MX2010006450A - Remedios para penfigo que contienen anticuerpos antiligando de fas. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de antagonistas de FasL, por ejemplo anticuerpos humanizados dirigidos contra ligandos de Fas humanos (también llamados CD95L o Apo IL y aquí posteriormente abreviados como FasL) para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de la piel asociadas con acantilosis de los gueratinocitos, particularmente para la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

Description

REMEDIOS PARA PENFIGO QUE CONTIENEN ANTICUERPOS ANTILIGANDO DE FAS I I CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de ? antagonistas del ligando Fas humano (también llamado CD95L i o ApolL y aquí posteriormente abreviado como FasL), de I manera más particular con el uso de anticuerpos humanizados contra FasL para la prevención y/o tratamiento' de enfermedades de la piel asociadas con acantólisis de' los queratinocitos , particularmente para la prevención ' y/o tratamiento del pénfigo. 1 El pénfigo es una condición de la piel bulosa (con ampollas) autoinmune caracterizada por la pérdida de adhesión de los queratinocitos debido a autoanticuerpos dirigidos contra proteínas desmosomales (desmogleinas, dsg) . El pénfigo tiene una distribución mundial con¡ una incidencia de aproximadamente 1-5 por 100.000 por año, y con una predominancia femenina. j El pénfigo se caracteriza por la pérdida de adhesión de los queratinocitos suprabasales que rondan en un proceso conocido como acantólisis. La patogénesis del pénfigo esta bajo revisión mayor, principalmente debido a que, además de los anticuerpos anti-desmogleína , un nuevo grupo de anticuerpos receptores anticolinérgicos pueden inducir acantólisis (Kalish, 2000) . Además, se | ha demostrado que el impedimento estérico solo no puede contribuir a la formación de ampulas tras la unión antígeno-anticuerpo (Kitajima, 2002) . Además, se mostró que la formación de desmosomas tampoco es inhibida ¡ por autoanticuerpos del pénfigo (PVIgG) que se une al pénfigo, mientras que las conexiones de desmosomales se disocian' 24-36 horas después del tratamiento con PVIgG. Durante 'este tiempo, toma lugar una serie de pasos de transducció'n de señales activados por PVIgG. ' Estas observaciones sugieren un papel para la apoptosis en el pénfigo. En realidad, el pénfigo es^ una I enfermedad debida a la ausencia de adhesión celular (Payne AS et al, 1978) y puede ocurrir apoptosis en asociación con j desprendimiento celular ( arconi et al, 2004) . Esos conceptos son completamente confirmados por la detección de la apoptosis en lesiones en la piel con pénfigo. En particular, las células acantoliticas expresan los marcadores principales de la apoptosis (Wang X et al, 2004) . De manera más interesante, también se encuentran i núcleos marcados con TUNEL unidos en la raíz de la ámpula, I sugiriendo la presencia de células apoptóticas en la piel perilesional antes del desprendimiento. Además, las células apoptóticas que expresan Ig y activadas con caspasa 8 son detectadas en el borde de la lesión, en áreas donde la j disrupción de los contactos célula-célula es visible (|Wang X et I, 2004) . Esos datos demuestran definitivamente qüe en el pénfigo, la apoptosis toma lugar en los queratinocitos antes que la acantólisis. j La apoptosis juega un papel fundamental en la regulación de la homeostasis celular y está implicada en muchos procesos patofisiológicos . La apoptosis celular puede seguir tanto a un desprendimiento célula a célula (Rezgui et al, 2000; Bergin et al, 2000) y la pérdida de interacción matriz-célula (Giancotti y Ruoslahti, 1999) |.

El Fas (o FasR) es un miembro de la superfamilia del receptor de TNF, el cual, tras la unión con el ligando de Fas (FasL), activa la apoptosis en muchos sistiemas I celulares (Sharma et al, 2000). La señalización intracelular de la apoptosis inducida por Fas-FasL ópera i vía el equipamiento de un número de moléculas adaptadoras como FADD (dominio mortal asociado con Fas) y FLICE ' (ICE similar a FADD, caspasa 8), que a su vez es inhibida por la i FLIP (proteina inhibidora de FLICE) (Juo et al, 1998). La i interacción Fas-FasL está implicada en patomecanismos de I varias condiciones inflamatorias inmunes e infecciosas, como el SIDA (Bahr et al, 1997) y lupus eritematoso í sistémico (Kovacs et al, 1997). Las enfermedades cutáneas caracterizadas por una implicación de la vía Fas-FasL incluyen enfermedad de injerto contra huésped aguda, í necrólisis epidérmica tóxica y melanoma ( ehrli et j al, 2000) . Además, se reportó que lesiones como las acantoliticas son observadas en queratinocitos cultivados tratados con PVIgG y con anti-FasR, mientras que el PVIgG induce un agrupamiento de FasR, FasL y caspasa-8 sobré la membrana celular varias horas antes de la formación de! las lesiones (Wang X et al, 2004). Además, se reportó qué el inhibidor similar a la caspasa 1 bloqueó significativaJente la formación de ámpulas en un modelo de ratón con pénfigo (Li et al, 2006) . Tomados juntos, esos datos indican que FasL y la vía apoptótica extrínseca juegan un papel critico en los mecanismos subyacentes a la acantólisis.

