (<1 mg/L)
esión de genes Cuphea lanceolata Kas-IV y Heliant III en Synechocystis sp.
Un fragmento de ADN comprendiendo un operón intetizó tal que contenga los siguientes eleme n dado: el promotor trc, el gen de 3 -cetoacil-aci adora de sintasa IV de Cuphea lanceolata (ClKas- so GenBank CAC59946) optimizado en codón para e so GenBank ABP93352) optimizado en codón para ex o Synechococcus elongatus PCC 7942 y Synechococc , y el terminador rpsl4 (SEQ ID NO: 28) de Synech 02. La secuencia de nucleótidos de este operón o con los varios sitios de reconocimiento de ricción de flanqueo, se proporciona en la SEQ ID
La optimización de codones se llevó a cabo programa de software "Gene Designer" (versió isto por DNA2.0, Inc. El operón funcional (c esión) conteniendo al gen ClKas-IV modificado por epresenta en la SEQ ID NO: 29 fue digerido por las ricción Spel y Xbal y se insertó en plásmido pSGI-sitios de restricción Spel y Xbal para formar plá , que permite la integración del operón funci osoma de Synechocystis sp. PCC 6803 en el sitio de "RS2" (Aoki et al., J*. Bacteriol. (1995) 177:560 en optimizado HaKas-III, y el terminador rpsl esenta en la SEQ ID NO: 32 y se hizo mediante i mento BamHI/SacI (conteniendo la región intergé gatus kaiBCf el gen Ha as-III, y el termina rado mediante amplificación por PCR hacia pSGI-BL4 BglII/SacI. Los cebadores de PCR usados para mento de ADN conteniendo la región kaiBC, Ha inador rpsl4 son provistos como SEQ ID NO: 33 y SE
Células de Synechocystis PCC 6803 de tipo s epa de Synechocystis transgénica SGC-YC10-5, que c ChFatB2-7942 , se transformaron con plásmidos pSGI- , pSGI-BL43 y pSGI-BL44 como se describe por Zang, icrobiol. (2007) 45:241-245. Cepas de control tan es y de tipo silvestre se pre-cultivaron en 20 m l a fase logarítmica media (OD730nm=0.7-0.9) en u torio (150 rpm) a 30°C con iluminación con iple de filtro de vacío Millipore. Filtrados se co S de cultivo de tapa roscada para análisis cromato S (GC) como se describe en el ejemplo 2.
Resultados indicando los niveles secretado oico y ácido decanoico en sobrenadantes de cultiv ués de inoculación de cultivo se muestran en la genes ClKas-IV y HaKas-III presentes en las cepas vieron bajo el control del promotor trc .
Tabla 6-1
eción de ácidos grasos de cadena media (en mg/L) cepas de Synechocystis sp.
Ácidos
Plásmido
Cepa Cepa Madre Transgenes
Añadido
8:0
6803 n/a n/a inguno ND
-YC10-5 PCC 6803 pSGI-YC08 trcE-ChFatB2-7942 69.8
-BL26-3 PCC 6803 pSGI-BL26 trc-ClKas-IV ND
trcE-ChFatB2-7942
sta solicitud podrían normalizarse en una manera
Tabla 6-2
creción de ácidos grasos de cadena media normali mg/L/OD730nm) en varias cepas de Synechocystis
ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
Resultados indicando los niveles secretado noico y ácido decanoico en cultivos sobrenadante ionales 120 horas después de inoculación de Tabla 6-3
eción de ácidos grasos de cadena media (en mg/L) cepas de Synechocystis sp.
ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
Para una medición mas optimizada de secreció os en estas cepas, los datos de secreción de áci rados en la Tabla 6-3 se normalizaron a densidad lar, medida como densidad óptica a 730 nm (OD73 S se presentan en la Tabla 6-4.
Tabla 6-4
creción de ácidos grasos de cadena media normali mg/L/OD730nm) en varias cepas de Synechocystis
ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
pio 7
oducción de un Gen Heterologo de Acil-ACP Tioeste omea
Un gen sintético que codifica un derivado d .tB2 con especificidad para acil-ACPs de cadena m encia de nucleótidos provista como SEQ ID NO: 35 re vado sintético del gen ChFatB2 que se ha optim esión en Thalassiosira pseudonana y en la cual la ficación de péptido de tránsito de pl stido nativa eemplazado con el péptido de tránsito de plástido ( encia de señal acoplada) asociada con la sub-unid orción de factor de acoplamiento (CF1) de la ATP oplasto a partir de T. pseudonana (Ide jgi/Thaps3/40156/est Ext__gwp_gwl . C_chr_ 0019 ) . L ficada por este gen, referida en la presente com , es provista en la SEQ ID NO: 36.
