MX2007015758A

MX2007015758A - Uso de leucocidina de panton-valentine para tratar y prevenir infecciones por estafilococos.

Info

Publication number: MX2007015758A
Application number: MX2007015758A
Authority: MX
Inventors: Ali Ibrahim Fattom; Kimberly Louise Taylor
Original assignee: Nabi Biopharmaceuticals
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2008-02-22
Also published as: AU2006257774B2; TW200716670A; KR20080016956A; KR101302764B1; CN101218252A; EP2289938A3; US20090074755A1; AU2006257774A1; CA2611023A1; JP5096326B2; WO2006135912A2; JP2008546648A; AR055580A1; TWI374892B; EP2289938A2; NZ565069A; EP1915396A2; WO2006135912A3; CN102698261A

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos para tratar infecciones por Staphylococcus aureus (S. aureus). En particular, la presente invencion provee vacunas que comprenden un antigeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL), anticuerpos que se unen al antigeno de PVL y composiciones que los contienen, a metodos para elaborar dichas composiciones y a metodos para tratar infecciones por S. aureus, incluyendo aquellas que son infecciones meticilino-resistentes adquiridas en la comunidad. La presente invencion tambien provee anticuerpos contra PVL, incluyendo anticuerpos contra PVL especificos para una sola subunidad de PVL, y antigenos de PVL, incluyendo antigenos de PVL conjugados y mutados.

Description

USO DE LEUCOCIDINA DE PANTON-VALENTINE PARA TRATAR Y PREVENIR INFECCIONES POR ESTAFILOCOCOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en términos generales al tratamiento y prevención de infecciones bacterianas.- En particular, en la presente invención se describen composiciones y métodos para tratar y prevenir infecciones por Staphylococcus a ureus ( S . aureus) , incluyendo infecciones por S . aureus meticilino-resistente adquirido en la comunidad (CA-MSRA) , utilizando composiciones que comprenden un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) o anticuerpos que se unen específicamente a la misma. La presente invención también se refiere en términos generales a anticuerpos y antigenos que pertenecen a las proteínas LukF-PV y LukS-PV, a versiones mutadas de dichas proteínas, y a combinaciones de proteína de fusión de dichas subunidades de PVL.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias Staphylococcus aureus, con frecuencia referida como "estafilos," "staph. aureus", o " S . aureus" comúnmente se encuentran en la piel o en la nariz de individuos sanos. Aproximadamente un 20-30% de la población está colonizada con S . aureus en cualquier momento dado. Estas bacterias con frecuencia causan infecciones menores, tales como barros y espinillas (pimples and boils) . Sin embargo, S. aureus también causa bacteremia grave y potencialmente letal, la cual es una condición médica caracterizada por bacterias viables presentes en el torrente sanguíneo. S. aureus expresa un número de factores de virulencia incluyendo polisacáridos capsulares y toxinas proteínicas. PVL es una proteína de S . a ureus que pertenece a una familia de toxinas sinergohimenotrópicas, las cuales dañan las membranas de las células de defensa del hospedero, glóbulos blancos, y eritrocitos mediante la acción sinergista de dos clases no asociadas de proteínas o subunidades secretoras. Supersac et al . , Infect . Immun . 61:580-7 (1993). Esta familia de proteínas incluye las proteínas alfa-he olisina (alfa-toxinaa) , beta-hemolisina, delta-hemolisina, gamma-hemolisina, leucocidina (Lu ) y PVL (LukS-PV y LukF-PV) . PVL fue descubierta por primera vez mediante observación de actividad leucotóxica en S . aureus . Van der Velde, La Cellule, 10:401-9 (1894). Posteriormente Panton y Valentine pudieron diferenciar a PVL de otras hemolisinas en la cepa V8 proveniente de un individuo con furunculosis crónica. Panton P., Lancet, 222:506-8 (1932). Woodin descubrió después que PVL está constituida por dos subunidades, LukS-PV y LukF-PV. Woodin AM. , Biochem . J. , 73:225-37 (1959) y Woodin AM. , Biochem . J. , 75:158-65 (1960) . Se ha demostrado que PVL es leucotóxica mediante inducción de poro p.ara células polimorfonucleadas (PMNs) y macrófagos de conejo y de humano. Finck-Barbancon et al . , Biochim . Biophys . Acta , 1182:275-82 (1993). PVL purificada induce lesiones inflamatorias severas cuando se inyecta por vía intradérmica en conejos, que conlleva a dilatación capilar, quimiotaxis, infiltración de PMN, carioclasis de PMN, y necrosis de la piel. Prevost et al . , J. Med. Microbiol . , 42:237-45 (1995) y Ward et al . , Infect . Immun . , 28:393-7 (1980). Las actividades leucotóxicas y hemolíticas de PVL implican unión secuencial y asociación sinergística de las dos subunidades de PVL. Primero, LukS-PV interactúa con un objetivo de membrana (Colin et al . , Infect . Immun . 62:3184-8 (1994)). Después de esto, la subunidad LukF-PV liga a la subunidad LukS-PV. Woodin, AM y Wieneke AA, Biochem J. , 105:1029-1038 (1967) y Colin et al . , supra . Aunque LukS-PV y LukF-PV son expresadas solamente en un porcentaje pequeño de aislados de S. aureus asociado con hospitales (Prevost et al . , Infect. Immun . , 63:4121-9 (1995)), la expresión de PVL parece ser predominante en cepas de S . aureus meticilino-resistente adquirido en la comunidad (CA-MRSA por sus siglas en inglés) a nivel mundial. Dufour et al . , Clin . Infect . Dis . , 35:819-24 (2002) y Vandenesch et al . , Emerg. Infect . Dis . , 9:978-84 (2003) . En efecto, la aparición y diseminación de CA-MRSA recientemente ha dado como resultado brotes de varias enfermedades, incluyendo abscesos y furunculosis (Lina et al . , Clin . Infect . Dis . , 29: 1128-32 (1999) y Kazakova et al . , N. Engl. J. Med., 352:468-75 (2005)), y toxemias graves tales como neumonía necrosante. Francis et al . , CHn. Infect. Dis., 40:100-7 (2005). Se calcula que aproximadamente 50% de las cepas de S . aureus en los Estados Unidos de Norteamérica actualmente son meticilino-resistentes. Por ejemplo, en 1999, 54.5% de todos los aislados de S . a ureus reportados en el sistema nacional de vigilancia de infecciones nosocómicas (NNISS por sus siglas en inglés) eran meticilino-resistentes. Los Centros para Control de Enfermedades estiman que en 2002 se presentaron aproximadamente 100,000 casos de infecciones por MRSA adquirido en hospital en los Estados Unidos de Norteamérica y que el problema de estas infecciones únicamente se empeora. Las tasas de resistencia a meticilina son incluso mayores en algunos países de Asia y Europa, (e.g., tasa de 72% de MRSA en Japón; 74% en Hong Kong) .

Por consiguiente, las cepas resistentes a antibiótico actualmente ocasionan problemas para tratar infecciones por S . aureus, y estos problemas únicamente serán peores a menos que se desarrollen nuevas herramientas para tratamiento. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos para tratar infecciones por S. aureus en general, y en particular infecciones por CA-MRSA. Los intentos previos para elaborar vacunas utilizando antígenos de PVL presentan deficiencias significativas, incluyendo toxicidad de los antígenos administrados y falta de eficacia. Por ejemplo, , Banffer y Franken, Path. Microbiol . 30: 16-74 (1967), reportan la inmunización de mujeres embarazadas con toxoide de leucocidina (PVL) y su efecto sobre los niveles de anticuerpo y la incidencia de mastitis. Los autores encontraron un incremento en anticuerpos anti-leucocidina en los individuos inmunizados, pero ninguna diferencia estadísticamente significativa en el desarrollo de mastitis. Los autores afirman que, de los 153 individuos inmunizados, 11 reportaron "inflamación en el sitio de inyección con ganglios linfáticos axilares palpables (moderados)" y en "3 casos la reacción se consideró grave". Gladstone, Br. J. Exp . Pa th . 54: 255-59 (1973), comentar sobre el trabajo hecho por el autor y otros que supuestamente demuestra la eficacia terapéutica de leucocidina purificada (que comprende tanto subunidades LukF-PV como subunidades LukS-PV) contra infección por Staphylococcus, pero reconoce que "su uso en personas sanas... está contraindicado por las reacciones locales y generales variables con frecuencia observadas". El autor reporta los resultados de la inmunización con una preparación de leucocidina purificada, destoxificada utilizando formalina, indicando que la inmunización fue bien tolerada por 16 de 17, en la que el 17° individuo experimentó fiebre, malestar y vómito. El autor reporta también una variabilidad considerable en los niveles de anticuerpo anti-leucocidina en los individuos inmunizados. El artículo no investiga la eficacia profiláctica o terapéutica de la preparación de leucocidina destoxificada con formalina. Ward y Turner, Infect . & Immun . 27: 393-97 (1980), reportaron experimentos efectuados con preparados de LukF-PV y preparados de LukS-PV, aunque la pureza de sus preparados no es clara debido a que ellos encontraron que cada preparado creaba anticuerpos tanto contra LukF-PV como contra LukS-PV, lo que indica o bien una falta de pureza o reactividad cruzada antigénica. Los autores descubrieron que la inmunización con el preparado de LukF-PV provee protección contra exposiciones posteriores mediante la administración de LukF-PV, LukS-PV, o ambas, mientras que la inmunización cuando el preparado de LukS-PV no provee protección contra ninguna de las exposiciones. Sin embargo, el hecho que las exposiciones a LukF-PV y LukS-PV inducen una respuesta tóxica indica que cada preparado está contaminado con la subunidad heteróloga debido a que una subunidad sola no es tóxica. Con respecto a la utilidad potencial de los anticuerpos anti-PVL, Gauduchon et al . , J. Infect . Dis . 189: 346 (2004), descubrió que los preparados de IVIG comerciales pueden neutralizar la PVL de S . aureus in vitro. Los autores utilizaron PVL recombinante purificada (rLukF-PV y rLukS-PV) para identificar anticuerpos anti-PVL en preparados comerciales de IVIG. Ellos descubrieron que la pre-incubación del antígeno producido en forma recombinante con IVIG inhibe la citotoxicidad en una manera dependiente de la concentración de IVIG. Se encontraron resultados similares cuando se preincubaron con IVIG los sobrenadantes de cultivo de dos cepas diferentes de S. aureus productoras de PVL. Sin embargo, los autores no demuestra que la actividad reportada se debe a los anticuerpos anti-PVL per se, y no controlan respecto al efecto y en inmuno-modulador general de IVIG. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad respecto a composiciones que comprenden antígenos de PVL y anticuerpos contra PVL que sean útiles en los métodos para tratamiento y prevención de infección por S . a ureus .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones de anticuerpo y antígeno de PVL, métodos para elaborarlos, y métodos para utilizarlos en la prevención y tratamiento de infección por S . aureus . En una modalidad, la invención provee un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S . aureus, que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukF-PV pero que no se une específicamente a una subunidad LukS-PV y (ii) un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukS-PV pero que no se une específicamente a una subunidad LukF-PV. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. En una modalidad específica, el anticuerpo se prepara mediante un procedimiento que comprende (i) administrar a un individuo una composición que se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) una composición que comprende una subunidad LukF-PV como antígeno de PVL, y ninguna subunidad LukS-PV y (b) una composición que comprende una subunidad LukS-PV como antígeno de PVL, y ninguna subunidad LukF-PV y (ii) obtener el anticuerpo a partir del individuo. La invención también provee una composición que comprende al anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en una modalidad específica la composición es una composición de IVIG, o a composición de IVIG específica hiperinmune. En una modalidad particular, la composición de anticuerpo también comprende uno o más anticuerpos contra uno o más de otros antígenos bacterianos, tales como anticuerpos contra uno o más antígenos de S . aureus que se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . a ureus Tipo 5, S . aureus 8, S. aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) , y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM por sus siglas en inglés) , y combinaciones de las mismas. La invención también provee un método para neutralizar citotoxicidad asociada con PVL en un individuo, que comprende administrar a un individuo una composición que comprende al anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo se une específicamente a LukS-PV. En otra modalidad, el anticuerpo se une específicamente a LukF-PV. La invención también provee un método para detectar antígeno de PVL en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra con el anticuerpo.

