MX2007015225A - Chaperonas farmacologicas para el tratamiento de obesidad. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con metodos para mejorar la actividad del receptor de melanocortina-4 (MC4R) normal, y para mejorar la actividad de un MC4R que tiene una mutacion la cual afecta el pliegue de la proteina y/o el procesamiento de MC4R. La invencion proporciona un metodo para tratar a un individuo que tiene una condicion en la cual el incremento de la actividad de un MC4R en la superficie celular seria benefico, por ejemplo en la obesidad, administrar una cantidad efectiva de una chaperona farmacologica para el MC4R. La invencion proporciona chaperonas farmacologicas de MC4R que mejoran la actividad de MC4R. La invencion proporciona ademas un metodo de secuenciamiento para identificar chaperonas farmacologicas que mejoran el pliegue de un MC4R en el reticulo endoplasmico (ER), para mejorar la actividad del MC4R en la superficie celular.

Description

CHAPERONAS FARMACOLÓGICAS PARA EL TRATAMIENTO DE OBESIDAD CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con métodos para mejorar la actividad normal del receptor de melanocortina 4 (MC4R) , y para mejorar la actividad de un MC4R que tiene una mutación o mutaciones, las cuales afectan el pliegue de la proteína y/o procesamiento del MC4R. La invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene una condición en la cual el incremento de la actividad de un MC4R en la superficie celular sería benéfico, como en la obesidad, administrando una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica para el MC4R. La invención proporciona chaperonas farmacológicas de MC4R, las cuales mejoran la actividad del MC4R. Las cuales mejoran la actividad en MC4R. La invención proporciona además un método de selección para identificar chaperones farmacológicas las cuales mejoran el pliegue de un MC4R en el retículo endoplásmico (ER) , para mejorar la actividad del MC4R en la superficie celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Obesidad La obesidad representa uno de los trastornos más prevalecientes del peso corporal, y es uno de los trastornos nutricionales más importantes en el mismo occidental, con Ref. No. 188462 estimaciones de su prevalecencia que van del 30% hasta el 50% de la población de edad media. El número de estadounidenses con sobrepeso y obesos a continuado incrementándose desde 1960, una tendencia que no disminuye. Hoy en día, el 64.5 por ciento de los adultos Estadounidenses (aproximadamente 127 millones) están en la categoría de sobrepeso u obesos. Cada año, la obesidad causa al menos 300,000 muertes en los Estados Unidos, y los costos de salud de adultos Estadounidenses con obesidad contabilizan aproximadamente $100 billones (Asociación Estadounidense de la Obesidad) . La obesidad incrementa el riesgo de un individuo de desarrollar condiciones como presión sanguínea alta, diabetes (tipo 2) , hiperlipidemia, enfermedades cardiacas, hipertensión, apoplejía, enfermedades de la vejiga, y cáncer de mama, próstata y colon (véase por ejemplo, Nishina, P. M. et al, 1994, Metab. 43: 554-558; Grundy, S. M. & Barnett, J. P., 1990, Dis. Mon. 36: 641-731). En los Estados Unidos, la incidencia de sobrepeso u obesidad ocurre en altos porcentajes en poblaciones raciales/étnicas minoritarias como Estadounidenses Africanos y Estadounidenses Hispanos, en comparación con los Estadounidenses Caucásicos. Las mujeres y personas de un status socioeconómico bajo dentro de las poblaciones minoritarias parecen ser particularmente afectadas por el exceso de peso y obesidad. Esta tendencia no se limita a los adultos. Aproximadamente el 30.3% de los niños, (edades de 6 a 11) tienen sobrepeso y 15.3 por ciento son obesos. Para los adolescentes (edades de 12 a 19), el 30.4 por ciento tienen sobrepeso y el 15.5 por ciento son obesos. La diabetes, hipertensión y otras enfermedades técnicas relacionadas con la obesidad que prevalecen entre los adultos, ahora se han vuelto más comunes en niños y adultos jóvenes. Se reporta que los hábitos dietéticos pobres e inactividad contribuyen el incremento de la obesidad en la juventud. Adicionalmente, los factores de riesgo para desarrollar obesidad en la niñez incluyen tener padres con sobrepeso, o padres no preocupados por el peso de sus hijos, incremento del consumo de energía debido a que se siguen más grandes, incremento del tipo de vida sedentaria y disminución de actividades relacionadas con el transporte (caminar a la escuela o a la parada del autobús) , que tienen un temperamento con altos niveles de enojo/frustración (lo cual puede hacer que los padres den a los niños alimento y calorías extra para disminuir sus molestias) ; tener Síndrome de Down, índice de Masa Corporal en el Embarazo de la Madre (IMC) , y de primer alumbramiento (incremento de la prevalecencia de la obesidad) . Una herramienta usada para diagnosticar la obesidad en adultos es calcular un IMC individual, el cual es una medida del peso corporal para la altura (Garrow and Webster, International Journal of Obesity 1985; 9:147-153). Un IMC de 25 a 29.9 indica que un individuo tiene sobrepeso, mientras que un IMC de 30 o superior es indicativo de obesidad. Para niños, el IMC es específico del género y la edad (Pietrobelli et al, Journal of Pediatrics 1998; 132:204-210) . Los factores de riesgo para desarrollar obesidad en la adultez incluyen una dieta pobre (un alto contenido de calorías, un bajo contenido de nutrientes) ; falta de actividad física; y frecuente de trabajo; dejar de fumar, tener ciertas condiciones médicas como enfermedades hereditarias raras, y desequilibrios hormonales (como hipotiroidismo, enfermedad de Gushing y síndrome de ovario poliquístico) ,- ciertas medicaciones (esteroides y algunos antidepresivos) ; ser de una minoría racial o étnica (especialmente una minoría femenina) ; un estatus económico bajo) ; edad (el riesgo se incrementa de los 20 a los 55) , embarazo; y retiro (debido a un programa alterado) .

Receptor de la Melanocortina 4 y la Obesidad El receptor de la melanocortina 4 (MC4R) ha sido implicada en la regulación del peso corporal (Graham et al, Nat. Genetics 1997; 17: 273-4). El MC4R se expresa en el cerebro, incluyendo el hipotálamo, lo cual tiene influencias sobre el consume de alimentos. Numerosas mutaciones que afectan la actividad del MC4R han sido encontradas y muchas asocian con la obesidad incluyendo la obesidad de aparición temprana (niñez) (Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:22939-45; Branson et al., New Eng. J. Med. 2003, 348:1096- 1103; Gu et al., Diabetes 1999, 48:635-39; Farooqi et al., New Eng. J. Med 2003, 348:1085-95; Tao et al., Endocrinology 2003, 144:4544-51).

Tratamientos Actuales Los fármacos antiobesidad actuales tienen eficacia limitada y numerosos efectos secundarios (Crowley, V. E., Yeo, G. S. & O'Rahilly, S., Nat. Rev. Drug Discov. 2002; 1, 276-86) . Con la obesidad alcanzando proporciones epidémicas en todo el mundo, existe una necesidad apremiante de desarrollar agentes terapéuticos adecuados en esta área. En años recientes, las hormonas y neuropéptidos implicados en la regulación del apetito, energía corporal y acumulación de masa grasa han emergido como fármacos antiobesidad potenciales (McMinn, J. E., Baskin, D. G. & Schwartz, M. W. , Obes Rev 2000; 1:37-46; Drazen, D. L. & Woods, S. C, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003; 6:621-629). En el presente, sin embargo, esos péptidos requieren administración parenteral . El prospecto de inyecciones diarias para controlar la obesidad durante periodos prolongados de tiempo (puesto que la obesidad es una condición crónica) no es muy alentador y limita el uso de esos fármacos.

Las Chaperonas Moleculares Estabilizan el Pliegue Apropiado de la Proteina Las proteínas son sintetizadas en el citoplasma, y las proteínas recién sintetizadas son secretadas hacia la luz del retículo endoplásmico (ER) en un estado altamente desplegado. En general, el pliegue de la proteína es gobernado por el principio de alto montaje. Los polipéptidos recién sintetizados se doblan en su conformación nativa sobre la base de sus secuencias de aminoácidos (Anfinsen et al., Adv. Protein Chem. 1975; 29:205- 300). In vivo, el pliegue de la proteína es complicado, debido a la combinación de la temperatura ambiente y una alta concentración de proteína estimula el proceso de agregación, en el cual, los aminoácidos normalmente se ocultan en el núcleo hidrofóbica interactuando con sus vecinos de manera no específico. Para evitar este problema, el pliegue de la proteína es facilitado usualmente por un grupo especial de proteínas llamadas chaperonas, las cuales evitan que las cadenas polipeptídicas nacientes se agreguen uniéndose a proteínas desplegadas de modo que la proteína se repliegue a la conformación nativa (Hartl, Nature 1996; 381:571-580). Las chaperonas moleculares endógenas están presentes virtualmente en todos los tipos de células y en la mayoría de los compartimientos celulares. Algunas están implicadas en el trasporte de proteínas y permiten que las células sobrevivan bajo tensión como choque térmico y aglutamiento de glucosa (Gething et al., Nature 1992; 355:33-45; Caplan, Trends Cell. Biol. 1999; 9:262-268; Lin et al., Mol. Biol. Cell. 1993; 4:109-1119; Bergeron et al., Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128). Entre las chaperonas endógenas, la BiP (proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina, Grp78) es la chaperona mejor caracterizada del ER (Haas, Curr. Top. Microbiol. Immunol . 1991; 167:71-82) . Al igual que otras chaperonas, la BiP interactúa con muchas proteínas secretoras y la membrana dentro del ER a través de su maduración. Cuando el pliegue de la proteína naciente procede uniformemente, esta interacción es normalmente débil y de corta vida. Una vez que se alcanza la conformación de la proteína nativa, la chaperona molecular ya no interactúa con la proteína. La unión de BiP a una proteína que falla en doblarse, montarse, o ser glicosilada apropiadamente se vuelve estable, y usualmente conduce a la degradación de la proteína a través de la vía de degradación asociada con el ER. Este proceso sirve como un sistema de "control de calidad" en el ER, que asegura que únicamente aquellas proteínas dobladas y montadas apropiadamente sean transportadas fuera del ER para su maduración adicional, y las proteínas dobladas de manera inapropiada sean retenidas para su degradación posterior (Hurtley et al., Annu. Rev.

Cell. Biol. 1989; 5:277-307). Debido a las acciones combinadas de la ineficiencia del proceso termodinámico de pliegue de la proteína y el sistema de control de calidad del ER, únicamente una fracción de las proteínas nacientes (no mutantes) se dobla en una conformación funcional y sal exitosamente del ER.

Chaperones Farmacológicos Derivadas de Inhibidores de Enzimas Especificas Rescate de Enzimas Mutantes y Enzimas Naturales Mejoradas Se ha demostrado previamente que los inhibidores de molécula pequeña de enzimas asociadas con trastornos de almacenamiento lisosomal (LSD) pueden rescatar el doblez y actividad de la enzima mutante, y mejorar el doblez y actividad de la enzima natural (véanse las Patentes Estadounidenses Nos. 6,274,597; 6,583,158; 6,589,964; 6,599,919; y 6,916,829, todas incorporadas aquí como referencia) . En particular, se describió que la administración de derivados de molécula pequeña de glucosa y galactosa, los cuales fueron inhibidores competitivos específicas de enzimas mutantes asociadas con LSD, se incrementaron in vi tro y in vivo la estabilidad de las enzimas mutantes y mejoraron la actividad de la enzima mutante. La teoría original detrás de ésta estrategia es la siguiente: Puesto que la proteína de enzima mutante se doble inapropiadamente en el ER (Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), la proteína enzimática es retardada en la vía de transporte normal (ER -» aparato de Golgi ? endosoma —» lisosoma) y se degrada rápidamente. Por lo tanto, un compuesto que estabiliza el pliegue correcto de una proteína mutante servirá como una chaperona específica del sitio activa para que la proteína mutante promueva su escape uniforme del sistema de control de calidad del ER. Los inhibidores enzimáticos ocupan el centro catalítico, dando como resultad la estabilización de la conformación de la enzima en células en cultivo y en animales. Esas chaperonas específicas fueron designadas como "chaperonas específicas del sitio activo (ASSC) " puesto que se unen al sitio activo de la enzima. Además de reclutar las enzimas mutantes, las ASSC mejoran la secreción del ER y la actividad de las enzimas naturales recombinantes. Una ASSC facilita el pliegue de la enzima natural sobreexpresada, el cual en otras circunstancias es retardado en el sistema de control de calidad del ER debido a que la sobreexpresión y sobreproducción de la enzima excede la capacidad del ER y conduce a la agregación y desagregación de la proteína. De este modo, un compuesto que incluye una conformación molecular estable de una enzima durante el pliegue sirve como una "chaperona" para estabilizar la enzima en una conformación apropiada para salir del ER. Como se hizo notar anteriormente, para enzimas, numerosos compuestos se tornó inesperadamente en un inhibidor competitivo de la enzima.

Mejora de Otras Proteinas con Chaperonas Además de las LSD, un número grande y diverso de enfermedades son ahora reconocidas como "enfermedades conformacionales" que son causadas por la adopción de conformaciones de proteínas no nativas, las cuales pueden conducir al retardo de la proteína en el ER y finalmente la degradación de las proteínas (Kuznetsov et al., N. Engl. J. Med. 1998; 339:1688-1695; Thomas et al., Trends Biochem. Set 1995; 20:456-459; Bychkova et al., FEBS Lett. 1995; 359:6-8; Brooks, FEBS Lett. 1997; 409:115-120). Por ejemplo, se encontró que los compuestos sintéticos pequeños estabilizan el dominio de unión del /ADN de formas mutantes de proteína supresora de tumor p53, permitiendo por lo tanto que la proteína mantenga una conformación activa (Foster et al., Science 1999; 286:2507-10) . La síntesis de receptores ha mostrado ser rescatada por antagonistas y ligados de receptores de molécula pequeña (Morello et al., J Clin. Invest. 2000; 105: 887-95; Petaja-Repo et al., EMBO J. 2002; 21:1628-37). Aún el rescate farmacológico de proteínas del canal de la membrana y otros transportadores de la membrana plasmática ha sido demostrado usando fármacos o sustratos bloqueadores de canales (Rajamani et al., Circulation 2002; 105:2830-5; Zhou et al., J Biol. Chem. 1999; 274:31123-26; Loo et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 709-12; Pedemonte et al., J. Clin. Inves . 2005; 115: 2564-71) . Sigue existiendo en la técnica una necesidad particular de resolver deficiencias en la función de la proteína MC4R que estén relacionadas o no relacionadas con la mutación del MC4R.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Como se describe aquí, la presente invención proporciona un método para mejorar la actividad del receptor de melanocortina-4 (MC4R) , por ejemplo, para el tratamiento de la obesidad, en sujetos que tienen una mutación del pliegue en el gen que codifica para MC4R, o en sujetos en los cuales un incremento de la actividad del MC4R nativo sería benéfica. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar el pliegue intracelular de un polipéptido de MC4R en una conformación funcional poniendo en contacto una célula que expresa MC4R con una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica. Mejorar el pliegue intracelular del MC4R, da como resultado una mejor expresión sobre la superficie celular de, por ejemplo, las neuronas del hipotálamo, reduce el impulso por comer, y por lo tanto, es útil en el tratamiento de trastornos de sobrealimentación, como el vicio de comer. En una modalidad, el polipéptido MC4R es un polipéptido MC4R natural, el cual, por ejemplo, tiene una secuencia como la descrita en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO : 8. En otra modalidad, el polipéptido MC4R es un polipéptido MC4R mutante. En esta modalidad, el polipéptido mutante contiene una o más mutaciones que dan como resultado un pliegue intracelular reducido o inapropiado del polipéptido MC4R. Las mutaciones ejemplares son las siguientes: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, y inserción de TGAT en el codon 244. En una modalidad, la chaperona farmacológica es un antagonista de MC4R. En otra modalidad, la chaperona farmacológica es agonista de MC4R. En otras modalidades, la chaperona farmacológica es un agonista parcial y/o agonista inverso de MC4R La presente invención también proporciona un método para mejorar la expresión en la superficie celular de un polipéptido de MC4R. Este método comprende poner en contacto una célula que expresa MC4R con una cantidad efectiva de una chaperona farmacológica. Esta modalidad de la invención pertenece a polipéptidos de MC4R naturales y polipéptidos de. MC4R mutantes, y las chaperonas farmacológicas expuestas anteriormente, para métodos para mejorar el pliegue intracelular de polipéptidos de MC4R. La presente invención también proporciona un método de selección para identificar una chaperona para un polipéptido de MC4R por contacto con un compuesto de prueba a una mezcla de reacción que comprende una célula que expresa un polipéptido de MC4R; detectar la estabilidad, actividad y/o ubicación en la superficie celular del polipéptido de MC4R en la mezcla de reacción en presencia del compuesto de prueba; y comparar la estabilidad, actividad y/o localización en la superficie celular del polipéptido de MC4R en presencia del compuesto de prueba con la estabilidad, actividad y/o localización en la superficie celular del polipéptido de MC4R en ausencia del compuesto de prueba, donde la detección del incremento de la estabilidad, actividad y/o localización en la superficie celular en presencia del compuesto de prueba con relación a la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es una chaperona para el polipéptido de MC4R. En una modalidad de este método de selección, el polipéptido de MC4R comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y 8.

