MX2009002855A - Profarmacos polimericos dirigidos que contienen enlazadores multifuncionales. - Google Patents

Profarmacos polimericos dirigidos que contienen enlazadores multifuncionales.

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Prasanna Reddy
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Abstract

La presente invención provee profármacos poliméricos dirigidos por anticuerpo de una sola cadena, que contienen enlazadores multifuncionales; también se describen métodos de preparación de los sistemas de suministro poliméricos y métodos de tratamiento de mamíferos usando los mismos.

Description

PROFARMACOS POLIMERICOS DIRIGIDOS QUE CONTIENEN ENLAZADORES MULTIFUNCIONALES INTERREFERENCIA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/844,943, presentada el 15 de septiembre de 2006, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se sabe que muchos de los agentes anticancerosos de bajo peso molecular tienen una toxicidad significativa. Durante años ha habido varios intentos para reducir la toxicidad y mejorar la eficacia de los agentes anticancerosos de bajo peso molecular. Un intento para reducir la toxicidad y mejorar la eficacia de los fármacos de bajo peso molecular estuvo enfocado en sistemas de suministro de fármaco dirigidos por agentes de dirección. Por ejemplo, el agente de dirección, tal como un anticuerpo de una sola cadena, péptidos de RGD, o ácido fólico, puede dirigir el suministro del agente terapéutico y mejorar su efecto. Al mismo tiempo, el suministro dirigido de agentes quimioterapéuticos muy potentes reduce su toxicidad. La propuesta ha sido validada por la aprobación de la FDA de, por ejemplo, gemtuzumab zogamicin, Mylotarg®, de Wyeth, un anticuerpo humanizado contra CD33 enlazado a la citotoxina caliqueamicina, para la leucemia mieloide aguda (AML). Tradicionalmente, los inmunoconjugados incluyen tres componentes: un agente de dirección como un anticuerpo monoclonal, una citotoxina y un enlazador. Sin embargo, en esta propuesta se requiere que el anticuerpo retenga un alto grado de afinidad de unión por su antígeno después de la conjugación con el fármaco. Además, los conjugados anticuerpo-fármaco tienen que ser estables en amortiguadores o en el plasma y no deben liberar prematuramente la toxina durante la circulación. También deben internarse una vez que el anticuerpo se une al antígeno sobre la superficie de la célula de tumor. Posteriormente, la molécula de fármaco tiene que ser liberada intacta dentro de las células de tumor objetivo a la velocidad deseada. Los anticuerpos de una sola cadena (SCA's) o anticuerpos de unión de antígeno de una sola cadena incluyen el dominio de unión del anticuerpo de longitud completa, solo con un cuarto del tamaño. Sin embargo, los SCA's se pueden unir al antígeno específicamente con alta afinidad. Una descripción de la teoría y producción de proteínas de unión de antígeno de una sola cadena se encuentra por ejemplo en las solicitudes de patente de EE. UU. Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030 y 5,518,889, de beneficiario en común. Las proteínas de unión de antígeno de una sola cadena producidas con los procesos citados en las patentes de EE. UU. anteriormente mencionadas, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia, tienen especificidad de unión y afinidad sustancialmente similares a las del fragmento Fab correspondiente. Más recientemente, la patente de EE. UU.
No. 6,872,393, de beneficiario en común, describe polipéptidos de una sola cadena modificados con óxido de polialquileno. El contenido de cada una de las patentes anteriores, de beneficiario en común, se incorpora aquí como referencia.
A pesar de los intentos y avances, continúa la necesidad de proveer un sistema polimérico de suministro de fármaco dirigido por agente de dirección, que tenga la actividad terapéutica deseada y menos toxicidad. La presente invención maneja estas y otras necesidades.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Para superar problemas anteriores y mejorar la tecnología de suministro de fármaco polimérico, se proveen compuestos nuevos y ventajosos que utilizan la tecnología de agente de dirección y pegilación, y también otras técnicas terapéuticas mejoradas. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proveen compuestos de fórmula (I): D -(L1)a-L2-(L3)b-D2 I A en donde: F es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico; A es un grupo bloqueador o D -(L1 )a-L2-(L3)b- D2 cada D- se selecciona independientemente de porciones de dirección, grupos funcionales y grupos salientes, preferiblemente porciones de dirección; cada D2 se selecciona independientemente de porciones biológicamente activas, grupos funcionales y grupos salientes, preferiblemente porciones biológicamente activas; cada L-i es independientemente un enlazador permanente o un enlazador liberable, preferiblemente un enlazador permanente; l_2 es un enlazador multifuncional; cada l_3 es independientemente un enlazador permanente o un enlazador liberable, preferiblemente un enlazador liberable; y (a) y (b) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero o 1 . En un aspecto de la invención, el residuo de polímero es un óxido de polietileno que puede estar conjugado tanto con moléculas de fármaco pequeñas como con anticuerpo de una sola cadena (SCA) por medio de enlazadores liberables y enlazadores permanentes a través de enlazadores multifuncionales. De esta manera, se proveen compuestos para proveer una plataforma de suministro de SCA-PEG-Enlazador-Fármaco para el suministro dirigido de compuestos citotóxicos de molécula pequeña.
Además, es ventajoso aumentar la carga tanto de molécula pequeña como de SCA por sitio de unión, con respecto a los conjugados tradicionales de SCA-íármaco. Por lo tanto, se proveen profármacos de SCA dirigidos, de bajo costo. Además, los profármacos de la presente invención proveen métodos para regular la vida media de los fármacos en circulación, por ejemplo aumentando la vida media en circulación cuando se desea, utilizando los enlazadores adecuados. Un aspecto general de la presente invención, sin limitación, se describe esquemáticamente con la siguiente estructura: Porción de lazador liberable dirección enlazador permanente enlazador multifuncional en • Fármaco (ÜÜ en donde PEG está unido tanto al SCA como al fármaco, tal como un agente citotóxico, por medio de un enlazador multifuncional localizado centralmente; el enlazador con el SCA es permanente, mientras que el enlazador con el agente citotóxico es liberable y se puede diseñar para ser estable en la sangre, pero fácilmente degradable en presencia de una enzima específica de sitio. En un aspecto preferido, el SCA está unido por medio de un enlazador permanente, por ejemplo uno que contiene un grupo maleimida, y el agente citotóxico por medio de un enlazador, tal como un enlazador de peptidilo (Val-Cit) que puede ser degradado específicamente por catepsina B. En una modalidad preferida, el agente citotóxico es SN38.
Aspectos adicionales de la invención incluyen métodos de preparación de los polímeros activados que contienen enlazadores multifuncionales, métodos de preparación de conjugados que contienen los mismos, y también métodos de tratamiento basados en la administración de cantidades efectivas de conjugados que contienen una porción biológicamente activa a un paciente (mamífero) en necesidad del mismo. Una de las ventajas de la presente invención es que los sistemas de suministro poliméricos de la presente son estables y por lo tanto mejoran la biodisponibilidad de los fármacos. Otra ventaja de la presente invención es que los sistemas de suministro poliméricos pueden liberar los fármacos intactos dentro de las células de tumor objetivo. Otra ventaja es que la velocidad de liberación de los profármacos se puede modificar para lograr una velocidad deseada. Otra ventaja de los sistemas poliméricos que corresponden a la invención es que son muy adecuados para fármacos de bajo peso molecular y oligonucleótidos tales como de antisentido, ARN interferente pequeño (siRNA) o compuestos de LNA. Otras ventajas adicionales serán evidentes de la siguiente descripción. Para los fines de la presente invención, el término "residuo" significa aquella porción de un compuesto a la que se refiere, esto es citotoxina, SN38, enlazador permanente, enlazador multifuncional, enlazador liberable, etcétera, que permanece después de haber experimentado una reacción de sustitución con otro compuesto. Para los fines de la presente invención, el término "residuo polimérico" o "residuo de PEG" significa aquella porción del polímero o PEG que permanece después de haber experimentado una reacción con otros compuestos, porciones, etcétera. Para los fines de la presente invención, los alquilos sustituidos incluyen carboxialquilos, aminoalquilos, dialquiloaminos, hidroxialquilos y mercaptoalquilos; los alquenilos sustituidos incluyen carboxialquenilos, aminoalquenilos, dialquenilaminos, hidroxialquenilos y mercaptoalquenilos; los alquinilos sustituidos incluyen carboxialquinilos, aminoalquinilos, dialquinilaminos, hidroxialquinilos y mercaptoalquinilos; los cicloalquilos sustituidos incluyen porciones tales como 4-clorociclohexilo; arilo incluye porciones tales como naftilo; arilo sustituido incluye porciones tales como 3-bromo-fenilo; aralquilo incluye porciones tales como tolilo; heteroalquilo incluye porciones tales como etil-tiofeno; heteroalquilo sustituido incluye porciones tales como 3-metoxi-tiofeno; alcoxi incluye porciones tales como metoxi; y fenoxi incluye porciones tales como 3-nitrofenoxi. Se entiende que halo incluye flúor, cloro, yodo y bromo. Para los fines de la presente invención, "ácido nucleico" o "nucleótido" incluye ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ya sea de una sola cadena o de doble cadena, a menos que se especifique de otra manera, y puede tener cualquier modificación química.
Para los fines de la presente invención, los términos "porción biológicamente activa" y "residuo de una porción biológicamente activa", significan aquella porción de un compuesto biológicamente activo que permanece después de que el compuesto biológicamente activo ha experimentado una reacción de sustitución, en la cual se añade la porción de transporte. Para facilitar la descripción, mas no para limitarla, se entiende que el término "porciones biológicamente activas" es intercambiable por "fármacos", "agentes citotóxicos", "citotoxinas". Para facilitar la descripción, más no para limitarla, se entiende que el término "moléculas pequeñas" es intercambiable por "compuestos farmacéuticamente activos". A menos que se defina de otra manera, para los fines de la presente invención: el término "alquilo" incluye alquilos rectos, ramificados, sustituidos, por ejemplo haloalquilo, alcoxialquilo, nitroalquilo, alquilo de CM2, cicloalquilo de C3.8, o cicloalquilo sustituido, etcétera; el término "sustituido" incluye agregar o reemplazar uno o más átomos contenidos dentro de un grupo funcional o compuesto, con uno o más átomos diferentes; el término "alquilo sustituido" incluye carboxialquilos, aminoalquilos, dialquilaminos, hidroxialquilos y mercaptoalquilos; el término "cicloalquilo sustituido" incluye porciones tales como 4- clorociclohexilo; arilo incluye porciones tales como naftilo; arilo sustituido incluye porciones tales como 3-bromofenilo; aralquilo incluye porciones tales como toluilo; heteroalquilo incluye porciones tales como etiltiofeno; el término "heteroalquilo sustituido" incluye porciones tales como 3-metoxi-tiofeno; alcoxi incluye porciones tales como metoxi; y fenoxi incluye porciones tales como 3-nitrofenoxi; el término "halo" incluye flúor, cloro, yodo y bromo; y los términos "cantidad suficiente" y "cantidad efectiva", para los fines de la presente invención, significan una cantidad que logra un efecto terapéutico, tal como dicho efecto es entendido por los expertos en la materia.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A. Generalidades En un aspecto de la presente invención, se proveen compuestos de fórmula (I): D1-(L1 )a-L2-(L3)b- D2 A en donde: Ri es un polímero soluble en agua, sustancialmente antigénico; A es un grupo bloqueador o D -(L,)a-L2- (L3)b- D2 cada D-i se selecciona independientemente de porciones de dirección, grupos funcionales y grupos salientes, preferiblemente porciones de dirección; cada D2 se selecciona independientemente de porciones biológicamente activas, grupos funcionales y grupos salientes, preferiblemente porciones biológicamente activas; cada Li es independientemente un enlazador permanente o un enlazador liberable, preferiblemente un enlazador permanente; l_2 es un enlazador multifuncional; cada L3 es independientemente un enlazador permanente o un enlazador liberable, preferiblemente un enlazador liberable; y (a) y (b) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero o 1 . En un aspecto preferido de la invención, los sistemas de suministro poliméricos dirigidos incluyen compuestos que tienen la fórmula: en donde: R2 y R'2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3-i9, cicloalquilo de C3.8, alquilo de Ci_6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C1-6, heteroalquilo de C1-6 sustituido, alcoxi de Ci-6, ariloxi, heteroalcoxi de Ci_6, heteroariloxi, alcanoilo de C2.6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (d ), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c"6), (c7) y (c8) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, muy de preferencia cero, 1 o 2; (d1 ), (d2), (d3), (d4), (d5) y (d7) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, muy de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; y todas las otras variables son como se define anteriormente. En otro aspecto, los sistemas poliméricos aquí descritos están bloqueados en una terminal con un grupo CH3, esto es, mPEG, mientras que en otras modalidades se proveen PEG's bis-activados, como los que corresponden a las fórmulas. 20 Otros grupos bloqueadores opcionales incluyen H, NH2, OH, C02H, alcoxi de Ci_6 y alquilo de C -6. Los grupos bloqueadores preferidos incluyen metoxi y metilo. En la mayor parte de los aspectos de la invención, los polímeros incluidos se describen en general como polímeros sustancíalmente no antigénicos. Dentro de este género de polímeros se prefieren los óxidos de polialquileno, y son muy preferidos los polietilenglicoles (PEG's). Para facilitar la descripción, más no para limitarla, la invención se describe algunas veces usando PEG como el polímero prototipo. Sin embargo, se debe entender que el alcance de la invención es aplicable a una amplia variedad de polímeros que pueden ser lineales, sustancialmente lineales, ramificados, etc. En otro aspecto de la invención, las porciones biológicas incluyen porciones que contienen -NH2, porciones que contienen -OH y porciones que contienen -SH.
