MX2008015882A

MX2008015882A - Metodos y composiciones para hacer blanco en hepsina.

Info

Publication number: MX2008015882A
Application number: MX2008015882A
Authority: MX
Inventors: Daniel K Kirchhofer; Rajesh Vij
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2009-01-12
Also published as: EP2044124A2; CN101490088B; CN101490088A; CA2656168A1; AU2007260950A1; NO20090333L; RU2009101813A; AU2007260950A8; KR20090029276A; WO2007149932A2; JP2009540835A; US8124352B2; BRPI0712273A8; KR101410195B1; BRPI0712273A2; US20120141374A1; MY150643A; US8383123B2; NZ573178A; US20100021474A1

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-HEPSINA y métodos para utilizar los anticuerpos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA HACER BLANCO EN HEPSINA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad bajo 35 USC §119 de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. No. de Serie 60/805,589, presentada en junio 22, 2006, todos los contenidos de la cual aquí se incorporan por referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de anticuerpos de anti-HEPSINA, y más particularmente a anticuerpos de anti-HEPSINA que son útiles en particular para diagnóstico y otros propósitos de blanco de HEPSINA. ANTECEDENTES La hepsina es una serina proteasa de transmembrana tipo II (TTSP = type II transmembrane serine protease) expresada en la superficie de células epiteliales. La proteína de 417-amino ácidos está compuesta de un dominio citoplásmico N-terminal corto, un dominio de transmembrana y un dominio rico en cisteína receptora de depurador sencillo que empaca cerradamente o apretadamente contra el dominio C-terminal de proteasa (1) . La función fisiológica de HEPSINA no es clara. A pesar de su expresión en las muy tempranas etapas de la embriogénesis (2) , ratones deficientes en HEPSINA fueron viables y tuvieron desarrollo normal (3,4). HEPSINA se encontró que no es esencial para regeneración del hígado y para funciones fisiológicas relacionadas con la coagulación (3,4). Sin embargo, la HEPSINA se ha implicado en cáncer de ovarios; [WO2001/62271] y cáncer de próstata. Varios estudios de expresión de genes identifican a HEPSINA como uno de los genes más altamente inducidos en cáncer de próstata (6,11). Niveles de AR de Hepsina se encontraron bajos en hiperplasia benigna y próstata normal, pero se incrementan fuertemente en carcinoma de próstata, particularmente en las etapas avanzadas (8-10) . La tinción de proteína Hepsina con un anticuerpo anti -HEPSINA monoclonal mostró que la expresión de HEPSINA fue la más alta en sitios de metástasis de huesos y en tumores primarios de etapa tardía (12), lo que es consiste con el hallazgo que incrementa los niveles de ARN de HEPSINA se correlaciona con superiores grados Gleason y el progreso del tumor (7-10, 13) . Evidencia experimental por un papel de HEPSINA en cáncer de próstata llega de un estudio reciente por Klezovitch et al . (14), demostrando que en un modelo de ratón de cáncer de próstata sin metástasis, la sobre-expresión de HEPSINA lleva a avance de tumor primario y metástasis. De forma intrigante, la sobre-expresión de HEPSINA se asocia con ruptura de membrana basal (14) que dirige hacia la posibilidad de que la actividad de HEPSINA está algo vinculada con la degradación de los componentes de membrana basal. In-vitro, la HEPSINA es capaz de convertir el factor de crecimiento latente, factor de crecimiento pro-hepatocito (pro-HGF = growth factor pro-hepatocyte growth factor) en su forma de dos cadenas (HGF) activa, que induce señalización de receptor Met; [(15); (16); WO2006/014928] . Debido a que la ruta HGF/Met se ha implicado en crecimiento de tumor invasivo y metástasis, es posible que la sobre-expresión de HEPSINA activa el eje HGF/Met en cáncer de próstata (15,16). La Hepsina también se muestra que escinde otros substratos in-vitro, primordialmente proteínas relacionadas a coagulación (15,17). Sin embargo, su papel en tumorigénesis no se conoce . La fuerte expresión de HEPSINA en cánceres de próstata y otros le hacen un marcador de diagnóstico atractivo para una variedad de enfermedades, en particular cánceres. Además, otros miembros de la familia TTSP, tales como matriptasa y TMPRSS2 se cambian o desprenden de las superficies de células y la matriptasa desprendida se ha detectado en leche materna (18) . Con base en la similaridad estructural con estos TTSPs, es posible que HEPSINA derivada de tumor pueda detectarse en fluidos corporales humanos utilizando sistemas de detección apropiados. Es evidente que la expresión HEPSINA se asocia con y probablemente juega un papel en la etiología de diversas enfermedades. La expresión HEPSINA se asocia con diversas características de enfermedades, tales como etapas particulares y extensión de malignidad de cánceres. Uno de los retos más difíciles en el manejo clínico de enfermedades complejas tales como cáncer es la identificación precisa y temprana de las enfermedades en un paciente. De esta manera, aunque algunos anticuerpos se han generado que aparentemente ligan HEPSINA (e.g., Tsuj i et al., J. Biol . Chem. (1991), 266 (25) : 16948-16953 ; Torres-Rosado et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA (1993), 90:7181-7185; WO2004/035733 ; WO2002/064839 ; O2004/033630) , es claro que sería benéfico el tener composiciones y métodos que sean efectivos y flexibles para detectar y/o hacer blanco HEPSINA in vi tro e in vivo. La invención proporcionada aquí se refiere a estas composiciones y métodos . Todas las referencias aquí citadas, incluyendo solicitudes y publicaciones de patentes, se incorporan por referencia en su totalidad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona anticuerpos novedosos capaces de ligar y/o hacer blanco en proteína HEPSINA asociada a células y soluble, in vi tro e in vivo. Un panel de anticuerpos de HEPSINA anti-humano monoclonales se generaron que ligan a HEPSINA en diversas formas y en diferentes epítopos. Estos anticuerpos tienen una variedad de usos, incluyendo el uso en sistemas de detección sensibles para medir niveles de HEPSINA en muestras biológicas. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de inmunoglobulina aislado que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o toda la secuencias hipervariables (HVR) seleccionadas del grupo que consiste de la secuencia HC-HVR1, HC-HVR2, HC-HVR3 , LC-HVR1, LC-HVR2 y la secuencia LC-HVR3 de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC = American Type Culture Collection) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el polipéptido de inmunoglobulina aislado específicamente liga HEPSINA humana. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o todas las secuencias hipervariables (HVR) seleccionadas del grupo que consiste de HC-HVR1, HC-HVR2, HC-HVR3 , LC-HVR1, LC-HVR2 y LC-HVR3 de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el anticuerpo aislado específicamente liga HEPSINA humana. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende al menos uno, dos o todas las HC-HVRs seleccionadas del grupo que consiste de HC-HVR1, HC-HVR2 y HC-HVR3, y al menos una, dos o todas las LC-HVRs seleccionadas del grupo que consiste de LC-HVR1, LC-HVR2 y LC-HVR3. En una modalidad, las secuencias HVR en un anticuerpo aislado de la invención son aquellas de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7469. En una modalidad, las secuencias HVR en un anticuerpo aislado de la invención son aquellas de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7470. En una modalidad, las secuencias HVR en un anticuerpo aislado de la invención son aquellas de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso No. PTA-7471. En una modalidad, las secuencias HVR en un anticuerpo aislado de la invención son aquellas de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7472. En una modalidad, las secuencias HVR en un anticuerpo aislado de la invención son aquellas de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7473. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de inmunoglobulina aislado que comprende secuencias de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC bajo los Nos. de Acceso No. PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el polipéptido de inmunoglobulina aislada específicamente liga HEPSINA humana. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende secuencias de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el anticuerpo aislado específicamente liga HEPSINA humana. En una modalidad, el anticuerpo aislado comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC bajo el No. de Acceso PTA-7469. En una modalidad, el anticuerpo aislado comprende secuencias de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, producidas por línea celular de hibridoma depositada en la ATCC bajo el No. de Acceso PTA-7470. En una modalidad, el anticuerpo aislado comprende secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7471. En una modalidad, el anticuerpo aislado comprende secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7472. En una modalidad, el anticuerpo aislado comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producida por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo el No. de Acceso PTA-7473. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti -HEPSINA monoclonal codificado por una secuencia de codificación de anticuerpo de línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo los Nos. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que liga al mismo epítopo en HEPSINA humana que un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo los Nos. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473. En un aspecto, la he invención proporciona un anticuerpo aislado que liga a un epítopo diferente en HEPSINA humana como un anticuerpo producido por línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo los Nos. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que compite con un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la (ATCC ) bajo los Nos. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473 para ligar HEPSINA humana. En una modalidad, un anticuerpo de la invención liga específicamente a un determinante antigénico o epítopo ubicado en una secuencia de dominio extracelular de HEPSINA humana. En una modalidad, la secuencia de dominio extracelular comprende Arg45 a Leu417 de HEPSINA humana. En una modalidad, el determinante antigénico o epítopo se ubica en el dominio proteasa de HEPSINA. En una modalidad, un anticuerpo de la invención no liga específicamente a la cadena A de HEPSINA. En una modalidad, un anticuerpo de la invención liga específicamente a HEPSINA humana pero no inhibe substancialmente in vivo y/o in vitro la actividad enzimática de HEPSINA. En una modalidad, la actividad enzimática comprende escisión del substrato polipeptido de HEPSINA. En una modalidad de un anticuerpo de la invención, toda la forma IgG de longitud íntegra del anticuerpo liga específicamente a HEPSINA humana con una afinidad de enlace de aproximadamente 150 nM o mejor. En una modalidad, la afinidad de enlace es aproximadamente 120 nM o mejor. En una modalidad, la afinidad de enlace es aproximadamente 100 nM o mejor. En una modalidad, la afinidad de enlace es aproximadamente 75 nM o mejor. En una modalidad, la afinidad de enlace es aproximadamente 50 nM o mejor. En una modalidad, la afinidad de enlace es aproximadamente 25 nM o mejor. En una modalidad, los valores de afinidad de enlace se obtienen por ELISA directo (por ejemplo, expresado como EC50 como se mide en ELISAs directos como se describe en los Ejemplos siguientes) . Un anticuerpo de la invención puede estar en cualquier cantidad de formas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal que es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Un anticuerpo de la invención puede ser de longitud íntegra o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que comprende un componente de enlace de antígeno) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención no es un anticuerpo anti-HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volume 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6 , A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones de PCT WO2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención no compite para enlace a HEPSINA humana con un anticuerpo anti-HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volume 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones PCT WO2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención no liga al mismo epítopo en HEPSINA humana como un anticuerpo anti-HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volume 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6 , A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones PCT WO2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) . En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención y un portador. En una modalidad, el portador es farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo) de la invención. En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona células anfitrionas u hospederas que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo un vector recombinante tal como un vector de expresión. Cualquiera de una variedad de células anfitrionas puede emplearse. En una modalidad, una célula hospedera es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli. En una modalidad, una célula hospedera es una célula eucariótica, por ejemplo una célula de mamífero tal como Célula de Ovario de Hámster Chino (CHO = Chínese Hámster Ovary) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para producir un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-HEPSIN (como se define aquí, incluye longitud íntegra y sus fragmentos) , el método comprende expresar en una célula hospedera conveniente, un vector recombinante de la invención que codifica el anticuerpo (o su fragmento) , y recuperar el anticuerpo . En un aspecto, la invención proporciona un artículo de manufactura que comprende un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende uno o más anticuerpos de la invención. En una modalidad, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición comprende un polipéptido de inmunoglobulina (por ejemplo un anticuerpo) de la invención que además comprende un portador, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un artículo de manufactura de la invención además comprende instrucciones para administrar la composición (por ejemplo el anticuerpo) a un sujeto. En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un primer recipiente, que comprende una composición que comprende uno o más anticuerpos de la invención; y un segundo recipiente que comprende un amortiguador. En una modalidad, el amortiguador es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una composición comprende un anticuerpo que además comprende un portador, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un equipo además comprende instrucciones para utilizar la composición (por ejemplo, el anticuerpo) para detectar y/o medir HEPSINA en una muestra. En una modalidad, un equipo además comprende instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el anticuerpo) a un sujeto. En un aspecto, un anticuerpo de la invención se enlaza a una toxina tal como un agente citotóxico. Estas moléculas pueden formularse o administrarse en combinación con un agente de mejora/aditivo, tal como un agente quimioterapéutico, radiación o esteroide. En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de HEPSINA en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención. En una modalidad, el enlace del anticuerpo a la muestra indica presencia de HEPSINA en la muestra. En un aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad, que comprende determinar el nivel de HEPSINA en una muestra de prueba de células de tejido por contacto de la muestra con un anticuerpo de la invención, en donde HEPSINA ligada por el anticuerpo indica presencia y/o cantidad de HEPSINA en la muestra. En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar si un individuo tiene riesgo de enfermedad (por ejemplo una enfermedad asociada con des -regulación de expresión de HEPSINA) que comprende determinar el nivel de HEPSINA en una muestra de prueba de células de tejido por contacto en la muestra prueba con un anticuerpo de la invención y de esta manera determinar la cantidad de HEPSINA presente en la muestras, en donde un nivel superior de HEPSINA en la muestra de prueba, en comparación con una muestra de control que comprende tejido normal del mismo origen celular que la muestra de prueba, es una indicación de que el individuo esté en riesgo de enfermedad. En una modalidad de los métodos de la invención, el nivel de HEPSINA se determina con base en una cantidad de polipéptido HEPSINA indicado por la cantidad de HEPSINA ligada por el anticuerpo en la muestra de prueba. Un anticuerpo empleado en el método puede opcionalmente ser etiquetado en forma detectable, conectado a un soporte sólido, o semejantes. En un aspecto, la invención proporciona un método para ligar un anticuerpo de la invención a HEPSINA presente en un fluido corporal, por ejemplo sangre. Todavía en otro aspecto, la invención se dirige a un método para ligar un anticuerpo de la invención a una célula que expresa HEPSINA, en donde el método comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo bajo condiciones que son adecuadas para ligar el anticuerpo a HEPSINA y permitir enlace entre ellos. En una modalidad, el anticuerpo no inhibe interacción de HEPSINA con su ligando. En un aspecto, la invención proporciona un método para ser blanco a un agente (por ejemplo, agente de diagnóstico o terapéutico) a un tejido asociado con HEPSINA en un hospedero, el método comprende administrar al hospedero el agente en una forma que se enlaza a un anticuerpo de la invención, con lo que el agente se hace blanco en el tejido asociado con HEPSINA en el anfitrión u hospedero. En una modalidad, el anticuerpo que liga HEPSINA es capaz de ligar específicamente a HEPSINA situado en una célula (ya sea in vitro o in vivo) , por ejemplo en donde HEPSINA está presente en la superficie de una célula. En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende determinar si un sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la presencia de la célula indica que el sujeto tiene un desorden asociado con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA. En un aspecto, la invención proporciona un método para pronosticar respuesta de un sujeto a terapia para un desorden asociado con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la presencia de la célula indica que el sujeto responderá a la terapia. En un aspecto, la invención proporciona un método para supervisar enfermedad residual mínima en un sujeto tratado para una enfermedad asociada con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa de la presencia de la enfermedad residual mínima. En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar un estado de enfermedad asociado con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA en un sujeto, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa de la presencia del estado de la enfermedad en el sujeto. En un aspecto, la invención proporciona un método para estimar predisposición de un sujeto a desarrollar un desorden asociado con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa de una predisposición para que el sujeto desarrolle el desorden. En un aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar un desorden asociado con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA en un sujeto, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula indica que el sujeto tiene dicho desorden. En un aspecto, la invención proporciona un método para distinguir entra una etapa temprana y tardía de una enfermedad asociada con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA (por ejemplo, grado de malignidad, etapa temprana o avanzada, etc.) en un sujeto, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula indica que el sujeto tiene la etapa tardía de la enfermedad.

En un aspecto, la invención proporciona un método para distinguir entre una etapa no invasiva o invasiva de una enfermedad asociada con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA en un sujeto, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula indica que el sujeto tiene la etapa invasiva de la enfermedad. En un aspecto, la invención proporciona un método para distinguir entre la etapa no metastásica y metastásica de una enfermedad asociada con des-regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA en un sujeto, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula indica que el sujeto tiene la etapa metastásica de la enfermedad. Las etapas en los métodos para examinar la expresión de HEPSINA pueden conducirse en una variedad de formatos de ensayo, incluyendo inmuno- istoquímica, ELISA y ensayos de transferencia. Opcionalmente , la muestra de tejido o células comprende tejido o células enfermas. Métodos de la invención proporcionan información útil para determinar etapas de intervención clínica apropiada, si y cuando sea apropiado. Por lo tanto, en una modalidad de un método de la invención, el método además comprende una etapa de intervención clínica con base en resultados de la evaluación de la expresión de HEPSINA. Por ejemplo, intervención apropiada puede involucrar etapas profilácticas y de tratamiento, o uno o varios ajustes de cualesquiera etapas de tratamiento profilácticas y entonces corrientes con base en información de expresión de HEPSINA obtenida por un método de la invención. Métodos aún adicionales de la invención incluyen métodos para tratar un desorden asociado con des -regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA en un mamífero, tal como cáncer, que comprende etapas de obtener tejido o una muestra celular del mamífero, examinar el tejido o células para expresión (por ejemplo, cantidad de expresión) de HEPSINA, y al determinar que la muestra de tejido o de células expresa HEPSINA (por ejemplo, en donde HEPSINA se expresa en cantidades mayores que una muestra de referencia (control) ) , administrar una cantidad efectiva de un agente terapéutico al mamífero. Opcionalmente , los métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de un agente terapéutico objetivo (por ejemplo, un anticuerpo que liga y/o bloquea actividad de HEPSINA y/o su ligando correspondiente y/o substrato, y un segundo agente terapéutico (por ejemplo, agente citotóxico, etc.) al mamífero.