En otra modalidad de este método de selección, el polipéptido de MC4R comprende una mutación asociada con el pliegue erróneo del polipéptido MC4R. En modalidades específicas, la mutación de pliegue errónea es una o más de las siguientes alteraciones: P78L, R165Q o R165W, I125K, C271Y, TI ÍA, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, o inserción de TGAT en el codon 244. En una modalidad, la mezcla de reacción se basa en células. En otra modalidad, la mezcla de reacción está libre de células. En una modalidad, el método de selección, incluye además detectar la actividad de un polipéptido de MC4R, por ejemplo, sobre la superficie celular. En otra modalidad, la actividad es medida a través de la activación de la AMPc. La presente invención será comprendida mejor con referencia a la descripción detallada y los ejemplos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS FIGURAS FIG. 1. Un agonista de los receptores de melanocortina-4 de rata y humano, de acuerdo a lo reportado por Sebhat, 2002, J Med Chem , 45, 4589-4593 (compuesto 1). FIG. 2. Un antagonista del MC4R humano, de acuerdo a lo reportado por Richardson, 2004, J Med Chem 47, 744-755 (compuesto 2) . FIG. 3. Esquema sintético para el compuesto 1. FIG. 4. Esquema sintético para el compuesto 2. FIG. 5. Un antagonista de MC4R, de acuerdo a lo reportado por Arasasingham, 2003, J Med Chem 46, 9-11 (compuesto 3) . FIG. 6. Un antagonista de MC4R (compuesto 4); la actividad biológica de este compuesto es reportada en la WO 02/062766 usando un ensayo de proximidad de destellos. FIG. 7. Esquema sintético para el compuesto 3. FIG. 8. Esquema sintético para el compuesto 4. FIG. 9. Un compuesto de bisaminotiazol descrito en Pedemonte et al., J. Clin . Inves . 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5) . FIGS. 10A-10D. Compuestos 6-25 descritos infra . FIG 11. Ensayo de señalización de MC4R en mutantes de MC4R tratados con agonistas de ligando y con y sin chaperonas antagonistas . FIG. 12. Actividad media de la a-galactosidasa A en células sanguíneas blancas de voluntarios normales, sanos que recibieron 50 mg de 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) b.i.d. (triángulos), 150 mg DGJ b.i.d. (cuadrados), o placebo (círculos abiertos) . Los valores se normalizaron a los valores de predosis de cada grupo (n=6 para los grupos tratados, n=4 para el grupo con placebo) FIG. 13. Estructura de la clase de compuesto basada en los compuestos 1, 2, 6, 1 , y 12-17.

FIG. 14. Estructura de la clase de compuesto basada en los compuestos 3, 9, 10, 11, y 21. donde X y Y son respectiva e independientemente H, F, Cl, Br, I o Donde R1 es un compuesto he FIG. 15. Estructura de la clase de compuesto basada en los compuestos 4, 8, 24, y 25. donde X es F, Cl, Br o I; en modalidades particulares X es F en la posición para. R-l es alquilo, alquinilo, alquenilo, alcoxi, hetero alquilo, etc; en modalidades particulares el grupo — Ro a,clu'10 tiene c?_6 > de manera mas preferible |_3 * R2 es arilo, heteroarilo o arilcarbonilalquilo sustituido o no sustituido; n es 1-4.

FIG. 16. Estructura de la clase de compuesto basada en los compuestos 18-20.

Donde R-| es alquilo con j_3¡ R2 es -S- o H; lo teniendo C| .5 anidinalquilo con el emente |_3 ; R5 es un arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido; y Rg es H, CH3 o alquilo de C-1.3 ; R7 es H o -S- R8 es H, CH3, o alquilo de C?3 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el descubrimiento de que las moléculas pequeñas pueden ser identificadas para rescatar el pliegue y procesamiento de proteínas de polipéptidos de MC4R mutantes y naturales y mejorar ,1a estabilidad de la proteína sobre la superficie celular de neuronas, lo cual a su vez, hace disminuir el hambre y sobrealimentación. Las chaperonas farmacológicas se unen específicamente a la proteína MC4R e inducen o estabilizan una conformación funcional del MC4R mutante o natural. La invención permite por lo tanto el rescate específico del MC4R mutante, así como una mejor expresión del MC4R natural en la superficie celular. En consecuencia las chaperonas farmacológicas para MC4R pueden ser usadas para el tratamiento de trastornos donde el rescate de o el incremento de la estabilidad o actividad de MC4R es deseable, por ejemplo, la condición de tener sobrepeso u obesidad. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administración de una chaperona farmacológica a un humano da como resultado un incremento significativo en el nivel de actividad de una proteína natural. Este descubrimiento, combinado con una comprensión de la capacidad de una chaperona farmacológica para promover el pliegue apropiado de la proteína en el ER, conduce al tráfico correcto de la proteína y un incremento significativo en la actividad de la proteína, proporciona de manera ventajosa la capacidad de lograr una actividad de proteína suficiente para revertir o aliviar una enfermedad, trastorno, o condición, particularmente en el sujeto humano. Este fenómeno es altamente específico para la proteína unida específica por la chaperona farmacológica particular, en contraste con métodos que usen compuestos que operan generalmente para incrementar la expresión de todas las proteínas, llamadas "chaperonas químicas". Ciertos resultados experimentales subyacen a la presente invención: las chaperonas farmacológicas incrementan la actividad de proteína natural endógena en humanos hasta aproximadamente 120% de lo normal, 130% de lo normal, y 145% de lo normal a una dosis más baja, y hasta 150% y 185% de los normal a una dosis más alta después de la administración de una chaperona farmacológica (véase el Ejemplo 7 y la Figura 12) . Este nivel de incremento in vivo no fue predecible de los resultados con células en cultivo tisular que permanecieron expuestas a la chaperona farmacológica. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,274,597 describe un incremento del 30% de la actividad de la a-galactosidasa A (a-Gal A) en linfoblastos normales cultivados in vi tro con desoxigalactonoj irimicina (DGJ), una chaperona farmacológica.

Dada la expectativa de que se esperaría que los procesos de eliminación fisiológica redujeran los efectos de las chaperonas farmacológicas sobre proteínas normales in vivo, no se esperaba que una chaperona farmacológica produjera un incremento significativo en la actividad de la proteína natural. El ejemplo 10 de la Patente Estadounidense No. 6,274,597 describe un incremento en la actividad de una enzima mutante en ratones transgénicos tratados durante una semana con una chaperona farmacológica. Sin embargo, esos experimentos implican formas mutantes de la proteína rescatada, no naturales, y se condujeron a ratones, de modo que los resultados no fueron predictivos o sugerentes de los resultados observados para proteína natural en humanos . No existían bases para esperar que una chaperona farmacológica pudiera incrementar el nivel de actividad de una proteína natural in vivo en al menos 20-25%, es decir, al menos 1.2 veces o 120% de lo normal, o en 30% (1.3 veces, 130% de lo normal), 40% (1.4 veces, 140% de lo normal), y particularmente no en al menos 50% (1.5 veces, 150% de lo normal) . Aún, como se ejemplifica aquí, la administración de DGJ a sujetos dio como resultado un incremento dependiente de la dosis en a-Gal A. Este efecto extraordinario resulta de la titulación de la chaperona farmacológica, la cual ya se demostró de acuerdo con la tecnología existente rescata una forma mutante de la proteína, para lograr el incremento descrito en la actividad o la proteína natural. En consecuencia, la invención proporciona la titulación de una dosis de chaperona farmacológica que se ha encontrado rescata la actividad de una proteína mutante para incrementar el nivel de actividad de una proteína natural en una cantidad definida.

Definiciones Los términos usados en esta especificación generalmente tienen sus significados comunes en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde cada término sea usado. Ciertos términos se discuten más adelante, o en otro lugar de la especificación, para proporcionar una guía adicional al practicante para describir las composiciones y métodos de la invención y como hacer y usar los mismos . Como se usa aquí, el término "chaperona farmacológica" , o algunas veces "chaperona farmacológica específica" ("SPC"), se refieren una molécula que se une específicamente al MC4R y tiene uno o más de los siguientes efectos: (i) mejorar la formación de una conformación molecular estable de la proteína; (ii) mejora el tráfico apropiado de la proteína de ER a otro sitio celular, preferiblemente un sitio celular nativo, es decir, que evita la degradación asociada con el ER de la proteína; (iii) previene la agregación de conformacionalidad inestable, es decir, proteínas más plegadas; (iv) restaura o mejora al menos parcialmente la tensión, estabilidad y/o actividad natural de la proteína; y/o (v) mejora del fenotipo o función de la célula que alberga al MC4R. De este modo, una chaperona farmacológica para el MC4R es una molécula que se une al MC4R, dando como resultado el pliegue, tráfico, no agregación y actividad del MC4R. Como se usa aquí, en este término no se refiere a chaperonas endógenas, como la BiP, o a agentes no específicos que han demostrado actividad de chaperona no específica contra varias proteínas, como el glicerol, DMSO o agua deuterada, es decir, chaperonas químicas (véase Welch et al, Cell Stress and Chaperones 1996; 1(2): 109- 115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5) : 491-502; Patente Estadounidense No. 5,900,360; Patente Estadounidense No. 6,270,954; y Patente Estadounidense No. 6,541,195) . Incluye moléculas de unión específicas, por ejemplo chaperonas farmacológicas específicas (discutidas anteriormente) inhibidores o antagonistas y agonistas. Como se usa aquí, el término "se une específicamente" se refiere a la interacción de una chaperona farmacológica con MC4R, específicamente, una interacción con aminoácidos residuales de MC4R que participan directamente en contacto con la chaperona farmacológica. Una chaperona farmacológica se une específicamente a una proteína blanco, aquí MC4R, para ejercer un efecto de chaperona sobre el MC4R, y no sobre un grupo genérico de proteínas relacionadas o no relacionadas . Los aminoácidos residuales del MC4R que interactúan con cualquier chaperona farmacológica de MC4R pueden o no estar dentro del dominio de unión del ligando del MC4R, es decir, el dominio que une el ligando natural MSH, o cualquier otro "sitio activo" del MC4R, por ejemplo, el dominio de unión de proteína G. La unión específica puede ser evaluada a través de ensayos de unión de rutina o a través de estudios estructurales, por ejemplo, cocristalización, RMN y similares. Los ejemplos de aminoácidos en el dominio de unión del ligando de MSH del MC4R incluye pero no se limitan a Phe284 y Tyr268 (usando, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 como una secuencia de referencia) . En una modalidad no limitante, la chaperona farmacológica es un inhibidor o antagonista de MC4R. En otra modalidad no limitante, la chaperona farmacológica es un agonista de MC4R. En otra modalidad más, la chaperona farmacológica es un agonista/antagonista mezclado. Como se usa aquí, el término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que se une a una proteína y bloquea, inhibe, reduce o neutraliza parcial o completamente una actividad de MC4R. El término "agonista" se refiere a cualquier molécula que se une a una proteína e incrementa, mejor, reestablece o imita al menos parcialmente una actividad de MC4R. Como se discute más adelante, esas moléculas son conocidas como MC4R. Como se usan aquí, los términos "que mejora la estabilidad conformacional de MC4R" o "incrementa la estabilidad conformacional de MC4R" se refiere al incremento en la cantidad o proporción de MC4R que adopta una conformación funcional en una célula en contacto con una chaperona farmacológica específica para MC4R, con relación al MC4R en una célula (preferiblemente del mismo tipo celular o la misma célula, por ejemplo, a un tiempo inicial) sin contacto con la chaperona farmacológica específica para MC4R. En otra modalidad, las células no expresan un MC4R mutante de conformación. En otra modalidad, las células expresan un polinucleótido de MC4R que codifica para un polipéptido, por ejemplo un MC4R mutante conformacional. Como se usa aquí, los términos "mejora del tráfico del MC4R" o "incrementa el tráfico de MC4R" se refieren al incremento de la eficiencia de transporte de MC4R hacia la membrana plasmática y una célula en contacto con una chaperona farmacológica específica para MC4R, con relación a la eficacia del transporte de MC4R en una célula (preferiblemente del mismo tipo celular o la misma célula, por ejemplo, un tiempo inicial) sin contacto con la chaperona farmacológica específica para MC4R. Como se usa aquí, los términos "mejora la actividad de MC4R" o "incrementa la actividad de MC4R se refiere a la actividad de MC4R, como se describe aquí, en una célula en contacto con una chaperona farmacológica específica para MC4R, con relación a la actividad de MC4R en una célula (preferiblemente del mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, un tiempo inicial) sin contacto con la chaperona farmacológica específica para MC4R. Como se usan aquí, los términos "mejora el nivel de MC4R" "incrementa el nivel de MC4R" se requiere en el incremento del nivel de MC4R en una célula en contacto con una chaperona farmacológica específica para MC4R, con relación al nivel de MC4R en una célula (preferiblemente del mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, al un tiempo inicial) sin contacto con la chaperona farmacológica específica para el MC4R. El término "estabiliza la conformación apropiada" se refiere a la capacidad de una chaperona farmacológica de MC4R para inducir o estabilizar una conformación de una proteína MC4R mutante que es funcionalmente idéntica a la conformación de la proteína MC4R natural. El término "funcionalmente idéntica" significa que aunque pueden existir variaciones menores en la conformación (casi todas las proteínas exhiben alguna flexibilidad conformacional en su estado fisiológico) la flexibilidad conformación no da como resultado (1) la agregación de la proteína, (2) eliminación a través de la vía de degradación asociada con el retículo endoplásmico, (3) deterioro de la función de la proteína, por ejemplo, la capacidad para unirse al ligando y/o activarla actividad de la adenilil ciclasa y/o (4) el transporte inapropiado dentro de la célula, por ejemplo, la localización en la membrana plasmática, en mayor o menor grado que la proteína natural. El término "conformación molecular estable" se refiere a una conformación de una proteína, es decir, MC4R, inducida por una chaperona farmacológica, inducida al menos una función natural parcial en la célula. Por ejemplo, una conformación molecular estable de un MC4R mutante sería una donde el MC4R escape del ER y transmite hacia la membrana celular como un MC4R, en lugar de plegarse de manera errónea y ser degradado. Además, una conformación molecular estable de un MC4R mutante también puede poseer la actividad total o parcial del MC4R, por ejemplo, actividad activadora de la adenilil ciclasa para la generación de AMPc mejorado vía su proteína G fisiológica cognada. Sin embargo, no es necesario que la conformación molecular estable tenga todos los atributos funcionales de la proteína natural. El término "actividad de MC4R" se refiere a la función fisiológica normal de un MC4R natural en una célula. Por ejemplo, tras la unión por un agonista, el MC4R señala vía la interacción con una proteína G, Gas, y activación de la adenilato ciclase (véase, por ejemplo VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40). Esto da como resultado la acumulación intracelular de AMPc y la activación de proteína cinasa A (PKA) . Esa funcionalidad puede ser probada por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, ensayos de unión del ligando a-, ß-, o ?-MSH, o el agonista 125i- [Nle4, D-Phe7] a-MSH para MC4R, o usando ensayos de activación de adenilil ciclase, o ensayos del gen reportero de luciferasa, pueden ser usados para determinar incrementos en el AMPc intracelular. También se conocen en la técnica los ensayos de acumulación de 7?MP cíclico (por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 18: 15935-40). "MC4R" se refiere a un polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica que tiene la secuencia como se describe en cualquiera de: SEQ ID NO: 1 (humana; Acceso del GenBank No. BC069172) ; 3 (humana; Acceso del GenBank No.

NM_005912) ,- 5 (rata; Acceso del GenBank No. NM_013099) ; o 7 (murina; Acceso del GenBank No. NM_016977) . Un "polipéptido de MC4R" también se refiere a una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NOs: 2 (humana; Acceso del GenBank No. 7?AIO1803) ; 4 (humana; Acceso del GenBank No. NM_005912) ; 6 (rata; Acceso del GenBank No.

NM_013099) ; o 8 (murina; Acceso del GenBank No. AF201662) , y cualesquier otras secuencias de aminoácidos que codifiquen para un polipéptido de MC4R que tenga la misma función y afinidad y mol de ligando que cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ó 8. El término "MC4R natural" se refiere a las secuencias nucleotídicas (SEQ ID NOs : 1, 3, 5 y 7) que codifican para MC4R, y las secuencias polipeptídicas (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, y 8) codificadas por las secuencias nucleotídicas mencionadas anteriormente (MC4R humana- Acceso del GenBank AAIO1803; MC4R humana- Acceso del GenBank No.