Cualquiera que sea la naturaleza de los autoanticuerpos del pénfigo, la exposición a PVIgG sobrerregula la expresión de varios genes proapoptóticos , incluyendo FasL, muchas horas antes que la acantólisis. Además, la IgG intravenosa (IVIgG) previene la sobrerregulación inducida por PVIgG de FasL y la apoptjosis en los queratinocitos. La IVIgG también impidej la acantólisis y la apoptosis in vivo (Arredondo J etj al, 2005) . I Sin tratamiento, la mortalidad del pénfigo común se aproxima al 100%. Se requiere terapia sistémica temprana para controlar el pénfigo, pero los efectos laterales la terapia sistémica son una complicación mayor El tratamiento incluye administración de corticosteroildes, ? medicamentos que contengan oro, el fármaco antiinflamatjorio dapsona o medicamentos que suprimen el sistema inmune (icomo la azatioprina, metotrexato, ciclosporina, ciclofosfamida o micofenolato mofetil) . El tratamiento más común para el pénfigo es hoy en dia los esteroides, los cuales necesitan ser administrados de por vida y puede causar severos efectos laterales. La mayoría de pacientes con pénfigo mueren por esos efectos laterales. Algunos antibiótlicos también son efectivos, particularmente la minociclina ly la doxiciclina. La inmunoglobulina intravenosa (IglV)' se utiliza ocasionalmente. La plasmaféresis es un proceso' por I el cual el plasma que contiene anticuerpos se elimina de la sangre y se reemplaza con líquidos intravenosos o plasma i donado. La plasmaféresis se puede utilizar además de los medicamentos sistémicos, para reducir la cantidad de i anticuerpos en el flujo sanguíneo. Un número de moléculas I novedosas también están en desarrollo: el micofenolato i mofetil, PI-0824, PRTX-100, anti-CD20 son fármacos I inmunosupresores que actúan sobre las células T y B.

El porcentaje de mortalidad actual aún fluctúa del 5 al 25%; la infección es la causa más frecuente de muerte y la terapia inmunosupresora a largo lazo (principalmente cort icosteroides ) es uno de los factores significativos que provoca aún un alto porcentajé de mortalidad. La inmunoglobulina puede producir alguna I mejoría a corto plazo, pero no parece inducir remisiones duraderas, y su costo hace que sea poco práctico para el uso a largo plazo. ¡ Existen también varios avisos sobre el uso de la I plasmaféresis . Los pacientes suprimidos con prednisona u otros agentes inmunosupresores y que reciben plasmaféresis, están en mayor riesgo de muerte súbita de la sepsis.

Además, el tratamiento es muy caro, y es necesario un i período de hospitalización de 2 semanas para adminis'trar la terapia. Por lo tanto, debido al riesgo de muerte súbita por sepsis y el alto costo, la plasmaféresis está indicada sólo en los casos más refractarios donde el paciente se encuentra claramente en riesgo de morir po'r la enfermedad misma. | I BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invenciónj es proporcionar un agente terapéutico para el pénfigo^ El desarrollo de un nuevo fármaco que bloquee FasL permitiría prevenir por completo el desprendimiento celular y la formación de la lesión cutánea. ¡ En general, la presente invención se refiere al i tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantólisis de los queratínocitos administrando! el antagonista de FasL. Los antagonistas de FasL pueden ser seleccionados de anticuerpos anti FasL, en particular anticuerpos anti FasL humanizados o humanos, moléculas efectoras de ácido nucleico de expresión de FasL como moléculas antisentido o moléculas capaces de interferir con el ARN como moléculas de ARNsi, moléculas receptoras) Fas solubles, muteinas de FasL antagónicas, y compuestos químicos de bajo peso molecular que inhiban la interacción Fas-FasL. Los antagonistas de FasL evitan la apoptosijs de í los queratinocitos y el desprendimiento célula-célula posterior (acantólisis ) . De este modo, los antagonistas de FasL son particularmente adecuados para la prevenciónj y/o tratamiento del pénfigo, por ejemplo, para la preve ción y/o tratamiento del pénfigo mucocutáneo.