Como será evidente para una persona con destreza en la técnica, en cualquier método de la invención, mientras que la detección de una expresión incrementada de HEPSINA indicará en forma positiva una característica de una enfermedad (por ejemplo, presencia, etapa o extensión de una enfermedad) , la no detección de una expresión incrementada de HEPSINA sería informativa también al proporcionar la caracterización recíproca de la enfermedad. En un aspecto, la invención proporciona un equipo de sonda/colección que comprende uno o más anticuerpos capaces de ligar específicamente a HEPSINA (por ejemplo, anticuerpos de la invención) . En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende una composición de la invención, e instrucciones para utilizar la composición para detectar un desorden asociado con des -regulación (por ejemplo, sobre-expresión) de HEPSINA al determinar si la expresión de HEPSINA está a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal. En una modalidad, la composición de la invención es un equipo de sonda/colección ordenada que comprende uno o más anticuerpos capaces de ligar específicamente a HEPSINA (por ejemplo, anticuerpos de la invención) . En una modalidad, la composición de la invención comprende un anticuerpo que detecta específicamente HEPSINA. En una modalidad, la composición de la invención comprende un anticuerpo que liga específicamente a cuando menos una porción de HEPSINA. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Caracterización de anticuerpos anti- HEPSINA. Figura 2. Valores ? ?? de inhibición de HEPSINA y uPA por HAI-2. Figura 3. ELISA de enlace de HEPSINA. Anticuerpos se agregan a placas de microtitulación revestidas con HEPSINA soluble. Anticuerpos ligados se detectan con IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano seguido por adición de substrato BioFX TMB. Figura 4. Determinación de epítopo por ELISA de enlace de competencia. Anticuerpo biotinilado y exceso molar de anticuerpos no etiquetados se agregan a placas de micro-titulación revestidos con HEPSINA soluble. Anticuerpo biotinilado ligado se detecta con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano seguido por adición de substrato BioFX TMB. Figura 5. Histograma de enlace de anticuerpo 3H10.1.2 a HEPSINA y células LnCaP . Células LnCaP-34 expresan HEPSINA transfectada y HEPSINA endógena, mientras que las células LnCaP-17 solo expresan HEPSINA endógena. Suspensiones celulares se incubaron con anticuerpo 3H10.1.2 y anticuerpo ligado en superficie detectado con IgG anti-ratón F(ab')2 conjugado con PE en un FACScan. Controles solo se incubaron con conjugado PE. Figura 6. Ensayo de substrato cromogénico.

Anticuerpos a 500 nM se incubaron con HEPSINA soluble (0.25 nM) por 30 min. Actividad enzimática de HEPSINA hacia el substrato para-nitroanilida S2366 se miden entonces y expresan como actividad fraccional (VÍ/Vq) . El inhibidor de HEPSINA KD1 (50 nM) se utiliza como un control positivo. Figura 7. Ensayo de activación Pro-uPA. Anticuerpos (710 nM) se incubaron por 30 min con HEPSINA 0.5 nM y pro-uPA (100 nM) se agrega para iniciar la reacción. Se retiran alícuotas en diversos puntos en tiempo y la concentración de uPA formada determinada en la segunda etapa del ensayo utilizando el substrato uPA S2444. La velocidad de formación de uPA (Tabla 1) se calcula a partir de las pendientes. El inhibidor de HEPSINA KD1 (71 nM) se utiliza como un control positivo. Figura 8. Inmuno-transferencia de HEPSINA soluble recombinante con anticuerpos monoclonales. HEPSINA se analiza por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y después de transferencia en membrana de nitrocelulosa, detecta con los anticuerpos monoclonales anti-HEPSINA. Las posiciones de la cadena HEPSINA B (dominio de proteasa) y las normas de peso molecular (Mr x 103) se indican. Figura 9. Una modalidad de una secuencia de amino ácido de HEPSINA humana nativa. Figuras 10A y B. Otra modalidad de una secuencia de amino ácidos de una HEPSINA humana nativa. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bio-química e inmunología, que están dentro de la destreza de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura, tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds . , 1987, and periodic updates) ; "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed. , 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V. , 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001) . Definiciones El término "HEPSINA" como se emplea aquí, abarca polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptido y fragmentos de un polipéptido de secuencia nativa y variantes de polipéptido (que se definen adicionalmente aquí) que es capaz de escisión pro-HGF en una forma similar a HEPSINA de tipo silvestre. El polipéptido de HEPSINA aquí descrito puede ser aquél que se aisla de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o prepara por métodos recombinantes o sintéticos. Los términos "HEPSINA", "polipéptido HEPSINA", "enzima HEPSINA", y "proteína HEPSINA" también incluyen variantes de un polipéptido HEPSINA como se describe aquí. Un "polipéptido HEPSINA de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de HEPSINA correspondiente derivado de la naturaleza. En una modalidad, un polipéptido de HEPSINA de secuencia nativa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:1 (ver Figura 9). En una modalidad, un polipéptido HEPSINA de secuencia nativa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ver Figura 10) . Esta secuencia nativa de polipéptido de HEPSINA de puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "secuencia nativa de polipéptido de HEPSINA" específicamente abarca formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido de HEPSINA específico (por ejemplo secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas en forma alterna) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido . "Variante de polipéptido de HEPSINA" o sus variantes, significa un polipéptido de HEPSINA, en general un polipéptido de HEPSINA activo, como se define aquí que tiene al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias nativas de secuencias de polipéptido de HEPSINA aquí descritas. Estas variantes de polipéptido de HEPSINA incluyen por ejemplo, polipéptidos HEPSINA en donde uno o más residuos aminoácido se agregan o eliminan en el extremo N o C de una secuencia de aminoácidos nativa. Ordinariamente, una variante de polipéptido HEPSINA tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia nativa de secuencia de polipéptido de HEPSINA como se describe aquí. De manera ordinaria, polipéptidos variantes de HEPSINA son al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más.

Opcionalmente, polipéptidos variantes de HEPSINA no tendrán más de una sustitución de aminoácidos conservadora en comparación con una secuencia de polipéptido de HEPSINA nativa, en forma alterna uno o más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácidos conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido de HEPSINA nativa . "Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia péptido o polipéptido, se define como el porcentaje de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos aminoácido en la secuencia péptido o polipéptido específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia y sin considerar sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar identidad de secuencia de aminoácidos en por ciento puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la especialidad, por ejemplo utilizando programas o soporte lógico de computadora disponible al público tales como BLAST, BLAST-2 , ALIGN o egalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre toda la longitud de las secuencias comparadas. Para los presentes propósitos, sin embargo, valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2, como se describe en la patente de los E.U.A. Número 6,828,146. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas hormonas y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos . En una modalidad, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por ejemplo por el método de Lowry y en algunas modalidades más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por uso por ejemplo de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando por ejemplo azul de Coomassie o tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo se preparará anticuerpo aislado por al menos una etapa de purificación.

Como se emplea aquí, el término "anticuerpo anti-HEPSINA" , se refiere a un anticuerpo que es capaz de ligar a HEPSINA. La frase "sustancialmente similar", "sustancialmente igual", "equivalente" o "sustancialmente equivalente", como se emplea aquí, denota un grado de similaridad suficientemente elevado entre dos valores numéricos (por ejemplo uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora) , de manera tal que la persona con destreza en la técnica considerará la diferencia entre los dos valores que son de poco significado o ninguno desde el punto de vista biológico y/o estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo valores Kd, efectos antivirales, etc.). La diferencia entre los dos valores de preferencia es menor que aproximadamente 50%, de preferencia menor que aproximadamente 40%, de preferencia menor que aproximadamente 30%, de preferencia menor que aproximadamente 20%, de preferencia menor que aproximadamente 10%, como una función del valor para la molécula de referencia/comparadora . La frase "sustancialmente reducido", o "sustancialmente diferente" como se emplea aquí, denota un grado de diferencia suficientemente elevado entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparadora), de manera tal que una persona con destreza en la técnica considere la diferencia entre los dos valores son de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo valores Kd o IC50) . La diferencia entre los dos valores de preferencia es mayor que aproximadamente 10%, de preferencia es mayor que aproximadamente 20%, de preferencia es mayor que aproximadamente 30%, de preferencia es mayor que aproximadamente 40%, de preferencia es mayor que aproximadamente 50% como una función del valor para la molécula de referencia/comparadora. "Afinidad de enlace" en general se refiere a la fuerza de la intensidad de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo un antígeno) . Al menos que se indique de otra forma, como se emplea aquí, "afinidad de enlace" se refiere a la afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede en general representarse por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos aquí descritos. Anticuerpos de baja afinidad en general ligan antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente mientras que anticuerpos de alta afinidad en general ligan antígeno más rápido y tienden a permanecer ligados por más tiempo. Una variedad de métodos para medir afinidad de enlace se conocen en la técnica, cualquiera de los cuales puede emplearse para propósitos de la presente invención. Modalidades ilustrativas específicas se describen a continuación. En una modalidad, la "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide por un ensayo de enlace de antígeno radioetiquetado (RIA= Radiolabeled Antigen Binding Assay) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno, como se describe por el siguiente ensayo que mide afinidad de enlace en solución de Fabs para antígeno al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno etiquetado (125I) en la presencia de una serie de titulación de antígeno no etiquetado, después capturar antígeno ligado con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer condiciones por el ensayo, placas de microtitulación (Dynex) se revisten durante la noche con 5 ug/ml por un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6), y subsecuentemente bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , antígeno [125I] de 100 M ó 26 pM se mezcla con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con evaluación de ün anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés después se incuba durante la noche; sin embargo la incubación puede continuar por un largo periodo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo por una hora) . La solución después se retira y la placa se lava 8 veces con Tween-20 al 0.1% en PBS . Al secar las placas, 150 ul/pozo de aparato de sellado (MicroScint-20 ; Packard) se agrega, y las placas se cuentan en un contador gama Topcount (Packard) por diez minutos. Concentraciones de cada Fab que dan menos que o igual a 20% de enlace máximo se seleccionan para utilizar en ensayos de enlace competitivo. De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor de Kd se miden al utilizar ensayos de resonancia plasmon de superficie utilizando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta (RU= Response Units) . Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-N'- (3 -dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye antígeno con acetato de sodio lOmM, pH 4.8 en 5ug/ml (~0.2uM) antes de inyección a un gasto de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, etanolamina 1M se inyecta para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, dobles diluciones en serie de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con Tween 20 0.05% (PBST) a 25°C a un gasto de flujo de aproximadamente 25ul/min. Velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir 1-a-1 simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultáneo del sensorgrama de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/^on. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad de disociación excede 10^ M"l S~l por el ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, la velocidad de disociación puede determinarse utilizando una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm a paso de banda) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20nM (forma Fab) en PBS pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectro fotómetro equipado con flujo tapón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja de agitación. Una "velocidad de disociación" o "velocidad de asociación" o "kon" de acuerdo con esta invención también puede determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmon de superficie descrita anteriormente utilizando BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biosensores de déxtrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida hidrocloruro (EDC) y ¿V-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio lOmM, pH 4.8 en 5ug/ml (~0.2uM) antes de inyección a un gasto de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de inyección de etanolamina 1M para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones dobles en serie de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con Tween-20 al 0.05% (PBST) a 25°C a un gasto de flujo de aproximadamente 25ul/min. Velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir 1-a-l simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensorgrama de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción koff ^on. Ver Por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad de asociación excede 106 M"1 S"1 por el ensayo de resonancia plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación de preferencia la determinada al utilizar una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm a paso de banda) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo tapón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. La "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención en una modalidad se mide por ensayo de enlace de antígeno radioetiquetado (RIA= Radiolabeled Antigen Binding Assay) realizado con la versión Fab del anticuerpo y molécula antígeno como se describe por el siguiente ensayo que mide afinidad de enlace en solución de Fabs para antígeno al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno etiquetado ( 25j) en ]_a presencia de una serie de titulación de antígeno sin etiquetar, después capturar antígeno ligado con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer condiciones para el ensayo, placas de microtitulación (Dynex) se revisten durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio de 50 m (pH 9.6), y subsecuentemente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS por 2 a 5 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , antígeno [125I] 100 pM o 26 pM se mezcla con diluciones en serie de un Fab de interés (consistente con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, in Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés después se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un más largo periodo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente por una hora. La solución después se retira y la placa se lava 8 veces con Tween-20 al 0.1% en PBS. Cuando las placas se han secado, 150 ul/pozo destellante (MicroScint-20 ; Packard) se agregan, y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) por diez minutos. Concentraciones de cada Fab que dan menos que o igual a 20% de enlaces máximos se eligen para utilizar en ensayos de enlace competitivo. De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor Kd se mide al utilizar ensayos de resonancia plasmon de superficie utilizando un BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye antígeno con acetato de sodio lOm , pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2uM) antes de inyección a un gasto de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de inyección de antígeno, etanolamina 1M se inyecta para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones en serie dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con Tween-20 al 0.05% (PBST) a 25°C a un gasto de flujo de aproximadamente 25ul/min. Velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir 1-a-l simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensorgrama de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon_ Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J". Mol Biol 293:865-881. Si la constante de asociación excede 106 M"1 S"1 por el ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse utilizando una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm a paso de banda) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones presentes de antígeno como se mide en un espectrómetro tal como un espectro fotómetro equipado con flujo tapón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja de agitación. En una modalidad, de acuerdo con esta invención una "velocidad de asociación" o "kon" de acuerdo con esta invención se determina con la misma técnica de resonancia de plasmon de superficie descrita anteriormente utilizando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a 10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-iV- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y iV-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio lOmM, pH 4.8, en 5ug/ml (~0.2uM) antes de inyección a un gasto de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de inyección de etanolamina 1 para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones en serie dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con Tween-20 0.05% (PBST) a 25°C a un gasto de flujo de aproximadamente 25ul/min. Velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir 1-a-l simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensorgrama de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon- Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad de asociación excede 10^ M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad de asociación de preferencia se determina al utilizar una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno de 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo tapón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. El término "vector" como se emplea aquí, se pretende que se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la cual se introducen (por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales) . Otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula anfitriona ante introducción en la célula anfitriona u hospedera y de esta manera se replican junto con el genoma hospedero. Aún más, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Estos vectores se refieren aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes" ) . En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo está en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden emplearse en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente empleada del vector. "Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se emplea aquí en forma intercambiable, se refiere a polímeros de nucleotidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleotidos, ribonucleótidos , nucleotidos modificados o bases, y/o sus análogos o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por ADN o ARN polimeraza o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados tales como nucleotidos metilados y sus análogos. "Anticuerpo" (Abs) y "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas tipo anticuerpo que en general carecen de especificidad de antígeno. Polipéptidos del último tipo son pro ejemplo producidos a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles incrementados por mielomas. Los términos "anticuerpo" y " inmunoglobulina" se emplean en forma intercambiable en el más amplio sentido e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo anticuerpos monoclonales de longitud íntegra o intactos) , anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, multivalentes anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe con mayor detalle aquí) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado con afinidad. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco clases mayores de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden ser además divididas en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 , y etc . Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y describen en general por ejemplo por Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000) . Un anticuerpo puede ser parte de una más grande molécula de fusión, formado por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos. Los términos "anticuerpo de longitud íntegra", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se emplean aquí en forma intercambiable, para referirse a un anticuerpo en su forma intacta sustancial, no fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen la región Fe.

