MX2009002412A - Nuevas plantas de rucola con esterilidad masculina citoplasmica. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe las plantas de rucola, que incluyen una planta de E. sativa, con la esterilidad masculina heredada, citoplásmica (CMS) para fines de producción de híbridos. La presente invención incluye plantas que comprenden el citoplasma de CMS proveniente de la coliflor (S. oleracea variedad botrytis) transferida a E. sativa por una cruza interespecífica amplia.

Description

NUEVAS PLANTAS DE RUCOLA CON ESTERILIDAD MASCULINA CITOPLASMICA Antecedentes de la Invención La rucóla es un vegetal tradicional para ensaladas que se origina del área del Mediterráneo, que en años recientes se ha vuelto también muy popular con los consumidores en los Estados Unidos y en la Unión Europea. La rucóla es desarrollada y vendida como hojas y es también llamada ruqueta, roquete, arugula y otros. La rucóla incluye Eruca sativa y un número de especies del género Diplotaxis, E. sativa ("rucóla cultivada") es más rápida para crecer y más tolerante al frío que las especies de Diplotaxis ("rucóla silvestre") y su sabor es más suave y por lo tanto preferible en algunos segmentos del mercado, mientras que las especies de Diplotaxis con su sabor más fuerte y más larga vida en anaquel son preferidos en otros segmentos del mercado. E. sativa y Diplotaxis son ambas un miembro de la familia de las Cruciferae. Los cultivadores de plantas han trabajo para mejorar la composición genética de plantas de E. sativa con miras a crear variedades que sean superiores a las variedades conocidas. Los Ejemplos de mejoramientos deseados son plantas que tienen rendimientos incrementados, resistencia a enfermedades, vida de anaquel, sabor, tolerancia al estrés o prontitud. Ref.:2O0026 Un procedimiento para mejorar esta meta en las cosechas de vegetales ha involucrado la cruza de rasgos genéticos deseables en plantas y luego desarrollándolas a líneas de crianza pura mediante generaciones sucesivas de auto-polinización. Las líneas superiores son luego combinadas para formar un híbrido uniforme Fl que contiene los rasgos genéticos deseables y elimina la depresión endogámica. En los mercados de semillas vegetales todas las cosechas de vegetales principales, excepto la lechuga, son hoy en día dominadas por tales híbridos superiores Fl debido a sus claras ventajas sobre los no híbridos. Sin embargo, no existe sistema de hibridación a bajo costo disponible para la rucóla. Esto restringe en gran medida el potencial para mejorar la rucóla, en particular plantas de E. sativa. Existe por lo tanto una necesidad no cumplida para desarrollos que permitan la producción rutinaria y a bajo costo de los híbridos en rucóla, en particular en E. sativa. Breve Descripción de la Invención La presente invención se dirige a la necesidad no cumplida para los desarrollos que permitan la producción rutinaria y a bajo costo de plantas híbridas en rucóla, en particular en E. sativa. Para cumplir esta necesidad la presente solicitud describe plantas de rucóla estériles macho, en particular plantas estériles macho citoplásmicas (CMS por sus siglas en inglés) de E. sativa. La presente solicitud también describe las semillas y parte de estas plantas, y métodos de producción de tales plantas. Las plantas de rucóla y en particular plantas de E. sativa caracterizadas por CMS no han sido nunca identificadas, y por lo tanto no ha sido posible explotar las oportunidades dadas por la esterilidad masculina en los programas de producción en E. sativa. Sin embargo, la presente invención proporciona plantas de E. sativa estériles, macho, producidas mediante la transferencia de un rasgo de esterilidad masculina de otra especie a E. sativa, a través de una cruza interespecífica amplia, y han obtenido sorprendentemente plantas de E. sativa con crecimiento y características morfológicas comercialmente aceptables. En un aspecto, las flores de una planta de la invención tienen una morfología de E. sativa normal. En otro aspecto más, el grupo de semillas de una planta de la invención está en el intervalo normal (donde el número de semillas/silicua es mayor de 5, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 ó 20; o entre 15-35 en promedio) . En otro aspecto más, la morfología vegetal de una planta de la invención es idéntica a E. sativa (Figuras 8 y 9) . La introgresión del rasgo CMS proveniente de otra especie, hace posible la producción de híbrido en esta cosecha y facilita por lo tanto el mejoramiento eficiente de la cosecha, con el fin de cumplir las necesidades emergentes en el mercado, tales como un rendimiento mejorado y resistencia a enfermedades, y vida en anaquel más prolongada. Esto beneficia a todos los criadores, productores, transportistas, comerciantes y consumidores de los productos de rucóla. En consecuencia, la presente invención, en una modalidad, proporciona una planta de rucóla estéril masculina, e incluye una planta que es Eruca sativa. En una modalidad adicional, dicha planta comprende un citoplasma estéril masculino que confiere esterilidad masculina a la planta. En consecuencia, la planta puede comprender citoplasma estéril masculino proveniente de Brassica olerácea o Brassica napus . Por ejemplo, el citoplasma estéril masculino puede ser transferido desde un donador de citoplasma estéril masculino seleccionado del grupo que consiste de coliflor (variedad botrytis) , coles de Bruselas (variedad gem ifera) , col blanca (variedad capitata) , col corazón de toro (variedad capitata) , col roja (variedad capitata) , repollo de mila (variedad sabauda) , colinabo (convar. acephala DC var . sabellica) , col portuguesa (variedad tronchuda) , berza común rizada (variedad sabellica) , kohlrabi (variedad gongylodes) , brócoli (variedad itálica) , berza china (variedad albiflora) , sarson de burma (variedad chinensis) , breza de cocina (variedad fimbriata) , breza de mil cabezas (variedad fruticosa) , col rizada (variedad sabellíca) y semilla de colsa/canola (23. napus) . En una modalidad adicional, el citoplasma estéril masculino es un citoplasma estéril masculino "Ogura" y la planta de Eruca sativa estéril masculina puede comprender un marcador de ADN orfl38. Una fuente adecuada de citoplasma estéril masculino es proveniente del híbrido Fl de la coliflor "Cheddar". En una modalidad, la planta Eruca sativa estéril masculina es RQ5000/06 [NCIMB No. 41429] o progenie o el ancestro de la línea RQ5000/06, que comprende el citoplasma estéril masculino. La planta de Eruca sativa de la invención puede ser un organismo endogámico o un híbrido. La invención incluye cualquier parte de la planta incluyendo la fruta, la semilla, el polen, el óvulo, el embrión, la hoja, el tallo, la raíz o cualquier combinación de los mismos . La invención proporciona además el uso de un donador de citoplasma estéril masculino "Ogura" para producir una planta estéril masculina de Eruca sativa, incluyendo por ejemplo un donador que es el híbrido Fl de la coliflor "Cheddar" . La invención proporciona además un método para producir una planta de Eruca sativa estéril masculina, que comprende los pasos de: a) cruzar una planta de Brassica olerácea de citoplasma estéril masculino o una planta de Brassica napus de citoplasma estéril masculino, con una planta de Eruca sativa, b) rescatar uno o más embriones que resultan de la cruza del paso a) , c) regenerar una planta a partir de uno o más embriones del paso b) , y seleccionar una o más plantas que tengan el fenotipo de Eruca sativa, d) duplicar el número de cromosomas de la planta del paso c) , y e) retrocruzar una o más plantas resultantes del paso d) , con una planta de Eruca sativa y seleccionar una o más plantas con el fenotipo de Eruca sativa. En una modalidad, este método incluye además la prueba de un marcador de ADN orfl38 durante la selección de una planta, en donde la planta seleccionada comprende un marcador. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir una planta de Eruca sativa estéril masculina, que comprende los pasos de: a. fusionar un protoplasto proveniente de una planta seleccionada de la planta Brassica olerácea de citoplasma estéril masculino, y una planta de Brassica napus de citoplasma estéril masculino y una planta de Eruca sativa de citoplasma estéril masculino, con un protoplasto proveniente de una planta de Eruca sativa, para producir una célula alogénica, b. regenerar la célula alogénica obtenida dentro de una planta de E. sativa estéril masculina citoplásmica, que tiene el citoplasma estéril masculino citoplásmico , c. · polinizar la planta regenerada con el polen proveniente de una planta de Eruca sativa y seleccionar una o más plantas de progenie citoplásmicas estériles masculinas. En una modalidad, este método incluye la prueba de un marcador de ADN orfl38 cuando se selecciona la progenie, mediante el cual una o más plantas de progenie seleccionadas comprende el marcador . Una planta de Eruca sativa CMS obtenible mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos es también abarcada por la presente invención. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para transferir el citoplasma estéril masculino a una planta de Eruca sativa fértil masculina, que comprende los pasos de: a) cruzar una planta de Eruca sativa estéril masculina citoplásmica con una planta de Eruca sativa fértil masculina , b) cosechar una o más semillas producidas por la cruza del paso a) , c) retro-cruzar una planta desarrollada a partir de una o más semillas del paso b) , con la planta de Eruca sativa estéril masculina, y cosechar las semillas producidas por la cruza, d) retro-cruzar una planta desarrollada a partir de una o más semillas cosechadas del paso c) , o las semillas provenientes del paso de retro-cruza subsiguiente, con la planta de Eruca sativa estéril masculina para una o más generaciones de retro-cruza hasta que uno o más genes nucleares provenientes de la planta de E. sativa fértil masculina, son transferidos a una o más de las plantas de progenie de retro-cruza, estériles, masculinas . De acuerdo a una modalidad de este método, la planta de Eruca sativa estéril masculina citoplásmica es RQ5000706 [NCIMB No . 41429] o la progenie de la misma. La invención proporciona además un método para producir una hoja de una planta de rucóla que comprende: a) desarrollar una planta de rucóla CMS de acuerdo a la invención hasta que es producida una hoja; y b) cosechar la hoja. Adicionalmente, la invención proporciona un método para propagar vegetativamente una planta de rucóla, que comprende: a) recolectar un tejido de la planta de rucóla CMS de la invención; b) cultivar el tejido para obtener brotes proliferados ; c) enraizar los brotes proliferados para obtener plántulas enraizadas . Además, la invención proporciona un método para producir la semilla de una planta de rucóla que comprende: a) desarrollar una primera planta de rucóla CMs de acuerdo a la invención; b) polinizar la planta de rucóla con el polen de una segunda planta de rucóla; y c) cosechar las semillas provenientes de la primera planta de rucóla. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Comparación de la morfología de las flores. Izquierda: E. sativa cv. "Myway" ; Centro-izquierda: RQ1400704-1 (coliflor CMS B. olerácea variedad botrytis x E. sativa) Fl; Centro-derecha: RQ1400/04-1, después de la duplicación cromósomica = alotetraploide ; Derecha. Coliflor CMS de B. olerácea variedad botrytis . Las flores de RQ1400/04-1 y su derivado alotetraploide (centro izquierda + derecha) tienen anteras disfuncionales, las cuales fallan en producir polen viable. Figura 2. Comparación de la morfología vegetal. Izquierda: planta BCi (E. sativa x B . olerácea) x E. sativa (No. RQ1438/05-1) . Derecha: E. sativa cv. "Myway". Parece que BCi tiene forma de hoja aserrada de E. sativa pero la planta es más vigorosa y las hojas son más grandes que E. sativa normal. Figura 3. Comparación de las formas de las hojas. Izquierda: hoja de 23. olerácea variedad botrytis cv. "Cheddar". Centro izquierda: Hoja proveniente de la planta BCi de RQ1438/05-1; Centro derecha: hoja de la planta BC2 de RQ 5000/06. Derecha: Hoja de E. sativa variedad "Myway" . Las plantas de BCi y BC2 muestran una forma similar a la rucóla. Figuras 4A-4F. contenido de ADN de material vegetal medido mediante citometría de flujo. El contenido de ADN detectable del material vegetal proveniente de cada uno de (Fig.4A) E. sativa cv. "Myway"; (Fig.4B) Coliflor cv. "Cheddar" y (Fig.4C) RQ1400/04-1 corresponde a un valor de aproximadamente 50 unidades FL, en comparación a un valor de aproximadamente 75 unidades FL en el material vegetal proveniente de RQ1438/05-1 (Fig.4D), indicando que RQ1438/05-1 tiene 3 genomas , por ejemplo es triploide. (Fig.4E) Planta BC2 de RQ 5000/06-3 es diploide, como también se observa en las plantas RQ 5000/06-1, -2 y -4, mientras que la planta RQ 5000/06-5 (Fig.4F) parece tener 3 grupos cromosómicos provenientes de E. sativa y de B. olerácea, eje X (FLl) = unidades de intensidad de fluorescencia y cuenta = cuentas totales . Figuras 5A-5B. Detección del marcador CMS en las líneas CMS de E. sativa progenitora. Los productos de PCR provenientes de la amplificación de los extractos de ADN de las plantas utilizando la combinación de cebadores oligo 37 + oligo 38, se analizan sobre geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. El fragmento de 512 pares de bases indica la presencia de CMS "Ogura" y el fragmento de 630 pares de bases es un control positivo para la presencia del gen cob y un control positivo para la reacción de PCR. Los productos de PCR provenientes del ADN extraído de las muestras de plantas se muestran como sigue: Fig. 5A: Bandas 1, 4b y 5 son provenientes de las muestras de las muestras las coliflores CMS de "Ogura"; bandas 2 y 3b son coliflores que carecen de CMS "Ogura"; bandas 6, 7 y 8b son cultivos de E. sativa fértiles masculinos normales; las bandas 9-16 son diferentes plantas de CMS-E. sativa alodiploides , y banda 4b es la variedad "Cheddar" del donador de CMS utilizado para generar las plantas CMS-E. sativa en las bandas 9-16. La banda M comprende los marcadores de tamaño de ADN. Fig. 5B: Babda 0188-3659; planta BCi RQ 1438/05-1, Bandas 0188-3660 a 0188-3664; plantas BC2 de RQ 5000/06, 1, 2, 3, 4, 5, respectivamente, banda 0188-3665; E. sativa variedad "Myway" . Banda de 100 pares de bases comprende una escalera de ADN de 400 a 1000 pares de bases como marcador de tamaño . Figura 6. Estructura de la flor de "Ogura" fértil normal y fértil masculina. Derecha. Anteras normales de E. sativa con polen. Izquierda: Anteras provenientes de la planta CMS+E. sativa sin polen. Figura 7. Imagen magnificada de la estructura de la antera de "Ogura" fértil normal y estéril masculina. Izquierda: Antera de E. sativa fértil normal con polen. Derecha: Antera C S-E. sativa. Figura 8: Izquierda: Flor normal de E. sativa. Derecha: flor CMS-S. sativa (Linea 5000/06). Las anteras son encogidas y delgadas, por ejemplo no llevan polen. Figura 9. Comparación de la morfología de planta.

Izquierda: planta BC3 de CMS-£. sativa. Derecha: E. sativa variedad "Myway" . Se observa que las plantas son casi idénticas . Figura 10. Secuencia de nucleótidos de "orfl38" . La secuencia de nucleótidos (2427 nucleótidos) del gen "orfl38" correspondientes al ADN mitocondrial híbrido de Brasita sp., ORF158, ORF138 y tR A-fMet; ACCESO Z12626. La detección por PCR del marcador de ADN "orfl38" emplea un cebador superior (Oligo 37) y un cebador inferior (oligo 38) que amplifican una secuencia de ADN correspondiente a los nucleótido 937 al 1449 de la secuencia mostrada (puesto de manifiesto en gris) . La posición de recocido de los cebadores en la secuencia nucleotídica es indicada por el subrayado. La amplificación por PCR con el oligo 37 y 38 produce un producto de ADN de 512 pares de bases.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones : Aglutinación: La formación de grumos o grupos de células . Alogénico: Genéticamente diferente. Aloplásmico: Organismo que contiene citoplasma (incluyendo mitocondrias y cloroplastos ) proveniente de una especie y el núcleo de otra especie. Alotetraploide : Tetraploide producido a partir de un híbrido entre dos o más especies diferentes, y que posee por lo tanto dos o más grupos diferentes de cromosomas. Anfidiploide : Diploide producido a partir de un híbrido entre dos especies diferentes y que posee por lo tanto dos grupos diferentes de cromosomas. BC : Retro Cruza. La técnica de crianza clásica que puede ser utilizada para introducir el citoplasma (o los genes) proveniente de un donador dentro de un antecedente genético homólogo llamado el progenitor recurrente (RP) . El donador femenino es cruzado una vez con el RP, con lo cual es creado un híbrido Fl . El híbrido Fl es luego cruzado con el RP dando la generación BCi . BCi es cruzada con RP, etc. Esto es repetido varias veces. Con esto, la línea genética homologa es recreada dentro del citoplasma proveniente del donador . Tallo: Masa de células no diferenciadas que inicialmente surge de la célula vegetal o del tejido vegetal en cultivo artificial. CMS: Una forma de esterilidad masculina en plantas, determinada por factores citoplásmicos , usualmente el ADN mitocondrial . Citoplasma de CMS: Citoplasma que contiene factores determinantes de la esterilidad masculina. Citoplasma: Toda la parte viviente de una célula dentro de la membrana celular y excluyendo el núcleo. Locus citoplásmico "orfl38": Un marcador específico (proveniente de INRA) para la esterilidad masculina "Ogura" . La combinación de cebadores que amplifican este marcador, tienen las secuencias : Oligo37: GCA TCA CTC TCC CTG TCG TTA TCG Oligo38: ATT ATT TTC TCG GTC CAT TTT CCA El producto de amplificación esperado es de 512 pares de bases. La secuencia del gen orfl38 está disponible en bases de datos públicas (NCBI) en el No. de Acceso Z12626.

Endonucleasa : Enzima nucleasa que divide el ADN en sitios internos. Mediante el uso de tales enzimas sobre el ADN, es obtenido un cierto patrón único de digestión. Este patrón puede ser utilizado para distinguir los organismos genéticamente diferentes. Fenotipo de Eruca sativa: Es un fenotipo caracterizado por una gama de características que distinguen el hábito de crecimiento morfológico de las plantas de Eruca sativa, incluyendo la forma y el tamaño de las hojas, la frecuencia de ramificación del tallo, la altura de la planta y el volumen-flor-forma y tamaño como se ilustran en las figuras. La selección de una planta con fenotipo de Eruca sativa puede incluir de este modo la selección de una planta que comprende una o más de estas características morfológicas distintivas . Híbrido Fl : Semillas o plantas que se originan de una cruza entre dos líneas progenitoras endogámicas. Fl denota Ia generación filial. Células alimentadoras : Las células utilizadas por ejemplo en el cultivo de protoplastos, con el fin de soportar el desarrollo de los protoplastos frágiles. Gameto: Célula reproductiva haploide producida al reproducir sexualmente los organismos, que se fusiona con otro gameto del sexo o tipo de apareamiento opuesto, para producir un cigoto. Citometría de flujo: Técnica para contar las células y distinguir diferentes tipos de células en una población mixta. Las células son usualmente teñidas con diferentes anticuerpos fluorescentes para distinguir las moléculas de la superficie celular y una corriente de células marcadas es luego corrida a través de un detector de fluorescencia, el cual cuenta las células de cada tipo. El método puede ser también utilizado para determinar la cantidad de ADN en las células y con esto dar una indicación del nivel de ploidía. Heterocarión : Una célula que contiene dos (o más) núcleos genéticamente diferentes, formados de manera natural o artificial en cultivo mediante la fusión de las dos células animales o los protoplastos vegetales. Endogámico (a) : Línea producida mediante auto-polinizaciones sucesivas. Híbridos interespecíficos: Híbridos elaborados a partir de una cruza entre dos especies diferentes. Introgresión : Transferencia gradual de un gen de una línea a otra, por ejemplo, mediante retro-cruza. Línea vegetal mantenedora: La línea vegetal fértil masculina utilizada como polinizador para la multiplicación de las semillas de una línea CMS específica. El citoplasma de la línea mantenedora es fértil masculino, pero los cromosomas nucleares son idénticos a los cromosomas nucleares de la línea CMS específica. Fértil masculino: Organismo o planta capaz de producir gametos masculinos viables. Estéril masculino: Organismo o planta incapaz de producir gametos masculinos viables. Estéril masculino parcial significa que la cantidad de polen viable es insignificante con respecto al potencial para la producción comercial de semillas híbridas a partir de una línea femenina dada . Apareamiento meiótico: Etapa en la meiosis (el proceso que produce gametos) , donde los cromosomas homólogos son alineados sobre el ecuador de la célula con todos los centrómeros que yacen a lo largo del ecuador del husillo. MES: Ácido 2- (N-morfolino) etansulfónico . Micro callos: Piezas muy pequeñas de callo. Micro-manipulación: Técnica común utilizada para manejar y clasificar células simples. Marcador de micro-satélite: Ver marcador de SSR. Mitocondrias : Organelos en el citoplasma de las células eucarióticas , que tienen una doble membrana, la interna invaginada, y que son el sitio del ciclo de los ácidos tricarboxílieos y la fosforilación oxidativa de la respiración oxidativa, generando ATP. Éstas contienen un ADN circular pequeño que especifica los tARNs, rAR s y algunas proteínas mitocondriales . n: Número de cromosomas haploides . Núcleo: Un organelo denso grande limitado por una doble membrana, presente en las células eucarióticas, y el cual contiene la cromatina y en el cual tiene lugar la replicacion y la transcripción del ADN. NCIMB: Nacional Collection of Industrial Bacteria. La colección también acepta semillas.