La presente invención se relaciona con! un medicamento que contenga al menos un compuesto que inhibe los efectos biológicos de FasL. La expresión "compuesto que ! inhibe los efectos biológicos de FasL" usada aquí se relaciona con todos los compuestos que pueden inhibir completa o al menos sustancialmente o neutralizan! los efectos biológicos de FasL. Por ejemplo, el efecto inhibidor o neutralizante puede basarse en la supresión de la unión de FasL a su receptor natural y por lo tíanto las transmisiones de señales así producidas. Esto se puede lograr por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos ! que se unen a FasL per se o receptores solubles que imiten a Fas o muteinas de FasL antagónicas, bloqueando de este modo la unión de FasL a los receptores celulares. La interferencia con expresión de Fas o FasL por ARNsi bloqueará al sistema Fas/FasL. ' La terapia con antagonista de FasL es | una monoterapia o puede darse en combinación con otros medicamentos adecuados para el tratamiento del pénfigo u I otras enfermedades cutáneas, particularmente como se describió anteriormente. Por ejemplo, una combinación de terapia de los antagonistas de FasL y esteroides p|uede permitir una reducción drástica de las dosisj de esteroides. , DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION I En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un agente terapéutico para el pénfigo, que comprende un anticuerpo contra un ligando de Fas humano, o un fragmento activo del mismo en un ingrediente activo. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo anti-FasL quimérico, humanizado o humano p un fragmento de unión de antigeno o derivado, por ejemplo, un I anticuerpo de una sola cadena recombinante . Si se desea, el anticuerpo puede ser conjugado a moléculas efectorasj por i ? ! ejemplo, compuestos citostáticos , citotóxicos y/o i radioactivos .

I Los anticuerpos humanizados preferidos adecuados para el tratamiento de la enfermedad cutánea asociada con I la acantólisis de los queratinocitos, en particular el i pénfigo de acuerdo con la presente invención, se describen i en la O 1997/002290A1 ("anticuerpos anti-ligando de Fas y método de ensayo con el mismo anticuerpo") o en la WO ? 1998/010070 Al ( " Inmunoglobulina humanizada que reacciona específicamente con el ligando de Fas o fragmentos actiivos del mismo y región que induce apoptosis que se origin'a en anticuerpos humanizados de ligando de Fas"), el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. ! Los anticuerpos humanizados preferidos adicionales adecuados para el tratamiento de la enfermedad cutánea asociada' con la acantólisis de los queratinocitos, en particular el pénfigo, de acuerdo con la presente invención, se describen en la US 7,262,277 ("Anticuerpos humanos anti ligando de hFas antagónicos y fragmentos de los mismos"), el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia también. , Los anticuerpos humanos o humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales sobre los anticuerpo^ de ratón y en algunos casos quiméricos para su uso en terapia humana: 1) debido a que la porción efectora es humana, puede interactuar mejor con otras partes del sistema i humano; 2) el sistema inmune humano no reconoce la estructura o región C del anticuerpo humanizado como ajena, y por lo tanto la respuesta del anticuerpo contra ese anticuerpo inyectado será mejor que contra un anticuerpo de ratón totalmente ajeno, o un anticuerpo quimérico parcialmente ajeno; 3) los anticuerpos humanizados inyectados presumiblemente tendrán una vida media más parecido al de los anticuerpos humanos naturales, I permitiendo que se den dosis más pequeñas y menos frecuentes.

Los antagonistas de FasL más preferidos j son i moléculas de FasR solubles que comprenden la parte soluble j extracelular del receptor de Fas o moléculas de FasL antagonistas modificadas las cuales tienen una actividad antagonista competitiva o no competitiva. Esas moléculas inhiben las interacciones de FasL/FasR dado que FasL se | une al análogo del receptor soluble y la molécula de FasL antagónica se une al receptor natural reduciendo o eliminando completamente por lo tanto la unión de FasL biológicamente activa al receptor natural. Durante ¡ el tratamiento con el ARNsi, puede ser usado un análisis de los niveles de proteina ARN de Fas y/o FasL para determinar el tipo de tratamiento y el curso la terapia en el tratamiento de un sujeto. La verificación los niveles de proteina ARN de Fas y/o FasL pueden ser utilizados para predecir el resultado del tratamiento y determinar la eficacia de los compuestos y composiciones que modulan el nivel y/o actividad de ciertas proteínas de Fas y/o FasL asociadas con un tratamiento, condición, o enfermedad .