"Fragmento de anticuerpo" comprende solo una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción de preferencia retiene al menos una, de preferencia la mayoría o todas de las funciones normalmente asociadas con aquella porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de enlace de antígeno del anticuerpo intacto y de esta manera retiene la capacidad para ligar antígeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fe, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fe, cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como enlace FcRn, modulación de vida media de anticuerpo, función ADCC y enlace de complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, este fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de enlace de antígeno enlazado con una secuencia Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos homogéneos sustancialmente, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población, comprenden secuencias de aminoácidos esencialmente idénticas excepto por mutaciones de origen natural posible que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de los E.U.A. Número 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984) ) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donado) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de región de estructura o marco (FR= Framework Región) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo de recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables en donde todo sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos sustancialmente de todas las FRs son aquellos de una secuencia inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos de revisión y referencias citados ahí: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994). El término "región hipervariable", "HVR" , o "HV" , cuando se utiliza aquí, se refiere a las regiones de dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . Las letras "HC" y "LC" que preceden al término "HVR" o "HV" se refieren respectivamente a HVR o HV de una cadena pesada y cadena ligera. En general, anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables, tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2 , L3) . Una cantidad de delineaciones de región hipervariable están en uso y se abarcan aquí . Las regiones de determinación de complementariedad Kabat (CDRs= Complementarity Determining Regions) se basan en variabilidad de secuencia y son las más comúnmente empleadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere por el contrario a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables AbM presentan un compromiso entre los CDRs de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se utilizan por el programa de modulación de anticuerpo AbM de Oxford Molecular' s. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristal complejo disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se anotan a continuación.

Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define aquí. La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios terminales amino de cadena pesada o ligera del anticuerpo. Estos dominios en general son las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de enlace de antígeno.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia aminoácidos que corresponde a la vida de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se describió aquí. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos . Un anticuerpo "madurado de afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más HVRs del mismo que resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo por antígeno, comparado con un anticuerpo precursor que no posee esa o esas alteraciones. En una modalidad, un anticuerpo madurado de afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Anticuerpos moderados de afinidad se producen por porciones conocidas en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe maduración de afinidad por entremezclado de dominio VH y VL. Mutagénesis al azar de CDR y/o residuos de estructura se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Inmuno1. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992). Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que liga. Anticuerpos de bloqueo preferidos o anticuerpos antagonistas sustancial o completamente inhiben la actividad biológica del antígeno. Un "anticuerpo agonista" como se emplea aquí, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales del polipéptido de interés. Un "desorden" es cualquier condición que se beneficia del tratamiento. Esto incluye desordenes o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. Ejemplos no limitantes de desordenes a tratar aquí incluyen cáncer y otros desordenes proliferativos celulares. Los términos "desorden proliferativo celular" y "desorden proliferativo" se refieren a desordenes que se asocian con cierto grado de proliferación de células anormales. En una modalidad, el desorden proliferativo celular es cáncer. "Tumor" como se empela aquí, se refiere a crecimiento y proliferación de células neoplásticas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "desorden proliferativo celular", "desorden proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se refiere aquí. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por proliferación/crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosa, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello . Como se emplea aquí, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis durante el curso de patología clínica. Efectos convenientes de tratamiento incluyen el evitar ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, evitar o disminuir inflamación y/o daño de tej ido/órgano, disminuir la velocidad de avance de enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o prognosis mejorado. En algunas modalidades, se utilizan anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o desorden. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos de la sustancia/molécula son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no en forma necesaria, ya que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. El término "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una substancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de las células. El término "diagnóstico" se emplea aquí para referirse a la identificación de un estado, enfermedad o condición patológica o molecular, tal como la identificación de un desorden proliferativo celular (por ejemplo, cáncer) . El término "prognosis" se emplea aquí para referirse a la predicción de la probabilidad de síntomas de enfermedad atribuibles al desorden, incluyendo por ejemplo, recurrencia, relapso y resistencia a la droga, de una enfermedad. El término "pronóstico" se emplea aquí para referirse a la probabilidad de que un paciente responda ya sea en forma favorable o desfavorable a una droga o conjunto de drogas. En una modalidad, el pronóstico se refiere a la proporción de estas respuestas. En una modalidad, el pronóstico se refiere a si y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore después de tratamiento, por ejemplo tratamiento con un agente terapéutico particular, y por un cierto periodo de tiempo sin recurrencia a la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden emplearse en forma clínica para tomar decisiones de tratamiento al seleccionar las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para pronosticar si un paciente probablemente responda en forma favorable a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico determinado, incluyendo por ejemplo, administración de un agente terapéutico o combinación determinado, intervención quirúrgica, terapia de esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, después de un régimen terapéutico. "Respuesta del paciente" puede estimarse utilizando cualquier punto extremo indicando un beneficio del paciente, incluyendo sin limitación, (1) inhibición en cierta medida, del avance de enfermedad, incluyendo el frenado y completa detención; (2) reducción en el número de episodios y/o síntomas de enfermedad; (3) reducción en tamaño de lesión; (4) inhibición (es decir, reducción, frenado o parado completo) de infiltración de células enfermas en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir reducción, frenado o parado completo) de dispersión de la enfermedad; (6) disminución de proliferación celular, invasión o metastásis, que puede pero no tiene que resultar en la regresión o ablación de una lesión de enfermedad; (7) alivio, en cierta medida de uno o más síntomas asociados con el desorden; (8) aumento en longitud o duración de presentación libre de enfermedad después de tratamiento; y/o (9) disminuida mortalidad en un punto en tiempo determinado después de tratamiento. El término "muestra", como se emplea aquí, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que se va a caracterizar y/o identificar, por ejemplo con base en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de enfermedad" y sus variaciones se refiere a cualquier muestra que se obtiene de un sujeto de interés que se espera o se conoce que contenga la entidad celular y/o molecular que se va a caracterizar. Por "muestra de tejido o celular" se entiende una colección de células similares que se obtienen de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de muestra de tejido o celular puede ser tejido sólido tal como de una muestra de órgano o tejido fresco, congelado y/o conservado o biopsia o aspirado; sangre o cualesquiera constituyentes de sangre; fluidos corporales tales como fluido cerebro espinal, fluido amniótico, fluido peritoneal, o fluido intersticial; células de cualquier tipo en gestación o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser de células o líneas celulares primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra de tejido o celular se obtiene de un órgano o tejido enfermo. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se entre-mezclan naturalmente con el tejido en naturaleza tales como conservadores, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos o semejantes. El término "gen de mantenimiento" se refiere a un grupo de genes que codifican por proteínas cuyas actividades son esencialmente para el mantenimiento de función celular. Estos genes típicamente se expresan similarmente en todos los tipos de células. Los genes de mantenimiento incluyen, sin limitación, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) , Cypl, albúmina, actinas, por ejemplo ß-actina, tubulinas, ciclofilina, hipoxantina fosforibosiltransferasa (HRPT) , L32. 28S y 18S. Para los presentes propósitos, una "sección" de una muestra de tejido se entiende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células cortadas de una muestra de tejido. Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis de acuerdo con la presente invención, siempre que se entienda que la presente invención comprende un método con lo que la misma muestra de sección o tejido se analiza en ambos niveles morfológicos y moleculares, o se analiza con respecto tanto a proteína como ácido nucleico. Por "correlaciona" o "correlacionado" se entiende comparar en cualquier forma, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo, con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se puede utilizar el resultado de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si habrá de realizarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de enlace de proteína, se puede utilizar los resultados de análisis de enlace de proteína o protocolo para determinar si habrá de realizarse un régimen terapéutico específico . La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o fusiona directamente o indirectamente a un reactivo, tal como un anticuerpo y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. La etiqueta por sí misma puede ser detectable (por ejemplo, etiquetas radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de etiqueta enzimática, pueden catalizar alteración química de un compuesto o composición de substrato que es detectable. Técnicas ilustrativas en general Una muestra que comprende una proteína objetivo puede obtenerse por métodos bien conocidos en la especialidad, y que son apropiados para el tipo y ubicación particular de la enfermedad de interés. Biopsia de tejido a menudo se emplea para obtener una pieza representativa de tejido enfermo. En forma alterna, pueden obtenerse células indirectamente en la forma de tejidos/fluidos que se conocen o se considera que contienen las células enfermas de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de enfermedad pueden obtenerse por resección, broncoscopia, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales, o de esputo, fluido pleural o sangre. Objetivos de proteínas pueden detectarse de tejido enfermo o de otras muestras corporales tales como orina, esputo o suero. Las mismas técnicas anteriormente discutidas para detectar proteínas objetivo en muestras enfermas pueden aplicarse a otras muestras corporales. Células enfermas son desprendidas de lesiones de la enfermedad y aparecen en estas muestras corporales. Al cribar estas muestras corporales, puede lograrse un simple dianóstico temprano para estas enfermedades. Además, el avance de terapia puede supervisarse más fácilmente al probar estas muestras corporales para proteínas objetivo. En una modalidad, los métodos de la invención son útiles para detectar cualquier desorden asociado con la desregulación de HEPSINA (por ejemplo, sobre-expresión) . Los métodos de diagnóstico de la presente invención son útiles para los médicos clínicos, de manera tal que puedan decidir sobre un curso de tratamiento apropiado. Por ejemplo, una muestra de un sujeto que exhibe un alto nivel de expresión de HEPSINA aquí descrito puede sugerir un régimen terapéutico más agresivo que una muestra que exhibe un nivel de expresión comparativamente menor. Métodos de la invención pueden utilizarse en una variedad de ambientes, incluyendo por ejemplo para ayudar a un paciente a elegir durante el curso del desarrollo de droga, pronóstico de la probabilidad de éxito cuando se trata un paciente individual con un régimen de tratamiento particular, para estimar avance de la enfermedad, para supervisar eficacia de tratamiento, para determinar prognosis para pacientes individuales, para estimar predisposición de un individuo a desarrollar un desorden particular (por ejemplo, cáncer) , para diferenciar etapas de la enfermedad, etc. Métodos y ensayos típicos de la invención Los métodos y ensayos aquí descritos se dirigen al exámen de expresión de HEPSINA en una muestra de células o tejido de mamífero, en donde la determinación de esa expresión de HEPSINA es predictiva o indicativa de si la muestra de tejido o células será sensible a tratamiento con base en el uso de inhibidores de HEPSINA. Como se discutió anteriormente, hay algunas poblaciones de tipos de células humanas enfermas que están asociados con expresión anormal de HEPSINA, que está asociada con diversos desórdenes. Por lo tanto, se considera que los métodos y ensayos descritos pueden proporcionar medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en costo para obtener datos e información útiles para estimar terapias apropiadas o efectivas para tratamiento de pacientes. Por ejemplo, un paciente al que se le ha diagnosticado una condición relacionada a HEPSINA, se le puede hacer una biopsia para obtener una muestra de tejido o células, y la muestra puede ser examinada mediante diversos ensayos in vitro para determinar si las células del paciente serán sensibles a un agente terapéutico tal como un inhibidor de HEPSINA (por ejemplo, un anticuerpo anti-HEPSINA) . La invención proporciona métodos para pronosticar la sensibilidad de una muestra de células o tejido de mamífero (tal como una célula de cáncer) a un inhibidor de anti-HEPSINA. En los métodos, una muestra de células o tejido de mamífero se obtiene y examina para expresión de HEPSINA. Los métodos pueden realizarse en una variedad de formatos de ensayo, incluyendo ensayos de inmunohistoquímica . Determinación de expresión de HEPSINA en los tejidos o células será predictiva de que estas células o tejidos serán sensibles a terapia de inhibidor anti-HEPSINA. Como se discute a continuación, la expresión de HEPSINA en una muestra puede analizarse por una cantidad de metodologías, muchas de las cuales se conocen en la técnica y entienden por la persona con destreza, incluyendo pero no limitadas a análisis Western y/o inmunohistoquimico, ensayos cuantitativos basados en sangre (tal como por ejemplo ELISA de suero) (para examinar, por ejemplo, niveles de expresión de proteína) . Protocolos típicos para evaluar el estado de proteína se encuentran, por ejemplo en Ausubel et al. eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unit 15 (Inmunotransferencia) , etc. Los protocolos siguientes referentes a la detección de HEPSINA en una muestra se proporcionan para propósitos ilustrativos . ******************************* Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o prueban la presencia de HEPSINA en una muestra de células o tejido de mamífero. Una variedad de métodos para detectar HEPSINA pueden emplearse e incluyen por ejemplo, análisis inmunohistoquímico, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, análisis de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación de células activada por fluorescencia (FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting) y semejantes. Por ejemplo, un método opcional para detectar la expresión de HEPSINA en un tejido o muestra, comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de la invención, su fragmento reactivo de HEPSINA, o una proteína recombinante que contiene una región de enlace de antígeno de un anticuerpo de la invención; y después detectar el enlace de la proteína HEPSINA en la muestra. En modalidades particulares de la invención, la expresión de proteínas de HEPSINA en una muestra, se examina utilizando protocolos de tinción e inmunohistoquímica . La tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido se ha mostrado que es un método confiable para estimar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para sondear y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente por métodos cromogenicos o fluorescentes. Para la misma preparación, una muestra de tejido o de células de un mamífero (típicamente un paciente humano) puede emplearse. Ejemplos de muestras incluyen pero no están limitados a, biopsia de tejido, sangre, aspirado pulmonar, esputo, fluido linfático, etc. La muestra puede obtenerse por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a excisión, quirúrgica aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una modalidad, una muestra se fija e incrusta en parafina o semejantes. La muestra de tejido puede estar fija (es decir conservada) por metodología convencional (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 3era edición (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston División McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel , Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Una persona con destreza en la técnica apreciará que la selección de un fijador se determina para el propósito para el cual se va a teñir histológicamente la muestra o de otra forma analizar. Una persona con destreza en la técnica también apreciará que la longitud de fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador empleado. A manera de ejemplo, formalina amortiguada neutra, líquido o solución de Bouin puede emplearse para fijar una muestra. En general, la muestra primero se fija y después deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, infiltra e incrusta con medio de seccionamiento apropiado de manera tal que pueda seccionarse la muestra de tejido. Medio de seccionamiento apropiado incluirá medio que permite detección de HEPSINA bajo condiciones de detección deseadas. En forma alterna, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A manera de ejemplo, la muestra de tejido puede incrustarse y procesarse por metodología convencional (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra) . Una vez que se incrusta la muestra de tejido, la muestra puede seccionarse por un microtomo o semejante (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . A manera de ejemplo para este procedimiento, secciones pueden estar en el intervalo de aproximadamente tres mieras a aproximadamente cinco mieras en espesor. Una vez seccionadas, las secciones pueden conectarse a porta-objetos por varios métodos estándar. Ejemplos de adhesivos de porta-objetos incluyen pero no están limitados a silano, gelatina, poli-L-lisina y semej antes . Opcionalmente, subsecuente a la preparación de la muestra, puede analizarse una sección de tejido utilizando IHC. IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridización in-situ de fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, el enlace del anticuerpo al antígeno objetivo (por ejemplo EPSINA) se determina directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo etiquetado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario etiquetado con enzima, que puede visualizarse sin adicional interacción de anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, anticuerpo primario no conjugado liga al antígeno y después un anticuerpo secundario etiquetado liga al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga a una etiqueta enzimática, un substrato cromogénico o fluorogénico se agrega para proporcionar visualización del antígeno. Ocurre amplificación de señal debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario. El anticuerpo primario y/o secundario empleado para inmunohistoquímica típicamente se etiquetará con una porción detectable. Numerosas etiquetas están disponibles que pueden en general agruparse en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 1C, 125I, 3H y 131I . El anticuerpo puede etiquetarse con un radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs . (1991) por ejemplo y pueden medirse la radioactividad utilizando conteo de destelleo . (b) Partículas de oro coloidal. (c) Etiquetas fluorescentes que incluyen pero no están limitadas a, quelatos de tierra rara (quelatos de europio) , Rojo Texas, rodamina, fluoresceina, dansil, Lissamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos comercialmente disponibles tales como SPECTRUM 0RANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera uno o más de los anteriores. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. Fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro. (d) Diversas etiquetas de substrato-enzima están disponibles y la patente de los E.U.A. No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima en general cataliza una alteración química del substrato cromogénico que puede medirse utilizando diversas técnicas.

Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, que puede medirse espectrofotométricamente . En forma alterna, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminescencia del substrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describieron anteriormente. El substrato quimioluminescente se vuelve electrónicamente excitado por una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasa (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; la patente de los E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato dehidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y semejantes. Técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) . Ejemplos de combinaciones de enzima-substrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un substrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor colorante (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB = tetramethyl benzidine) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil -ß-D-galactosidasa) o un substrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-ß- D-galactosidasa) . Numerosas otras combinaciones de enzima-substrato están disponibles para aquellos con destreza en la técnica. Para una revisión general de estas, ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,275,149 y 4,318,980. En ocasiones, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. La persona con destreza estará al tanto de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro categorías amplias de etiquetas mencionadas anteriormente, pueden conjugarse con avidina, o vice versa.

