MX2008010562A

MX2008010562A - Formulacion de anticuerpo.

Info

Publication number: MX2008010562A
Application number: MX2008010562A
Authority: MX
Inventors: Arvind Srivastava; Joel Goldstein
Original assignee: Imclone Systems Inc
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2009-03-05
Also published as: NO20083640L; WO2007095337A3; WO2007095337A2; EP1987067A4; AU2007215012A1; CN101495136A; EA200870264A1; EP1987067A2; CA2642270A1; BRPI0707796A2; US20090306348A1; JP2009526856A; KR20080096827A; IL193408A0

Abstract

La presente invención proporciona formulaciones y métodos para la estabilización de anticuerpos. En una modalidad, la invención proporciona la formulación estable de anticuerpos que son propensos a fragmentación no enzimática en la región de pivoteo. En una modalidad más, la invención proporciona métodos para la estabilización de anticuerpos, que comprenden liofilizar una formulación acuosa de un anticuerpo. Las formulaciones pueden ser liofilizadas para estabilizar los anticuerpos durante procedimiento y almacenamiento, y después las formulaciones pueden ser reconstituidas para administración farmacéutica. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para la estabilización de anticuerpos anti-VEGFR, que comprenden liofilizar una formulación acuosa del anticuerpo anti-VEGFR. Las formulaciones pueden ser liofilizadas para estabilizar los anticuerpos anti-VEGFR durante el procedimiento y almacenamiento, y después las formulaciones pueden ser reconstituidas para administración farmacéutica.

Description

FORMULACION DE ANTICUERPO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud de EUA No. 60/774,101, presentada el 15 de Febrero del 2006, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presenta invención está dirigida a formulaciones y métodos para la estabilización de anticuerpos. En una modalidad, la invención proporciona formulaciones y métodos para estabilizar anticuerpos que son propensos a división no enzimática en la región de pivoteo. Más particularmente, esta invención se refiere a la formulación de anticuerpos que son propensos a la división no enzimática en la región de pivoteo con un regulador de pH y un lioprotector. En otra modalidad, la invención proporciona métodos y formulaciones para la estabilización de anticuerpos anti-VEGFR.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los anticuerpos en las formulaciones líquidas son susceptibles a una variedad de procesos químicos y físicos incluyendo hidrólisis, agregación, oxidación, desamidación , y fragmentación en la región de pivoteo. Esta fragmentación es un proceso no enzimático, el cual puede ser dependiente de temperatura y/o del pH, y típicamente ocurre en la región de pivoteo de cadena pesada cerca del sitio de escisión de papaína. Estos procesos pueden alterar o eliminar la eficacia clínica de anticuerpos terapéuticos reduciendo la habilidad de anticuerpos funcionales, y reduciendo o eliminando sus características de unión de antígeno. La presente invención dirige la necesidad para formulaciones estables de anticuerpos monoclonales, especialmente aquellos que son propensos a división o escisión no enzimática en la región de pivoteo, y además proporciona un método y formulación para la liofilización de estos anticuerpos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a formulaciones y métodos para la estabilización de preparaciones de anticuerpo. Además, la presente invención también está dirigida a formulaciones y métodos para la estabilización de anticuerpos que son propensos a división o escisión no enzimática, particularmente en la región de pivoteo. En una modalidad, la invención proporciona una formulación estable que comprende un anticuerpo que es propenso a división o escisión no enzimática, y un regulador de pH. La formulación también puede contener uno o más agentes de estabilización. Además, la formulación püede contener un agente tensoactivo. En otra modalidad, la invención proporciona una formulación que es compatible con liofilización y puede contener un lioprotector.

En otra modalidad, la invención proporciona una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo que es propenso a división o escisión no enzimática, un regulador de pH de histidina, y un azúcar lioprotector. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para la estabilización de anticuerpos que son propensos a división o escisión no enzimática, que comprenden una' formulación en un regulador de pH de histidina y un azúcar lioprotector. Además, la formulación puede contener un agente tensoactivo. Las formulaciones pueden ser liofilizadas para estabilizar los anticuerpos durante procesamiento y almacenamiento, y después las formulaciones pueden ser reconstituidas para administración farmacéutica. En una modalidad adicional, los anticuerpos reconstituidos pueden ser utilizados en un formato de dosis múltiple.

En una modalidad, la invención proporciona una formulación liofilizada estable que contenga un anticuerpo anti-VEGFR, un regular de pH, y un lioprotector. La formulación también puede contener uno o más agentes de estabilización. Además, la formulación puede contener un agente tensoactivo. En otra modalidad, la invención proporciona una formulación liofilizada estable que comprende un anticuerpo anti-VEGFR2, un regulador de pH, y un lioprotector. La formulación también puede contener uno o más agentes de estabilización. Además, la formulación puede contener un agente tensoactivo.

En otra modalidad, la invención proporciona una formulación liofilizada que comprende un anticuerpo anti-VEGFR2, una regular de pH de histidina, y un azúcar lioprotector. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para la estabilización de anticuerpos anti-VEGFR que comprenden liofilizar una formulación acuosa de un anticuerpo anti-VEGFR. Las formulaciones pueden ser liofilizadas para estabilizar los anticuerpos anti-VEGFR durante procesamiento y almacenamiento, y después las formulaciones pueden ser reconstituidas para administración farmacéutica. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir la actividad de VEGFR, proporcionando una composición de la presente invención. La presente invención también proporciona un método para inhibir la trayectoria de VEGF en mamíferos, particularmente seres humanos, que comprende administrar una composición de la presente invención. La presente invención también proporciona un método para tratar condiciones dependientes de VEGFR, que comprende administrar una composición de la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un cromatograma de cromatografía de exclusión de tamaño-cromatografía de líquido de alto rendimiento (SEC-HPLC) del anticuerpo 'IMC-11'21 B' en PBS después de 3 meses de incubación a 40°C.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácido para la cadena pesada de IMC-1121 B (secuencia No.5), y los sitios en donde ocurre la escisión no enzimática. La Figura 3 muestra SDS-PAGE de IMC-1121B degradado y sus fracciones de exclusión de tamaño. La Figura 4 muestra una gráfica de regresión para análisis DSC de IMC-1121B. La Figura 5 muestra un perfil de predicción para un estudio de agitación. La Figura 6 muestra un perfil de predicción de estabilidad de temperatura acelerada, en tiempo real, de IMC-1121B a 40°C. La Figura 7 muestra un perfil de predicción de estabilidad de temperatura acelerada, en tiempo real, de IMC-1121B a 20°C. La Figura 8 es un cromatograma de SEC-HPLC de IMC-1121B después de incubación durante 150 días a 40°C y a temperatura ambiente en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0).

La Figura 9 muestra la variación de porcentaje de monómero de IMC-1121B en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) como una función de tiempo de incubación a 40°C y a temperatura ambiente. La Figura 10 muestra la variación de porcentaje de agregado de IMC-1121B en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) como una función de tiempo de incubación a 40°C y a temperatura ambiente. La Figura 11 muestra la variación de porcentaje de degradador de IMC-1121B en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) como una función de tiempo de incubación a 40°C y a temperatura ambiente. La Figura 12 es un cromatograma de IEC-HPLC de IMC-1121B después de 30 y 150 días de incubación a temperatura ambiente y a 40°C. La Figura 13 muestra SDS-PAGE de reducción y no reducción de IMC-1121B en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) después de 150 días de incubación a temperatura ambiente y a 40°C. La Figura 14 muestra el enfoque y su eléctrico de IMC-1121B después de 150 días de incubación a temperatura ambiente y a 40°C.