B. Enlazadores multifuncionales (L?) En vista de la estructura de la presente invención, el enlazador multifuncional permite la unión (liberable o permanente) de 3 o más componentes, esto es, un agente de dirección, un polímero y un compuesto citotóxico biológicamente activo, como SN38. El técnico puede apreciar que también se pueden usar otras moléculas que incluyen por lo menos tres grupos funcionales independientes. Un enlazador multifuncional preferido puede ser un residuo de ácido aspártico o lisina. El grupo L2 que tiene por lo menos tres sitios funcionales se puede seleccionar de los siguientes: en donde: R2 y R'2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2.6, alquilo ramificado de C3-i9, cicloalquilo de C3-8, alquilo de C-i-6 sustituido, alquenilo de C2.6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3-8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C-|.6, heteroalquilo de C-i.6 sustituido, alcoxi de C1-6, ariloxi, heteroalcoxi de C-i_6, heteroariloxi, alcanoilo de C2_6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2_6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (d ), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c"6), (c7) y (c8) son como se define anteriormente; y (d1 ), (d2), (d3), (d4), (d5) y (d7) son como se define anteriormente. Las modalidades preferidas incluyen: C. Polímeros solubles en agua, sustancialmente no antigénicos ÍBU Los profármacos de la presente invención incluyen un residuo polimérico R-?, preferiblemente polímeros solubles en agua y sustancialmente no antigénicos. Los ejemplos adecuados de tales polímeros incluyen óxidos de polialquileno (PAO's) tales como polietilenglicoles. Algunos polímeros preferidos incluyen polietilenglicoles como mPEG. Una lista no limitativa de tales polímeros incluye homopolimeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos, y copolímeros de bloque de los mismos. La porción de polímero de los compuestos aquí descritos tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton, de preferencia de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 60,000 Dalton. En algunos aspectos, el óxido de polialquileno puede ser de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 25,000 Dalton; de preferencia de aproximadamente 12,000 Dalton a aproximadamente 20,000 Dalton, cuando están unidos proteínas u oligonucleótidos, o alternativamente de aproximadamente 20,000 Dalton a aproximadamente 45,000 Dalton, de preferencia de aproximadamente 30,000 Dalton a aproximadamente 40,000 Dalton, cuando se utilizan compuestos farmacéuticamente activos en los compuestos aquí descritos (moléculas pequeñas que tienen un peso molecular promedio menor de aproximadamente 1 ,500 Dalton). El polietilenglicol (PEG) se representa en general con la estructura: -0-(CH2CH20)n- en donde (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300, y depende del número de brazos de polímero cuando se usan polímeros de multibrazo. Se entenderá que el polímero soluble en agua se modificará para su unión con los enlazadores. Alternativamente, la porción de polietilenglicol (PEG) de la invención se puede representar con la estructura: -Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-, -Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)-Y71-, -Y71-C(=Y72HCH2)a71-Y73-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71- -Y71-(CR71 R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR7-|R 2)a72-Y7r, -Y71-(CH2CH20)n-CH2CH2-, -Y71-(CH2CH20)n-CH2C(=Y72)-, -C(=Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a7 C(=Y72)- - y -(CR71 R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH20)n-(CH2)b71-Y73- en donde: Y71 y Y73 son independientemente O, S, SO, S02, N R73 o un enlace; Y72 es O, S, o NR74; R71-74 son independientemente las mismas porciones que se pueden usar para R2; (a71 ), (a72) y (b71 ) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente 0-6, muy preferiblemente 1 ; y (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300. Como un ejemplo no limitativo, el PEG puede estar modificado como se indica a continuación: -C(=Y74)-(CH2)m-(CH2CH2O)n-, -C(=Y74)-Y-(CH2)m-(CH2CH20)n-, -C(=Y74)-NR1 (CH2)m-(CH2CH2O)n-, -CR75R76-(CH2)m-(CH2CH20)n-, en donde R75 y R76 se seleccionan independientemente de H, alquilo de d. 6, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido y alquilo de d-6 sustituido; m es cero o un entero positivo, preferiblemente 1 ; Y74 es O, o S; y n representa el grado de polimerización. Aunque los profármacos de la presente invención se pueden formar usando cualquiera de los polímeros sustancialmente no antigénicos aquí descritos, algunos óxidos de polialquileno preferidos incluyen: CH30-PEG-0-(CH2)m-C02H; PEG-NHS; CH3O-PEG-0-(CH2)m-NR11R12; y CH30-PEG-0-(CH2)2 -S-(CH2)m-C02H; SC-PEG; o cualquiera de los PEG's activados reconocidos en la técnica. En particular se prefieren polietilenglicoles (PEG's), PAO's mono-activados terminados en alquilo de Ci-4, tales como polietilenglicoles terminados en mono-metilo (mPEG's), cuando se desean polímeros monosustituidos; y se prefieren óxidos de polietileno bis-activados cuando se desean profármacos disustituidos. Para proveer el enlace deseado, se usan polímeros activados mono- o diácidos, tales como PEG ácidos o PEG diácidos. Los PAO ácidos adecuados se pueden sintetizar convirtiendo mPEG-OH en un éster etílico; véase también Gehrhardt, H. , ef al. Polymer Bulletin 18: 487 (1987), y Veronese, F.M., et al., J. Controlled Reléase 10; 145 (1989).
Alternativamente, el PAO-ácido se puede sintetizar convirtiendo mPEG-OH en un éster f-butílico; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 5,605,976 y No. 5,965,566, de beneficiario en común; las descripciones de todas ellas se incorporan aquí como referencia.
Las patentes de EE. UU. Nos. 5,643,575, 5,919,455, 6,1 13,906, y 6,566,506, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia, describen derivados ramificados o U-PEG. Una lista no limitativa de tales polímeros corresponde a los sistemas de polímero (i)-(vii) que tienen las siguientes estructuras: O H m-PEG N— C \ CH— (Y63CH2)w61C(=0)- — H / m-PEG N— C O (ü) m-PEG — C - -NH \ (CH2). w62 HC (Y63CH2)w61C(=0)- ,(CH2)w63 m-PEG — C N II H O (vi) en donde: Y6i-62 son independientemente O, S o NR6i ; Y63 es O, NR62, S, SO o SO2; (w62), (w63) y (w64) son independientemente 0 o un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 10, muy de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 6; (w61 ) es 0 o 1 ; mPEG es metoxi-PEG; en donde PEG es como se define anteriormente y el peso molecular total de la porción de polímero es de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton; y R6i y F*62 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de Ci.6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3.19, cicloalquilo de C3-8, alquilo de C-i-6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2.6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de Ci_6, heteroalquilo de C1-6 sustituido, alcoxi de C1-6, ariloxi, heteroalcoxi de C^, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2_6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C -6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2.6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido. En otro aspecto, los polímeros incluyen PEG-OH de multibrazo o productos "star-PEG" como los que se describen en el Catálogo de Sistemas de Suministro de Fármaco de NOF Corp., versión 8, abril de 2006, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los conjugados de polímero de multibrazo contienen cuatro brazos de polímero o más, de preferencia cuatro u ocho brazos de polímero. Para fines de ilustración más no de limitación, el residuo de polietilenglicol (PEG) de multibrazo puede ser: H2C O — (CH2CH20)nH I HC 0 — (CH2CH20)nH I CH2 "cT C H2 HC O — (CH2CH20)nH H2C O — (CH2CH20)nH En donde: (x) es 0 o un entero positivo, esto es, de aproximadamente O a aproximadamente 28; y (n) es el grado de polimerización. En una modalidad particular de la presente invención, el PEG de multibrazo tiene la estructura: H2C O— (CH2CH20)nH en donde n es un entero positivo. En una modalidad preferida de la invención, los polímeros tienen un peso molecular total de aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 60,000 Dalton, de preferencia de 12,000 Da a 40,000 Da. En otra modalidad particular, el PEG de multibrazo tiene la estructura: en donde (n) es un entero positivo. En una modalidad preferida de la invención, el grado de polimerización (n) del polímero de multibrazo es de aproximadamente 28 a aproximadamente 350, para dar polímeros con un peso molecular total de aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 60,000 Da; de preferencia, de aproximadamente 65 a aproximadamente 270 (12,000-45,000 Da), para dar polímeros con un peso molecular total de 12,000 Da a 45,000 Da. Esto representa el número de unidades repetidas en la cadena de polímero, y depende del peso molecular del polímero.
Los polímeros pueden ser convertidos a un polímero adecuadamente activado usando las técnicas de activación descritas en las patentes de EE. UU. Nos. 5,122,614, o 5,808,096. Específicamente, dicho PEG puede ser de la fórmula: en donde: (u') es un entero de aproximadamente 4 a aproximadamente 455; y hasta 3 porciones terminales del residuo están bloqueadas con un metilo u otro alquilo inferior. En algunas modalidades preferidas, los cuatro brazos del PEG pueden ser convertidos en grupos activadores adecuados para facilitar la unión de grupos aromáticos. Tales compuestos, antes de la conversión, incluyen: Las sustancias poliméricas aquí incluidas son preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitativa de tales polímeros incluye homopolimeros de óxido de polialquileno tales como polietllenglicol (PEG) o polipropilenglicol, poliol polioxietilenado, copolimeros de los mismos y copolimeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua del copolimero de bloque.
En una modalidad adicional, y como una alternativa a los polímeros basados en PAO, se pueden usar uno o más materiales efectivamente no antigénicos, tales como dextrano, alcohol polivinílico, polímeros basados en carbohidrato, hidroxipropilmetacrilamida (HPMA), óxidos de polialquileno, o copolímeros de los mismos; véase también la patente de EE. UU. No. 6, 153,655, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los expertos en la materia entenderán que el mismo tipo de activación se utiliza como se describe aquí para PAO's tales como PEG. Los expertos en la materia, además, se darán cuenta de que la lista anterior es únicamente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades aquí descritas. Para los fines de la presente invención, "sustancialmente o efectivamente no antigénicos" significa todos los materiales conocidos que son inocuos y no provocan una respuesta inmune aprecíable en los mamíferos. En algunos aspectos, se pueden utilizar polímeros que tienen grupos amino terminales para hacer los compuestos aquí descritos. Los métodos de preparación de polímeros que contienen aminas terminales con alta pureza se describen en las solicitudes de patente de EE. UU. 1 1/508,507 y 1 1/537, 172, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Por ejemplo, polímeros que tienen azidas se hacen reaccionar con un agente reductor de fosfina, tal como trifenílfosfina, o un agente reductor de borohidruro de metal alcalino, tal como NaBH4. Alternativamente, los polímeros que incluyen grupos salientes reaccionan con sales de amina protegidas tales como la sal de potasio de ¡midodicarbonato de metil-ter-butilo (KNMeBoc), o la sal de potasio de ¡midodicarbonato de di-ter-butilo (KNBoc2), seguido por desprotección del grupo amino protegido. La pureza de los polímeros que contienen las aminas terminales formados mediante estos procesos, es mayor de 95%, aproximadamente; de preferencia mayor de 99%. En aspectos alternativos, en los sistemas de suministro poliméricos aquí descritos se pueden utilizar polímeros que tienen grupos de ácido carboxílico terminales. Los métodos de preparación de polímeros que tienen ácidos carboxílicos terminales con alta pureza se describen en la solicitud de patente de EE. UU. No. 1 1/328,662, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los métodos incluyen preparar primero un éster de alquilo terciario de un óxido de polialquileno, seguido por conversión al derivado de ácido carboxílico del mismo. El primer paso de la preparación de los ácidos carboxílicos de PAO incluye formar un intermediario tal como éster t-butílico de ácido carboxílico de óxido de polialquileno. Este intermediario se forma haciendo reaccionar un PAO con un haloacetato de t-butilo, en presencia de una base como t-butóxido de potasio. Una vez formado el intermediario de éster t-butílico, el derivado de ácido carboxílico del óxido de polialquileno puede ser provisto fácilmente con una pureza mayor de 92%, de preferencia mayor de 97%, de preferencia mayor de 99%, muy de preferencia mayor de 99.5%.
D. Agentes de dirección (D ) Se pueden añadir agentes de dirección a los compuestos poliméricos aquí descritos para guiar los conjugados al área objetivo in vivo. Los agentes de dirección permiten que porciones biológicamente activas tales como compuestos farmacéuticamente activos y oligonucleótidos tengan eficacia terapéutica en el área objetivo, esto es, en el sitio del tumor. El suministro dirigido in vivo incrementa la incorporación celular de estas moléculas mejorando su eficacia terapéutica. En algunos aspectos, algunos péptidos penetradores de célula pueden ser reemplazados con una variedad de péptidos de dirección para el suministro dirigido al sitio del tumor. En un aspecto de la invención, la porción de dirección, tal como un anticuerpo de una sola cadena (SCA) o anticuerpo de unión de antigeno de una sola cadena, anticuerpo monoclonal, péptidos de adhesión celular tales como péptidos de RGD y Selectin, péptidos penetradores de célula (CPP's) tales como TAT, Penetratin y (Arg)9, ligandos de receptor, moléculas de carbohidrato de dirección o lectinas, oligonucleótido, derivados de oligonucleótido como ácido nucleico cerrado (LNA) y aptámeros, o similares, permiten dirigir específicamente fármacos citotóxicos a regiones objetivo; véase Curr Opin Pharmacol., octubre de 2006; 6(5):509-14, "Cell-penetratíng peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery"; véase también J Pharm Sci., septiembre de 2006; 95(9): 1856-72: "Cell adhesión molecules for targeted drug delivery", cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.
Las porciones de dirección se pueden marcar como compuestos biotinilados, compuestos fluorescentes, compuestos radiomarcados. Una marca adecuada se prepara uniendo cualquier porción adecuada, por ejemplo un residuo de aminoácido, con cualquier isótopo emisor estándar, marca radiopaca, marca de resonancia magnética u otras marcas isotópicas no radiactivas para imagografía de resonancia magnética, marcas de tipo fluorescente, marcas que exhiben colores visibles o son capaces de emitir fluorescencia bajo estimulación ultravioleta, infrarroja o electroquímica, para permitir la toma de imágenes del tejido de tumor durante los procedimientos quirúrgicos, etc. Opcionalmente, la marca diagnóstica se incorpora o se enlaza con una porción terapéutica conjugada permitiendo monitorear la distribución de un material terapéutico biológicamente activo dentro de un animal o paciente humano. En un aspecto adicional de la invención, los conjugados marcados de la invención se preparan fácilmente, por medio de métodos conocidos, con cualquier marca adecuada que incluye por ejemplo marcas de radioisótopo. Simplemente a manera de ejemplo, estas incluyen 13 Yodo, 12 Yodo, 99mTecnecio o 111lndio, para producir agentes radioinmuno-escintigráficos para incorporación selectiva en las células de tumor in vivo. Por ejemplo, existen varios métodos conocidos para enlazar el péptido a Tc-99m, que incluyen, simplemente a manera de ejemplo, los que se muestran en las patentes de EE. UU. Nos. 5,328,679; 5,888,474; 5,997,844; y 5,997,845, que se incorporan aquí como referencia.