Para producir un vector de expresión para T. el gen ChFatB2-Thal se colocó entre el promoto liña de T. pseudonana y las secuencias regulatori s. El promotor de alfa-tubulina se amplificó a pa mico aislado de T. pseudonana CCMP 1335 por /BamHI para formar pSGI-PR16. Adem s, un gen opti n que .codifica la enzima nourseotricina acetilt ) a partir de Streptomyces noursei (SEQ ID NO: 1) ( Gene (1993) 127:127-131) se sintetizó y el /BamHI a partir de pSGI-PR5 para formar pSGI-PR7 oducción hacia T. pseudonana y otras diatom orcionar resistencia al antibiótico nourseotricin pSGI-PR16 y pSGI-PR7 se co-transíormar donana CCMP 1335 mediante bombardeo de partículas e como se describe por Poulsen, et al. (J. Phyc 059-1065) . Células transformadas se seleccionaron gar en la presencia de 100 mg/L de nourseotricina nido de Werner BioAgents, Alemania) . La presenc tB2-Thal en células, se confirmó por el uso de PCR. es se cultivaron en medio líquido ASW (Darley y Vo Res. (1964) 58:334). en un agitador giratorio ( ?? 8
eción de Ácidos Grasos por Algas Verdes
Un gen sintético que codifica un derivado d tB2 con especificidad para acil-ACPs de cadena m ) se expresa en algas verdes {Chlorophyceae) truir y utilizar vectores de expresión comprendie tB2 enlazado operativamente a regiones regulatori motores y terminadores) que funcionan en algas ver ptimiza para expresión en especies de algas verdes y la porción del gen que codifica la región de sito de plástido de la proteína ChFatB2 nativa se un péptido de tránsito de plástido que funciona ma en algas verdes. La secuencia de nucleótidos pr
ID NO: 42 representa un derivado del gen ChFatB2 . expresión en Chlamydomonas reinhardtii y en 1 ?? de codificación de péptido de tránsito de plást Un fragmento de ADN de 1.4 kbp abarcand iente arriba y hacia la región de codificación ma de ramificación de 1, 4-alfa-glucano {glgB, desi Cyanobase=sll0158) de Synechocystis sp. PCC6803 se rtir de ADN genómico usando PCR con cebadores glg 4) y glgB-3 (SEQ ID NO:45) . Este fragmento se clo or pCR4-Topo (Invitrogen) para producir plásmido ecuentemente cortar la enzima de restricción ucho de marcador de resistencia de espectinomicina i gen aadA y secuencias de control regulatorias as rido por HindIII a partir del plásmido pSGI-BL27 fragmentos no lineales fueron tratados con el ting (New England Biolabs) . El cartucho de exprés entonces se insertó hacia el sitio Aval de pSGI ucir pSGI-BL33. La porción de pSGI-BL33 que se ins sactiva al gen glgB es provisto como SEQ ID NO: 46 ecimiento de medio líquido usaron un agitador gir a 30°C con iluminación constante (60 µ?-pG^"1) . C ularon en 25 mL de medio BG-11 conteniendo espec µg/mL) y/o kanamicina (5 pg/mL) de manera ac ivaron en una densidad suficiente (OD730nm míni ivos entonces se usaron parai inocular 100 mL de m atraces de policarbonato de 250 mL a OD730nm=0.4 baron durante la noche. Cuarenta y cinco mL nte la noche a OD730nm=0.5 se añadieron a matrace mL; algunos cultivos se indujeron con IPTG 1 m o controles no inducidos. Muestras (0.5 mL) se to
144, y 216 horas post- inducción y se procesar ribe en el ejemplo 2.
Ácidos grasos libres (FFA) se separaron de obrenadante de cultivo filtradas por extracció ido para análisis GC/FID. Para cada muestra, 2 mL Tabla 9-1
eción de ácidos grasos de cadena media (en mg/L) cepas de Synechocystis
ND representa "no detectado" (<1 mg/L) .