Otro aspecto de la invención se refiere a antígeno de PVL. En una modalidad, la invención provee un antígeno de PVL que comprende un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S . a ureus conjugado a otro antígeno bacteriano. En una modalidad, el antígeno de PVL se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukF-PV y ninguna subunidad LukS-PV y (b) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukS-PV y ninguna subunidad LukF-PV. En una modalidad, el antígeno de PVL se selecciona a partir del grupo que consiste de antígenos de PVL de tipo silvestre y antígenos de PVL recombinantes purificados. En una modalidad, el otro antígeno bacteriano se selecciona a partir del grupo que consiste de S . a ureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, -toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) . En otra modalidad, el otro antígeno bacteriano es otra subunidad de PVL, y el antígeno de PVL comprende un conjugado que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) una subunidad LukF-PV conjugada a una subunidad LukS-PV; (ii) una subunidad LukF-PV conjugada a otra subunidad LukF-PV; y (iii) una subunidad LukS-PV conjugada a otra subunidad LukS-PV. En una modalidad, el conjugado es una proteína de fusión o conjugado químico. En otra modalidad, la invención provee un antígeno de PVL que comprende una mutación en por lo menos una de la secuencia de aminoácido de LukF-PV o LukS-PV, con relación a su secuencia de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido. En una modalidad, la mutación se selecciona a partir del grupo que consiste de mutaciones que (i) evitan la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evita que un tallo o extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana se desdoble para LukS o F, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) altere la hendidura de unión a membrana de LukF-PV; (viii) cree deleciones N-terminal del "cerrojo amino" de los antígenos de PVL, y (ix) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana. En una modalidad particular, el antígeno de PVL comprende una subunidad LukF-PV que comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) E191A, (ii) R197A, (iii) W176A, y (iv) Y179A. En otra modalidad particular, el antígeno de PVL comprende una subunidad LukS-PV que comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) T28F, (ii) T28N, y (iii) T28D. En una modalidad, el antígeno de PVL se selecciona a partir del grupo que consiste de (a) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukF-PV y ninguna subunidad LukS-PV; (b) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukS-PV y ninguna subunidad LukF-PV; (c) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukF-PV mutada y una subunidad LukS-PV de tipo silvestre; (d) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukF-PV de tipo silvestre y una subunidad LukS-PV mutada; y (e) antígeno de PVL que comprende una subunidad LukF-PV mutada y una subunidad LukS-PV mutada. La invención también provee una composición que comprende un antígeno de PVL de S . aureus y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El antígeno de PVL puede ser cualquier antígeno descrito anteriormente. En una modalidad, la composición comprende una subunidad LukF-PV y una subunidad LukS-PV. En otra modalidad, la composición comprende una subunidad LukF-PV y ninguna subunidad LukS-PV o una subunidad LukS-PV y ninguna subunidad LukF-PV. En una modalidad, la composición también comprende uno o más antígenos bacterianos adicionales. En una modalidad particular, dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8 y S . a ureus 336, S. epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) . La invención también provee un anticuerpo que específicamente se une a cualquiera de los antígenos de PVL descritos en la presente invención. La invención también provee un método para tratar o prevenir infección por S . a ureus que comprende administrar a un individuo en necesidad de lo mismo la composición que comprende un anticuerpo o antígeno como los descritos en la presente invención. El método también puede comprender administrar un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de un agente anti-infeccioso, un antibiótico, y un agente antimicrobiano. En una modalidad, el agente antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste de vancomicina, clindamicina y lisostafina. En una modalidad, la infección por S . aureus se selecciona a partir del grupo que consiste de una infección por S . aureus meticilino-resistente adquirido en la comunidad CA-MRSA, una infección de la piel o de tejido blando, neumonía necrosante, mastitis, fascitis necrosante, Síndrome de Waterhouse Friderichsen, sepsis por CA-MRSA e infección por una cepa de S . aureus que exprese antígeno de PVL. En una modalidad, el método también comprende administrar uno o más anticuerpos contra uno o más antígenos bacterianos adicionales. En una modalidad específica, dichos uno o más anticuerpos se seleccionan a partir del grupo que consiste de anticuerpos contra un antígeno de S. aureus que se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, y S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S. epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) . En otra modalidad, el método también comprende administrar uno o más antígenos bacterianos adicionales. En una modalidad específica, dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, y S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) . La invención también provee un método para elaborar un preparado de IVIG específico hiperinmune que comprende (i) administrar un antígeno de PVL a un individuo, (ii) recolectar plasma a partir del individuo, y (iii) purificar una inmunoglobulina proveniente del individuo. En una modalidad alternativa, la invención provee un método para elaborar un preparado de IVIG específico hiperinmune que comprende (i) someter a pruebas de tamizaje a un individuo al que no se le ha administrado un antígeno de PVL respecto a títulos altos de anticuerpos anti-PVL, (ii) recolectar plasma a partir del individuo, y (iii) purificar inmunoglobulina proveniente del paciente.

La invención también provee una composición que comprende (i) una composición de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S. aureus y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la cual la composición de IVIG comprende un título de anticuerpo anti-PVL que es por lo menos dos veces más grande que el encontrado en IVIG normal. Los aspectos adicinales de la invención se describen con mayor detalle más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la inmuno-difusión de los antígenos de rLukS-PV y rLukF-PV con antisuero de conejo anti-LukS-PV y anti-LukF-PV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones y métodos para tratar y prevenir infecciones por S. aureus, incluyendo infecciones por CA-MRSA. Las composiciones comprenden un antígeno de PVL, como se define y describe con mayor detalle más adelante, o anticuerpos que específicamente se unen a un antígeno de PVL. Los métodos comprenden administrar una composición de anticuerpo de PVL o antígeno de PVL de conformidad con la invención a un paciente en necesidad de lo mismo. En la siguiente discusión, "un", "uno", y "el (la)" significan "uno o más", a menos que se especifique de otra manera. Además, en casos en los que los aspectos de la invención se describan con referencia a listas de alternativas, la invención incluye cualquier miembro individual o subgrupo de la lista de alternativas y cualesquiera combinaciones de una o más de las mismas.

I . Composiciones Antíqeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) La presente invención provee composiciones que comprenden un antígeno de PVL. Tal como se utiliza en la presente invención, "antígeno de PVL" se refiere a un antígeno de PVL de tipo silvestre aislado y purificado, un antígeno de PVL recombinante, un antígeno de PVL que comprende solamente una subunidad LukS-PV o solamente una subunidad LukF-PV, y un antígeno de PVL que comprende tanto una subunidad LukS-PV como una subunidad LukF-PV. Por ejemplo, un antígeno de PPVL de tipo silvestre que comprende subunidades de LukS-PV y LukF-PV se puede purificar a partir de la cepa prototipo V8 de S. aureus (ATCC 49775) utilizando una serie de pasos cromatográficos. Finck-Barbancon et al., Biochim . Biophys . Acta , 1182:275-82 (1993) y Prevost et al . , Infect . Immun . , 63:4121-9 (1995). De conformidad con una modalidad, el antígeno de PVL es un antígeno recombinante de PVL. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "antígeno recombinante de PVL" designa un antígeno de PVL que se elabora utilizando metodologías de ADN. Dichas metodologías de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica. En términos generales, el antígeno recombinante de PVL está libre de otras proteínas y componentes celulares con los cuales PPVL de tipo silvestre está asociada en su estado original (por ejemplo, proteínas y componentes celulares presentes en células de Staphylococcus) . De conformidad con una modalidad, el antígeno de PVL es un antígeno de PVL purificado. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "antígeno de PVL purificado" designa un antígeno de PVL que ha sido separado por lo menos parcialmente de otras proteínas y componentes celulares con los cuales PPVL de tipo silvestre está asociada en su estado original (por ejemplo, proteínas y componentes celulares presentes en células de Staphylococcus) . En modalidades específicas de la invención, se proveen preparados de una sola subunidad de PVL, tal como un preparado de LukF-PV que no contiene LukS-PV, o un preparado del LukS-PV que no contiene LukF-PV. La pureza de dichos preparados se puede confirmar, por ejemplo, mediante demostración que los anticuerpos creados contra un preparado de LukF-PV no se unen específicamente a LukS-PV, o que los anticuerpos creados contra un preparado de LukS-PV no se unen específicamente a LukF-PV. En algunas modalidades, los preparados que comprenden una sola subunidad de PVL se obtienen mediante expresión recombinante de la subunidad de PVL individual en un hospedero que no contiene (y que no está manipulado genéticamente para que contenga) un gen funcional que codifique para la otra subunidad de PVL. De conformidad con un aspecto de la invención, las subunidades LukF-PV y LukS-PV se expresan en forma recombinante en células de E. coli y después se purifican a partir de E. coli utilizando un esquema de columna de dos pasos que incluye cromatografía de intercambio iónico (utilizando, por ejemplo, una columna de SP-sefarosa) seguido por cromatografía de afinidad (utilizando, por ejemplo, una columna cerámica de hidroxiapatita (CHT) ) . Un antígeno de PVL como el descrito en la presente invención también se refiere a un fragmento de antígeno de PVL, un fragmento de subunidad LukS-PV y un fragmento de subunidad LukF-PV. Los fragmentos apropiados para ser utilizados en la presente invención poseen propiedades antigénicas similares a las del antígeno de PVL de tipo silvestre. Por ejemplo, un fragmento de antígeno de PVL, un fragmento de subunidad LukS-PV y un fragmento de subunidad LukF-PV son fragmentos que inducen anticuerpos que reconocen específicamente al antígeno de PVL de tipo silvestre. Un antígeno de PVL de conformidad con la presente invención (incluyendo subunidades LukS-PV y/o LukF-PV y fragmentos de PVL y de subunidad) puede comprender una o más inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácido en por lo menos una de la subunidad LukS-PV, la subunidad LukS-PV, o ambas. Por ejemplo, se puede sustituir uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia de LukF-PV o LukS-PV por otro aminoácido de una polaridad similar, el cual actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar a partir de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. De manera alternativa, se pueden hacer alteraciones no conservadoras, incluyendo las alteraciones discutidas con mayor detalle más adelante en el contexto de destoxificación. Por lo tanto, en una modalidad, se efectúa un cambio de aminoácido no conservador al antígeno de PVL para destoxificar la proteína o para estabilizar la proteína y evitar la inserción dentro de la membrana. "Antígeno de PVL" tal como se utiliza en la presente invención también se refiere a un antígeno de PVL que ha experimentado una modificación, tal como una modificación que (i) evite la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evite que el tallo o la extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana se desdoble para LukS-PV o LukF-PV, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) altere la hendidura de unión a membrana de LukF-PV; (viii) cree deleciones N-terminal del "cerrojo amino" de los antígenos de PVL, o (ix) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana . Como se describe con mayor detalle más adelante, se pueden efectuar una o más de estas modificaciones utilizando métodos que incluyen tratamiento químico, conjugación, y mutaciones tales como deleción o sustitución de aminoácido. En una modalidad, el antígeno de PVL es un destoxificado. Tal como se utiliza en la presente invención, un antígeno de PVL "destoxificado" no permite el influjo de cationes divalentes a través de los canales de calcio celulares de los neutrófilos o el influjo de catión monovalente a través del poro de PVL o la formación de un poro de PVL. La toxicidad de PVL en neutrófilos polimorfonucleados humanos (PMN) se puede medir utilizando técnicas conocidas en el campo, tales como microscopía de luz o fluorescente, citometría de flujo, y fluorimetría. Véase, Staali et al . , J Membrane Biol . 162: 209-216 (1998), Meunier et al . , Cytometry 21: 241-247 (1995), Werner et al . , Infection and Immuni ty: 70: (3) 1310-1318 (2002). Por ejemplo, el antígeno de PVL induce la apertura de un canal de calcio celular existente en la membrana de PMN. La apertura del canal de calcio y el influjo subsiguiente de calcio se pueden monitorear con el uso de indicadores fluorescentes, Fura2, Fluo3, Fluo4 o Calcium 3 y utilizando pruebas para medir el influjo de Ca+ al interior de la célula utilizando con DMSO para diferenciación en los neutrófilos maduros (PMN) . Además, la PVL forma poros separados mediante la inserción de sus subunidades dentro de la membrana celular. La formación de poro se puede medir mediante el flujo de cationes monovalentes dentro o fuera de la célula. El bromuro de etidio también puede entrar a la célula a través de estos poros y por lo tanto, se puede utilizar bromuro de etidio para rastrear el influjo de cationes monovalentes. Cuando el bromuro de etidio ingresa a la célula éste se intercala con el ácido nucleico y da como resultado la emisión fluorescente. La fluorescencia intracelular se puede detectar visualmente utilizando un microscopio fluorescente o cuantitativamente utilizando un fluorómetro. De igual manera, se pueden utilizar indicadores fluorescentes tales como PBFI (indicador fluorescente de unión a fosfato) y Na-verde, el cual forma quelatos con potasio y sodio, para monitorear la formación de poros de PVL.