En un aspecto especialmente preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antígeno del mismo específico para la proteína ligando de Fas (FasL), en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y por lo menos una región variable de cadena ligera, djonde las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Asn Tyr Trp lie Gly (SEQ ID N0:1) (bx) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 2), ; (Ci) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met; Asp Tyr (SEQ ID NO: 3) o (di) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs : 1, 2 y/o 3 y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones i determinantes de la complementariedad (CDR) de la cajdena I ligera son (a2) CDR Ll: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEQ ID NO: ), (b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SF!Q ID NO: 5) , (c2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID N0:6) o | (d2) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 o 3 aminoácidos de la SEQ ID NOs : 4, 5 y/o 6 o (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión de antigeno del mismo el cual reconoce el mismo epitopo de FasL humanos como el anticuerpo (i), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento dej una enfermedad cutánea asociada con acantólisis de los queratinocitos, en particular de pénfigo. ! En un segundo aspecto especialmente preferidCj, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de anticuerpo del mismo especifico para la proteina del ligando de Fas (FasL) humana, donde el anticuerpo monoclonal es producido por la célula de hibridoma ¡bajo el Número de Acceso FERM BP-5045 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de la misma, o (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragment¡o de unión de antigeno del mismo que reconoce el mismo epitope de FasL humano como el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de los queratinocitos, en particular ¡ del pénfigo .

En un tercer aspecto especialmente preferido;, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antigeno del mismo especifico para la proteína del ligando Fas (FasL) humana, en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada son: j (ai) CDR Hl: Glu Tyr Pro Met His (SEQ ID N0:7), (bi) CDR H2: Met lie Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 8), (cj.) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr | (SEQ ID NO: 9) o (di) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs : 7, 8 y/o 9, y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera son: (a2) CDR Ll: Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn (SEQ ID NO: 10) , (b2) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID N0:11), I (c2) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trpj Thr (SEQ ID NO: 12) o j (d2) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2j o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs : 10, 11 y/o 12 o (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a I antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitopo sobre FasL humano como el anticuerpo (i), para la elaboración de I un medicamento para la prevención y/o tratamiento de' una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de | los queratinocitos , en particular de pénfigo. ¡ En un cuarto aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de I (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de anticuerpo del mismo especifico para la proteina i de ligando de Fas (FasL) humana, donde el anticuerpo monoclonal es producido por la célula de hibridoma bajo el No. de Acceso FERM BP-5533, FERM BP-5534 y/o FERM' BP-5535 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo deri'vado del mismo, o i (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antigeno del mismo el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano como el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la Ipiel asociada con la acantólisis de los queratinocitos, en particular de pénfigo.

En una modalidad especialmente preferida, la presente invención está dirigida al uso de anticuerpos humanos anti-FasL, o porciones de unión de antigenó de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada como se describe en US 7,262, 277, el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. En particular, los anticuerpos humanos anti FasL preferidos adecuados para el tratamiento de la enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de los queratinocitos de acuerdo conj la presente invención comprenden una región variable' de cadena ligera que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO 2 de la US 7,262,277 (incorporada aquí como referencia) y que comprende además una región variable de cadena pesada que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en la SEQ ID N(0 10 o 18 de la US 7,262, 277 (incorporada aquí como referencia) . De manera más particular, la invención se refiere al uso del anticuerpo humano anti-hFas 3E1 J y/o 4G11 como se describe en la US 7,262, 277 (incorpcjrada aquí como referencia) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento del una enfermedad asociada con acantólisis de queratinocitos, en particular de pénfigo.

En un aspecto aún más preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo humano monoclonal ol un fragmento de unión de antigeno del mismo especifico parja la proteina del ligando Fas (FasL) humana, donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Arg His Gly lie Thr (SEQ ID N0:13) o (a2) CDR Hl: Ser His Gly lie Ser (SEQ ID NO: 14), (bi) CDR H2: Trp lie Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO: 15) o (b2) CDR H2: Trp lie Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO: 16), (Ci) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO: 17) o (c2) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO: 18) , o (di) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 ó 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18, y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera son (a3) CDR Ll: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Serj I Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 19), (b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 20), (c3) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 21) o (d3) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 ó 3 aminoácidos de la SEQ ID NOs : 19, 20 y/o 21 o (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión de i antígeno del mismo el cual reconoce el mismo epitopje de FasL humano como el anticuerpo (i), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento d una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de ¡ los queratinocitos , en particular de pénfigo.

En un aspecto preferido final adicional la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmentjo de unión de anticuerpo del mismo especifico para proteiria de ligando de Fas humana (FasL), donde el anticuerpo monoclonal es producido por la célula de hibridoma bajo el número de Acceso ATCC PTA-4017 y/o ATCC PTA-4018 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado del mismq, o (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmentio de unión de antigeno del mismo el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano como el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la I prevención y/o tratamiento de una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de los queratinocitos, particularmente del pénfigo.