Para una medición mas optimizada de secreció os en estas cepas, los datos de secreción de ci rados en la Tabla 9-1 se normalizaron a densidad lar, medida como densidad óptica a 730 nm (OD730 S se presentan en la Tabla 9-2. Otros experimentos sta solicitud podrían normalizarse en una manera
-
plo 10
ura de Ácidos Grasos Libres a partir de Soluciones ñas Adsorbentes Hidrófobas
Una solución de pico se formuló mediante d de ácido octanoico y 75 mg/L de ácido decanoico e uplementado con NaCl 300 mM y ajustando el pH a 5. una de las resinas listadas en la Tabla 1 se pes de centrífuga de 50 mL y se combinaron con 1.0 mL agitaron suavemente. El metanol de exceso se dec nas se secaron bajo un vacío de 25 inHg, t ente, durante la noche. 50 mL de la solución ieron a cada una de las resinas y se incubaron co e a 31°C por 24 horas. Después de incubación, las vieron mediante filtrar sobre un filtro de fibra man GF/F y los filtrados se analizaron para co o octanoico y ácido decanoico por cromatografía de Tabla 10-1
acidades de adsorción de varios adsorbentes
disponibles
Capacidad de Adsorci escripción Tipo de Resina Ácido Ác do ÁC
Octanoico Decanoico li
ex Optipore Poliestireno divinil
V503 (Dow benceno macroporoso 26.3 69.8
Chemical) post-reticulado
atit 1064 D Poliestireno divinil
1.1 46.7
(LanXess) benceno macroporoso
yst CBV 28014 Zeolita de alúmina
17.4 74.7
(Zeolyst) muy baja
lyst CBV 901 Zeolita de alúmina
5.4 64.8
(Zeolyst) baj
isiv 3000
icalite (UOP Silicalita hidrófoba 15.3 23.7
oneywell)
pidex 5000
Gel de sephadex
(Packard 0.00 18.6
alquilado
trument Co . )
rit ROW 0.8 Carbón activado
40,2 71.8
Fluka extrudido
izaron para concentración de ácidos grasos 1 atografía de gases. Los resultados se listan en la íente .
Tabla 10-2
Desorción de ácidos grasos libres en metano
% de Desorción
de MeOH/mg de Resina 0.1 mL/mg 0.5 mL/mg 1
Dowex Optipore V503 92% 84%
CBV 28014 53% 76%
CBV 901 78% 76%
Norit ROW 44% 85%
El efecto de pH sobre capacidad de ads dió utilizando Dowex Optipore V503. 40 mg de la inaron con 40 mL de medio BG--11 picado con 150 mg/ oico y decanoico y ajustados a un pH de 10.0, 7 El pico de pH 10 se reguló con CAPS 5 mM. Los pi 8 se re ularon con fosfato 5 mM el H 4.8 Tabla 10-3
cidad de adsorción de Dowex Optipore V503 a vari de pH
pH Capacidad de Adsorción (mg FFA/g resin 10 42 ± 13
7.5 64 + 4
4.8 172 ± 4
2.8 259 ± 1
valores reportados son la media de dos réplicas ex +/- una desviación estándar,
pio 11
ura In Vivo de Ácidos Grasos Libres a Partir de C SGC-YC10-5 de Synechocystis
La cepa SGC-YC10-5 de Synechocystis sp, , qu en ChFatB2-7942 como se describe en el ejemplo 1, G-11 con y sin resina Dowex Optipore V503. 400 mL ultivo a partir de los matraces de prueba y m rol también se tomó diariamente. Las muestras se mi m y se filtraron sobre un filtro de fibra de vidr y se analizaron para contenido de ácido octanoi noico por cromatografía de gatses como se describe p i ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Ta
Tabla 11-1
ura in vivo de ácidos grasos libres a partir de c
Synechocystis SGC-YC10-5
Tasa de Crecimiento Productivida
Específica Promedio Grasos Libr
(d-1) (mg I/
Sin Dowex 0.090 ± 0.005 16 +
Con Dowex 0.090 ± 0.010 31 res reportados son la media de dos duplicados biol desviación estándar,
pio 12
ración de Entre a de C0 Recu eración de Pro s como aquellas pertenecientes a los géneros Syne chocystis , Spirulina, y muchos otros, que prefi e 9 y 11 para crecimiento óptimo. La figura 5 d a de realización de la invención donde este p elve mediante reciclar una porción del cultivo és de un recipiente donde se pone en contacto c entrado para reducir el pH, luego a través de u rbente estacionaria donde los ácidos grasos libres apturan.
La suspensión agotada por ácidos graso quecidos por C02, entonces se regresa al cultivo p resión dentro del contactador de gas- liquido podr e de manera independiente para proporcionar un pH a corriente saliendo de la columna de adsorción. ión del recipiente de destello post-columna puede c que proporcione un suministro de C02 que se titul mérica Dowex Optipore V503. La resina se activ menes de columna de metanol, seguido por un lava menes de columna de NaCl 100 mM, pH 11.1 Rec acto de líquido-gas E2 se llenó entonces con ción de pico y 34.7 psia de C02. Cuando el pH de l ico dentro de E-2 ha disminuido a entre 5 y 6 rmina por una tira de papel pH contenida dent as peristálticas P-l y P-2 se fijaron a la mis o y carga de columna se inició. La válvula V-2 n es necesario para incrementar la presión de enir la formación de burbujas de gases.