NM_005912; MC4R de rata - Acceso del GenBank No. NM_013099; y MC4R de ratón - Acceso del GenBank AF201662) , y cualesquier otras secuencias nucleotídicas que codifiquen para un polipéptido de MC4R (que tenga las mismas propiedades funcionales y afinidades de unión de las secuencias polipeptídicas mencionadas anteriormente) , como variantes alélicas en individuos normales, que tengan la capacidad de lograr una conformación funcional en el ER, lograr una ubicación apropiada dentro de la célula, y exhibir actividad natural (por ejemplo, estimulación de MC4R de acumulación de AMPc) . Como se usa aquí el término "MC4R mutante" se refiere a un polipéptido de MC4R que es traducido de un gen que tiene una mutación genética que da como resultado una secuencia de aminoácidos de MC4R alterada. En una modalidad, la mutación da como resultado una proteína que no alcanza una conformación nativa bajo las condiciones normalmente presentes en el ER, cuando se comparada con el MC4R natural, o exhibe menor estabilidad o actividad en comparación con el MC4R natural. Este tipo de mutación se conoce aquí como "mutación conformacional" , y la proteína que tiene esa mutación es referida como "mutante conformacional" . La falla para lograr esta conformación da como resultado que la proteína MC4R sea degradada o agregada, más que ser transportada a través de una guía normal en el sistema de transporte de proteínas hacia su ubicación nativa en al célula o hacia el ambiente extracelular. En algunas modalidades, una mutación puede ocurrir en una parte no codificadora del gen que codifica para MC4R lo que da como resultado una expresión menos eficiente de la proteína, por ejemplo, una mutación que afecta la eficiencia de la transcripción, eficiencia de empalme, estabilidad del ARNm, y similares. Mejorando el nivel de expresión de las variantes naturales así como mutantes conformacionales del MC4R, la administración de un chaperona farmacológica para MC4R puede aliviar el déficit resultante de esa expresión de proteína insuficiente. Las mutaciones ejemplares (usando el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen P78L, R165Q, y R165W. Otros mutantes de MC4R incluyen 1125K5 C271Y, T11A, A175T, 1316L3 I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, e inserción de TGAT en el codon 244. Además, otras mutaciones de MC4R (nuevamente usando la SEQ ID NO: 2 como referencia) incluyen aquellas descritas en la Tabla 1, infra . Ciertas pruebas pueden evaluar los atributos de una proteína que puede o no corresponder a su actividad in vivo real, pero no obstante que son sustituías apropiadas de la funcionalidad de la proteína, y el comportamiento natural en esas pruebas demuestra evidencias que apoyan las técnicas de rescate o mejora del pliegue de la proteína de la invención.

Una de esas actividades de acuerdo con la invención es el transporte apropiado de un MC4R funcional del retículo endoplásmico a la membrana celular. Los términos "expresión endógena" y "expresado de manera endógena" se refieren a la expresión fisiológica normal del MC4R en células en un individuo que no tenga o se sospeche que tenga una enfermedad o trastorno asociado con la deficiencia de MC4R, sobreexpresión de un mutante negativo dominante, u otro defecto, por ejemplo, la obesidad, como una mutación en la secuencia del ácido nucleico o polipéptido del MC4R que altere, por ejemplo, inhiba su expresión, actividad o estabilidad. Este término también se refiere a la expresión del MC4R en células o tipos de células en los cuales normalmente se expresan individuos sanos, y no incluyen la expresión del MC4R en células o tipos de células, por ejemplo, células tumorales, por ejemplo en las cuales el MC4R no es expresado en individuos sanos. Como se usa aquí, el término "eficiencia de transporte" se refiere a la capacidad de una proteína mutante para ser transportada fuera del retículo endoplásmico a su ubicación activa dentro de la célula, membrana celular o hacia el ambiente extracelular. Los términos "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" se refieren a una cantidad suficiente parta mejorar el procesamiento de la proteína en el ER (permitiendo una conformación funcional) , sin inhibir la proteína ya expresada en la ubicación celular apropiada (en el caso de un antagonista) o sin inducir una internalización del receptor mediada por el ligando de la proteína de la ubicación celular apropiada (en el caso de un agonista) y mejor actividad de la proteína blanco, dando como resultado de este modo una respuesta terapéutica en un sujeto. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un clínico) reconocerá como una respuesta efectiva a la terapia, incluyendo los síntomas anteriores y marcadores clínicos sustitutos. De este modo, una respuesta terapéutica será generalmente un alivio o inhibición de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, la obesidad o el vicio de comer. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son tolerables fisiológicamente y típicamente no producen reacciones adversas cuando se administran a un humano. Preferiblemente, como se usa aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas para usarse en animales, y de manera más particular en humanos. El término "soporte" se refiere a un diluente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual el compuesto se administrado. Esos soportes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites. El agua o las soluciones salinas acuosas y la dextrosa acuosa y las soluciones de glicerol son empleadas preferiblemente como soportes, particularmente para soluciones inyectables . Los soportes farmacéuticos adecuados son descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18va Edición, u otras ediciones. Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" generalmente significaran un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Típicamente, los grados ejemplares de error están dentro del 20 por ciento (%) , preferiblemente dentro del 10%, y de manera más preferible dentro 5% de un valor o intervalo dado de valores . De manera alternativa y particularmente en sistemas biológicos, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que estén dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces y de manera más preferible dentro de dos veces un valor dado. Las cantidades numéricas dadas aquí son aproximadamente a menos que se establezca otra cosa, significando que el término "alrededor de" o "aproximadamente" puede ser inferidos cuando no sean establecidos de manera expresa. Como se usa aquí, el término "aislado" significa que el material referido es removido del ambiente en el cual se encuentra normalmente. De este modo, un material biológico aislado puede estar libre de componentes celulares, es decir componentes de las células en el cual el material se encuentra o es producido. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto de PCR, una banda de ARNm o un gel, un ADNc, o un fragmento de restricción. En otra modalidad, un ácido nucleico aislado es escindido preferiblemente del cromosoma en el cual pueda encontrarse, y de manera más preferible no está ya unido a regiones no reguladoras, no codificadoras, o a otros genes, localizados corriente abajo (en dirección 5') del gen contenido por la molécula de ácido nucleico aislada cuando se encuentre el cromosoma. En otra modalidad más, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Los ácidos nucleicos aislados incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. De este modo, en una modalidad específica, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede ser asociada con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambos, con los cuales se asocia en una célula, o con membranas celulares si esta es una proteína asociada con una membrana. Un organelo, célula o tejido aislado es removido del sitio anatómica en el cual se encuentra en un orgánico. Un material aislado puede ser, pero no necesita ser purificado.

El término "purificado" como se usa aquí se refiere a material, como un ácido nucleico o polipéptido de MC4R, que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan materiales no relacionados, es decir, contaminantes. Por ejemplo, una proteína purificada está manera preferible, sustancialmente libre de otras proteínas o ácidos nucleicos con los cuales esté asociado en una célula. Como se usa aquí, el término "sustancialmente libre" se usa operativamente, el contexto de la prueba analítica del material. Preferiblemente, el material purificado es sustancialmente libre de contaminantes y está al menos 50% puro; de manera más preferible, al menos 90% puro, y de manera más preferible aún al menos 99% puro. La pureza puede ser evaluada por medios convencionales, por ejemplo, cromatografía, electroforésis sobre gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros métodos conocidos en la técnica. El término "Me" significa metilo, "Et" significa etilo y "Ac" significa acetilo. El término "halo", a menos que se indique otra cosa significa flúor, cloro, bromo o yodo. Los grupos halo preferidos son flúor, cloro y bromo. El término "alquilo", a menos que se indique otra cosa, incluye radicales hidrocarbúricos monovalentes saturados que tienen porciones lineales, ramificadas o cíclicas (incluyendo porciones bicíclicas y espirocíclicas fusionadas o unidas por un paciente) , o una combinación de las porciones anteriores . Para que un grupo alquilo tenga porciones cíclicas, el grupo debe tener al menos 3 átomos de carbono . El término "cicloalquilo" , a menos que se indique otra cosa, incluye porciones de alquilo cíclicas donde el alquilo es como se definió anteriormente. El uso del término "cicloalquilo" no deberá constituirse en limitante del término "alquilo" a porciones no cíclicas. El término "alquenilo" , a menos que se indique otra cosa, incluye porciones alquilo que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono, donde el alquilo es como se definió anteriormente e incluyendo los isómeros E y Z de la porción de alquenilo. El término "alquinilo" , a menos que se indique otra cosa, incluye porciones de alquilo que tienen al menos un enlace triple carbono-carbono, donde el alquilo es como se definió anteriormente. El término "alcoxi", a menos que se indique otra cosa, incluye grupos O-alquilo donde el alquilo es como se definió anteriormente. El término arilo, a menos que se indique otra cosa, incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático por la remoción de un hidrógeno, como el fenilo o naftilo.

El término "heterocíclico de 4 a 10 miembros" , a menos que se indique otra cosa, incluye grupos heterocíclicos aromáticos y no aromáticos que contienen de 1 a 4 heteroátomos, cada uno seleccionado de O, S y N, donde el grupo heterocíclico tiene de 4 a 10 átomos en su sistema anular, y con la condición de que el anillo del grupo no contenga dos átomos de O o S adyacentes . Los grupos heterocíclicos no aromáticos incluyen grupos que tienen únicamente 4 átomos en su sistema anular, pero los grupos heterocíclicos aromáticos deben tener al menos 5 átomos en su sistema anular. Los grupos heterocíclicos incluyen sistemas anulares fusionados por benzo. Un ejemplo de un grupo heterocíclico de 4 miembros es el acetidinilo (derivado de la acetidina) . Un ejemplo de un grupo heterocíclico de 5 miembros es el tiazolilo y un ejemplo de un grupo heterocíclico de 10 miembros es el quinolinilo. Los grupos heterocíclicos no aromáticos son el pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperacinilo, homopiperacinilo, acetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxacepinilo, diacepinilo, tiacepinilo, 1, 2, 3, 6-tetrahidropiridinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1, 3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo [3.1.0] hexanilo, 3-azabiciclo [4.1.0] heptanilo, azabiciclo [2.2.2] hexanilo, 3H-indolilo y quinolicinilo. Los ejemplos de grupos heterocíclicos aromáticos son el piridinilo, imidazolilo, pirimidinilo, pirazolilo, triazolilo, piracinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalacinilo, piridacinilo, triacinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzothiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, y furopiridinilo. Las porciones espiro también están incluidas dentro del alcance de esta definición, incluyendo el l-oxa-6-aza-spiro [2.5] oct-6-ilo. Los grupos anteriores, como los derivados de los grupos listados anteriormente, pueden estar unidos en C o unidos en N donde sea posible. Por ejemplo, el grupo derivado del pirrol puede ser el pirrol-1-ilo (unido en N) o pirrol-3-ilo (unido en C) . Además, un grupo derivado del imidazol puede ser el imidazol-1-ilo (unido en N) o el imidazol-3-ilo (unido en C) . La frase "sales farmacéuticamente aceptables", a menos que se indique otra cosa, incluye sales de grupos ácidos o básicos los cuales pueden estar presentes en un compuesto usado en los métodos de la invención. Los compuestos que son de naturaleza básica son capaces de formar una amplia variedad de sales con varios ácidos inorgánicos u orgánicos . Los ácidos que pueden ser usados para preparar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable de esos compuestos básicos son aquellos que forman sales de adición de ácido no tóxicas, es decir, sales que contienen yodos farmacológicamente aceptables, como el acetato, bencensulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, disliato, estolato, esilato, etilsuccinato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromohidruro, clorohidruro, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metiisulfato, mucato, napsilato, nitrato, oleato, oxalato, pamoato (embonato) , palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, tannato, tartrato, teoclato, tosilato, trietioduro, y valerato. Puesto que un solo compuesto puede incluir más de una porción cida o básica, ese compuesto puede incluir mono, di o tri-sales de un solo compuesto.

Receptor de Melanocortina 4 Los receptores de melanocortina (MC) son miembros de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G de la superfamilia transmembranal 7 que activa la generación del segundo /AMP cíclico (AMPc) mensaje. Existen cinco receptores de MC aislados hasta la fecha: MC1R, MC2R, MC3R, MC4R y MC5R. El MC2R es el receptor de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) . El MC4R humano es de 332 aminoácidos de longitud. El receptor de melanocortina 4 (MC4R) ha sido implicado en la regulación del peso corporal (Graham et al, Nat. Genetics 1991; 17: 273-4). El MC4R es expresado en el cerebro, incluyendo el hipotálamo, el cual tiene influencia sobre el consumo de alimento. La señalización vía el MC4R estimula la vía neural anorexigénica. Los ratones nulos MC4R desarrollan aparición tardía de la obesidad con hiperglicemia e hiperinsulinea. Los ratones que carecen de un alelo de MC4R (heterocigotos) tienen un peso corporal intermedio entre los ratones naturales y nulos homocigóticos. En humanos, la deficiencia de MC4R es la forma monogénica más común de la obesidad (Farooqi et al., New Engl. J. Med. 2003; 348: 1085-95) . Los ratones transgénicos que sobreexpresan un agonista de MC4R endógeno, proteína relacionada con agouti (AgRP) , exhiben incremento en la ganancia de peso, consumo de alimento y longitud corporal en comparación con camadas no transgénicas (Oilman et al., Science 1997; 278: 135-37).

Numerosas mutaciones, encontrados en su mayoría en individuos obesos, han sido identificadas en el gen MC4R humano, incluyendo mutaciones de desviación de marco, sin sentido o sentido perdido (Nijenhuis et al . , J Biol. Chem. 2003; 278: 22939-45). Al menos dos grupos de investigadores han confirmado que el MC4R se encuentra mutado en aproximadamente el 5% de los individuos obesos. Los portadores de mutaciones de MC4R demuestran hiperfagia e hiperinsulinemia, tuvieron una densidad mineral ósea superior a la promedio, y un crecimiento lineal más rápido que sujetos control apareados para IMC. Farooqi et al. también han encontrado que las propiedades de señalización de los receptores de MC4R mutante se correlaciona con la severidad de la obesidad. Varios autores ya han revisado los recientes avances de nuestra comprensión de la genética del MC4R en la obesidad de aparición temprana (véase, por ejemplo, Farooqi IS, O'Rahilly S, Int J Obes (Lond), 2005 Oct, 29(10), 1149-52; Govaerts C, Srinivasan S, Shapiro A, Zhang S, Picard F, Clement K, Lubrano-Berthelier C, Vaisse C, Peptides, 2005 Oct, 26(10), 1909-19; Tao YX, Mol Cell Endocrinol, 2005 M 15, 239(1-2), 1- 14; Farooqi IS, O'Rahilly S, Annu Rev Med, 2005, 56, 443-58) . Por ejemplo, en un paciente con obesidad severa de aparición temprana, se ha encontrado que un modo dominante o cosomal de herencia de una mutación del MC4R se debe a un efecto negativo dominante causado por dimerización del receptor (Biebermann H, Krude H, Eisner A, Chubanov V, Gudermann T, Gruters A, Diabetes, 2003 Dec, 52(12), 2984-8) . Se espera la pérdida de función del MC4R con algunas mutaciones, puesto que la mayoría de las mutaciones identificadas hasta la fecha son sustituciones de aminoácidos no conservativas. Se ha demostrado que varios MC4Rs se encuentran en individuos obesos. Además, un número de mutaciones han sido asociadas con una expresión reducida del MC4R (Gu et al., Diabetes 1999, 48: 635-39; Nijenhuis et al., supra) . Por ejemplo, en una selección de once mutaciones sin sentido de MC4R que se encontraban únicamente en individuos obesos, y que se localizaban fuera de la región N-terminal del MC4R (la cual no implicó la unión del ligando) , diez exhibieron una unión específica menor en la superficie celular al ligando de la hormona estimuladora de los a-melanocitos (a-MSH) 125I- [Nle4 , D-Phe7] a-MSH, en comparación con el MC4R natural. Nijenhuis et al., supra, a 22941. Se determinó que la disminución de la unión específica refleja una menor expresión en la superficie celular, puesto que la afinidad por el ligando entre los mutantes fue en gran medida similar a la del receptor natural, como se describe en la Tabla 1 a continuación (valores de CI50 en nM +/- S.E.) : Tabla 1 Nijenhuis et al., J. Biol. Chem. 2003; 278: 22939-22945, en 22942. Igualmente dos mutantes con mayor afinidad de unión (L250Q y T112M) demostraron menor expresión en la superficie celular de acuerdo a experimentos de unión de saturación. Además, todos los mutantes demostraron disminución de la respuesta máxima (activación del receptor de acuerdo a lo medido usando un ensayo de adenilil ciclasa) tras la unión de a-MSH. En particular, Nijenhuis et al. concluyeron resultados de datos inmunocitoquímicos que los mutantes P78L, R165Q y R165W se expresaron, pero se retuvieron intracelularmente. Un estudio adicional identificó las siguientes mutaciones MC4R: I125K; C271Y; TI1A (A434G) ; A175T; I316L; N97D; N62S; y C271R (Farooqi et al., New Eng. J. Med. 2003; 348; 1085-95). De esas mutaciones, todas exhibieron actividad reducida o ninguna actividad, in vi tro evaluada usando un ensayo del gen reportero de luciferasa sensible a AMP. Sin embargo, éste grupo encontró que tres variantes V1031; 125IL; y T112M no tiene efecto sobre la señalización del MC4R. Las mutaciones asociadas con la niñez, es decir con la aparición temprana de la obesidad fueron S58C, N62S, Y157S, C271Y, P78L, G98R que dieron como resultado una disminución (S58C, N62S, Y157S, C271Y) o ausencia de unión de ligando (P78L, G98R) , también demostraron ser funcionales en la producción de AMPc estimulada por [NIe4, D-Phe7] a-MSH- (Tao et al., Endocrinology 2003; 144 (10) : 4544-51) . Un estudio final identificó los siguientes mutantes en MC4R; 125IL (A1144C) ; F51L (T544C) ; M200V (A991G) ; T5T (C408T) (Branson et al., New Eng. J. Med. 2003; 348: 1096-1103) . Además de la obesidad, el MC4R ha sido implicado en el vicio de comer. De acuerdo al Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Text Revisión (DSM- IV-TRR, Cuarta Edición) , el vicio de comer implica episodios recurrentes de comida y una cantidad anormalmente grande de alimento y experimenta sensación de falta de control sobre el comportamiento. En un estudio de 469 sujetos obesos blancos, se encontró que son un pequeño porcentaje de los sujetos obesos fueron diagnosticados con vicio de comer, todos los sujetos obesos con mutaciones MC4R fueron diagnosticados con el vicio de comer (Branson et al., supra) .