La biotina liga selectivamente a avidina y de esta manera, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo en esta forma indirecta. En forma alterna, para lograr conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno . De esta manera, puede lograrse conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo. Aparte de los procedimientos de preparación de muestra discutidos anteriormente, adicional tratamiento de la sección de tejido antes de, durante o después de IHC puede ser conveniente. Por ejemplo, métodos de recuperación de epítopo, tales como calentar la muestra de tejido en amortiguador citrato, pueden llevarse a cabo (ver, por ejemplo, Leong et al. Appl . Immunohistochem. 4(3) :201 (1996) ) . Siguiendo una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpo primario por un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas de manera tal que el anticuerpo primario liga al antígeno de proteína objetivo en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para lograr esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. La extensión de enlace de anticuerpo a la muestra se determina al utilizar cualquiera de las etiquetas detectables anteriormente discutidas. De preferencia, la etiqueta es una etiqueta enzimática (por ejemplo HRPO) que cataliza una alteración química del substrato cromogénico tal como cromógeno 3 , 3 ' -diaminobenzidina . De preferencia, la etiqueta enzimática se conjuga al anticuerpo que liga específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo anti-conejo cabra) . Opcionalmente, los anticuerpos empleados en el análisis IHC para detectar expresión de EPSINA, son anticuerpos generados para ligar primordialmente a EPSINA, incluyendo por ejemplo anticuerpos de la invención. Opcionalmente, el anticuerpo anti -EPSINA es un anticuerpo monoclonal. Anticuerpos anti-EPSINA están fácilmente disponibles en la técnica, incluyendo de diversas fuentes comerciales y también pueden generarse utilizando destrezas rutinarias conocidas en la especialidad. Especímenes así preparados pueden montarse y cubreobjetos. La evaluación del porta-objetos se determina entonces, por ejemplo utilizando un microscopio y criterios de intensidad tinción, empleados rutinariamente en la especialidad pueden ser empleados. Como un ejemplo, los criterios de intensidad de tinción pueden evaluarse como sigue : TABLA A Califica Patrón de Tinción -ción No se observa tinción en las células. 0 Se detecta una tinción débil/escasamente 1+ perceptible en más de 10% de las células. Se observa una tinción débil a moderada 2+ en más de 10% de las células. Se observa una tinción moderada a fuerte 3+ en más de 10% de las células.

En métodos alternos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para EPSINA bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-EPSINA, y después detectar el complejo. La presencia de EPSINA puede ser detectada en una cantidad de formas, tales como por procedimiento de transferencia Western y ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmuno-ensayo utilizando este formato de ensayo están disponibles, ver, por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto ensayos de un solo sitio y dos sitios o "emparedado" de los tipos no competitivos, así como en los ensayos de enlace competitivo tradicionales. Estos ensayos también incluyen enlace directo de un anticuerpo etiquetado a un bio-marcador obj etivo . Ensayos emparedados están entre los ensayos más útiles y comúnmente empleados. Existe una cantidad de variaciones de la técnica de ensayo emparedado, y todas se pretenden abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo no etiquetado se inmoviliza en un substrato sólido, y la muestra a probar se pone en contacto con la molécula ligada. Después de un periodo conveniente de incubación, por un periodo de tiempo suficiente para permitir formación de complejo anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo específico para el antígeno, etiquetado con una molécula reportera, capaz de producir una señal detectable después se agrega e incuba, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo etiquetado con antígeno-anticuerpo . Cualquier material sin reaccionar se lava por arrastre, y la presencia del antígeno se determina por observación de una señal producida por la molécula reportera. Los resultados ya pueden ser cualitativos, por simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse al comparar con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de EPSINA. Variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en donde tanto la muestra como anticuerpo etiquetado se agregan simultáneamente al anticuerpo ligado. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad, incluyendo cualesquiera variaciones menores como será fácilmente aparente. En un ensayo de emparedado directo típico, un primer anticuerpo que tiene una especificidad para el antígeno ya se liga en forma covalente o pasiva a una superficie sólida. La superficie sólida típicamente es vidrio o cristal o un polímero, los polímeros más comúnmente empleados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en la forma de tubos, perlas, discos de microplacas, o cualquier otra superficie conveniente para realizar un inmuno-ensayo . Los procesos de enlace son bien conocidos en la técnica y en general consisten de enlace covalente-reticulación de entrelazamiento o adsorción física, el complejo polímero-anticuerpo se lava en preparación para la muestra de prueba. Un alícuota de la muestra a probar después se agrega al complejo de fase sólida e incuba por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones convenientes (por ejemplo de temperatura ambiente a 40 grados C tal como entre 25 grados C y 32 grados C inclusive) para permitir enlace de cualquier sub-unidad presente en el anticuerpo. Después del periodo de incubación, la fase sólida de la sub-unidad de anticuerpo se lava y seca e incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del antígeno. El segundo anticuerpo se enlaza con una molécula reportera que se utiliza para indicar el enlace del segundo anticuerpo al antígeno. Un método alterno involucra inmovilizar la proteína objetivo en la muestra y después exponer el objetivo inmovilizado a anticuerpo específico que puede o no ser etiquetado con una molécula reportera. Dependiendo de la cantidad del objetivo y la fuerza de la señal de molécula reportera, un objetivo ligado puede ser detectable por etiquetado directo con el anticuerpo. En forma alterna, un segundo anticuerpo etiquetado específico al primer anticuerpo se expone al complejo de primer anticuerpo-objetivo para formar un complejo terciario obj etivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula reportera. Por "molécula reportera", como se emplea en la presente especificación, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de anticuerpo ligado a antígeno. Las moléculas reporteras más comúnmente empleadas en este tipo de ensayo son ya sea moléculas que contienen enzimas, fluoróforos o radionúclidos (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminescentes. En el caso de un inmuno ensayo de enzimas, una enzima se conjuga al segundo anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehido o peryodato . Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes, que están fácilmente disponibles para la persona con destreza. Enzimas comúnmente empleadas incluyen peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los substratos a emplearse con las enzimas específicas en general se selecciona para la producción, ante hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear substratos fluorogénicos, que dan por resultado un producto fluorescente en vez de los substratos cromogenicos anteriormente anotados. En todos los casos, el anticuerpo etiquetado con enzima se agrega al primer complejo marcador molecular-anticuerpo, se deja ligar y después el reactivo en exceso se lava por arrastre. Una solución que contiene un substrato apropiado después se agrega al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El substrato reaccionará con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser además cuantificada, usualmente en forma espectrofotométrica, para dar una indicación de la cantidad de antígeno objetivo que estaba presente en la muestra. En forma alterna, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente con anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo etiquetado con fluorocromo adsorbe la energía de luz, induciendo un estado de excitabilidad a la molécula, seguido por emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en EIA, el anticuerpo etiquetado fluorescente se deja que ligue al primer complejo anticuerpo-antígeno . Después de lavar por arrastre el reactivo no ligado, el complejo terciario restante se expone entonces a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del antígeno objetivo de interés. Técnicas de inmunofluorescencia y EIA ambas están muy bien establecidas en la especialidad. Sin embargo, otras moléculas reporteras, tales como moléculas de radioisótopo, quimioluminescentes o bioluminescentes, también pueden emplearse. Se contempla que las técnicas anteriormente descritas también pueden emplearse para detectar expresión de EPSINA. Subsecuente a la determinación de que la muestra de tejido o de células expresa EPSINA indicando que la muestra de tejido o células será sensible a tratamiento con inhibidores de EPSINA, se contempla que una cantidad efectiva del inhibidor se pueda administrar al mamífero para tratar un desorden que aflige al mamífero. Diagnóstico en mamíferos de las diversas condiciones patológicas aquí descritos pueden realizarse por el practicante con destreza. Técnicas de diagnóstico están disponibles en la especialidad que permiten por ejemplo, el diagnóstico o detección de enfermedad en un mamífero.

Un inhibidor de HEPSINA puede administrarse de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal , intracerobroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o de inhalación. Opcionalmente, la administración puede realizarse a través de infusión de mini-bomba utilizando diversos dispositivos comercialmente disponibles. Dosis y programas efectivos para inhibidores de HEPSINA puede determinarse empíricamente, y hacer estas determinaciones está dentro de la destreza en la técnica. Pueden emplearse dosis sencillas o múltiples. Por ejemplo, una dosis o cantidad efectiva de inhibidores de HEPSINA empleada sola puede estar en el intervalo desde aproximadamente 1 :g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más por día. Ajuste en escala de dosis inter-especies puede realizarse en una forma conocida en la especialidad, por ejemplo, como se describe en Mordenti et al., Pharmaceut . Res . , 8:1351 (1991). Cuando se emplea administración in vivo de inhibidor de HEPSINA, cantidades de dosis normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, de preferencia aproximadamente 1 g/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Guía en cuanto a las dosis y métodos particulares de suministro se proporcionan en la literatura; ver, por ejemplo, las patentes de los E.U.A. números 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes desordenes, que la administración a blanco a un órgano o tejido por ejemplo, puede requerir el suministro de una forma diferente para otro órgano o tejido. Se contempla que terapias aún adicionales pueden emplearse en los métodos . La una o más otras terapias pueden incluir pero no están limitadas a, administración de agentes citotóxicos y otra norma de regímenes de cuidado para el desorden particular en cuestión. Se contempla que estas otras terapias pueden emplearse como un agente separado del inhibidor de HEPSINA. Para utilizar en las aplicaciones descritas o sugeridas anteriormente, también se proporcionan por la invención equipos o artículos de manufactura. Estos equipos pueden comprender un medio portador que esta separado por compartimientos o subdividido para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios recipientes tales como ampolletas, tubos y semejantes, cada uno de los medios de contenedores que comprenden uno de los elementos separados para utilizarse en el método. Por ejemplo, uno de los medios contenedores puede comprender una sonda que es o puede ser etiquetada en forma detectable. Esta sonda puede ser un anticuerpo de la invención. El equipo de la invención típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más otros recipientes o contenedores que comprenden materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaques con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se utiliza para una aplicación de terapia específica o no terapéutica y también pueden indicar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como aquellas descritas anteriormente. Los equipos de la invención tienen una cantidad de modalidades. Una modalidad típica es un equipo que comprende un recipiente o contenedor, una etiqueta en el contenedor, y una composición contendida dentro del contenedor; en donde la composición incluye un anticuerpo primario que liga a HEPSINA, la etiqueta en el contenedor indica que la composición pude utilizarse para evaluar la presencia de HEPSINA en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para utilizar el anticuerpo para evaluar la presencia de HEPSINA en al menos un tipo de célula de mamífero. El equipo puede además comprender un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar anticuerpo a la misma sección de una muestra de tejido. El equipo puede incluir tanto un anticuerpo primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta enzimática. Otros componentes opcionales en el equipo incluyen uno o más amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de bloque, amortiguador de lavado, amortiguador de substrato, etc) , otros reactivos tales como substrato (por ejemplo, cromógeno) que se altera químicamente por una etiqueta enzimática, solución de recuperación de epitopo, muestras de control (controles positivo y/o negativo), porta objeto(s) de control . Anticuerpos - Generalidad En general, anticuerpos anti-HEPSINA de la invención encuentran utilidad en una variedad de ambientes, incluyendo utilizados como reactivos para detección y aislamiento de HEPSINA, tales como detección de expresión de HEPSINA en diversos tipos de células y tejidos, incluyendo la determinación de densidad de HEPSINA y distribución en poblaciones celulares, y clasificación celular con base en expresión de HEPSINA. En todavía en otro aspecto, los presentes anticuerpos de anti-HEPSINA son útiles para el desarrollo de antagonistas de HEPSINA con patrones de actividad de enlace similares a aquellos de los anticuerpos objeto. Por ejemplo, anticuerpos anti-HEPSINA de la invención pueden emplearse para determinar e identificar otros anticuerpos que tienen las mismas características de enlace de HEPSINA. Como un ejemplo adicional, anticuerpos anti-HEPSINA de la invención pueden utilizarse para identificar otros anticuerpos anti-HEPSINA que ligan substancialmente el o los mismos epitopos de HEPSINA que los anticuerpos aquí ejemplificados, incluyendo epitopos lineales y de conformación. La generación de anticuerpos candidato puede lograrse utilizando destrezas rutinarias en la especialidad, incluyendo aquellas aquí descritas, tales como la técnica de hibridoma y criba de las bibliotecas de exhibición fago de moléculas aglutinantes. Esos métodos están bien establecidos en la especialidad. Brevemente, los anticuerpos de anti-HEPSINA de la invención pueden elaborarse al utilizar bibliotecas de combinación para cribar ciónos de anticuerpos sintéticos con la o las actividades deseadas. En principio, se eligen ciónos de anticuerpos sintéticos al cribar bibliotecas fago que contienen fago que exhiben diversos fragmentos de región variable de anticuerpo (Fv) fusionada a proteína de revestimiento fago. Estas bibliotecas fago son seleccionadas por ciclos de absorción-desorción mediante cromatografía de afinidad contra el antígeno deseado. Ciónos que expresan fragmentos Fv capaces de ligar al antígeno deseado se adsorben al antígeno y de esta manera separan de los ciónos que no enlazan en la biblioteca. Ciónos de enlace después se eluyen del antígeno, y además pueden enriquecerse por ciclos adicionales de adsorción/elución de antígeno. Cualquiera de los anticuerpos anti-HEPSINA de la invención puede obtenerse al diseñar un procedimiento de criba de antígeno conveniente para seleccionar el clon fago de interés seguido por construcción de un clon de anticuerpo anti-HEPSINA de longitud integra utilizando las secuencias Fv del clon fago de interés y secuencias de región constante convenientes (Fe) descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Ver también la publicación de PCT Pub. WO03/102157, y las referencias ahí citadas . En una modalidad, anticuerpos anti-HEPSINA de la invención son monoclonales . También abarcados dentro del alcance de la invención son fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab, Fab ' , Fab'-SH y F(ab')2, y sus variaciones, de los anticuerpos anti-HEPSINA aquí suministrados. Estos fragmentos de anticuerpo pueden crearse por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o pueden generarse por técnicas recombinantes . Estos fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos, humanos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para propósitos de diagnostico y terapéuticos aquí establecidos. Anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Los anticuerpos monoclonales de anti-HEPSINA de la invención pueden elaborarse utilizando una variedad de métodos conocidos en la especialidad, incluyendo el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) , o en forma alterna pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 4,816,567). Vectores, Células Hospederas y Métodos Recombinantes Para producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que codifica se aisla e inserta en un vector replicable para adicional clonación (amplificación del ADN) o para expresión. ADN que codifica el anticuerpo se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Están disponibles muchos vectores. La selección de vector depende en parte de la célula hospedera a emplear. En general, células hospederas preferidas son de origen ya procariotico o eucariótico (en general de mamífero) . Generación de anticuerpos utilizando células hosperederas procarióticas Construcción de Vector Secuencias polinucleótido que codifican polipéptidos (anticuerpos) de la invención pueden obtenerse utilizando técnicas recombinantes estándar. Secuencias de polinucléotidos deseadas pueden aislarse y secuenciarse de células que producen anticuerpo tales como células de hibridoma. En forma alterna, polinucléotidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de nucleótido o técnicas PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capas de replicar y expresar polinucléotidos heterologos en hospederos procarioticos. Muchos vectores que están disponibles y conocidos en la especialidad pueden emplearse con el propósito de la presente invención. Selección de un vector apropiado dependerá primordialmente del tamaño de los ácidos nucleicos a insertar en el vector y la célula anfitriona u hospedera particular que va a transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterologo, o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedera particular en donde reside. Los componentes de vector en general incluyen, pero no están limitado a: un origine de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de enlace de ribosoma (RBS = ribosome binding site) , una secuencia de señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de transcripción. En general, vectores plásmido que contiene secuencias de control y replicón que se derivan de especies compatibles con la célula hospedera, se utilizan en conexión con estos hospederos. El vector ordinariamente transporta un sitio de replicación, así como secuencias de marcado que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transformada utilizando pBR322, un plásmido derivado de especies E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y a tetraciclina (Tet) y de esta manera proporcionan fáciles medios para identificar células transformadas. pBR322, sus derivdos u otros plásmidos microbinos o bacteria fago también pueden contener, o ser modificados para contener, promotores que pueden emplearse por el organismo microbiano para expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados pBR322 utilizados para expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Cárter et al., patente de los E.U.A. número 5,648,237. Además, vectores fago que contienen secuencias de control y replicón que son compatibles con el microorganismo anfitrión u hospedero, pueden utilizarse como vectores de transformación en conexión con estos hospederos. Por ejemplo, bacteriófago tal como AGEM.TM.-ll puede utilizarse para producir un vector recombinante que puede utilizarse para transformar células hospederas susceptibles tales como E. coli LE392. El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de un promotor-cistrón, que codifican a cada uno de los componentes polipéptido. Un promotor es una secuencia regulatoria sin traducción situada corriente arriba (5') a un cistrón que modula su expresión. Promotores procarióticos típicamente caen en dos clases, inducible y constitutiva. Un promotor inducible es un promotor que inicia niveles incrementados de transcripción del cistrón bajo su control, en respuesta a cambios en la condición de cultivo, por ejemplo en la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura . Una gran cantidad de promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales son bien conocidos. El promotor selecto puede enlazarse operativamente a ADN cistrón que codifica la cadena pesada o ligera al retirar el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzima de restricción e insertar la secuencia promotora aislada en un vector de la invención. Tanto la secuencia promotora nativa y muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para amplificación y/o expresión directa de los genes objetivo. En algunas modalidades, promotores heterólogos se utilizan, ya que en general permiten mayor transcripción y superiores rendimientos de gen objetivo expresado en comparación con el promotor polipéptido objetivo nativo . Promotores adecuados para utilizar con anfitriones u hospederos procarióticos incluye el promotor PhoA, los sistemas promotores ß -galactamasa y lactosa, un sistema promotor triptófano (trp) y promotores híbrido tales como el promotor tac o trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o fago conocidos) son adecuados por igual. Sus secuencias nucleótido se han publicado, de esta manera permitiendo a una persona con destreza ligarlos operativamente a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada objetivo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualesquiera sitios de restricción requeridos. En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la traslocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN polipéptido objetivo que se inserta en el vector. La secuencia de señal selecta para el propósito de esta invención deberá ser aquella que se reconoce y procesa (es decir escinde por una señal peptidasa) por la célula hospedera. Para células hospederas procarióticas que no reconocen y procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, penicilinasa, pp, o líderes de enterotoxina II (STII) termo estables, LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una modalidad de la invención, la secuencia de señal empleada en ambos cistrones del sistema de expresión para son secuencias de señal STII o sus variantes. En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención puede ocurrir en el citoplasma de la célula hospedera, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. En este aspecto, cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina se expresan, doblan y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas sepas hospederas (por ejemplo, las cepas E. coli trxB') proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para formación de enlace disulfuro, de esta manera permitiendo un adecuado doblado y ensamblado de sub unidades de proteína expresadas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995) . Anticuerpos de la invención también puede producirse al utilizar un sistema de expresión en donde la proporción cuantitativa de componentes polipéptido expresados pueden modularse a fin de llevar al máximo el rendimiento de anticuerpos ensamblados secretados y adecuadamente ensamblados de la invención de la invención. Esta modulación se logra al menos en parte por fuerzas de traslación-modulación simultáneas para los componentes polipéptido. Una técnica para modular la fuerza de producción se describe por Simmons et al., patente de los E.U.A. número 5,840,523. Utiliza variantes de la región de inicio de producción (TIR= translational initiation región) dentro de un cistrón. Para una TIR determinada, una serie de variantes de secuencia de aminoácido o ácido nucleico puede crearse con un rango de fuerzas de traducción, de esta manera proporcionando un medio conveniente por el cual se ajusta este factor para el nivel de expresión deseado de la cadena específica. Variantes TIR pueden generarse por técnicas de mutagénesis convencional que resultan en cambios de codón que pueden alterar la secuencia de aminoácidos, aunque cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos se prefieren. Alteraciones en la TIR pueden incluir por ejemplo alteraciones en el número o espaciamiento de secuencias Shine-Dalgarno, junto con alteraciones con la secuencia de señal . Un método para generar secuencias de señal mutantes es la generación de un "banco de codones" al inicio de una secuencia de codificación que no cambia la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal (es decir, los cambios son silenciosos) . Esto puede lograrse al cambiar la posición del tercer nucleótido de cada codón; adicionalmente, algunos aminoácidos tales como leucina, serina y arginina tienen múltiples posiciones primera y segunda que pueden agregar complejidad al hacer el banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle por Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol . 4:151-158. De preferencia, un conjunto de vectores se genera con un intervalo de fuerza de TIR para cada cistrón. Este conjunto limitado proporciona una comparación de niveles de expresión de cada cadena así como el rendimiento de cada uno de los productos de anticuerpo deseados bajo diversas combinaciones de fuerza TIR. Fuerzas TIR pueden determinarse al cuantificar el nivel de expresión de un gen reportero como se describe en detalle por Simmons et al. Patente de los E.U.A. número 5, 840,523. Con base en la comparación de fuerza de traducción, las TIRs individuales deseadas se eligen para combinarse en una construcción de vector de expresión. Células anfitrionas procarióticas adecuadas para expresión de anticuerpos de la invención, incluyen Arqueobacterias y Eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (e.g., E. coli) , Bacilos (e.g., B. subtilis) , Enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus . En una modalidad, se utilizan células Gram negativas. En una modalidad, células de E. coli se utilizan como anfitriones para la invención. Ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol . 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987) , pp. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27,325) y sus derivados incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ??p???? (nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de los E.U.A. número 5,639,635). Otras cepas y sus derivados tales como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31,537) y E. coli RV308 (ATCC 31,608) también son adecuados. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas que tienen genotipos diferentes se conocen en la especialidad y describen por ejemplo por Bass et al., Proteins, 8^:309-314 (1990). En general es necesario seleccionar las bacterias apropiadas tomando en consideración la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, especies de E. coli, Serratia, o Salmonella pueden ser empleadas convenientemente como el anfitrión cuando plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 se utilizan para suministrar el replicón. Típicamente a la célula hospedera deberá secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas e inhibidores de proteasa adicionales pueden incorporarse convenientemente en el cultivo celular. Producción de Anticuerpo Células hospederas se transforman con los vectores de expresión anteriormente descritos y cultivan en medio nutriente convencional según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Transformación significa introducir ADN en el anfitrión u hospedero procariótico de manera tal que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extracromosomal o por integrante cromosomal . Dependiendo de la célula hospedera empleada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para estas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio generalmente se utiliza para células bacterianas que contienen barreras de pared celular substanciales. Otro método para transformación emplea polietilen glicol/DMSO. Todavía otra técnica utilizada es electroporación. Células procarióticas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención se desarrollan en medios conocidos en la técnica y adecuados para cultivo de las células anfitrionas selectas. Ejemplos de medios convenientes incluyen caldo luria (LB= luria broth) más los suplementos nutrientes necesarios. En algunas modalidades, el medio también contiene un agente de selección, seleccionado con base en la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente crecimiento de células procarióticas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se agrega ampicilina al medio para cultivo de células que expresan gen resistente a ampicilina. Cualesquiera suplementos necesarios además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, también pueden incluirse a concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno complejo. Opcionalmente , el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste de glutationa, cisteínas cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotritol.