Fracciones del flujo se tomaron en intervalo de 70-100 mL y se ensayaron para ácido octano o de ácidos grasos libres comercialmente irido de Zen-Bio. Dos tasas de flujo lineales sup valuaron: 16.3 cm/min y 6,1 cm/min. Para ambas Tabla 12-1
cidad de ligadura dinámica con y sin acidificació mediada por C02
Capacidad de Ligadura Dinámica {mg/ idad de flujo (cm/min) < +34.7 psia C02 Control (pH 11.1)
43,5 10.5
7.2 1.9
pio 13
eción de Ácido Oleico por Microorganismos Fotosin
Un gen sintético que codifica un derivado de -ACP TE de plantas tipo FatA con especificidad pa se expresa en varios microorganismos fotosintétic truir y utilizar vectores de expresión comprendie enlazado operativamente a regiones regulatoria motores y terminadores) que funcionan en el micro sintético hospedero. El gen es optimizado ara ex ept) : NP_189147.1/ ACC49002, CAA52070.1, C
41.1, CAC39106, CA017726, AAC72883, AAA33020, 8223.1, AAB51523, AAL77443, AAA33019, AAG35064, y
El siguiente es un listado de secuencias de encias referidas anteriormente.
D N0:1
GTGGAGTATATCAATGGTGGGGAGGTGTGGTGTAGTAGTTGCGAGCAAAGATGACACTTG
.CGTGGAT CTGCGACGA G TTGGCCGTACACACGTCGGATTTG TG CATATGTGT TTGACTAGTTTGAGGAACCTTCACGTGTTTCGC CTCAAACTTTGAGACAACAGCCTCCG ACTTTTAAACACAAGCTAGGAGCTGGTGATATARAATATGCTGGTTGTATGAAAGAGACT AATGATGGCTCGCCCTAGTGAATGCTCCTCAGACJACGCTCATTCGTCCAAGTGTTCGTC TCCTCCGAGGCCAAGGTGGTCGAGTAGGTAGATACCAGCTATTCTCTTGCTTCTTTTACT CAAAAACAGCACGTTATTATCTCCTTTCCATTCC:ACGCAATAACAAGAGGCAATCGGTAA GAGAACAAAGACCCCGGCTGCTTCTCTCGTCCGTCCGCCGCCCCTAAACTTCAAGTTTT TGTTTTTTGGCGCAAAAAGCGCCGTTGCTCCGCCGTCCTCCGCACTTTTCAGTTCTCTGT ATCAACTTCCAAGATCTCCATCTCTTCTCCTATCCTCCCCTAACAAAGTACG
D NO: 2
ATGCCTTTGGTGTTGTCGTCAATÁGGCACTTCGACTTTGCTCTTGGTTCCGTTATCCCA CACGGTCCTCTCGGTTTCGGTGGTATCCCAGGAC:CTCTCGTAGTTGATGCAGGGTTCAG TGTTGTCGTTTGTTGTTTTGTTGATTTTACCTTGICTTCCAGCTTTCGGTCTGTAATTAC TAGAAATGATGTACGTTTGATGGAATCTCTAAA/ÍTTATGAGCTATTTATGAACACAGGA CCATCGAAATCCGTAGGAGAATTCTAATGTCCTC:TTCGGACGAGAGACAGACGTATCAGG TCCAAGATTCTATCTTCATGAGGTCTGGATATGACAGTCCTGCCTTCGAGGCAAGCCCTG TCGCGTCGTCAATAATTTTAGGAACGCAAGGATAGGGATTCTCCATAGTAAGGACTATTG CTTCAACCTTTACCCCAAGAATGGGGCATTCATAAGTGAAAAACGTTTGTTATGTATGCC GGAATAGGTATTGAATCACGTAGAAAATGATCGI,TGCGCCGCAAGCAAACACACCGGCTC CTCTTCCAATCCAACAAACAAACGCAACC
TCTACCGGCAATTGACAGACTGATGTGAAAACACjAGAGTAACCGTAAACAAGTACCGGT CTTTACTTGTTCCGTTGGCGTCTGTCATTTGATC5TCACGCAGACTTGAAAAGTCGTTCG TATCATGCGACAACGTTCAGAAAGGCCGGCGTGCAATCGGTTTGCCTTGTTTCTGATCC ACGACCTGCGGAGGACCACAATGATCTTTCTCTTGTCGTGAGAGCTAGTTCTATTACCT TTCTTGTATTACTCGAAGCTCTCGTTCTTCTATC
? NO: 5
TAATTCGCCACTACCTTTACGCAAGTAAGAACG TTCATGCTGGAGTCGTGGACCAATC GTCATACCGCGCCTGTACTATTTACGACACGAGAGAAAGCCACTGCAGTTCTGGGATGG CCTTTCACTGCGCTGGCAAACTGTATGCTAGACACGACTCGGATCGGATATCGAAATCA GTTCGGATGACTGTCCGGAGCTACCTAGGAAAACÍCTTCTTTTTCGTTTCGGACCACCAA TGTACTCGTGCGATAGGAAGCATCAGACGTATT GTTCGGATGAGATCACACCAGAACT TAGCTATTGTCATCTACAGATTTCGAACCAAACCJTGGATACTAGAAAGCATGGGATTGA GTGTTGCACACTTTATACCTACCCTCGACCTCG ACTTTGTGTAGTAGCAAAATGTGGA TAGAAGGGTTTGGGGTTGACACGGGTTCATTCA ATCCGGGTACTCGAAAATGACCGCA CGAGATACGGTGTACACGTAGACTACGTAGAAA;CCTACGAGGAAGCAGATATGATTTT CACCCAGCCAACGTCGGCAAACAACCAAACAACGTCGTCGCCCCTTGTTGTTCAAGATC GCCTTTTCAACGAAACCGTTCGGTCGTTTGATTCCATACGTCTTTGAATACCAACAGA
D NO: 6
ATCAATAGCTTATTCCAGATTTTTGTGATGTTAGCCTACTTGTAAAGCAGCGGAGGTCT TGGCTGGTTTCGCTCCGGAAATTAAGTTCTGGTTTTATATCTCAACATAACTAGAGATA TACTGTAAGTCCGCAGATTGCTAATGCTTTGCTTCGGTGTCCGTAAAGCTTATGTTACT GGTATCCACGATTTTCAAACGAAAGTGACATATTGCGAATTGTGCAGTATCAGAAAATC TACATTAGTTTGGCCGTATTGCAACGAGTAGCTCTCCTGAAGATGCAAGTAATAGAGGC TGAATTTGCCTGTTTAGAAGCTGGGGATCACATC:TCGTGCTCCCCAAAAGTCTCTCAGT CTATTTTCGAAAACATTGCTATTTATTTAGTTA CCGGCTTCGTCCTCCCATTTAAATA GACACCACCAACGTCCGCAAGATCACGATTCGACJAGGATTCTTCTTTGTCCCAACCATG TAACACGTATATGAAGTACCGCTGCTGGTACCCC5GAAAAGAGAGGACATTCCTTGTGGG CTGCCAATCGAAAAAAATGCCAAGGCGAGAAAACSCGCAGTTCGTTCTTATAATCCAATT TACTCGTTGCTACCTTCCCACCTTCCCAACCAÍACCACTCGCAACC
D NO: 7
GCGAATGGTTCTGCAGTCTCTTTGAAATCTGGA^GCTTGAATACGCAGGAGGATACTAG
SDLKVHKPKVKTGDSIQKGLTPGW DLDVNQHVS VKYIGWILESMPTEVLETQELCSLA SVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGAl'EWRPKNAGANGAISTG TSNGNSVS
D NO : 9