En una modalidad, el antígeno de PVL se destoxifica molecularmente, lo cual se puede lograr utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo extensión de iniciador en una plantilla de plásmido utilizando plantillas de cadena sencilla mediante el método original de Kunkel (Kunkel, TA, Proc. Acad. Sci., USA, 82:488-492 (1985)) o plantillas de ADN de doble cadena (Papworth et al., Strategies, 9(3): 3-4 (1996)), y mediante clonación con PCR (Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2a ed. Humana Press, Totowa, NJ (2002), Ishii et al., Meth. Enzymol., 293, 53-71 (1998), Kam ann et al., Nucleic Acids Res., 17:5404 (1989), Hemsley et al., Nucleic Acids Res., 17:6545-6551 (1989), Giebel et al., Nucleic Acids Res., 18:4947 (1990), Landt et al., Gene, 96:125-128 (1990), Stemmer et al., BioTechniques, 13:214-220 (1992), Marini et al., Nucleic Acids Res., 21 :2277-2278 (1993), y Weiner et al., Gene, 151:119-123 (1994)). En otra modalidad, el antígeno de PVL se destoxifica mediante medios químicos, por ejemplo, conjugando el antígeno de PVL a otra molécula. Esta modalidad abarca antígeno de PVL que no se destoxifica por ningún medio excepto conjugación a otra molécula. En otra modalidad, el antígeno de PVL se conjuga a otro antígeno, tal como otro antígeno de PVL. Por ejemplo, una subunidad LukF-PV se puede conjugar a otra subunidad LukF-PV o a una subunidad LukS-PV. Aunque sin desear estar limitado a ninguna teoría, los inventores creen que la conjugación de una subunidad LukS a una subunidad LukF, directamente o a través de un enlazador, pueden destoxificar al antígeno evitando que el antígeno se desdoble en su estado tóxico, por ejemplo, evitando que las subunidades S y F interactúen en la manera requerida para exhibir toxicidad. En otra modalidad, el antígeno de PVL se conjuga a otro antígeno, tal como otro antígeno bacteriano, incluyendo un antígeno Gram-negativo o Gram-positivo, another staphylococcal antigen, and/or a bacterial polysaccharide. Por ejemplo, un antígeno de PVL se puede conjugar a uno o más de otros antígenos de S . aureus, tal como un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste deS. aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, -toxina, LTA, MSCRAMMs, otros antígenos o toxinas protectoras, y combinaciones de las mismas. En otra modalidad el antígeno de PVL se destoxifica mediante una mutación en por lo menos una de la secuencia de aminoácido de LukF-PV o LukS-PV, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido. Una composición, tal como una vacuna, puede comprender una o ambas de una subunidad LukF-PV y una subunidad LukS-PV. De conformidad con una modalidad, una composición, tal como una vacuna, también comprende uno o más antígenos de S . a ureus, tal como un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S. aureus Tipo 8, S. aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) , otros antígenos o toxinas protectoras, y combinaciones de las mismas. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden comprender un conjugado de PVL Tipo 5, un conjugado de PVL Tipo 8, un conjugado de PVL tipo 336, un conjugado de PVL-PS1, un conjugado de PVL-GP1, un conjugado de PVL-oí-toxina, un conjugado de PVL-LTA, o un conjugado de PVL-MSCRAMM, en las cuales cualesquiera de estos conjugados comprende un antígeno de PVL. En una modalidad, el antígeno de PVL se convierte en derivado y se liga a otro antígeno bacteriano, tal como otros antígenos de S . aureus, tal como un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de S . a ureus Tipo 5, S . a ureus Tipo 8, S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) , otros antígenos o toxinas protectoras, y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, el antígeno de Tipo 5 o Tipo 8 se puede activar mediante l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDAC) para formar derivados de cisteamina. PVL se modifica con N-succinimidil-3- (-2-piridilditio) propionato (SPDP) y después se conjuga al derivado cisteamina de T5 CP o T8 CP mediante reemplazo de tiol. Los conjugados resultantes se pueden separar del antígeno no conjugado mediante cromatografía por exclusión de tamaño. En otra modalidad, el antígeno de PVL se conjuga a un antígeno 336, por ejemplo, mediante activación de los grupos hidroxilo en el antígeno se activan utilizando bromuro de cianógeno o tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridinio, y unión a través de un enlazador que contiene grupo o grupos nucleofílicos o sin un enlazador, a PVL. Véase, por ejemplo, Kohn et al . FEBS Lett . , 154: 209:210 (1993); Schneerson et al . , J. Exp . Med. , 152:361-376 (1980); Chu et al . Infecí . Immun . , 40:245-256 (1983); Kossaczka et al . , Infect . I mun . , 68:5037-5043 (2000). Los conjugados resultantes se pueden separar después del antígeno no conjugado. Se puede utilizar un método análogo para conjugar antígeno de PVL a LTA. En otra modalidad, el antígeno de PVL se conjuga a a-toxina (alfa-hemolisina) , una exoproteína formadora de poro y hemolítica producida por la mayoría de cepas patógenas de S . aureus . Incluso en otra modalidad, el antígeno de PVL se conjuga a un antígeno de PS1 o GPl, por ejemplo, mediante modificación de PS1 o GPl de S . epidermidis con dihidrazida de ácido adípico (ADH) mediante una reacción facilitada por EDC para preparar el derivado hidrazida de ácido adípico de PS1 (PSIAH) • El antígeno de PVL se modifica después con succinilo y el derivado succínico de PVL (PVLsuc) se conjuga a PS1AH, lo cual es mediado por EDC. Se puede utilizar un método análogo para conjugar el antígeno de PVL a LTA. Existen otros métodos de conjugación conocidos en la técnica, por ejemplo, oxidación con peryodato seguido por animación reductiva, tratamiento con carbodi-imida, y otros métodos y/o sus diferentes combinaciones que puedan proveer la unión covalente directa o indirecta (a través de un enlazador) de PS y portador de proteína y de esta manera producir el conjugado. Por ejemplo se puede conjugar el antígeno de PVL a otra proteína mediante tratamiento del antígeno de PVL y proteína utilizando un agente para entrelazamiento homobifuncional no reversible, tal como bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) , el cual reacciona rápidamente con aminas primarias. Véase también Partís et al . , J. Prot. Chem. 2: 263-77 (1983). Independientemente del método utilizado para conjugar el antígeno a la proteína portadora, la unión covalente de PS al portador proteínico convierte PS de un antígeno independiente de célula T a un antígeno dependiente de célula T. Como resultado, el conjugado PS-proteína puede inducir respuesta de anticuerpo específica de PS en animales inmunizados en contraste a la ausencia de dicha respuesta observada después de administrar PS sola. Como se discutió anteriormente, la presente invención contempla proteínas de fusión que comprenden LukS-PV y LukF-PV, o que comprenden dos subunidades LukF-PV o que comprenden dos subunidades LukS-PV. Dichas proteínas de fusión se pueden crear en forma recombinante o mediante conjugación química. En una modalidad, se expresa una proteína de fusión de la presente invención utilizando secuencias de ADN construidas de manera apropiada. Por ejemplo, se puede ligar una secuencia de ácido nucleico que codifica para una subunidad LukF-PV directa o indirectamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una subunidad LukS-PV, por ejemplo, se puede unir un extremo del ácido nucleico de LukF-PV directamente a un extremo del ácido nucleico de LukS-PV, o las secuencias que codifican para las subunidades se pueden separar mediante una secuencia de ácido nucleico "enlazadora" o "espaciadora". La invención incluye proteínas de fusión que comprenden una subunidad LukF-PV ligada directa o indirectamente por su extremo 3' a una subunidad LukS-PV. La invención también incluye proteínas de fusión que comprenden una subunidad LukS-PV unida directa o indirectamente por su extremo 3' a una subunidad LukF-PV. La presente invención contempla la expresión recombinante de subunidades de subunidades LukF-PV y LukS-PV en la misma construcción o en construcciones diferentes, en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, pueden estar una secuencia de ADN que codifique para LukF-PV y una secuencia de ADN que codifique para LukS-PV en una sola construcción que esté ligada en forma operable a los elementos reguladores apropiados, por ejemplo, a un promotor y terminador, para expresión. De manera alternativa la presente invención contempla la expresión utilizando dos construcciones, una para expresar LukF-PV y otra para expresar LukS-PV. En dicha modalidad, cada secuencia de subunidad puede estar ligada en forma operable a sus propios elementos reguladores, por ejemplo, con diferentes promotores que controlen la expresión de cada subunidad. Las construcciones de expresión pueden estar presentes en los mismos vectores de expresión o en vectores de expresión diferentes. Por lo tanto, la presente invención contempla transcribir en forma recombinante una sola molécula de ARNm que comprenda secuencias para ambas de las subunidades LukS-PV y LukF-PV, o para transcribir en forma recombinante por lo menos dos transcritos de ARNm, cada uno de los cuales codifica para una subunidad dada. Cuando se utiliza un solo vector de expresión, se utiliza una célula hospedera individual para expresión, y produce ambas subunidades. Cuando se utiliza más de un vector expresión, se pueden utilizar una o más células hospederas para expresión. Por ejemplo, se puede utilizar una sola célula para todos los vectores, o se puede utilizar una célula para cada, o se puede utilizar una célula para un vector y se puede utilizar otra célula para uno o más vectores. Por lo tanto, la invención contempla líneas celulares múltiples cada una de las cuales expresa en forma recombinante una subunidad particular. Se puede aislar a partir de una línea celular una subunidad que sea expresada y después se une a otra subunidad que haya sido expresada y aislada a partir de otra línea celular. En esta modalidad, las dos subunidades se pueden unir químicamente, tal como mediante conjugación química. Desde luego, la invención también contempla la conjugación química de subunidades de PVL obtenidas mediante medios no recombinantes, tal como las subunidades de PVL original, o subunidades que se expresen a partir del genoma de una célula o modelo de sistema de staphylococcus . Sin considerar si se crea o no una proteína de fusión de PVL utilizando técnicas recombinantes o conjugación química, cualquiera o ambas de las subunidades LukF-PV y LukS-PV puede (n) comprender una o más mutaciones de aminoácido, incluyendo sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido con relación a la secuencia de tipo silvestre, tal como aquellas descritas más adelante. Por lo tanto, la proteína de fusión de PVL puede comprender (i) una LukF-PV mutada y una LukS-PV de tipo silvestre, (ii) una LukS-PV mutada y una LukF-PV de tipo silvestre, o (iii) una LukF-PV mutada y una LukS-PV mutada. En algunas modalidades de la invención, el antígeno de PVL se destoxifica modificando el antígeno de PVL esta manera que contenga una mutación en por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácido de LukF-PV o LukS-PV. Los ejemplos de mutaciones pueden evitar la unión de PVL a una membrana celular, evitar que un "tallo" o extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana se desdoble para LukS-PV o LukF-PV, bloquee el ensamblado de una subunidad LukF-PV y/o una subunidad LukS-PV, bloquee la actividad del canal de Ca+2, bloquee la actividad de poro de PVL, altere un sitio de fosforilación de LukS-PV, y/o altere la hendidura de unión a membrana de LukF-PV. Las mutaciones de ejemplo pueden generar o eliminar puentes de disulfuro internos, generar o eliminar sitios de fosforilación, o eliminar interacciones entre las subunidades LukF-PV y LukS-PV. Las mutaciones pueden incluir por lo menos una mutación de punto, por lo menos una deleción de aminoácido, o una combinación de las mismas. En una modalidad, se sustituye Thr28 de la subunidad LukS-PV con, por ejemplo, una leucina, fenilalanina, asparagina, ácidos aspártico, histidina o cisteína. Las mutaciones en esta posición afectan el ensamblado de las leucotoxinas . Véase Guillet et al . , J. Biol. Chem., 279:41028-41037 (2004). En otra modalidad, se efectúa una mutación en Thr246 de LukS proveniente de gamma-hemolisina. Se ha descrito que esta posición de aminoácido es responsable de la actividad leucocitolítica de gamma-hemolisina. Véase Nariya et al . , FEBS Letters, 415:96-100 (1997), la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad. También se puede efectuar una mutación de punto en el sitio de fosforilación postulado, Thr244, o una deleción de los residuos Thr240-Thr244 de LukS-PV, destruyendo de esta manera la actividad leucocitolítica de LukS-PV. Otras mutaciones contempladas en la presente invención incluyen por lo menos una mutación de punto y/o por lo menos una deleción en el "tallo" o extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana de LukF-PV, tal como en ValllO, Valll4, Tyrlld, Tyrlld, Ilel22, Ilel24 y/o Leul28, y mutaciones similares en el tallo de LukS-PV, incluyendo Vall03, Vall05, Leul09, Tyrlll, Ilell3 y/o Phell7. La presente invención también contempla una o más deleciones de aminoácido entre Leul28-Serl35, Ilel24-Serl29, y/o Serl25-Leul28. Estas mutaciones permiten el desacoplamiento de la inducción por Ca+2 de las actividades formadoras de poro de PVL. Véase Moussa et al . , FEBS Letters, 461:280-286 (1999) y Werner et al . , Infect . Immun . , 70:1310-1318 (2002), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Otras mutaciones contempladas en la presente invención incluyen aquellas que crean deleciones N-terminales del "cerrojo amino" de los antígenos de PVL, tal como deleciones en Alal-Vall2 de LukF-PV, Ilel24-Serl29 de LukF-PV y/o Aspl-Ile7 de LukS-PV, Phell7-Serl22. De manera adicional, las mutaciones que crean mutantes dobles de cisteína para elaborar enlaces de disulfuro entre un núcleo de emparedado beta y el pre-tallo para evitar el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana también son apropiadas para ser utilizadas en la presente invención. Por ejemplo, en la presente invención se contemplan mutantes de cisteína de LukF-PV tales como Vall3Cys-Lysl36Cys; Asp43Cys-Tyrll6Cys o Ser45Cys-Glyll9Cys, o mutantes de cisteína de LukS-PV tales como Ile7Cys-Asnl30Cys; y Asp38Cys-Ilell3Cys; o mutantes similares. Por ejemplo, la presente invención contempla mutaciones en la región de contacto de emparedado beta de LukS-PV. Por lo tanto, algunas mutaciones en esta región incluyen, pero no se limitan a T28F, T28N, y T28D, por ejemplo, la treonina en la posición 28 de LukS-PV o en la posición de aminoácido que corresponde a la posición 28, es remplazado por fenilalanina, asparagina, o aspartato. La presente invención también contempla mutaciones en el sitio de fosforilación de LukS-PV, las cuales eliminan o reducen la fosforilación en dicho sitio. Por lo tanto, una mutación particular de dicha región incluye, pero no se limita a T244A. otras mutaciones contempladas en la presente invención incluyen aquellas que alteran la hendidura de unión a membrana de LukF-PV, por ejemplo, en la hendidura de unión de fosfatidilcolina postulada. Por ejemplo, los mutantes de LukF-PV en las posiciones N173, W176, Y179, E191 y R197, se contemplan en la presente invención. En este sentido, una mutación específica contemplada por la presente invención incluye, pero no se limita a E191A, por ejemplo, el glutamato en la posición 191 de LukF-PV o en la posición de aminoácido que corresponda a la posición 191, está reemplazado por alanina. De manera similar, otras mutaciones específicas de LukF-PV incluyen N173A, W176A, R197A, y Y179A. La invención contempla antígenos de PVL con combinaciones de una o más mutaciones discutidas anteriormente, tales como, por ejemplo, un antígeno de PVL con una deleción del cerrojo amino y un mutante de punto en un sitio de fosforilación de LukS-PV.

Composiciones/vacunas La presente invención provee composiciones, incluyendo vacunas, que comprenden un antígeno de PVL y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El antígeno de PVL puede ser cualquier antígeno de PVL descrito anteriormente, incluyendo un antígeno de PVL de tipo silvestre purificado o un antígeno recombinante de PVL. El antígeno de PVL puede incluir una subunidad LukF-PV, una subunidad LukS-PV, o ambas, o puede comprender fragmentos de PVL, de la subunidad LukF-PV, de la subunidad LukS-PV, o de ambas. El antígeno de PVL puede ser un antígeno modificado y/o destoxificado, como el descrito anteriormente, y se puede conjugar a otro antígeno de PVL u otra molécula tal como otro antígeno bacteriano. El antígeno de PVL puede incluir una o más de las mutaciones descritas anteriormente, tal como dos mutaciones.

Los métodos para elaborar vacunas son conocidas en general en la técnica. Véase, por ejemplo, Di Tommaso et al . , Vaccine, 15:1218-24 (1997), y Fattom et al., Infect . and Immun . 58:2367-2374 (1990) y 64:1659-1665 (1996). Una vacuna de conformidad con la invención típicamente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que se puede utilizar como un vehículo para el antígeno de Staphylococcus debido a que el material es inerte o de alguna otra manera médicamente aceptable, y también es compatible con el agente activo, en el contexto de la administración de vacunas. Además de un excipiente apropiado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos convencionales para vacuna tal como diluyentes, coadyuvantes y otros inmuno-estimulantes, antioxidantes, conservadores y agentes para solubilización. Por ejemplo, se puede agregar polisorbato 80 para reducir al mínimo la agregación y para que actúe como un agente estabilizante, y se puede agregar un regulador de pH para control de pH. La formulación de vacuna descrita en la presente invención permite la adición de un coadyuvante con facilidad relativa y sin distorsionar la composición. Además, la vacuna de la presente invención se puede formular de modo tal que incluya un componente de "depósito" para incrementar la retención del material antigénico en el sitio de administración. A manera de ejemplo, además de un coadyuvante (si se utiliza uno) , se puede agregar alumbre (hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio) , QS-21, sulfato de dextrano o aceite mineral para proveer este efecto de depósito.