La Figura 15 muestra el ciclo de congelación-secado para el proceso de liofilización de IMC-1121B. La Figura 16 muestra el porcentaje de monómero restante para productos liofilizados de IMC-1121B después de 100 días de incubación a 40°C y 50°C. La Figura 17 muestra el porcentaje de monómero restante para IMC-1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 50°C. La Figura 18 muestra el porcentaje de agregados para IMC-1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 50°C. La Figura 19 muestra el porcentaje de degradantes para IMC-1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 50°C. La Figura 20 muestra el porcentaje de monómero restante para IMC-1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 40°C. La Figura 21 muestra el porcentaje de agregados para IMC- 1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 40°C. La Figura 22 muestra el porcentaje de degradantes para IMC-1121B en formulaciones liofilizadas y de solución como una función del tiempo de incubación a 40°C. La Figura 23 muestra el porcentaje de monómero restante para IMC-1121B formulado en solución y liofilizado después de incubación a 50°C. La Figura 24 muestra el porcentaje de agregado para IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a 50°C. La Figura 25 muestra el porcentaje de degradante para IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a 50°C. La Figura 26 muestra el porcentaje de monómero restante para IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a 50°C. La Figura 27 muestra el porcentaje de agregado para IMC-1121B incubado a 40°C en solución y formulaciones secadas por congelación.