GGGCTGGCAGCTTAGTCCTGCGCÁATCTCTACTACATCTGCCAACCCAGTGAAATTTTGA AGTCGCCGCAGTAGTGATGGCCGCCGAGTTGGC ATCGCTTGGTCAAGGGCGGCAGCAGC GCTGGAAAAAGCGCTCCGCATGGATCTGACCAACATGATCATTGAGTTGCGCGTTTCCAA GCGGCATTCCCCTGACTGTTGAAGGCGTTGCCAÍVTATCAAGATTGCTGGGGAAGAACCGA ATCGAGCGGCTGCTTGGCAAAAACCGTAAGGAA? TCGAGCAAATTGCCAAGGAGACCCTC TGGTGTTTTAGCCAGCCTCACGCCGGAGCAGATCAACGAGGACAAAATTGCCTTTGCCAA AGGCGGAGGATGACCTTGAGCAGCTGGGTCTAGTCCTCGATACGCTGCAAGTCCAGAACA GGTTATCTCTCGGCTAGTGGACGCAAGCAGCGGC;CTGATCTGCAGCGAGATGCCCGAATT CCAGGCTGCCTCTGCGATCCAAACGGCCGAAAATGACAAGATCACGGCCCTGCGTCGGAT CGATCGCCCAAGCCGAGGCCGAGCGCCGGATTC;^GGATGCGTTGACGCGGCGCGAAGCGG GAAGCGGACATTGCTACCGAAGTCGCTCGTAGCC-AAGCAGAACTCCCTGTGCAGCAGGAG GCAGCAGCAACTTCAAGCCGATGTGATCGCCCCI^GCTGAGGCAGCTTGTAAACGGGCGAT GGGCCGCCGCCCGTATCGTCGAAGATGGAAAAGC:TCAAGCGGAAGGGACCCAACGGCTGG ACCGCTGGTGCTAATGCCCGCGACATCTTCCTGC:TCCAGAAGCTCGAAATTCGAGCTCGG ACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTAI:GGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTC AATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCACJAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACC GAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGCjGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGG CCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCT CACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAAi:CTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGC GGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGiGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACG TCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCA TGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATG CTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACG
.GCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCCJCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGT GTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCA71TCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGG GCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGC:TGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCG CGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATI^ACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGC TGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAA CTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAAC:TCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGC CGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCG CATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGAC]'GGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGC
CCGCCATTGTGAACGGCGCGACCGAATGGCGCCCCAAAAATGCCGGCGCTAACGGGGCA ACCTCCAATGGAAACAGCGTCAGCTAATGATAGGATCCGAGCTGGAGATCTGCAGCTGG CGAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGAIRTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCA CTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCCJCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCC ACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCGCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGG AAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCT TCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCA/^CGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGAC CCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAA TTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATCJGGGATCCGACTAGTAGGCCTCGAGG AGATCTCCGCGGCCGCCGATCCTCTAGTATGCT GTAAACCGTTTTGTGAAAAAATTTT GACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATA?TCTATTAAAGGTCATTCAAAAGGTC TTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCGGATGTTGCGATTACTTCGCCAACTATTGC CCAGCCTTTCATGATATATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAAT GACCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGTTAAG GCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTCJCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTT ATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCC ATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTT GGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAG AGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTGAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGA GCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTGTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAG GGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTT AACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAAGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATC GAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCT CAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCCSCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAAT TCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCG CTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCT TCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGAGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAA AAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGAC ATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCCACTGGGTTCGTGC CGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGC AGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAG CTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCT GGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCA CGTTTGTTCGCCCAGCTTCTGTATG TCAGTGAGGGTTTGCAACTGCGGGTCAAGGATC GGATTTCGATCACGGCACGATCATC