Anticuerpos La presente invención también provee composiciones que comprenden un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PVL de S . aureus (un "anticuerpo contra PVL "), tal como cualquiera de los antígenos de PVL descritos anteriormente, formulado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de anticuerpo ede la presente invención puede comprender un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, o una combinación de los mismos. Un "anticuerpo contra PVL", como se describe en la presente invención, se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa {es decir, de origen natural o formado mediante procedimientos re-combinatorios de fragmento de gen de inmunoglobulina normal) (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, que se una específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, incluyendo un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Sin considerar la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de longitud completa, y, en el contexto de la presente invención, se une específicamente a un antígeno de PVL. Los métodos para elaborar y seleccionar fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo contra PVL de la presente invención se puede preparar mediante un número de métodos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo contra PVL se puede obtener a partir de individuos a los que se les administra un antígeno de PVL, o a partir de plasma sometido a tamizaje respecto a anticuerpo contra PVL, como se discute con mayor detalle más adelante. De conformidad con otra modalidad, el anticuerpo contra PVL se elabora utilizando métodos recombinantes. Los anticuerpos monoclonales recombinantes se pueden elaborar utilizando técnicas bien conocidas en el campo. Los anticuerpos policlonales recombinantes se pueden producir utilizando métodos análogos a aquellos descritos en la solicitud de patente E.U.A. 2002/0009453 (Haurum et al . ) , utilizando un antígeno de PVL como el inmunógeno. A anticuerpo contra PVL de conformidad con la invención puede ser un anticuerpo de múrido, humano o humanizado. Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la cual las CDRs de un anticuerpo proveniente de una especie, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se transfieren desde las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo de roedor en los dominios variables pesado y ligero de humano. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se obtienen a partir de aquellos de un anticuerpo de humano. Los métodos para elaborar anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, un anticuerpo que específicamente se une a LukS-PV no se une específicamente a LukF-PV. En otra modalidad, un anticuerpo que específicamente se une a LukF-PV no se une específicamente a LukS-PV. Por lo tanto, por ejemplo, un anticuerpo anti-LukS-PV podría no presentar reacción cruzada con LukF-PV y un anticuerpo anti-LukF-PV podría no presentar reacción cruzada con LukS-PV. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a un epítope en una subunidad de PVL (por ejemplo, LukF-PV o LukS-PV) que está presente en PVL tal como ésta existe en un estado original (por ejemplo, su estado original plegado y/o su estado original como está complejada con la otra subunidad de PVL) , o a un epítope que está presente en una proteína de fusión que comprende la subunidad de PVL, por ejemplo, uniéndose específicamente a un epítope de conformación en la proteína original o de fusión. En otras modalidades, un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a una subunidad de PVL independientemente de su configuración tridimensional, por ejemplo, uniéndose específicamente a un epítope lineal. En algunas modalidades, el anticuerpo de la presente invención se une específicamente a uno o más de los antígenos mutados de PVL descritos en la presente invención pero no presenta reacción cruzada con una versión de tipo silvestre de dicho antígeno. Por lo tanto, la invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a una de las proteínas de fusión recombinantes o químicamente conjugadas descritas en la presente invención. Asimismo, un anticuerpo de la presente invención se puede unir específicamente a uno o más de los antígenos mutados de PVL descritos en la presente invención sin presentar reacción cruzada con una versión de tipo silvestre de dicho antígeno. En algunas modalidades, un antígeno mutado de PVL está diseñado para que tenga una mutación de un mutante o variante de PVL de origen natural, y los anticuerpos específicos para dicho antígeno mutado de PVL son útiles en los métodos de diagnóstico y terapéuticos que eligen como blanco al mutante o variante de PVL de origen natural. Un método de la presente invención implica administrar uno o más de dichos anticuerpos a un individuo.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-LukS-PV. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-LukF-PV. En una modalidad adicional, uno o ambos de dichos anticuerpos, por ejemplo, el anticuerpo anti-LukF-PV y/o el anticuerpo anti-LukS-PV, se administran en forma simultánea o secuencial. De manera alternativa, se administra solamente un anticuerpo al individuo. Los anticuerpos antes descritos se pueden obtener utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, se puede administrar un antígeno de PVL (como se definió anteriormente) a un individuo y las IgG resultantes se pueden purificar a partir del plasma recolectado del individuo utilizando metodología estándar. El antígeno de PVL utilizado para obtener el anticuerpo contra PVL puede ser cualquier antígeno de PVL descrito anteriormente. En una modalidad, el antígeno de PVL utilizado para obtener el anticuerpo contra PVL se hace no tóxico conformidad con las enseñanzas anteriores, incluyendo mediante mutación o conjugación. De manera alternativa, los anticuerpos se pueden elaborar en forma recombinante.

Composiciones de anticuerpo La invención incluye composiciones de anticuerpo apropiadas para administración, tal como composiciones que comprenden un anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de anticuerpo se pueden formular para cualquier vía de administración, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutánea y percutánea, utilizando métodos que son conocidos en la técnica. En una modalidad, la composición de anticuerpo es una composición de IVIG. Como se describe en la presente invención, "IVIG" se refiere a una composición de inmunoglobulina apropiada para administración intravenosa. "IVIG específica" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una IVIG específica para uno o más antígenos de PVL, tales como cualesquiera de los antígenos de PVL descritos anteriormente. De conformidad con una modalidad, la presente invención provee una composición de anticuerpo contra PVL que comprende una composición de IVIG que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PVL de S . aureus, tal como cualesquiera de los antígenos antígenos de PVL descritos anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De conformidad con una modalidad, una composición de IVIG que comprende anticuerpo contra PVL se obtiene a partir del plasma obtenido de individuos donadores estimulados con un antígeno de PVL. De conformidad con esta modalidad, se administra un antígeno de PVL (tal como cualquiera de los descritos anteriormente) a un individuo, tal como un humano u otro animal', incluyendo un ratón, para estimular la producción de un anticuerpo contra PVL. En una modalidad, el antígeno de PVL se administra como una vacuna. Como un componente de la vacuna, el antígeno de PVL se destoxifica, por ejemplo mediante cualesquiera medios descritos anteriormente. El anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PVL se obtiene después a partir del individuo, por ejemplo, mediante obtención de inmunoglobulina a partir del plasma a través de metodología de fraccionamiento de plasma convencional. En un aspecto específico de esta modalidad, el anticuerpo contra PVL se obtiene como un preparado de inmunoglobulina (IVIG) específica hiper-inmune. Una "IVIG específica hiper-inmune" se refiere a un preparado de IVIG contiene títulos altos de anticuerpo contra PVL. Se puede obtener una composición de IVIG específica hiperinmune administrando un antígeno de PVL a un individuo, recolectando plasma a partir del individuo, y obteniendo la IVIG específica hiperinmune a partir del plasma mediante metodología convencional de fraccionamiento de plasma. De manera alternativa, se puede obtener una composición de IVIG específica hiperinmune a partir del plasma obtenido de un individuo al que no se le ha administrado un antígeno de PVL (es decir, un individuo no estimulado) . En esta modalidad, el plasma proveniente de individuos no estimulados se somete a tamizaje respecto a títulos altos de anticuerpos contra un antígeno de PVL, incluyendo un antígeno de PVL que comprende solamente una de LukS-PV, LukF-PV, o ambas. De conformidad con una modalidad, el plasma se somete a tamizaje respecto a títulos de anticuerpo contra PVL que sean mayores dos veces o más en los niveles típicamente encontrados en preparados de IVIG normales, el plasma se utiliza para preparar una composición de IVIG específica hiperinmune. De nuevo, el individuo puede ser humano o un animal. El antígeno de PVL utilizado para obtener la composición de anticuerpo contra PVL puede ser cualquier antígeno de PVL descrito anteriormente, incluyendo un antígeno de PVL de tipo silvestre purificado, antígeno recombinante de PVL, un antígeno de PVL que comprenda una o ambas de una subunidad LukF-PV y una subunidad LukS-PV, un antígeno de PVL con una o más inserciones, sustituciones de aminoácido, un antígeno de PVL con deleciones en por lo menos una de la secuencia de aminoácido de LukF-PV o LukS-PV, un antígeno modificado de PVL, un fragmento de un antígeno de PVL, o un antígeno destoxificado de PVL, incluyendo un antígeno de PVL destoxificado mediante conjugación a otro antígeno de PVL u otra molécula. De conformidad con una modalidad, la composición de anticuerpo contra PVL de la presente invención (incluyendo las composiciones de IVIG y de IVIG específica hiperinmune) también comprenden uno o más anticuerpos contra uno o más antígenos de Staphylococcus, tal como aquellos descritos más adelante. Como se describe más adelante, los ejemplos de antígenos de S . aureus incluyen antígenos de Staphylococcus Tipo 5, Tipo 8, y Type 336. Los ejemplos de antígenos de S. epidermidis incluyen PS1 y GPl. Por ejemplo, la composición puede comprender anticuerpos contra antígenos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de antígenos de S . aureus, tal como un antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de S. aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, S. aureus 336, S. epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) , otros antígenos o toxinas protectoras, y combinaciones de las mismas. Por lo tanto, en una modalidad, la composición de IVIG de la presente invención comprende por lo menos un anticuerpo que se une a un antígeno de PVL y también se une a antígeno diferente de Staphylococcus, o por lo menos un anticuerpo que se une a un antígeno de PVL y por lo menos un anticuerpo que se une a un antígeno diferente de Staphylococcus.

Componentes de antígeno/anticuerpo opcionales adicionales Además de los antígenos o anticuerpos contra PVL descritos anteriormente, la composición de antígeno de PVL o anticuerpo contra PVL de la presente invención puede comprender antígenos o anticuerpos adicionales, tal como uno o más antígenos de polisacárido capsular de S. aureus, tal como los antígenos de Tipo 5 y Tipo 8 descritos en Fattom et al., Infec . and Immun . , 58:2367-2374 (1990), y Fattom et al . , Infec . and Immun . , 64:1659-1665 (1996), o anticuerpos contra los mismos. De manera adicional o alternativa, la composición puede comprender el antígeno 336 de S. aureus descrito en las patentes E.U.A Nos. 5,770,208; 6,194,161; 6,537,559 o el antígeno 336 CPS de Staphylococcus descrito en las patentes E.U.A Nos. 5,770,208 y No. 6,194,161, o anticuerpos contra el mismo. Otros antígenos de S . aureus son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Adams et al., J. Clin . Microbiol . , 26:1175-1180 (1988), Rieneck et al., Biochim . Biophys . Acta . , 1350:128-132 (1977) y O'Riordan et al . , Clin . Microbiol . Rev. , 17: 218-34 (2004), y las composiciones que comprenden dichos antígenos o anticuerpos contra los mismos también son útiles en la presente invención. De manera similar, también se pueden utilizar antígenos de S . epidermidis (o anticuerpos contra los mismos) de conformidad con la presente invención. Un antígeno tipo II de S . epidermidis, también conocido como un PS1, se describe en las patentes E.U.A Nos. 5,961,975 y 5,866,140. Este antígeno es un antígeno de polisacárido de carácter ácido que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende cultivar las células de un aislado de S . epidermidis que aglutina los antisueros para ATCC 55254 (un aislado de tipo II) . Incluso otro antígeno de Staphylococcus útil en la presente invención se describe en el documento WO 00/56357. Este antígeno comprende aminoácidos y una hexosamina N-acetilada en una configuración a, no contiene grupos O-acetilo, y no contiene hexosa. Este se une específicamente con anticuerpos contra una cepa de Staphylococcus depositada bajo ATCC 202176. El análisis de aminoácido del antígeno muestra la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina, y treonina en relaciones molares de aproximadamente 39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituyen aproximadamente el 32% en peso de la molécula de antígeno. Este antígeno, o anticuerpos contra el mismo, se puede incluir en las composiciones de antígeno de PVL (o anticuerpo contra PVL) de la presente invención. Otro antígeno de Staphylococcus útil en la presente invención se describe en la solicitud de patente publicada E.U.A. No. 2005/0118190, y se conoce como el antígeno "GPl" de Staphylococcus epidermis. Dicho antígeno es común para muchas cepas coagulasa-negativas de Staphylococcus, incluyendo Staphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolyticus, y Staphylococcus hominis. El antígeno se puede obtener a partirla cepa de Staphylococcus epidermis depositado como ATCC 202176. Este antígeno, o anticuerpos contra el mismo se puede incluir en las composiciones de PVL (o anticuerpo contra PVL) de la presente invención. Los antígenos también incluyen aquellos que pertenecen a ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) , y otros antígenos o toxinas protectoras.