I El medicamento de la presente invención puede ser proporcionado como una composición farmacéutica junto ! con un soporte farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente^, la I composición farmacéutica es administrada por inyección o infusión, por ejemplo, intravenosa, intraarterial , subcutánea, intraperitonealmente o por otros me'dios adecuados. La composición puede ser administrada local o sistémicamente . Preferiblemente, la composición ! es administrada sistémicamente. \ Las composiciones farmacéuticas adecuadas Ipara usarse en la invención comprenden un agente activo enj una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido.; Una dosis efectiva de un medicamento de la presente invención puede estar en el intervalo de 0.1 µq a 100 pg, hastat una dosis total de aproximadamente 1 g dependiendo de la ruta de administración. La composición farmacéutica puede j ser administra diariamente, por ejemplo una o varias veces, o cada dos a cuatro días, cada semana o una vez cada| dos semanas. El medicamento puede ser administrado en un .solo ciclo de tratamiento consistente de una o varias administraciones de medicamento o en varios ciclos de I tratamiento consistiendo cada uno de una o varias I administraciones del medicamento. Cada ciclo de tratamiento puede tener una duración de un día hasta varias semanas, meses o aún años. ^ En consecuencia, de acuerdo con la presente invención el medicamento también puede ser usado en una terapia combinada con al menos una terapia adicional efectiva contra una enfermedad cutánea asociada coñ la i acantólisis de los queratinocitos y en particular contra el pénfigo. El medicamento será usado solo o en combinación con otros fármacos inmunosupresores , particularmente' con esteroides, para reducir su dosis y/o para minimizarl sus efectos laterales crónicos. Cuando se usa en combinación, el medicamento preferiblemente será administrado sobrej una base mensual. Cuando se use solo, el medicamento preferiblemente será administrado continuamente dentro de un marco de tiempo dependiendo del caso individual. j Además, la presente invención será explicada! con mayor detalle por los siguientes ejemplos. ¡ Ejemplos Primero se evaluó la frecuencia de apoptosi^s en la epidermis de piel perilesional en cortes congeladós de pacientes con pénfigo no tratados por tinción de TUNEL. Los especímenes fluorescentes fueron analizados por Microscopía con láser de barrido confocal. En las capas i suprabasales de la epidermis perilesional la mayoría de los queratinocitos son apoptóticos, en comparación con la piel normal (Fig. 1) . | Para confirmar la apoptosis en las lesiones de pénfigo usamos biopsias fijadas con formalina e incluidas I en parafina y detectamos la forma activa de la caspasa-3. El protocolo de tinción fue efectuado por UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen | (Lab Vision Corporation, CA, EUA) de acuerdo con j las instrucciones del fabricante. La visualización se obtuvo con tabletas Fast Red en sustrato de fosfato de naftoí. En las muestras con pénfigo encontramos que el fragmente de caspasa-3 se localiza tanto en la raíz como en el piso de la ámpula, con algunas células siendo positivas en la epidermis perilesional (Figura 2). Este resultado parece indicar que la muerte celular de los queratinocitos ocurre antes de que el desprendimiento de los queratinocitos conduzca a la acantólisis. I Puesto que los queratinocitos apoptóticoSj son expresados abundantemente en el pénfigo, deseamos explorar si los sueros de pénfigo son capaces de inducir apoptosis i I en queratinocitos humanos normales. Para este propósito, los queratinocitos fueron cultivados en portaobjetos de cámara y cultivados en medio libre de suero (KG ) hasta la preconfluencia . Las células fueron entonces cultivadas en medio basal de queratinocitos y tratadas durante 48 horas con adición de 25% de suero de pacientes no tratados o pacientes tratados con corticoesteroides sistémicos Los sueros de sujetos sanos fueron usados como controles'. La apoptosis fue evaluada por la tinción de TUNEL in si tu. Se evaluaron aproximadamente 100 células, en campos seleccionados aleatoriamente, y el porcentaje de células positivas a TUNEL fue contado. Los sueros de pénfigo Ipero no de sujetos sanos o pacientes sometidos a tratamiento con esteroides indujeron apoptosis en los queratinocitos i humanos (Figura 3 A-B) .