Las porciones de dirección preferidas incluyen anticuerpos de una sola cadena (SCA's) o fragmentos variables de una sola cadena de anticuerpos (sFv). El SCA contiene dominios de anticuerpo que pueden unirse o reconocer a moléculas específicas de células de tumor objetivo. Además de mantener un sitio de unión de antigeno, un SCA pegilado por medio de enlazadores puede reducir la antigenicidad y aumentar la vida media del SCA en la corriente sanguínea. Los términos "anticuerpo de una sola cadena" (SCA), "molécula o anticuerpo de unión de antígeno de una sola cadena" o "Fv de una sola cadena" (sFv) se usan intercambiablemente. El anticuerpo de una sola cadena tiene afinidad de unión por el antigeno. El anticuerpo de una sola cadena (SCA) o Fvs de una sola cadena ha sido construido de varias maneras. Una descripción de la teoría y producción de proteínas de unión de antígeno de una sola cadena se encuentra en la solicitud de patente de EE. UU. No. 10/915,069, y en la patente de EE. UU. No. 6,824,782, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Normalmente, los dominios de SCA o Fv se pueden seleccionar de entre anticuerpos monoclonales conocidos por sus abreviaciones en la literatura, tales como 26-10, MOPC 315, 741 F8, 520C9, McPC 603, D1.3, phOx murina, phOx humana, RFL3.8 sTCR, 1A6, Se 55-4, 18-2-3,4-4-20, 7A4-1 , B6.2, CC49,3C2,2c, MA-15C5/K12G0, Ox, etc. (véase Huston, J. S. et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Huston, J. S. et al. , SIM News 38(4) (Supl.):1 1 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 1 14 (1990); McCartney, J. E. et al., resultados no publicados (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med. 32 (Supl.):1005 (1991); Huston, J. S. et al., en: "Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications", Parte B, editado por J. J. Langone, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Huston, J. S. et al., en: "Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology", Epenetos, A. A. (Ed.), Londres, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242:423-426 (1988); Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265:18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cáncer Inst.82:1191-1197 (1990) ; Gibbs, R. A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4001-4004 (1991); Milenic, D. E. et al., Cáncer Research 51:6363-6371 (1991); Pantoliano, M. W. et al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339:394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990); Batra, J. K. er al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171:1-6 (1990); Batra, J. K. et al., J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 87:9491-9494 (1990); Batra, J. K. et al., Mol. Cell. Biol. 11:2200-2205 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8616-8620 (1991); Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266:17376-17381 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3075-3079 (1992); Glockshuber, R. et al., Biochemistry 29:1362-1367 (1990); Skerra, A. et al., Bio/Technol. 9:273-278 (1991); Pack, P. et al., Biochemistry 31:1579-1534 (1992); Clackson, T. et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Iverson, B. L. et al., Science 249:659-662 (1990); Roberts, V. A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci.
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E. Porciones biológicamente activas (D?) Una amplia variedad de porciones biológicamente activas se pueden añadir a los polímeros activados aquí descritos. Las porciones biológicamente activas incluyen compuestos farmacéuticamente activos, enzimas, proteínas, oligonucleótídos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena y péptidos.
Cualquier agente citotóxico o quimioterapéutico, esto es, ácido fólico, etcétera, susceptible de ser añadido a un polímero, que incluye sin limitación las porciones biológicamente activas que se describen en la patente de EE. UU. No. 5,965,566, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. En un aspecto de la invención, los compuestos biológicamente activos son adecuados para uso médico o diagnóstico en el tratamiento de animales, por ejemplo mamíferos, incluyendo los humanos, para condiciones para las cuales se desea dicho tratamiento. En otro aspecto, las porciones biológicamente activas que contienen amina, hidroxilo o tiol están dentro del alcance de la presente invención. Las únicas limitaciones sobre los tipos de las porciones biológicamente activas adecuadas para su inclusión en la presente, es que esté disponible por lo menos un grupo hidroxilo o tiol que pueda reaccionar y enlazarse con una porción portadora, y que no haya pérdida sustancial de bioactividad en forma conjugada con los sistemas de suministro poliméricos aquí descritos. Alternativamente, los compuestos originales adecuados para su incorporación en los compuestos conjugados de transporte polimérico de la invención, pueden ser activos después de liberación hidrolítica del compuesto enlazado, o inactivos después de la liberación hidrolítica, pero que se activan después de experimentar una reacción o proceso químico adicional. Por ejemplo, un fármaco anticanceroso que es suministrado a la corriente sanguínea por el sistema de transporte polimérico, puede permanecer inactivo hasta que entra a una célula de cáncer o tumor, después de lo cual es activado por la química de la célula del cáncer o tumor, por ejemplo por una reacción enzimática única para esa célula. En una modalidad preferida, los sistemas de transporte poliméricos aquí descritos incluyen compuestos farmacéuticamente activos. Para los fines de la presente invención, se entiende que los compuestos farmacéuticamente activos incluyen moléculas de bajo peso molecular. Normalmente, los compuestos farmacéuticamente activos tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1 ,500 Dalton. Una lista no limitativa de dichos compuestos incluye inhibidores de ADN de topoisomerasa I, tales como camptotecina y sus análogos, taxanos y derivados de paclitaxel, nucleósidos que incluyen AZT y aciclovir, compuestos de antraciclina que incluyen daunorrubicina y doxorrubicina, compuestos antimetabolitos relacionados que incluyen Ara-C (citosina arabinósido) y gemcitabina, etcétera. 1. Taxanos y derivados de taxano Una clase de compuestos incluidos en las composiciones de profármaco de la presente invención es la de los taxanos. Para los fines de la presente invención, el término "taxano" incluye todos los compuestos dentro de la familia de terpenos del taxano. De esta manera, taxol® (paclitaxel), derivados de ter-butoxi-carbonil-amina 3'-sustituidos (taxotere®), etcétera, y también otros análogos, disponibles por ejemplo de Sigma Chemical de San Luis, Misuri, están dentro del alcance de la invención. Se ha encontrado que estos compuestos son agentes anticancerosos eficaces. Muchos estudios indican que los agentes tienen actividad contra varios tipos de malignidad. A la fecha, su uso se ha limitado severamente, entre otras cosas, por su bajo suministro, baja solubilidad en agua e hipersensibilidad. Se entiende que otros taxanos que incluyen los 7-aril-carbamatos y 7-carbazatos descritos en las patentes de EE. UU. Nos. 5,622,986 y 5,547,981 , de beneficiario en común, también pueden estar incluidos en los profármacos de la presente invención. El contenido de las patentes de EE. UU. anteriores se incorpora aquí como referencia. Aunque los ejemplos describen entre otros a paclitaxel con fines ilustrativos, se entiende que los métodos aquí descritos son adecuados para todos los taxanos y moléculas relacionadas. 2. Camptotecina e inhibidores de topoisomerasa I relacionados La camptotecina es un alcaloide citotóxico insoluble en agua producido por los árboles de Camptoteca accuminata originarios de China, y los árboles de Nothapodytes foetida originarios de la India. La camptotecina y los compuestos relacionados y análogos también se conocen como potenciales agentes anticancerosos o antitumorales, y se ha mostrado que exhiben estas actividades in vitro e in vivo. La camptotecina y los compuestos relacionados también son candidatos para su conversión a profármacos de la presente invención; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,004,758, y Hawkins, Oncology, diciembre de 1992, páginas 17-23. La camptotecina y los análogos relacionados son por ejemplo Topotecan, Irinotecan (CPT-1 1 ) o SN38. Análogos de camptotecina adicionales incluyen los reportados en la literatura, que incluyen las 10-hidroxicamptotecinas, 1 1 -hidroxicamptotecinas o 10,1 1 -dihidroxicamptotecinas, camptotecinas 7- o 9-sustituidas con alquilo, cicloalquilo, alcoxi, alquenilo, amino alquilo, etcétera; camptotecinas sustituidas en el anillo A tales como 10,1 1 -alquilendioxicamptotecinas, como las que se describen en la patente de EE. UU. No. 5,646,159, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia, etcétera. En una modalidad preferida de la invención, el agente citotóxico es SN38. 3. Oligonucleótidos Los siguientes términos se definen para apreciar más completamente el alcance de la presente invención. El técnico apreciará que los términos "ácido nucleico" o "nucleótido" se aplican a ácido desoxirribonucleico ("ADN"), ácido ribonucleico ("ARN"), ya sea de una sola cadena o de doble cadena, a menos que se especifique de otra manera, y cualquier modificación química de los mismos. Un "oligonucleótido" es generalmente un polinucleótido relativamente corto, por ejemplo cuya longitud varía de aproximadamente 2 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos. Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención generalmente son ácidos nucleicos sintéticos, y son de una sola cadena, a menos que se especifique de otra manera. Los términos "polinucleótido" y "ácido polinucleico" también se usan como sinónimos en la presente. Las modificaciones de oligonucleótidos contempladas en la invención incluyen, por ejemplo, la adición o sustitución de nucleótidos seleccionados con grupos funcionales o porciones que permiten un enlace covalente de un oligonucleotido con un polímero deseable, o la adición o sustitución de porciones funcionales que incorporan en un oligonucleotido carga adicional, polaridad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y funcionalidad. Tales modificaciones incluyen, sin limitación, modificaciones de azúcar en la posición 2', modificación de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodouracilo, modificaciones de esqueleto, metilaciones, combinaciones de apareamiento de bases, tales como las ¡sobases isocitidina e isoguanidina, y combinaciones análogas. Las modificaciones de oligonucleotido también pueden incluir modificaciones 3' y 5', tales como bloqueo. A continuación se proveen estructuras de análogos de nucleosido ilustrativos.
Morfolino 2'-F-A A 2'-(3-hidroxi)propil 3'-Fosforamidato 0=P-BH," Boranofosfalos Véanse más ejemplos de análogos de nucleósido en Freier y Altmann; Nucí. Acid Res. , 1997, 25, 4429-4443, y Uhlmann; Curr. Opinión in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. El término "antisentido", como se usa aquí, se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica que codifica un producto de gen o que codifica una secuencia de control. El término "cadena de antisentido" se usa con respecto a una cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena de "sentido". En la operación normal del metabolismo celular, la cadena de sentido de una molécula de ADN es la cadena que codifica polipéptidos u otros productos de gen. La cadena de sentido sirve como un molde para la síntesis de un transcrito de ARN mensajero ("ARNm") (una cadena de antisentido), que a su vez dirige la síntesis de cualquier producto de gen codificado. Se pueden producir moléculas de ácido nucleico de antisentido por medio de métodos conocidos, que incluyen la síntesis por ligación de los genes de interés en una orientación inversa, en un promotor viral que permite la síntesis de una cadena complementaria. Una vez introducida en una célula, esta cadena transcrita se combina con secuencias naturales producidas por la célula para formar dúplex. Estos dúplex bloquean entonces la transcripción o traducción posteriores. De esta manera, se pueden generar fenotipos mutantes. Se sabe que la designación "negativa" o (-) se refiere a la cadena de antisentido, y que "positiva" o (+) se refiere a la cadena de sentido. En una modalidad preferida, la elección para la conjugación es un oligonucleótido (o "polinucleótido"), y después de la conjugación el objetivo es referido como un residuo de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden seleccionar de entre cualquiera de los oligonucleótidos y oligodesoxinucleótidos conocidos con esqueletos de fosforodiéster o esqueletos de fosforotioato. Los oligonucleótidos o derivados de oligonucleótido pueden incluir de aproximadamente 10 ácidos nucleicos a aproximadamente 1000 ácidos nucleicos, preferiblemente polinucleótidos relativamente cortos, por ejemplo que varían en longitud de aproximadamente 2 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, o de preferencia de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos. Además, los oligonucleótidos y oligodesoxinucleótidos útiles de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, los siguientes: oligonucleótidos y oligodesoxinucleótidos con esqueleto de fosforodiéster natural o esqueleto de fosforotioato, o cualquier otro análogo con esqueleto modificado; LNA (ácido nucleico cerrado); PNA (ácido nucleico con esqueleto de péptido); ARN interferente pequeño (siRNA) microARN (miARN); ácido nucleico con esqueleto de péptido (PNA); fosforodiamidato morfolino oligonucleótidos (PMO); triciclo-ADN; ODN de señuelo (oligonucleótido de doble cadena); secuencia de ARN catalítico (RNAi); ribozimas; aptámeros; oligonucleótidos Spiegelmer (oligonucleótidos L-conformacionales); oligómeros CpG; etc., como los que se describen en: Tides, 2002, "Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences", 6-8 de mayo de 2002, Las Vegas, Nevada, y Oligonucleotide & Peptide Technologies", 18 y 19 de noviembre de 2003, Hamburgo, Alemania, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. Opcionalmente, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención también pueden incluir cualquier análogo y derivado de nucleótido adecuado conocido, que incluyen los que se enlistan más abajo en el cuadro 1 .