CMS Ogura: El término citoplasma de CMS Ogura como se utiliza en la presente, se refiere al citoplasma que se origina de Raphanus sativus que comprende ADN mitocondrial que confiere esterilidad masculina a las plantas. El término planta o célula vegetal de Brassica olerácea CMS Ogura, como se utiliza en la presente, se refiere a una planta o célula vegetal de Brassica olerácea que comprende el citoplasma CMS Ogura . Osmolaridad: La concentración osmótica de una solución. Osmoticum: Compuesto utilizado para incrementar la concentración osmótica de una solución. Óvulo: En las plantas de semilla, la estructura consiste del megagametofito y megaspora, rodeado por el núcleo y encerrado en un integumento, y que se desarrolla en una semilla después de la fertilización. PCR: Reacción en Cadena de Polimerasa. Técnica común utilizada para amplificar regiones o fragmentos específicos del ADN. Cebador: Fragmento de ADN específico corto, en la PCR, un par de oligonucleótidos sintéticos (cebadores) complementarios a las regiones flanqueantes del ADN que va a ser copiado, que son unidos al ADN antes de que comience la reacción, para asegurar que la replicación del ADN sea iniciada en los puntos requeridos.

Nivel de ploidía: Número de cromosomas o moléculas de ADN en una célula u organelo, o el número típico de cromosomas de un organismo multicelular. Protoplasto: Célula vegetal con pared celular removida; el componente viviente de una célula, por ejemplo el protoplasma que no incluye cualquier pared celular. Marcador de SSR: Repetición de Secuencia Simple. Ciertas áreas del genoma que contienen secuencias simples repetidas, por ejemplo, ATT n veces. Se sabe que estas repeticiones tienen un alto grado de polimorfismo y son por lo tanto útiles como marcadores de ADN. Triploide: Un organismo con tres grupos de cromosomas por célula somática. El explotar las oportunidades de híbridos en rucóla podría incrementar significativamente la eficiencia de la producción de rucóla, ya que la depresión endogámica de un número de rasgos podría entonces ser eliminada. Un método para producir híbridos confía en la esterilidad masculina en la línea de producción para la cual es deseada la hibridación. Las líneas estériles masculinas permiten que el criador produzca semillas híbridas mediante el control de la fertilización cruzada en las flores de la línea de producción (por ejemplo la línea madre) . La fertilización cruzada es asegurada y la auto-fertilización es eliminada mediante el uso de producción de plantas de línea que son estériles masculinas debido a su falla para producir polen viable. 100% de hibridación de la línea de producción estéril masculina con la línea padre deseada, puede ser entonces obtenida. Varias fuentes de CMS pueden ser utilizadas en el contexto de la presente invención, por ejemplo: citoplasma estéril masculino "Ogura" de Raphanus sativus) ; citoplasma estéril masculino de "Polima" de B. napus, y citoplasma estéril masculino "Nap" de B. napus y citoplasma estéril masculino "Anand" de Brassica toumefortii (Cardi T. & E.D. Earle, 1997) . Las plantas que poseen CMS pueden volverse fértiles masculinas nuevamente, o fértiles masculinas parcialmente, en presencia de ciertos genes nucleares. Estos genes nucleares son llamados "genes restauradores" debido a que éstos contraatacan el efecto del citoplasma CMS. La fertilidad masculina puede ser restaurada en el híbrido Fl mediante cruza con una línea polinizadora que posee genes restauradores . Las cruzas entre diferentes especies de Cruelferae podrían facilitar la transferencia de genes deseables, tales como la esterilidad masculina citoplásmica , entre especies. No obstante, la producción de híbridos interespecíficos es en general impredecible y a menudo extremadamente difícil de lograr debido a la necesidad para superar las barreras genéticas naturales que existen entre especies. Otra manera más de producir los híbridos interespecíficos, que comprenden los genes citoplásmicos provenientes de una especie y los genes nucleares provenientes de otra, es mediante la fusión de protoplastos. Aquí, un protoplasto proveniente de una especie que tiene rasgos deseables es combinado con un protoplasto proveniente de una planta de CMS proveniente de otra especie. El material nuclear del donador de CMS es removido, o inactivado, antes de la fusión, de modo que éste dona únicamente el citoplasma. El híbrido citoplásmico resultante o "cíbrido" es luego regenerado en una planta. Esta planta poseerá los genes nucleares para los rasgos deseables y será estéril masculino. Este procedimiento es tan impredecible para la generación de híbridos interespecíficos como el método de cruza descrito anteriormente. La barrera para obtener un híbrido interespecífico verdadero puede ser ya sea provocada por la incapacidad de los tubos de polen ajenos a penetrar al tejido ovárico del aceptor del polen, o ser provocado por eliminación de todos los cromosomas de uno de los progenitores, típicamente el padre. En una cruza entre E. sativa y B. olerácea, Yadav et al. 2002 mostraron que E. sativa no funcionó como un aceptor de polen. En la cruza recíproca, la fertilización limitada ocurrió, y únicamente pocos tubos de polen fueron observados en el tejido ovárico de B. olerácea después de 24 horas de polinización. Sundberg & Glimelius, 1991 mostraron que en una cruza entre B. napus y E. sativa, los cromosomas del genoma de E. sativa parecieron ser preferentemente clasificados. Un mecanismo similar fue observado en las cruzas iniciales de B. olerácea x E. sativa realizadas para esta invención, en las cuales únicamente unas pocas plantas, derivadas de las semillas rescatadas por embrión, se asemejaron fenotípicamente a los híbridos interespecíficos verdaderos entre E. sativa y B. olerácea . El resto de las plantas fueron fenotípicamente similares a la línea femenina de B. olerácea. La producción de plantas de rucóla CMS (por ejemplo CMS E. sativa) de acuerdo a la presente invención ha sido de este modo sorprendentemente lograda como se detalla más adelante. Las semillas de la línea RQ5000/06, una planta representante de acuerdo a la presente invención, han sido depositadas con NCIMB ltd., Bucksburn, Aberdeen, AB21 gYA, el 14 de agosto del 2006 bajo el número de acceso NCIMB 41429. I. Programa de Cruza para la producción de E. sativa CMS La presente invención describe las plantas de rucóla (por ejemplo plantas de E. sativa) con CMS, introgresadas a partir de B. olerácea. E. sativa misma, no puede ser utilizada como un donador de CMS para obtener un híbrido de rucóla CMS, debido a que el rasgo CMS nunca ha sido reportado en estas plantas . La hibridación interespecifica es realizada mediante la cruza de un donador de CMS como la madre, tal como coliflor (variedad botrytis) , coles de Bruselas (variedad gemmifera) , col blanca (variedad capitata) , col corazón de toro (variedad capitata) , col roja (variedad capitata) , repollo de mila (variedad sabauda) , colinabo (convar. acephala DC var . sabellica) , col portuguesa (variedad tronchuda) , berza común rizada (variedad sabellica) , kohlrabi (variedad gongylodes) , brócoli (variedad itálica) , berza china (variedad albiflora) , sarson de burma (variedad chinensis) , breza de cocina (variedad fimbriata) , breza de mil cabezas (variedad fruticosa) , col rizada (variedad sabellica) y semilla de colsa/canola (B. napus) , y E. sativa como el padre. Cuando el CMS es introgresado a partir de una coliflor (B. olerácea variedad botrytis) donadora, ésta proporciona morfología favorable de la flor. Ya que la coliflor (n = 9) tiene un genoma diploide de 18 cromosomas y E. sativa (n = 11) tiene un genoma diploide de 22 cromosomas, éstas no son sexualmente compatibles. En el desarrollo de las semillas esta incompatibilidad puede dar como resultado la degradación incompleta del endosperma necesaria para apoyar la maduración del embrión, y la pérdida de los cromosomas proveniente del polinizador. El desarrollo y la supervivencia de los embriones producidos por la cruza puede no obstante ser asegurada mediante el empleo de la técnica de "rescate de embrión" . El rescate de embrión involucra la remoción del embrión de la silicua producido mediante la cruza, aproximadamente 3 semanas después de la polinización, la sincronización exacta del rescate del embrión, dependiendo del tiempo del año y de las líneas progenitoras en la cruza. Las silicuas son previamente tratadas con un desinfectante y luego enjuagadas en agua estéril para eliminar la contaminación microbiana. Las silicuas son luego cortadas por apertura y los embriones son removidos y colocados en un medio adecuado para facilitar el crecimiento, como por ejemplo MS (medio Murashige & Skook) detallado en la Tabla 1. Los embriones son luego desarrollados aproximadamente a 25°C en un régimen de oscuridad/luz hasta que éstos han germinado y desarrollado raíces, después de lo cual éstos son transferidos al suelo y desarrollados bajo un régimen de día/noche de aproximadamente 20°C en la noche y 22-25°C en el día . Las plantas Fl regeneradas son desarrolladas hasta la madurez, y aquellas que producen flores con anteras disfuncionales que carecen de polen, se espera que lleven el rasgo CMS. Las plantas Fl que tienen el rasgo CMS y muestran rasgos deseados conferidos por el progenitor paterno pueden ser identificadas por sus propiedades fenotípicas . Las propiedades de crecimiento y la morfología que pueden ser seleccionadas para incluir el crecimiento vigoroso, la vida en anaquel (espesor incrementado de la hoja y cera superficial), sabor (amargura), resistencia a las enfermedades, contenido de materia seca, bajo contenido de nitrato) . A manera de ejemplo, una cruza entre B. olerácea CMS y E. sativa produjo una planta Fl (planta No. RQ1400/04-1), cuyo crecimiento fue más vigoroso que una rucóla normal, pero su volumen fue más pequeño que una coliflor. Las hojas fueron aserradas como el tipo progenitor de E. sativa durante el crecimiento completo. Las flores de la planta llevaron claramente rasgos CMS, produciendo anteras disfuncionales sin el