Las células hospederas procarióticas se cultivan a temperaturas convenientes. Para crecimiento de E. coli, por ejemplo la temperatura preferida está en un intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39°C, de preferencia de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37°C, de preferencia de aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo primordialmente del organismo hospedero. Para E. coli, el pH puede ser de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.4 o aproximadamente 7.0. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, se induce expresión de proteína bajo condiciones convenientes para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se utilizan promotores PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos . De acuerdo con esto, las células hospederas transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para inducción. En una modalidad, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P (ver e.g., Simmons et al., J. I munol. Methods (2002), 263:133-147). Una variedad de otros inductores puede emplearse de acuerdo con la construcción de vector empleada, como se conoce en la especialidad. En una modalidad, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en y recuperan del periplasma de las células hospederas. Recuperación de proteínas típicamente involucra romper el microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que se rompen las células pueden retirarse desechos celulares o células enteras mediante centrifugación o filtración. Las proteínas además pueden ser purificadas, por ejemplo mediante cromatografía de resina de afinidad. En forma alterna, las proteínas pueden transportarse en medio de cultivo y aislarse ahí. Pueden retirarse células del cultivo y el sobrenadante del cultivo se filtra y concentra para adicional purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden ser además aislados e identificados utilizando métodos comúnmente conocidos tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE= polyacrylamide gel electrophoresis) y ensayo de transferencia western. En un aspecto de la invención, se conduce producción de anticuerpo en una gran cantidad por un proceso de fermentación. Diversos procedimientos de fermentación por lotes alimentados a gran escala están disponibles para producción de proteínas recombinantes . Fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, de preferencia aproximadamente 1,000 a 100,000 litros de capacidad. Estos termentadores utilizan impulsores de agitador para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energía preferida) .

Fermentación a escala pequeña se refiere en general a fermentación en un termentador que no es más de aproximadamente 100 litros en capacidad volumétrica y puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros. En un proceso de fermentación, la inducción de expresión de proteína típicamente se inicia después de que las células se han desarrollado bajo condiciones convenientes a una densidad deseada, por ejemplo una OD550 de aproximadamente 180-220, en cuya etapa las células están en la fase estacionaria temprana. Puede emplearse una variedad de inductores, de acuerdo con la construcción de vector empleada, como se conoce en la técnica y describió anteriormente. Pueden desarrollarse células por periodos más cortos antes de inducción. Las células usualmente se inducen por aproximadamente 12-50 horas, aunque puede emplearse tiempos de inducción más largos o más cortos. Para mejorar el rendimiento y calidad de producción de los polipéptidos de la invención, pueden modificarse diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el armado y plegado adecuado de los polipéptidos de anticuerpos secretados, vectores adicionales que sobre-expresan proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis, trans-isomerasa con actividad chaperona) pueden emplearse para co-transformar las células procarióticas hospederas. Las proteínas chaperonas han demostrado que facilitan el plegado y solubilidad adecuados de las proteínas heterólogas producidas en células hospederas bacterianas. Chen et al. (1999) J" Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente de los E.U.A. número 6,083,715; Georgiou et al., Patente de los E.U.A. número 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol . Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J". Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. Para reducir al mínimo la proteolisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles) , ciertas cepas hospederas deficientes para enzimas proteolíticas pueden emplearse para la presente invención, por ejemplo, cepas de células hospederas pueden modificarse para efectuar una o varias mutaciones genéticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y sus combinaciones. Algunas cepas deficientes en proteasa de E. coli están disponibles y se describen por ejemplo en Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente de los E.U.A. número 5,264,365; Georgiou et al., Patente de los E.U.A. número 5,508,192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2 :63-72 (1996) .

En una modalidad, cepas de E.coli deficientes para enzimas proteolíticas y transformadas con plasmados que sobre-expresan una o más proteínas chaperonas, se utilizan como células anfitrionas u hospederas en el sistema de expresión de la invención. Purificación de Anticuerpos En una modalidad, un anticuerpo producido aquí se purifica adicionalmente para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas para adicionales ensayos y usos. Métodos de purificación de proteínas estándar conocidos en la especialidad pueden emplearse. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación convenientes: fraccionación o inmunoafinidad o columnas de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o resina de intercambio de cationes tales como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio y filtración de gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75. En un aspecto, proteína A inmovilizada en una fase sólida se utiliza para purificación de inmunoafinidad de los productos de anticuerpo de la invención. Proteína A es una proteína de pared celular de 41kD de Staphylococcus áureas, que liga con alta afinidad a la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol . Meth. 62:1-13. La fase sólida a la cual la proteína A se inmoviliza puede ser una columna que comprende una superficie de sílice o vidrio, o una columna de vidrio con poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se reviste con un reactivo tal como glicerol, para evitar posiblemente adherencia no específica de contaminantes. Como la primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular como se describió anteriormente puede aplicarse en una fase sólida inmovilizada con proteína A para permitir enlace específico del anticuerpo de interés a proteína A. La fase sólida entonces será lavada para retiro de contaminantes no ligados específicamente a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida por elusión. Generación de anticuerpos utilizando células hospederas eucarióticas : Los componentes vector generalmente incluyen pero no están limitados a uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de secuencia de señal Un vector para utilizar en una célula hospedera eucariótica también puede contener una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de decisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido de interés.

La secuencia de señal heteróloga seleccionada, en general es aquella que se reconoce y procesa (es decir escinde por una señal peptidasa) por la célula hospedera. En expresión de células de mamífero, secuencias de señal de mamífero así como líderes secretores virales, por ejemplo la señal gD de herpes simples están disponibles. El ADN para esta región precursora se liga en un marco de lectura a ADN que codifica el anticuerpo. (ii) Origen de replicación En general , no se requiere un componente de origen de replicación para vectores de expresión de mamífero. Por ejemplo, el origen SV40 típicamente puede emplearse solo debido a que contiene el promotor temprano. (iii) Selección de componente de gen Vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotrópicas de complemento, cuando sea relevante o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para frenar el crecimiento de una célula hospedera. Esas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a droga y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan las drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores de selección convenientes para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico anticuerpo tal como DHFR, timidina quinasa, metalotionina- I y -II (por ejemplo genes de metalotionina de primate), adenosina deaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR pueden primero identificarse al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Células hospederas apropiadas cuando se emplea DHFR tipo silvestre incluyen por ejemplo la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR (e.g., ATCC CRL-9096) . En forma alterna, células hospederas (particularmente hospederos de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias ADN que codifican un anticuerpo, proteína DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como 3 ' -fosfotransferasa (APH) , pueden seleccionarse por crecimiento celular del medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosílico, por ejemplo canamicina, neomicina o G418. Ver patente de los E.U.A. número 4,965,199. (iv) Componente promotor Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y se enlaza operativamente con ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, un anticuerpo) . Secuencias promotoras se conocen por eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sito en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos esta una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola poli A al extremo 3 ' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son convenientemente insertadas en vectores de expresión eucarióticos. Transcripción de anticuerpo polipéptido de los vectores en células hospederas de mamífero, puede ser controlada, por ejemplo, por promotores que se obtienen de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de postulación avícola, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B y Virus de Simio 40 (SV40 = Simian Virus 40 ) , de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en hospederos de mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como un vector, se describe en la Patente de los E.U.A. número 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de los E.U.A. número 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en expresión de ADNc ß - interferona humana en células de ratón bajo el control de un promotor timidina quinasa, del virus herpes simplex. En forma alterna, la repetición terminal larga del virus Rous Sarcoma puede ser empleada como el promotor. (v) Componente elemento mejorador La transcripción de ADN que codifica un anticuerpo polipéptido de la invención por superiores eucariotas a menudo puede incrementarse al insertar una secuencia mej oradora en el vector. Muchas secuencias mej oradoras ahora se conocen de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a -fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizara un mejorador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270) , el mejorador promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador polioma en el lado tardío del origen de replicación, y mej oradores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en elementos mej oradores para activación de promotores eucarióticos . El mejorador puede dividirse en el vector en una posición 51 o 3 ' a la secuencia que codifica el anticuerpo polipéptido, pero en general se ubica en sitio 5' del promotor. (vi) Componente de terminación de transcripción Vectores de expresión empleados en células anfitrionas eucarióticas, típicamente también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles de regiones sin traducción 51 y ocasionalmente 3', de los ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótido transcritos como fragmentos de poliadenilación en la porción sin traducción del ARNm que codifica un anticuerpo. Una componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino. Ver WO94/11026 y el vector de expresión ahí descrito. (vii) Selección y transformación de células anfitrionas Células anfitrionas u hospederas convenientes para clonar o expresar el ADN en los vectores presentes incluyen células eucarióticas superiores aquí descritas, incluyendo células de hospederos vertebrados. Propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles son la línea de riñon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)) ; células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Repord. 23:243-251 (1980) ) ; células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Células hospederas se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritas para producción de anticuerpo y cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencia deseadas. (viii) Cultivado de las células hospederas Las células hospederas empleadas para producir un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Minimal Essential Médium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio Eagle modificado con Dulbecco ( (DMEM = Dulbecco's Modified Eagle 1 s Médium), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), en las Patentes de los E.U.A. números 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; O 90/03430; WO 87/00195; o en la Patente de los E.U.A. número 30,985 pueden emplearse como medios de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCIN" ) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos a concentraciones apropiadas que serán conocidas por aquellos con destreza en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y semejantes, son aquellos previamente empleadas con la célula hospedera seleccionada para expresión, y serán aparentes para la persona con destreza ordinaria en la especialidad. (ix) Purificación de anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente o secretada en forma directa al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los deshechos de partículas, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, en general se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, en general sobrenadantes de estos sistemas de expresión primero se concentran utilizando un filtro para concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y antibióticos pueden incluirse para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo preparada de las células puede purificarse utilizando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es una técnica de purificación generalmente aceptable. La conveniencia de los reactivos de afinidad tales como proteína A como un ligando de afinidad, depende de las especies e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fe que esté presente en el anticuerpo. Proteína A puede emplearse para purificar proteínas que se basan en cadenas pesadas ??, ?2 o ? humanas (Lindmark et al., J. Im unol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ? 3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se conecta el ligando de afinidad es más a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Mecánicamente, matrices estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) benzeno permiten gastos de flujo más rápidos y más cortos tiempos de procesamiento que los que se logran con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABXMR (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación etanol, HPLC fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSEMR cromatografía en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromato de enfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. Siguiendo cualesquiera etapa o etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes, puede someterse a etapas adicionales de purificación, según sea necesario, por ejemplo por cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, en general realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M de sal) . Deberá de notarse que en general , técnicas y metodologías para preparar anticuerpos para utilizar el uso de investigación, prueba y clínicas están bien establecidas en la especialidad, consistentes con lo anterior y/o según se requiere apropiado por una persona con destreza en la técnica para el anticuerpo de interés particular. Ensayos de actividad Anticuerpos de la invención pueden caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas por diversos ensayos conocidos en la especialidad. Anticuerpos purificados pueden ser además caracterizados por una serie de ensayos incluyendo, pero no limitados a, secuenciado N-terminal, análisis de amino ácido, cromatografía de líquido con alta presión-exclusión de tamaño sin desnaturalización (HPLC) , espectrometría de masas, cromatografía de intercambio de iones y digestión con papaína . Cuando sea necesario, se analizan anticuerpos por su actividad biológica. En algunas modalidades, anticuerpos de la invención se prueban por su actividad de enlace de antígeno. Los ensayos de enlace de antígeno que se conocen en la técnica y que pueden emplearse aquí, incluyen sin limitación cualesquiera ensayos de enlace directos o competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias western, radioinmunoensayos , ensayo de inmnosorbente enlazado con enzima (ELISA = enzyme linked immnosorbent assay) , inmunoensayos de "emparedado", ensayo de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. En una modalidad, la invención contempla un anticuerpo alterado que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que lo hacen un candidato conveniente para muchas aplicaciones en donde la vida media del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas. En ciertas modalidades, las actividades Fe del anticuerpo se miden para asegurar que solo se mantengan las propiedades deseadas . Ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo, pueden realizarse para confirmar la reducción/agotamiento de actividad CDC y/o ADCC. Por ejemplo, ensayos de enlace de receptor Fe (FcR) pueden realizarse para asegurar que el anticuerpo carece de enlace Fc R (por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero retienen la actividad de enlace FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fe/ de retrazo humano solo, mientras que los monocitos expresan Fc/RI, Fc RII y Fe/ RUI. Expresión FcR en células hematopoiéticas se resume en la Tabla 3 en página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. I munol 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en las patentes de los E.U.A. números 5,500,362 o 5,821,337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = peripheral blood mononuclear cells) y células destructoras naturales (NK = Natural Killer) . En forma alterna, o adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como los descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Ensayos de enlace Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de ligar Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. Para estimar activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J". Immunol. Methods 202:163 (1996), puede realizarse. Enlace de FcRn y determinaciones de vida media/liberación in vivo también pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la especialidad. Anticuerpos Humanizados La invención abarca anticuerpos humanizados. Diversos métodos para humanizar anticuerpos no humanizados se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos amino ácidos introducidos de una fuente que no es humana. Estos residuos amino ácidos no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". Humanización puede ser realizada esencialmente de siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) iVature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), al sustituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. número 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable de anticuerpo intacto se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores . La selección de dominios variables humanos tanto ligeros como pesados para utilizarse en producir los anticuerpos humanizados, puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método así denominado "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se criba contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como el marco humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Inmuno1. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede emplearse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Iwmunol., 151:2623. Además en general es conveniente que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con el método, anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de la secuencia precursora y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben probables estructuras de conformación tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidato selectas. La inspección de estas exhibiciones permiten análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antigeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias de importación y recipiente de manera tal que la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el o los antígenos objetivo se logre. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados en forma directa y no substancialmente en influenciar enlace de antígeno. Variantes de Anticuerpo En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en la interfase de polipéptidos Fe que comprenden la región Fe, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fe y una cavidad en un segundo polipéptido Fe, en donde la protuberancia se ubica en la cavidad para promover complejado del primer y segundo polipéptidos Fe. Métodos para generar anticuerpos con estas modificaciones se conoce en la especialidad, por ejemplo como se describe en la patente de los E.U.A. Número 5,731,168. En algunas modalidades, se contemplan una o varias modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan al introducir cambios de nucleótidos apropiados en el anticuerpo-ácido nucleico o por síntesis de péptidos. Estas modificaciones incluyen por ejemplo eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos-anticuerpo presentes al tiempo de en que se hizo la secuencia. Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, un residuo o grupos de residuos objetivos se identifican (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazan por un aminoácido con carga neutra o negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Esas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son entonces refinadas por introducción adicional u otras variantes en, o para los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no requiere ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio determinado, mutagénesis al azar o de exploración ala se realiza en el codón o región objetivo y las inmunoglobulinas expresadas se criban por la actividad deseada. Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones terminal amino y/o carboxilo en el intervalo en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen 100 o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula anticuerpo incluye la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero también se contemplan alteraciones FR. Sustituciones conservadoras se ilustran en la Tabla A bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla B, o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a clases de aminoácidos, pueden introducirse y los productos cribarse. TABLA B Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) Val; Leu; He Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Gln Arg Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; He; Val; He Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; He Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Tyr Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val ; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met ; Phe; Leu Ala; Norleucina Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) en una unión de la cadena lateral . Aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed. , pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acídicos: Asp (D) , Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) De forma alterna, residuos de origen natural pueden dividirse en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílieos Neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe . Sustituciones no conservadoras involucrarán intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o en forma más preferible en los sitios restantes (no conservados) . Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para adicional desarrollo tendrán propiedades biológicas modificadas (por ejemplo mejoradas) respecto al anticuerpo precursor del cual se generan. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución involucra maduración de afinidad utilizando exhibición fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos así generados se exhiben de partículas fago filamentosas como fusiones para al menos parte de una proteína de revestimiento fago (por ejemplo el producto de gen III de M13) empacada dentro de cada partícula. Las variantes de exhibición fago después se criban por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace) como se describe aquí. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidato para modificación, puede realizarse mutagénesis de exploración (por ejemplo exploración de alanina) para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace de antígeno. En forma alterna o adicional, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo aquellas aquí elaboradas. Una vez que estas variantes se generan, el panel de variante se somete a criba utilizando técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo aquellas aquí descritas y anticuerpos con propiedades superiores en una o más ensayos relevantes, pueden seleccionarse para adición al desarrollo.

Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo, se preparan por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Estos métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuerte natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagelesis mediada por oligonucleótido (o dirigida por sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cassette, de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser conveniente introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fe de anticuerpos de la invención, de esta manera generando una variante de región Fe . La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo una región Fe IgGl , IgG2 , IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido incluyendo la de una cisteína bisagra. De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de las especialidad, se contempla que en algunas modalidades, un anticuerpo de la invención puede comprender una o más alteraciones en comparación con el anticuerpo contraparte del tipo silvestre, por ejemplo en la región Fe. Estos anticuerpos sin embargo retienen sustancialmente las mismas características requeridas para utilidad terapéutica en comparación con su contra parte de tipo silvestre. Por ejemplo, se considera que ciertas alteraciones pueden realizarse en la región Fe que resulten en enlace Clq alterado (es decir ya sea mejorado o disminuido) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC= Complement Dependent Cytotoxicity) , por ejemplo, como se describe en 099/51642. Ver también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); patente de los E.U.A. Número 5,648,260; patente de los E.U.A. Número 5,624,821; y W094/29351 referentes a otros ejemplos de variantes de región Fe. Inmunoconjugados En otro aspecto, la invención proporciona inmunoconjugados o conjugados de droga-anticuerpo (ADC= Antibody-Drug Conjugates) , que comprende un- anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una droga, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano fungal de planta o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo (es decir un radioconjugado) . El uso de conjugados anticuerpo-droga para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos , es decir drogas para exterminar o inhibir células de tumor en el tratamiento de cáncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; patente de los E.U.A. Número 4,975,278) permiten el suministro dirigido de la porción de droga a tumores, y acumulación intracelular ahí, en donde la administración sistémica de estos agentes de droga no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como células de tumor que se buscan eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986) :603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review, " in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506) . Se busca de esta manera máxima eficacia con mínima toxicidad. Tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . Immunother. , 21:183-87). Drogas empleadas en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Las toxinas empleadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina de difteria, toxinas de plantas tales como resina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cáncer Inst . 92 (19) : 1573 -1581 ; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). La toxinas pueden lograr sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen enlace a tubolina, enlace de ADN, o inhibición de topoisomerasa . Algunas drogas citotóxicas tienden a ser inactivas o menos activas cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteína . ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal kappa IgGl 1 murino dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos normales y malignos B y radioisótopo 11:LIn o 90Y que se liga por un quelador enlazador de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7) : 766-77 ; Wiseman et al (2002) Blood 99 (12) :4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol . 20 (10) :2453-63; Witzig et , al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) : 3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no Hodgkin de célula B (NHL= Non-Hodgkin' s Lymphoma) , la administración resulta en citopenias severas y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) , un conjugado de droga-anticuerpo compuesto de un anticuerpo hu CD33 enlazado a calicheamicina, se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7) :686; patente de los E.U.A. Números. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-droga compuesto del anticuerpo huC242 enlazado mediante un enlazador disulfuro SPP a la porción de droga maitansinoide, DM1 se prueba para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico, y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-droga compuesto del anticuerpo monoclonal antígeno-membrana específico antidroga (PSMA) enlazado a la porción de droga maitansinoide, DM1 se prueba para el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los auristatina péptidos, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos a Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos a CD30 en malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7) : 778-784) y están bajo desarrollo terapéutico. Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados aquí se describen (anteriormente) . Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de fitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y tricotecenos . Ver, por ejemplo, O 93/21232 publicada en octubre 28, 1993. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldéhido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotóxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil -3 -metildietilen triaminpentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) en un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. Ver O94/11026. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, maitansinoides , dolostatinas, aurostatinas, un tricoteceno, y CC1065, y derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también aquí se contemplan. Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas maitansinoides . Maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir polimerización de tubulina. Maitansina, primero se aisló del arbusto africano oriental Maytenus serrata (patente de los E.U.A. Número 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y C-3 maitansinol ásteres (patente de los E.U.A. Número 4,151,042). Maitansinol y sus derivados y análogos sintéticos se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Números 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533. Porciones de droga maitansinoide son porciones de drogas atractivas en conjugados de droga anticuerpo debido a que son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) susceptibles a derivatización con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro a anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) efectivos contra una variedad de líneas de células de tumor. Modalidades ejemplares de las porciones de droga maitansinoide incluyen: DM1 ; DM3; y DM4. Inmunoconjugados que contienen maitansinoides , métodos para producirlos y su uso terapéutico se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Números 5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Liu et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. El conjugado se encuentra que es altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumor en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en donde se conjugan maitansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que liga a un antígeno en líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que liga al oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea de cáncer de células de mama humana SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar a la droga maitansinoide, que puede incrementarse al aumentar el número de moléculas maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones. Conjugados de anticuerpo-maitansinoide, pueden prepararse por enlace químico de un anticuerpo con una molécula maitansinoide, sin disminuir significativamente la actividad biológica ya sea del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,208,020 (la descripción de la cual aquí se incorpora expresamente por referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejore la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. aitansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislamiento de fuentes naturales. Maitansinoides convenientes se describen por ejemplo en la patente de los E.U.A. número 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones que no son de patente referidas previamente. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinol, tales como diversos ésteres de maitansinol . Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para producir conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo por ejemplo aquellos descritos en la patente de los E.U.A. número 5,208,020 o la patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992), y en la solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 10/960,602, presentada en Octubre 8, 2004, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC pueden prepararse como se describe en la solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 10/960,602, presentada en Octubre 8, 2004. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábil, o grupos esterasa lábil, como se describe en la patentes anteriormente identificadas, grupos disulfuro y tioéter se prefieren. Grupos enlazadores adicionales se describen y ejemplifican aquí. Conjugados del anticuerpo y mantansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de (amidoésteres tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilenediamina) , diisocianatos tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenzene) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4 - (2 -piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador puede conectarse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Puede formarse un enlace éster por reacción con un grupo hidorxil utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo maitansinol . Auristatinas y Dolastatinas En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a dolastatinas o a análogos peptídicos de dolastatina y derivados, las auristatinas (patentes de los E.U.A. números 5635483; 5780588). Dolastatinas y auristatinas se ha mostrado que interfieren con las dinámicas de microtúbulos , hidrólisis GTP, y división nuclear y celular ( oyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12) : 3580-3584) y tienen actividad anti cáncer (patente de los E.U.A. número 5663149) y anti fungal (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción de droga dolastatina o auristatina pueden conectarse al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxil) de la porción de droga peptídica ( O 02/088172) . Modalidades de auristatina ejemplares incluyen las porciones de droga monometil auristatina DE y DF enlazadas con extremo N descritas en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 10/983,340, presentada en Noviembre 5, 2004, la descripción de la cual se incorpora expresamente por referencia en su totalidad. Modalidades de auristatina ejemplares son MMAE y MMAF. Modalidades ejemplares adicionales comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes enlazadores (descritos adicionalmente aquí) Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE y Ab-MC-MMAF. Típicamente pueden prepararse porciones de droga basadas en péptido al formar enlace péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos péptido. Estos enlaces péptido pueden prepararse por ejemplo de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (ver E. Schróder and K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de química de péptidos. Las porciones de drogas auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de la patente de los E.U.A. ; patente de los E.U.A. número 5635483; patente de los E.U.A. número 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc . 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; and Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans . 1 5:859-863. Ver también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7) :778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", solicitud de patente de los E.U.A. número de serie presentada en Noviembre 5, 2004, aquí incorporada por referencia en su totalidad (describiendo por ejemplo enlazadores y métodos para reparar compuestos monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados con enlazadores) . Calicheamicina En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos calicheamicina es capaz de producir ruptura de ADN de doble hebra en concentraciones sub-pico molar. Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina, ver las patentes de los E.U.A. números 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden emplearse incluyen pero no están limitados a ???, a2?, a3?, N-acetyl-??? , PSAG and T?? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de los E.U.A. anteriormente mencionadas otorgadas a American Cyanamid) . Otra droga anti-tumor con la que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente sus defectos citotoxicos. Otros agentes citotoxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, streptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de los E.U.A. números 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de los E.U.A. número 5, 877,296) . Toxinas y sus fragmentos enzimáticamente activos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de mormodica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver por ejemplo WO 93/21232 publicada en Octubre 28, 1993. La presente invención además contempla un inmunoconjugado formado entre Un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como deoxiribonucleasa; DNasa) Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios de escintográficos , por ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocido como formación de imagen por resonancia magnética, RI) tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, fluoro-19, carbono-13, nitrógeno-15 , ox£geno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio etiquetas u otras pueden incorporarse en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos convenientes que involucran por ejemplo flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como tc99m o I123, .Re186, Re188 y In111 pueden conectarse mediante un residuo cisteína en el péptido. Itrio-90 puede conectarse mediante un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede emplearse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) describe otro método en detalle.

Conjugados del anticuerpo y agentes citotóxico, pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , ésteres activos tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldeído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazonobenzoil) -etilenediamina) , diisocianatos tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina resina puede prepararse como se describe en Vitetta et al . , Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminepentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14, es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver O94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene bisulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente de los E.U.A. número ,208,020) puede emplearse. Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no están limitados a ADC preparado con reactivos de entrelazadores : BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS , sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidil - (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. , U.S.A) . Ver páginas 467-498, 2003-2004 Manual de Aplicaciones y Catálogo. Preparación de conjugados de droga-anticuerpo En los conjugados de anticuerpo-droga (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga con una o más porciones de droga (D) , por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 20 porciones de droga por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . El ADC de la fórmula I puede prepararse por varias rutas, empleando reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por aquellos con destreza en la especialidad, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico del anticuerpo con u reactivo enlazador bivalente para formar Ab-L mediante un enlace covalente, seguido por reacción con una porción de droga D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una porción de droga con un reactivo enlazador bivalente para formar D-L mediante un enlace covalente, seguido por reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Métodos adicionales para preparar ADC se describen aquí . Ab-(L-D)p I El enlazador puede estar compuesto por uno o más componentes enlazadores. Componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valine-citrulline ( "val -cit " ) , alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo ("PAB"), N- Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC), y N-Succinimidil ( -yodo-acetil ) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes enlazadores adicionales se conocen en la técnica y algunos se describen aquí. Ver también "Monomethyl aline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 10/983,340, presentada en Noviembre 5, 2004, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, el enlazador puede comprender residuos aminoácido. Componentes enlazadores de aminoácidos ejemplares incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Tripéptidos ejemplares incluyen glicina-valina-citrulina (gly-val-cit ) y glicina-glicina- glicina (gly-gly-gly) . Residuos aminoácido que comprenden un componente enlazador aminoácido incluyen aquellos de origen natural, así como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no son de origen natural, tales como citrulina. Componentes enlazadores de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para escisión enzimática por enzimas particulares, por ejemplo una proteasa asociada con tumor, catepsina B, C y D o plasmina proteasa. Estructuras componentes de enlazador ejemplares se ilustran a continuación (en donde la línea ondulada indica sitios de conexión covalente con otros componentes de ADC) : MPEG Componentes enlazadores ejemplares adicionales y abreviaturas incluyen (cuando se ilustran el anticuerpo (Ab) y enlazador, y p es 1 a aproximadamente 8) : MC-val-cit-PAB Grupos nucleofílicos en anticuerpos incluyen pero no están limitados a: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos de amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína y (iv) grupos amino o hidroxilo azúcar en donde el anticuerpo se glicosila. Grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) ésteres activos tales como NHS, ásteres HOBt, haloformeatos y aluros de ácido; (ii) alquil y bencil aluros tales haloacetamidas ; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Anticuerpos pueden hacerse reactivos por conjugación con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente cisteína formará de esta manera teóricamente, dos nucleófilos tiol reactivos. Grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2 -iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en conversión de una amina en un tiol. Grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o su fragmento) al introducir uno, dos, tres, cuatro o más residuos cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoácidos cisteína no nativos) .