CUADRO 1 Análogos y derivados de nucleotido representativos 4-acet¡lc¡t¡d¡na 5-metoxiaminometil-2-t¡ouridina 5-(carbox¡hidroximetil)urid¡na beta, D-manos¡lqueuos¡na 2'-0-metilcitid¡na 5-metoxicarbon¡lmet¡l-2-tiouridina 5-carboximetilam¡nometil-2-l¡ouridina 5-metoxicarbonilmetiluridina 5-carboximetilaminometiluridina 5-metoxiuridina Dihidrouridina 2-metiltio-N6-¡sopenten¡ladenosina 2'-0-met¡lseudourid¡na N-((9-beta-D-r¡bofuranosil-2- metiltiopurin-6-il)carbamoil)treonina D-galactosilqueuosina N-((9-beta-D-ribofuranosilpurin-6-il)N- met¡lcarbamoil)treonina 2'-0-met¡lguanosina éster metílico del ácido uridin-5- oxiacético Inosina ácido uridin-5-oxiacético N6-isopenteniladenosina Wybutoxosina 1-metiladenosina Seudouridina 1 -metilseudouridina Queuosina 1 -metilguanosina 2-tiocitidina 1 -metilinosina 5-metil-2-tiouridina 2,2-dimetilguanosina 2-tiouridina 2-metiladenosina 4-tiouridina 2-metilguanosina 5-metiluridina 3-metilcitidina N-((9-beta-D-ribofuranosilpurin-6-il)- carbamoil)treonina CUADRO 1 (Continuación) Preferiblemente, el oligonucleótido está involucrado en las células de tumor objetivo, o regula negativamente una proteína involucrada en la resistencia de las células de tumor a la terapia anticancerosa. Por ejemplo, en la presente invención se puede usar cualquier proteina celular conocida, tal como BCL-2, para regulación negativa con oligonucleótidos de antisentido, para la terapia del cáncer; véase la solicitud de patente de EE. UU. No. 10/822,205, presentada el 9 de abril de 2004, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Una lista no limitativa de oligonucleótidos terapéuticos preferidos incluye oligonucleótidos de antisentido de HIF-1 a, y oligonucleótidos de antisentido de Survivin. En una modalidad preferida, el oligonucleótido pueden ser por ejemplo un oligonucleótido que tiene una secuencia de oligonucleótidos igual o sustancialmente similar a la de Genasense (a/k/a oblimersen sodio, producida por Genta Inc., Berkeley Heights, Nueva Jersey). El Genasense es un oligonucleótido de antisentido de fosforotioato de 18 elementos, TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 6), que es complementario a los primeros seis codones de la secuencia de iniciación del ARNm de bc1 -2 humano (el ARNm de bc1-2 humano es conocido y se describe por ejemplo como la SEQ ID NO: 19 en la patente de EE. UU. No. 6,414,134, que se incorpora aquí como referencia). La Administración de Fármacos y Alimentos de EE. UU. (FDA) otorgó el estatus de "Fármaco Huérfano" a Genasense en agosto de 2000. Las modalidades preferidas incluyen: (i) LNA de antisentido de Survivin (SEQ ID NO: 3) mC3-Ts-mC3-As_as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mC3-As-Gs-c en donde las letras mayúsculas representan LNA, la "s" representa un esqueleto de fosforotioato; (¡i) siRNA de antisentido de Bc12: SENTIDO: 5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' (SEQ ID NO: 4) ANTISENTIDO: 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5' (SEQ ID NO: 5), en donde dT representa ADN; (iii) Genasense (oligonucleótido de antisentido de fosforotioato) (SEQ ID NO: 6): ^s"^s"^s"<-'S-'-'s"^s"^s~9s"^s"9s"^s"9s"'-'s~9s"^s~Cs-C3-as-t en donde las letras minúsculas representas ADN y "s" representa esqueleto de fosforotioato; (iv) LNA de antisentido de HIF1a (SEQ ID: 7) 5'- sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa -3' (SEQ ID NO: 7), en donde las letras mayúsculas representan LNA y la "s" representa esqueleto de fosforotioato. LNA incluye el biciclonucleótido 2'-O, 4'-C-metileno como se muestra abajo: Monómero de LNA -configuración ß-D- Véase la descripción detallada de LNA de Survivin descrita en la solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 1 1/272, 124, titulada "LNA Oligonucleotides and the Treatmemt of Cáncer"; y 10/776,934, titulada Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression", el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia; véase también la solicitud de patente de EE. UU. No de serie 10/407,807, titulada "Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression"; y 1 1/271 ,686, titulada "Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression", el contenido de las cuales también se incorpora aquí como referencia. Los oligonucleótidos utilizados en los compuestos aquí descritos se pueden modificar con enlazadores (CH2)w-amino en el extremo 5' o 3' de los oligonucleótidos, en donde w en este aspecto es un entero positivo, o de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia 6. Los oligonucleótidos modificados contemplados en los compuestos aquí descritos pueden ser NH-(CH2)w-Oligonucleótido. En una modalidad preferida, el extremo 5' de la cadena de sentido de siRNA está modificado. Por ejemplo, el siRNA utilizado en los conjugados poliméricos se modifica con un 5'-C6-NH2. Una modalidad particular de la presente invención utiliza siRNA de Bc12 que tiene la secuencia: SENTIDO: 5'-(NH2-C6)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' ANTISENTIDO: 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5\ otra modalidad preferida, los compuestos aquí descritos pueden incluir oligonucleótidos modificados con enlazadores (CH2)w-amino que contienen éster impedido; véanse las solicitudes provisionales de EE. UU. Nos. 60/844,942, titulada "Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers", cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los compuestos poliméricos pueden liberar los oligonucleótidos sin una cola de amina. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden tener la estructura: en donde w es un entero positivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia aproximadamente 6. En otra modalidad preferida, los oligonucleótidos se pueden modificar con enlazadores (CH2)W sulfhidrilo (tio-oligonucleótidos). Los tio-oligonucleótidos se pueden usar para conjugarse directamente con la cisteína del péptido cargado positivamente o por medio del grupo maleimidilo. Los tio-oligonucleótidos pueden tener la estructura SH-(CH )w-oligonucleótido. Los tio-oligonucleótidos también pueden incluir éster impedido tendiendo la estructura: Los oligonucleótidos modificados ejemplares incluyen: (i) Genasense modificado con una cola de C6-NH2: 5'- NH2-C6- stsCstscscscsasgscsgstsgscsgsCsCsast -3' s /^^O-P-T-sC-sT-sC-sC-sC-sA-sG-sC-sG-sT-sG-sC-sG-sC-sC-sA-sT (ii) LNA de antisentido de HIF 1 a modificado con una cola de C6- 5'- NH2-C6- s sGsGsCsasasgscsastsCscsTsGsTsa -3'; (iii) LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de 5'-NH2-C6- smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc -3'; (iv) LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de C6-SH: 5'-HS-C6- smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc-3'; (v) Genasense modificado con una cola de éster impedido 4. Porciones biológicamente activas adicionales Además de las moléculas anteriores, los compuestos de la presente invención se pueden preparar usando muchos otros compuestos. Por ejemplo, se pueden incluir compuestos biológicamente activos tales como derivados de cis-platino que contienen grupos OH, floxuridina, podofilotoxina, y compuestos relacionados. Otros compuestos originales útiles incluyen por ejemplo algunas proteínas biológicamente activas de bajo peso molecular, enzimas y péptidos, incluyendo peptidoglicanos, y también otros agentes antitumorales, agentes cardiovasculares como forskolina, antineoplásicos como combretastatina, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, AraC, maytansina, etc. , antiinfecciosos como vancomicina, etc. , antifúngicos como nistatina o anfotericina B, agentes antiinflamatorios, agentes esteroideos, etcétera. Lo anterior es ilustrativo de las porciones biológicamente activas que son adecuadas para los profármacos de la presente invención.
F. Enlazadores permanentes y liberables (Li y L3) Los enlazadores L-\ y L3 incluyen enlazadores bifuncionales. Los enlazadores bifuncionales pueden ser enlazadores permanentes o liberables. Los enlazadores bifuncionales incluyen aminoácidos o derivados de aminoácido. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales. También se contemplan dentro del alcance de la invención los derivados y análogos de los aminoácidos naturales, y también varios aminoácidos no naturales conocidos (D o L), hidrofóbicos o no hidrofóbicos. Una lista no limitativa adecuada de aminoácidos no naturales incluye ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadipico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido 2-aminobutirico, ácido 4-aminobutírico, ácido piperidinico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutirico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-aminobutirico, desmosina, ácido 2,2-diaminopimélico, ácido 2,3-diamino-propiónico, n-etilglicina, N-etilasparagina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metil-isoleucina, 6-N-metil-lisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina. Algunos residuos de aminoácido preferidos incluyen glicina, alanina, metionina y sarcosina; muy preferiblemente glicina. Alternativamente, l_i y L3 se pueden seleccionar de: -[C(=0)]v(CR22R23)t[C(=0)]v-, -[C(=0)]v(CR22R23)rO[C(=0)]v-, -[C(=0)]v(CR22R23),-NR26[C(=O)]v -, -[C(=0)]vO(CR22R23),[C(=0)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23)tO[C(=O)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23),NR26[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23),[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23),0[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23),NR26[C(=0)]v -, -[C(=0)]v(CR22R23),0-(CR28R29)f[C(=0)]v-, -[C(=O)]v(CR22R23),NR26-(CR28R29), [C(=O)]v-, -[C(=0)]v(CR22R23),S-(CR2eR29)f[C(=0)]v.-, -[C(=0)]vO(CR22R23)tO-(CR2eR29)r[C(=0)]v.-, -[C(=0)]vO(CR22R23),NR26-(CR28R29)r[C(=0)]v-1 -[C(=0)]vO(CR22R23),S-(CR28R29),-[C(=0)]v-, -[C(=O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)r[C(=0)]v-, -[C(=0)]VNR21(CR22R23),NR26-(CR28R29),.[C(=0)]V.-, -[C(=0)]VNR21(CR22R23),S-(CR28R29),-[C(=0)]V-, -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v.-, -[C(=0)]V(CR22R23CR28R290),[C(=0)]V-, -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290),NR26[C(=0)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290),[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)»NR26[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290),[C(=0)]v-, -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290),(CR24R25)f[C(=0)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290),(CR24R25).'[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25MC(=0)]v- -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290),(CR24R25)fO[C(=0)]v-, -[C(=0)]v(CR22R23),(CR24R25CR28R290) [C(=0)]v.-, -[C(=0)]V(CR22R23),(CR24R25CR28R290),.NR26[C(=0)]V.
-[C(=0)]v0(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)« [C(=0)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23),(CR24R25CR28R290)t [C(=0)]v-, -[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)rNR26[C(=O)]v-, -[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)tO[C(=0)]v-, -[C(=0)]vNR21 (CR22R23),(CR24R25CR28R290)t.[C(=O)]v-, -[C(=0)]vNR21 (CR22R23)t(CR24R25CR28R29O) NR26[C(=O)]v-, en donde: R21 -29 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C-i-6, alquilo de C3-12 ramificado, cicloalquilo de C3_8, alquilo de Ci_6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de Ci-6, heteroalquilo de Ci_6 sustituido, alcoxi de Ci.6, fenoxi y heteroalcoxi de C1-6; (t) y (f) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 12, de preferencia un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, muy de preferencia 1 o 2; y (v) y (?') son independientemente cero o 1 . Preferiblemente, los enlazadores bifuncionales se pueden seleccionar de: -[C(=0)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)2-, -[C(=0)]rNH(CH2)2(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r -, -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=O)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s [C(=0)]r-, -[C(=0)]r NH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s [C(=0)] , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)[C(=0)]r -, -[C(=0)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s [C(=0)],-, -[C(=0)]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=O)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2CH20)s(CH2)s [C(=0)]r-, -[C(=0)]rNHCH2CH2NH[C(=0)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2CH2)20[C(=0)]r -, -[C(=0)]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r-, -[C(=0)]rNH(CH2)3[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2CH20)2NH[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2)20(CH2)2[C(=0)],-, -[C(=0)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2CH2)NH[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2CH2)0[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2)3NH[C(=0)]r-, -[C(=0)]rO(CH2)30[C(=0)] , -[C(=0)]rO(CH2)3[C(=0)] , -[C(=O)]rCH2NHCH2[C(=O)]r-, -[C(=0)]rCH2OCH2[C(=0)]r-, -[C(=0)]rCH2SCH2[C(=0)]r-, -[C(=0)]rS(CH2)3[C(=0)]r-, -[C(=O)]r(CH2)3[C(=O)]r-, — [C(=0)]rOCH2-^^-CH20[C(=0)]r— -[C(=0)]rNHCH2-^^-CH2NH[C(=0)]r- y -[C(=0)]rNHCH2^^-CH20[C(=0)]r.— en donde (r) y (r') son independientemente cero o 1 , con la condición de que (r) y (r') no son cero al mismo tiempo.
. Enlazadores liberables En una modalidad preferida de la invención, los compuestos aquí descritos contienen una porción biológicamente activa unida a un enlazador liberable. Una ventaja de la invención es que la porción biológicamente activa puede ser liberada de manera controlada. Entre los enlazadores liberables pueden estar enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo (o basados en lactonizacion de cierre de trialquilo), enlazadores basados en bicina, enlazadores lábiles al ácido, péptidos escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B. Entre los enlazadores lábiles al ácido pueden estar el enlace disulfuro, enlazadores que contienen hidrazona y enlazadores que contienen tiopropionato. Alternativamente, los enlazadores liberables son enlazadores lábiles intracelulares, enlazadores extracelulares y enlazadores lábiles al ácido. Los enlazadores lábiles al ácido, tales como enlaces de hidrazona, se pueden hidrolizar en el medio lisosomal ácido. Algunos enlazadores liberables adecuados son oligopéptidos que incluyen Val-Cit, Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, y Phe-Lys. Un enlazador liberable preferido es un enlazador peptidilo (Val-Cit) que puede ser degradado específicamente por la catepsina B. Preferiblemente, el L3 incluye enlazador liberable. Los enlazadores liberables preferidos incluyen: -Val-Cit-, -Gly-Phe-Leu-Gly- -Ala-Leu-Ala-Leu-, -Phe-Lys-, O II H -Val — Cit— C-N- /, -Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-, -Val-C¡t-C(=0)-CH2SCH2-C(=0)-, y -NHCH(CH3)-C(=O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=O)-¡ en donde, Y-i 1-19 son independientemente O, S o NR48; R31-48, R50-51 y 51 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6| alquilo de C3.12 ramificado, cicloalquilo de C3-8, alquilo de C1-6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de C1-6l heteroalquilo de d-6 sustituido, alcoxi de C1-6, fenoxi y heteroalcoxi de C1-6; Ar es una porción arilo o heteroarilo; L-11.-I5 son espaciadores bifuncionales seleccionados independientemente; J y J' se seleccionan independientemente de porciones transportadas activamente a una célula objetivo, porciones hidrofóbicas, porciones enlazadoras bifuncionales, y combinaciones de las mismas; (c11), (h11), (k11), (111), (m11) y (n11) son enteros positivos seleccionados independientemente, de preferencia 1; (a11), (e11), (g11), (j11), (o11) y (q 1 ) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente 1 ; y (b11), (x11), (x'11), (f11), (¡11) y (p11) son independientemente cero o uno. Varios enlazadores liberables, basados en eliminación de bencilo o basados en cierre de trialquilo, se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos. 6,180,095, 6,720,306, 5,965,119, 6624,142 y 6,303,569, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los enlazadores basados en bicina también se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 7,122,189 y 7087,229, de beneficiario en común, y las solicitudes de patente de EE. UU. Nos.10/557,522, 11/502,108, y 11/011,818; el contenido de todas ellas se incorpora aquí como referencia. Preferiblemente, los compuestos biológicamente activos, que incluyen oligonucleótido, se enlazan a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores lábiles al ácido. Sin limitarse a ninguna teoría, los enlazadores lábiles al ácido facilitan la liberación de los ninguna teoría, los enlazadores lábiles al ácido facilitan la liberación de los oligonucleótidos de los compuestos poliméricos originales dentro de las células y específicamente en el lisosoma, endosoma o macropínosoma. 2. Enlazadores permanentes En aspectos preferidos de la invención, la porción de dirección, tal como el SCA, está unida al enlazador multifuncional por medio de un enlazador permanente. Los enlazadores premanentes son capaces de conjugar la porción de dirección y el enlazador multifuncional. Un enlazador permanente preferido puede ser una molécula como una molécula que contiene maleimidilo, que puede proveer un enlace de tio-éter. Los enlazadores permanentes que contienen grupos maleimidilo se pueden seleccionar de: En una modalidad alternativa, los enlazadores permanentes incluyen estructuras que corresponden a los que se muestran arriba, pero en lugar del grupo maleimidilo tienen grupos tales como vinilo, residuos de sulfona, amino, carboxi, mercapto, hidrazida, carbamato, etc., en lugar de maleimidilo.