La Figura 28 muestra el porcentaje de degradante para IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a 40°C. La Figura 29 es un cromatograma de IEC-HPLC de IMC-1121B incubado durante tres meses a 40°C en solución y formulaciones secadas por congelación. La Figura 30 muestra el porcentaje de monómero restante para IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a temperatura ambiente. La Figura 31 muestra el porcentaje de agregados para I C- 1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a temperatura ambiente. La Figura 32 muestra el porcentaje de degradantes para 1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a temperatura ambiente. La Figura 33 es un cromatograma de IEC-HPLC de IMC-1121B en solución y formulaciones secadas por congelación después de incubación a temperatura ambiente durante 3 meses. La Figura 34 muestra la reducción, mediante SDS-PAGE, de IMC-1121B en solución y formulaciones secadas por congelación después de incubación a temperatura ambiente, 40°C y 50°C durante 3 meses. La Figura 35 muestra SDS-PAGE de no reducción de IMC-1121B en solución y formulaciones secadas por congelación después de incubación a temperatura ambiente, 40°C y 50°C durante 3 meses. g DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona formulaciones para el secado por congelación de anticuerpos, incluyendo sus fragmentos funcionales, que son propensos a escisión o división no enzimática. Las formulaciones pueden comprender elementos adicionales tales como agentes de estabilización, agentes tensoactivos, agentes de reducción, vehículos, conservadores, aminoácidos, y agentes quelatadores. La presente invención también proporciona métodos para estabilizar una composición de anticuerpo, que comprende liofilizar una formulación acuosa de un anticuerpo en presencia de un lioprotector. Las formulaciones pueden ser I i of i I iza d a s para estabilizar los anticuerpos durante procesamiento y almacenamiento, y después reconstituirse antes de la administración farmacéutica. De preferencia, el anticuerpo sustancialmente retiene su estabilidad física y química e integridad de producción a administración. Varios componentes de formulación pueden ser adecuados para mejorar la estabilidad de acuerdo con la presente invención, incluyendo reguladores de pH, agentes tensoactivos, azúcares, alcoholes de azúcar, derivados de azúcar, y aminoácidos. Varias propiedades de formulación pueden ser adecuadas para mejorar la estabilidad de acuerdo con la presente invención, incluyendo pH y concentración de componentes de formulación. De acuerdo con la presente invención, un regular de pH puede ser utilizado para mantener el pH de la formulación. El regulador de pH reduce al mínimo las fluctuaciones en pH debido a variaciones externas. Las formulaciones de la presente invención contienen uno o más reguladores de pH para proporcionar a las formulaciones un pH adecuado, de preferencia de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, y muy preferiblemente alrededor de 6.0. Los regulares pH ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, regulares de pH orgánicos en general, tales como histidina, citrato, malato, succinato, y acetato. En una modalidad, la concentración de regulador de pH es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM. En una modalidad adicional, la concentración de regulador de pH es de aproximadamente 10 mM. Las formulaciones de la presente invención pueden contener uno o más agentes de estabilización, los cuales pueden ayudar a prevenir la agregación y degradación de los anticuerpos. Los agentes de estabilización adecuados incluyen, pero no se limitan a, azúcares polihídricos, alcoholes de azúcar, derivados de azúcar, y aminoácidos. Los agentes de estabilización preferidos incluyen, pero no se limitan a ácido aspártico, ácido lactobiónico, glicina, trehalosa, manitol, y sucrosa. Las formulaciones de la presente invención pueden contener uno o más agentes tensoactivos. Las soluciones de anticuerpo tienen alta tensión de superficie en la superficie colindante de aire-agua. Con el fin de reducir esta tensión de superficie, los anticuerpos tienden a agregarse en la superficie colindante de aire-agua. Un agente tensoactivo reduce al mínimo la agregación de anticuerpo en la superficie colindante de aire-agua, ayudando así a mantener la actividad biológica del anticuerpo en solución. Por ejemplo, el agregar 0.01% de Tween 80 puede reducir la agregación de anticuerpo en solución. Cuando la formulación es liofilizada, el agente tensoactivo también puede reducir la formación de partículas en la formulación reconstituida. En las formulaciones liofilizadas de la presente invención, el agente tensoactivo puede ser agregado a uno o más de la formulación pre-liofilizada, la formulación liofilizada y la formulación reconstituida, pero preferiblemente a la formulación pre-liofilizada. Por ejemplo, se puede agregar 0.005% de Tween 80-a la solución de anticuerpo antes de la liofilización. Los agentes tensoactivos incluyen, pero no se limitan a, Tween 20, Tween 80, Pluronic F-68 y sales biliares. En una modalidad, la concentración de agente tensoactivo es de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 1.0%. El proceso de liofilización puede generar una variedad de tensiones que pueden desnaturalizar proteínas o polipéptidos. Estas tensiones incluyen reducción de temperatura, formación de cristal de hielo, incremento de resistencia iónica, cambios en pH, separación de fase, remoción de la cubierta de hidratación, y cambios de concentración. Los anticuerpos que son sensibles a las tensiones del proceso de congelación y/o secado pueden ser estabilizados agregando uno o más lioprotectores. Un lioprotector es un compuesto que protege contra las tensiones asociadas con la liofilización. Por lo tanto, los lioprotectores como una clase incluyen crioprotectores, los cuales justamente protegen del proceso de congelación. Se puede utilizar uno o más lioprotectores para proteger de las tensiones asociadas con la liofilización y, por ejemplo, puede ser un azúcar tal como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaina; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como azúcares de alcohol trihídrico o superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; glicol propilénico; glicol polietilénico; Pluronics; y sus combinaciones. Ejemplos de lioprotectores preferidos ¡ncluyen~pero~no-se-limitan aT los agentes de estabilización y agentes tensoactivos como se describe anteriormente. La presente invención proporciona formulaciones estabilizadas, las cuales pueden ser preparadas a través del proceso de liofilización. La liofilización es un proceso de estabilización en donde un sustrato primero es congelado y después se reduce la cantidad del solvente, primero mediante sublimación (el proceso de secado primario) y después desabsorción (el proceso de secado secundario) a valores que no soportarán más la actividad biológica a reacciones química. En una formulación liofilizada, las reacciones de hidrólisis, desaminación, oxidación y fragmentación asociadas con soluciones pueden ser evitadas o reducirse significativamente. Una formulación liofilizada también puede evitar el daño debido a fluctuaciones de temperatura de corto tiempo durante el embarque y permiten almacenamiento a temperatura ambiente. Las formulaciones de la presente invención también pueden ser secadas a través de otros métodos conocidos en la técnica, tales como secado por aspersión y secado por burbujeo. A menos que se especifique otra cosa, las formulaciones de la presente invención se describen en términos de sus concentraciones de componente según medidas en la formulación antes de la liofilización. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos y formulaciones para estabilizar anticuerpos que son propensos a degradación no enzimática, que puede ocurrir en la región de pivoteo. Los factores que pueden predisponer a - un- anticuerpo a escisión o división no enzimática incluyen secuencia de aminoácido, conformación y procesamiento post-traducción . La determinación de un anticuerpo experimenta escisión no enzimática puede lograrse a través de incubación del anticuerpo en una solución acuosa. Típicamente, la incubación es realizada a temperaturas elevadas para reducir la duración del estudio. Por ejemplo, una incubación durante 3 meses a 40°C o 50°C. Después de la incubación, los productos de degradación pueden ser analizados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño-cromatografía de líquido de alto rendimiento (SEC-HPLC). Varias técnicas analíticas conocidas en el campo pueden medir la estabilidad del anticuerpo de una formulación liofilizada reconstituida. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, determinar (i) estabilidad térmica utilizando calorimetría de exploración diferencial (DSC) para determinar la temperatura de fusión principal (Tm); (ii) estabilidad mecánica utilizando agitación controlada a temperatura ambiente; (iii) estabilidad de temperatura acelerada isotérmica en tiempo real a temperaturas de aproximadamente -20°C, aproximadamente 4°C, tempera ambiente (alrededor de 23°C-27°C), aproximadamente 40°C, y aproximadamente 50°C; (iv) turbiedades de solución verificando la absorbancia a aproximadamente 350 nm, y (v) la cantidad de monómero, agregados y degradantes utilizado SEC-HPLC. La estabilidad puede ser medida a una temperatura selecciona durante un tiempo seleccionado. En una modalidad, la formulación liofilizada proporciona una-alta concentración del anticuerpo después de reconstitución. En una modalidad más, la formulación liofilizada estable se puede reconstituir con un líquido para formar una solución con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 1-10 veces mayor que la concentración de anticuerpo de la formulación antes de la liofilización. Por ejemplo, en una modalidad, la formulación liofilizada es reconstituida con 1 mi de agua o menos para obtener una formulación . reconstituida libre de partículas con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 50 mg/ml aproximadamente 200 mg/ml. Los anticuerpos de existencia natural típicamente tienen dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, cada cadena ligera covalentemente