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D NO: 14
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D NO: 16
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D NO: 17
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D NO: 19
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D NO : 23
GCCCCCGTGCTATGACTAGC
D N0 : 24
GCCCGGAACGTTTTTTGTACCCC
TCTTCCTTCCATCTGATTATGGTTACGCCAATTMCTACCATTCCATCCATTGCCTGGC CACCGGAGAAAATTTTGCCGATATTGTGGCCCTCAACGATCGCCATAGTCATCCCCCCG CCCAATTGGTCACACGGGATAATACCGCGCCACI^TAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATC TCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCAC ATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAA GAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGA TATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGT CCGAAAAGTGCCAC CTGACGTCTAAGAAAC CAT ATTATCATGACATTAAC CTATAAAA GGCCCTTTCGTCTTCGAATAAATACCTGTGACGCIAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAA TGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGI^AAATGAGACGTTGATCGGCACGTAA ACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTAT TTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGA ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC CACCGTTC3ATATATCC CAATGGCATCGTAAAGA TCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTT AAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCT ATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGC5ATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGT TGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCAC:GACGATTTCCGGCAGTTTCTACACA TGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTT CCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACC5TGGCCAATATGGACAACTTCTTCGC GGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTCSATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATC GCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACMCAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGC TAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTCJCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAG AATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCT TTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAGG TCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGACGATATGATCGACCAATTGCGGGAAGAAATTACAG TACAGAGTTTAGGAGTTACCCCCCATCAACACC GGCCATTTTCGCCGACAACAGCCCC GATCAAGGCAGTATGTTGGCTGGAGCCGTCAACCJCCGTCCGTTCTGCCCAAGCAGAGCG CATCCTAGAAGACAGCAACAGCCGTACTTTAATCGCAGAAAATCGGCAAACCCTAAGCA GCGAAACCATTGACCTGAAACTAATCATCCTCCTCACCGATGAAGAAGTGGCAGAGGAC TATAACTTTGCCCAGGTCATGGCCCTAGGGGCCGGCAAAATCCCCACTCCCGTTCCCCG AGCCACCCTGATCTACACCTCCGGCACCACAGGACAACCCAAAGGGGTGATGCTCAGCC ACCAAGTACGGGAATTGGATTCGGTGATTATTCCCCGCCCCGGCGATCAGGTGTTGAGC CACTCCCTAGAAAGAAGCGCCGAATATTTTCTTCTTTCCCGGGGCTGCACGATGAACTA TTTCAAGGGGGATGTGAAGGACATTAAACCCCA CACATTGTCGGTGTGCCCCGGCTGT AAGGGGTACAAAAAACGTTCCGGGCTAAGGGCG UVTTCTGCAGATATCCATCACACTGG
CACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCÍ^GGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG GAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCC5ACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCAT GCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTC GGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGG ATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTG CTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAG AAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTC3TCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCA TTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA^GATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACG AACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAC3TTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAA AAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTI^TTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGT TTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGT ACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCAT TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACA TGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGA GAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAA AGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATC3CCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCG GCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAAT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAG CTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTCSCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGT CATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGG TGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGCJTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAC TACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCRATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTG TAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTI:TCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGT ??????? ??????????? ???? ????? ???G? ?????? ?????????? ? ???? GTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTT TTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAG TACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCA CACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGC TGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGCJCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGG TTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTG
.CACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAG ATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCCJCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACG AGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGG GAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTC ACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGCJAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCT GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCG TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGT AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACC TAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTCTCGAG
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D NO:30
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D NQ:31
ACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAiTTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC TGAGAAAAAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAJTTTATCAGACAATCTGTGTGGGCAC GATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGA CGTCGCACTGCAACCAGCTCAAGAAGTCGCAACTAAGAAAAAGCCTGCAATCAAACAGC CCGGCATGGGTGTGGTGACTCCCCTCGGGCATG^ACCGGATGTGTTTTACAACAATCTC
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D NO: 36
VAVSALATASAFTTSPASFTTVSSPSVNNVFGQICGNAHRNRRATIV DGANGSAVSLKS RTFLHQLPDWSRLLTAITTVFV SKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQS IETLMNHLQETSLNHC STGILLDGFGRTLEMCIRDLIWWIKMQIKVNRYPAWGDTVEI DWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLIPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVH PGWNDLDWQHVSNVKYIG ILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESW LEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS
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TCCGGGGAGGTGTGGTGTAGT
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TCCAGTGGTGCCCATGGTACTTTGTTAGGGGAGGATAG
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TCCTCACTCTGTCGCGCTGTTG
D NO: 40
AGAGAGGATTGATTTCCGAGTC
D NO: 41
CACCACTCTCGACGACACGGCTTACCGCTACCGCACCAGTGTGCCGGGGGACGCCGAGG ATGGGTCCTTCACCACCGACACCGTCTTCCGCGTCACCGCCACCGGGGACGGCTTCACC
AGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACTCCCGGCTGGAACGACCTGGACGTGAAC GTGAAGTACATCGGCTGGATTCTGGAGTCGATGCCCACCGAGGTGCTGGAGACGCAGGAG GCTGGAGTATCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTGCTGGAGTCCGTCACCGCGATGG GTGTCCGCAGCCAGTACCAACACCTGCTGCGCCTCGAGGACGGCACCGCCATTGTGAACG CGGCCGAAGAACGCGGGCGCTAACGGCGCCATCTCCACGGGCAAGACCTCCAACGGCAA ATAGGATCC
D NO : 43
ASKQGAF GRSSFAPAPKGVASRGSLQWAGANC3SAVSLKSGSLNTQEDTSSS PPPRTFL TVFVKS KRPDMHDR S KRPDMLVDS FGLES TVQDGLVFRQS FS I S YE I GTDRTAS I ETL TGILLDGFGRTLEMCKRDLIWWIKMQIKVlTOYPAWGDTVEIKrrRFSRLGKIGMGRDWLI AYA MNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDL VHKFKVKTGDS IQKGLTPGW GWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSV1JESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDG AGANGAI STG TSNGNSVS
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AAAATGCCTATGTGTTAACG
D NO ; 45
GCAGTGTGCAACCAGGAGCC
D NO : 4 6