polen, pero teniendo de otro modo un tipo de flor crucifera fenotípicamente normal (Figura 1, segunda desde la izquierda) cuando se comparan las flores de las dos líneas progenitoras de la cruza (Figura 1, izquierda y derecha) . A pesar de conducir un número muy grande de cruzas entre la planta RQ1400/04-1 y polinizadores de E. sativa, a todo lo largo del periodo de floración completo, no fueron obtenidas semillas o incluso embriones. El complemento cromosómico de las plantas Fl híbridas generadas a partir de una cruza entre un donador CMS B . olerácea y una variedad de E. sativa, puede ser determinado mediante la extracción de los núcleos a partir del material de planta híbrida y midiendo la cantidad de ADN mediante citometría de flujo. Los diferentes protocolos para el aislamiento de los núcleos y preparación de suspensiones de núcleos teñidos para la citometría de flujo, pueden ser utilizados, como es ejemplificado en el Ejemplo 1. Como se muestra en el Ejemplo 1, el contenido de ADN de RQ1400/04-1 fue consistente con una planta anfihaploide , teniendo un grupo de 9 cromosomas de la coliflor y 1 de 11 de E. sativa (Figuras 4A-4F) . Tales plantas pueden ser propagadas vegetativamente, y los clones mantenidos in vivo, no obstante éstas pueden ser encontradas no fértiles cuando son cruzadas a otros polinizadores de E. sativa. Si el complemento cromosomico de una planta híbrida Fl comprende un grupo de cromosomas de coliflor y un grupo de cromosomas de E. sativa, como es el caso para RQ1400/04-1, entonces es probable que la planta sea infértil debido a una capacidad para conducir el apareamiento meiotico normal y formar gametos fértiles, como es requerido para la formación subsiguiente de la progenie. En este caso, es deseable duplicar el complemento cromosomico de la planta híbrida Fl para generar una planta con 2 grupos de cromosomas de coliflor y 2 grupos de cromosomas de E. sativa. Tales plantas duplicadas cromosómicamente son capaces de sufrir meiosis ya que los 2 grupos de cromosomas pueden realizar el apareamiento cromosomico internamente, y las plantas son de este modo fértiles. Una estrategia de duplicación cromosómica, que emplea el tratamiento con colchicina, fue exitosamente empleada para generar un derivado fértil de los clones vegetativos de las plantas RQ1400/04-1 (Ejemplo ID) . Las plántulas de las plantas híbridas Fl de CMS que han sufrido duplicación cromosómica exitosa, son reconocidas por su fenotipo distintivo, incluyendo el crecimiento vigoroso de los tallos y las hojas, y las flores de hasta el doble de su tamaño normal, conservando mientras su fenotipo CMS con anteras rudimentarias desprovistas de polen. Durante el periodo de floración, estas plantas tratadas con colchicina pueden ser retro-cruzadas con cultivos de E. sativa para producir semillas viables. Las plantas de progenie son seleccionadas para el rasgo CMS y para la herencia de los rasgos de E. sativa deseados, incluyendo por ejemplo el hábito de la hoja aserrada, la morfología de la flor de E. sativa, el crecimiento vigoroso, la fertilidad, alta producción de semillas, vida en anaquel (espesor incrementado y cera superficial), sabor (amargura), resistencia a la enfermedad, contenido de materia seca, bajo contenido de nitrato. El complemento cromosómico de una retro-cruza híbrida seleccionada puede ser determinado mediante la extracción de los grupos a partir de una muestra del material vegetal híbrido y citometría de flujo. La progenie retro-cruzada seleccionada (BCi) puede, por ejemplo, ser encontrada como triploide con un complemento cromosomico consistente con un grupo de cromosomas de coliflor (n = 9) y 2 grupos de cromosomas de E. sativa (n = 11) dando un total de 31 cromosomas como es observada para las líneas BC1 derivadas de las plantas RQ1400/04-1 (Ejemplo ID) . El análisis de marcador de ADN, puede ser empleado para demostrar la presencia del CMS de "Ogura" en la progenie BC>i, como es ilustrado utilizando el marcador "orfl38" en el Ejemplo 13 de la Figura 5A. La generación BCi seleccionada puede tener una fertilidad reducida y puede no tener todos los rasgos deseados provenientes del progenitor de E. sativa, en cuyo caso puede ser llevado a cabo un programa de retro-cruza entre la planta BCi seleccionada y la línea progenitora de E. sativa deseada. Como es ilustrado en el Ejemplo 1, la retro-cruza de la planta BCi triploide RQ1438/05-1 para E. sativa variedad "Myway" generó un número de plantas BC2, cuya morfología se asemejó estrechamente a E. sativa, así como también retuvo la esterilidad masculina. El análisis de citometría de flujo indicó que estas plantas BC2 se habían revertido al complemento cromosomico diploide. Por lo tanto, un programa de retro-cruza comenzando a partir de las plantas BCi seleccionadas puede generar líneas de plantas que producen números similares de semillas como su progenitor recurrente E. sativa, y producen hojas compatibles con la producción de hojas comerciales, como es ilustrado para la planta BC2 RQ1438/0B-1 en el Ejemplo 1 y en la Figura 9. La cantidad de ADN de B. olerácea todavía presente en las plantas BC>i generada a partir de la retro-cruza, puede ser determinada por análisis del marcador de ADN, por ejemplo mediante el uso de 72 marcadores SSR que cubren el genoma C completo de B . napus . En el Ejemplo 14, las plantas BC3 de CMS mostraron que tienen una alta homología a E. sativa, y que todos los cromosomas de B. olerácea han sido eliminados en el proceso de retro-cruza. II Programa de fusión de protoplastos Plantas de E. sativa de CMS pueden también ser preparadas mediante la fusión de protoplastos. Los protoplastos pueden ser obtenidos a partir de una planta de B. olerácea o B. napus que contiene el citoplasma CMS de "Ogura" y es estéril masculina, y plantas de E. sativa con rasgos agronómicos deseables. Las plantas donadoras de CMS adecuadas incluyen plantas de B . olerácea por ejemplo coliflor variedad "Cheddar" u otras variedades de B. olerácea o B. napus con CMS. Los protoplastos pueden ser obtenidos a partir de material de la planta verde, por ejemplo material de hoja y a partir del material de planta blanca por ejemplo plántulas etioladas, de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 2 (Glimelius (1984), Physiologia Plantarum 61:38). Cuando los protoplastos son aislados a partir del material vegetal blanco es ventajoso teñirlo con un colorante fluorescente para facilitar la selección del mejor material, ver Ejemplo 2C. Después del aislamiento de los protoplastos el núcleo en el protoplasto que contiene CMS debe ser inactivado mediante irradiación . La inactivación del núcleo mediante irradiación puede ser efectuada con la ayuda de rayos gamma, UV o X. Donde la irradiación es efectuada con una fuente de rayos X, la inactivación del núcleo será en general obtenida mediante la aplicación de una dosis por ejemplo de 10 krad por minuto por 3 a 20 minutos. La dosis de rayos X apropiada puede ser por ejemplo establecida mediante la determinación del nivel máximo de irradiación con rayos X que mata 100% de la población de protoplastos; el porcentaje de células muertas es estimado mediante el conteo del número de colonias formadas después de 10 a 20 días en cultivo. Con base en el nivel óptimo de la irradiación con rayos X requerida, la fusión de protoplastos es realizada con un protoplasto de CMS irradiado (con el núcleo inactivado) y el protoplasto de E. sativa . La fusión de los protoplastos aislados puede ser luego lograda mediante el empleo de polietilenglicol (PEG) el cual provoca la aglutinación, en presencia de un amortiguador de fusión de alto pH, el cual promueve la fusión membranal entre los protoplatos . La hibridación somática puede ser realizada bajo las condiciones descritas en Sundberg et al., (Plant Science, 1986, 43: 155), incorporada por referencia en la presente, para la producción de híbridos interespecíficos o modificaciones de los mismos. No obstante, una persona experta en la materia podría reconocer que la fusión de protoplastos puede ser llevada a cabo por medio de un uso diferente al del polietilenglicol (PEG) . Por ejemplo, los protoplastos pueden ser fusionados mediante el uso de técnicas de fusión inducidas por campo eléctrico como se describe por Koop et al. en Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, edited: Neuman et al. pgs 355-365 (1989), incorporada por referencia en la presente. Además, la fusión de protoplastos puede ser llevada a cabo con dextrano y alcohol poliviní lico , como se describe por Hauptmann et al., "Carrot x Tobacco Somatic Cell Hybrids Selected by Amino Acid Analog Resistance Complementation " , 6o Simposio Internacional sobre Protoplastos, Basilea, Agosto 12-16, 1983, incorporada por referencia en la presente. Si la fusión de protoplastos va a ser llevada a cabo con polietilenglicol, el procedimiento descrito más adelante puede ser utilizado. La fusión de protoplastos es convenientemente efectuada en una solución de lavado (W5'), descrita más adelante, que contiene un osmoticum por ejemplo un carbohidrato tal como manitol, sorbitol, glucosa o sucrosa, y sales de potasio y de calcio. El pH puede estar en el intervalo de 5.2 a 10 y es preferentemente de aproximadamente 5.7. Los protoplastos de diferente origen son mezclados y concentrados, convenientemente hasta una densidad final de lxlO5 y lxlO8 protoplastos por mi. La mezcla de protoplastos debe ser luego dejada sin perturbar en un recipiente (por ejemplo caja de petri) por al menos 10 minutos para permitir que los protoplastos se sedimenten hacia el fondo del recipiente. La mezcla es luego tratada con pol i et i 1 engl i col (PEG), preferentemente teniendo un peso molecular de 1500 a 6000. En general, son obtenidos buenos resultados cuando se emplea una solución acuosa (PFS) que comprende 18.8% en peso de PEG a una proporción volumétrica de W5 ' de PFS de 10:1 a 1:1. PFS comprende convenientemente un osmoticum y una sal de calcio. Los protoplastos son incubados en PFS por 15 a 20 minutos dependiendo de la fragilidad de las células . La fusión es llevada a cabo