Puesto que el sistema Fas/FasL está implicado con í muchos procesos apoptópicos también a nivel de la piel I (Wehrli et al, 2000), medimos los niveles de FasL en suero i de pacientes con pénfigo por un inmunoensayo enzimático en I dos sitios (ELISA) . La concentración de suero fue i determinada por absorbancia a 450 nm contra proteína estándar FasL humana recombinante . Los niveles de FasL fueron muy altos en suero de pacientes no tratados inferiores al límite de detección en suero de pacientes tratados con corticosteroides o en sueros de sujetos sanos. Los sueros de pacientes con HBV fueron usados como control positivo (Figura 4A) . En un paciente, los niveles de FasL disminuyeron progresivamente con la terapia sistémica ! con esteroides (Figura 4B) .

Puesto que el FasL está contenido en altas cantidades en los sueros de pénfigo, buscamos a la expresión del receptor cognado FasR. Para este propósito usamos biopsias fijadas con formalina o incluidas, en parafina. El protocolo de tinción fue efectuado por UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La visualización fue obtenida con tabletas Fast Red en sustrato de fosfató de los pacientes fueron pretratados con anticuerpo neutralizante antiFasL o inhibidor de caspasa-8, y agre.gado a cultivos de queratinocitos . Los queratinocitos fueron cultivados en KGM y tratados con sueros de pénfigos o^ con sueros de pacientes no tratados. Los sueros fueron pretratados con anticuerpo neutralizante antiFasL (2.5 mg/ml durante 30 min.) o inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK I (100 µ? durante 30 min.) . La apoptosis fue evaluada por í tinción de TUNEL. La adición de anticuerpo neutralizante i antiFasL o inhibidor de caspasa-8 previno parcialmente la I apoptosis de los queratinocitos inducida por suero de pénfigo (Figura 6) . ^ Además, los queratinocitos fueron tratados 'como en la Figura 6 y provistos con anticuerpo antiFasL o inmunoglobulinas irrelevantes. Las células fueron entonces homogenizadas en amortiguador RIPA para el análisis de Western blotting. Las membranas fueron incubadas | con anticuerpos anti caspasa-8 humana o antiactina bJ La intensidad relativa de las bandas sobre autorradiogramas fue cuantificada en autorradiogramas por densitometrila de láser de barrido. Los resultados muestran que la caspása-8 fue notablemente activada en los queratinocitos tratados con suero de pénfigo, en comparación con las células no tratadas, mientras que la escisión de la caspasaj fue inhibida parcialmente por el pretratamiento con anticuerpo antiFasL (Figura 7) . I Tomados juntos, esos datos sugieren que. los sueros de pénfigo inducen la apoptosis de los queratinocitos a través de la vía apoptópica extrínseca activada por el sistema Fas/FasL.

Estudios recientes han mostrado que los componentes del complejo de adhesión de cadherina-catenina en uniones adherentes epiteliales son dirigidos por las I caspasas durante la apoptosis (Weiske et al, 2001) . 'para evaluar si la vía apopótica inducida por Fas/FasL es también responsable de la separación desmosomal, tratamos por 72 horas queratinocitos confluentes, cultivados exl KGM en presencia de CaCl2 1.8 mM, con sueros de pénfigos con o sin terapia. Los extractos de proteína del cultivo fueron analizados por Western blotting usando anticuerpos |anti Dsgl y anti Dsg3. Se usó ß-actina como control intérno.

Encontramos que los sueros de pénfigo pueden escindir Dsgl y Dsg3. En particular, los sueros de pacientes no tratados, pero no de pacientes bajo terapia con esteroides escindiendo extrañamente a Dsgl y Dsg3. (Figura 8) .

De manera más importante, el tratamiento de' los queratinocitos con cantidades crecientes de FasL (0.1,; 10, 100 ng/ml) durante 72 horas, escindieron dsgs en un forma dependiente de la dosis. Los extractos de proteína de los cultivos fueron analizados por Western blotting usando anticuerpos anti Dsgl y anti-Dsg3. Se usó ß-actina como control interno. Estas dosis son consistentes con las detectadas en los sueros de pénfigo (Figura 9) Dado que FasL ejerce un papel importante eh la patogénesis del pénfigo, hemos probado un anticuerpo anti FasL (N0K2, anticuerpo producido por la linea de célulL de hibridoma N0K2, número de acceso FERM BP-5045) Los queratinocitos confluentes, cultivados en G con CaCl2 l.¡ mM, fueron tratados durante 72 horas con: 1. KGM soloj; 2. Ac anti FasL (N0K2, 15 g/ml); 3. FasL (50 ng/ml) ; 4. FasL + anti FasL. Presentamos evidencia de que el Ac anti FasL (N0K2) previene la escisión de dsg inducida por FasL. También mostramos que Ac anti FasL (NOK2) inhibe la apoptosis inducida por la caspasa-8 (Figura 10 A) L La Figura 10B muestra que el Ac anti FasL (N0K2) previene el desprendimiento célula a célula inducido por FasL, es decir, la acantólisis.