Estructura de MC4R y Unión del Ligando Los agonistas de melanocortina endógenos contienen la secuencia His-Phe-Arg-Trp, la cual es importante para el reconocimiento molecular y estimulación molecular del receptor de melanocortina. Los determinantes moleculares de la unión del ligando de MC4R fueron determinados en un estudio empleando un arreglo grande de ligandos (Nickolls et al., Pharmacol Exp Ther 2003; 304 (3) : 1217-27) . El modelaje molecular del receptor fue usado para identificar Phe284, en el dominio transmembranal (TM) 7 (TM7) , como un sitio potencial de interacción de ligando. La mutación de Phe284 a la alanina redujo la afinidad y potencia de unión de los péptidos que contienen L-Phe hasta 71 veces, pero no afectó la unión de péptidos lineales que contienen D-Phe. Estos datos fueron consistentes con una interacción hidrofóbica entre la Phe7 de a-MSH y Phe284. En segundo lugar, se examinó el efecto de una mutación natural en TM3 (I137T) , la cual, como se describió anteriormente está ligada a la obesidad. Esta mutación disminuyó la afinidad y potencia de péptidos cíclicos, rígidos pero no péptidos más flexibles, consistente con un efecto indirecto de la mutación sobre la estructura terciaria del receptor. Los residuos que soportan selectividad del ligando para MC4R sobre el MC3R también fueron determinados. La mutación de Ilel25 (TM3) del MC4R al residuo equivalente del MC3R (fenilalanina) hizo disminuir selectivamente la afinidad y potencia de los ligandos selectivos de MC4R. Este efecto fue verificado por la mutación de MC3R recíproca F157I. La magnitud de este efecto indica que éste sitio no es de importancia mayor. Sin embargo, se propuso que una mutación de isoleucina/ fenilalanina puede afectar la orientación de Asp 122, la cual ha sido identificada como un determinante mayor de la afinidad del ligando. Otros han determinado que la Tyr268 sea requerida para la interacción selectiva con la proteína de Agouti agonista de MC4R, así como para la selectividad de otro agonista de MC4R (Oosterom et al., J Biol. Chem. 2001; 276 (2) : 931-6) . La proteína de Agouti es expresada normalmente en la piel y es el agonista natural de MC4R (Kiefer et al., Biochemistry 1997; 36: 2084-2090).

Agonistas y Antagonistas de MC4R De acuerdo a la invención, los agonistas y antagonistas de MC4R incluyen los compuestos descritos en las Figuras 1-8 y 10 aquí y descritas además en los Ejemplos 3 y 4 más adelante.

Los agonista naturales (ligandos) naturales del MC4R incluyen a-MSH, ACTH, ß-MSH, y ?-MSH (en orden de mayor a menos afinidad) . Otros ligandos de MC4R, incluyendo agonistas y antagonistas, que han sido descritos a la fecha son predominantemente péptidos (Patente Estadounidense 6,060,589) y análogos de péptidos cíclicos (Patente Estadounidense 6,613,874 de Mazur et al.). También ha sido diseñada una serie de agonistas peptídicos de MC4R (Sun et al., Bioorg Med Chem 2004; 12 (10) : 2671-7) . Además, Nijenhuis et al. (Peptides 2003; 24 (2) : 271-80) describieron el desarrollo y evaluación de compuestos antagonistas de melanocortina que fueron selectivos para el MC4R. Se encontró que un compuesto, designado como Ac-NIe-Gly-Lys-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH (2) (SEQ ID NO:9), era el compuesto más selectivo de MC4R, con una selectividad de 90 y 110 veces por el MC4R en comparación con el MC3R y el MC5R, respectivamente. Una modificación posterior produjo el compuesto Ac-Nle-Gly-Lys-D-Nal (2) -Arg-Trp-Gly-NH(2) (SEQ ID NO: 10), un antagonista de MC4R selectivo con una selectividad de 34 veces para MC4R/MC3R y de 109 veces para MC4R/MC5R. Ambos compuestos fueron activos in vivo, y cruzaron la barrera sanguíneo-cerebral . Además, las Patentes Estadounidenses Nos. 6,054,556 y 5,731,408 describen familias de agonistas y antagonistas para MC4R que son heptapéptidos de lactama que tiene una estructura cíclica.

Otros antagonistas de MC4R de alta afinidad son descritos en Grieco et al. (J Med Chem 2002; 24:5287-94). Esos antagonistas cíclicos fueron designados sobre la base de antagonistas de alta afinidad conocidos SHU9119 (Ac-Nle4- [Asp5-His6-DNal(2' ) 7-Arg8-Trp9-LyslO] -NH(2) ) (SEQ ID NO: 11). Los análogos de SHU9119 fueron modificados en la posición 6 (His) con aminoácidos no convencionales. Un compuesto que contiene una sustitución de Che en la posición 6 es un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0.48 nM) con una selectividad de 100 veces sobre el MC3R. Otro compuesto con una sustitución de Cpe en la posición 6 también fue un antagonista de MC4R de alta afinidad (CI50 = 0.51 nM) con una selectividad de 200 veces sobre el MC3R. Se usó el modelaje molecular para examinar las propiedades conformacionales de los péptidos cíclicos modificados en la posición 6 con aminoácidos restringidos conformacionalmente. Véase también, Grieco et al., Peptides 2006; 27 (2) : 472-81. Varios ligandos de MC4R no peptídicos han sido descritos en la solicitudes de patentes Estadounidenses publicadas 2003/0158209 de Dyck et al. y 2004/082590 de Briner et al. También, la Patente Estadounidense No. 6,638,927 de Renhowe et al. describe guanidobenzamidas pequeñas, de bajo peso molecular, como agonistas de MC4R específicas. Richardson et al. han descrito arilpipericinas novedosas que son agonistas de MC4R (J Med Chem 2004; 47 (3) : 744-55) . Las Patentes Estadounidenses Nos. 6,979,691 de Yu et al. y 6,699,873 de Maguire también describen compuestos no peptídicos los cuales se unen selectivamente a MC4R. La WO 99/55679 de Basu et al. describe derivados de isoquinolina, compuestos no peptídicos de molécula pequeña, los cuales muestran bajas afinidades (micromolares) por MC1R y MC4R, reducción de la inflamación dérmica inducida por ácido araquidónico, y reducciones de peso corporal y consumo de alimento. La WO 99/64002 de Nargund et al. también describe derivados de espiropiperidina como agonistas del receptor de melanocortina, útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos como la obesidad, diabetes y disfunción sexual. Han sido descritos otros antagonistas de MC4R peptídicos. De este modo, las solicitudes de patentes Estadounidenses publicadas 2003/0176425 y 2003/0162819 de Eisinger describen derivados de 1, 2, 4 -tiadiazol y 1,2,4-tiadiazolio, novedosos, respectivamente como antagonistas o agonistas de MC4R. Esas solicitudes también describen el uso de esos compuestos para tratar la obesidad. Se ha demostrado que varios antagonistas de los receptores de melanocortina son antagonistas competitivos, es decir, que compiten con la unión con un ligando. Por ejemplo, la proteína de señalización de agouti antagonista de melanocortina (ASIP) mostró tener características consistentes con el antagonismo competitivo observado en el hMCIR, y un comportamiento más complejo observado en otros receptores (Yang et al., Mol. Endocrinology 1997; 11(3): 274-280) . De manera similar, la ACTH, ligando natural para el MC2R, no puede competir con la unión por a-, ß~, o ?-MSH (Abdel-Malek et al., Cell. Mol. Life Sci. 2001; 48: 434-41. Otros compuestos de unión de MC4R son descritos en los siguientes: Bednarek and Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005;15 (18) :4023-8; WO 03/07949 (Merck); WO 03/61660 (Eli Lilly) ; WO 03/09847 (Amgen) ; WO 03/09850 (Amgen) ; WO 03/31410 (Neurocrine Biosciences) ; WO 03/94918 (Neurocrine Biosciences) ; WO 03/68738 (Neurocrine Biosciences) ; WO 03/92690 (Procter and Gamble) ; WO 03/93234 (Procter and Gamble) ; WO 03/72056 (Chiron) ,- WO 03/66597 (Chiron) ; WO 03/66587 (Chiron) ; WO 03/66587 (Chiron) ; WO 02/67869 (Merck) ; WO 02/68387 (Merck) ; WO 02/00259 (Taisho) ; WO 02/92566 (Taisho) ,- Tran et al, Bioorg Med Chem Lett. 2006 [epub ahead of print]; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005 (23) 5237-40; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005 15 (10) 2541-6; Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004 14 (22) 5605-9; Cheung et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005 15(24) 5504-8; Yan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004 15(20) 4611-4; Hsiung et al., Endocrinology. 2005 Dec 146(12): 5257-66; and Todorovic et al., Peptides. 2005 Oct 26 (10) : 2026-36. Los agonistas y antagonistas no peptídicos de MC4R específicos contemplados para usarse en los métodos reclamados por la presente son descritos en Sebhat et al., J Med Chem 2002; 45: 4589 (compuestos 1 y 6); Richardson et al., J Med Chem. 2004; 47: 744 (compuesto 2); Arasasingham et al., J Med Chem. 2003; 46: 9 (compuesto 3); WO 02/062766 de Millennium Pharmaceuticals (compuesto 4); Pedemonte et al., J. Clin. Inves. 2005; 115: 2564-71 (compuesto 5); Tran et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 3434-38 (compuesto 7) ; Xi et al., Bioorg Med Chem Lett.. 2004; 14: 377-81 (compuesto 8); Vos et al., J Med Chem. 2004; 47: 1602-04 (compuesto 9); Pan et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 11: 185 (compuesto 10); Marsilje et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004. 14: 3721 (compuesto 11); Ujjainwalla et al., Bioorg Med Chem Lett. 2003; 133: 4431 (compuesto 12); Nickolls et al., J Pharmacol Exp Therap. 2005; 313: 1281-1288 (compuestos 13-17); Schioth et al., Biophys Biochem Res Comm. 2003; 399-405 (compuesto 18); Benoit et al., J. Neurosci. 2000; 20: 3442-48 (compuestos 19 y 20); Vos et al., Bioorg Med Chem Lett. 2006; : 2302 (compuesto 21); Tucci et al., Bioorg Med Chem Lett 2005; 15: 4389 (compuesto 22); Pontillo et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005; 15: 4615-18 (compuesto 23); Chaki et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304: 818 (compuesto 24); Chaki et al., Pharmacol Biochem Behav. 2005; 82: 621 (compuesto 25).

Los compuestos 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 13-17, y 19 descritos anteriormente son agonistas de MC4R, mientras que los compuestos de 3 , 4, 7, 9, 11, 18, y 20 son antagonistas. Los antagonistas peptídicos de MC4R específicos contemplados para usarse en los métodos reclamados por la presente son Ac-Cys-Glu-His-D- (2 ' )Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH(2) (SEQ ID NO: 12); Ac-Cys-Nle-Arg-His-D- (2' )Nal-Arg-Trp-Gly-Cys-NH(2) (SEQ ID NO: 13); Ac-Cys-Glu-His-D-Phe (3,4-di-Cl) -Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH (2) (SEQ ID NO: 14), Ac-Nle-c [Asp-Che-DNal (2 ' ) -Arg-Trp-Lys-NH (2) (SEQ ID NO: 15); Ac-Nle-c [Asp-Cpe-DNal (2 ' ) -Arg-Trp-Lys-NH (2) (SEQ ID NO: 16); ciclo (1-6) -SUC-His-DPhe-Arg-Trp-Lys-NH (2) (SEQ ID NO: 17); y Ac-DArg [Cys-Glu-His-DPhe-Arg-Trp-Cys] -NH(2) (SEQ ID NO: 18) . Se contemplaron agonistas y antagonistas basados en péptidos con cadenas laterales y peptidomiméticos naturales. Véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,650,489; véase también, la Patente Estadounidense No. 6,090,912, especialmente en la Sección 5.5. Por ejemplo, la cadena lateral de los compuestos 18-20 y las cadenas laterales en la clase de compuestos descrito en la Figura 16 pueden ser no naturales . El MC4R ha mostrado experimenta internalización del receptor mediada por ligando (Gao et al . , J Pharmacol Exp Ther 2003; 307 (3 ): 870-7) . La preexposición de células GT 1-7 expresan MC4R endógeno al agonista hormona estimulante de a-melanocito- (a-MSH) , dio como resultado un deterioro en la formación de AMPc a un segundo desafía de a-MSH (Shinyama et al., Endocrinology 2003; 144 (4) : 1301-14) . Esto no fue observado con la administración de un antagonista. La internalización inducida por el ligando es activada en receptores acoplados por proteína G por fosforilación de los residuos de serina o treonina entre el segmento C-terminal y el tercer laso intracelular. La fosforilación promueve la unión de beta-arrestinas, los cuales son receptores blanco para la internalización y degradación por lisosomas. Datos recientes demuestran que la cola citosólica de una proteína similar a la atractiva (ALP) se une al dominio C-terminal del MC4R (Yeo et al., Biochem. J. 2003; 376). De este modo, una chaperona que incremente la estabilidad del MC4R sobre la superficie celular será especialmente benéfica dada la vida media corta del recetor sobre la superficie. Se espera además que una chaperona que sea agonista que se una de manera reversible a un polipéptido de MC4R en el ER no induzca internalización del receptor. De manera similar, donde el compuesto de chaperona sea un antagonista, se espera que no inhiba la actividad del receptor una vez que el receptor esté en la superficie celular.

Métodos de Tratamiento La presente invención también proporciona un método para tratar una condición asociada con una estabilidad reducida del MC4R, como la obesidad, o que tenga factores de riesgo para desarrollar obesidad, administrando un sujeto que necesite de ese tratamiento una chaperona para mejorar la estabilidad y/o actividad del MC4R. El individuo a ser tratado puede ser un individuo que no exhibe una mutación en el MC4R que afecte el pliegue procesamiento del MC4R, pero que se beneficiaría del incremento de la estabilidad del MC4R, sobre pro ejemplo, las neuronas. El individuo a ser tratado también puede tener una mutación en el MC4R que afecte el pliegue y procesamiento de la proteína MC4R, y exhiba estabilidad reducida del MC4R en las neuronas.