Métodos Métodos para tratar y prevenir infección bacteriana La presente invención provee métodos para tratar o prevenir una infección por S. aureus utilizando composiciones que comprenden un anticuerpo contra PVL o un antígeno de PVL. Una población objetivo de pacientes para los métodos de tratamiento y prevención descritos en la presente invención incluye mamíferos, tales como humanos, quienes están infectados con, o en riesgo de ser infectados por, patógenos bacterianos, tales como S. aureus (incluyendo CA-MSRA) o S . epidermidis . De conformidad con una modalidad, la invención provee un método para tratar o prevenir una infección por S. aureus utilizando composiciones que comprenden un anticuerpo contra PVL. De conformidad con este método, se administra a un paciente en necesidad de lo mismo una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de PVL de S . aureus y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de anticuerpo puede comprender cualquier anticuerpo contra PVL descrito anteriormente, y opcionalmente puede ser una composición de IVIG, una composición de IVIG específica hiperinmune, una composición que comprende anticuerpos recombinantes contra PVL (incluyendo composiciones que comprenden fragmentos de anticuerpo contra PVL) , o una composición que comprende anticuerpos contra PVL humanizados . La composición de anticuerpo contra PVL se puede administrar en combinación con un agente anti-infeccioso, un antibiótico, o un agente antimicrobiano. Los ejemplos de agente anti-infecciosos incluyen, pero no se limitan a vancomicina, clindamicina y lisostafina. Los ejemplos de antibióticos y agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a penicilinas resistentes a penicilinasa, cefalosporinas y carbapenems, incluyendo vancomicina, lisostafina, penicilina G, ampicilina, oxacilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, cefalotin, cefazolin, cefalexin, cefradina, cefamandol, cefoxitin, imipenem, meropenem, gentamicina, teicoplanina, lincomicina y clindamicina. Las dosis de estos antibióticos son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY, § 13, Cap. 157, 100a Ed. (Beers & Berkow, eds., 2004). Los agentes anti-infecciosos, antibióticos y/o antimicrobianos se pueden combinar antes de la administración, o se pueden administrar en forma concurrente o secuencial con la composición de IVIG descrita. En algunas modalidades, se administran relativamente pocas dosis de composición de anticuerpo contra PVL, tal como una o dos dosis, y se emplea terapia con antibióticos convencional, la cual generalmente implica dosis múltiples a través de un periodo de días o semanas. Por lo tanto, los antibióticos se pueden tomar una, dos, o tres o más veces por día durante un periodo de tiempo, tal como durante por lo menos 5 días, 10 días o incluso 14 o más días, mientras que la composición de anticuerpo contra PVL usualmente se administra solamente una o dos veces. Sin embargo, las diferentes dosis, tiempo de las dosis, y cantidades relativas de la composición de anticuerpo contra PVL y antibióticos pueden ser seleccionadas y ajustadas por el experto en la técnica . Las composiciones de anticuerpo contra PVL de la presente invención son apropiadas para tratar infecciones por S. aureus meticilino-resistente adquirido en la comunidad (CA-MRSA) , incluyendo, pero sin limitarse a neumonía necrosante, mastitis, fascitis necrosante, syndrome de Waterhouse-Friderichsen, sepsis de CA-MRSA, e infección de la piel y detejidos blandos. La dosis apropiada puede ser determinada por el experto en la técnica utilizando métodos de rutina. La dosis puede depender de un número de factores, tales como la gravedad de la infección, la composición de anticuerpo contra PVL particular utilizada, la frecuencia de administración, y detalles del individuo (tales como edad, peso y condición inmune del individuo) . En algunas modalidades, la dosis es de por lo menos 50 mg de composición de anticuerpo contra PVL por kilogramo de peso corporal (mg/kg) , incluyendo por lo menos 100 mg/kg, por lo menos 150 mg/kg, por lo menos 200 mg/kg, por lo menos 250 mg/kg, por lo menos 500 mg/kg, por lo menos 750 mg/kg, y por lo menos 1000 mg/kg. La frecuencia de dosificación y número de dosis también depende de un número de factores, tales como la gravedad de la infección y el estado inmunológico del paciente. Sin embargo, un régimen de dosificación apropiado, puede ser determinado por un practicante calificado utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la dosis se puede administrar por lo menos una vez cada tercer día, incluyendo por lo menos una vez al día y por lo menos dos veces al día. También puede variar el número de dosis necesarias para tratar de manera efectiva la infección. Por ejemplo, podría ser necesario administrar una, dos, tres, cuatro, o más dosis de la composición de anticuerpo contra PVL. Un individuo con un sistema inmune debilitado o infección particularmente grave podría requerir más dosis y/o dosificación más frecuente. En la presente invención también se describen métodos para tratar y/o prevenir una infección por S. aureus utilizando las composiciones de antígeno descritas en la presente invención. Dichos métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad de lo mismo una composición, tal como una vacuna, que comprenda un antígeno de PVL (como el descrito anteriormente) , y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una población objetivo de individuos para los métodos de tratamiento y prevención descritos en la presente invención incluye mamíferos, tales como humanos, quienes están infectados con, o en riesgo de ser infectados por, patógenos bacterianos, tales como S . aureus . Dichos métodos incluyen la prevención de infecciones por CA-MRSA, incluyendo infecciones de la piel y tejido blando, neumonía necrosante, mastitis, fascitis necrosante, Síndrome de Waterhouse Friderichseny sepsis por CA-MRSA. Como se describió anteriormente, una vacuna de conformidad con la presente invención comprende un antígeno de PVL y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De conformidad con una modalidad, el antígeno de PVL está destoxificado, como se describió anteriormente. De conformidad con una modalidad específica, la PVL se destoxifica mediante conjugación a otra molécula, incluyendo mediante conjugación a otro antígeno de PVL u otro antígeno bacteriano. La presente invención también provee métodos para tratar y/o prevenir una infección bacteriana utilizando una composición de antígeno, tal como una vacuna, que comprende un antígeno de PVL (como el descrito anteriormente) conjugado a otro antígeno bacteriano, tal como un antígeno bacteriano Gram-positivo o Gram-negativo, tal como un antígeno de estafilococo u otro polisacárido bacteriano. Una población objetivo de individuos para los métodos de tratamiento y prevención descritos en la presente invención incluye mamíferos, tales como humanos, quienes están infectados con, o en riesgo de ser infectados por, patógenos bacterianos, tales como S . a ureus . De conformidad con una modalidad, el antígeno de PVL se destoxifica, como se describió anteriormente. De conformidad con una modalidad específica, la PVL se destoxifica mediante conjugación a otra molécula, incluyendo mediante conjugación a otro antígeno de PVL u otro antígeno bacteriano. Se puede administrar una composición o vacuna de antígeno en conjunto con antígenos adicionales, tal como uno o más antígenos de polisacárido capsular de S . a ureus, tales como los antígenos Tipo 5, Tipo 8, y 336 descritos anteriormente, y/u otro S . a ureus conocido en la técnica. De manera adicional o alternativa, se puede administrar una composición o vacuna en conjunto con uno o más .antígenos de S. epidermidis, tal como el antígeno PS1 descrito anteriormente, o con cualquier otro antígeno de Staphylococcus, tal como el antígeno descrito en el documento WO 00/56357 y el antígeno descrito en la solicitud publicada de patente E.U.A. No. 2005/0118190 (GPl) (discutido anteriormente). Una composición o vacuna de la presente invención también puede comprender antígenos tales como a-toxina, ácido lipoteicoico (LTA) o proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM), u otros antígenos o toxinas protectoras.

Dichos uno o más antígenos adicionales se pueden administrar por separado de la composición de vacuna de PVL o se pueden incluir en la composición de vacuna de PVL. Se puede administrar una composición o vacuna de antígeno en conjunto con un agente anti-infeccioso, un antibiótico, y/o un agente antimicrobiano, en una terapia de combinación como se indicó anteriormente. Además, se puede administrar una composición de vacuna de conformidad con la invención con o sin un coadyuvante. Si se utiliza un coadyuvante, éste se selecciona de modo tal que se evite toxicidad inducida por coadyuvante. Una composición o vacuna de conformidad con la presente invención puede comprender de manera adicional un ß-glucano o factor estimulante de colonia de granulocitos, en particular, un ß -glucano como el descrito en la patente E.U.A. No. 6,355,625, presentada el 14 de septiembre de 1999 y expedida el 12 de marzo de 2002. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición o vacuna de antígeno de la presente invención se puede determinar utilizando métodos que son rutinarios en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán que la cantidad puede variar con la composición de la vacuna, las características particulares del individuo, la vía de administración elegida, y la naturaleza de la infección bacteriana que está siendo tratada. Los lineamientos generales se pueden encontrar, por ejemplo, en las publicaciones de la Conferencia Internacional sobre Harmonización y en REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, en las páginas 484-528 (Mack Publishing Company 1990) . Una dosis típica de vacuna puede variar desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 400 µg. La composición o vacuna se puede proveer en cualquier forma de dosificación deseada, incluyendo formas de dosificación que se puedan administrar a un humano por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, o percutánea. La composición o vacuna se puede administrar en una sola dosis, o de conformidad con un protocolo de dosificación múltiple. La administración puede ser mediante cualquier número de vías, incluyendo subcutánea, intracutánea, e intravenosa. En una modalidad, se utiliza administración por vía intramuscular. El experto en la técnica reconocerá que la vía de administración puede variar en función de la infección bacteriana a ser tratada y de la composición de la vacuna.

Métodos para identificar infección de PVL La invención también provee un método para tamizar muestras respecto a la presencia de antígeno de PVL. De conformidad con este aspecto de la invención, cualesquiera de los antígenos de PVL descritos anteriormente se puede poner en contacto con una muestra, y se puede evaluar la unión entre los anticuerpos y cualquier antígeno de PVL presente en la muestra. Las pruebas basadas en anticuerpo son bien conocidas en la técnica, y la invención contempla pruebas tanto cualitativas como cuantitativas que utilicen los anticuerpos de la invención para detectar antígeno de PVL, incluyendo toxoide original de PVL y cualquier antígeno de PVL discutido anteriormente. Las muestras que se pueden analizar respecto a antígeno de PVL no están limitadas e incluyen, por ejemplo, muestras biológicas provenientes de un paciente (tal como muestras de sangre o suero) , muestras del sobrenadante de cultivo celular, muestras bacterianas, y cualquier otra muestra de la que se sospecha que contiene antígeno de PVL. La invención se describe de manera adicional con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proveen solamente para ilustración. La invención no queda limitada a los ejemplos sino más bien incluye todas las variaciones que serán evidentes a partir de las enseñanzas suministradas en la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de clones de tipo silvestre dß rLukF-PV y z ^ S- PV Se aisla ADN genómico a partir de la cepa de S. aureus depositada en el ATCC con el número de acceso 49775, una cepa prototipo de PVL que produce niveles altos de PVL, utilizando un protocolo de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega) con ligera modificación (se agrega lisostafina a la solución reguladora para re-suspensión) . Se diseñan iniciadores de oligonucleótido utilizando las secuencias publicadas de los genes de PVL (Nos. de acceso GenBank X72700 y AB006796) para confinar los genes de LukF-PV y LukS-PV, por separado. Los iniciadores hacia el extremo 5' se diseñan para eliminar los péptidos de señal putativos e incorporar un sitio Ncol. El ATG del sitio Ncol se diseña para que sirva como el codón de inicio para la traducción, eliminando la adición de aminoácidos N-terminales codificados por el vector. Los iniciadores hacia el extremo 3' se diseñan para incorporar un sitio BamHl inmediatamente hacia el extremo 3' del codón de terminación. Los genes luks-PV y lukf-'PV se amplifican mediante PCR a partir de S . a ureus ATCC 49775 utilizando condiciones estándar de amplificación con PCR. Los productos de PCR se clonan en pTrcHisB utilizando los sitios Ncol y BamHl. Además, el inserto NcoI-BamHI que contiene los genes luks-PV y lukf-PV se subclonan posteriormente en pET28 (Novagen) .

EJEMPLO 2 Generación de clones de proteina de fusión de rLu F-PV y rLukS-PV Se utilizan técnicas de clonación con PCR para construir una proteína de fusión de PVL, una proteína manipulada genéticamente que es codificada por una secuencia de nucleótido que se elabora empalmando juntos los genes lukf-PV y luks-PV. Las subunidades de PVL se unen covalentemente a través de un enlazador corto de aminoácido con la configuración rLukF-PV —enlazador de aa—rLukS-PV o rLukS-PV—enlazador de aa—rLukF-PV. Esta proteína de fusión es no citotóxica, debido a que las dos subunidades no pueden ensamblarse y/o interactuar en la manera necesaria para exhibir toxicidad, por ejemplo, en la manera necesaria para que se inserten correctamente en la membrana del leucocito. La proteína de fusión es útil para estimular anticuerpos en un hospedero contra ambas subunidades de PVL (por ejemplo, LukS-PV y LukF-PV) y contra la toxina de PVL como un todo.

EJEMPLO 3 Generación de clones mutantes de rLukF-PV y rLukS-PV Se construyen los siguientes mutantes utilizando el estuche para mutagénesis QuickChange empleando el protocolo descrito por el fabricante (Stratagene) y pTrcHisBLukF-PV y/o pTrcHisBLukS-PV como una plantilla: Mutantes de rLukF-PV: ?I124-S129; E191A; N173A; R197A; W176A, y Y179A. Mutantes de rLukS-PV: ?D1-I17; ?F117-S122; T28D; T28F; T28N, y T244A. El experto en las técnicas de genética entiende que esta nomenclatura es terminología normal. Es decir, "?I124-S129" significa que la región terminada por isoleucina en la posición 124 y serina en la posición 129 está suprimida ("?") en un mutante de rLukF-PV. De manera similar, "?D1-I17" indica que los residuos 1 (aspartato) a 17 (isoleucina) están suprimidos en un mutante rLukS-PV. Del mismo modo, el experto en la técnica sabe que "E191A" significa que el glutamato en la posición 191 está remplazado por alanina, que "N173A" indica que un mutante de rLukF-PV tiene una alanina (A) en la posición 173 en lugar de la asparagina normalmente presente en la Naturaleza (N) , y que "R197A" significa que la arginina (R) en la posición 197 está sustituida por una alanina (A) ; etc. Otros mutantes contemplados específicamente incluyen: Mutantes de rLukF-PV: un mutante doble V12C/K136C para generar puentes de disulfuro internos; ?W176; ?G175-G177; ?R197 y ?S196-Q198. Mutantes de rLukS-PV: T244A o ?T244 para eliminar un sitio de fosforilación; un mutante doble 17C/N130C o un mutante doble D38/I113C para crear un puente de disulfuro estable, ?T28; ?V27-Q29; ?G115-G124, y otros mutantes dobles tales como T28D/?D1-17. Todas las construcciones se transforman en células GC10 de E. coli utilizando el protocolo del fabricante (Gene Choice) . La determinación de secuencia se efectúa utilizando el aparato para determinación de secuencia Dye Terminator Cycle Sequencing de ABI PRISM. Todos los clones con la secuencia correcta se transforman en E. coli GC10 o E. coli BL21(DE3) pLysS para expresión.

EJEMPLO Expresión y Purificación de Antigenos de Mutante y de Tipo Silvestre de rLukS-PV y rLukF-PV En matraces de agitación, se cultiva la cepa de GC10 o BL21 (DE3) pLysS de E. coli que contiene el plásmido de rLukS-PV o rLukF-PV en medio selectivo a 3 °C hasta la mitad de la fase log y se induce utilizando la concentración final de 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 2-3 horas. Las células se recolectan mediante centrifugación. El análisis de los cultivos en matraz agitado mediante análisis de SDS-PAGE y Western blot muestra una banda aproximadamente a 33-34 kDa que no es evidente antes de la inducción. Los comprimidos de células se vuelven a suspender en solución reguladora para lisis celular (20 mM de Na2HP0, 50 mM de NaCl, 5% de glicerol, pH 6.5), y se tratan con 2 mg/g de lisozima a temperatura ambiente, seguido por aplicación de energía sónica con un aparato de energía sónica Misonix. El sobrenadante del lisado celular se recolecta mediante centrifugación. La proteína soluble se carga en una columna intercambio catiónico pre-equilibrada con solución reguladora para lisis celular. La proteína LukS-PV o LukF-PV unida se eluye con un gradiente lineal de 50 a 500 mM de NaCl en solución reguladora de Na2HP04 20 mM, 5% de glicerol, pH 6.5. Las fracciones que contienen rLukS-PV o rLukF-PV se combinan y aplican en una columna cerámica de hidroxiapatita. La rLukS-PV o rLukF-PV pura se eluye a partir de un gradiente lineal de NaCl 50 mM a NaCl 750 mM en solución reguladora de Na2HP04 20 M, 5% de glicerol, pH 6.8. Las proteínas recombinantes y mutantes de rLukF-PV y rLukS-PV se purifican utilizando esta misma metodología y se encuentra que son altamente puras (banda individual de ~33 o 34kDa para rLukF-PV y rLukS-PV, respectivmente; >95% de pureza mediante SDS-PAGE/tinción con azul de Coomassie) . Para el análisis western blot, las proteínas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y se procesa utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica empleando anticuerpo monoclonal primario contra rLukF-PV o rLukS-PV. Los blots confirman la presencia de antígenos de rLukS-PV y rLukF-PV con una banda casi a ~33-34 kDa. Además, la determinación de secuencia N-terminal de rLukS-PV y rLukF-PV confirma la presencia de los productos génicos de lukS-PV y lukf-PV .