Conjugados de anticuerpo-droga de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofílicas , que pueden reaccionar con substituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o droga. Los azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden ser oxidados, por ejemplo con reactivos oxidantes peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o porciones de droga. Los grupos base Schiff-imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden ser reducidos, por ejemplo por reactivos borohidruro para formar enlaces amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glicosilado ya sea con glactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede dar por resultado grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en la droga (Hermanson¿_ Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, proteínas que contienen residuos serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, resultando en producción de un aldehido en lugar del primer amino ácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Este aldehido puede reaccionarse con una porción de droga o nucleofilo enlazador. Igualmente, grupos nucleofílicos en una porción de droga incluyen pero no están limitados a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como NHS ésteres, HOBt ésteres, haloformiatos, y haluros de ácido; (ii) alquil y benzil haluros tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotoxico puede elaborarse, por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separados por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado . Todavía en otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilizar en pre-blanco de tumor, en donde el conjugado receptor-anticuerpo se administra al paciente, seguido por remoción de conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y después administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleótido) . El anticuerpo (Ab) -MC-M AE puede prepararse por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que aquí se proporcionan con MC-MMAE como sigue. Anticuerpo, disuelto en 500 mM de borato de sodio y 500 mM de cloruro de sodio a pH 8.0 se trata con exceso de 100 mM ditiotreitol (DTT) . Después de incubación a 37 grados C por aproximadamente 30 minutos, el amortiguador se intercambia por elución sobre resinas Sephadex G25 y eluye con PBS con DTPA 1 mM. El valor tiol/Ab se verifica al determinar la concentración de anticuerpo reducida de la absorbancia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, I) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo. El reactivo enlazador de droga, maleimidocaproil-monometil auristatin E (MMAE) , es decir MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y agrega al anticuerpo reducido enfriado 2H9 en PBS. Después de aproximadamente una hora, un exceso de maleimida se agrega para neutralizar la reacción y tapar o terminar en extremo cualesquiera grupos tiol de anticuerpos sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y 2H9-MC-MMAE se purifica y desalifica por elución a través de resina G25 en PBS, filtra a través de filtros 0.2 µt bajo condiciones estériles, y congela para almacenamiento. Anticuerpo-MC-MMAF puede prepararse por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que aquí se proporcionan con MC-MMAF siguiendo el protocolo que se proporciona para preparación de Ab-MC-MMAE. Anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAE se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que aquí se proporcionan con MC-val -cit-PAB-MMAE siguiendo el protocolo que se proporciona para preparación de Ab-MC-MMAE. Anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAF se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que aquí se proporcionan con MC-val-cit-PAB-MMAF siguiendo el protocolo que se proporciona para preparación de Ab-MC-MMAE. Anticuerpo-SMCC-DM1 se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan aquí SMCC-DM1 como sigue. Anticuerpo purificado se derivatiza con (Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc.) para introducir el enlazador SMCC. Específicamente, el anticuerpo se trata a 20 mg/mL en fosfato de potasio a 50 mM / cloruro de sodio 50 mM / EDTA 2 mM, pH 6.5 con 7.5 equivalentes molares de SMCC (20 mM en DMSO, 6.7 mg/mL) . Después de agitar por 2 horas bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con fosfato de potasio 50 mM / cloruro de sodio 50 mM / EDTA 2 mM, pH 6.5. Fracciones que contienen anticuerpo se reúnen y ensayan . Anticuerpo-SMCC preparado de esta manera se diluye con fosfato de potasio 50 mM / cloruro de sodio 50 mM / EDTA 2 mM, pH 6.5, a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml, y reacciona con una solución 10 mM de DM1 en dimetilacetamida . La reacción se agita a temperatura ambiente bajo argón 16.5 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtra a través de una columna de filtración de gel Sephadex G25 (1.5 x 4.9 cm) con 1 x PBS a pH 6.5. La proporción de droga DM1 a anticuerpo (p) puede ser aproximadamente 2 a 5, como se mide por la absorbancia a 252 nm y a 280 nm. Ab-SPP-DMl se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que aquí se proporcionan con SPP-DM1 como sigue. Anticuerpo purificado se derivatiza con N-succinimidil-4 - (2 -piridiltio) pentanoato para introducir grupos ditiopiridilo . Anticuerpo (376.0 mg, 8 mg/mL) en 44.7 mL de amortiguador fosfato de potasio 50 mM (pH 6.5) que contiene NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trata con SPP (5.3 equivalentes molares en 2.3 mL etanol) . Después de incubación por 90 minutos bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra en gel a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con citrato de sodio 35 mM, NaCl 154 mM, EDTA 2 mM. Fracciones que contienen anticuerpo se reunieron y ensayaron. El grado de modificación del anticuerpo se determina como se describió anteirormente . Anticuerpo-SPP-Py (aproximadamente 10 µ?t????? de grupos 2 -tiopiridina liberables) se diluye con el amortiguador citrato de sodio 35 mM anterior, pH 6.5 a una concentración final de aproximadamente 2.5 mg/mL. DM1 (1.7 equivalentes, 17 µt??1e3) en dimetilacetamida 3.0 mM (DMA, 3% v/v en la mezcla de reacción final) se agrega entonces a la solución de anticuerpo. La reacción procede a temperatura ambiente bajo argón por aproximadamente 20 horas. La reacción se carga en una columna de filtración de gel Sephacryl S300 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) equilibrada con citrato de sodio 35 mM, NaCl 154 mM, pH 6.5. El gasto de flujo puede ser aproximadamente 5.0 mL/min y 65 fracciones (20.0 mL cada una) se recolectan. El número de moléculas de droga DM1 enlazadas por molécula de anticuerpo (?') se determina al medir la absorbancia a 252 nm y 280 nm, y puede ser aproximadamente 2 a 4 DM1 porciones de droga por anticuerpo 2H9. Anticuerpo-BMPEO-DM1 se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos que se proporcionan aquí con BMPE0-DM1 como sigue. El anticuerpo se modifica por el reactivo bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), dejando un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto puede lograrse al disolver BM(PEO)4 en una mezcla a 50% de etanol/agua a una concentración de 10 mM y agregar un exceso molar de diez veces a una solución que contiene anticuerpo en salino amortiguado con fosfato a una concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolar) y permitir que reaccione por 1 hora para formar intermediario anticuerpo-enlazador, 2H9-BMPEO. Exceso BM(PE0)4 se retira por filtración en gel (columna HiTrap, Pharmacia) en citrato 30 mM, pH 6 con amortiguador NaCl 150 mM. Un exceso molar de 10 veces aproximado de DM1 se disuelve en dimetil acetamida (DMA) y agrega al intermediario 2H9-BMPEO. Dimetil formamida (DMF) también puede emplearse para disolver el reactivo de porción de droga. La mezcla de reacción se deja que reaccione durante la noche antes de filtración de gel o diálisis en PBS para retirar DM1 sin reaccionar. Filtración en gel en columnas S200 en PBS se utiliza para retirar agregados de alto peso molecular y proporcionar purificado 2H9-BMPEO-DM1. Derivados de Anticuerpo Anticuerpos de la invención pueden ser adicionalmente modificados para contener porciones no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. En una modalidad, las porciones adecuadas para derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a, polietilen glicol (PEG) , copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliamino ácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar), y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propropilen glicol, co-polímeros de polipropilen óxido/etilen óxido, polioles polioxietilados (por ejemplo glicerol) , polivinil alcohol y sus mezclas. Polietilen glicol propionaldehido puede tener ventajas en fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros conectados al anticuerpo puede variar, y si se conecta más de uno de los polímeros, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros empleados para derivatización puede determinarse con base en consideraciones incluyendo pero no limitadas, a las propiedades particulares o funciones del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se utilizara en una terapia bajo condiciones definidas, etc. Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención, se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales {Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Osol , A. Ed. (1980)), en la forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras secas. Portadores excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o venzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones formadores de sal, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . La formulación aquí también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí . Estas moléculas convenientemente están presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido . Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina-microcápsula y microcápsula de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. Pueden elaborarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2- hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol ) ) , poliláctidas (patente de los E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido-glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (micro-esferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Mientras que polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos más cortos de tiempo. Cuando inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposición a la humedad a 37 grados C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad . Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es una formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse estabilización al modificar residuos sulfidrilo, liofilización de soluciones acídicas, controlar el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados, y desarrollar composiciones de matriz de polímero específicas. Los siguientes son de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que diversas otras modalidades pueden practicarse, dada la descripción general que se proporciona anteriormente. EJEMPLO Materiales y Métodos Reactivos Pro-uPA fue de Cortex Biochem (San Leandro, CA) , uPA (forma de alto peso molecular) de American Diagnostica (Greenwich, CT) y los substratos cromogénicos S2444 y S2366 de Diapharma (Westchester, OH) . El inhibidor de dominio Kunitz KD1 derivado de inhibidor activador de factor de crecimiento hepatocitos-?? (HAI-1B) se produjo en E. coli como se describe (19). Células T.inPro fueron de Expression System LLC ( oodland, CA) . Resina níquel-ácido-nitrilotriacético fue de Qiagen Inc (Chatsworth, CA) y Q-Sepharose de GE Healthcare (Piscataway, NJ) . Una forma soluble de inhibidor del activador de factor de crecimiento de hepatocito-2 (HAI-2) se expresó en forma recombinante y purificó como se describe (16) . Una forma soluble de HEPSIN que comprende todo el dominio extracelular se produjo por uso de un sistema de expresión de baculovirus. Una ADNc de HEPSINA etiquetado His secretado se construyó por fusión del ADNc que codifica por la secuencia de señal de melitina de abejas mieleras (Met1-Tyr20) con ADNc que codifica el dominio extraceluar de HEPSINA humana (Arg5-Leu417) . La construcción de ADNc final se insertó en un vector de expresión de baculovirus bajo el control de un promotor polihedrina y expresó en células T.in.Pro. Hepsina se purifica por cromatografía de afinidad de níquel-ácido-nitrilotriacético, esencialmente como se describe en (20) . Medio que contiene hepsina se acondiciona con azida de sodio 1 mM, NaCl 0.3M e Imidazol 15 mM y el pH se ajustó a pH 6.5 utilizando NaOH. Resina de níquel-ácido-nitrilotriacético pre-cargada se agrega al medio (4 mi resina/1 L medio) . Absorción por lote se realiza por ligera agitación a 4 grados C por 2 h. Después de permitir que la resina sedimente por 1 h, el sobrenadante se decanta y la resina se empaca en una columna. La columna se lava con un mínimo de 10 volúmenes de columna de PBS/NaCl 0.3 M pH 7.4, después seguido por 10 volúmenes de columna de Imidazol 25 mM, NaCl 0.3M, azida de sodio 1 mM pH 8.0. Se eluyeron proteínas con Imidazol 250 mM, NaCl 0.3 M, azida de sodio 1 mM pH 8.0. Las fracciones recolectadas se diluyeron 60-veces en Tris 10 mM, azida de sodio 1 m azida pH 8.0 y ajustaron a un pH final de 8.0 con conductividad inferior a 2.0 mS/cm. La proteína se cargó en Q-Sepharose FF a 0.1 mi resina/mg de proteína. La columna se lavó con un mínimo de 10 volúmenes de columna de Tris 20 mM, azida de sodio 2 mM pH 8.0 y HEPSINA se eluye con un gradiente NaCl 0 - 1 M en Tris 20 mM, azida de sodio 2 mM pH 8.0.