Formulación, Dosis y Administración Una chaperona farmacológica específica para el MC4R, es decir, un agonista o antagonista de MC4R u otro compuesto de unión de MC4R como se describió anteriormente, o como se identificó a través de los métodos de selección de la invención como se expone más adelante, se formula de manera ventajosa en una formulación farmacéutica junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. La chaperona puede ser designada como un ingrediente activo o agente terapéutico para el tratamiento de la obesidad u otro trastorno que implique expresión reducida del MC4R sobre la superficie celular o transporte hacia la superficie celular reducidos. La concentración del ingrediente activo (chaperona farmacológica) depende de la dosis y régimen de administración deseado, como se discute más adelante. Los intervalos de dosis ejemplares del ingrediente activo son de aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal por día; de aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día; o de aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 75 mg/kg por día. Los compuestos terapéuticamente efectivos pueden ser proporcionados a un sujeto en formulaciones estándar, y pueden incluir cualesquier aditivos farmacéuticamente aceptables, como excipientes, lubricantes, diluentes, saborizantes, colorantes, amortiguadores, y desintegrantes. Las formulaciones estándar son bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ésima edición, Mack Publishing Company, 2000. La formulación puede ser producida en unidades de dosis útiles para la administración por cualquier ruta que permita que la chaperona terapéutica cruce la barrera sanguíneo-cerebral . Las rutas ejemplares incluyen las rutas oral, parenteral, transmucosa, intranasal, inhalación o transdérmica. Las rutas parenterales incluyen la administración intravenosa, intraarteriolar, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intratecal, e intracraneal . En una modalidad, una chaperona farmacológica para el MC4R, particularmente aquellas descritas en las Figuras 1-8 y 10 aquí, es formulada en una forma de dosificación oral sólida. Para la administración oral, por ejemplo, para una molécula pequeña, la composición farmacéutica puede tener la forma de una tableta o cápsula preparada por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa) ; cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o almidón glicolato de sodio) ,- o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden ser presentadas como productos secos para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Esas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes suspensores (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) ; y preservativos (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes según sea apropiado. En otra modalidad, una chaperona para MC4R es formulada para administración parenteral. La chaperona puede ser formulada para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de un bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampolletas o recipientes multidosis, con un preservativo agregado. Las composiciones pueden tomar formas como suspensiones, soluciones emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación como agentes suspensotes, estabilizadores y/o dispersantes. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituirse con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Además de las formulaciones descritas anteriormente, la chaperona también puede ser formulada como una preparación de depósito. Esas formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantes (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble . En otra modalidad, la chaperona puede ser liberada en una vesícula, particularmente liposoma. En otra modalidad, la chaperona puede ser liberada en forma de liberación controlada. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser administrado usando infusión intravenosa con una bomba continua, en una matriz polimérica, como ácido poli-láctico/glutámico (PLGA) , en un granulo que contenga una mezcla de colesterol y el ingrediente activo (SilasticRMR; Dow Corning, Midland, MI; Véase la Patente Estadounidense No. 5,554,601), por implante subcutáneo o por parche transdérmico. Terapia Combinada. La composición farmacéutica también puede incluir otras sustancias biológicamente activas en combinación con el compuesto candidato. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a sibutramina, orlistat (Xenical®) , leptina, neuropéptido Y, colecistocinina, o GLP-1.

Selección para Chaperones Farmacológicos para MC4R La presente invención proporciona además un método para identificar un compuesto de chaperona candidato que modula la estabilidad, actividad y/o localización en la superficie celular de un polipéptido de MC4R. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para identificar una chaperona para la proteína MC4R, el cual comprende poner un compuesto de prueba marcado o no marcado en contacto con la proteína MC4R o un fragmento de la misma y medir la cantidad del compuesto de prueba unido a la proteína MC4R o al fragmento del mismo. Esto puede ser logrado, por ejemplo como sigue: (a) poniendo en contacto una primera célula con el compuesto de prueba durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la célula responda al contacto con el compuesto de prueba,- (b) determinar la estabilidad conformacional, actividad y/o localización en la superficie celular de un polipéptido de MC4R (o un fragmento del mismo comprende un dominio de unión del ligando) en la célula (sobre la superficie de la célula) del contacto en el paso (a) ,- y (c) comparar la estabilidad, actividad y/o localización en la superficie celular del polipéptido de MC4R terminada en el paso (b) con la de un polipéptido de MC4R en una célula control que no haya sido puesta en contacto con el compuesto de prueba. donde un cambio detectable en la estabilidad, actividad, y/o estabilidad en la superficie celular del polipéptido de MC4R en la primera célula en respuesta al contacto con el compuesto de prueba en comparación con el nivel de estabilidad del polipéptido de MC4R en las células control que no haya sido puesta en contacto con el compuesto de prueba, indique que el compuesto de prueba modula la estabilidad del polipéptido de MC4R y es un compuesto candidato para el tratamiento de un trastorno asociado con la estabilidad o actividad reducida de MC4R La célula puede ser una célula hospedera transformada con un MC4R natural o mutante no endógeno, o una célula que exprese una MC4R de manera endógena, incluyendo MC4R mutantes y naturales . Esas células incluyen las "neuronas de la obesidad" como las células GT1-7, descritas anteriormente, como aquéllas descritas en MacKenzie et al., Current Medicinal Chemistry - Immunology, Endocrine & Metabolic Agents 2004; 4: 113-117, las cuales expresan MC4R de manera endógena, o las células transformadas que expresan MC4R marcados normales o mutantes como las células HEK293 descritas en Blondet et al., JBiochem 2004; 135: 541-546 y más adelante en los Ejemplos. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para identificar una chaperona para la proteína MC4R, el cual comprende tener un compuestos de prueba marcada en contacto con las células o una fracción de membrana celular que contiene la proteína MC4R y medir la cantidad del compuesto de prueba marcado inhibe las células o la fracción de la membrana celular. Pueden ser empleados numerosos métodos de selección de alto rendimiento (HTS) para seleccionar grandes números (por ejemplo, cientos, miles, decenas de miles) de compuestos de prueba simultáneamente para la unión a una MC4R. Una compuesta de prueba puede ser, sin limitación, una molécula orgánica o inorgánica pequeña (preferida) , un péptido o un polipéptido (incluyendo un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra molécula inmunoespecífica) , una molécula oligonucleotídica (como un aptámero) , una molécula polinucleotídica, o una quimera o derivado de la misma. Los compuestos de prueba que son chaperonas candidatas que se unen específicamente a un polipéptido de MC4R pueden ser identificadas usando ensayos basados en células y/o libres de células. Varios métodos de ensayos automatizados que han sido desarrollados en años recientes permiten la selección de decenas de miles de compuestos en un periodo de tiempo breve (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,585,277, 5,679,582, y 6,020,141). Por ejemplo, un grupo reportó la identificación de un agonista de MC4R de arilpiperacina a través de la selección iterativa y dirigida de bibliotecas desviadas del receptor acoplado a proteína G no peptidílico (Richardson et al., J Med Chem 2004; 47 (3) : 744-55) . Esos métodos HTS son particularmente útiles, por ejemplo, en microarreglos. Para la selección o separación, las clases purificadas de compuestos que pueden ser identificados incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas (es decir, moléculas orgánicas o inorgánicas que son de menos de aproximadamente 2 kilodaltons (kD) en peso molecular, y, de manera más preferible, de menos de aproximadamente 1 kD de peso molecular) . Esos son los componentes de bibliotecas de compuestos . Como se usa aquí, el término "compuesto libre" se refiere a una entidad molecular seleccionada de una selección primaria de antagonistas o agonistas de MC4R que pueden ser efectivos por si mismos en la estabilización de la conformación de la proteína de la proteína MC4R al natural o mutante, o pueden ser modificados por un desarrollo adicional para generar un compuesto farmacéutico apropiado.

Bibliotecas de Compuestos . Las bibliotecas de ligandos orgánicos pequeños de alta pureza y agonistas peptídicos que tienen actividades farmacológicas bien documentadas están disponible de Sigma-Aldrich (LOPAC LIBRARY*"1 and LIGAND-SETS"*) . También está disponible de Sigma-Aldrich está una Biblioteca de Aldrich de Productos Químicos Raros, la cual es una biblioteca diversa de más de 100,000 compuestos de molécula pequeña, incluyendo extractos de plantas y extractos de cultivos microbianos . Otras bibliotecas de compuestos están disponibles de Tripos (LeadQuest®) y TimTech (incluyendo bibliotecas dirigidas para moduladores de cinasas) . Otras compañías que suministran o han suministrado bibliotecas de compuestos del tipo adecuado para la selección de acuerdo a la invención incluyen las siguientes: 3- Dimensional Pharmaceuticals, Inc.; Advanced ChemTech; Abinitio PharmaSciences,- Albany Molecular; Aramed Inc.; Annovis, Inc. (formerly Bearsden Bio, Inc.); ASINEX; AVANT Immunotherapeutics; AXYS Pharmaceuticals; Bachem; Bentley Pharmaceuticals; Bicoll Group; Biofor Inc.; BioProspect Australia Limited; Biosepra Inc.; Cadus Pharmaceutical Corp.; Cambridge Research Biochemicals; Cetek Corporation; Charybdis Technologies, Inc.; ChemBridge Corporation; ChemDiv, Inc.; ChemGenics Pharmaceuticals Inc.; ChemOvation Ltd.; ChemStar, Ltd.; Chrysalon; ComGenex, Inc.; Compugen Inc.; Cytokinetics; Dextra Laboratories Ltd. ,- Discovery Partners International Inc.; Discovery Technologies Ltd.; Diversa Corporation; Dovetail Technologies, Inc.; Drug Discovery Ltd.; ECM Pharma; Galilaeus Oy; Janssen Pharmaceutica; Jerini Bio Tools; J-Star Research; KOSAN Biosciences, Inc.; KP Pharmaceutical Technology, Inc.; Lexicón Genetics Inc.; Libris Discovery; MicroBotanica, Inc.; MicroChemistry Ltd.; MicroSource Discovery Systems, Inc.; Midwest Bio-tech Inc.; Molecular Design & Discovery; MorphoSys AG; Nanosyn, Inc.; Ontogen Corporation; Organix, Inc.; Pharmacopeia, Inc.; Pherin Pharmaceuticals; Phytera, Inc.; PTRL East, Inc.; REPLICor Inc.; RSP Amino Acid Analogues, Inc.; Sanofi- Synthelab (now Sanofi-Aventis) Pharmaceuticals; Sequitur, Inc.; Signature BioScience Inc.; Spectrum Info Ltd.; Talón Cheminformatics Inc.; Telik, Inc.; Tera Biotechnology Corporation; Tocris Cookson; Torrey Pines Institute for Molecular Studies; Trega Biosciences, Inc.; and WorldMolecules/MMD. Además, el Institute of Chemistry and Cell Biology (ICCB) , mantenido por la Escuela Médica de Harvard, proporciona las siguientes bibliotecas químicas, incluyendo bibliotecas de productos naturales, para la selección: Chem Bridge DiverSet E (16,320 compuestos); Bionet 1 (4,800 compuestos); CEREP (4,800 compuestos); Maybridge 1 (8,800 compuestos); Maybridge 2 (704 compuestos); Peakdale 1 (2,816 compuestos) ; Peakdale 2 (352 compuestos) ; ChemDiv Combilab and International (28,864 compuestos); Mixed Commercial Píate 1 (352 compuestos) ; Mixed Commercial Píate 2 (320 compuestos) ; Mixed Commercial Píate 3 (251 compuestos) ; Mixed Commercial Píate 4 (331 compuestos) ; ChemBridge Microformat (50,000 compuestos); Commercial Diversity Set 1 (5,056 compuestos); NCI Collections: Structural Diversity Set, versión 2 (1,900 compuestos); Mechanistic Diversity Set (879 compuestos); Open Collection 1 (90,000 compuestos); Open Collection 2 (10,240 compuestos); Known Bioactives Collections: NINDS Custom Collection (1,040 compuestos); ICCB Bioactives 1 (489 compuestos) ; SpecPlus Collection (960 compuestos); ICCB Discretes Collections. Los siguientes compuestos químicos ICCB fueron recolectados de forma individual químicamenteen el ICCB, Harvard, y otras instituciones que colaboran: ICCBl (190 compuestos) ,- ICCB2 (352 compuestos) ; ICCB3 (352 compuestos) ; ICCB4 (352 compuestos). Extractos de Productos Naturales: NCI Marine Extracts (352 depósitos) ; Organic fractions - NCI Plant and Fungal Extracts (1,408 depósitos); Philippines Plant Extracts 1 (200 depósitos) ; ICCB-ICG Diversity Oriented Synthesis (DOS) Collections; DDS1 (DOS Diversity Set) (9600 depósitos) . Existen numerosas técnicas disponibles para crear bibliotecas de compuestos más enfocadas más que grandes, diversas. La Chemical Computing Group, Inc. (Montreal) ha desarrollado programas y sistemas de programación o software con un nuevo método para el diseño de fármacos de alto rendimiento . El método de la compañía usa datos experimentales de selección de alto rendimiento (HTS) para crear un modelo probabilística QSAR (Relación de la Actividad de la Estructura Cuantitativa) , el cual es usado posteriormente para seleccionar los bloques de construcción en una biblioteca combinada virtual. Este se basa en estimaciones estadísticas en lugar del análisis de regresión estándar. Además, ArQuIe, Inc. (Woburn, MA) también integrado a tecnologías para efectuar la producción automatizadas, de alto rendimiento, de compuestos químicos y para proporcionar esos compuestos de estructura conocida y alta pureza en suficientes cantidades para la optimización libre. AMAPMR (Planta de Montaje Molecular Automatizada) efectúa la síntesis química de alto rendimiento para cada fase de descubrimiento del compuesto. Con frecuencia se proporcionan compuestos similares en bases de datos en línea o en CD-ROM para "captación selectiva de compuestos". Véase, por ejemplo, Ablnitio PharmaSciences; ActiMol; Aral Biosynthetics; ASDI Biosciences; Biotechnology Corporation of America; Chembridge; ChemDiv; Florida Center - Heterocyclic Compounds; Microsource /MSDI; NorthStar; Peakdale; Texas Retaining Group; Zelinsky Institute,- Advanced ChemTech; Ambinter; AnalytiCon Discovery; Aurora Fine Chemicals; Biofocus; Bionet /Key; Comgenex; Key Organics; LaboTest; Polyphor; SPECS and Biospecs ,- y Bharavi Laboratories .

Microarreglos En una modalidad, la selección HTS para chaperonas de MC4R emplea microarreglos .

Arreglos de proteína . Los arreglos de proteína son sistemas de ensayo de unión, en fase sólida, que usan proteínas inmovilizadas sobre varias superficies que son seleccionadas por ejemplo de vidrio, membranas, pozos microtrituradores, placas, y perlas u otras partículas de espectrómetro de masas. Los ensayos de unión que usan esos arreglos son altamente paralelos y con frecuencia miniaturizados. Sus ventajas son que son rápidos, pueden ser automatizados, son capaces de tener alta sensibilidad, y son económicos en su uso de reactivos, y proporcionan una abundancia de datos de un solo experimento. Los formatos múltiples o automatizados son los sistemas HTS mejor desarrollados. Los sistemas de selección basados en placas de 96 o 384 pozos automatizados son los más ampliamente usados. La tendencia actual en los sistemas de selección basados en placas es reducir el volumen de los pozos de reacción aún más, e incrementar la densidad de los pozos por placa (de 96 pozos a 384 pozos a 1,536 pozos por placa) . La tendencia da como resultado un incremento en el rendimiento, disminución dramática de los costos de los biorreactivos por compuestos seleccionados, y una disminución en el número de placas que necesitan ser manejadas por la automatización. Para una descripción de los arreglos de proteína que pueden ser usados para HTS, véanse por ejemplo: las Patentes Estadounidenses No. 6,475,809; 6,406,921; y 6,197,599; y las Publicaciones internacionales Nos. WO 00/04389 y WO 00/07024. Para la construcción de arreglos, las fuentes de MC4R o fragmentos de los mismos, ya sea en forma natural o mutante, pueden incluidos sistemas de expresión basados en células para proteínas recombinantes, purificación de fuentes naturales, producción in vi tro por sistemas de translación libres, y métodos sintéticos para producir péptidos de MC4R. Para arreglos de captura y de análisis de función de proteína, con frecuencia es el caso que los polipéptidos MC4R están plegados correctamente y funcionales. Esto no siempre es el caso, por ejemplo, donde las proteínas recombinantes son extraídas de bacterias bajo condiciones desnaturalizantes; otros métodos (aislamiento de proteínas naturales, síntesis libres de células) generalmente retienen la funcionalidad. Sin embargo, los arreglos de proteínas desnaturalizadas pueden aún ser útiles en la selección de chaperonas, puesto que la chaperona probablemente se unirá a la proteína mutante mientras no se pliegue en su conformación apropiada. El método de inmovilización usado es aplicable preferiblemente a polipéptidos de MC4R de diferentes propiedades (por ejemplo, fragmentos naturales, mutantes, de longitud completa, longitud parcial, hidrofílicos, hidrofóbicos, etc.), sensibles a un alto rendimiento y automatización, y generalmente compatibles con retención de la capacidad de unión de la chaperona. Ambos métodos covalente y no covalente de inmovilización de proteína MC4R pueden ser usados . Los sustratos para la unión covalente incluyen, por ejemplo, portaobjetos de vidrio recubiertos con reactivos de silano que contiene amino o aldehido (Telechem) . En el sistema VersalinxMR (Prolinx) , el acoplamiento covalente reversible es logrado por la interacción entre la proteína derivado con ácido fenildiborónico, y ácido salicilhidroxámico inmovilizado sobre la superficie de soporte . Los métodos de acoplamiento covalente que proporcionan un enlace estable pueden ser aplicados a una gama de proteínas. La unión no covalente de proteínas no modificadas ocurre dentro de estructuras porosas como el HidroGelMR (PerkinElmer) , basado en un gel de poliacrilamida tridimensional .