mediante lavado de los protoplastos, por ejemplo, tres veces, con solución de lavado (W5') que contiene un osmoticum (por ejemplo glucosa) en una concentración que tiene una osmolaridad menor que PFS y sales de potasio, sodio y calcio. El procedimiento de fusión es llevado a cabo a una temperatura en el intervalo de 16°C y 20°C, por ejemplo 18°C. La concentración de PEG en la mezcla de fusión es gradualmente disminuida con cada paso de lavado consecutivo (ver por ejemplo, Ejemplo 10) . Cada paso de lavado debe tomar al menos 5 minutos para permitir que los protoplastos se ajusten lentamente a la menor osmoralidad del medio, y evitar el estallido de los protoplastos. Después de que los pasos de lavado han sido llevados a cabo, los protoplastos fusionados deben estar en el intervalo de lxlO5 a lxlO6 protoplastos por mi. Los híbridos pueden ser luego regenerados en presencia de protoplastos progenitores no fusionados, o después de su aislamiento a partir del medio de cultivo mediante selección. La selección de los híbridos a partir de los protoplastos no fusionados puede ser realizada mediante la tinción y separación por un micromanipulador o mediante citometría de flujo que contiene una función de clasificación de células . Si los protoplastos son teñidos con diacetato de f luoresceína , el protoplasto de origen de hipocotilo se teñirán de amarillo bajo una luz UV y el protoplasto proveniente de las hojas que contienen cloroplastos dará una auto- fluorescencia roja bajo luz UV Sunderberg and Glemelius. 1986, Plant Science 43:155-162; Glimelius et al., 1986, Plant science 45:133-141). Los productos de fusión obtenidos pueden ser cultivados en un medio de cultivo apropiado que comprende un suministro de nutrientes bien balanceado para el crecimiento de los protoplas tos . El medio contiene micro- y macro-elementos , vitaminas, aminoácidos y pequeñas cantidades de carbohidratos, por ejemplo diversos azúcares tales como glucosa. La glucosa sirve como una fuente de carbono así como un osmoticum. El medio de cultivo también comprende hormonas vegetales (auxinas y citocininas) que son capaces de regular la división celular y la regeneración de los brotes. Los ejemplos de auxinas adecuadas incluyen ácido naf tilacetico (NAA) , ácido 2 , 4-diclorof enoxiacético (2,4-D) y ácido indolacético (IAA) . Los ejemplos de citocininas adecuadas incluyen benc i 1 - aminopi rina (BAP), zeatina (Zea) y ácido giberélico (GA3) . En general se utilizan NAA y 2,4-D en combinación con BAP para iniciar la división celular, en cuyo caso la proporción de auxina/citocinina debe ser alta, por ejemplo mayor de 1. Dos o tres días después del tratamiento de fusión, el medio es reemplazado en su mayoría por el medio de cultivo (BP) el cual comprende agarosa, en el cual están incrustados los productos de fusión y los protoplastos progenitores. Después de 14 días, la concentración de las auxinas es diluida por la adición de un medio de cultivo que no contiene o que contiene sustancialmente menos auxinas. Los micro-callos en forma de estrella se desarrollarán en general después de 3 a 4 semanas. Tales micro-callos son luego transferidos a un medio de regeneración para iniciar la formación de los brotes, preferentemente después de la adaptación en un medio de regeneración intermediario para permitir que las células se ajusten a las diferencias en la composición y las propiedades físicas del medio de cultivo y el medio de regeneración. Con el fin de inducir la formación de brotes, la proporción de auxina/citocinina en el medio de regeneración debe ser preferentemente bajo, por ejemplo por debajo de 1:10. En general, será preferible emplear la auxina NAA en combinación con las citocininas Zea y BAP para la regeneración de los brotes. El contenido de nutrientes de los medios de regeneración, BR y K3 , es relativamente comparado a aquel del medio de cultivo, ya que éstos contienen menos vitaminas, un menor contenido de la fuente de carbono que comprende únicamente sucrosa y xilosa, y no contienen aminoácidos. Los medios de regeneración tienen también una viscosidad mayor que el medio de cultivo. El medio de regeneración Br es un medio sólido y contiene los reguladores del crecimiento 2,4-D, NAA y BAP, con la proporción de auxina a citocinina que es menor de 1. El medio K3 contiene Zea, GA3 y también nitrato de plata para promover el desarrollo de los brotes. Después de dos semanas de regeneración sobre el medio Br, los callos de aproximadamente 3 mm de diámetro son transferidos al medio de regeneración K3 que contiene una baja concentración de sucrosa. En esta etapa, los brotes se desarrollarán dentro de 2 a 3 semanas. Los brotes obtenidos son luego enraizados sobre un medio básico, tal como B5, sin hormonas adicionales. El ADN nuclear y el ADN mitocondrial de las plántulas obtenidas puede ser luego identificado mediante métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo empleando endonucleasas de restricción adecuadas y comparando el patrón de digestión de ADN obtenido, del ADN proveniente de los productos de fusión con aquel de las líneas progenitoras. Como se describió anteriormente, después de la fusión, las células híbridas son regeneradas para formar plantas de E . sativa que contienen el citoplasma de CMS. Estas plantas pueden ser subsecuentemente retro-cruzadas con otras plantas de E. sativa. Se apreciará que la planta de E. sativa de esta invención puede ser empleada como el material inicial para la preparación de otras variedades de E. sativa que tienen CMS mediante técnicas in vitro y/o de cruzamiento. Tales técnicas in vitro y de cruzamiento son conocidas en la materia por el productor experto . EJEMPLO 1. E. sativa CMS generada mediante un programa de cruza Se llevó a cabo una hibridación interespecífica utilizando un híbrido de coliflor anaranjada Fl "Cheddar" (Seminis vegetable Seeds) como la madre, y E. sativa variedad "Myway" (L. Daehnfeldt A/S) como el padre. Numerosas cruzas interespecíficas fueron realizadas, de las cuales fueron regeneradas un total de 10 plantas Fl mediante el empleo del siguiente procedimiento de rescate de embriones. A. Rescate de embriones Aproximadamente 3 semanas después de la polinización cruzada, las silicuas fueron cosechadas de la planta progenitora polinizada. Las silicuas fueron desinfectadas por 20 minutos en una solución de corsolina al 2.5% y enjuagadas tres veces en agua estéril. Las silicuas fueron luego cortadas en una dirección longitudinal y los embriones removidos y sembrados en placas sobre el medio MS (Tabla 1), con 3% de sucrosa y sin hormonas, en un recipiente de plástico. Los embriones fueron luego desarrollados a 25°C en 16 horas de luz por al menos dos semanas. Cuando los embriones habían germinado en plantas y habían desarrollado raíces éstos fueron subcultivados sobre turba, cubiertos con plástico blanco, y desarrollados por 5 a 7 días en un invernadero bajo un régimen de 20°C en la noche y 22-25°C en el día. Tabla 1. Composición del crecimiento de los embriones y de los medios de regeneración (1 litro) MS MAC 8P Br K3 B5 CaCI202H2O 440 mg 600 mg 600 mg 300 mg 300 mg 150 mg CoCI2'6H20 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg CuScv5H20 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg 0.025 mg FeNa EDTA 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg H3BO3 6.20 mg 3 mg 3 mg 3 mg 3 mg 3 mg KH2P04 170 mg 164 mg 164 mg Kl 0.83 mg 0.75 mg 0.75 mg 0.75 mg 0.75 mg 0.75 mg KNO3 1900 mg 956 mg 956 mg 1556 mg 1556 mg 3000 mg MgSCy7H20 370 mg 300 mg 300 mg 250 mg 250 mg 250 mg nS04:4H20 22.3 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg Na2MoCv2H20 0.25 mg 0.25 mg 0.25 mg 0.25 mg 0.25 mg 0.25 mg NH4NO3 1650 mg 600 mg 600 mg 250 mg 250 mg ZnSCy7H20 8.6 mg 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg io-inositol 100 mg 100 mg Tiamina 0.10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg Piridoxina 0.5 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg Ácido nicotínico 0.5 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg Glicina 2 mg Sodio 20 mg 20 mg Piruvato-ácido 40 mg 40 mg cítrico Ácido maleico Ácido fumárico 40 mg 40 mg Glucosa 40 mg 40 mg Caseína 250 mg 250 mg NAA 0.1 mg 0.1 mg 0.1 mg 2,4D 0.2 mg 1 mg 0.1 mg Zeatina 0.26 mg BAP 0.5 mg 0.5 mg 0.5 mg GA3 0.006 mg AgNOa 5 mg Xilosa 250 mg Sucrosa 30 g 80 g 50 g 40 g 10 g 20 g Agar 8 g 8 g 8 g Agarosa 16 g B. Propiedades fenotípicas de las plantas híbridas Fl A partir de 10 plantas regeneradas Fl obtenidas a partir de la cruza interespecífica, cinco mostraron claramente un fenotipo de coliflor, mientras que las otras cinco mostraron claramente el fenotipo de hoja aserrada de E. sativa. Únicamente una de estas últimas plantas sobrevivió a la etapa sexual (Planta No. RQ1400/04-1) . Durante el crecimiento completo, el fenotipo de esta planta simple se asemejó estrechamente a una cruza entre E. sativa y la coliflor. Ésta fue más vigorosa que una rucóla normal, pero el volumen de la planta fue más pequeño que una coliflor. Las hojas fueron aserradas como el tipo progenitor de E. sativa durante el crecimiento completo. Las flores de la planta llevaron claramente el rasgo CMS, produciendo anteras disfuncionales sin el polen, pero teniendo de otro modo un tipo de flor crucifera fenotípicamente normal (Figura 1, segunda desde la izquierda) . Esta planta fue propagada vegetativamente, y los clones mantenidos in vivo. C. Contenido de ADN de las plantas híbridas Con el fin de determinar el contenido cromosómico de las líneas híbridas producidas por la cruza interespecífica del híbrido Fl de coliflor "Cheddar" y E. sativa variedad "Myway" , el ADN fue extraído del material de la hoja de las plantas y analizado mediante citometría de flujo de acuerdo al siguiente protocolo. Una pieza pequeña de muestra de hoja (0.5 cm2) fue desmenuzada con un escalpelo afilado en una caja de petri que contenía 2.5 mi de un amortiguador detergente (Tabla 2). La suspensión de los núcleos liberados del tejido cortado fue filtrada a través de una malla de nailon de 50 mm para eliminar el tejido grande y los fragmentos celulares.