unida a una cadena pesada a través de un enlace de disulfuro entre cadenas. Múltiples enlaces de disulfuro además enlazan las dos cadenas pesadas entre sí. Las cadenas individuales pueden duplicarse a dominios teniendo tamaños similares (110-125 aminoácidos) y estructuras, pero diferentes funciones. La cadena ligera puede comprender un dominio variable (VL), y/o un dominio constante (CL). La cadena pesada también puede comprender un dominio variable (vH) y/o, dependiendo de la clase o isotipo del anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), En seres humanos, los isotipos son IgA, IgD, I g E , IgG, e IgM, IgA e IgG además subdividiéndose en subclases o subtipos (lgA1-2 y IgG -4) En general, los dominios variables muestran variabilidad de secuencia de aminoácido considerable de un anticuerpo al siguiente, particularmente en la ubicación del sitio de unión de antígeno. Tres regiones, denominadas regiones hipervariables o de determinación de complementariedad (CDRs), se encuentran en cada uno de VL y VH, las cuales son soportadas por regiones menos variables denominadas regiones variables de estructura de trabajo. La porción de un anticuerpo que consiste de los dominios VL y VH, es designada como Fv (variable de fragmento) y constituye el sitio de unión de antígeno. La cadena individual Fv (scFv) es un fragmento de anticuerpo que contiene un domino VL y un dominio VH, en una cadena de polipéptido, en donde el término N de un dominio y el término C del otro dominio se unen a través de un enlazador flexible (ver, por ejemplo, Patente de EUA No. 4,946,778 (Ladner et al.); WO 88/09344, (Huston et al.). WO 92/01047 (McCafferty et al.) describe la presentación de fragmentos scFv sobre la superficie de paquetes de presentación genética recombinante solubles, tales como bacteriófagos. Los anticuerpos de cadena individual carecen de algunos o todos los dominios constantes de los anticuerpos enteros a partir de los cuales se derivan. Por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos enteros. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena individual tienden a estar libres de ciertas interacciones indeseadas entre regiones constantes de cadena pesada y otras moléculas biológicas. Además, los anticuerpos de cadena individual son considerablemente más pequeños que los anticuerpos enteros y pueden tener una mayor permeabilidad que los anticuerpos enteros, permitiendo que los anticuerpos de cadena individual se localicen y se unan a sitios de unión de antigénico más eficientemente. Además, el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos de cadena individual los hace menos probables a provocar una respuesta inmune no deseada en un receptor que en los anticuerpos enteros. Los anticuerpos de cadena individual múltiples, cada cadena individual teniendo un dominio VH y un dominio VL covalentemente enlazado a través de un primer enlazador de péptido, pueden ser covalentemente enlazados a través de por lo menos uno o más enlazadores de péptido para formar anticuerpos de cadena individual multivalentes, los cuales pueden ser monoespecíficos o multiespecíf icos. Cada cadena de un anticuerpo de cadena individual multivalente incluye un fragmento de cadena ligera variable y un fragmento de cadena pesada variable, y se enlaza a través de un enlazador de péptido a por lo menos otra cadena. El enlazador de péptido esta compuesto de por lo menos quince residuos de aminoácido. El número máximo de residuos de aminoácido es aproximadamente 100. Dos anticuerpos de cadena individual pueden ser combinados para formar un diacuerpo, también conocido como un dímero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de unión, y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio VH, conectado a un dominio Vi.. Los dominios están conectados con enlazadores que son lo suficientemente cortos para evitar la formación de pares entre dominios en la misma cadena, dirigiendo así la paridad entre dominios complementarios en diferentes cadenas para recrear los dos sitios de unión de antígeno. Tres anticuerpos de cadena individual pueden ser combinados para formar triacuerpos, también conocidos como trímeros trivalentes. Los triacuerpos están construidos con el término de aminoácido de un dominio VL o VH, directamente fusionado al término carboxilo de un dominio VL o VH, es decir, sin ninguna secuencia enlazadora. El triacuerpo tiene tres cabezas Fv con los péptidos dispuestos en una forma cíclica, de cabeza a cola. Una conformación posible del triacuerpo es plana, con los tres sitios de unión localizados en un plano a un ángulo de 120 grados entre sí. Los triacuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o triespecíficos. Fab (Fragmento, unión de antígeno) se refiere a los fragmentos del anticuerpo que consisten de los dominios VL CL VH, y CH1. Aquellos generados después de digestión de papaína simplemente son denominados como Fab y no retienen la región de pivoteo de cadena pesada. Después de la digestión de pepsina, varios Fabs que retienen el pivoteo de cadena pesada son generados. Aquellos fragmentos divalentes con los enlaces de disulfuro entre cadenas intactos son denominados como F(ab')2, mientras que un Fab' monovalente resulta cuando los enlaces de disulfuro no son retenidos. Los fragmentos de F(ab')2 tiene avidez superior para antígeno que los fragmentos de Fab monovalentes. Fe (Cristalización de fragmento) es la designación para la porción o fragmento de un anticuerpo que comprende dominios constantes de cadena pesada en pares. En un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fe comprende los dominios CH2 y CH3. El Fe de un anticuerpo IgA o un IgM además comprende un dominio CH4. El Fe está asociado con unión de receptor Fe, activación de citotoxicidad mediada por complemento, y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Para anticuerpos tales como IgA e IgM, los cuales son complejos de múltiples proteínas de tipo IgG, la formación de complejo requiere de dominios constantes de Fe. Finalmente, la región de pivoteo separa las porciones Fab y Fe del anticuerpo, proporcionando la movilidad de Fabs con relación uno al otro y con relación a Fe, así como incluyendo múltiples enlaces de disulfuro para enlace covalente de las dos cadenas pesadas. De esta manera, los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de existencia natural, fragmentos bivalentes tales como (Fab')2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos de cadena individual, Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos de dominio individual, anticuerpos de cadena individual multivalentes, diacuerpos, triacuerpos, y similares, que se unen específicamente con antígenos. Los anticuerpos, o sus fragmentos, de la presente invención, por ejemplo, pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen dos diferentes caracteres específicos o sitios de unión de antígeno. Cuando un anticuerpo tiene más de un carácter especifico, los epítopos reconocidos pueden ser asociados con un antígeno individual o con más de un antígeno. De esta manera, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos, o fragmentos de los mismos, que se unen a dos diferentes antígenos. El carácter específico de anticuerpos, o sus fragmentos, puede ser determinado basándose en afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo ( Kd) , mide la resistencia de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión de anticuerpo. La avidez es la medida de la resistencia de unión entre un anticuerpo con su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo con su sitio de unión de antígeno en el anticuerpo, como la valencia del anticuerpo, que se refiere al número de sitios de unión de antígeno de un epítopo particular. Los anticuerpos típicamente se unen con una constante de disociación (kd) de 10"5 a 10"11 litros/mol. Cualquier Kd menor que 10~4 litros/mol generalmente se considera que indica unión no específica. Entre más bajo sea el valor de Kd, más fuerte es la resistencia de unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión de anticuerpo. Como se utiliza aquí, "anticuerpos" y "fragmentos de anticuerpo" incluyen modificaciones que retienen el carácter específico para un antígeno especifico. Dichas modificaciones-incluyen, pero no se limitan a conjugación a una molécula efectora tal como un agente quimioterapéutico (por ejemplo, cisplatina, taxol, doxorubicina) o citotoxina (por ejemplo, una proteína, o un agente quimioterapéutico orgánico que no es proteína). Los anticuerpos pueden ser modificados a través de la conjugación a porciones de reportero detectables. También se incluyen anticuerpos con alteraciones que afectan las características de no unión, tales como la vida media (por ejemplo, pegilación). Las proteínas y agentes que no son proteínas se pueden conjugar a anticuerpos a través de métodos que son conocidos en la técnica. Los métodos de conjugación incluyen enlace directo, enlace a través de enlazadores covalentemente unidos, y miembros en pares de unión específicos (por ejemplo, avidina-biotina). Dichos métodos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos por Greenfield et al., Cáncer Research 50,6600-6607 (1990) para la conjugación de doxorubicina y aquellos descritos por Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991) y por Kiseleva et al., Mol. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991) para la conjugación de compuestos de platino. Los anticuerpos de la presente invención además incluyen aquellos para los cuales las características de unión han sido mejoradas a través de mutación directa, métodos de maduración de afinidad, presentación de fago, o entremezclado de cadena. La afinidad y el carácter especifico pueden ser modificados o mejorados a través de mutación de CDRs y clasificación para sitios de unión de antígeno teniendo las características deseadas- (ver, por ejemplo, Yang et al., J. Mol. Biol., 254:392-403 (1995)). Las CDRs son mutadas en una variedad de formas. Una forma es aleatorizar residuos individuales o combinaciones de residuos, de manera que en una población de sitios de unión de antígeno de otra manera idénticos, los veinte aminoácidos se encuentran en posiciones particulares. Alternativamente, se inducen mutaciones a través de una escala de residuos de CDR a través de métodos de PCR propensos a error (ver, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación de fago que contienen genes de región variable de cadena pesada y ligera pueden ser propagados en cepas mutantes de E. coli (ver, por ejemplo, Low et al., J. Mol. Biol., 250:359-368 (1996)). Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos métodos conocidos por algún experto en la técnica. Cada dominio de los anticuerpos de esta invención puede ser un dominio de inmunoglobulina completo (por ejemplo, un domino variable o constante de cadena pesada o ligera), o puede ser un equivalente funcional o un muíante o derivado de un dominio de existencia natural, o un dominio sintético construido, por ejemplo, in vitro utilizando una técnica tal como alguna descrita en WO 93/11236 (Griffiths et al.). Por ejemplo, es posible unir conjuntamente dominios que corresponden a dominios variables de anticuerpo, los cuales no están presentes en al menos un aminoácido. El aspecto de caracterización importante de los anticuerpos es la presencia de un sitio de unión de antígeno. Los términos fragmento de cadena pesada y ligera variable no deben ser construidos para excluir variantes que no tengan un efecto material sobre el carácter específico. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden ser obtenidos, por ejemplo, de anticuerpos de existencia natural, o bibliotecas o colecciones de presentación de fago Fab o scFv. Se debe entender que, para hacer un anticuerpo de dominio individual de un anticuerpo que comprende un dominio VH y VL, ciertas substituciones de aminoácido fuera de la CDRs pueden ser deseadas para mejorar la unión, expresión o solubilidad. Por ejemplo, puede ser deseable modificar residuos de aminoácido que de otra manera pueden quedar enterrados en la superficie colindante de VH-VL. Además, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención pueden ser obtenidos a través de tecnología de hibridoma estándar (Harlow & Lañe, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), la cual se incorpora aquí por referencia) utilizando ratones transgénicos (por ejemplo, ratones KM de Medarex, San José, Calif.) que producen cadenas gama pesadas y kappa ligera de inmunoglobulina humana. En una modalidad preferida, una porción sustancial del anticuerpo humano que produce genoma es insertada en el genoma de un ratón, y se hace deficiente en la producción de anticuerpos de murino endógenos. Dichos ratones pueden ser inmunizados subcutáneamente (s.c.) con parte o toda la molécula objetivo en un auxiliar completo de Freund. La presente invención también proporciona un método para tratamiento, que comprende administrar una formulación reconstituida. Las formulaciones reconstituidas se preparan reconstituyendo las formulaciones liofilizadas de la presente invención, por ejemplo, con 1 mi de agua. El tiempo de reconstitución preferiblemente es menor que un minuto. La formulación reconstituida concentrada permite flexibilidad en administración. Por ejemplo, la formulación reconstituida puede ser administrada en una forma diluida intravenosamente, o puede ser administrada en una forma más concentrada mediante inyección. Una formulación reconstituida concentrada de la presente invención puede ser diluida a una concentración que. es diseñada para el sujeto particular y/o la ruta de administración particular. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos de tratamiento que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva dé un anticuerpo a un mamífero, particularmente un ser humano, con la necesidad de esto. El término administrar como se utiliza aquí, significa suministra la composición de anticuerpo de la presente invención a un mamífero a través de cualquier método que pueda lograr el resultado buscado. La formulación reconstituida puede ser administrada, por ejemplo, intravenosa o intramuscularmente. En una modalidad, una formulación reconstituida concentrada se administra a través de inyección. Los anticuerpos de la presente invención son preferiblemente humanos. En una modalidad, la composición de la presente invención puede ser utilizada para tratar enfermedades neoplásticas, incluyendo tumores sólidos y no sólidos y para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. Cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de anticuerpo de la presente invención que, cuando se administra a un mamífero, es efectiva para producir el efecto terapéutico deseado, tal como reducir o neutralizar la actividad de VEGFR, inhibición de crecimiento de tumor, o tratar una enfermedad hiperproliferativa no cancerosa. La administración de los anticuerpos como se describió anteriormente puede ser combinada con administración de otros anticuerpos o cualquier agente de tratamiento convencional, tal como un agente anti-neoplástico. En una modalidad de la invención, la composición puede ser administrada en combinación con uno o más agentes antineoplástico. Se puede utilizar cualquier agente anti-neoplástico adecuado, tal como un agente quimioterapéutico, radiación o combinaciones de los mismos. El agente anti-neoplástico puede ser un agente de alquilación o un anti-metabolito. Ejemplos de agentes de alquilación incluyen, pero no se limitan a, cisplatina, ciclofosfamida, melfalan, y dacarbazina. Ejemplos de anti-metabolitos incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina, daunorubicina, paclitaxel, irinotecan (CPT-11), y topotecan. Cuando el agente anti-neoplástico es radiación, la fuente de la radiación puede ser ya sea externa (terapia de radiación de rayo externo -EBRT) o interna (braquioterapia - BT) al paciente que se está tratando. La dosis del agente anti-neoplástico administrada depende de numerosos factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y severidad de tumor que se va a tratar y la ruta de administración del agente. Sin embargo, se debe enfatizar que la presente invención no está limitada a ninguna dosis particular. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos para VEGFR, IGF-IR, EGFR y PDGFR. En una modalidad, los anticuerpos, o sus fragmentos, de la presente invención son específicos para VEGFR. En otra modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos, o sus fragmentos, que se unen a dos diferentes antígenos, con al menos un carácter especifico para VEGFR. VEGFR se refiere a la familia de receptores de VEGF humanos, incluyendo VEGFR-1 (FLT1), VEGFR-2 (KDR), VEGFR-3 (FLT4) . El factor de crecimiento endotelial bascular (VEGF) es un mediador clave de angiogénesis. En seres humanos saludables, el VEGF promueve angiogénesis en el desarrollo de embrión, para curar heridas, y durante el ciclo reproductivo femenino. Sin embargo, el VEGF media angiogénesis en tumores cuando es sobre-regulado por expresión de oncogén, factores de crecimiento, e hipoxia. La angiogénesis es esencial para el desarrollo de tumor más allá de cierto tamaño por la difusión limitada de nutrientes y oxigeno. De esta manera, en una modalidad, el anticuerpo anti-VEGFR se une a VEGFR y bloque la unión de un ligando, tal como VEGF. Este bloqueo puede dar como resultado la inhibición de crecimiento de tumor, que incluye la inhibición de invasión- de- tumor, metástasis; — reparación de célula, y angiogénesis, interfiriendo con los efectos de la activación de VEGFR. En una modalidad, el anticuerpo es el anticuerpo anti-VEGFR-2 (KDR), IMC-1121B (IgG 1 ), el cual se describe en WO 03/07840 (PCT/US03/06459). El nucleótido y la sustancia de aminoácido de VH para IMC-1121B están representadas en SEQ. ID. NOS. 1 y 2, respectivamente. El nucleótido y la secuencia de aminoácido de VL para IMC-1121B están representados en SEQ. ID. NOS: 3 y 4, respectivamente. Los equivalentes de los anticuerpos, o sus fragmentos, la presente invención también incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácido de las regiones variables o hipervariables del anticuerpo anti-VEGFR de longitud completa provisto aquí. Substancialmente la misma secuencia de aminoácido es definida aquí como una secuencia con al menos aproximadamente 70%, de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, y muy preferiblemente por lo menos alrededor de 90% de homología, según determinada a través del método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85,2444-8 (1998)).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos además ilustran la invención, pero no deben ser construidos para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Las descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como aquellos empleados en el análisis de proteínas, pueden ser obtenidas a partir de numerosas publicaciones tales como Current Protocols in Immunology (publicada por John Wiley & Sons). Todas las referencias mencionadas aquí se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Ejemplo 1. Fragmentación del Anticuerpo anti-VEGFR2, e IMC-1121 B. Se incubó IMC-1121B a 5 mg/ml en salina regulada en su pH con fosfato (PBS) a 40°C durante 3 meses. Después de esta incubación, se utilizaron SEC-HPLC y secuenciación N-terminal para analizar los productos de degradación. El cromatograma de SEC-HPLC de IMC-1121 B degradada en PBS se muestra en la Figura 1. El producto degradado tiene dos picos degradantes (fracciones 2 y 3) además de picos de agregado (fracción 1) y de monómero. Las fracciones fueron recolectadas utilizando un colector de fracción para análisis de secuencia N-terminal. La secuencia de ADNc para la cadena pesada de IMC-1121B se muestra en la Figura 2. La secuencia de señal, regiones variables y regiones constantes se muestran con un texto subrayado, doblemente subrayado y plano, respectivamente. El análisis de secuenciación N-terminal de la muestra degradada y fracciones 2 y 3 muestra dos sitios de fragmentación en la cadena pesada (texto ilustrado en gris en la Figura 2). El sitio en el residuo 156 del término N dio como resultado dos fragmentos de cadena pesada detectados en SDS-PAGE reducida (Figura 3) como bandas de aproximadamente 40KD y aproximadamente 15KD. El otro sitio de fragmentación en la región de pivoteo en el residuo 220 del término N dio como resultado bandas de aproximadamente 33 KD y aproximadamente 27 KD en SDS-PAGE reducido (Figura 3).