Arreglos Basados en Células . Los arreglos basados en células combinan la técnica de cultivo celular en conjunto con el uso de dispositivos fluídicos para medir la respuesta de la célula a compuestos de prueba de una muestra de interés, seleccionar las muestras para identificar moléculas que inducen un efecto deseado en células cultivadas, y selección e identificación de poblaciones de células de características novedosas y deseadas . Puede efectuarse una selección de alta rendimiento (HTS) sobre células fijas usando anticuerpos marcados de manera fluorescente, ligandos biológicos o chaperonas candidatas y/o sondas de hibridación de ácido nucleico, o sobre células vivas usando indicadores fluorescentes multicolor y biodetectores. La elección de células fijas o vivas depende del ensayo basado en células específico requerido. Existen numerosas técnicas de arreglo basadas en una sola y múltiples células conocidas en la técnica. Las técnicas desarrolladas recientemente como los arreglos micropatrón (descritos, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales PCT WO 97/45730 y WO 98/38490) y arreglos microfluídicos proporcionan herramientas valiosas para el análisis comparativo basado en células. Los microarreglos de células transfectadas son una técnica complementaria en la cual las características del arreglo comprenden conjunto de células que sobreexpresan ADN definidos. Los AND complementarios clonados en vectores de expresión son impresos sobre portaobjetos de microscopio, los cuales se convierten en arreglos vivientes después de la adición de un reactivo de transfección lipídica y de células de mamífero adherentes (Bailey et al., Drug Discov. Today 2002; 7(18 Suppl) : S113-8) . Los arreglos basados en células son descritas con detalle en, por ejemplo, Beske, Drug Discov. Today 2002; 7(18 Suppl): S131-5; Sundberg et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2000; 11: 47-53; Johnston et al., Drug Discov. Today 2002; 7: 353-63; Patentes Estadounidenses Nos. 6,406,840 y 6,103,479, y solicitud de patente estadounidense publicada en No. 2002/0197656. Parar arreglos basados en células usado específicamente para seleccionar moduladores de canales de iones cerrados por ligando, véase Mattheakis et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 1: 124-34; y Baxter et al., J. Biomol Screen. 2002; 7: 79-85.

Marcas Detectables . Para la detección de moléculas como chaperonas para MC4R candidatas usando ensayos de selección, puede ser usado un ensayo funcional para seguir moléculas no marcadas como se describe en otra parte aquí. Una molécula de interés (por ejemplo, una molécula pequeña, un anticuerpo, o una sonda polinucleotídica) o una biblioteca de la misma también puede ser marcada de manera detectable con un átomo (por ejemplo, un radionúclido) , una molécula detectable (por ejemplo, fluorescencia) , o un complejo que, debido a una propiedad física o química sirve para indicar la presencia de la molécula de interés . Una molécula también puede ser marcada de manera detectable cuando se une covalentemente a una molécula "reportera" (por ejemplo, una biomolécula, una enzima) , que actúe sobre un sustrato para producir un producto detectable. Las marcas detectables adecuadas para usarse en la presente invención incluye cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos) . Las etiquetes útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, biotina para teñir con conjugado de avidita o estreptavidina marcado, pernas magnéticas (por ejemplo, DynabeadsMR) , tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína-isotiocianato de fluoresceína (FITC) , rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, lisamina, ficoeritrina, Cy2, Cy3, Cy3.5 , Cy5 , Cy5.5 , Cy7 , Flúor X de Amersham, Verde SyBR I y II de Molecular Probes, y similares) , marca radiactiva (por ejemplo, 3H, 1251, 35S, 14C o 32P) , enzimas (por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas como la fosfatasa alcalina, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidadas como la peroxidas de rábano, y similares) , sustratos, cofactores, inhibidores, grupos quimiluminiscentes, agentes cromogénicos y marcas colorimétricas como el oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreadas (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.) Los ejemplos de Patentes describen el uso de esas marcas incluyen las Patentes Estadounidense Nos.: 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241.

Los medios para detectar esas marcas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las marcas radioactivas y quimioluminiscentes pueden ser detectadas usando película fotográfica o contadores de destellos; los marcadores fluorescentes pueden ser detectados usando un fotodetector para detectar la luz emitida (por ejemplo, como la clasificación de células activadas o fluorescencia, FACS) ; y las marcas enzimáticas pueden se detectadas proporcionando a la enzima un sustrato y detectando, por ejemplo, un producto de reacción que podría producir por la acción de la enzima sobre el sustrato.

Ensayos de Estabilidad, Localización y Actividad Como se indicó anteriormente, la estabilidad mejorada del MC4R puede ser determinada midiendo un incremento en el polipéptido de MC4R celular, determinando un incremento en el tráfico hacia la superficie celular, por ejemplo, de acuerdo a lo determinado por el incremento de la expresión en la superficie celular, o determinando el incremento de la actividad de MC4R. Los métodos ejemplares no limitantes para evaluar cada uno de los anteriores se describe más adelante.

Determinación de la estabilidad intracelular del MC4R. Los métodos para determinar los niveles de proteína MC4R intracelular son bien conocidos en la técnica. Esos y una precipitación seguida por análisis Western blotting (IP Western) , o inmunofluorescencia usando una proteína MC4R marcada .

Determinación del tráfico de MC4R. La evaluación del tráfico de proteínas a través de la vía biosintética puede ser lograda por ejemplo, usando experimentos versátiles con proteína receptora marcada con 35S, en conjunto con glicosidasas ; o por inmunofluorescencia indirecta o directa para determinar la modificación de la proteína durante el tráfico. Esos y otros métodos son descritos por ejemplo en Cell Biology 2001; John Wiley & Sons. Los métodos para detectar un tráfico deteriorado de proteínas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para proteínas las cuales son glicosiladas en N y/o O en el aparato de Golgi, puede ser usada la marcación metabólica por el uso usando proteínas marcadas radioactivamente, combinadas con el tratamiento con glicosidasa e inmunoprecipitación, para detectar si las proteínas están experimentando una glicosilación completa en el aparato de Golgi, o si están siendo retenidas en el ER en lugar de transitar hacia el aparato de Golgi para su glicosilación adicional. Los métodos sensibles para detectar visualmente la ubicación celular también incluyen la microscopía fluorescente usando proteínas fluorescentes o anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, las proteínas MC4R de interés pueden ser marcadas con, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente cian, proteína fluorescente amarilla, y proteína fluorescente roja, seguida por microscopía multicolor y de lapso de tiempo y microscopía electrónica para estudiar el desvanecimiento de esas proteínas en células fijas y células vivientes. Para una revisión del uso de la formación de imágenes fluorescentes en el tráfico de proteínas véase Watson et al, Adv Drug Deliv Rev 2005; 57(1):43-61. Para una descripción del uso de la microscopía confocal para la colocalización intracelular de proteínas, véase Miyashita et al., Methods Mol Biol. 2004; 261:399-410. La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es un método de detección ultrasensible y no invasivo capaz de mover una resolución de una sola molécula y en tiempo real (Vukojevic et al., Cell Mol Life Sci 2005; 62(5): 535-50) . La SPFI (formación de imagines fluorescentes de una sola particular) usa la alta sensibilidad de la florescencia para visualizar moléculas individuales que han sido marcadas selectivamente con partículas fluorescentes pequeñas (Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31(Pt 5): 1028-31). Para la localización de proteínas dentro de lipidíeos, véase et al., Endocrinology 2003; 144(11): 4725-8). Para una revisión de la formación de imágenes de células vivas, véase Hariguchi, Cell Struct Funct 2002; 27 (5) : 333-4) . La microscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) también es usada para estudiar la estructura y localización de proteínas bajo condiciones fisiológicas (Periasamy, J Biomned Opt 2001; 6 (3) : 287-91) . Para proteínas residentes en la membrana plasmática, pueden ser usados ensayos menos sensibles para detectar si están presentes sobre la membrana. Esos métodos incluyen inmunohistoquímica de células fijas, o marcación de células completas usando ligando marcado radioactivamente (por ejemplo, 125I) .

Determinación de la Expresión de MC4R en la superficie celular. Una vez que ha sido identificado el contexto candidato, el siguiente paso es determinar si el compuesto candidato puede aumentar la cantidad de un MC4R que transite ha la superficie celular. Pueden ser usados numerosos ensayos para evaluar cuantitativamente la expresión del receptor en la superficie celular. Por ejemplo, pueden ser usadas ensayos de unión del ligando radiactivo, usando por ejemplo, 125I-MSH, para determinar la unión a células completas que expresen MC4R o atracciones de membrana celular. Véase la solicitud estadounidense publicada 2003/0176425 para una descripción de un método ejemplar; véase también Ch ajlani, Peptides. 1996; 17 (2) : 349-51. Además, también puede ser usada la tinción inmunofluorescente, usando anticuerpos marcados MC4R {por ejemplo, MC4R marcado con FLAG) . Otro método bien conocido es la clasificación celular de células activada por fluorescencia (FACS) , la cual clasifica o distingue poblaciones de células de anticuerpos marcados contra los marcadores de la superficie celular. Véase también, Nijenhuis et al., supra.

Determinación de un Incremento en la Actividad de MC4R. La actividad del MC4R puede ser determinada usando, por ejemplo, ensayos de activación/acumulación de AMPc (véase, por ejemplo, VanLeeuwen et al., J Biol Chem 2003; 18: 15935-40) o midiendo un incremento en la trascripción de uno o más genes activados por AMPc, o midiendo la expresión del gen reportero por el enlace operativo a un gen reportero como la luciferasa a un elemento de respuesta de AMPc (CRE) (véase por ejemplo, Lee et al., Eur J Biochem 2001; 268 (3) : 582-91) . Además, también se sabe que el MC4R estimula la secreción de TNF-a en melanóforos. Por lo tanto, la actividad de MC4R en respuesta a un compuesto candidato puede ser evaluado midiendo la secreción de TNF-a (véase por ejemplo, Ignar et al., Peptides 2003 May; 24 (5) : 709-16) . Finalmente, los melanoforos proporcionan un bioensayo rápido y sensible para agonistas y antagonistas de melanocortina. Este método se basa en la medición de la dispersión de granulos de pigmento inducida por a-MSH, de acuerdo a lo determinado por cambios en la densidad óptica (Quillan et al., PNAS U.S.A. 1995; 92: 2894; y Potenza et al., Pigment Cell Res 1992; 5: 372).

Definiciones de Biologia Molecular De acuerdo con la presente invención pueden ser empleadas técnicas de biología molecular, microbiología y AND recombinante convencionales dentro de la experiencia de la técnica. Esas técnicas son generalmente útiles para la producción de células recombinantes que expresan MC4R naturales o mutantes para usarse en ensayos de selección. Esas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ,- F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) ; y últimas ediciones de cada una, donde están disponibles . El término "célula hospedera" significa cualquier célula de cualquier organismo que sea seleccionada, modificada, transformada, cultivada, usada, o manipulada de alguna manera, para la producción de una sustancia deseada por la célula, por ejemplo, la expresión por la célula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o una enzima. De acuerdo a la presente invención, la célula hospedera es modificada para expresar un ácido nucleico y polipéptido de MC4R mutante o natural. Las células hospederas pueden además ser usadas para ensayos de selección u otros. Las células hospederas ejemplares para usarse en la presente invención son las células HEK293, células COS y células CHO. Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula recombinante es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación biológica molecular. Los polinucleótidos de MC4R aquí pueden estar flanqueados por secuencia reguladoras (control de expresión) o pueden estar asociados con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) y otras secuencias del sitio de unión ribosomal, mejoradores, elementos de respuesta, supresores, secuencia señal, secuencias de poliadenilación, intrones, secuencias no codificadoras 5'- y 3'-, y similares. Los ácido nucleicos también pueden ser modificados por muchos medios conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de esas modificaciones incluyen: metilación, "coronas", sustitución de uno o más nucleótidos naturales con un análogo, y modificaciones internucleótido como, por ejemplo, aquellas con enlaces recargados, (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos , carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener una o más porciones ligadas covalentemente adicionales, como, por ejemplo, proteína (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.). intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidativos etc.) y alquiladores. Los polinucleótidos pueden ser derivados por formación de un metil o etil fosfotriéster o un enlace de fosforamidato de alquilo. Además, los polinucleótidos aquí también pueden ser modificados con una marca capaz de proporcionar una señal detectable, ya se directa o indirectamente. Las marcas ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares. Los ácidos nucleicos también pueden ser alterados en una o más bases, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio para facilitar la biología molecular asociada con el uso de las moléculas. Una "secuencia codificadora" o una secuencia "que codifica" para un producto de expresión, como un ARN o polipéptido de MC4R, es una secuencia nucleotídica que, cuando es expresada, da como resultado la proyección de ese ARN o polipéptido, por ejemplo, la secuencia nucleotídica de MC4R que codifica para la secuencia de aminoácidos para un polipéptido (proteína) MC4R. Una secuencia codificadora para la proteína puede incluir un codon de inicio (usualmente ATG) y un codon sin sentido. El término "gen" , también llamado "gen estructural" significa una secuencia de AD? que codifica para o corresponde a una secuencia particular de aminoácidos, la cual comprende toda o parte de una o más proteínas de MC4R, y puede o no incluir secuencias de AD? reguladoras, como secuencias promotoras, las cuales determinan por ejemplo las condiciones bajo las cuales el gen de MC4R es expresado. Los términos "expresa" y "expresión" , como se usa en el contexto de la producción de una secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos, significan que permiten o hacen que la información de un gen o secuencia de AD? de MC4R se manifieste, por ejemplo produciendo una proteína MC4R activando las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción del gen o secuencia de AD? de MC4R correspondiente. Una secuencia de ADN es expresada en o por una célula para formar un "producto de expresión" como una proteína MC4R. El producto de expresión en sí, por ejemplo, la proteína resultante, también puede es "expresada" por la célula. Un producto de expresión puede ser caracterizado como intracelular, extracelular o secretado. De acuerdo a la presente invención, el MC4R es expresado en la superficie celular de las neuronas. El término "intracelular" significa algo que se encuentra dentro de una célula. El término "extracelular" significa algo que está fuera de una célula. Una sustancia es "secretada" por una célula aparece en una medida significativa fuera de la célula, desde algún lugar sobre o dentro de la célula. El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos que no ocurren de manera natural o en combinación. Por ejemplo, el ADN heterólogo se refiere al ADN no licalizado de manera natural en la célula, o en un sitio cromosomal de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen ajeno a la célula. Un elemento regulador de la expresión heteróloga es un elemento asociado operativamente con un gen diferente al que se encuentra asociado operativamente en la naturaleza. En el contexto de la presente invención, un gen que codifica para una proteína de interés es heterólogo al ADN del vector en el cual se insertó para la clonación o expresión, y es heterólogo a una célula hospedera que contiene ese vector, en el cual se expresó, por ejemplo, una célula de E. coli . El término "transformación" se refiere al proceso mediante el cual el ADN, es decir un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de MC4R, es introducido desde el medio circundante hacia una célula hospedera. El término "transducción" se refiere a la introducción de ADN, es decir, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de MC4R, en una célula hospedera procariótica, por ejemplo, en una célula hospedera procariótica vía un virus bacteriano o bacteriófago. Una célula hospedera procariótica o eucariótica que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" o "transducida" y es una "transformante" o un "clon" . El ADN o ARN introducido en la célula hospedera puede provenir de cualquier punto, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedera, o células de un género o especie diferente, o secuencias sintéticas. El término "célula modificada de manera recombinante" se refiere a cualquier célula procariótica o eucariótica que haya sido manipulada para expresar o sobreexpresar el ácido nucleico de interés, es decir un ácido nucleico que codifique para un polipéptido de MC4R, por cualquier método apropiado, incluyendo la transfección, transformación o transducción. Este término también incluye la activación endógena de un ácido nucleico en una célula que normalmente no expresa el producto del gen o que expresa el producto del gen a un nivel subóptimo. El término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico ajeno (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula. El ácido nucleico "ajeno" incluye un gen, secuencia de ADN o ARN a la célula hospedera, de modo que la célula hospedera replicará el ADN y expresará el gen o secuencia introducida para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducida. El gen introducido, es decir, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de MC4R, o secuencia también puede ser llamado gen o secuencia "clonada", puede incluir secuencias reguladoras o de control, como secuencias de inicio, sin sentido, promotoras, señal, secreción u otras usadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin una función conocida. El ADN puede ser introducido ya sea como un elemento extracromosomal o por integración cromosomal o una célula hospedera que reciba y exprese el ADN o ARN introducido. Dependiendo de la célula hospedera usada, la transformación o transfección se efectúa usando técnicas estándar apropiadas para esas células. En el tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., 1989 supra, es usado generalmente para células bacterianas que contienen barreras de paredes celulares sustanciales . Otro método para la transformación emplea polietilen glicol/DMSO, como se describe en Chung and Miller (Nucleic Acids Res. 1988, 16:3580). Otro método es el uso de la técnica llamada electroporación. De manera alternativa, donde sea usado un vector viral, las células hospederas pueden ser infectadas por el virus que contenga el gen de interés. Los términos "vector" , "vector de clonación" y "vector de expresión" significan el vehículo por el cual la secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen de MC4R) puede ser introducido en una célula hospedera, para transformar el anfitrión y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc.; ellos son bien conocidos en la técnica. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora corriente abajo (en dirección 3'). Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora es unida en su término 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a un nivel detectable por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Una secuencia codificadora está "bajo el control" o "asociada operativamente con" las secuencias de control transcripcional o translacional en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, el cual es entonces trans-RNA empalmado (si contiene intrones) y es traducido en la proteína codificada por la secuencia codificadora. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente emplea técnicas de ligación estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados son escindidos, diseñados y religados en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos . Para el análisis para confirmar las secuencias incorrectas en los plásmidos construidos, se usan mezclas de ligación para transformar cepas bacterianas, y las transformantes exitosas son formadas por resistencia a la ampicilina o tetraciclina donde sea apropiado. Los plásmidos de las transformantes son preparados, analizados por digestión con endonucleasa de restricción, y/o secuenciados por el método de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74:5463- 5467) o Messing et al. (Nucleic Acids Res. 1981, 9:309), o por el método de Maxam et al. (Methods in Enzymology 1980, 65:499). Las células hospederas son transformadas a los vectores de expresión descritos anteriormente de esta invención y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para el promotor utilizado.