Después de 5 minutos de incubación, se agregaron 5 mi de una solución de teñido (Tabla 3) a la muestra, y después de 10 minutos de incubación la muestra estuvo lista para ser analizada mediante el uso de citometría de flujo (Partee GMBH, Münster, República Federal de Alemania) . La muestra de los núcleos teñidos fue transferida al tubo de muestra, colocado en el portamuestras sobre el citómetro de Flujo, y el contenido de ADN fue medido y trazado gráficamente en formato de histograma. El contenido de ADN de RQ1400/04-1 fue consistente con una planta anf ihaploide , que tenía un grupo de 9 cromosomas provenientes de la coliflor y uno de los 11 provenientes de E. sativa (Figura 4 C comparada al contenido de ADN de las líneas progenitoras mostradas en 4A y 4B) . Tabla 2 Solución detergente (100 mi) 100 mi de agua destilada 2.1 g de ácido cítrico'í^O 0.5 mi de Tween 20 Tabla 3 Solución de teñido (100 mi) 100 mi de agua destilada 7.1 g de Na2HP04'2H20 0.2 mg de DAPI (4 , 6-diamidino-2-fenilindol ) D. Producción de un derivado fértil del híbrido Fl de CMS, RQ1400/04-1 Un número muy grande de cruzas (>1000) entre la planta RQ1400/04-1 y polinizadores de E. sativa fueron realizadas, a todo lo largo del periodo de floración completo, no obstante no se obtuvieron semillas o incluso embriones. La infertilidad fue atribuida al complemento cromosomico anfihaploide de la planta RQ1400/04-1, y la incapacidad para conducir el apareamiento meiótico normal durante la gametogénesis . Las plantas fueron de este modo tratadas con colchicina, de acuerdo al siguiente protocolo, para producir plantas fértiles con un complemento cromosomico duplicado, capaz de sufrir meiosis normal. Los clones vegetativos de las plantas RQ1400/04-1, que comprenden plántulas enraizadas de 10 cm, fueron primeramente lavados en agua y luego sumergidos en una solución al 0.34% (P/V) de colchicina por 3 horas. Las plántulas fueron luego enjuagadas y sembradas en una mezcla de esfagnum en una proporción de 1000 litros de esfagnum (tipo "Brun Stenr®gel") a 1 kg de CaC03 (cal) [suministrado por Stenr©gel A/S, Stenrogelve 13, Thoming, 8620 Kjellerup, Dinamarca] . Al alcanzar la etapa de floración, aproximadamente 50% de las plantas tuvieron un fenotipo característico de las plantas después de la duplicación cromosómica, incluyendo el crecimiento extraordinariamente vigoroso de los tallos y las hojas, y las flores de casi el doble de su tamaño normal (Figura 1, centro derecha). Las flores de estas plantas conservaron su fenotipo CMS con anteras rudimentarias desprovistas de polen (Figuras 6 y 7). Durante el periodo de floración, estas plantas tratadas con colchicina fueron cruzadas extensamente (>2.000 polinizaciones) con los cultivos de E. sativa "Runway" y "Myway" . La progenie fue obtenida de estas cruzas comprendiendo un total de únicamente 4 semillas provenientes de las cruzas de la variedad "Runway" y 4 semillas provenientes de las cruzas de la variedad "Myway" . Las semillas fueron cosechadas pero únicamente 1 semilla proveniente de la cruza de la variedad "Runway" (No. RQ1437/05-1) y 2 semillas provenientes de la cruza de la variedad "Myway" (No. RQ1438/05-1 y -2) germinaron. Estas plantas fueron nuevamente claramente más vigorosas que una rucóla normal (Figura 2) . Las hojas fueron aserradas como el tipo progenitor de E. sativa durante el crecimiento completo (Figura 3 ) . La progenie retro-cruzada superviviente (BCi) fue también encontrada como triploide con base en el análisis de ADN mediante citometría de flujo (ver Figura 4D comparada a A, B y C) , con un complemento cromosómico consistente con un grupo de cromosomas de coliflor (n = 9) y 2 grupos de cromosomas de E. sativa (n = 11) dando un total de 31 cromosomas. Los fenotipos de las plantas RQ1438/05-1 y -2 fueron muy similares a aquel de E. sativa, pero su crecimiento vegetativo fue más vigoroso (ver Figura 2 y Figura 3), y su conversión a la etapa sexual fue también muy severamente retrasada en comparación a E. sativa. RQ1438/05-1 fue la primera de las 3 plantas en florecer, y expresó un fenotipo estéril masculino, mientras que tuvo de otro modo una morfología de flor normal. El análisis de marcador de ADN reveló que las 3 plantas contenían el marcador "orfl38", mostrando que el CMS "Ogura" está presente (ver Ejemplo 13 + Figura 5A) . E . Líneas retro-cruzadas derivadas de plantas de RQ1438/05 que comprenden rasgos de E. sativa y de CMS RQ1438/05-1, de la generación BCi, fue polinizado extensamente con la variedad "Myway" y 3 meses después de la primera polinización, se cosecharon un total de 33 semillas BC2, consistentes con una baja fertilidad. Las primeras 5 semillas BC2 maduras (Línea No. RQ5000/06) fueron germinadas y 5 plantas BC2 individuales fueron obtenidas, todas las cuales fueron estériles masculinas. De estas plantas, la número 1 a la 4 se asemejaron claramente a la morfología de E. sativa, mientras que la número 5 fue más vigorosa. Aparte de tener anteras disfuncionales, las flores de las plantas BC2 fueron ahora morfológicamente similares a E. sativa variedad "Myway" (Figura 8 ) . Un análisis de citometría de flujo sugirió que las plantas 1, 2, 3 y 4 se habían revertido al complemento cromosómico diploide, y que la planta número 5 fue anfitetraploide llevando 3 grupos de E. sativa y 1 grupo de cromosomas de B. olerácea 3n=33 + n=8=41 cromosomas (Figura 4E-4F) . El análisis del marcador de ADN reveló que todas las 5 plantas de RQ5000/06 contenían el marcador "orfl38", mostrando que está presente en CMS "Ogura" (Ejemplo 13 + Figura 5 ) . F. E. sativa CMS diploide derivada de la retro-cruza de las plantas RQ1438/05 Las cuatro plantas BC2, identificadas como E. sativa diploide, produjeron un promedio de 24.9 semillas/silicua, que se compara favorablemente con la E. sativa fértil masculina utilizada como RP (Progenitor Recurrente), que produce un promedio de 17.3 semillas /silicua . La cantidad de la semilla producida fue normal para E. sativa en relación al tiempo del año y el número de polinizaciones realizadas, y con base en esto se concluyó que la fertilidad femenina fue completamente restaurada en las plantas BC3. A partir de estas semillas BC3 se realizó un depósito NCIMB con el No. de Acceso 41429. Las plantas BC3 generadas a partir de RQ5000/06 son indistinguibles del progenitor recurrente de E. sativa (cv. "Myway" ) en el tamaño de la cosecha normalmente utilizado para la producción de hoja comercial (Ver Figura 9) . Con el fin de determinar la cantidad de ADN de B. olerácea todavía presente en las plantas BC3 generadas a partir de RQ5000/06, se realizó un análisis de marcador de ADN con 72 marcadores SSR que cubren el genoma C completo de B. napus . El análisis (Ejemplo 14) reveló que las plantas BC3 tenían muy alta homología a E. sativa, y que todos los cromosomas de B. olerácea habían sido eliminados en el proceso de retro-cruza. EJEMPLO 2. E. sativa CMS generada mediante fusión de protoplastos A. Esterilización y germinación de semillas Semillas de B. olerácea o de B. napus con CMS son sumergidas por aproximadamente 10 segundos en alcohol al 70% y esterilizadas en una solución de hipoclorito de sodio al 1.5% por dos veces por 10 minutos a 20°C. Las semillas esterilizadas son luego extensamente enjuagadas con agua destilada estéril. Las semillas son luego colocadas sobre el medio nutritivo MS (ver Tabla 1) con 3% de sucrosa y sin hormonas. Para obtener plantas estériles verdes, las semillas son desarrolladas en recipientes de vidrio en la luz (8000 lux), por un fotoperiodo de 16 horas con temperaturas de 25°C de día y 20°C de noche. Los brotes estériles son subcultivados bajo las mismas condiciones en recipientes de plástico. Para obtener el tejido blanco para el aislamiento de protoplastos, por ejemplo los hipocotilos, las semillas son desarrolladas en cajas de petri en la oscuridad a 25°C. B. Aislamiento de los protoplastos Hojas de brotes de cuatro semanas de edad del material vegetal de acuerdo al Ejemplo 3, son cortadas en piezas pequeñas e incubadas en una solución enzimática (Tabla 4A) por 16 horas a 25°C en un agitador giratorio a 40 rpm. La suspensión es filtrada a través de una malla de nailon (40 µp?) y lavada con una solución CPW 16S (Tabla 4D) mediante centrifugación a 817 rpm por 5 minutos. Esto da como resultado la flotación de los protoplastos intactos. Los protoplastos son recolectados y enjuagados dos veces con solución W5 (Tabla 4B) mediante centrifugación a 708 rpm por 5 minutos. Los protoplastos son diluidos a una densidad de lxlO5 protoplastos por mi de solución W5, antes de ser utilizados para los experimentos de fusión. Tabla 4 A. SOLUCION DE ENZIMA (1 L) 90 g manitol 0.0272 g KH2 P0 0.1 g K 03 0.246 g MgS047H20 0.0008 g Kl O .00025 g CuS04.5H20 1.4 g CaCI2.2H20 1.1 g MES 6 g Celulosa RIO 1 g pH 5.8 Macarozyme B. SOLUCION DE LAVADO (W5) (1 L) 18.4 g CaCI2.2H20 