AAAATGCCTATGTGTTAACGGATCTACAAACCAC3CACCAAACTCTATTACGAACCCCAC CAACTGCAAGACTTGGGGCCCATTGATGTGGTT TAACCCCCGTCATTGGCATCAATAT GGTGCTCAATGGCCAGAAAACCACCCTGGAGCT TGTCGCACTGTCCATCCCCAGGCGA GAGCCGCAGAATTGAACTATAGCGGTTTACTAAC:TAAAGTTTTACGTTTAGACGGCGAT CAGTCCCTAATTGACGAAGGGATACAAGCTTCCCTATGGGAACCCCAGGTGGGAGTGCC ATCCACCGTTGGCTAGGTTGGAATGTTCAAATC ^CTGTGCGGTGTGATGCTTGATAAAT AAACTGCAAAAAAGTGTATAAAGTAGGTTTAACTTGAATCAAAATCCTTTCTCCGCAGT GAAGATTACCAGCGAAGCAAGTTGTCTTCCCCTi^GCTTTGGGCGGGCAAACCCCTTGCA AAAAATCACCATAGCCGAATGACCTACACCATCAACGCTGACCAAGTCCATCAGATTGT CGATCCCTTTGAAGTGTTGGGCTGCCATCCCCTCGGAGCTTTATGCTTGTAAACCGTTT AAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAAT AATTAGTAATATAATCTATTAAAGG TCCACCGGATCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCGGATGTTGCGATTACT
AAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCG GCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGT ATGGAACGGGCATGCGGATCAGTGAGGGTTTGCj\ACTGCGGGTCAAGGATCTGGATTTC ATCGTGCGGGAGGGCAAGGGCTCCAAGGATCGGGCCTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAG GGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATi TTACTAATTAATTGGGGACCCTAGA TTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCi TAAAGCTTCGGGGACCACGGCAAGG TTCGTGCCTATTTACCCACGGCTGAAGCGGTAACGGTGTTGCTTCCCACCGATCGCCGG ACGGTCCACCATCCCAACTTTTTTGAATGCGTGTTGGAGTTGGAAGAACCGAAGAATTA CGAAAATGGCCACGAAAGGGTAATTTATGACCC(HTATGGTTTTAAAACTCCCAAACTGA ATGTGTTTGGGGAAGGCAACCACCACCGTATTTi CGAAAAACTCGGTGCTCACCTGATG AAAGGGGTTTATTTTGCTGTGTGGGCCCCCAAT(jCCCGCAACGTTTCCATTTTGGGGGA CGGCAGATTGCACCAAATGCGGAAACGCAACAACATGGTGTGGGAATTATTTATCCCTG CTTCTTATAAGTATGAGATTAAAAACTGGGAAG(jGCACATCTACGAAAAGACTGACCCC GAAGTACGCCCCAAAACCGCTTCCATTGTGGCA(jACTTGGACGGTTACCAATGGCACGA AGCTAGGCGCACCAGCGATCCCCTGAGCAAACCCGTTTCCGTTTACGAACTCCATTTAG CTGCCTACG
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Un cultivo celular de un microorganismo recombinante , dicho microorganismo modificado par olécula de ácido nucleico que contiene una molécul eico que comprende por lo menos un sistema de binante que produce por lo menos una acil-ACP t ena, donde dicha acil-ACP tioesterasa de preferen cadena de ácido graso que contiene 6-20 carbonos, donde el medio de cultivo proporciona carbono omo sustancialmente la única, fuente de carbono, y donde dicho microorganismo secreta al ác rado por la acil-ACP tioesterasa hacia el medio d 2. El cultivo de la reivindicación 1, donde s una acil-ACP tioesterasa exogena es una tioester 6. El cultivo de la reivindicación 5, do ena de preferencia produce acil-ACPs teniendo la l na para la cual la tioesteraisa tiene actividad pr 7. El cultivo de la reivindicación 1, oorganismo fotosintético recombinante se modifica uno o mas genes que codifican enzimas de tray ación beta son desactivadas o reguladas hacia abaj mas son inhibidas . 8. El cultivo de la reivindicación 1, oorganismo fotosintético recombinante se modifica uno o mas genes que codifican acil-ACP sint ctiven o regulen hacia abajo, o dichas sintetasas S 9. El cultivo de la reivindicación 1, oorganismo fotosintético recombinante se modifica uno o mas genes que codifican una enzima invo íntesis de carbohidratos se desactiven o re ulen ha incubar el cultivo de la reivindicación 1 oorganismo fotosintético recombinante entonces o graso hacia el medio de cultivo; y recuperar los ácidos grasos secretados a o de cultivo. 12. El método de la reivindicación 11, os grasos se recuperan a partir del cultivo mediant acto al medio con adsorbentets en partículas . 13. El método de la reivindicación 12, rbentes en partículas circulan en el medio. 14. El método de la reivindicación 12, rbentes en partículas están contenido en una colum 15. El método de la reivindicación 14, dond o se reduce durante dicha puesta en contacto. 16. El método de la reivindicación 15 d 20. Una composición que comprende un ác cido por el cultivo de la reivindicación 1. 21. La composición de la reivindicación 20 sición se usa para producir otro compuesto. 22. La composición de la reivindicación 20 sición es un bio-crudo. 23. Una composición que comprende un deri graso producido por el cultivo de la reivindica 24. La composición de la reivindicación 23 sición es un combustible terminado o aditivo de co 25. La composición de la reivindicación 23 sición es un sustituto biológico para un producto 26. La composición de la reivindicación 23 ado es un alcohol, un alcano, o un alqueno. en Microorganismos fotosintéticos recombina ierten carbono inorgánico a ácidos grasos sec iben. Métodos para recuperar los ácidos grasos se ir del medio de cultivo sin la necesidad de cosec ién se describen.
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