Para confirmar aún más el papel central de FasL, usamos otros anticuerpos anti-FasL (F918-7-3, anticuerpos producidos por la linea celular de hibridoma con número de acceso No. FERM BP-5533, F918-7-4, anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma con número de acceso NoJ BP- i i 5534 FERM; F919-9-18, anticuerpo producido por la linea i celular de hibridoma con número de acceso No FERM BP-5535). Los queratinocitos confluentes, cultivados en KGM con CaCl2 1.8 mM, fueron tratados durante 72 horas con: KGM solo; FasL recombinante (50 ng/ml), medio de hibridoma diluido 1:1 en KGM; FasL + medio de hibridoma a diferentes diluciones en KGM. Presentamos evidencia de que los I anticuerpos anti-FasL evitan la escisión de dsg3 inducida i por FasL dependiente de la dosis (Fig. 11A y Fig. 11B) , inhibiendo la activación de la apoptosis inducida ' por i caspasa-8 (Fig. 11A) . La Figura 11C muestra que el Ac 'FasL contenido en el medio de la linea celular de hibridoma !FERM BP-5535 evita el desprendimiento célula a célula inducido por FasL, es decir la acantólisis. | Para investigar si la vía apoptótica extrínseca es responsable de la escisión de dsg, pretratamos queratinocitos confluentes con inhibidor de caspasa-|8-Z-IETD-FMK (100 µ? durante 30 min) o con Ac anti-FasL (NO 2, 15 µg/ml). Entonces las células fueron incubadas durante 72 horas con suero de pénfigo sano o no tratados. Los extractos de proteína del cultivo fueron analizadas por I Western blot utilizando anticuerpos anti-Dsg3 y Ac anti caspasa 8. Se usó vinculina como control interno. (Fig. i 12A) . La Fig. 12B muestra que el desprendimiento celular (es decir, la acantólisis) es prevenido por inhibidor de Ac anti-FasL de la caspasa 8. Esos resultados indican que la inhibición como la vía apoptópica activa por FasL o caspasa 8 previene la activación de la caspasa-8 y escisión de j dsg, bloqueando de este modo la acantólisis. | En conclusión, mostramos que FasL ejercej una I doble actividad, activando la vía apotóptica extrínseca activada por caspasa 8 y escisión de Dsg. De acuerdo) con nuestro trabajo, ang y sus colaboradores (Wang et j al, 2004) han sugerido que la apoptosis puede ser la causal del fenómeno acantolítico . Ellos mostraron que la PV-IgG y el anticuerpo contra un receptor de Fas (anti-FasR) inducen lesiones in vitro en forma similar, causando: ' (1) secreción de FasL soluble, (2) cantidades celulares elevadas de FasR, FasL (soluble y membranal), proteínas Bax y p53, (3) la reducción en los niveles de celular Bcl-2 celular, (4) enriquecimiento en caspasa 8, y la activación de las caspasas 1 y 3, (5) coagregación de FasL y FasR con caspasa 8 en el complejo de señalización de inducció'n de muerte membranal (DISC). En consecuencia, la vía de señalización de muerte mediada por Fas parece estar j implicado en la formación de la lesión.

Un modelo animal bien establecido ha sido ? ampliamente utilizado durante largo tiempo para el estudio I del pénfigo. La transferencia pasiva de PVIgG en ratones neonatales induce el desprendimiento celular y la formación de la ámpula. Este modelo ha sido usado para evaluar la implicación de la apoptosis y FasL en la patogénesis del pénfigo. Inyectado subcutáneamente PVIgG (5mg/g/BW) purificado de suero de pacientes en ratones C57BL/6N Crl neonatos. Los ratones neonatos normales tratados con IgG purificada de sueros de individuos sanos (NIgG) fueron usados como controles. Los animales se sacrificaron 20 horas después de la inyección.

La tinción con hematoxilina y eosina muestra que únicamente se desarrollan ámpulas en ratones tratados! con PVIgG, pero no en los ratones tratados con IgG humana normal (Fig. 13 A) . La apoptosis fue detectada por TUNEL o por la activación de la caspasa-3 únicamente en los ratjones tratados con PVIgG (Fig. 13B) .