EJEMPLOS La presente invención es descrita mejor por medio de los ejemplos, presentados a continuación. El uso de esos ejemplos es ilustrativo únicamente y no limita de ninguna manera el alcance o significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. De igual modo, la invención no se limita a ninguna modalidad preferida particular descrita aquí. En realidad, muchas modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica tras leer esta especificación y pueden hacerse sin apartarse de su espíritu y alcance. La invención por lo tanto es limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance de las equivalentes con el cual las reivindicaciones estén dotadas .

EJEMPLO 1 : Generación de Líneas Celulares que Expresan Mutantes de Pliegue de MC4R Para determinar si o no los mutantes de MC4R dan como resultado efectos conformacionales de MC4R, los ácidos nucleicos de MC4R que contienen los diferentes mutantes son transfectados en células HEK-293T y COS-7 y se evalúa su expresión o actividad en la superficie celular. Aquellas líneas celulares en las cuales sea observada una expresión en la superficie celular reducida o ausente son evaluados adicionalmente para determinar la presencia y/o ubicación intracelular del polipéptido de MC4R.

Métodos Generación de Mutantes de MC4R. El ADNc que codifica para un MC4R natural (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) es modificado usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR, mutagénesis dirigida al sitio) para generar ADNc de MC4R mutantes que contengan alteraciones en los nucleótidos que den como resultado, por ejemplo, uno de los siguientes polipéptidos mutantes de MC4R: P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, TI ÍA, A175T, I316L, 1316S5 I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, S58C, CTCT en el codon 211, y/o inserción de TGAT en el codon 244. Esos mutantes también pueden ser fusionados a una marca fluorescente, como GFP, como se describe en Blondet et al. JBiochem (Tokyo) 2004; 135(4) :541-6, o marcado con FLAG, como se describe en VanLeeuwen et al., J Biol. Chem. 2003; 278: 15935-15940, o marcado con una enzima como la luciferasa. Cultivo Celular y Transfección. Esos ácidos nucleicos de MC4R mutantes son clonados en un vector de expresión apropiado, por ejemplo, pC de DNA3.1 (Invitrogen, Carisbad, CA) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La transfección de las células es efectuada usando LipofectAMINA (Invitrogen) , y las líneas celulares clónales fueron transfectadas permanentemente son seleccionadas por la resistencia al análogo de la neomicina G418. De manera breve, las células HEK-293T y COS-7 son mantenida en medio de Eagle modificado de Dulbecco (con glutamina; Invitrogen) suplementado con 10% de suero de bovina fetal, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml estreptomicina (Invitrogen) . Las células son incubadas a 37°C en aire humidificado con un contenido de 5% de C02. Las células están generalmente a una confluencia del 70-80% el día de la transfección.

MC4R marcado con GFP. El ADNc de proteína fluorescente verde (GFP) está disponible de BD Biosciences (San José, CA) o Clontech (Palo Alto, CA) . La GFP se fusiona al marco al C terminal del MC4R humano con el codon de terminación C-terminal removido, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El plásmido recombinante de proteína de fusión MC4R-GFP quimérico es entonces transfectado como anteriormente. Se emplea igualmente un plásmido recombinante de luciferasa.

Detección de la Localización de Mutantes MC4R. Los experimentos de unión para determinar la ubicación en la superficie celular son efectuados usando las condiciones descritas anteriormente (Yang et al., J Biol Chem 1997; 272: 23000-23010) . De menara breve, se usan 2 x 105 cpm de 125I-NDP-MSH (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) en combinación con ligando marcados radiactivamente NDP-MSH, AgRP 87-132, o AgRP 110-117. Las reacciones de unión se terminan removiendo los medios y lavando las células dos veces con medios esencial y mínimo con un contenido de 0.2% de albúmina de suero bovino. Las células son entonces lisadas con NaOH 0.2 N y la radioactividad en el lisado es cuantificada en un contador analítico. La hormona específica es determinada midiendo la cantidad de marca de 125I unida en presencia de ligando no marcado 10"6 M. Adicionalmente, puede usarse FACS como se describe más adelante en el Ejemplo 4. La unión específica es calculada sustrayendo la radioactividad no unida específicamente de la radioactividad unida total. La unión máxima (Bmax) puede ser calculada usando la ecuación Bmax = [NDP-MSH unión específica] /( [NDP-MSH] / (Kd + [NDP-MSH] ) . Ki = CI50/1 + concentración de ligando/Kd. Donde el mutante MC4R es marcado de manera fluorescente, se usa microscopía confocal para verificar el tráfico intracelular del MC4R marcado (Blondet et al., JBiochem 2004; 135: 541-546; o Gao et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 307 (3) : 870-7) . De manera breve, las células se hacen crecer en capas de vidrio de cámara 24 a 48 h antes de los experimentos. Después de los tratamientos apropiados, las células son lavadas con PBS frío y fijadas en formalina durante 20 minutos, y observadas sobre un microscopio de barrido láser LSM 510 META (Cari Zeiss, Thornwood, NY) . La fluorescencia de la GFP es excitada usando un láser de argón/criptón de 488-nm con un filtro de paso de banda de 500 a 550 nm. La señal roja es excitada con un láser de HeNe a 543 nm y la fluorescencia es detectada con un filtro de paso de banda de 565 a 615. Las imágenes adquiridas digitalmente son cuantificada usando un Scion Image Beta 4.02. Las imágenes confocales de fluorescencia verde original son convertidas a escala de gris y se efectúa una filtración media. A cada pixel se le asigna un valor de intensidad que va de 0 (negro) a 255 (blanco) . La intensidad de la fluorescencia de las superficies celular y celular total son medidas después de seleccionar manualmente el área correspondiente. La distribución subcelular de MC4R-GFP se expresan con una relación de la intensidad de fluorescencia de la superficie celular y la intensidad de la fluorescencia celular total. Una disminución en la relación indica internalización del receptor. Usando esos métodos, son identificados dos mutantes de pliegue de MC4R que serían candidatos para el rescato mediado por chaperona.

EJEMPLO 2 : Estructuras de Agonistas y Antagonistas de MC4R Los agonistas y antagonista potenciales de MC4R fueron seleccionados sobre la base de la revisión de las patentes y referencias en la literatura publicadas (en particular, Bednarek y Fong, Exp. Opn. Therapeutic Patents 2004; 14(3): 327-326 y WO 02/062766). Los criterios usados en la selección de los compuestos aquí incluyeron los datos de CI50 publicados, datos de animales in vivo, y datos de biodisponibilidad (por ejemplo, farmacocinética) donde estén disponibles . a) Sintesis del Agonista de la Figura 1 (compuesto 1) La selección de éste compuesto, conocido como THIQ, se basó en los siguientes datos: La síntesis de esta molécula (11 pasos) se efectúo sobre la base del esquema descrito en la Figura 3. b) Síntesis del Agonista de la Figura 2 (compuesto 2) La selección de este compuesto conocido, referido como compuesto 2, se basó en los siguientes datos: La síntesis de ésta molécula (11 pasos) se efectuó sobre la base del esquema descrito en la Figura 4. c) Sintesis del Antagonista de la Figura 5 (compuesto 3) Este compuesto fue seleccionado sobre la base de los datos de aMSH/MC4R reportados por Arasasingham (J Med Chem 2003, 46: 9-11). La síntesis de éste compuesto fue efectuado por el método descrito aquí, resumido en la Figura 7. d) Sintesis del Antagonista de la Figura 6 (compuesto 4) Este compuesto fue seleccionado y sintetizado sobre la base de los datos y el método sintético descrito en la Publicación de Patente Internacional WO 02/062766 de Millennium Pharmaceuticals; el esquema sintético se resume en la Figura 8. La actividad biológica de éste compuesto es reportado en la WO 02/062766 usando un ensayo de proximidad de destellos . De manera breve, la síntesis se logró usando el siguiente método: Se agregaron 1, 3 -diaminopropano (Acros, 27.7 g, 0.374 mmol) a ácido tiosalicílico (Acros, 20 g, 0.130 mmol) en 1, 2-diclorobenceno (Acros, 200 ml) , esta mezcla es calentada a 170 °C durante 4 horas. Tras enfriar a 60°C, se agrega metanol (50 ml) , la reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche y el sólido cristalino amarillo resultante es recolectado con éter para dar 9 g del producto puro. Se agrega bromuro de 2 -Metoxi-5-nitrobencilo (Fluka, 1.86 g, 7.559 mmol) a 2- (1, 4 , 5 , 6-tetrahidropirimidin-2-il)bencentiol (lg, 5.201 mmol) en metanol (60 ml) a temperatura ambiente, se mantiene durante 12 horas concentrado y se agrega éter (10 ml) , las agujas Amarillo claro resultantes son recolectadas y lavadas con éter para dar 1.28 g del producto crudo.

EJEMPLO 3: Rescate de MC4R no plegado Usando Baja Temperatura Chaperonas Químicas Puesto que se sabe que tanto las bajas temperaturas (rescate térmico) como las chaperonas químicas en general como el DMSO restablecen el pliegue de proteínas mutantes, se evaluó la expresión en la superficie celular del natural y varios mutantes del pliegue de MC4R en células que contenían WT y MC4R mutante, y en aquellas células cultivadas a 30 °C o con 1% de DMSO.

Métodos Células y Transfección. Las células HEK 293 fueron transfectadas de manera transitoria con MC4R naturales (WT) o los siguientes mutantes de hMC4R marcados previamente con 3HA y Venus (Enhanced Yellow Green Fluorescent Protein; EYFP) : S58C; N62S; R165W; R165Q, y P299H.

Ensayo a Baja Temperatura. Las células WT transfectadas fueron incubadas a 30°C ó 37°C durante 12 horas antes de la evaluación de la expresión de MC4R en la superficie celular. La ganancia fue determinada usando los siguientes: Ganancia = [(% de expresión a la superficie a 30°C - % de expresión a la superficie a 37°C)/% de expresión a la superficie a 37°C] * 100.

Ensayo de Chaperona Química: Las células WT y transfectadas de manera transitoria fueron incubadas en presencia o ausencia de 1% de DMSO durante 12 horas antes de la evaluación de la expresión en la superficie celular del MC4R.

Análisis por FACS. El análisis por FACS fue efectuado después de marcar de manera fluorescente células con anticuerpo anti-HA.ll (ratón; dilución 1;1000) y el anticuerpo secundario acoplado a Alexa 647 (anti-ratón de cabra; dilución 1:1000). Las células vivas (negativas al yoduro de propidio) fueron clasificadas en los siguientes dos grupos relevantes: P : Células totales positivas YFP (representativas de la expresión total de MC4R) P5: Por ciento de células positivas para YFP y Alexa 647 (células positivas para Alexa y YFP) / (células positivas para YFP + células positivas para Alexa y YFP) (representativos de la expresión en la superficie celular) Resultados Expresión de MC4R en la Superficie Celular. La expresión Basal en la superficie de la expresión en la superficie de células WT alcanza el 90%. Ninguno de los mutantes expresó en la MC4R sobre la superficie celular de acuerdo a lo detectado por la unión de NDP-a-MSH marcado con 125I (no se muestran los datos) . Cuando se analizaron por FACS, todos los mutantes exhibieron una disminución significativa de expresión en la superficie cuando se compararon con células transfectadas con MC4R WT (no se muestran los datos) . Aproximadamente 90% de las células WT 3HA-hMC4R-Venus exhibieron expresiones en la superficie de MC4R (P5) , mientras que la expresión basada en la superficie sobre los mutantes fue de entre 12% y 18% para N62S, R165W, R165Q y P299H. S58C se exhibe una expresión en la superficie de aproximadamente el 40%.

Rescate Térmico. Los cinco mutantes exhibieron una ganancia en la expresión en la superficie celular de MC4R (P5) en la Tabla 2 como sigue: Tabla 2 Chaperona química: No se detectó una mejora significativa de expresión en la superficie celular en presencia de 1% de DMSO.

EJEMPLO 4: Rescate de MC4R no Plegado Usando Chaperonas Farmacológicas para MC4R Los compuestos antagonistas de MC4R descritos en la Figura 5 (compuesto 3) y Figura 6 (sal de HBr; compuesto 4) fueron evaluados respectivamente por la actividad de la chaperona en células que albergan los siguientes mutantes de MC4R: S58C; N62S; R165Q; R165W; y P299H.

Métodos Ensayo de Chaperona Farmacológica. De manera breve, las células que albergan cada uno de los mutantes de MC4R referidos anteriormente (transfectados como se describe en el Ejemplo 3) fueron retiradas con cada uno de los compuestos antagonistas a concentraciones de 1.0 µM y 10 µM durante 12 h y evaluadas por la expresión en la superficie celular de MC4R usando el análisis de clasificación celular activado por fluorescencia como se describió anteriormente.

Los niveles de expresión en la superficie celular son comparados entre las condiciones de tratamiento y básales. El por ciento de ganancia es determinada de acuerdo a lo siguiente: [Ganancias = [(% de expresión en la superficie (sin tratamiento) - % de expresión en la superficie (sin tratamiento) ) / % de expresión en la superficie (w/o sin tratamiento)] * 100.

Ensayo de Actividad MC4R. Se evaluó la acumulación de AMPc para mutantes de MC4R S58C, N62S, R165W y P299H en respuesta al tratamiento con el agonista de MC4R en NDP-MSH (10-7M) en presencia o ausencia de cada antagonista usando el Equipo de Ensayo de Fluorescencia de AMPc Catch Point de Molecular Devices (ensayo de células completas; Cat. No. R8044) . Los controles no fueron tratados únicamente con NDP-MSH. Resultados Rescate de la Chaperona Farmacológica. Como se muestra en la Tabla 3, más adelante, ambos agonistas fueron capaces de incrementar la expresión en la superficie de los mutantes de MC4R R165 W, S58C, y R165Q a ambas concentraciones de 1.0 µM y 10 µM, con un efecto dependiente de la dosis. Como se indicó anteriormente, la expresión basada en la superficie sobre los mutantes fue de entre 12% y 18% para N62S, R165W, R165Q y P299H. El S58C se exhibe una expresión en la superficie de aproximadamente el 40%. De manera inesperada, el tratamiento con 10 µM de cada compuesto pudo establecer la expresión en la superficie celular del MC4R R165 W a un nivel idéntico a las células que expresen el MC4R natural . Para el mutante N62S, no se observó efecto a 1.0 µM con cualquiera de los compuestos, aunque se observó una ganancia en por ciento significativa en la expresión en la superficie celular del mutante MC4R con ambos compuestos a la concentración de 10 µM. El compuesto descrito en la Figura 5 es más potente, es decir, que se observó más expresión en la superficie celular que con el compuesto mostrado en la Figura 6. Para el mutante P299H, el compuesto mostrado en la Figura 6 no tuvo efecto sobre el reestablecimiento de la expresión en la superficie celular del receptor mutante a 1.0 µM o 10 µM, y únicamente se observó un pequeño efecto con el compuesto mostrado en la Figura 5 a 10 µM.