EJEMPLO 5 Producción y caracterización de anticuerpos policlonalos para rLukF-PV o rLukS-PV Se inyectan rLukS-PV o rLukF-PV (50 µg de cada uno) conejos blancos de Nueva Zelanda con coadyuvante (CFA seguido por IFA) a una relación 1:1 3 veces con 2 semanas de separación. El antisuero contra LukS-PV reconoce a rLukS-PV como un antígeno idéntico en una prueba de inmunodifusión contra el antígeno, mientras que el antisuero contra rLukF-PV reconoce a LukF-PV. rLukS-PV o rLukF-PV no reaccionan con el antisuero heterólogo. Esto indica que ni la vacuna de rLukS-PV ni la vacuna rLukF-PV generan anticuerpos que presenten reacción cruzada con la subunidad de proteína heteróloga. Por lo tanto, la vacuna de la presente invención es útil para obtener anticuerpos anti-LukS que no presenten reacción cruzada con LukF-PV, y anticuerpos anti-LukF que no presenten reacción cruzada con LukS-PV. Se combinan los sangrados positivos y las IgG se purifican en una columna de proteína G. Se utiliza IgG anti-PVL purificada en modelos animales, como se describe más adelante.

EJEMPLO 6 Análisis inmunoquimico de antigenos de rLukF-PV o rLukS-i?V Se efectúa inmunodifusión doble para determinar la especificidad de los antisueros contra LukS-PV y LukF-PV, y también para determinar el carácter antigénico de los antígenos de la subunidad de PVL. Brevemente, se cargan 10 µl/cavidad de 200 µg/ml de cada antígeno de PVL (cavidades exteriores) y 10 µl/cavidad de antisuero (cavidad central) en geles con agarosa al 1% y se deja que se difundan durante la noche en un ambiente húmedo. Los geles de agarosa se lavan después en PBS y se comprimen durante tres veces consecutivas, después se secan y se tiñen con azul de Coomoassie. Los geles se analizan respecto a bandas de precipitina, las cuales se forman cuando el antígeno y el anticuerpo reaccionan y forman un complejo inmune. Como se muestra en la figura 1, los antígenos de rLukF-PV reaccionan con una banda individual de precipitina con anticuerpos anti-LukF-PV, mientras que los antígenos de rLukS-PV no presentan reacción cruzada con este antisuero. De manera similar, los antígenos de rLukS-PV reaccionan con una banda individual de precipitina con los anticuerpos anti-LukS-PV, mientras que los antígenos de rLukF-PV no presentan reacción cruzada con estos anticuerpos. Por lo tanto, los anticuerpos son específicos para los antígenos homólogos de PVL. Se analizan los siguientes antígenos: Como se demuestra en la figura 1, se observa que todos los antígenos mutantes de rLukF-PV y rLukS-PV comparten una línea de identidad con la subunidad recombinante de tipo silvestre homologa, lo que demuestra que las proteínas mutantes son antigénicamente idénticas con la proteína homologa de tipo silvestre. Por ejemplo rLukS-PV, rLukS-PV ?D1-I17, rLukS-PV ?F117-S122, rLukS-PV T28F, rLukS-PV T28N, rLukS-PV T28D, y rLukS-PV T244A de tipo silvestre son cada una reactivas con anticuerpos anti-LukS-PV y comparten una línea de identidad. De manera adicional, rLukF-PV, rLukF-PV ?I124-S129, rLukF-PV E191A, rLukF-PV N173A, rLukF-PV R197A, rLukF-PV W176A y rLukF-PV Y179A de tipo silvestre son reactivas con anticuerpos anti-LukF-PV y comparten una línea de identidad. Se efectúa ELISA cuantitativa en ambos anticuerpos anti-LukF-PV y anti-LukS-PV, que lo que demuestra que no existe reactividad cruzada para cualquier subunidad de PVL contra el antisuero heterólogo. Estos datos confirman que los antígenos de rLukF-PV y rLukS-PV descritos en la presente invención son antígenos de PVL que no presentan reactividad cruzada.

EJEMPLO 7 Producción de hibridoma de LukS-PV y LukF-PV (anticuerpos monoclonales) Se inmunizan ratones BALB/c con cualquiera de rLukS-PV o rLukF-PV. Se recolectan los esplenocitos inmunizados a partir de los ratones de los estudios respectivos en procedimientos separados y se fusionan en células de mieloma Sp2/0, en experimentos diferentes, utilizando polietilenglicol al 50%. Las células fusionadas se vuelven a suspender en un medio para selección, se siembran en placas para cultivo de tejidos de 96 cavidades y se incuban bajo condiciones humedecidas en una incubadora a 37 °C con 8% de C02. Los sobrenadantes de los cultivos en crecimiento se someten a tamizaje en placas de ELISA revestidas con antígenos purificados, representativos de los inmunógenos respectivos (rLukS-PV o rLukF-PV) , respecto o a secretores de anticuerpo monoclonal (MAb) . Los positivos en ELISA se vuelven a tamizar respecto a reactividad cruzada sobre los antígenos de rLukS-PV y rLukF-PV para verificar la especificidad de los MAb secretados antes que se efectúen los experimentos de clonación para establecer colonias que secreten MAb generadas a partir de células individuales. Las reservas de semilla se generan a partir de cultivos en masa establecidos a partir de estos clones que también se utilizan para producir fluido de ascitos de ratón a partir del cual se preparan los MAb purificados y se caracterizan posteriormente.

EJEMPLO 8 Caracterización de anticuerpos monoclonales contra LukS-PV y LukF-PV Todos los anticuerpos monoclonales para cada una de las subunidades de proteína PVL demuestran ser de la subclase kappa de IgGl. Se analizan los sobrenadantes de 10 MAbs de cada uno de LukS-PV y LukF-PV en pruebas ELISA respecto a reactividad cruzada para rLukS-PV, y los antígenos de rLukF-PV se aplican como revestimiento sobre la placa ELISA. Todos los MAbs son específicos para sus antígenos homólogos (los MABS contra LukS se unen al antígeno de rLukS-PV únicamente, mientras que los MAb contra LukF se unen únicamente al antígeno de rLukF-PV) .

Todos los MAbs se analizan respecto a unión a las proteínas de rLukS-PV y rLukF-PV en pruebas Western blot. De nuevo, cada MAb demuestra que se une específicamente a su antígeno y no presenta reactividad cruzada para el otro antígeno.

EJEMPLO 9 Determinación in vitro de actividad de PVL mediante la prueba de influjo de calcio Se siembran células HL-60 (ATCC CLL-240; Gallagher et al . , Blood 54: 713-33 (1979)) a 2xl05 células/ml y se pasan después de 6 o 7 días cuando la densidad celular llega aproximadamente a 1 x 106 células/ml. Las células HL-60 se diferencian de la siguiente manera: se efectúan conteos celulares para determinar el número y viabilidad de las células utilizando azul de Tryan, se agrega DMSO hasta 1.25% en el medio de cultivo celular, y las células se diluyen hasta 2 x 105 por ml en el medio de cultivo celular que contiene DMSO. Las células se cultivan en una incubadora con C02 a 37°C/8% de C02 durante 6 a 7 días, después de lo cual se efectúan los conteos de célula y se determina que las densidades celulares son de aproximadamente 1 x 106 por ml. Las células HL-60 diferenciadas se cargan con Fluo-4 10 µM y 0.1% de ácido plurónico F-127 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células se lavan dos veces en HBSS/HEPES/Probenecid, y las células se ajustan hasta 6 x 106 células/ml en HBSS/HEPES/Probenecid, y se agregan a cada cavidad de una placa de microtitulación Costar de 96 cavidades de pared negra/fondo transparente. Después se agregan 5 µl de CaCl2 20 mM, seguido por la adición subsiguiente de 25 µl de rLukS-PV y/o 25 µl de rLukF-PV o control con solución reguladora. La citotoxicidad de PVL para las células HL-60 se determina midiendo el cambio en calcio intracelular según se determina mediante el cambio en fluorescencia utilizando el sistema de detección de microplaca basado en monocrómetro Safire2 de Tecan. Un influjo de calcio al interior de las células HL-60 según se determina mediante el cambio en fluorescencia se detecta únicamente cuando están presentes tanto rLukS-PV como rLukF-PV, lo que demuestra que ambas subunidades de PVL son requeridas para citotoxicidad in vitro. Una subunidad de PVL sola no muestra un incremento en florescencia, demostrando por lo tanto que rLukF-PV y rLukS-PV solas no son citotóxicas y se pueden utilizar de manera individual como antígenos para una vacuna sin que requiera destoxificación. Utilizando la prueba de influjo de calcio bajo las condiciones descritas anteriormente, se evalúa una selección de los mutantes de rLukS-PV y rLukF-PV descritos anteriormente respecto a actividad en comparación con las proteínas de tipo silvestre, utilizando un mutante en conjunto con la proteína heteróloga de tipo silvestre. Por ejemplo, las proteínas mutantes de rLukS-PV se combinan con proteínas rLukF-PV de tipo silvestre, o proteínas mutantes de rLukF-PV se combinan con rLukS-PV de tipo silvestre, y se comparan las actividades de las combinaciones mutante/tipo silvestre con la actividad de rLukF-PV y rLukS-PV de tipo silvestre. Se encontró que no todos los mutantes dan como resultado complejos inactivos; sin embargo, varios mutantes dan como resultado formas inactivas (<10% de actividad de tipo silvestre) según se determina mediante la prueba de influjo de calcio. Véase Tablas 1 y 2 más adelante. Estos incluyen los mutantes de LukF-PV diseñados para que tengan una mutación en la hendidura de unión de fosfatidilcolina (por ejemplo, E191A R197A, W176A y Y179A) y los mutantes de LukS-PV T28F, T28N, y T28D. Como se describió anteriormente, ningún mutante no citotóxico (incluyendo aquellos con mutaciones de punto, deleciones, truncamientos, o doblemente destoxificados con dos o más de dichas mutaciones) de una subunidad se puede utilizar con la forma de tipo silvestre de la subunidad heteróloga para crear un antígeno o vacuna estimuladora no tóxica. De manera adicional, se pueden utilizar mutantes de ambas subunidades. En cualquier caso, la vacuna puede inducir anticuerpos contra ambos de LukS-PV y LukF-PV. La no toxicidad de una proteína de fusión o conjugado químico que comprende LukF-PV y LukS-PV se puede confirmar utilizando la prueba de influjo de calcio descritas anteriormente. Como se indicó anteriormente, dicha proteína de fusión o conjugado químico se puede utilizar como un antígeno o vacuna estimuladora para generar anticuerpos contra ambas de LukS-PV y LukF-PV.

TABLA 1 Actividad de proteinas mutantes de rLukF-PV TABLA 2 Actividad de proteinas mutantes de rLukS-PV EJEMPLO 10 Neutralización con anticuerpo policlonal de las actividades eitotóxicas de PVL utilizando la prueba de influjo de calcio Para determinar la actividad neutralizante de anticuerpos contra PVL, se efectúa la prueba de flujo de calcio como se describió anteriormente, modificada en el sentido que se incuba antisuero de conejo anti-LukS-PV o anti-LukF-PV con cualquiera de rLukS-PV o rLukF-PV 30 minutos antes de la adición a las células HL-60 cargadas. Para determinar el por ciento de neutralización, se compara el cambio en fluorescencia para esta reacción con la de la proteína PVL de tipo silvestre sola. La Tabla 3 muestra la neutralización de citotoxicidad de PVL determinada como se describió anteriormente. Tanto el antisuero anti-LukS-PV como el antisuero anti-LukF-PV son efectivos para neutralizar citotoxicidad in vitro. Cuando se evalúan juntos tanto el antisuero anti-LukS-PV como el antisuero anti-LukF-PV respecto a neutralización, no se detecta sinergista. Es decir, cuando se utilizan concentraciones subóptimas de ambos tipos de anticuerpo (ambas a dilución 1:160), no se observa una neutralización mayor que la aditiva. Esto resultados demuestran que los anticuerpos para una subunidad de PVL solamente, por ejemplo, se requieren anticuerpos anti-LukF-PV antibodies o anticuerpos anti-LukS-PV para neutralización de la toxina de PVL.