4.91 g NaCl 0.372 g KC1 0.901 g glucosa pH = 5.8 C. SOLUCION DE LAVADO ( 5') (1 L) 18.4 g CaCI2.2H20 4.91 g NaCl 0.372 g KCl 0.901 g glucosa 9.76 g MES pH = 5.8 D. CPW 16 S (1 L) , 160 g sucrosa 0.0272 g KH2 P04 0.1 g KN03 1.45 g CaCI2.2H20 0.246 g MgS04.2H20 0.0008 g Kl O .025 mg CuS04.5H20, pH = 5.5-5.8 E. solución de fusión de PEG (PFS), 18.8% PEG (MW 4000) 0.06 M CaCl2.2H20 0.1 M manítol , 0.025 M glucina, 10% (Wv) D SO F. SOLUCION SPA (1 L) 20 g SeaPlaque agarosa, 100 g Sucrosa C. Preparación de los protoplastos teñidos con fluoresceína Hipocotilos de seis a ocho días de edad del material vegetal preparado de acuerdo al Ejemplo 2A, son aislados de acuerdo al proceso del Ejemplo 2B, excepto que se agregan 3 µg/ml de diacetato de fluoresceína a la solución enzimática utilizada durante el paso de tratamiento con enzima. Son de este modo obtenidos los protoplastos teñidos, adecuados para la selección manual y para determinación de la frecuencia de fusión. D. Irradiación de Protoplastos Protoplastos recién aislados preparados de acuerdo al Ejemplo 2B son sembrados en placa en una caja de petri de 6 cm en 2 a 3 mi de solución W5 (Tabla 4B) . Los protoplastos son irradiados utilizando una fuente de rayos X (Baltograph CE 100), a una dosis de 3500 Gy durante 20 minutos. Después de la irradiación, los protoplastos inactivados fueron lavados con W5 mediante centrifugación a 708 rpm por 5 minutos. Los protoplastos son diluidos a una densidad de lxlO5 protoplastos por mi de solución W5 antes de ser utilizados para los experimentos de fusión. E. Procedimiento de Fusión Los protoplastos de acuerdo al Ejemplo 2B, 2C y 2D, son mezclados 1:3 en una concentración final de lxlO5 protoplastos por mi de solución W5. Tres gotitas de 100 µ? de los protoplastos suspendidos son colocadas en una caja de petri de 6 cm no recubierta, y los protoplastos se dejan sedimentar por 5 a 10 minutos. Trescientos µ? de solución PFS son agregados en el centro de las tres gotitas para inducir la aglutinación por 15 minutos. Después de esto, se agregan 300 µ? de solución W5 a la mezcla, y nuevamente después de 10 minutos, y nuevamente después de 5 minutos adicionales. El medio W5 es reemplazado dos veces con solución 8P concentrada (Tabla 1) y los protoplastos son cultivados por uno a tres días a 25°C en la oscuridad. F. Selección y crecimiento de los productos de fusión La mezcla de fusión completa de acuerdo al Ejemplo 2E es cultivada por uno a tres días en la oscuridad a 25°C. Las células son recolectadas mediante centrifugación a 548 rpm por 5 minutos y diluidas en dos veces el medio 8P concentrado a una densidad de lxlO5 protoplastos por mi. Se agrega un volumen igual de medio SPA a 37°C (Tabla 4F) , y las células son sembradas en placa en 5 gotitas de 100 µ? en una caja de petri recubierta C) . También 5 gotitas de 100 µ? con células alimentadoras (suspensión celular que mejora la regeneración) son agregadas. Después de dos semanas, las gotitas con las células alimentadoras son retiradas (mediante el uso de una pipeta) y se agregan 2 mi de medio MAC (Tabla 1) por caja de petri. Después de dos semanas las gotitas son dispersadas sobre el medio Br sólido (Tabla 1) . Después de dos a tres semanas las colonias individuales son transferidas a una caja de petri con el medio K3 sólido (Tabla 1) . Los micro-callos son cultivados en baja intensidad luminosa (2500 lux) a 25°C con un fotoperiodo de 18 horas. Las células fusionadas, las cuales pueden ser reconocidas visualmente, por ejemplo por la presencia de la doble fluorescencia, son recogidas con un micromanipulador . Las células híbridas son cultivadas en gotitas de 100 µ? de agarosa (SeaPlaque al 1%) a una densidad de 2000 a 50,000 protoplastos por mililitro. Las gotitas son colocadas en un sistema de cultivo de alimentación líquida (columna Cos tar-Transwel 1 ) con células alimentadoras e incubado a 25°C en la oscuridad. Las gotitas son dispersadas sobre medio Br sólido (Tabla 1) después de dos semanas. Los callos pequeños son transferidos a medio K3 sólido (Tabla 1) y se incuban a 25°C en baja intensidad luminosa (2500 lux) con un fotoperiodo de 16 horas. 6. Regeneración de las Plantas Los callos de acuerdo a los Ejemplos 10 y 11, habiéndose desarrollado a un tamaño de 2 a 5 mm de diámetro, son transferidos al medio K3 fresco (Tabla 1) a intensidad luminosa normal (8000 lux) a 25°C con un fotoperiodo de 16 horas. Los brotes pequeños son transferidos al medio B5 (Tabla 1) con 1% de sucrosa sin hormonas y enraizadas sobre el mismo medio. EJEMPLO 3. Identificación de CMS por marcadores de ADN Fue utilizado un marcador de ADN para detectar la presencia de CMS de "Ogura" en material vegetal. La detección del marcador estuvo basada en un procedimiento de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) empleando la combinación de cebadores oligo37 y oligo38 (Tabla 5) . Esta combinación de cebadores produce un fragmento de PCR de 512 pares de bases cuando está presente el CMS "Ogura" -marcador "orfl38". Tabla 5 Oligo 37 (cebador superior) : 5 ' GCA TCA CTC TCC CTG TCG TTA TCG3 ' Oligo 38 (cebador inferior) : 5 ' ATT ATT TTC TCG GTC CAT TT CCA3 ' Gen Cob (cebador superior) : TCT TCT CTC GGG GTC ATC CT Gen Cob (cebador inferior) : CCC CCT TCA ACA TCT CTC AT La PCR fue realizada sobre el ADN total extraído de 16 muestran gue consisten de la coliflor con y sin CMS "Ogura", cultivos fértiles masculinos normales de E. sativa y las cruzas Fl y BCi entre CMS-B. olerácea y E. sativa. Como un control positivo interno, se utilizó un marcador de 630 pares de bases ("gen cob") . Todas las muestras de plantas analizadas fueron primeramente trituradas en nitrógeno líquido. El ADN fue luego extraído de 250 mg del material vegetal proveniente de cada muestra, por medio de un protocolo de extracción de ADN basado en CTAB (Eurofins, Chen D. H. & Ronald, P.C., 1999) . El rendimiento de ADN promedio fue de 5 ng/µ?. Las condiciones de PCR estándares fueron utilizadas con una temperatura de recocido de 53°C. Los productos de la PCR realizados sobre el ADN extraído de cada muestra de planta empleando los dos pares de cebadores (oligo 37/38 y cebadores del gen cob) fueron analizados sobre un gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio, como se muestra en la Figura 5A. Un fragmento de ADN de 512 pares de bases fue positivamente detectado en las tres líneas de coliflor conocidas que poseen CMS "Ogura" (Figura 5A, bandas 1, 4b, 5) , mientras que el fragmento de 512 pares de bases estuvo ausente de las 2 líneas de coliflor no-"Ogura" (Figura 5A, bandas 2, 3b) y las 3 líneas de E . sativa (Figura 5A, bandas 6, 7, 8b) . Los 8 extractos de ADN provenientes de las muestras de diferentes cruzas de generación entre el híbrido Fl de Coliflor variedad "Cheddar" y E . sativa (Figura 5A, bandas 9-16) fueron todas positivas para el fragmento de 512 pares de bases, indicando la presencia del gen orfl38 en estos híbridos ínterespecíficos. Las 5 plantas BC2 de la línea RQ5000/06 también probaron ser positivas para el fragmento de 512 pares de bases, indicando la presencia del marcador de CMS orfl38 en la línea RQ5000/06 (ver Figura 5B) . EJEMPLO 4. Estudios de homología por marcadores de SSR El ADN genómico fue extraído de cinco plantas BC3 generadas a partir de la Línea RQ 5000/06, y analizadas con un grupo de 72 marcadores. Los marcadores utilizados cumplieron los siguientes criterios: todos los marcadores se mapean sobre el genoma C del mapa genético de B. napus 8 marcadores cubren cada uno de los 9 grupos de enlace (cromosomas) de B. olerácea (el donador de CMS, con el genoma C) los marcadores cubren el genoma C de B. napus tan uniformemente como es posible El análisis del fragmento de ADN fue realizado como un ensayo de carga múltiple que analiza dos o tres marcadores, cada uno marcado con un colorante ABI diferente, simultáneamente. La prueba fue diseñada para revelar el grado de homología entre las plantas BC3 y el RP (E. sativa variedad "Myway") . 47 de los marcadores no fueron amplificados a partir del ADN del progenitor recurrente de E. sativa (RP) , mientras que únicamente 2 de los marcadores no fueron amplificados del ADN de la planta donadora de CMS B . olerácea. Todos los marcadores fueron amplificados a partir del ADN del B. napus que contiene el genoma C, el cual fue incluido como un control positivo. En total 4 de los marcadores fueron no informativos (incluyendo los 2 que no se amplificaron en B. olerácea) debido a que éstos mostraron una concordancia exacta entre el donador CMS de B . olerácea y el RP de E. sativa. Por lo tanto, éstos fueron desechados. Una concordancia positiva es contada como una concordancia exacta entre los productos de amplificación de las dos muestras. Si un marcador no fue amplificado ya sea en las plantas RP ( E . sativa) o BC3 , esto fue también calificado como una concordancia positiva.