Producción de anticuerpo anti-HEPSINA monoclonal Cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories, A, USA) se hiper- inmunizaron con HEPSINA purificada en adyuvante RIBI (Ribi Immunochem Research Inc., MO, USA) . Células B de nodos linfáticos de cinco ratones se fusionaron con células de mieloma de ratón (X63. Ag8.653 ; American Type Culture Collection, MD, USA) como se describió previamente (21) . Después de 10 - 14 días, los sobrenadantes se recolectaron y cribaron para producción de anticuerpo con un ELISA enlace a HEPSINA y por FACS utilizándose células LnCaP-34 y la línea celular colorectal HPAC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) como un control negativo. Cinco clones positivos, que muestran el más alto inmuno-enlace y especificidad después de la segunda ruta de clonación de célula sencilla por pozo (Elite 1 Sorter, Beckman Coulter, CA, USAJ , se incrementaron en escala para purificación en INTEGRA CELLine 1000 (Integra Biosciences, AG, Suiza) . Los sobrenadantes se purificaron por cromatografía de afinidad de Proteína Á, filtraron estériles (0.2 µt? tamaño de poro; Nalge Nunc International, NY, USA) y almacenaron a 4 grados C en PBS. ELISA de enlace HEPSINA Placas de microtitulación (Nalge Nunc International, NY, USA) se revistieron con 100 µ?/???? de HEPSINA (1 /zg/ml) en amortiguador de carbonato 0.05 M, pH 9.6, durante la noche a 4 grados C. Las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween 20 y subsecuentemente bloquearon con PBS/0.5% (p/v) BSA/0.05% (v/v) Tween 20. 100 µ? de sobrenadante de cultivo se agregan a cada pozo e incuban por 1 h a RT. Las placas se lavaron y el anticuerpo ligado se detecta con IgG anti-ratón cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich Inc. MO, USA), 100 µ?/???? a 1:5000 a dilución de PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20, incubado por 30 min. Después de una etapa de lavado adicional, substrato BioFX TMB (BioFX Laboratories, MD, USA) se agrega, incuba por 5 min y la reacción se detiene con solución de Parada BioFX Stop (BioFX Laboratories, MD, USA) . Después, la absorbancia a 630 nm se mide en un lector de microplacas. Producción de HEPSINA que sobre-expresa células LnCaP La línea celular de carcinoma de próstata humano, LnCaP-FGC (LnCaP) , se obtiene de American Type Culture Collection (Manassas, VA) . Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (ATCC, Manassas, VA) más suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Un clon LnCaP que expresó en forma estable el gen de luciferasa de luciérnaga (LnCaP-luc) se utiliza para experimentos de transfección de HEPSINA. Para establecer la línea celular LnCaP-luc, el gen de luciferasa se sub-clonó como un fragmento ADNc EcoRI/Xhol insertado en el vector de expresión pMSCVneo (BD Biosciences-Clontech, Mountain View, CA) . Células LnCaP se transíectaron con la construcción luciferasa utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las células se seleccionaron con 500 ^g/ml de Geneticina (Invitrogen) y se cribaron ciónos por actividad de bioluminescencia al utilizar el equipo Luclite (PerkinElmer, Boston, MA) . El clon LnCaP-luc, que produce la señal de luminiscencia más fuerte, se seleccionó para experimentos de transfeccion de Hepsina. El ADNc de HEPSINA de longitud íntegra se insertó en un vector de expresión de mamífero que contiene el gen de resistencia a puromicina para selección de antibióticos (Genentech, South San Francisco, CA) . El clon LnCaP-luc se transfecta con la construcción que codifica HEPSINA de longitud íntegra con una etiqueta Bandera C-terminal y las células se seleccionaron con 0.5 µg/ml puromicina (Sigma-Adrich) . Los ciónos se analizaron para FACS para expresión de superficie de HEPSINA utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Flag (Sigma-Adrich) . Dos ciónos, el expresor de HEPSINA alto LnCaP-34 y el expresor de HEPSINA bajo LnCaP-17, se seleccionaron para estudios con los monoclonales anti-HEPSINA. Análisis FACS Capas de células confluentes se lavaron con PBS y células se retiraron con solución de disociación de células (Sigma-Aldrich Inc. MO, USA). Las células se lavaron con PBS y resuspendieron a 0.5 - 1.0 x 107 células/ml en PBS/l% (v/v) FBS. 100 µ? de una suspensión celular se incuba con sobrenadantes de cultivo o anticuerpos purificados por 40 min en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS antes de incubación con IgG anti-ratón cabra F(ab')2 conjugado con PE (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. PA, USA) diluido 1:1000 en PBS/1%FBS (v/v) . Placas se incubaron por 30 min en hielo, las células se lavaron dos veces con PBS. Los precipitados celulares se resuspenden en formalina al 1% (Richard Alien Scientific, MI, USA) y enlace de anticuerpo mide en un aparato FACSscan (Becton and Dickinson Biosciences, CA, USA) . Isotipado Los isotipos de MAbs purificados se determinaron al utilizar dos equipos comercialmente disponibles, el equipo mono-AB-ID SP Kit (Zymed Laboratories, CA, USA) y el equipo de isotipado de anticuerpo monoclonal de ratón Isostrip (Roche Diagnostics Corporation, IN, USA) . Biotinilación de anticuerpos monoclonales La biotina se acopla covalentemente con IgG mediante N-hidroxisuccinamida éster de biotina de cadena larga (LCB-NHS, Pierce, USA) . LCB-NHS se disuelve en DMSO (2 mg/ml) y agrega a una proporción de 100 /¿g biotina :1 mg de anticuerpo e incuba por 2 horas. Biotina libre se retira por diálisis extensa contra PBS a 4 grados C. Los anticuerpos biotinilados después se filtraron estériles y almacenaron a 4 grados C . Determinación de epítopo anticuerpo por ELISA de enlace de competencia Placas de microtitulación se revistieron con 100 µ?/???? de HEPSINA (1 µg/ml) en un amortiguador de carbonato 0.05 M pH 9.6 durante la noche a 4 grados C. Las placas se lavaron con PBS/0.05% (v/v) Tween 20 y bloquearon con PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20 por 30 minutos. Los anticuerpos purificados no etiquetados (20 µg/ml) se incubaron por 1 h a RT, seguido por adición de anticuerpos biotinilados (2 ^g/ml) . Después de incubación por 1 h, el anticuerpo biotinilado se detecta con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano diluida a 1:5000 (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., PA, USA). La absorbancia a 630 nm se mide en un lector de microplacas. Activación Pro-uPA por HEPSINA Una forma soluble del inhibidor bi-Kunitz HAI-2 se utiliza como un reactivo de parada para el ensayo de activación pro-uPA. HAI-2 inhibe en forma potente la actividad de HEPSINA pero no la actividad de uPA como se verifica en un ensayo enzimático. HAI-2 se incuba con HEPSINA 0.5 nM o UPA 10 nM por 30 min en amortiguador Hepes (20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl , 5 mM CaCl2, 0.01% Tritón X-100) a temperatura ambiente. Los substratos cromogénicos S2366 (para HEPSINA) o S2444 (para uPA) se agregan a una concentración que corresponde a sus valores Km respectivos, que se determinaron en experimentos separados . Después de adición de substrato, el aumento en absorbancia a 405 nm se mide en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Los valores fCiapp se determina al ajustar los datos a la ecuación para cerrada inhibición de enlace (22, 23) . En ensayos de activación pro-uPA, los anticuerpos purificados o KD1 se incubaron con HEPSINA por 30 min y la reacción se inició al agregar pro-uPA. En esta mezcla, la concentración de reactivos son como sigue: HEPSINA 0.5 nM, pro-uPA 100 nM, anticuerpos 710 nM y KD1 71 nM. En diferentes puntos en tiempo, se retiraron alícuotas de 50 µ? y agregaron a 0.15 mi HAI-2 en amortiguador Hepes para detener la reacción. Después de agregar 50 µ? de S2444 (2.5 mM) , el aumento en absorción a 405 nm se mide en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . La concentración de uPA formada en cada punto en tiempo se determina a partir de una curva estándar de pro-uPA enzimáticamente convertido y las velocidades lineales de formación de uPA se calculan. Todas las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Ensayo de substrato cromogénico Los anticuerpos purificados en el inhibidor KD1 derivado de HAI-1B (19) se incubaron con HEPSINA 0.25 nM por min en amortiguador Hepes. Actividad enzimática se supervisa después de adición del substrato cromogénico S2366. Las concentraciones finales de los reactivos fueron: HEPSINA 0.25 nM, anticuerpo 500 nM, KD1 50 nM y S2366 0.25 mM. El aumento en absorbancia a 405 nm se midió en un lector de microplacas cinético y los resultados se expresan como actividad de enzima fraccional (vi/v0) . Todas las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Inmuno-transferencia Para experimentos de inmuno-transferencia, HEPSINA soluble recombinante se analizó por SDS-PAGE 4-20% bajo condiciones de reducción. La proteína se transfirió en filtros de nitrocelulosa (Invitrogen) utilizando el sistema de Transferencia Semi Seco Bio-Rad. Se detectó HEPSINA al utilizar anticuerpos anti-Hepsina monoclonales de ratón (2D5, 3H10, 1F2, 1E7, 3H1) seguido por anticuerpo anti-ratón cabra conjugado HRP (Pierce; Rockford, IL) y mejora de ECL (GE Healthcare; Piscataway, NJ) . Resultados Se produjeron cinco anticuerpos anti-HEPSINA monoclonales. Mostraron fuerte enlace a HEPSINA en un ensayo de enlace tipo ELISA directo (Figura 3) . El aglutinante más débil fue 1E7.1.1. Experimentos de bloqueo cruzado se llevaron a cabo para identificar los epítopos de enlace relativo de los anticuerpos. Los anticuerpos 3H1.1.1, 3H10.1.2 y 1F2.1.1 se inhiben entre sí de enlace a HEPSINA (Figura 4) , indicando que comparten un epítopo común, referido como epítopo A. 2D5.1.9 y 1E7.1.1 no se inhibieron por ninguno de los otros anticuerpos (Figura 4) , indicando que ligan a epítopos separados, que se refieren como epítopos B y C, respectivamente (Figura 1) . Los isotipos de anticuerpo se determinaron y se ilustran en la Figura 1. Dos líneas celulares LnCaP se produjeron para examinar si los anticuerpos reconocen HEPSINA expresada en superficies celulares. Con base en resultados RT-PCR en tiempo real, encontramos que la línea de célula LnCaP-34 sobre-expresa HEPSINA, mientras que la línea celular LnCaP-17 solo expresa niveles endógenos de HEPSINA (datos no mostrados) . Análisis FACS de los 5 anticuerpos mostraron que todos están ligados a las superficies celulares. 1E7.1.1 fue el aglutinante más débil de acuerdo con los resultados de ELISA de enlace directo. Consistente con la expresión ARN de HEPSINA superior de células LnCaP-34, los anticuerpos dieron una más fuerte señal de fluorescencia con estas células como se indica por las superiores intensidades de fluorescencia promedio (Figura 1) . Esto se ejemplifica por el histograma en la Figura 5 que muestra el enlace de 3H10.1.2 a las dos líneas celulares LnCaP. Los resultados demuestran que los anticuerpos son capaces de reconocer HEPSINA nativa de longitud completa, expresada en la superficie celular así como la forma soluble recombinante . A continuación, determinamos si los anticuerpos interfieren con la función enzimática de HEPSINA. En un ensayo de substrato cromogénico con el substrato para-nitroanilida S2366, ninguno de los anticuerpos interfiere con la actividad de HEPSINA a una concentración de 500 nM (Figura 6) . Como un control positivo, utilizamos el inhibidor HEPSINA potente, KD1 que inhibe completamente la actividad de HEPSINA a una concentración de 50 nM (Figura 6) . Aún más, se examinaron los anticuerpos en un ensayo de activación pro-uPA dependiente de HEPSINA. Por uso del inhibidor tipo Kunitz HAI-2, que inhibe en forma potente HEPSINA pero no uPA (Figura 2) , fuimos capaces de detener la reacción en diferentes puntos en tiempo y cuantificar el uPA formado en la segunda etapa del ensayo. Las velocidades lineales de formación de uPA en la presencia de anticuerpos o KD1 se ilustran en la Figura 7. Ninguno de los anticuerpos inhibe significativamente la velocidad de formación de uPA, mientras que KD1 inhibe completamente la reacción (Tabla 1 en la Figura 7) . Estos resultados sugieren que los anticuerpos ni interfieren con activación mediada por HEPSINA de pequeños substratos sintéticos ni con substratos macromoleculares . Por lo tanto, los epítopos de enlace deben ser ubicados fuera del sitio activo de HEPSINA y enlace de anticuerpo no influencia aloestéricamente la conformación de sitio activo, al menos no en un grado que fuera nocivo para el procesamiento de los substratos pro-uPA o S2366. Experimentos de inmuno-transferencia mostraron que los anticuerpos ligados al dominio proteasa de 30kDa (= cadena-B) de HEPSINA (Figura 8) . La cadena A de 20 kDa no fue detectada con los anticuerpos (Figura 8) indicando que el epítopo de enlace está contenida en el dominio proteasa. Los anticuerpos monoclonales anti-HEPSINA aquí descritos ligan tanto a HEPSINA expresada en superficie celular como soluble. Ligan a tres regiones de epítopos distintos situados en el dominio de proteasa HEPSINA. Los resultados de cinética de enzimas sugieren que ligan fuera de la región de sitio activo, que puede permitir enlace de anticuerpo incluso si el sitio activo de HEPSINA es ocupado por un inhibidor endógeno. Esto puede ser importante para la detección de HEPSINA en sangre u orina, debido a que HEPSINA derivada de tumor puede formar complejos con inhibidores endógenos similares a matriptasa, que se aisla como un complejo matriptasa :HAI-1 en leche humana (18). Además, la capacidad de los anticuerpos para ligar a HEPSINA desnaturalizada o parcialmente desnaturalizada puede permitir la detección de HEPSINA derivada de tumor que se ha sometido a cierto grado de degradación y/o desnaturalización. Los siguientes hibridomas se han depositado con la Colección de Cultivo Tipo Americano, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) : Líneas Celulares No . de Acceso Fecha de ATCC Depósito Antibody 4544 (3H10.1.2) PTA-7472 Abril 5, 2006 Antibody 4545 (2D5.1.9) PTA-7470 Abril 5, 2006 Antibody 4546 (1F2.1.1) PTA-7471 Abril 5, 2006 Antibody 4547 (1E7.1.1) PTA-7473 Abril 5, 2006 Antibody 4548 (3H1.1.1) PTA-7469 Abril 5, 2006 Estos depósitos se realizaron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimiento de Patente y los Reglamentos subyacentes (Tratado de Budapest) . Esto asegura mantenimiento de un depósito viable por 30 años a partir de la fecha de depósito. Estas líneas celulares serán disponibles por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un convenio entre Genentech, Inc., y ATCC, que asegura disponibilidad permanente y no restringida de las líneas celulares al público al otorgarse en la patente de los E.U.A. pertinente o al dejar abierta al público cualquier solicitud de patente de los E.U.A. o extranjera que lo que sucediera primero, y asegura disponibilidad de las líneas celulares a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas de los E.U.A., para que tenga derecho de acuerdo con 35 USC §122 y las reglas del comisionado de acuerdo con esto (incluyendo 37 CFR §1.14 con referencia particular a 886 OG 638) . La cesionaria de la presente solicitud ha convenido de que si las líneas celulares depositadas habrán de perderse o destruirse cuando se cultivan bajo condiciones convenientes, rápidamente serán reemplazadas ante notificación con un espécimen de la misma línea celular. Disponibilidad de las líneas celulares depositadas no habrá de considerarse como una licencia para práctica de la invención en contravención a los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes . Lista Parcial de Referencias 1. Somoza, J. R. , Ho, J. D., Luong, C, Ghate, M. , Sprengeler, P. A., Mortara, K. , Shrader, . D., Sperandio, D., Chan, H., McGrath, M. E., and Katz, B. A. (2003) Structure 11(9), 1123-1131 2. Vu, T. K., Liu, R. W., Haaksma, C. J. , Tomasek, J. J. , and Howard, E. W. (1997) J Biol Chem 272(50), 31315-31320 3. Yu, I. S., Chen, H. J. , Lee, Y. S., Huang, P. H., Lin, S. R., Tsai, T. W. , and Lin, S. W. (2000) Thromb Haemost 84(5), 865-870 4. Wu, Q. , Yu, D., Post, J., Halks-Miller, M. , Sadler, J. E., and Morser, J. (1998) J Clin Invest 101(2), 321-326 5. Tanimoto, H . , Yan, Y . , Clarke, J. , Korourian, S., Shigemasa, K. , Parmley, T. H. , Parham, G. P., and O'Brien, T. J. (1997) Cáncer Res 57(14), 2884-2887 6. 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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que comprende al menos una secuencia hipervariable (HVR) , seleccionada del grupo que consiste de HC-HVR1, HC-HVR2, HC-HVR3, LC-HVR1, LC-HVR2 y LC-HVR3 de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC = American Type Culture Collection) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el anticuerpo aislado liga HEPSINA humana.
2. Un anticuerpo aislado que comprende secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el anticuerpo aislado liga a HEPSINA humana .
3. Un polipéptido de inmunoglobulina que comprende cuando menos una secuencia hipervariable (HVR) seleccionada del grupo que consiste de HC-HVR1, HC-HVR2, HC-HVR3, LC-HVR1, LC-HVR2 y LC-HVR3 de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el polipéptido de inmunoglobulina liga a HEPSINA humana.
4. Un polipéptido de inmunoglobulina que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473, en donde el polipéptido de inmunoglobulina liga a HEPSINA humana.
5. Un anticuerpo aislado que liga al mismo epítopo en HEPSINA humana que el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473.
6. Un anticuerpo aislado que compite con el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473 para enlace a HEPSINA humana.
7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la forma IgG de longitud íntegra del anticuerpo liga específicamente a HEPSINA humana con una afinidad de enlace EC50 de 150 nM o mejor.
8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la afinidad de enlace EC50 es 120 nM o mejor.
9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la afinidad de enlace es EC50 es 100 nM o memor.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la afinidad de enlace es EC50 es 75 nM o mejor.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la afinidad de enlace es EC50 es 50 nM o mejor.
12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo liga específicamente HEPSINA que está en forma nativa, parcialmente desnaturalizada o desnaturalizada.
13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo liga a HEPSINA soluble o conectada a célula.
14. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo no es un anticuerpo anti-HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volumen 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones de PCT WO2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) .
15. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo no compite para enlace a HEPSINA humana con un anticuerpo anti-HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volumen 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6 , A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones de PCT WO2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) .
16. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo no liga al mismo epítopo en HEPSINA que un anticuerpo anti -HEPSINA descrito en Cáncer Research, Volumen 66, páginas 3611-3619 publicado en 2006 (por ejemplo, anticuerpo 1A12, 85B11, 94A7, A6 , A174, A21 y/o A24 como se ejemplifica en la Figura 4) , o un anticuerpo de HEPSINA aislado descrito en las Publicaciones de PCT O2004/033630 (por ejemplo, anticuerpo 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 y/o 72H6 referido en la página 93 y en las Figuras 15A-D) .
17. Un anticuerpo de HEPSINA codificado por una secuencia de codificación de anticuerpo de la línea celular de hibridotna depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el No. de Acceso PTA-7469, PTA-7470, PTA-7471, PTA-7472 o PTA-7473.
18. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
19. Una célula hospedera que comprende la molécula de ácido nucleido de conformidad con la reivindicación 18.
20. Una línea celular capaz de producir el anticuerpo de HEPSINA de cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
21. Un método para producir un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo bajo condiciones en donde se produce el anticuerpo.
22. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, y un portador.
23. Método para diagnosticar la presencia de HEPSINA en una muestra, caracterizado porque comprende contactar la muestra con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
24. Un método para tratamiento de una enfermedad o condición asociada con la desregulación de la expresión de HEPSINA, el método se caracteriza porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el anticuerpo se enlaza a un agente heterologo.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente heterologo es terapéutico.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente heterologo es una etiqueta, agente citotóxico y/o radioisótopo.
27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el paciente es un paciente mamífero.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el paciente es humano.
29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la enfermedad es cáncer.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el cáncer se elige del grupo que consiste de cáncer de próstata y cáncer de ovarios.
31. Un método que comprende determinar si un sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la presencia de la célula indica que el sujeto tiene un desorden asociado con la desregulación de expresión de HEPSINA.
32. Método para pronosticar respuesta de un sujeto a terapia para una enfermedad asociada con desregulación de expresión de HEPSINA, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la presencia de la célula indica que el sujeto responderá a la terapia.
33. Método para supervisar enfermedad residual mínima en un sujeto tratado por una enfermedad asociada con la desregulación de expresión de HEPSINA, el método se caracteriza porque comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa de la presencia de enfermedad residual mínima.
34. Método para detectar un estado de enfermedad de una enfermedad asociada con desregulación de expresión de HEPSINA en un sujeto, el método se caracteriza porque comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa del estado de enfermedad de la enfermedad en el sujeto.
35. Un método para estimar predisposición de un sujeto para desarrollar un desorden asociado con desregulación de expresión de HEPSINA, el método comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula es indicativa de una predisposición para que el sujeto desarrolle el desorden.
36. Un método para diagnosticar un desorden asociado con la desregulación de expresión de HEPSINA en un sujeto, el método se caracteriza porque comprende determinar si el sujeto comprende una célula que expresa HEPSINA a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal, en donde la detección de la célula indica que el sujeto tiene el desorden.
37. Un conjunto o chip de proteína caracterizado porque comprende uno o más anticuerpos de anti-HEPSINA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, o su fragmento que es capaz de ligar HEPSINA.
38. Un equipo que comprende el conjunto o chip de proteína de conformidad con la reivindicación 37, e instrucciones para utilizar el conjunto ordenado o chip para detectar un desorden asociado con la desregulación de HEPSINA en un sujeto al determinar si la expresión de HEPSINA en una muestra obtenida del sujeto está a un nivel mayor que el nivel de expresión de HEPSINA en una muestra de referencia normal .