G. Grupos salientes y grupos funcionales En algunos aspectos, los grupos salientes adecuados incluyen, sin limitación, halógeno (Br, Cl), carbonato activado, carbonilimidazol, ¡midationa cíclica, isocianato, N-hidroxisuccinimidilo, para-nitrofenoxi, N-hidroxiftalimida, N-hidroxibenzotriazolilo, imidazol, tosilato, mesilato, tresilato, nosilato, alquiloxi de Ci.C6, alcanoiloxi de C^Ce, arilcarboniloxi, orto-nitrofenoxi, N-hidroxibenzotriazolilo, imidazol, pentafluorofenoxi, 1 ,3,5-triclorofenoxi, y ,3,5-trifluorofenoxi, u otros grupos salientes adecuados como será evidente para el experto en la materia. Para los fines de la presente invención, se entiende que los grupos salientes son los grupos que son capaces de reaccionar con un nucleófilo encontrado en el objetivo deseado, esto es, una porción biológicamente activa y una porción de dirección. En algunas modalidades preferidas, los grupos funcionales para enlazar los sistemas de transporte poliméricos a las porciones biológicamente activas, incluyen maleimidilo, vinilo, residuos de sulfona, amino, carboxi, mercapto, hidrazida, carbazato, etcétera, que pueden estar conjugados adicionalmente, con un grupo biológicamente activo o un grupo de dirección. Para los fines de la presente invención, cuando Di o D2 son grupos funcionales, los grupos l_i y L3 no son porciones funcionales. En una modalidad preferida, el grupo funcional puede ser maleimidilo y los grupos salientes se pueden seleccionar de OH, metoxi, ter-butoxi, para-nitrofenoxi y N-hidroxisuccinimidilo.
H. Modalidades preferidas que corresponden a la fórmula (I) Algunas modalidades particulares preparadas mediante los métodos aquí descritos incluyen: en donde: mPEG tiene la fórmula: CH3-0(CH2CH20)n-; PEG tiene la fórmula -0(CH2CH20)n-; (n) es un entero positivo de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300; R51 y R52 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C-|.6, alquilo de C3-12 ramificado, cicloalquilo de C3.8, alquilo de C -6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arito sustituido, aralquilo, heteroalquilo de C -6, heteroalquilo de Ci-6 sustituido, alcoxi de C1-6, alcoxicarbonilo de C1-6, ariloxicarbonilo, fenoxi y heteroalcoxi de Ci-6; D-i es una porción de dirección, un grupo funcional o un grupo saliente; y D2 es una porción biológicamente activa, un grupo funcional o un grupo saliente. Los compuestos poliméricos preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen: en donde: S-SCA es un anticuerpo de una sola cadena; RGD es: LNA es ácido nucleico cerrado; Acido fólico es un residuo de: SN38 es 7-etil-10-hidroxicamptotecina; mPEG tiene la fórmula: CH3-0(CH2CH20)n-; PEG tiene la fórmula -0(CH2CH20)n-; y (n) es un entero positivo de aproximadamente aproximadamente 2,300.
I. Métodos de preparación de los conjugados Generalmente, los conjugados se pueden hacer uniendo secuencialmente el polímero, el agente citotóxico y la porción de dirección al enlazador multifuncional. El orden exacto de adición no está limitado a ese orden y, como será evidente para el experto en la materia, hay aspectos en los cuales el PEG puede agregarse primero al enlazador multifuncional, seguido por la adición del fármaco citotóxico unido liberablemente, seguido por la adición del agente de dirección, como el anticuerpo monoclonal. En los ejemplos que se dan más abajo se dan detalles con respecto a algunos aspectos preferidos de esta modalidad. En un aspecto de la invención, el compuesto polimérico que tiene un enlazador multifuncional se puede preparar conjugando un compuesto polimérico que tiene un grupo terminal OH o un grupo saliente, con un nucleoófilo que contiene un agente citotóxico unido por medio de un enlazador opcional. El técnico puede usar menos cantidad del nucleófilo en comparación con el número de grupos salientes del polímero para formar un intermediario polimérico que contiene tanto el agente citotóxico como grupos salientes. Además, este intermediario se puede hacer reaccionar con una porción de dirección para formar el conjugado polimérico multisustituido con el agente citotóxico y el agente de dirección. Alternativamente, el polímero se puede activar con diferentes grupos para proveer diferentes reactividades químicas hacia varias porciones nucleofilicas. Por ejemplo, diferentes grupos protectores tales como éster ter-Bu y éster metílico de terminales de ácido carboxílíco, se pueden desproteger selectiva y gradualmente para proveer varios grados de grupo activo para ser conjugados con diferentes agentes biológicamente activos, tales como agente citotóxico y agente de dirección. Como se muestra en los esquemas A-M, el grupo maleimidilo y el éster succinimidilo pueden reaccionar selectivamente con porciones que contienen SH o NH2, respectivamente. Todas las reacciones aquí descritas son reacciones químicas estándares con los pasos y condiciones necesarias conocidas por los expertos en la materia. Las reacciones sintéticas aquí descritas, por lo tanto, no requieren mayor experimentación. Los métodos de preparación de un conjugado polimérico que contiene enlazadores multifuncionales comprende: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (Illa): M - (L1 )a- L2-M2 A21 (Illa) con un compuesto que contiene una porción biológicamente activa, que tiene la fórmula (lllb): 3— (L3)b — D22 bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto de fórmula (lile): M -(L )a — L2— (L3)b D22 I i 1 A22 (lile) en donde Ri es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico; A2i es un grupo bloqueador o M -(L1 )a-L2-M2 .
A22 es un grupo bloqueador -(L1 )a-L2-(L3)b D22 es un grupo funcional; D22 es una porción biológicamente activa; M2 es OH o un grupo saliente; M3 es OH, NH2 o SH; L-i es un enlazador permanente o enlazador liberable; L2 es un enlazador multifuncional; L3 es un enlazador permanente o un enlazador liberable; y (a) y (b) son independientemente cero o un entero positivo. Además, los métodos incluyen: hacer reaccionar el compuesto de fórmula (lile): con una porción que contiene una porción nucleofílica que tiene la fórmula (llld): D2i— M4 ( md) bajo condiciones adecuadas para formar el compuesto de fórmula (lile): en donde: A23 es un grupo bloqueador o D2i-(Li)a-L2— (L3)b— D22 ; Mi es un grupo funcional; D2i es una porción de dirección; y M4 es OH, NH2, o SH. La unión del compuesto nucleofílico, tal como la fórmula (lllb), al PEG u otro polímero, se puede hacer usando técnicas estándares de síntesis química muy conocidas para el experto en la materia. La porción de polímero activado, tal como SC-PEG, PEG-amina, PEG ácidos, etcétera, se puede obtener de fuentes comerciales, o puede ser sintetizada por el técnico sin mayor experimentación. La unión del compuesto nucleofílico, tal como la fórmula (lllb), a la porción de polímero, se efectúa preferiblemente en presencia de un agente de acoplamiento. Una lista no limitativa de agentes de acoplamiento adecuados incluyen 1 ,3-diisopropilcarbodiímida (DIPC), cualquier carbodiimida de dialquilo adecuada, halogenuros de 2-halo-1 -alquil-piridinio (reactivos de Mukaiyama), 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida (EDC), anhídrido cíclico del ácido propanofosfónico (PPACA), y fenildiclorofosfatos, etcétera, que están disponibles por ejemplo de fuentes comerciales como Sigma-Aldrich Chemical, o se sintetizan usando las técnicas conocidas. Preferiblemente, las reacciones se efectúan en un disolvente inerte como cloruro de metileno, cloroformo, DMF, o mezclas de los mismos. Preferiblemente, las reacciones se pueden realizar en presencia de una base, tal como dimetilaminopiridina (DMAP), diisopropiletilamina, piridina, trietilamina, etcétera, para neutralizar cualquier ácido generado. Las reacciones se pueden efectuar a una temperatura de aproximadamente 0 °C a arriba de aproximadamente 22 °C (temperatura ambiente). Algunas modalidades particulares preparadas mediante los métodos aquí descritos incluyen: J. Métodos de tratamiento En aspectos alternativos de la invención, también se proveen métodos de tratamiento de un mamífero, que comprenden administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene un compuesto de fórmula (I) de la presente invención a un paciente en necesidad del mismo. En un aspecto preferido de la invención, también se proveen métodos de tratamiento de un paciente que tiene una malignidad o cáncer, que comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene el compuesto de fórmula (I). En algunos aspectos, el cáncer tratado puede ser uno o más de los siguientes: tumores sólidos, linfomas, cáncer de pulmón de célula pequeña, leucemia linfocítica aguda (ALL), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del ovario, cáncer gástrico, etcétera. Las composiciones son útiles para el tratamiento de enfermedad neoplásica, reducción de la carga de tumor, prevención de metástasis de neoplasmas, y prevención de recurrencias de tumor /crecimientos neoplásicos en los mamíferos.
Otro aspecto de la presente invención provee métodos de tratamiento de varias condiciones médicas en los mamíferos. Brevemente, a un mamífero en necesidad de dicho tratamiento se le puede administrar cualquier porción biológicamente activa que se pueda unir al polímero de PEG. Cualquier oligonucleótido, etcétera, que tiene efectos terapéuticos en estado no conjugado, se puede usar en su forma conjugada, preparado como se describe en la presente. La cantidad de la composición administrada dependerá de la molécula original incluida. En general, la cantidad de profármaco usada en los métodos de tratamiento es aquella cantidad que logra eficientemente el resultado terapéutico deseado en los mamíferos. Naturalmente, las dosificaciones de los diversos compuestos de profármaco varían un poco dependiendo del compuesto original, la velocidad de hidrólisis in vivo, el peso molecular del polímero, etcétera. Los expertos en la materia determinarán la dosificación óptima de los conjugados de transporte poliméricos seleccionados, basándose en su experiencia clínica y la indicación del tratamiento. Las dosificaciones reales serán evidentes para el técnico sin mayor experimentación. Los compuestos de la presente invención se puede incluir en una o más composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a los mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución, suspensión, tableta, cápsula o similar, preparada de acuerdo con los métodos conocidos. También se contempla que la administración de dichas composiciones puede ser por vía oral o parenteral, dependiendo de las necesidades del técnico. Una solución o suspensión de la composición se puede utlizar por ejemplo como vehículo para inyección o infiltración de la composición mediante cualquier método conocido, por ejemplo por inyección intravenosa, intramuscular, intraperitonial, subcutánea, etcétera. Dicha administración también puede ser mediante infusión a un espacio o cavidad del cuerpo, y también por inhalación o vía ¡ntranasal. En aspectos preferidos de la invención, sin embargo, los conjugados poliméricos se administran por vía parenteral a los mamíferos en necesidad de los mismos. En un aspecto adicional de la invención, se proveen métodos de administración de polinucleótidos (oligonucleótidos), preferiblemente oligonucleótidos de antisentido, a células de mamífero. Los métodos incluyen suministrar una cantidad efectiva de un conjugado preparado como se describe aquí para la condición tratada, que dependerá de la eficacia de los polinucleótidos para dichas condiciones. Por ejemplo, si los oligonucleótidos no conjugados tienen eficacia contra algunas células cancerosas o neoplásticas (por ejemplo, los oligonucleótidos de antisentido de BCL2, oligonucleótidos de antisentido de Survivin), el método incluiría suministrar un conjugado de polímero que contiene los oligonucleótidos a las células que susceptibles a los oligonucleótido simples. El suministro se puede hacer in vivo como parte de una composición farmacéutica adecuada, o directamente a las células en un medio ex vivo. En un tratamiento particular se pueden usar los conjugados poliméricos que incluyen oligonucleótidos (SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NOs: 2 y 3, y SEQ ID NO: 4).
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para proveer una mayor apreciación de la invención, pero de ningún modo restringen el alcance de la invención. Los números en negritas citados en los ejemplos corresponden a los que se muestran en los esquemas A-M. En todos los ejemplos se usan abreviaturas tales como DCC (diciciohexilcarbodiimida), DCM (diclorometano), DCU (diciclohexilurea), DIEA (diisopropiletilamina), DIPC (diisopropilcarbodiimida), DMAP (4-dimetilaminopiridina), DMF (?,?'-dimetilformamida), DSC (carbonato de disuccinimidilo), EDC (1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida), EEDQ (2-etoxi-1 -etoxicarbonil-1 ,2-dihidroquinolina), IPA (isopropanol), NHS (N-hidroxisuccinimida), NMM (N-metilmorfolina), PEG (polietilenglicol), SCA-SH (anticuerpo de una sola cadena), SN38 (7-etil-10-hidroxicamptotecina), TBDPS (ter-butil-dipropilsililo), y TEA (trietilamina).