Tabla 6. Porcentaje de concordancias positivas exactas entre los productos de amplificación del marcador de las plantas BC3 derivadas de la linea RQ 5000/06, el donador de CMS B . olerácea y el RP de E. sativa.

* El porcentaje de concordancia indica la homología entre las plantas BC3, el donador de CMS y el RP. El porcentaje de concordancia indica la homología entre las plantas BC3 , el donador de CMS y el RP . A partir de la Tabla 6, se observa que las plantas BC3 muestran una homología muy alta a E . sativa. La razón de que la concordancia no sea del 100% entre las plantas BC y RP es que RP es una variedad polinizada abierta y por lo tanto no es completamente homozigotica. Si todas las concordancias parciales, por ejemplo, una concordancia en uno de múltiples fragmentos de ADN amplificados provenientes de un marcador dado, son incluidas, la homología a E . sativa está entre 85-90% en las plantas BC3. Ninguna de las plantas BC3 muestra alguna homología al donador de CMS. Se concluye por lo tanto que todos los cromosomas de B. olerácea ha sido eliminado durante el proceso de BC . Referencias Cardi, T. & E.D.Earle, 1997. Production of new CMS Brassica olerácea by transfer of "Anand" cytoplasm from B. rapa through protoplast fusión, Theoretical and Applied Genetics, 94, 204-212 Cargill, Inc., PO Box 9300, Minneapolis, MN, 55440-9300, USA, www. cargill . com Chen.-D.H. S Ronald, P . C . ; 1999. A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications . Plant Molecular Repórter, 1999, p. 53-57. Glimelius, 1984, Physiologia Plantarum 61:38 Hauptmann et al . , 1983 "Carrot x Tobacco Somatic Cell Hybrids Selected by Amino Acid Analog Resistance Complementation " , 6th International Protoplast Symposium, Basel, Aug . 12-16, INRA. Agrocampus Rennes , BP 35327, F-35653 Le Rheu, France INRA, NCBI, acc. Z12626 Koop et al . 1989. Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, edited: Neuman et al . pgs 355-365 L.Daehnfeldt A/S, Faaborgvej 248B, 5250 Odense SV. , Denmark Seminis Vegetable Seeds, Oxnard, California, USA, www. seminis . com Sigareva, M.A. & E. D.Earle, 1997, Direct transfer of a cold-tolerant "Ogura" male sterile cytoplasm into cabbage (Brassica olerácea ssp. Capitata)via protoplast fusión, Theoretical and Applied Genetics, 94, 213-220 Sundberg et al.; 1986, Plant Science, 43:155 Sundberg, E. & Glimelius, K., 1991. Effects of parental ploidy level and genetic divergence on chromosome elimination and chloroplast segregation in somatic hybrids within Brassicaceae . Theoretical and Applied Genetics, vol . 83, no.l, p. 81-82. Syngenta Seeds B. V., Westeinde 62, P.O. Box 2, 1600 AA Enkhuizen, Netherlands, www.syngenta.com TraitGenetics GmbH, Am Schwabeplan Ib, D- 06466 Gatersleben, Germany Tsunoda S., Hinata K. & Gómez-Campo C, 1980, Brassica crops and wild allies, Japan Scientific Societies Press, Tokyo Yadav, R.C., Yadav, N.R. & P.K. Sareen, 2002. Interspecific hybridization in different I rassica species: pollen tube studies. National Journal of Plant Improvement, vol . 4-, p. 42-47 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la in ' ;nción .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una planta de rucóla estéril masculina. 2. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es Eruca sativa. 3. La planta de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende un citoplasma estéril masculino que confiere esterilidad masculina a la planta. 4. La planta de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el citoplasma estéril masculino es proveniente de Brassica olerácea o Brassica napus. 5. La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el citoplasma estéril masculino es transferido de un donador de citoplasma estéril masculino seleccionado del grupo que consiste de coliflor (variedad botrytis) , coles de Bruselas (variedad gemmifera) , col blanca (variedad capitata) , col corazón de toro (variedad capitata) , col roja (variedad capitata) , repollo de mila (variedad sabauda) , colinabo (convar. acephala DC var. sabellica) , col portuguesa (variedad tronchuda) , berza común rizada (variedad sabellica) , kohlrabi (variedad gongylodes) , brócoli (variedad itálica) , berza china (variedad albiflora) , sarson de burma (variedad chinensis) , breza de cocina (variedad fimbriata) , breza de mil cabezas (variedad fruticosa) , col rizada (variedad sabellica) y semilla de colsa/canola (B. napus) . 6. La planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el citoplasma estéril masculino es un citoplasma estéril masculino "Ogura" . 7. La planta de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende un marcador de ADN orfl38. 8. La planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el citoplasma estéril masculino es proveniente del híbrido Fl de coliflor "Cheddar". 9. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque es RQ5000/06 [NCIMB no. 41429] o la progenie o el ancestro de la línea RQ5000/06 que comprende el citoplasma estéril masculino. 10. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la planta de Eruca sativa es endogámica. 11. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la planta Eruca sativa es un híbrido. 12. Una parte vegetal de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste del fruto, la semilla, el polen, el óvulo, el embrión, la hoja, el tallo, la raíz y cualquier combinación de los mismos. 13. La semilla de la planta caracterizada porque de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11. 1 . El uso de un donador de citoplasma estéril masculino "Ogura" para producir una planta estéril masculina Eruca sativa. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el donador es el híbrido Fl de coliflor "Cheddar " . 16. Un método para producir una planta estéril masculina de Eruca sativa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cruzar una Brassica olerácea estéril masculina citoplásmica o una planta de Brassica napus con una planta de Eruca sativa, b) rescatar uno o más embriones resultantes de la cruza del paso a) , c) regenerar una planta a partir de uno o más embriones del paso b) , y seleccionar una o más plantas que tengan el fenotipo de Eruca sativa, d) duplicar el número de cromosomas de la planta del paso c) , y e) retro-cruzar una o más plantas resultantes del paso d) con una planta de Eruca sativa y seleccionando una o más plantas con el fenotipo de Eruca sativa. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además la retro-cruza de una o más plantas resultantes del paso e) , con una planta de Eruca sativa y seleccionar una o más plantas con el fenotipo de Eruca sativa. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque la selección incluye además la prueba para un marcador de ADN orfl38 y en donde la planta seleccionada comprende el marcador. 19. Un método para producir una planta estéril masculina de Eruca sativa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende los pasos de: a. fusionar un protoplasto proveniente de una planta seleccionada de Brassica olerácea estéril masculina citoplásmica, Brassice napus estéril masculina citoplásmica y Eruca sativa estéril masculina citoplásmica, con un protoplasto proveniente de una planta de Eruca sativa para producir una célula alogénica , b. regenerar la célula alogénica obtenida en una planta E. sativa estéril masculina citoplásmica, que tiene el citoplasma estéril masculino c. polinizar la planta regenerada con el polen proveniente de una planta de Eruca sativa y seleccionar una o más plantas de progenie estériles masculinas citoplásmicas. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la selección incluye además la prueba para un marcador de ADN orfl38, y en donde una o más plantas de progenie seleccionadas comprenden el marcador. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17 a 18, caracterizado porque comprende la cruza de una o más plantas seleccionadas de una Eruca sativa endogámica para producir una o más plantas híbridas. 22. Una planta de Eruca sativa, caracterizada porque es obtenible mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21. 23. Un método para transferir el citoplasma estéril masculino a una planta de Eruca sativa fértil, masculina, caracterizado porque comprende los pasos de: a) cruzar una planta de Eruca sativa estéril masculina, citoplásmica con una planta de Eruca sativa fértil masculina , b) cosechar una o más semillas producidas por la cruza del paso a) , c) retro-cruzar una planta desarrollada a partir de una o más semillas del paso b) , con la planta de Eruca sativa estéril masculina, y cosechar la semilla producida por la cruza, d) retro-cruzar una planta desarrollada proveniente de una o más semillas cosechadas del paso c) , o la semilla proveniente del paso de retro-cruza subsiguiente, con la planta de Eruca sativa estéril masculina, por una o más generaciones de retro-cruza, hasta que uno o más genes nucleares provenientes de la planta E. sativa fértil masculina, son transferidos a una o más de las plantas de progenie de la retro-cruza, estériles masculinas. 24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la planta de Eruca sativa estéril masculina citoplásmica es RQ5000/06 [NCIMB no. 41429] o la progenie de la misma. 25. Un método para producir una hoja de una planta de rucóla caracterizado porque comprende: a) desarrollar una planta de rucóla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 hasta que es producida una hoja; y b) cosechar la hoja. 26. Un método para propagar vegetativamente una planta de rucóla, caracterizado porque comprende: a) recolectar un tejido de una planta de rucóla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; b) cultivar el tejido para obtener los brotes proliferados ; c) enraizar los brotes proliferados para obtener las plántulas enraizadas. 27. Un método para producir una semilla de una planta de rucóla caracterizado porque comprende: a) desarrollar una primera planta de rucóla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13; b) polinizar la planta de rucóla con el polen de una segunda planta de rucóla; y c) cosechar las semillas provenientes de la primera planta de rucóla. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la segunda planta de rucóla es una planta mantenedora de la primera planta de rucóla.