Ejemplo 2. Optimización de Formulación de Regulador de pH La formulación secada por congelación para IMC-1121B se desarrolló en dos etapas. En la primera etapa, el regulador de pH de solvente fue optimizado utilizando un diseño de aspecto de experimento (DOE) con modelación factorial fraccional como se ilustra en el Cuadro 1. Los factores clasificados en este proceso de optimización fueron regulador de pH, pH, sal, aminoácidos, azúcares y agente tensoactivo, y derivados de azúcar. Se realizó la optimización de solvente a una concentración de 1121B de 5 mg/ml. Se utilizó agitación controlada a 300 rpm a temperatura ambiente para probar la estabilidad mecánica. La estabilidad térmica se probo utilizando DSC y temperaturas aceleradas. Las predicciones de DOE fueron confirmadas utilizando metodología tradicional de un factor a un tiempo. Se utilizó análisis de regresión lineal para determinar la importancia de los resultados.

Cuadro 1. Diseño de matriz de experimento (DOE) Estudio de calorimetría de exploración diferencial (DSC): Se midió la temperatura de fusión, o de transición (Tm) utilizando MicroCal VP-DSC. La concentración de proteína se fijó a 5 mg/ml y la rampa de temperatura fue de 5°C a 95°C a una velocidad de exploración de 1.5°C/min. Se recolectaron curvas de fusión térmica de IMC-1121B en varias formulaciones (Cuadro 1). Las temperaturas de fusión que corresponden al pico de transición principal (50% de las moléculas son desnaturalizadas) se ajustaron a un modelo de regresión lineal para estimar el efecto de variables probadas sobre Tm. El modelo fue estadísticamente importante con un p = 0.0006. Los factores importantes (p<0.05) fueron pH y tipo de regulador de pH. La gráfica de regresión para la variación de Tm con tipo de regulador de pH y pH se muestra en la Figura 4. El pH óptimo fue de aproximadamente 6.0 para los reguladores de pH de histidina, citrato y acetato, los cuales fueron superiores al regulador de pH de fosfato, a un pH de 6.0. Otras variables no presentaron un efecto estadísticamente importante sobre la Tm. Estudio de Agitación: Se agitaron soluciones de anticuerpo en un agitador de plataforma 300 rpm a temperatura ambiente. Se agitaron cinco mL de IMC-1121B a 5 mg/ml en un frasco de vidrio de 20 mL en varias formulaciones (Cuadro 1) durante hasta 84 horas. Se determinaron como sigue la turbiedad de solución, porcentaje de monómero, porcentaje de agregado, y porcentaje de degradante. Se midió la turbiedad de soluciones a través de absorbancia a 350 nm utilizando un espectrofotómetro bioespecífico Shimatzu 1601. El porcentaje de monómero, porcentaje de agregado y porcentaje de degradante se midieron utilizando SEC-HPLC realizadas en un aparato Agilent 1100 Serie LC utilizando una columna Tosoph Biosep TSK 3000 con 10 mM de fosfato de sodio, 0.5M CsC1 a pH 7.0 como la fase móvil. El efecto de variables probadas sobre turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se estimó ajustando a un modelo de regresión lineal utilizando software JMP (SAS institute, NC). El valor p para la gráfica Actual por Pronosticada fue de <0.002. Los efectos de las variables de pH importantes, Tween 80, NaCI y tiempo de turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se muestran en la Figura 5. Estabilidad de temperatura acelerada, en tiempo real a 40°C: La IMC-1121B a 5 mg/ml en varias formulaciones (Cuadro 1) se incubó a 40°C durante hasta 14 días. Se determinaron la turbiedad de solución, porcentaje de monómero, agregado y degradante como se describe anteriormente. El efecto de variables probadas sobre turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se estimó ajusfándolo a un modelo de regresión lineal utilizando el software JMP. El valor p para las gráficas Actual por Pronosticada fue de <0.001. El efecto de variable es importante sobre turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se muestran en la Figura 6. El regulador de pH óptimo fue histidina a un pH de 6.0. La sal redujo el monómero e incremento la agregación. Pero no afecto la degradación. La glicina no tuvo efecto sobre el monómero, agregado o degradante. Estabilidad de temperatura de congelación en tiempo real a -20°C: El anticuerpo IMC-1121B a 5 mg/ml en varias formulaciones (Cuadro 1) se incubo a -20°C durante hasta 16 días. La turbiedad de solución, porcentaje de monómero, agregado y degradante se estimo como se describe anteriormente. El efecto de variables probadas sobre turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se determinó ajustando a un modelo de regresión lineal utilizando el software JMP. El valor p para la gráfica Actual por Pronosticado fue de <0.001. El efecto de variable es importante sobre turbiedad, porcentaje de monómero, agregado y degradante se muestran en la Figura 7. El pH óptimo fue de 6.0. El ácido aspártico incremento el monómero y redujo la agregación con une efecto mínimo sobre degradación. NaCI y glicina tuvieron un efecto insignificante sobre la turbiedad, monómero, agregado y degradante.