TABLA 3 Neutralización de citotoxicidad de PVL mediante anticuerpos policlonales de conejo TABLA 3 (cont.) EJEMPLO 11 Determinación in vitro de citotoxicidad de PVL ediante la prueba XTT Se prepara una solución que contiene rLukS-PV y rLukF-PV (20 nM de cada uno) en medio de Eagle modificado de Dulbecco con contenido elevado de glucosa sin rojo de fenol (HG-DMEM) (Gibco) , complementado con 50 µg/mL de gentamicina y 1% de suero fetal de bovino inactivado con calor (HI-FBS) (Gibco) , medio de mantenimiento (MM) . Se efectúan diluciones dobles en serie de la toxina a partir de 20 nM en MM en una placa de cultivo celular de 96 cavidades. Se incluyen en cada placa de prueba cavidades de control de medio negativo y cavidades de control de célula, conteniendo cada conjunto MM en lugar de toxina diluida. Se agregan aproximadamente 5 x 105 células HL-60 viables (inducidas con sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta diferenciación para mayor madurez y células susceptibles a PVL de la ruta neurotrofílica) a cada cavidad con toxina diluida y medio para control celular. Todas las cavidades de control de medio reciben MM en lugar de una suspensión celular. La placa de prueba con las muestras se incuba bajo condiciones humedecidas en una incubadora a 37 °C con 8% de C02 durante 24-48 horas. XTT como la sal sódica del compuesto 2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxianilida (Sigma, cat. # TOX-2), y preparado en MM de conformidad con las instrucciones del fabricante, se agrega después a todas las cavidades a 20% del volumen del medio de cultivo en cada cavidad. La placa se regresa a la incubadora para incubación adicional para permitir el desarrollo de un color debido a la acción de XTT. (Las deshidrogenasas mitocondriales de las células vivas cortan el anillo de tetrazolio de XTT, lo que da como resultado que se desarrolle una solución de color naranja) . La placa se retira después de la incubadora, se centrifuga para comprimir las células y los restos celulares antes de transferir un volumen del sobrenadante de cada cavidad a las cavidades correspondientes de una placa de ELISA de fondo redondo. Las densidades ópticas (DO) de los sobrenadantes se miden a 450 nm con ayuda de una lectora de placas de ELISA que resta la DO solamente del medio como fondo antes de reportar los datos. Después se calcula el por ciento de células aniquiladas debido a la acción citotóxica de PVL. Según se determina mediante la prueba XTT, se requieren ambas subunidades de PVL de tipo silvestre, rLukF-PV y rLukS-PV a > 0.5 nM, para citotoxicidad in vitro. No se observa citotoxicidad para cada subunidad de PVL sola a 10 nM. Por lo tanto, los datos también demuestran que una subunidad de PVL sola no es citotóxica y puede ser individualmente como una vacuna o antígeno estimulador.

EJEMPLO 12 Neutralización con anticuerpo de citotoxicidad de PVX- utilizando la prueba XTT Los anticuerpos purificados provenientes de suero inmune de ratón recolectados a partir de los estudios de LukS-PV y LukF-PV efectuados para generar esplenocitos inmunizados para producción de hibridoma en experimentos de fusión de célula de mamífero y, a partir de fluido de ascitos generados con hibridomas establecidos que secretan MAbs específicos para las subunidades de la toxina, se caracterizan respecto a sus capacidades para neutralizar la toxina de PVL in vitro. Se efectúan diluciones dobles en serie de los anticuerpos en una placa de cultivo celular de 96 cavidades. En cada placa de prueba se incluyen cavidades de control de medio negativas y cavidades de control de célula, que no contienen toxina, y un conjunto de cavidades de control de toxina positivas. Se agrega un volumen igual de 40 nM de subunidades de toxina de PVL en MM (descrito anteriormente) a todas las cavidades con anticuerpo y a aquellas para control positivo de toxina. Se agrega MM a volúmenes iguales a todas las cavidades de control de medio y a las cavidades de control de célula. A cada cavidad con anticuerpo diluido, toxina y medio para control celular, se agregan aproximadamente 1 x 106 células HL-60 viable inducidas con DMSO en un volumen igual a aquel en cada cavidad. Todas las cavidades de medio de control reciben MM en lugar de una suspensión celular. Esta manera todas las concentraciones de anticuerpo y toxina se diluyen cuatro veces con respecto a las concentraciones de partida. El contenido de cada cavidad se mezcla y se transfiere un volumen de 50% a la cavidad correspondiente en otra placa de cultivo celular de 96 cavidades. Ambas placa se incuban en una incubadora humedecida a 37 °C, 8% de C02. XTT como la sal sódica del compuesto 2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxianilida (Sigma, cat. # TOX-2), y preparado en MM de conformidad con las instrucciones del fabricante, se agrega después a todas las cavidades a 20% del volumen del medio de cultivo en cada cavidad. La placa se regresa a la incubadora para incubación adicional para permitir el desarrollo de un color debido a la acción de XTT. La placa se retira después de la incubadora, se centrifuga para comprimir las células y los restos celulares antes de transferir un volumen del sobrenadante de cada cavidad a las cavidades correspondientes de una placa de ELISA de fondo redondo. Las densidades ópticas (DO) de los sobrenadantes se miden a 450 nm. Después se calcula el por ciento de células aniquiladas debido a la acción citotóxica de PVL. Como se indica en la tabla 4, los MAbs contra LukS-PV son 10 veces más efectivos para neutralizar la citotoxicidad de PVL que los MAbs contra LukF-PV en esta prueba. Es decir, se requiere Mab contra LukF aproximadamente 10 veces más alto para neutralización de citotoxicidad de PVL in vitro según se determina mediante la prueba XTT. Por ejemplo, se logra el 50% de neutralización de citotoxicidad de PVL utilizando 0.4-10 µg/ml de Mab contra LukS, mientras que se requiere 5-95 µg/ml de Mab contra LukF para lograr el 50% de neutralización. Los resultados en la tabla 4 también muestran que los anticuerpos policlonales específicos para rLukS-PV ("LukS-M-IgG") o rLukF-PV ( "LukF-M-IgG" ) pueden neutralizar la citotoxicidad de PVL in vitro. Estos resultados indican que una composición que comprenda un antígeno de LukS-PV sólo (es decir, sin LukF-PV) pueden ser efectiva como una vacuna, y que una composición que comprende anticuerpo anti-LukS-PV (incluyendo MAb, o IVIG o IVIG específica hiperinmune que comprenda anticuerpos anti-LukS-PV) sólo (es decir, sin anticuerpo anti-LukF-PV) podría ser efectiva para neutralizar la citotoxicidad de PVL. Aunque composiciones de antígeno/anticuerpo de LukF-PV comparables pudieran ser menos potentes, estas también pueden ser útiles, como se demuestra por la capacidad del mAb contra LukF sólo para neutralizar la citotoxicidad de PVL en esta prueba.

TABLA 4 50% de neutralización con mAb de la aniquilación eitotóasica de PVL (prueba XTT) TABLA 4 (cont.) EJEMPLO 13 Neutralización de citotoxicidad mediada por PVL mediante anticuerpos anti-LukS monoclonales o policlonales Se extrae sangre periférica a partir de voluntarios sanos y los PMN de humano se purifican mediante un gradiente de Percoll. Se agrega anticuerpo anti- LukS-PV monoclonal (lLukS235) o policlonal (conejo) a diluciones diferentes a los PMN de humano (5 x 105 células/ cavidad) para inhibir el efecto citotóxico de rPVL (10 nM) o sobrenadante de cultivo de USA300 de 24 horas (dilución 1:40), el cual contiene LukS-PV a 1.2 µg/ml y LukF-PV a 0.5 µg/ml. Estas diluciones elegidas inducen respectivamente 85% (MAb) y 70% (PAb) de citotoxicidad en los PMN de humano.

Como controles, se utilizan suero de conejo y MAb antialfa-toxina. Se evalúa el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-LukS-PV utilizando una prueba XTT después de dos horas de cultivo, según se mide por el cambio de florescencia a 450 nm. Los resultados indican que las células HL-60 inducidas y los PMN de humano purificados de sangre periférica son susceptibles a rPVL a las mismas concentraciones. rPVL y PVL obtenidas a partir de un sobrenadante de cultivo de CA-MRSA US A300 son igualmente efectivas para inducir citotoxicidad en PMN de humano. Como se demuestra en la tabla 5, los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales son efectivos para neutralizar citotoxicidad dependiente de PVL en PMN de humano. Como control, el suero de conejo no afectado (dilución 1:10) sólo induce 10% de neutralización de citotoxicidad para el sobrenadante de US A300 que contiene tanto rPVL como PVL. Estos resultados demuestran que los anticuerpos monoclonales y policlonales anti-LukS-PV son efectivos para neutralizar los efectos citotóxicos tanto de rPVL como de PVL original expresadas por CA-MRSA.

TABLA 5 Neutralización con MAb y PAb de citotoxicidad de PVL (pruebA XTT) EJEMPLO 14 Toxicidad de la toxina PVL, rLukF-PV y rL kS- Se rasuran conejos Nuva Zelanda de género femenino (Harían) , de 4-5 meses de edad, y se inyectan por vía intradérmica con dosis cada vez mayors de rLukF-PV y rLukS-PV, o toxina rPVL (rLukF-PV y rLukS-PV) a concentraciones casi equimolares (12.5, 25, 50 y 100 µg) . La dermonecrosis se sigue diariamente durante 1 semana; se mide el tamaño de las lesiones. Este estudio demuestra la susceptibilidad de los conejos a dermonecrosis causada por inyección intradérmica de toxina rPVL (rLukF-PV y rLukS-PV) . Aunque la dermonecrosis se observa después de 24 horas después que se inyecta la toxina rPVL (12.5-100 µg) , la inyección de una subunidad de PVL individual (cualquiera de 200 µg de rLukS-PV o 200 µg de rLukF-P) no produce ninguna lesión. Se observa un efecto dependiente de la dosis en el que el tamaño de la lesión se incrementa con concentraciones cada vez mayores de la toxina rPVL. Esto resultados también demuestra que cualquiera de rLukS-PV o rLukF-PV sola es un antígeno no tóxico que se puede utilizar como una vacuna o antígeno para estimulación sin destoxificación adicional.

EJEMPLO 15 Eficacia de anticuerpos contra PVL para neutralizar la toxina de PVL in vivo Se evalúa la capacidad de las vacunas que comprenden rLukS-PV, rLukF-PV, o rPVL (rLukS-PV + rLukF-PV) para neutralizar la toxina rPVL (12.5-200 µg) in vivo. Se inmunizan conejos Nueva Zelanda de género femenino, de 5-6 meses de edad, 3 x 2 semanas de separación mediante vía intramuscular con 50 µg de rLukS-PV, 50 µg de rLukF-PV, o con ambas subunidades (50 µg de cada una) , utilizando Titermax (Sigma) como un coadyuvante en una relación 1:1. Los conejos se sangran siete días después de la tercera inyección y se evalúan los títulos de IgG para LukS-PV y LukF-PV mediante ELISA. En todos los sueros relevantes, los títulos para IgG de LukS-PV, e IgG de LukF-PV fueron dilución 1/106 para una DO450nm = 2.0. Los antisueros provenientes de conejos inmunizados con rLukF-PV reaccionan únicamente con rLukF-PV, mientras que los conejos inmunizados con rLukS-PV reaccionan únicamente con rLukS-PV, lo que demuestra que no existe reactividad cruzada entre las subunidades heterólogas y los anticuerpos. Los conejos se rasuran y se les inyecta (desafía) en su espalda con toxina rPVL (200 µg de cada subunidad) , 200 µg de rLukF-PV, 200 µg de rLukS-PV o PBS. La vacunación con rLukS-PV y rLukF-PV induce títulos altos de anticuerpo para cada subunidad, respectivamente (dilución 1/106 para OD = 2) . Asimismo, estos anticuerpos demuestran protección contra, dermonecrosis que resulta del desafío con toxina rPVL. Es decir, después del desafío con rPVL, no se observa dermonecrosis en conejos inmunizados con cualquier subunidad de rPVL (rLukS-PV o rLukF-PV) . En contraste, se observa dermonecrosis en conejos de control, los cuales reciben placebo (PBS más Titermax) . De manera adicional, en todos los conejos, no se observa necrosis cuando solamente se utiliza una subunidad de PVL como el desafío. Estos resultados también demuestran que la inmunización con rLukS-PV o rLukF-PV sola (es decir, sin la otra subunidad) es efectiva para evitar la necrosis causada por PVL. Por lo tanto, una composición que comprenda uno de dichos antígenos de PVL puede ser útil para la prevención de necrosis causada por CA-MRSA que produzca PVL.

EJEMPLO 16 Eficacia de anticuerpos contra PVL en la protección contra infección por PVL+CA-MRSA Se evalúa la capacidad de vacunas que comprenden rLukS-PV, rLukF-PV, o rPVL (rLukS-PV + rLukF-PV) para neutralizar infecciones de la piel por S. aureus productor de PVL. Se inmunizan conejos Nueva Zelanda de género femenino, de 5-6 semanas de edad, 3 x 2 semanas de separación mediante vía intramuscular con 50 µg de rLukS-PV, 50 µg de rLukF-PV, o con ambas unidades (50 µg de cada una) , utilizando Titermax (Sigma) como un coadyuvante en una relación 1:1. Los conejos se sangran siete días después de la tercera inyección y los títulos de IgG de LukS-PV y LukF-PV se evalúan mediante ELISA. En todos los sueros relevantes, los títulos para IgG de LukS-PV IgG, e IgG de LukF-PV son dilución 1/106 para una DO450n = 2.0. Los antisueros provenientes de conejos inmunizados con rLukF-PV reaccionan solamente con rLukF-PV, mientras que los conejos inmunizados con rLukS-PV reaccionan solamente con rLukS-PV, lo que demuestra que no existe reactividad cruzada entre las subunidades heterólogas y los anticuerpos. Los antisueros provenientes de conejos inmunizados con ambas subunidades reaccionan tanto con LukF-PV como con LukS-PV. Los conejos se rasuran e inyectan en la espalda con 108 UFC/100 µl de cepas de S . aureus, CA-MRSA USA300 (productora de PVL. La vacunación con rLukS-PV y rLukF-PV induce títulos altos de anticuerpo para cada subunidad, respectivamente (dilución 1/106 para OD = 2) . Estos anticuerpos muestran protección contra dermonecrosis que resulta de un aislado de S . aureus productor de PVL (o CA-MRSA USA300) . Es decir, no se observa dermonecrosis en conejos inmunizados con cualquier subunidad de rPVL (rLukS-PV o rLukF-PV) o con rPVL (rLukS-PV y rLukF-PV) . En contraste, se observa dermonecrosis en los conejos de control, los cuales reciben placebo (PBS más Titermax) o conejos no afectados. Además, los conejos que se inmunizan con rPVL (rLukS-PV y rLukF-PV) tienen una gravedad reducida de infección. Ninguno de los conejos inmunizados con rPVL desarrolla lesiones, mientras que el conejo de control produce lesiones. Los conejos inmunizados con cualquiera de rLukS-PV o rPVL (rLukF-PV y rLukS-PV) están sanos en el día 7. Sin embargo, el conejo inmunizado con rLukF-PV demuestra signos clínicos de morbidez (pérdida de peso, fiebre) en el día 5 y el conejo de control, el cual recibe PBS, muere después de 40 horas. La vacuna de rLukS-PV y la vacuna de rPVL (rLukF-PV y rLukS-PV) son efectivas para evitar infecciones por CA-MRSA. Los signos de morbidez en el único conejo inmunizado con la vacuna de rLukF-PV podrían indicar que la vacuna de rLukF-PV no es tan efectiva como la vacuna de rLukS-PV, pero el tamaño de la muestra es muy pequeño para inferir una conclusión científicamente válida. En cualquier caso, la vacuna de rLukF-PV por lo menos retrasa el inicio y/o gravedad de la enfermedad, incluso si el conejo no está completamente protegido contra infección.