Para evaluar el papel de FasL in vivo, ' los ratones fueron tratados con PVIgG o PVIgG más anticuerpo anti-FasL (clon MFL3, especifica para ratón) . Se administró anti-FasL (40 µg/ratón) 3 horas después de la inyección de PVIgG y previno la formación de ámpulas en los ratones, como es mostrado por la tinción con H y E. Además; la longitud de las hendiduras de los ratones tratados j con anti-FasL se redujo notablemente (Fig. 14) j En conclusión, hemos mostrado que FasL ejerce una doble actividad, activando la vía apoptótica extrínseca mediada por caspasa-8 y la escisión de Dsg. De manera( más i importante, el bloque de FasL protege contra la acantólisis in vitro e in vivo. i Referencias Aoudjit F and Vuori K: Matrix attacnment regulates FAS-induced apoptosis in endothelial cells: a i role for c-FLIP and implications for anoikis. J Cell Biol 152 : 633 - 643 , 2001 Arredondo J et al Am J Pathol 167 : 1531 - 1544 , 2005 Bahr GM, Capron A, Dewulf J, Nagata S, Tanaka M, I Bourez J , Mouton Y. Elevated serum level of Fas ligand i correlates with the asymptomatic stage of human i immunodeficiency virus infection. Blood 90:896- 8 98 , 1997 Bergin E, Levine JS, Koh JS, Lieberthal W: Mouse i proximal tubular cell-cell adhesión inhibits apoptosis by a cadherin-dependent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol 278: F758-F768, 2000 ! Du, Z., et al., Biochem. Biophys. Res. Coramun. , 1996 226, 595-600 I Frisch SM: Evidence for a function of death-receptor-related, death-domain-containing proteins f in anoikis. Current Biol 9:1047-1049, 1999 i Frisch SM, Francis H: Disruption of epithélial cell-matrix interactions induces apoptosis. J Cell i Biol 124:619-626, 1994 j Frisch SM, Screaton RA: Anoikis mechanisms. [ Curr Opin Cell Biol 13:555-562, 2001 ¡ Giancotti FG, uoslahti E: Integrin signaling.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antigeno del mismo especifico para la proteina ligando de Fas (FasL) humano, en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y por lo menos una región variable de cadena ligera, donde las secuencias | de aminoácidos de las regiones determinantes de | la complementariedad (CDR) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Asn Tyr Trp lie Gly (SEQ ID N0:1) (bi) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr| Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEQ ID N0:2), (??) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 3) o (di) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2| o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs : 1, 2 y/o 3 y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera son (a2) CDR Ll: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn| Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEQ ID NO:4), (b2) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 5) , (C2) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID NO:6) o (d2) una secuencia derivada sustituyendo 1, 21 o 3 aminoácidos de la SEQ ID NOs: 4, 5 y/o 6 o I (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión de antigeno del mismo el cual reconoce el mismo epitopé de FasL humano como el anticuerpo (i), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento dej una enfermedad cutánea asociada con acantólisis de los I queratinocitos , en particular de pénfigo. I 2. Uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de anticuerpo del mismo especifico ¦ para la proteina del ligando de Fas (FasL) humana, donde el anticuerpo mónoclonal es producido por la célula de hibridoma bajo el número de acceso FERM BP-5045 p un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado dé la misma, o ¦ (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de I unión de antigeno del mismo que reconoce el mismo epitope de FasL humano como el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención! y/o tratamiento de una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de los queratinocitos. j 3. Uso de (i) un anticuerpo monoclonal jO un fragmento de unión de antigeno del mismo especifico para la proteina del ligando Fas (FasL) humana, en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde las secuencias de aminoácidos dé la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Glu Tyr Pro Met His (SEQ ID N0:7), I (bi) CDR H2: Met lie Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 8), I (Ci) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 (SEQ i ID NO: ) o ' (di) una secuencia derivada sustituyendo 1, ? o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs : 7, 8 y/o 9, I y/o las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera son: I (a2) CDR Ll: Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn (SEQ ID NO: 10), ¡ (b2) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID NO: 11), , (c2) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 12) o ( (d2) una secuencia derivada sustituyendo 1, 2 o 3 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 10, 11 y/o 12 o (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión de antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitope sobre FasL humano como el anticuerpo (i), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de' una enfermedad cutánea asociada con la acantólisis de los queratinocitos . 4. Uso de (i) un anticuerpo monoclonal 6 un fragmento de unión de anticuerpo del mismo especifico para la proteina de ligando de Fas (FasL) humana, donde el anticuerpo monoclonal es producido por la célula de hibridoma y/o FERM derivado unión de epitope d prevenció asociada 1 a 4, donde el anticuerpo del fragmento de unión de antigeno del mismo es seleccionado de un anticuerpo parcial desmogleina. I 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones í 1-7, donde la enfermedad cutánea es el pénfigo. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en una terapia combinada con al menos ¡ una terapia adicional efectiva contra la enfermedad cutánea1. 9. Uso según la reivindicación 8 en combinación con al menos un fármaco inmunosupresor adicional, en particular con al menos un esteroide adicional. '