Ejemplo 3. Comparación de Estabilidad de IMC-1121B en PBS y Formulaciones de 10 mM de Regulador de pH de Histidina (pH 6.0).

Los estudios de clasificación de DOE pronosticaron que el anticuerpo IMC-1121B tuvo una estabilidad significativamente mejor en una formulación de 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) que en PBS. En ese estudio, la estabilidad de IMC-1121B a 5 mg/ml como concentración en 10 mM de histidina, pH 6.0 y PBS, se examinó a través de varias técnicas para confirmar la predicción de DOE. Estudio de calorimetría de exploración diferencial (DSC): Se examinaron la estabilidad térmica de IMC-1121B en PBS y formulaciones de 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) de acuerdo con el procedimiento descrito en los Métodos. Las temperaturas de fusión para la transición principal fueron 70.0 y 76.6°C para IMC-1121B en PBS y 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0), respectivamente. Estabilidad de temperatura acelerada en tiempo real a 40°C y temperatura ambiente: Se incubó el IMC-1121B a 5 mg/ml a 40°C y temperatura ambiente (RT) durante hasta 150 días en PBS y formulaciones de 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). Después de la incubación, las muestras se analizaron a través de SEC-HPLC, IEC-HPLC, SDS-PAGE e IEF como se describe anteriormente. Análisis de SEC-HPLC: El análisis de SEC-HPLC de IMC-1121B en PBS o 10 mM de regulador- de- pH-de- histidina- (pH- 6,0)— después de 150 días de incubación a 40°C y temperatura ambiente se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Los cromatogramas de HPLC se muestran en la Figura 8. El porcentaje total de agregado en muestras de control, temperatura ambiente y 40°C fue de 0.90, 1.49 y 3.90 para PBS, y 0.80, 0.82 y 0.75 para 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0), respectivamente. El porcentaje total de degradante en las muestras de control, temperatura ambiente y 40°C fue de 1.32, 2.56 y 12.54, respectivamente, para PBS y de 1.23, 2.09 y 9.00 para 10 mM de regulador de pH de histidina, formulaciones, pH 6.0, respectivamente. Los cambios en el porcentaje de monómero, porcentaje de agregado, y porcentaje de degradante como una función de tiempo de incubación se muestran en las Figuras 9, 10 y 11, respectivamente. El porcentaje de monómero se redujo y el porcentaje de agregado y porcentaje de degradante se incrementaron a una velocidad más rápida en la formulación de PBS que en 10 mM de histidina (pH 6.0). La formulación de 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) proporciona un ambiente superior para el mantenimiento del anticuerpo IMC-1121B. Análisis de IEC-HPLC: Se realizó la cromatografía de intercambio de ión de IMC-1121B después de 30 y 150 días de incubación a 40°C y temperatura ambiente en un aparato Agilent 1100 Serie LC utilizando una columna analítica Dionex ProPac WCX-10. Las muestras se eluyeron con un gradiente lineal de 10 mM fosfato (pH 7.0), 20 mM NaCI a 10 mM Fosfato (pH 7.0), 100 mM NaCI en 32 minutos. Los cromatogramas de IEC-HPLC se muestran en la Figura 12. La incubación a temperatura ambiente y a 40°C causo que los picos se desplazaran hacia el tiempo de retención más bajo (es decir, hacia un pH ácido) en ambas formulaciones. Sin embargo, los desplazamientos fueron considerablemente mayores en la formulación de PBS que en la formulación de 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). Análisis de SDS-PAGE: El anticuerpo IMC-1121B (a 5 mg/ml) en PBS o 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) se incubó a temperatura ambiente o a 40°C durante 150 días antes del análisis mediante SDS-PAGE de reducción y de no reducción (4-20% de gel de gradiente de tris-glicina) de acuerdo con protocolos estándares. Las muestras incubadas en PBS tuvieron cantidades mayores de productos de degradación que las muestras incubadas en 10 mM de histidina (pH 6.0) según medido por la intensidad de las bandas (Figura 13). Análisis de Enfoque Isoeléctrico (IEF): IMC-1121B a 5 mg/ml en formulaciones de PBS y 10 mM de histidina (pH 6.0) después de 150 días de incubación a temperatura ambiente y a 40°C se analizó a través de IEF (escala de pH 6.0-10.5). Se realizó el análisis de enfoque isoeléctrico en placas de IsoGel® Agarose IEF con una escala de pH de 6.0 a 10.5. Las bandas resultantes emigraron hacia un pH ácido en las formulaciones tanto de PBS como de histidina. Sin embargo, el desplazamiento fue mayor para la formulación de PBS que para la formulación de 10 mM de histidina (pH 6.0) (Figura 14).

Ejemplo 4. Clasificación de Formulación de Secado por Congelación. En la segunda etapa de optimización, se optimizaron agentes proporcionadores de volumen y crio-lio-protectores a una concentración de anticuerpo fija de 20 mg/ml en 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). Los aditivos probados fueron manitol, glicina, sacarosa y trehalosa como se muestra en el diseño de matriz experimento (Cuadro 2). Como controles, se analizó el anticuerpo IMC-1121B a una concentración de 5 mg/ml en formulación de solución (sin secado por congelación) con regulador de pH de PBS (pH 6.0) o 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0).

Cuadro 2: Matriz DOE para Clasificación de Formulación Secada por Congelación Proceso de Secado por Congelación: Los productos fueron liofilizados utilizando un secador por congelación Lyostar II. La charola de liofilización se cargo con la muestra a temperatura ambiente. Los productos se remojaron a -50°C durante 2 horas. Se realizó un secado primario a -30°C durante 10 horas seguido por un secado secundario a 20°C durante otras 10 horas. Las velocidades de enfriamiento y calentamiento fueron de 0.5°C/min. La presión de la cámara durante el secado primario y secundario fue de 50 mT. Una vez que se completo la liofilización, la cámara de muestra se relleno con N2 y se tapó. El proceso de liofilización se completo en aproximadamente 24 horas. La temperatura fija de almacén y la temperatura de los productos como una función de tiempo de operación se muestra en la Figura 15. El proceso de liofilización se consideró completo cuando la temperatura del producto alcanzó (o cruzo) la temperatura de fijación de almacén. Estabilidad de temperatura acelerada: Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas fueron incubadas durante 100 días ya sea a 40°C o 50°C. Después del periodo de incubación, los productos se reconstituyeron a 5 mg/ml con 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). El tiempo de reconstitución fue menos de 1 min. El porcentaje de monómeros que permaneció después de la incubación se muestra en la Figura 16. Las formulaciones secadas por congelación con 4% de sacarosa o 4% de trehalosa retuvieron el porcentaje más alto de monómero después de las incubaciones de 100 días a 40°C y 50°C. Comparación de estabilidad de temperatura acelerada entre formulaciones secadas por congelación y formulaciones de solución: Las formulaciones secadas por congelación: (1) 20 mg/ml IMC-1121 B, 4% de sacarosa, 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0), y (2) 20 mg/ml IMC-1121B, 4% de trehalosa, 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0), se compararon con formulaciones de solución (1) 5 mg/ml IMC-1121B en PBS (pH 7.2) y (2) 5 mg/ml IMC-1121B en 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). Las muestras se incubaron a 40°C o 50°C durante hasta 100 días. Después del periodo de incubación, los productos de liofilización fueron reconstituidos a 5 mg/ml con 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). Las muestras liofilizadas reconstituidas y las muestras de solución fueron analizadas a través de SEC-HPLC. La variación de porcentaje de monómero, agregado y degradante como una función del tiempo de incubación a 40°C o 50°C se proporciona en las Figuras 17 a 23. El porcentaje de degradación se incremento con el tiempo en ambas formulaciones de solución, pero se mantuvo sin cambio en las formulaciones liofilizadas (Figuras 19 y 22).