Tabla 3 Esos resultados demuestran que los mutantes de MC4R pueden ser "rescatados" cuando se pongan en contacto con bajas concentraciones antagonistas de MC4R, las cuales actúan como chaperonas farmacológicas para reestablecer la expresión en la superficie celular. Finalmente, un compuesto de bisaminotiazol descfrito en Pedemonte et al., J Clin . Inves . 2005; 115: 2564-71 (Fig. 9) demostró un pequeño efecto sobre los mutantes S58C (ganancia de 31.25%) y R165W (ganancia de 28.95%). Actividad de MC4R. Como se muestra en la Figura 11, la recuperación de la señalización a través del MC4R fue observada en el mismo grado que hMC4R WT en S58C y R165W después del tratamiento con ambos antagonistas a 10 µM. La capacidad de señalización en el mutante MC4R N62S también fue reportado en un menor grado. No se reestableció la señalización en el P299H, como se esperaba, puesto que esta mutación es un dominio necesario para el acoplamiento de proteína G.

EJEMPLO 5: Selección de Chaperonas para MC4R que Reestablecen la Estabilidad y Actividad de MC4R Mutantes o Incrementan la Estabilidad de MC4R Natural Este ejemplo describe un método para seleccionar compuestos de chaperonas para MC4R para mejorar el mutante mal plegado o expresión en la superficie celular natural y/o actividad en MC4R.

Métodos Transfección de MC4R mutante o natural. La identificación de mutantes de MC4R de pliegue/tráfico es lograda como se describe en el Ejemplo 1. La transfección de esos MC4R mutantes de pliegue y/o naturales se logra como se describió anteriormente, o usando cualesquier métodos conocidos en la técnica para detectar la expresión en la superficie celular de proteínas, incluyendo inmunoensayos como el ELISA y análisis FACS. Administración de Chaperona. Los cultivos o arreglos de células que expresan MC4R natural o células que expresan mutantes de pliegue de MC4R se agregaron varias concentraciones de compuestos de prueba chaperonas. Entonces se determinó la ubicación celular del MC4R además de la actividad del MC4R que transitó hacia la superficie celular.

Por ejemplo, los compuestos de prueba basados en piperacina-, piperidina-, 1, 4-diazapan- , guanidina- u otros como se describe por ejemplo en las siguientes se seleccionaron: Bednarek and Fong, Exp Opn Ther Patents 2004; 14: 327-36; Ujjainwalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 4431-4435; WO03/07949; WO03/61660; WO03/09847; WO03/09850; WO03/31410; WO03/94918; WO03/68738; WO03/92690; WO03/93234; WO03/72056; WO03/66597; WO03/66587; WO03/53927; WO02/67869; WO02/68387; WO03/68738; WO02/00259; WO02/92566; WO02/81443; WO02/81430; y WO02/80896. Detección del Tráfico de MC4R hacia la Superficie Celular. La detección de la localización celular y/o la superficie celular de las células que expresan MC4R tratadas con compuesto en comparación con las células no tratadas se efectuó como se describió anteriormente. Detección de la Actividad de MC4R Midiendo la Acumulación de AMPc. 48 h después de la transfección, las células son lavadas una vez con PBS y entonces desprendidas de la placa con PBS que contiene EDTA al 0.02% (Sigma). Las células desprendidas son cosechadas por centrifugación y resuspendidas en solución salina balanceada de Hanks (Invitrogen) que contiene IBMX, 0.5 mM, HEPES 2 mM, pH 7.5 (amortiguador de IBMX) . Después de la incubación a 37 °C durante 15 min para permitir una absorción de IBMX, se agregan 0.4 ml de la suspensión celular (aproximadamente 5 x 105 células/ml) a 0.1 ml de amortiguador de IBMX que contiene varias concentraciones de agonistas (por ejemplo, [Nle4-D- Phe7] -MSH (NDP-MSH) , a-MSH) , u otras chaperonas candidatas o forscolina 10 µm. Lasa células son incubadas posteriormente a 37°C durante 15 min para permitir la acumulación de AMPc. La actividad es terminada agregando 0.5 ml de ácido tricloroacético al 5%, y el AMPc liberado de las células lisadas es ensayado por el sistema de ensayo de proximidad de destellos de 125I AMPc (Amersham Biosciences) . Los valores de CE50 son calculados con un intervalo de confianza del 95% usando el programa GraphPad Prism (usando análisis de regresión no lineal ajustado con una curva de respuesta sin moldear con pendiente variable) .

EJEMPLO 6 : Administración de una Sola Dosis de DGJ para Evaluar la Seguridad, Tolerancia, Farmacocinética, y Efectos sobre la Actividad Enzimática de la a-Galactosidasa A Este ejemplo describe un estudio Fase I controlado con placebo aleatorizado, doblemente ciego de una dosis oral dos veces al día de DGJ para evaluar los efectos de seguridad, tolerancia, farmacocinética y actividad enzimática de a-Galactosidasa A (a-Gal A) de DGJ en voluntarios sanos. Diseño y Duración del Estudio : este estudio fue el primer estudio en humanos controlado con placebo en un solo centro, fase I, aleatorizado doblemente ciego con una dosis de dos veces al día para evaluar los efectos de seguridad, tolerancia, farmacocinética y actividad enzimática de a-Gal A del DGJ después de la administración oral. El estudio probó dos grupos de 8 (6 activos y 2 con placebo) que recibieron una dosis dos veces al día de 50 ó 150 mg de DGJ o placebo administrada oralmente durante 7 días consecutivos, acompañada por una visita de seguimiento al séptimo día. Los sujetos fueron alojados en instalación de tratamiento durante 14 horas antes de la dosificación hasta 24 horas después de la dosificación. Los alimentos fueron controlados por medio de un programa y los sujetos permanecieron ondulatorios durante 4 horas después de la administración de fármaco. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos para DGJ en plasma el Día 1 y el Día 7. Además, se calculó el porcentaje acumulativo de DGJ expresado (12 horas después de la dosis) en orina. Se calculó la actividad en células sanguíneas blancas (WBC) antes de comenzar la dosificación, y nuevamente antes de la 100 horas, 150 horas, y 336 horas en el ensayo. Población de Estudio : Los sujetos eran voluntarios masculinos sanos, no institucionalizados, no fumadores de entre 19 y 50 años de edad (inclusive) consistiendo de miembros de la comunidad a la postre. Evaluaciones de Seguridad y Tolerancia: LA seguridad fue determinada evaluando los signos vitales, parámetros de laboratorio (química del suero, hematología y urianálisis) , ECG, examinación física y registro de efectos adversos durante el periodo de tratamiento.

Muestreo farmacocinético: las muestras de sangre (10 mL cada una) fueron recolectadas en tubos de recolección de sangre que contenían EDTA antes de la dosificación y a los siguientes tiempos posteriormente: 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 horas. Las muestras de sangre fueron recolectadas en un baño de hielo y centrifugadas bajo refrigeración tan pronto como fue posible. Las muestras de plasma fueron divididas en dos alícuotas y almacenadas a 20 ± 10°C pendientes para el ensayo. Al final del estudio todas las muestras fueron transferidas a MDS Pharma Services Analytical Laboratories (Lincoln) para su análisis. La salida de orina completa fue recolectada para su efecto para el análisis de DGJ para determinar la eliminación renal durante las primeras 12 horas después de la administración de DGJ los días 1 y 7. Muestreo de la Actividad Enzimática de WBC a-GAL A. Se recolectaron muestras de sangre (10 mL cada una) en tubos de recolección de sangre que contenían EDTA y se extrajeron la WBC antes de la precipitación y a los siguientes tiempos posteriormente: 100 horas, 150 horas, y 336 horas. Las muestras fueron tratadas como se describió anteriormente y se determinaron los niveles de actividad enzimática de a-Gal A en WBC. Análisis estadístico. Los datos de seguridad incluyendo las evaluaciones de laboratorio, exámenes físicos y datos adversos, verificación de ECG y evaluaciones de signos vitales que se unieron por el grupo de tratamiento y punto en el tiempo de la recolección. Se calcularon las estadísticas descriptivas (media aritmética, desviación estándar, mediana, mínimo y máximo) para datos recibidos cuantitativos así como para la diferencia con el basal. Se recopilaron conteos de frecuencia para la clasificación de los datos de seguridad cuantitativos. Los eventos adversos fueron purificados usando diccionario MedDRA versión 7.0 resumidos por tratamiento por el número de sujetos reportando el evento adverso y el número de eventos adversos reportados. Se proporcionó una lista de datos de eventos adversos por sujetos que incluye el término taquigráfico, término codificado, grupo de tratamiento, severidad y relación con el tratamiento. Las medicaciones concomitantes y la historia médica se listaron por tratamiento. Los parámetros farmacocinéticos fueron recibidos por grupo de tratamiento usando estadísticas descriptivas (medios aritméticos, desviaciones estándar, coeficiente de variación, tamaño de muestra, mínimo, máximo y mediana) .

Resultados Los sujetos tratados con placebo no tuvieron un efecto adverso (AE) y los sujetos no presentaron AE después de recibir 50 mg b.i.d. o 150 mg b.i.d. de DGJ. El DGJ parece ser seguro y bien tolerado por este grupo de sujetos masculinos sanos y las dosis fueron administradas a 50 mg b.i.d. y 150 mg b.i.d. Ocurrieron desviaciones del laboratorio de los intervalos normales después de la dosificación, pero ninguna se juzgó clínicamente significativa. No hubo desviaciones de datos medios clínicamente relevantes en cualquier parámetro investigado a través del curso del estudio. No ocurrió anormalidad clínicamente relevante en un ningún signo vital, ECG, o parámetro de examen físico.

Evaluación Farmacocinética . La siguiente tabla resume los datos farmacocinéticos obtenidos durante el estudio. Tabla 4. a Porcentaje acumulativo de DGJ excretado durante 12 horas después del periodo de dosificación. La farmacocinética de DGJ fue bien caracterizada en todos los sujetos y a todos los niveles de dosis. El promedio, ocurrió en concentraciones pico a aproximadamente 3 horas para todos los niveles de dosis . La Cmax del DGJ se incrementó en una forma proporcional a la dosis cuando las dosis se incrementaron de 50 mg a 150 mg. Las vidas medias de eliminación promedio (t._) fueron comparables a los niveles de dosis de 50 y 150 mg el Día 1 (2.5 contra 2.4 horas) . El porcentaje medio de DGJ excretado durante las 12 horas posteriores al periodo de dosificación fue de 16% y 42% a niveles de dosis de 50 mg y 150 mg, respectivamente, el día 1, incrementándose a 48% y 60%, respectivamente, el Día 7. Actividad enzimática de a-Galactosidasa A (a-Gal A) . Los datos de la actividad enzimática de a-Gal A obtenidos durante el estudio se muestran en la Figura 1. DGJ no inhibió la actividad enzimática de a-Gal A en WBC en sujetos a dosis de 50 mg b.i.d. o 150 mg b.i.d. Además, DGJ produjo una tendencia dependiente de la dosis de incremento de a-Gal A en WBC en voluntarios sanos. La actividad enzimática de a-Gal A fue medida en WBC a sujetos a los que se les administró placebo, 50 mg b.i.d., y 150 mg b.i.d. de DGJ. El placebo no tuvo efecto sobre la actividad enzimática de a-Gal A en WBC.

Las variaciones en la actividad enzimática a la respuesta al placebo no fueron clínicamente significativas. 50 mg b.i.d. y 150 mg b.i.d. de DGJ incrementó la actividad enzimática de a-Gal A en WBC normalizada. En respuesta a 50 mg b.i.d. de DGJ, la actividad enzimática de a-Gal A en WBC se incrementó hasta 120%, 130%, y 145% de los niveles previos a la dosis a las 100 horas, 150 horas, y 336 horas después de la dosis, respectivamente. En respuesta a 150 mg b.i.d. de DGJ, la actividad enzimática de la a-Gal A en WBC se incrementó hasta 150%, 185%, y 185% de los niveles previos en la dosis a las 100 horas, 150 horas, y 336 horas después de la dosis, respectivamente. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas aquí. En realidad, varias modalidades de la invención además de aquellas descritas aquí serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las Figuras acompañantes. Esas modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos y protocolos se citan a través de esta aplicación, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para mejorar la actividad de un polipéptido de MC4R, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula que expresa MC4R con una chaperona farmacológica que se une al polipéptido MC4R en una cantidad efectiva para incrementar la actividad del MC4R. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido MC4R es un polipéptido de MC4R natural .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido de MC4R tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, y SEQ ID NO : 8.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de MC4R es un polipéptido mutante de MC4R.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante comprende una mutación asociada con el pliegue erróneo del polipéptido de MC4R.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste de P78L, R165Q, Rl 65 W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, and P299H.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante es R165Q, R165W, S58C, N62S, o P299H.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica es un antagonista de MC4R.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antagonista de MC4R tiene una estructura como se expone en la Figura 5 o la Figura 6.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica se une al polipéptido de MC4R que se está plegando en una conformación funcional .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad mejorada por la chaperona farmacológica es la activación de la adenilil ciclasa.
12. 12. Un método para mejorar la expresión en la superficie celular de un polipéptido de MC4R, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula que expresa MC4R con una chaperona farmacológica que se une al polipéptido de MC4R en una cantidad efectiva para incrementar la expresión de MC4R en la superficie celular.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la chaperona farmacológica se disocia del polipéptido de MC4R cuando se pliega en su conformación funcional.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R natural .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido de MC4R tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO : 8.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R mutante.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante comprende una mutación asociada con pliegue erróneo del polipéptido de MC4R.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste de P78L, R165Q, R165W, I125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, 1316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, y P299H.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de MC4R mutante es R165Q, R165W, S58C, N62S, O P299H.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la chaperona farmacológica es un antagonista de MC4R.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el antagonista de MC4R tiene una estructura como se expone en la Figura 5 o la Figura 6.
22. 22. Uso de una chaperona farmacológica que se une al polipéptido de MC4R para incrementar la estabilidad, para elaborar un medicamento para tratar a un individuo que necesita un incremento en la estabilidad de un polipéptido de MC4R.
23. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la chaperona farmacológica es un antagonista de MC4R que tiene una estructura como se expone en la Figura 5 o la Figura 6.
24. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la chaperona farmacológica incrementa el tráfico del polipéptido de MC4R hacia la membrana celular.
25. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el individuo es obeso o está en riesgo de ponerse obeso.
26. 26. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el individuo comprende una mutación en un agente MC4R el cual ha sido asociado con la obesidad.
27. 27. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la chaperona farmacológica es administrada en un soporte farmacéuticamente aceptable.
28. 28. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R natural.
29. 29. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R mutante .
30. 30. Un método para identificar una chaperona farmacológica para un MC4R, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una mezcla de reacción que comprende una célula o extracto celular que expresa un polipéptido de MC4R, donde las condiciones de la mezcla de reacción permiten la unión de los compuestos de prueba al polipéptido de MC4R; (b) detectar la estabilidad, actividad o ubicación en la superficie celular del polipéptido de MC4R en la mezcla de reacción en presencia del compuesto de prueba; y (c) comparar la estabilidad, actividad o ubicación en la superficie celular del polipéptido de MC4R en presencia del compuesto de prueba con la estabilidad, actividad o ubicación en la superficie celular del polipéptido de MC4R en ausencia del compuesto de prueba, donde la detección de la mejor estabilidad, actividad o ubicación de la superficie celular en presencia del compuesto de prueba con relación a la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es una chaperona farmacológica para el MC4R.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R natural .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polipéptido de MC4R comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polipéptido de MC4R es un polipéptido de MC4R mutante.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el polipéptido de MC4R comprende una mutación asociada con el pliegue erróneo del polipéptido de MC4R.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34 , caracterizado porque la mutación del MC4R es seleccionada del grupo que consiste de P78L, R165Q, R165W, 1125K, C271Y, T11A, A175T, I316L, I316S, I317T, N97D, G98R, N62S, C271R, S58C, N62S, N97D, Y157S, I102S, L106P, L250Q, Y287X, P299H, y S58C, con relación a las secuencias polipeptídicas de MC4R naturales como se expone en la SEQ ID NO: 2.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la mezcla de reacción se basa en células .
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la mezcla de reacción está libre de células .
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende además detectar la actividad de un polipéptido de MC4R localizado en la superficie celular.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la actividad detectada es la activación de AMPc.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica tiene una estructura como se describe en la Figura 13.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica tiene una estructura como se describe en la Figura 14.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica tiene una estructura como se describe en la Figura 15.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la chaperona farmacológica tiene una estructura como se describe en la Figura 16.