Procedimientos generales. Todas las reacciones se hicieron bajo una atmósfera de nitrógeno seco o argón. Se usaron reactivos comerciales sin mayor purificación. Todos los compuestos de PEG se secaron al vacío o por medio de destilación azeotrópica de tolueno antes de usarse. Se obtuvieron espectros de RMN de 1H a 300 MHz y espectros de RMN de 3C a 75.46 MHz, utilizando un espectrómetro de RMN Vahan Mercury 300 y cloroformo deuterado como disolvente, a menos que se especifique de otra manera. Los desplazamientos químicos (d) se reportan en partes por millón (ppm) abajo del tetrametilsilano (TMS).
Método de HPLC. Las mezclas de reacción y la pureza de los intermediarios y productos finales se monitorearon con un instrumento de HPLC Beckman Coulter System Gold®. Utiliza una columna de fase inversa ZORBAX® 300SB C8 (150 x 4.6 mm), o una columna de fase inversa Phenomenex Júpiter® 300A C18 (150 x 4.6 mm), con un detector de UV de arreglo de diodo 168, usando un gradiente de acetonitrilo 10%-90% en ácido trifuoroacético (TFA) al 0.05%, a una velocidad de flujo de 1 mL/min.
ESQUEMA A Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 1-5 Preparación de enlazador heterobifuncional de PEG-amida (maleimida /ácido carboxilico activado) ESQUEMA B Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 6-7 Preparación de enlazador heterobifuncional de PEG-carbamato (maleimida /ácido carboxilico activado) ESQUEMA C Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 8-9 Preparación de PEG-carbamato-Lvs(RGDC)-NH-Oliqo ESQUEMA D Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 10-14 Síntesis de Boc-Val-Cit-PABE-SN38 (Método A) 48% 12 13 14 ESQUEMA E Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 15-17 Síntesis de Boc-Val-Cit-PABE-SN38 (Método B) Cit (1.05 eq) R EEDQ (1.5 eq) J Y "0H BocHN-Va OSu *- BocHN-Val-Cit— »- BocHN-Val-Cit-1^ NaHC03 OH DCM:MeOH (2:1 ) ¾ (1.05 eq) Boc-Val-Cit Boc-Val-Cit-PAB 15 16 1 MsCI, CH3CN O f^ O(10)SN38 . »- BocHN-Val-Cit-^ 2. SN38, K2C03 H DMF Boc-Val-CK-PABE-SN38 14 ESQUEMA F Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 18-19 Síntesis de PEG-carbamato-Lys(RGDC)Val-Cit-PABE-SN38 18 17 ESQUEMA G Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 20-23 Síntesis de enlazador heterobifuncional de PEG-carbamato (NPys /ácido carboxílico activado) (4 brazos) (4 brazos) ESQUEMA H Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 24-25 Síntesis de BocPheLys(Fmoc)-NH-PABE-SN38 O G iT O-(10)-SN38 BocPheOSu Lys (Fmoc)-OH BocPheLys(Fmoc)-OH - ? D . ' ' EEDO BocPheLys(Fmoc) N 23 DCM/ eOH u ESQUEMA I Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 26-28 Síntesis de PEG-carbamato-Lys(Cys(RGDC))-Phe-Lvs-PABE- SN38 ESQUEMA J Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 29-32 Síntesis de PEG-carbamato-Lys(Cvs(NPvs))-Val-C¡t-PAB-OH Cu (1 05 eq) EE DO (1 5 eq) OH FmocHN Val- OSu — » FmocHN- al - Cit-- - FmocHN- Val- CitY N NaHCO, OH DC eOH (2:i; H (1 05 eq) Piperidina/D F ESQUEMA K Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 33-35 Síntesis de PEG-carbamato-Lys(Cvs(RGDC))-Val-Cit-PAB-Dox o ESQUEMA L Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 36-38 Síntesis de enlazador heterobifuncional de PEG-carbamato (4 brazos) ESQUEMA M Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 39-40 Síntesis de PEG-carbamato-l_vs(folato)-Cys-S-Oliqo EJEMPLO 1 N-(Metoxicarbonil)maleimida (compuesto 1) A una solución de maleimida (5.5 g, 56.7 mmol, 1 eq.) y NMM (6.2 mL, 56.7 mmol, 1 eq.) en 200 mL de EtOAc, a 0 °C, se le agregó cloroíormiato de metilo (4.4 mL, 56.7 mmol, 1 eq.). La suspensión se agitó a 0 °C durante 30 minutos, se filtró y se lavó con EtOAc. El filtrado y los lavados se combinaron y el producto se lavó con agua fría y se secó sobre Na2SO4 anhidro. Después de filtrar y evaporar al vacío, se obtuvo un sólido rosa. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-EtOAc, 1 :1 , v/v) dio el producto (4.8 g, 55%).
EJEMPLO 2 NE-Maleoil-a-(Boc)-L-lisina (compuesto 2) A una solución de Boc-L-lisina (500 mg, 2.03 mmol, 1 eq.) en 10 mL de solución acuosa saturada de NaHCO3, a 0 °C, se le agregó N-(metoxicarbonil)maleimida (315 mg, 2.03 mmol, 1 eq ). La mezcla se agitó vigorosamente a 0 °C durante 40 minutos y a temperatura ambiente durante una hora más. Después de enfriar a 0 °C, la solución se acidificó a pH 3.0 con H2SO4 concentrado antes de extraer con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y el producto se secó sobre MgSO4 anhidro. Después de eliminar el disolvente al vacío, el residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando una mezcla de CHCI3-MeOH (5: 1 , v/v) para proveer el producto (458 mg, 69%): 1H RMN d 1.39-1.87 (6 H, m, (CH2)3), 1 -44 (9H, s, Boc), 3.52 (2H, t, J = 7.2 Hz, NCH2), 4.25-4.30 (1 H, m, CH), 5.15 (1 H, d, NH), 6.70 (2H, s, maleimida).
EJEMPLO 3 N' -Maleoil-g-L-lisina (compuesto 3) Una solución de NE-maleoil-a-(Boc)-L-lisina (172 mg, 0.53 mmol) en 5 mL de DCM anhidro, se trató con 10 mL de HCI 2N en éter etílico durante una hora a temperatura ambiente, antes de agregar 10 mL de éter etílico anhidro. El sólido resultante se filtró para producir 82 mg (59%) de la sal HCI de Nc-maleoil-a-L-lisina: 1H RMN (CD3OD) d 1 .36-1.54 (2 H, m, CH2), 1 .65 (2 H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 1.83-2.02 (2 H, m, CH2), 1 .44 (9H, s, Boc), 3.53 (2H, t, J = 6.9 Hz, NCH2), 3.95 (1 H, t, 6.2 Hz, CH), 6.82 (2H, s, maleimida); 3C RMN (CD3OD) d 23.17, 29.03, 31.01 , 37.96, 135.26, 172.34, 175.20.
EJEMPLO 4 mPEG-amida-Lys(Nc-maleoil)-COOH (compuesto 4) A una solución de ^mPEGCOONHS (805 mg, 0.16 mmol, 1 eq.) en 8 mL de DCM anhidro, se le agregó N'-maleoil-a-L-lisina (3, 82 mg, 0.31 mmol, 2 eq.) en 2 mL de DMF, seguido por DIEA (109 µ?, 0.62 mmol, 4 eq ). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se filtró y se evaporó al vacio. El residuo se precipitó primero con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA. 3C RMN (CDCI3): d 22.53, 28.02, 31.69, 37.32, 51.18, 58.86, 70.11-71 .73 (PEG), 133.84, 169.51 , 170.38, 172.41 .
EJEMPLO 5 5KmPEG-amida-Lys(NE-maleoil)-NHS (compuesto 5) 5KmPEG-Lys(Nc-maleo¡l)-COOH (4) y NHS en DCM a 0 °C, se trataron con DCC. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó al vacio y el residuo se precipitó con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA.
EJEMPLO 6 mPEG-carbamato-Lys(N' -maleo¡l)-COOH (compuesto 6) A una solución de ÜKmPEGCOONHS (5 g, 0.98 mmol, 1 eq.) en 45 mL de DCM anhidro, se le agregó N' -maleoil-a-L-lisina (3, 514 mg, 1 .95 mmol, 2 eq.) en 5 mL de DMF, seguido por DIEA (0.7 mL, 3.92 mmol, 4 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se filtró y se evaporó al vacio. El residuo se precipitó primero con DCM/éter etílico y después se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el compuesto 6: 13C RMN d 22.30, 28.01 , 31 .89, 37.29, 53.26, 58.89, 64.06, 69.31 -71.77 (PEG), 133.87, 155.60, 170.42, 172.82.
EJEMPLO 7 5KmPEG-carbamato-Lys(Nc-maleoil)-NHS (compuesto 7) A una solución de 5KmPEG-carbamato-Lys(Nr-maleoil)-COOH (6, 1 g, 0.19 mmol, 1 eq.) y NHS (88 mg, 0.76 mmol, 4 eq.) en 10 mL de DCM, a 0 °C, se le agregó DIPC (1 18 µ?, 0.76 mmol, 4 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó al vacio y el residuo se precipitó con DCM/éter; después se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el compuesto 7: 3C RMN d 22.31 , 25.90, 28.25, 32.39, 37.44, 52.42, 59.30, 64.92, 69.64-72.18 (PEG), 134.25, 155.59, 167.75, 168.55, 170.91 .
EJEMPLO 8 Compuesto 8 A una solución de 5'extGS (5 mg, 0.85 µ????) en amortiguador PBS (2.5 mL, pH 7.8), se le agregó el compuesto 7 (92 mg, 17 µ?t???, 20 eq.), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 10 mL con agua, se filtró y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ, (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho -16 mL), que previamente se equilibró con amortiguador de Tris-HCI 20 mM, pH 7.0 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en amortiguador de Tris-HCI 20 mM, pH 7.0, amortiguador B, en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/minutos. El producto eluido se desaló usando una columna de desalación Hiprep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 8 (1 mg equivalente de oligo, 40% de rendimiento).
EJEMPLO 9 Compuesto 9 A una solución del compuesto 8 (1 mg equivalente de oligo) en amortiguador PBS (1 mL, pH 7.0), se le agregó el péptido cRGDfC (1 mg, 1 .7 µ????), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 20 mL con agua y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ (10 mm x 1.5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que previamente se equilibró con amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.0 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.0, amortiguador B, en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló usando una columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 9 (0.78 mg equivalentes de oligo, 78% de rendimiento).
EJEMPLO 10 Compuesto 10 A una solución de alcohol p-amino-bencílico (1 g, 8.12 mmol, 1 eq.) en 80 mL de THF anhidro, se le agregó DIEA (1 .4 mL, 8.12 mmol, 1 eq.) y Boc20 (1 .9 mL, 8.12 mmol, 1 eq.). La mezcla se calentó a reflujo durante la noche y después se enfrió y se evaporó al vacio. El residuo se disolvió en EtOAc. La capa orgánica se lavó con una solución de HCI 0.1 N, se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacio. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hex-EtOAc, 1 :1 , v/v), para dar 1.85 g de producto (rendimiento cuantitativo): H RMN d 0.1.49 (9H, s), 2.17 (1 H, s), 4.53 (2H, s), 6.83 (1 H, s), 7.19 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.28 (2H, d, J = 8.2 Hz); 13 C RMN d 28.28, 64.54, 80.37, 1 18.49, 127.59, 135.31 , 137.46, 152.72.
EJEMPLO 11 Compuesto 11 A una solución a -20 °C del compuesto 10 (220 mg, 0.98 mmol, 1 eq.) y DIEA (188 µ?_, 1 .08 mmol, 1.1 eq.) en 8 mL de DCM anhidro, se le agregó gota a gota una solución de MsCI (84 µ?, 1 .08 mmol, 1.1 eq.) en 2 mL de DCM anhidro. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y después se agitó una hora. La mezcla de reacción se lavó con una solución saturada de NaHC03, una solución saturada de NH4CI y salmuera, se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacio. El compuesto crudo se usó en el siguiente paso sin mayor purificación.
EJEMPLO 12 Compuesto 12 Al compuesto 11 (0.98 mmol, 2 eq.) disuelto en 15 mL de DMF anhidra se le agregó SN38 (192 mg, 0.49 mmol, 1 eq.) y K2CO3 (68 mg, 0.49 mmol, 1 eq.). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C usando un baño de aceite previamente calentado. Después de 2 horas, una HPLC mostró la desaparición completa de SN38 y la formación del producto principal. La mezcla de reacción se evaporó al vacio y el residuo se redisolvió en EtOAc y se lavó con agua, solución saturada de NH4CI y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacio. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH2Cl2-EtOAc, 1 : 1 , v/v), para dar 140 mg de producto (48% de rendimiento): 1H RMN (DMSO-d6) d 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1 .27 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1 .47 (9H, s), 1.85-1 .88 (2H, m), 3.15-3.17 (2H, m), 5.25 (2H, s), 5.26 (2H, s), 5.42 (2H, s), 6.49 (1 H, s), 7.26 (1 H, s), 7.41 -7.56 (6H, m), 8.05 (1 H, d, J = 9.1 Hz), 9.39 (1 H, s); 13C RMN (DMSO-dg) d 7.65, 13.31 , 22.09, 27.96, 30.1 1 , 49.31 , 65.05, 69.47, 72.17, 78.84, 95.74, 103.39, 1 17.71 , 1 17.92, 122.35, 127.44, 127.99, 128.43, 129.59, 131 .07, 139.07, 143.46, 144.06, 145.92, 149.21 , 149.69, 152.37, 156.46, 156.82, 172.1 1 .
EJEMPLO 13 Compuesto 13 Al compuesto 12 (535 mg) se le agregó TFA al 15% (v/v) en solución de DCM, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta que una HPLC mostró la desaparición completa del material inicial. Se le agregó éter etílico (200 mL) y el sólido resultante se filtró y se lavó con más éter (307 mg, 58% de rendimiento).
EJEMPLO 14 Compuesto 14 El compuesto 13 (48 mg, 0.1 mmol, 1 eq.) y el compuesto 15 (36 mg, 0.1 mmol, 1 eq.) se trataron con EEDQ (48 mg, 0.2 mmol, 2 eq.). La mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo sólido resultante se trituró con 10 mL de éter etílico. El sólido se filtró y se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (CHCI3:MeOH, 15: 1 a 9.1 ), para dar el producto deseado (8 mg, 9% de rendimiento): 3 C RMN (DMSO-de) d 7.8, 13.49, 18.1 1 , 18.17, 18.58, 19.13, 19.25, 22.25, 26.51 , 26.72, 28.19, 29.59, 30.26, 30.41 , 30.50, 49.49, 51 .67, 51.80, 52.90, 55.98, 59.26, 59.67, 63.03, 65.21 , 69.54, 72.33, 77.91 , 78.01 , 95.92, 103.63, 1 18.10, 1 18.95, 122.52, 127.63, 128.21 , 128.58, 131 .17, 131 .27, 138.53, 143.69, 144.25, 146.10, 149.43, 149.86, 155.15, 155.26, 156.63, 156.97, 158.48, 158.66, 170.39, 171 .15, 171 .33, 172.15, 172.29.