EJEMPLO 17 Clonación, expresión, y purificación de antigenos da PVL Se clonan secuencias de nucleótido que codifican para LukF-PV y LukS-PV utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir del ADN genómico de S. aureus ATCC No. 49774 en un vector pTrcHis-B (Stratagene) utilizando sitios de restricción Ncol y BamHl en los extremos amino-terminal y carboxilo-terminal, respectivamente. Se forman los plásmidos pTrcLukS PV1 y pTrcLukF PV1 y se confirma mediante determinación de secuencia de ADN. La expresión del plásmido está bajo control de un operón lac y por lo tanto, se utiliza IPTG para inducir la expresión de proteína. La expresión se efectúa en células de E. coli transformadas con los plásmidos . Las subunidades LukF-PV y LukS-PV se purifican después a partir de las células de E. coli utilizando un esquema en columna de dos pasos. Las células de E. coli que contienen LukF-PV y LukS-PV se lisan y los restos celulares se eliminan mediante centrifugación. El lisado celular se carga primero en una columna SP-Sefarosa en NaCl 0.05M/fosfato de sodio 0.02 M, pH 6.5 que contiene 5% de glicerol, y se eluye con un gradiente lineal de NaCl 0.05-0.5 M. Se combinan las fracciones que contienen antígeno, LukF-PV o LukS-PV, según se detecta mediante SDS-PAGE. El antígeno combinado se purifican adicionalmente en una columna por afinidad de cerámica de hidroxiapatita (CHT) . La columna de CHT se equilibra primero con NaCl 0.05 M/fosfato de sodio 0.02 M, pH 6.8 que contiene 5% de glicerol y se eluye con un gradiente lineal de NaCl 0.05M-0.75 M. Los productos finales se analizan respecto a pureza utilizando SDS-PAGE/tinción con plata.

EJEMPLO 18 Generación de proteínas mutantes de PVL no tóxicas Se generan proteínas mutantes de PVL no tóxicas mediante mutagénesis. Las proteínas mutantes se generan utilizando técnicas de clonación con PCR/mutagénesis . Los mutantes se crean utilizando ADN de plásmido [pTrcLukF PVl (para LukF-PV) y pTrcLukS PVl (para LukS-PV) ] como un ADN de plantilla utilizando métodos estándar de mutagénesis dirigida a sitio. Las proteínas mutantes contienen mutaciones que eliminan la capacidad de la subunidad LukS-PV de insertarse por sí misma en una membrana celular, evita que el tallo o extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana se desdoble para LukS o F, altera el sitio de fosforilación que es requerido para actividad leucocitolítica, bloquea la actividad del canal de Ca+2, bloquea la actividad de poro de PV, y/o altera la interacción entre las subunidades LukS-PV y LukF-PV.

EJ?MPLO 19 Pruebas de neutralización Se analizan los antisueros provenientes de estudios con animales mediante ELISA respecto a títulos contra las subunidades de PVL LukF-PV y LukS-PV. Se utilizan los antisueros con títulos altos en una prueba de neutralización. Esencialmente, las pruebas de citotoxicidad se efectúan agregando un anticuerpo neutralizante. El anticuerpo se agrega a las subunidades de PVL antes de mezclar con las células polimorfonucleadas o se agrega simultáneamente a las células polimorfonucleadas durante la prueba. La neutralización se detecta observando una reducción de los cambios morfológicos causados por PVL y/o detectando un decremento en las emisiones fluorescentes ocasionado por el influjo de cationes a través ya sea de los canales de calcio activados o los poros de PVL.

EJEMPLO 20 Producción de anticuerpo de PVL Estimulación del donador Se utilizan proteínas de PVL para vacunar donadores de plasma. El plasma se recolecta y se purifican las IgGs utilizando metodología estándar.

Generación de anticuerpos monoclonales (MAbs) específicos de PVL Para la producción de MAb, se inmunizan cuatro grupos de ratones BALB/c con una toxina de PVL (ya sea una subunidad LukF-PV, una subunidad LukS-PV, o ambas) en dos grupos de ratones por toxina. Las inmunizaciones se efectúan a intervalos de dos semanas con excepción de la inyección final la cual se aplica 3 días antes de sacrificar los ratones. Cada toxina se inyecta a 5 µg y 10 µg por ratón de los grupos respectivos . Las toxinas se administran en combinación con coadyuvante completo y coadyuvante incompleto de Freund en forma secuencial, para las primeras dos inyecciones. Las inyecciones subsiguientes se efectúan con toxina diluida en solución salina regulada con fosfatos (PBS) . Se preparan suspensiones de esplenocitos como una mezcla de los grupos respectivos de los ratones sacrificados y se almacenan el alícuotas apropiadas en nitrógeno líquido para uso en experimentos de fusión en fechas posteriores. Se produce un inventario de suministros de reserva concentrados de MAbs específicos para LukF-PV y LukS-PV en aproximadamente 4 meses de las fechas de los experimentos de fusión. Después que se seleccionan los anticuerpos monoclonales de ratón, estos se humanizan empalmando los genes de ratón para la porción de reconocimiento de antígeno altamente específica del anticuerpo en los genes de humano que codifican para el resto de la molécula de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales humanizados típicamente contienen menos de 10% de contenido de ratón, reduciendo al mínimo de esta manera cualquier reacción inmune.

Producción de anticuerpo recombinante generación de anticuerpos utilizando despliegue de fago Se aplican dos estrategias cuando se utiliza tecnología de despliegue de fago. La primera es el uso de genotecas se preparan fácilmente conocidas como genotecas no afectadas expresan ya sea péptidos o fragmentos de anticuerpo de humano. La segunda implica la construcción de una genoteca de anticuerpos que sean específicos para la proteína de interés. Antes de determinar cuál estrategia se utiliza, se investigan y comparan las genotecas comerciales. De manera alternativa, se utilizan células de bazo provenientes de un animal inmunizado para construir una genoteca específica para la proteína de interés. Después que se decide la estrategia de genoteca, se utilizan LukS-PV y LukF-PV como objetivos para las pruebas de tamizaje. Las subunidades LukS-PV y LukF-PV se adsorben en un soporte sólido para capturar al fago que despliega los péptidos o fragmentos de anticuerpo específicos. Las partículas de fago capturadas se eluyen en forma diferencial para la selección de péptidos o fragmentos de anticuerpo con afinidad más alta. Generalmente se utilizan tres rondas de selección para el aislamiento de péptidos o fragmentos de anticuerpo altamente específicos. También se puede utilizar mutagénesis aleatoria de las genotecas de fago para incrementarla especificidad, si se requiere. Se pueden efectuar varias sustituciones y modificaciones a la invención descrita en la presente sin alejarse del campo y alcance de la invención. La descripción y ejemplos anteriores son solamente ilustrativos, y no limitan el campo de la invención, el cual queda definido por las reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukS-PV de un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S . aureus, pero que no se une específicamente a una subunidad LukF-PV.

2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

3.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que se prepara mediante un procedimiento que comprende : (i) administrar a un individuo una composición que comprende una subunidad LukS-PV de antígeno de PVL de S. aureus y ninguna subunidad LukF-PV, y (ii) obtener el anticuerpo a partir del individuo.

5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la subunidad LukS-PV se selecciona a partir del grupo que consiste de subunidad LukS-PV de tipo silvestre purificada y subunidad LukS-PV recombinante.

6.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende una mutación en su secuencia de aminoácido, con relación a su secuencia de aminoácido de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido.

7.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la mutación es por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de una mutación o mutaciones que: (i) evitan la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evitan que un tallo o extremidad citoplasmática de un dominio de transmembrana se desdoble para LukS, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) cree deleciones N-terminales del "cerrojo amino" de LukS-PV, y (viii) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana.

8.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) T28F, (ii) T28N, y (iii) T28D.

9.- Una composición que comprende al anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la composición es una composición de IVIG.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la composición es una composición de IVIG específica hiperinmune.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, que comprende también uno o más anticuerpos contra uno o más antígenos bacterianos adicionales .

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque dichos uno o más anticuerpos se seleccionan a partir del grupo que consiste de anticuerpos contra uno o más antígenos de S . aureus que se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, S. aureus 336, S. epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) , y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM), y combinaciones de las mismas.

14.- A method para neutralizar citotoxicidad asociada con PVL en un individuo, que comprende administrar a un individuo una composición que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

15.- Una composición que comprende una subunidad LukS-PV de un antígeno de PVL de S . aureus y un vehículo farmacéuticamente acceptable, caracterizada porque la subunidad LukS-PV comprende una mutación en la secuencia de aminoácido de LukS-PV, con relación a su secuencia de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la subunidad LukS-PV comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de mutaciones que (i) evitan la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evitan que un tallo o extremidad citoplasmática de un dominio de transmembrana se desdoble para LukS, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) cree deleciones N-terminales del "cerrojo amino" de LukS-PV, y (viii) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el antígeno de PVL comprende una subunidad LukS-PV que comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) T28F, (ii) T28N, y (iii) T28D.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la composición no comprende subunidad LukF-PV.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, que comprende también uno o más antígenos bacterianos adicionales.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S. aureus Tipo 8 y S. aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) .

21.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, que comprende también uno o más antígenos de PVL adicionales.

22.- Una subunidad LukS-PV de un antígeno de PVL de S . aureus que comprende una mutación en la secuencia de aminoácido de LukS-PV, con relación a su secuencia de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido.

23.- La subunidad LukS-PV de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la mutación se selecciona a partir del grupo que consiste de mutaciones que (i) evitan la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evitan que un tallo o extremidad citoplasmática de un dominio de transmembrana se desdoble para LukS, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) cree deleciones N-terminales del "cerrojo amino" de LukS-PV, y (viii) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana.

24.- La subunidad LukS-PV de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la subunidad LukS-PV comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) T28F, (ii) T28N, y (iii) T28D.

25.- Un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukS-PV de conformidad con la reivindicación 22.

26.- Un método para tratar o prevenir infección por S. a ureus asociada con cepa de S . aureus que expresa PVL, que comprende administrar a un individuo en necesidad de lo mismo una composición que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la subunidad LukS-PV de un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S. aureus, pero que no se une específicamente a una subunidad LukF-PV y un vehículo farmacéuticamente aceptable y (ii) una composición que comprende una subunidad LukS-PV de un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S. aureus y ninguna subunidad LukF-PV y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, que comprende también administrar un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de un agente anti-infeccioso, un antibiótico, y un agente antimicrobiano.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente antibiótico se selecciona a partir del grupo que consiste de vancomicina, clindamicina y lisostafina.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la infección por S . aureus se selecciona a partir del grupo que consiste de una infección por S . aureus meticilino-resistente adquirido en la comunidad (CA-MRSA) , una infección de la piel o de tejido blando, neumonía necrosante, mastitis, fascitis necrosante, syndrome de Waterhouse Friderichsen, sepsis de CA-MRSA e infección por una cepa de S. aureus que exprese antígeno de PVL.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 26, que comprende también administrar uno o más anticuerpos contra uno o más antígenos bacterianos adicionales .

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque dichos uno o más anticuerpos se seleccionan a partir del grupo que consiste de anticuerpos contra un antígeno de S . a ureus que se selecciona a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S. aureus Tipo 8, y S. aureus 336, S. epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) .

32.- El método de conformidad con la reivindicación 26, que comprende también administrar uno o más antígenos bacterianos adicionales.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . a ureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, y S . aureus 336, S . epidermidis PS1, S . epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) .

34.- Un método para elaborar un preparado de IVIG específico hiperinmune que comprende (i) administrar una composición que comprende una subunidad LukS-PV de un antígeno de PVL de S . a ureus y ninguna subunidad LukF-PV y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un individuo, (ii) recolectar plasma a partir del individuo, y (iii) purificar una inmunoglobulina proveniente del individuo.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la subunidad LukS-PV se selecciona a partir del grupo que consiste de una subunidad LukS-PV de tipo silvestre y una subunidad LukS-PV mutada.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende una mutación en las secuencias de aminoácido de LukS-PV, con relación a la secuencia de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 34, que comprende también administrar uno o más antígenos bacterianos adicionales al individuo.

38.- Una composición que comprende (i) una composición de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) que comprende un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukS-PV de un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S . aureus pero que no se une específicamente a una subunidad LukF-PV y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque la composición de IVIG comprende un título de anticuerpo anti-subunidad LukS-PV que es por lo menos dos veces más grande que el encontrado en IVIG normal.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque se administra la composición que comprende una subunidad LukS-PV.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la composición comprende una subunidad LukS-PV que comprende una mutación en la secuencia de aminoácido de LukS-PV, con relación a su secuencia de tipo silvestre, que comprende por lo menos una sustitución, inserción, o deleción de aminoácido.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la mutación se selecciona a partir del grupo que consiste de mutaciones que (i) evitan la unión de PVL a una membrana celular, (ii) evitan que un tallo o extremidad citoplasmática de un dominio transmembrana se desdoble para LukS, (iii) bloquee el ensamblado de LukF-PV y LukS-PV, (iv) bloquee la actividad del canal de Ca+2, (v) bloquee la actividad de un poro de PVL, (vi) altere el sitio de fosforilación de LukS-PV, (vii) cree deleciones N-terminales del "cerrojo amino" de LukS-PV, y (viii) cree mutantes dobles de cisteína que eviten el desdoblamiento del pre-tallo y la inserción dentro de la membrana.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende por lo menos una mutación que se selecciona a partir del grupo que consiste de (i) T28F, (ii) T28N, y (iii) T28D.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende una subunidad LukS-PV de tipo silvestre.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque se administra dicha composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad LukS-PV de un antígeno de Leucocidina de Panton-Valentine (PVL) de S . a ureus, pero que no se une específicamente a una subunidad de LukF-PV.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la subunidad LukS-PV comprende una subunidad LukS-PV de tipo silvestre.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque dichos uno o más antígenos bacterianos adicionales se seleccionan a partir del grupo que consiste de S . aureus Tipo 5, S . aureus Tipo 8, y S. aureus 336, S. epidermidis PS1, S. epidermidis GPl, a-toxina, ácido lipoteicóico (LTA) y proteínas de molécula de matriz adhesiva de reconocimiento de componentes de superficie microbiana (MSCRAMM) .