Ejemplo 5. Formulación de secado por congelación para anticuerpo de alta concentración. Los resultados previos demostraron que los compuestos probados, 4% de sacarosa o 4% de trehalosa, proporcionan la estabilidad mayor para formulaciones secadas por congelación del anticuerpo IMC-1121B a concentraciones de 20 mg/ml. En este estudio, se incremento la concentración de IMC-1121B de 20 mg/ml a 50 mg/ml y se varío la concentración de sacarosa de 4% a 8% con el objetivo de formular un IMC-1121B a una concentración de 50 mg/ml. Como un control, también se liofilizó IMC-1121B a 20 mg/ml en presencia de 4% de sacarosa. Los productos liofilizados y la formulación de solución de control se incubaron a temperatura ambiente, 40°C y 50°C durante hasta 3 meses. La formulación de solución de control consistió de la formulación de solución optimizada, actual recomendada para el anticuerpo IMC-1121B (5 mg/ml en 10 mM de histidina, 133 mM Glicina, 75 mM NaCI, 0.01% Tween 80). Después del período de incubación, los productos liofilizados fueron reconstituidos a 5 mg/ml con 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) y después se analizaron a través de SEC-HPLC, IEC-HPLC, y SDS-PAGE de reducción y no reducción. Análisis de SEC-HPLC de IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a 50°C: Se realizó SEC-HPLC en muestras antes y después de liofilización y después de incubaciones de un mes y 3 meses a 50°C. Después de la incubación, los productos liofilizados fueron reconstituidos con 10 mM histidina (pH 6.0). La variación en el porcentaje de monómero, agregado y degradante se muestra en las Figuras 23, 24 y 25, respectivamente. El porcentaje de monómero fue mayor y el de agregado fue menor para la muestra de 8% de sacarosa. Las muestras liofilizadas contuvieron significativamente menos degradantes que las muestras formuladas en solución. Análisis de SEC-HPLC e IEC-HPLC de IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de incubación a temperatura ambiente y a 40°C: Se realizaron SEC-HPLC e IEC-HPLC en muestras antes y después de liofilización y después de incubaciones de un mes y 3 meses a temperatura ambiente y 40°. Después de la incubación, los productos liofilizados fueron reconstituidos con 10 mM de regular de pH de histidina (pH 6.0). La variación del porcentaje de monómero, agregado y degradante se muestra en las Figuras 26, 27 y 28, respectivamente para las muestras incubadas a 40°C, y en las Figuras 30, 31 y 32, respectivamente, para las muestras incubadas a temperatura ambiente. Las muestras liofilizadas contuvieron significativamente menos degradantes que las muestras formuladas en solución. Un cromatograma de IEC-HPLC del IMC-1121B incubado 3 meses en solución, o secado por congelación conteniendo 8% de sacarosa, se muestra en la Figura 29 (incubaciones a 40°C) y Figura 23 (incubaciones a temperatura ambiente). Se incluyó una muestra de IMC-1121B de referencia para comparación. El cromatograma de la muestra deseada por congelación es similar al IMC-1121B de referencia, pero el cromatograma para el IMC-1121B formulado en solución se desplazó hacia un pH ácido. Análisis de SDS-PAGE de IMC-1121B liofilizado y formulado en solución después de una incubación de 3 meses: Los productos liofilizados fueron reconstituidos en 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0). El IMC-1121B se mantuvo en solución, y se analizaron las muestras secadas por congelación reconstituidas de IMC-1121B en 10 mM de regulador de pH de histidina (pH 6.0) con un 4-20% de SDS-PAGE de reducción (Figura 34) y 4-20% de SDS-PAGE de no reducción (Figura 35) después de una incubación de tres meses. Las formulaciones liofilizadas, 20 mg/ml de anticuerpo con 4% de sacarosa y 50 mg/ml de anticuerpo con 8% de sacarosa presentaron una degradación de cadena pesada significativamente reducida en comparación con la formulación no liofilizada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación estable que comprende un anticuerpo y un regulador de pH, en donde la fragmentación no enzimática del anticuerpo se reduce substancialmente.

2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGFR.

3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGFR2.

4. La formulación de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo VEGFR2 es IMC-1121B.

5. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/ml.

6. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de histidina.

7. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM.

8. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 10 mM.

9. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

10. La formulación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 6.0.

11. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de citrato.

12. La formulación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el pH del regulador de pH de citrato es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

13. La formulación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el pH del regulador de pH de citrato es de aproximadamente 6.0.

14. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de acetato.

15. La formulación de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el pH del regulador de pH de acetato es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

16. La formulación de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el pH del regulador de pH de acetato es de aproximadamente 6.0.

17. Una formulación liofilizada estable que comprende: un anticuerpo, un regulador de pH, y un lioprotector, en donde la fragmentación no enzimática del anticuerpo substancialmente se reduce.

18. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGFR.

19. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGFR2.

20. La formulación de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el anticuerpo VEGFR2 es IMC-1121B.

21. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/ml.

22. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de histidina.

23. La formulación de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM.

24. La formulación de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 10 mM.

25. La formulación de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

26. La formulación de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 6.0.

27. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de citrato.

28. La formulación de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el pH del regulador de pH de citrato es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. 29. La formulación de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el pH del regulador de pH de citrato es de aproximadamente

6.0.

30. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de acetato.

31. La formulación de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el pH del regulador de pH de acetato es de aproximadamente

5.5 a aproximadamente 6.5. 32. La formulación de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el pH del regulador de pH de acetato es de aproximadamente 6.0.

33. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el lioprotector es un azúcar.

34. La formulación de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el lioprotector es una sacarosa.

35. La formulación de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el lioprotector es un trehalosa.

36. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, la cual comprende además un agente tensoactivo.

37. La formulación de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el agente tensoactivo es tween 80.

38. La formulación de acuerdo con la reivindicación 17, la cual comprende además un agente de estabilización.

39. La formulación de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el agente de estabilización es ácido aspártico.

40. Una formulación liofilizada que comprende: un anticuerpo anti-VEGFR, un regulador de pH, y un lioprotector.

41. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo es un anticuerpo VEGFR2.

42. La formulación de acuerdo con la reivindicación 41, en donde el anticuerpo VEGFR2 es IMC-1121B.

43. La formulación de acuerdo con la reivindicación 42, en donde la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/ml.

44. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el regular de pH comprende un regulador de pH de histidina.

45. La formulación de acuerdo con la reivindicación 44, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM.

46. La formulación de acuerdo con la reivindicación 44, en donde la concentración de regulador de pH de histidina es de aproximadamente 10 mM.

47. La formulación de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

48. La formulación de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el pH de regulador de histidina es de aproximadamente 6.0.

49. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de citrato.

50. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el regulador de pH comprende un regulador de pH de acetato.

51. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el lioprotector es un azúcar.

52. La formulación de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el lioprotector es sacarosa.

53. La formulación de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el lioprotector es una trehalosa.

54. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, que comprende además un agente tensoactivo.

55. La formulación de acuerdo con ía reivindicación 54, en donde el agente tensoactivo es tween 80.

56. La formulación de acuerdo con la reivindicación 40, la cual comprende además un agente de estabilización.

57. La formulación de acuerdo con la reivindicación 56, en donde el agente de estabilización es ácido aspártico.

58. Una formulación liofilizada que comprende: un anticuerpo anti-VEGFR2, un regulador de pH de histidina, y un azúcar lioprotector.

59. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el anticuerpo VEGFR2 es IMC-1121B.

60. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

61. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el pH del regulador de pH de histidina es de aproximadamente 6.0.

62. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el lioprotector es sacarosa.

63. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, en donde el lioprotector es trehalosa.

64. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, que además comprende un agente tensoactivo.

65. La formulación de acuerdo con la reivindicación 64, en donde el agente tensoactivo es tween 80.

66. La formulación de acuerdo con la reivindicación 58, la cual comprende además un agente de estabilización.

67. La formulación de acuerdo con la reivindicación 66, en donde el agente de estabilización es ácido aspártico.

68. Un método para tratar, que comprende administrar una formulación reconstituida que comprende: un anticuerpo anti-VEGFR, un regulador de pH, y un lioprotector.