EJEMPLO 15 Boc-Val-Cit-OH (Compuesto 15) A una solución de L-citrulina (5.85 g, 33.40 mmol, 1.05 eq.) en 20 mL de THF y NaHCO3 (2.8g, 33.40 mmol, 1 .05 eq.) en 80 mL de agua, se le agregó Boc-Val-NHS (10 g, 31 .81 mmol, 1 eq.) en 80 mL de DME . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se le agregó ácido cítrico acuoso (200 mL de una solución al 15% en agua), y la mezcla se extrajo con IPA 10%/EtOAc (2 x 200 mL). La suspensión se lavó con agua (2 x 200 mL) y el disolvente se evaporó al vacio. El sólido resultante se trituró con 200 mL de éter etílico y se filtró para producir el producto (6.08 g, 51 % de rendimiento): 1H RMN (CD3OD) d 0.92 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1 .44 (9H, s), 1 .51-2.06 (5H, m), 3.12 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.90 (1 H, d, J = 7.0 Hz), 4.37-4.41 (1 H, m). 13C RMN (CD3OD): d 18.58, 19.83, 27.58, 28.75, 30.03, 32.09, 40.48, 53.33, 61.38, 80.49, 157.75, 162.05, 174.30, 174.69.
EJEMPLO 16 Compuesto 16 (Boc-Val-Cit-PAB) Se trató Boc-Val-Cit (1 g. 2.67 mmol, 1 eq.) y alcohol p-aminobencílico (362 mg, 2.94 mmol, 1.1 eq.) en DCM/MeOH 2: 1 (26 mL /13 mL) con EEDQ (1 .32 g, 5.34 mmol, 2 eq.). La mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo sólido resultante se trituró con 10 mL de éter etílico. El sólido se recogió por filtración y se lavó con éter etílico para dar el producto (900 mg, 70%): H RMN (CD3OD) d 0.93 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.97 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1 .44 (9H, s), 1.49-2.06 (5H, m), 3.07-3.29 (2H, m), 3.91 (1 H, d, J = 6.7 Hz), 4.50-4.55 (3H, m), 7.29 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.22 (1 H, d, J = 7.3 Hz); 3C RMN (CD3OD) d 18.64, 19.85, 27.84, 28.75, 30.61 , 31 .92, 40.28, 54.90, 54.99, 61 .73, 64.78, 80.62, 121 .09, 128.44, 138.47, 138.55, 158.01 , 162.1 1 , 172.00, 174.42, 174.52.
EJEMPLO 17 Compuesto 14 (Boc-Val-Cit-PABE-SN38) A una suspensión de Boc-Val-Cit-PAB (214 mg, 0.45 mmol, 1 eq.) en 3 mL de CH3CN, se le agregó DIEA (0.23 mL, 1 .35 mmol, 3 eq.), seguido por la adición a gotas de una solución de MsCI (0.1 mL, 1 .35 mmol, 3 eq.) en 1 mL de CH3CN. Después de 1 hora, una TLC mostró que no quedaba material inicial (CHCI3-MeOH, 5: 1 , v/v). La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo resultante se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con solución saturada de NH4CI, solución saturada de NaHCO3 y salmuera; se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacío. Al residuo crudo disuelto en 5 ml_ de DMF, se le agregó SN38 (88 mg, 0.22 mmol, 0.5 eq.) y K2CO3 (31 mg, 0.22 eq, 0.5 eq.), y la mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas. La formación de producto se monitoreó por medio de HPLC y concordó con el producto preparado en el ejemplo 14.
EJEMPLO 18 Compuesto 17 El compuesto 14 en DCM se trató con HCL 2N en éter. Después de terminada la reacción, se le agregó más éter y el sólido resultante se filtró y se lavó con éter para dar Val-Cit-PABE-SN38. A una solución del compuesto 5 en DCM anhidro se le agregó HCI Val-Cit-PABE-SN38 en DMF anhidra, seguida por DIEA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacio y el sólido resultante se precipitó con DCM/éter y se recristalizó con CH3CN/IPA, para dar el producto.
EJEMPLO 19 Compuesto 18 A una solución del compuesto 17 (1eq.) en una mezcla de DCM/DMF, se le agregó RGDC (2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después el disolvente se evaporó al vacío. El residuo se precipitó con DCM/éter etílico y se recristalizó con DMF/IPA para dar el producto.
EJEMPLO 20 Compuesto 19 A una solución de 20kPEGSC (4 brazos) (7 g, 0.35 mmol, 1 eq.) en 60 mL de DCM anhidro, se le agregó Lys(Boc)-OH (690 mg, 2.8 mmol, 2 eq.) en 15 mL de DMF, seguida por DIEA (1 mL, 5.6 mmol, 4 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se filtró y se evaporó al vacio. El residuo se precipitó primero con DCM/éter etílico y se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el compuesto 19: 13C RMN d 21.88, 27.97, 29.04, 31.57, 39.60, 44.98, 53.00, 63.44, 68.86-70.37 (PEG), 78.04, 155.26, 172.89.
EJEMPLO 21 Compuesto 20 A una solución de PEG (4 brazos)-Lys(Boc)-OH en 25 mL de DCM anhidro, se le agregó una solución de HCI 4N en dioxano (25 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas y después se evaporó al vacío. El residuo se precipitó agregando éter etílico. El sólido se filtró y se lavó con éter para dar PEG (4 brazos)-Lys-OH (1 .77 g): 13C RMN d 21 .97, 26.54, 31 .22, 39.63, 45.1 1 , 53.16, 63.66, 69.88-70.51 (PEG), 78.04, 155.59, 172.78.
EJEMPLO 22 Compuesto 21 Una solución de BocCys(NPys)-OH (300 mg, 0.80 mmol, 1 eq.) y NHS (97 mg, 0.84 mmol, 1 .05 eq.) en 10 mL de DCM anhidro, a 0 °C, se trató con DCC (173 mg, 0.84 mmol, 1.05 eq.). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El subproducto de DCU sólido se separó por filtración. Al filtrado se le agregó el compuesto 20 (1 .7 g, 0.082 mmol, 1 eq.), seguido por DIEA (1 14 µ?, 0.66 mmol, 8 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se evaporó al vacio. El residuo se precipitó primero con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA, para dar el compuesto 21 (1.5 g): 13C RMN d 22.32, 25.52, 28.27, 28.83, 31.90, 39.03, 42.45, 45.38, 53.41 , 53.58, 63.91 , 64.37, 69.30-72.38 (PEG), 80.1 1 , 120.98, 133.94, 142.54, 153.34, 155.51 , 155.71 , 157.28, 169.98, 173.32.
EJEMPLO 23 Compuesto 22 A una solución del compuesto 21 (1 .5 g, 0.07 mmol, 1 eq.) y NHS (125 mg, 1 .09 mmol, 16 eq.) en 15 mL de DCM, a 0 °C, se le agregó DIPC (168 µ?, 1.09 mmol, 16 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se precipitó con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA, para dar el producto (1 .3 g): 13C RMN d 22.05, 25.76, 25.93, 28.68, 28.92, 32.01 , 38.89, 42.49, 45.79, 52.40, 53.97, 64.78, 69.57-71 .77 (PEG), 80.47, 121.32, 134.29, 142.93, 153.75, 155.71 , 157.60, 168.18, 169.14 , 169.71 , 170.56.
EJEMPLO 24 Compuesto 23 (BocPheLys(Fmoc)-OH). A una solución de BocPheOSu ( 1 .5 g, 4.14 mmol, 1 eq.) en DCM (10.3 mL) y DMF (10.3 mL), se le agregó H-Lys(Fmoc)-OH (1.84g, 4.55 mmol, 1.1 eq.), seguido por DIEA (2.9 mL, 16.56 mmol, 4 eq.). La mezcla de reacción resultante se agitó durante la noche y se diluyó con acetato de etilo. La solución se lavó con agua (30 mL x 2) y salmuera (30 mL x 2). Las capas orgánicas se combinaron y el producto se secó sobre MgS04 y se concentró al vacio, para producir un residuo amarillo. El residuo crudo se sometió entonces a cromatografía sobre gel de sílice usando CHCI3-MeOH (3: 1 , v/v) para dar el producto. MS [M+1]+ 616.
EJEMPLO 25 Compuesto 24 El compuesto 13 ( 1 1 mg, 0.22 mmol, 1 eq.) y el compuesto 16 (208 mg, 0.34 mmol, 1 .5 eq.) se trataron con EEDQ (167 mg, 0.67 mmol, 3 eq.). La mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo sólido resultante se trituró con 10 mL de éter etílico. El sólido se filtró y se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH2CI2-EtOAc, 1 : 1 a 1 :2, v/v), para dar el producto deseado (20 mg, 8% de rendimiento). MS [M+1 ]+ 1095.
EJEMPLO 26 Compuesto 25 El compuesto 24 (8 eq.) se trató con HCI 4N en dioxano. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se le agregó éter etílico y el sólido se filtró. Este sólido se disolvió en DMF y se añadió a una solución del compuesto 22 (1 eq.) en DCM. A la mezcla se le agregó DIEA (16 eq.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el sólido resultante se precipitó con DCM/éter etílico y se recristalizó con DMF/IPA, para dar el producto.
EJEMPLO 27 Compuesto 26 A una solución del compuesto 25 en DCM se le agregó piperidina. La mezcla de reacción se agitó 4 horas. El disolvente se eliminó al vacío y el sólido resultante se precipitó con DCM/éter etílico y se recristalizó con DMF/IPA, para dar el producto.
EJEMPLO 28 Compuesto 27 A una solución del compuesto 26 (1eq.) en una mezcla de DCM/DMF, se le agregó RGDC (2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después el disolvente se evaporó al vacío. El residuo se precipitó con DCM/éter etílico y se recristalizó con DMF/IPA, para dar el producto.
EJEMPLO 29 FmocVal-Cit-OH (Compuesto 28 ) A una solución de L-citrulina (1 .05 g, 6.01 mmol, 1.05 eq.) en 8 mL de THF y NaHC03 (505 mg, 6.01 mmol, 1.05 eq.) en 15 mL de agua, se le agregó Fmoc-Val-NHS (2.5 g, 5.73 mmol, 1 eq.) en 15 mL de DME. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se le agregó ácido cítrico acuoso (75 mL de una solución al 15% en agua), y la mezcla se extrajo con IPA 10% /EtOAc (2 x 100 mL). La capa orgánica se lavó con agua (3 x 100 mL) y el disolvente se evaporó al vacio. El sólido resultante se trituró con 100 mL de éter etílico y se filtró para dar el producto (1.98 g, 70% de rendimiento): H RMN (DMSO-d6) d 0.86 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.90 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1 .40-1 .48 (2H, m), 1.51-1.75 (2H, m), 1 .98 (1 H, sext, J = 6.8 Hz), 2.95 (2H, q, J = 6.2 Hz), 3.93 (1 H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.14-4.29 (4 H, m), 5.40 (2H, brs), 5.96 (1 H, t, J = 5.6 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.39-7.44 (3H, m), 7.75 (2H, t, J = 6.3 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 8.19 (1 H, d, J = 7.3 Hz); 13 C RMN (DMSO-d6) d 18.31 , 19.25, 26.75, 28.40, 30.59, 46.68, 51.91 , 59.81 , 64.92, 65.65, 1 19.98, 125.30, 126.94, 127.52, 140.55, 143.61 , 143.76, 155.88, 158.58, 171.12, 173.25.
EJEMPLO 30 FmocVal-Cit-PAB (Compuesto 29) Una solución del compuesto 28 (1 g, 2.01 mmol, 1eq.) y alcohol p-aminobencílico (273 mg, 2.21 mmol, 1 .1 eq.) en una mezcla de DCM/MeOH (20 mL/10 mL), se trató con EEDQ (996 mg, 4.03 mmol, 2 eq.). La mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó al vacio y el residuo sólido resultante se trituró con 10 mL de éter etílico. El sólido se recogió por filtración y se lavó con éter etílico para dar el producto (925 mg, 76% rendimiento): H RMN (D SO-de) d 0.87 (6H, d, t = 7.5 Hz), 1 .36-1.47 (2H, m), 1 .51 -1.75 (2H, m), 1.99 (1 H, sext, J = 6.7 Hz), 2.90-3.04 (3H, m), 3.93 (1 H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.23-4.38 (4 H, m), 4.43 (2H, d, J = 5.3 Hz), 5.13 (1 H, t, J = 5.6 Hz), 5.43 (2H, brs), 5.99 (1 H, t, J = 5.6 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.39-7.48 (3H, m), 7.54 (2H, d, J =8.5 Hz), 7.74 (2H, t, J = 6.7 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.12 (1 H, d, J = 7.3 Hz); 13 C RMN (DMSO-de) d 18.34, 19.28, 26.84, 29.56, 30.47, 46.67, 53.05, 60.05, 62.55, 65.65, 1 18.71 , 1 19.98, 125.23, 126.79, 126.94, 127.51 , 137.27, 137.36, 140.55, 143.60, 143.73, 155.93, 158.69, 170.17, 171 .06.
EJEMPLO 31 Val-Cit-PAB (Compuesto 30) A una solución del compuesto 29 (622 mg, 1 .03 mmol) en 10 mide DMF anhidra, se le agregó piperidina (2 ml_). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después el disolvente se evaporó al vacío. El residuo se trituró en DCM y el sólido resultante se filtró y se lavó con DCM, para dar el producto (283 mg, 72% de rendimiento): H RMN (DMSO-d6) d 0.79 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1 .38-1 .42 (2H, m), 1 .52-1 .68 (2H, m), 1 .94 (1 H, sext, J = 6.3 Hz), 2.89-3.01 (2H, m), 3.05 (1 H, d, J = 4.7 Hz), 4.46 (2H, s), 5.09 (1 H, brs), 5.40 (2H, s), 5.98 (1 H, t, J = 5.3 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.14 (1 H, brs), 10.03 (1 H, s); 3 C RMN (DMSO-d6) d 16.80, 19.33, 26.53, 29.95, 31 .10, 52.31 , 59.33, 62.35, 1 18.61 , 126.59, 137.06, 137.14, 158.44, 170.06, 173.69.
EJEMPLO 32 Compuesto 31 A una solución del compuesto 22 (1 .3 g, 0.06 mmol, 1 eq.) en 15 mL de DCM anhidro y 3 mL de DMF anhidro, se le agregó el compuesto 30 (175 mg, 0.46 mmol, 8 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y después el disolvente se evaporó al vacio. El residuo se precipitó primero con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el producto (1.1 g): 13C RMN (CDCI3/CD3OD) d 18.48, 19.46, 22.85, 26.74, 28.54, 28.94, 29.50, 30.47, 31 .81 , 39.21 , 42.04, 45.79, 53.51 , 54.06, 55.32, 59.67, 64.32, 65.04, 69.54-70.99 (PEG), 80.70, 120.23, 121.44, 127.64, 134.31 , 137.16, 142.94, 153.86, 155.86, 156.85, 160.44, 170.45, 171 .02, 171 .87, 173.19.
EJEMPLO 33 Compuesto 32 A una solución del compuesto 31 (1 eq.) en una mezcla de DCM/DMF (4/1 , v/v), se le agregó DSC (16 eq.) y la mezcla se enfrió a 0 °C. Después se le agregó piridina (16 eq.) y la mezcla se calentó gradualmente a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se precipitó con DCM/éter etílico, y después se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el producto.
EJEMPLO 34 Compuesto 33 A una solución del compuesto 32 se le agregó doxorrubicina. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se precipitó con DCM/éter etílico y después se recristalizó con DMF/IPA para dar el producto.
EJEMPLO 35 Compuesto 34 A una solución del compuesto 33 (1 eq.) en una mezcla de DCM/DMF se le agregó RGDC (2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y entonces el disolvente se evaporó al vacío. El residuo se precipitó con DCM/éter etílico y se rechstalizó con DMF/IPA para dar el producto.
EJEMPLO 36 Compuesto 35 A una solución del compuesto 19 (6.14 g, 0.307 mmol, 1 eq.) y NHS (283 mg, 2.456 mmol, 8 eq.) en 31 mL de DCM anhidro, a 0 °C, se le agregó DCC (507 mg, 2.456 mmol, 2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se filtró sobre una almohadilla de celite y se evaporó al vacío. El residuo se precipitó primero de DCM/éter etílico y después se rechstalizó con CH3CN/IPA, para dar el producto (5.69 g, 86%): 13C RMN d 21 .59, 25.21 , 28.1 1 , 29.03, 31 .42, 39.36, 45.13, 51 .80, 64.07, 68.90-70.53 (PEG), 155.15, 155.58, 168.17, 168.54.
EJEMPLO 37 Compuesto 36 A una solución del compuesto 35 (5.0g, 0.232mmol, 1 eq.) en 23 ml_ de DCM anhidro y DMF anhidra, se le agregó HCI.NH2Cys(NPys)-OH (0.77g, 2.78mmol, 12eq.), seguido por DIEA (0.65 ml_, 3.71 mmol, 16 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se evaporó al vacío, después de filtrar a través de una almohadilla de celite. El residuo se precipitó primero con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA para dar el producto (4.88 g, 95% de rendimiento): 13C RMN d 22.17, 28.22, 29.27, 31 .85, 39.92, 45.22, 51 .85, 54.49, 63.98, 69.06-70.62 (PEG), 78.56, 120.87, 132.88, 142.27, 153.44, 155.67, 156.47, 162.14, 170.74, 171.20.
EJEMPLO 38 Compuesto 37 A una solución del compuesto 36 (4.38g, 0.197 mmol, 1 eq.) en DCM (44 mL) se le agregaron 8.8 mL de TFA, y la mezcla de reacción se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente. Después de 20 horas, la mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se precipitó primero con DCM/éter y después se recristalizó con CH3CN/IPA, para dar el producto (2.1 g, 49%): 13C RMN d 21 .47, 26.41 , 31 .64, 39.47, 45.25, 52.32, 54.1 1 , 63.75, 69.12-70.65 (PEG), 120.85, 133.46, 142.25, 153.67, 155.64, 1 56.39, 171 .53, 171 .79.
EJEMPLO 39 Compuesto 38 A una solución de ácido fólico (124mg, 0.28mmol, 1 eq.) en 3.1 mL de DMSO, a temperatura ambiente, se le agregó NHS (71 mg, 0.616 mmol, 2.2 eq.), seguido por la adición de DCC (64mg, 0.308 mmol, 1 .1 eq.) y 63 DL de trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche en la oscuridad y se filtró sobre una almohadilla de Celite® para obtener una solución amarilla transparente de FA-NHS, que se usó como tal para el siguiente paso de acoplamiento con el enlazador. A una solución de H2N-Lys(PEG (4 brazos))CysNPys (37, 381 mg, 0.0175 mmol, 1 eq.) en 4 mL de DCM anhidro y 4 mL de DMF anhidra, se le agregó la solución de DMSO de FA-NHS (preparada como se muestra arriba), seguida por DIEA (49 DL, 0.28 mmol, 16 eq.). La mezcla de reacción se dejó agitando durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Después se sometió a diálisis durante 4 días con agua destilada. Después, la solución amarilla se liofilizó para obtener 197 mg del producto final.
EJEMPLO 40 Compuesto 39 A una solución de C6-tio-LNA-survivin (OligoSH) en amortiguador de fosfato de pH 6.5, se le agregó el compuesto 38, y la solución se agitó 1 hora a temperatura ambiente. El avance de la reacción se verificó por HPLC de intercambio aniónico. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y se cargó en una columna de intercambio aniónico Poros. El producto se eluyó con un gradiente usando un sistema amortiguador de Tris. HCI 20 mM y NaCI 2 M, pH 7.0. El producto se desaló y se liofilizó.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un compuesto de fórmula (I): D1-(L1 )a-L2- (L3)b- D2 I A en donde: es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico; A es un grupo bloqueador o D - (L, )a-L2-(L3)b-D2 cada D-i se selecciona independientemente del grupo que consiste en porciones de dirección, grupos funcionales y grupos salientes; cada D2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en porciones biológicamente activas, grupos funcionales y grupos salientes; cada Li es un enlazador permanente o un enlazador liberable seleccionado independientemente; L2 es un enlazador multifuncional; cada L3 es un enlazador permanente o un enlazador liberable seleccionado independientemente; y (a) y (b) son independientemente cero o un entero positivo. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque L2 se selecciona del grupo que consiste en: en donde: R2 y R'2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de Ci-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3.19, cicloalquilo de C3.8, alquilo de Ci-6 sustituido, alquenilo de C2.6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3-8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C^, heteroalquilo de C^e sustituido, alcoxi de d-6, ariloxi, heteroalcoxi de Ci.6l heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2_6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2_6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (d ), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c"6), (c7) y (c8) son independientemente cero o un entero positivo; (d1 ), (d2), (d3), (d4), (d5) y (d7) son independientemente cero o un entero positivo. 3 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque L2 se selecciona del grupo que consiste en: 4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación izado además porque se selecciona del grupo que consiste en: (lie), 5.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en: ??? 6. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en porciones que contienen -NH2, porciones que contienen -OH y porciones que contienen -SH. 7. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en compuestos farmacéuticamente activos, enzimas, proteínas, oligonucleótidos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena y péptidos. 8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los compuestos farmacéuticamente activos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de topoisomerasa de ADN, fármacos inhibidores de microtúbulo, agentes dañadores de ADN, antimetabolitos, análogos de nucleósido y fármacos anticancerosos. 9. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa es un oligonucleótido. 10. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, 138 caracterizado además porque el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en oligonucleótidos de antisentido, ácidos nucleicos cerrados (LNA), ARN ¡nterferente pequeño (siRNA), micro-ARN (miARN), ácido nucleico péptido (PNA), y fosforodiamidato morfolino oligonucleótidos (PMO). 1 1.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en oligonucleótidos de antisentido de bd -2, oligonucleótidos de antisentido de HIF- a, y oligonucleótidos de antisentido de Survivin. 12 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente de dirección se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, péptidos de adhesión celular, péptidos penetradores de célula, ligandos de receptor, moléculas de carbohidrato de dirección o lectinas, y oligonucleótido. 13 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente de dirección se selecciona del grupo que consiste en péptido de RGD, selectin, TAT, penetratin, (Arg)9 y ácido fólico. 14.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el enlazador liberable se selecciona del grupo que consiste en enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo, enlazadores basados en bicina, enlazadores lábiles al ácido, péptidos escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B. 15 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los enlazadores liberables se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: -s — s- -Val-Cit-, -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Ala-Leu-Ala-Leu-, -Phe-Lys-, -Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-, -Val-Cit-C(=O)-CH2SCH2-C(=O)-, y -NHCH(CH3)-C(=0)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=0)-; en donde ?11 -19 son independientemente O, S o NR48; R3i-48, R50, R100 y A5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de Ci.6, alquilo de C3_1 ramificado, cicloalquilo de C3.8> alquilo de C -6 sustituido, cicloalquilo de C3_8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de C e, heteroalquilo de C1-6 sustituido, alcoxi de C^, alquiloxicarbonilo de C1-6, fenoxi y heteroalcoxi de C i-6; Ar es una porción arilo o heteroarilo; L - 5 son espaciadores bifuncionales seleccionados independientemente; Z y Z' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en porciones transportadas activamente a una célula objetivo, porciones hidrofóbicas, porciones enlazadoras bifuncionales, y combinaciones de las mismas; (c11), (h11), (k 11 ), (111), (m11) y (n11) son enteros positivos seleccionados independientemente; (a11), (e11), (g11), (o11) y (q1 ) son independientemente cero o un entero positivo; y (b11), (x11), (x'12), (f11), (i 11 ) y (p11) son independientemente cero o uno. 16.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los enlazadores permanentes se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: 17.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque U y L3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un aminoácido, un derivado de aminoácido, y un péptido. 18.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Ri comprende un óxido de polialquileno lineal, ramificado terminalmente, o de multibrazo. 19 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el óxido de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol y polipropilenglicol. 20. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el óxido de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en: -Y2i-(CH2CH20)n-CH2CH2Y2i-, -Y2r(CH2CH2O)n- C( = Y22)-Y2 y -Y21-(CR5l R52)a2-Y23-(CH2)b2-0-(CH2CH20)n-(CH2)b2-Y23- (CR5 R52)a2-Y2r; en donde: Y2i y Y23 son independientemente O, S, SO, SO2, NR53 o un enlace; Y22 es O, S, o NR53; R51-53 se seleccionan independientemente del grupo para R2; (a2) y (b2) son independientemente cero o un entero positivo; y (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300. 21 . - El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el óxido de polialquileno es un polietilenglicol de la fórmula -O-(CH2CH2O)n-, en donde (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300. 22. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R-? tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton. 23.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Ri tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 60,000 Dalton. 24 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R-? tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 25,000 Dalton, o de aproximadamente 20,000 Dalton a aproximadamente 45,000 Dalton. 25.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en: i44 20 ??? ??? en donde: mPEG tiene la fórmula: CH3-O(CH2CH2O)n-; PEG tiene la fórmula -0(CH2CH20)n-; (n) es un entero positivo de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300; R5 y R52 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C-|.6> alquilo de C3.12 ramificado, cicloalquilo de C3_s, alquilo de Ci-6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de C1.6, heteroalquilo de Ci_6 sustituido, alcoxi de Ci_6, alquiloxicarbonilo de C -6, ariloxicarbonilo, fenoxi y heteroalcoxi de es una porción de dirección, un grupo funcional o un grupo saliente; y D2 es una porción biológicamente activa, un grupo funcional o un grupo saliente. 26 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en: ??? 150 151 i52 i53 i54 i55 ??? ??? ??? 161 i62 i63 i64 LNA es ácido nucleico cerrado; ácido fólico es un residuo de: mPEG tiene la fórmula: CH3-0(CH2CH20)n-; PEG tiene la fórmula -0(CH2CH2O)n-; y (n) es un entero positivo de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300. 27.- Un método de preparación de un conjugado polimérico que contiene un enlazador multifuncional, que comprende: hacer reaccionar un compuesto de fórmula (Illa): M -(L1)a-L2-M2 I Ri A2I (Illa) con un compuesto que contiene una porción biológicamente activa, que tiene la fórmula (lllb): M3 — (L3)b D22 bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto de fórmula (lile): M -(L1 )a-L2-(L3)b D22 I i 1 A22 (lile) en donde es un polímero soluble en agua, sustancialmente no antigénico; A2i es un grupo bloqueador o M - (L1)a-L2-M2 . A22 es un grupo bloqueador o M 1-(L1 )a- L2-(L3)b D22 . Mi es un grupo funcional; D22 es una porción biológicamente activa; M2 es OH o un grupo saliente; M3 es OH, NH2 o SH; L-? es un enlazador permanente o enlazador liberable; L2 es un enlazador multifuncional; L3 es un enlazador permanente o un enlazador liberable; y (a) y (b) son independientemente cero o un entero positivo. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende: hacer reaccionar el compuesto de fórmula (lile): M1-(L1)a- L2- (L3)b D22 I i 1 A22 (lile) con una porción que contiene una porción nucleofilica que tiene la fórmula (llld): D21— M4 ( | M d ) bajo condiciones adecuadas para formar el compuesto de fórmula (lile): en donde: A23 es un grupo bloqueador o D2i-(L1)a-L2— (L3)b— D22 Mi es un grupo funcional; D2i es una porción de dirección; y M4 es OH, NH2, o SH; y todas las otras variables son las mismas que se definen en la reivindicación 27. 29.- El uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar tumores sólidos, linfomas, cáncer de pulmón de célula pequeña, leucemia linfocítica aguda (ALL), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del ovario, cáncer gástrico, enfermedad neoplásica, reducción de la carga de tumor, prevención de metástasis de neoplasmas, y prevención de recurrencias de tumor /crecimientos neoplásicos en un mamífero. 30.- Un método in vitro de administración de polinucleótidos a células de mamífero, que comprende suministrar una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (I) de la reivindicación 1 a una célula que requiere dicho tratamiento.
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