MX2007013831A - Marcador de diagnostico para complicaciones vasculares diabeticas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al descubrimiento que CTGF es un marcador de diagnostico indicativo de riesgo incrementado para desarrollo y progreso de enfermedad vascular.

Description

MARCADOR DE DIAGNOSTICO PARA COMPLICACIONES VASCULARES DIABÉTICAS Campo de la Invención La presente invención se refiere al descubrimiento que el CTGF es un marcador de diagnóstico indicativo de riesgo incrementado de desarrollo y progreso de enfermedad vascular. Antecedentes de la Invención La diabetes mellitus esta asociada con movilidad y mortalidad incrementada, derivada principalmente de complicaciones cardiovasculares. El progreso de las lesiones vasculares se mejora en el estado diabético y se acentúa grandemente este riesgo por la hipertensión coexistente. (Christlieb et al (1981) Diabetes 30 (Suppl 2):90-96; Krolewski et al (1988) N Engl J Med 318:140-145). Aún están sin definir los mecanismos por los cuales la diabetes y la hipertensión co-segregan y aceleran el daño vascular. Ambas condiciones se asocian con disfunción endotelial, acumulación de células inflamatorias, proliferación y migración de células del músculo liso vascular (VSMC) , y de depósito de matriz extracelular en la pared del vaso. (Ver Ross (1993) Nature 362:801-809; Clowes y Karnovsky (1977) Nature 265:625-626; Clowes et al (1983) Lab Invest 49:327-333; y Jackson and Schwartz (1992) Hypertension 20:713-736). REF. §187541 El desarrollo de micro- y macro-albuminuria en individuos diabéticos y no diabéticos aumenta el riesgo de desarrollo de enfermedad macrovascular . Los pacientes diabéticos tipo 1 con proteinuria tienen un riesgo de enfermedad macrovascular incrementado diez veces con relación aquel de los pacientes del tipo 1 sin proteinuria. La relación de la microalbuminuria a las complicaciones de la enfermedad vascular tal como espesor de la intima-media de la carótida (IMT) se ilustró recientemente en el cohorte DCCT/EDIC de pacientes diabéticos tipo 1 (The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes and Complications Research Group (2003) N Engl J Med 348:2294-2303). La enfermedad renal diabética se asocia con elevaciones de presión sanguínea y dislipidemia, condiciones que preceden y aceleran típicamente el progreso de enfermedad vascular en pacientes diabéticos (Perkins et al (2003) N Engl J Med 348:2285-2293). Sumario de la Invención El CTGF se identificó originalmente como un producto de células endoteliales de vena umbilical humana que fue tanto quimiotáctico como mitogénico para los fibroblastos (Ver, por ejemplo Bradham et al (1991) J Cell Biol 114:1285-1294 y Patente de los Estados Unidos No. 5,408,040). El CTGF corresponde a una familia génica, CCN, nombrada después miembros prototipos de esta familia, CTGF, Cyrßl, y Nov (Bork (1993) FEBS Lett 327:12-130). El peso molecular de factores tipo CTGF varía entre 35-40 kDa, y la estructura de estas moléculas consiste de cuatro módulos: un dominio N-terminal tipo IFGBP, un dominio de repetición tipo C de factor de Von Willebrand, un dominio de repetición tipo 1 de trombospondina, y un dominio de dimerización C-terminal (Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130). El CTGF se caracteriza por 38 residuos de cisteina conservados que constituyen más de 11 % de su contenido total de aminoácidos. Las cisteinas codificadas dentro de cada uno de los cuatro exones de la proteína segregada están apareadas internamente conduciendo la creación de dominios amino- y carboxi-terminales unidos por un péptido de 32 aminoácidos, sensible a proteasa y flexible, corto (Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130). El CTGF se escinde fácilmente dentro de la llamada región de "charnela" que da por resultado el fragmento amino-terminal de CTGF (fragmento N de CTGF; ver Publicación Internacional No. WO 00/035936), la forma predominante de CTGF presente en la sangre y orina. Puesto que los cambios en el nivel en plasma del fragmento N de CTGF son predictivos del grado de activación y producción de CTGF, el presente estudio se llevó a cabo para determinar si los niveles de circulación de CTGF y fragmento N de CTGF marcan un riesgo incrementado de desarrollo de enfermedad vascular y renal en agentes diabéticos tipo 1. Por lo tanto, la presente invención proporciona un marcador de diagnóstico indicativo de riesgo incrementado de desarrollo y progreso de enfermedad vascular. Breve Descripción de la Figura La Figura 1 muestra distribución acumulativa de logaritmo (log) de fragmento N de CTGF por estado hipertenso. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un método para diagnosticar un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes en un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener diabetes, el método que comprende obtener una muestra biológica del sujeto, medir el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en esa muestra biológica, y comparar el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en la muestra biológica a niveles normales de CTGF o del fragmento de CTGF, donde un nivel elevado de CTGF o de fragmento de CTGF en la muestra biológica es indicativo de un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes. Típicamente, el sujeto que tiene o esta en riesgo de obtener diabetes es un sujeto humano. En algunas modalidades, la complicación vascular es una complicación macrovascular o una complicación microvascular. En particular, la complicación vascular puede ser una complicación cardiovascular o una complicación cerebrovascular; o una complicación de la vasculatura periférica. En algunas modalidades, la complicación vascular es espesor de la intima-media de la carótida. Típicamente, el nivel del fragmento de CTGF o del CTGF en la muestra biológica es detectable y cuantificable usando un ensayo descrito en la Publicación Internacional No. WO 03/024308. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra derivada de los fluidos corporales. En particular, la muestra biológica es orina o plasma . En modalidades preferidas, el sujeto tiene diabetes tipo 1. Este sujeto también puede tener presión sanguínea incrementada o microalbuminuria. Se va a entender que la invención no se limita a las metodologías, protocolos, líneas celulares, ensayos, y reactivos particulares descritos en la presente, puesto que pueden variar. También se va a entender que la terminología usada en la presente se propone que describa modalidades particulares de la presente invención, y no se propone de ningún modo que limite el alcance de la presente invención como se expone en las reivindicaciones anexas . Se debe señalar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el (la)" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, una referencia a "un fragmento" incluye una pluralidad de estos fragmentos, una referencia a un "anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes del mismo conocidos por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde esta invención. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente, en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describe los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para el propósito de describir y exponer las metodologías, reactivos y herramientas reportadas en las publicaciones que se pueden usar en unión con la invención. Nada en la presente se va a considerar como una admisión que la invención no esta facultada para anteceder esta descripción por virtud de una invención anterior. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. , Mack Publishing Co . ; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y CC. Blackwell, eds., 1986, Blackwell, Scientific Publications) ; Maniatis, T. et al., eds, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press) ; PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag) . La presente invención se refiere al descubrimiento que CTGF es un marcador de diagnóstico indicativa de riesgo incrementado de desarrollo y progreso de enfermedad vascular. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes en un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener diabetes, el método que comprende obtener una muestra biológica del sujeto, medir el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en esa muestra biológica, y comparar el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en la muestra biológica a niveles normales de CTGF o del fragmento de CTGF, donde un nivel elevado de CTGF o del fragmento de CTGF en la muestra biológica es indicativo de un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes . En modalidades preferidas de la presente invención, el sujeto que tiene o esta en riesgo de tener diabetes es un sujeto humano. Si un sujeto tiene o esta en riesgo de tener diabetes se puede determinar por cualquier medida aceptada y utilizada por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, un sujeto humano que tiene un nivel de glucosa en sangre por arriba de aproximadamente 200 mg/dL (por ejemplo, como se determina en una prueba de glucosa en sangre en ayuno, una prueba de tolerancia glucosa oral, una prueba de glucosa en sangre al azar) se puede caracterizar como un sujeto que tiene diabetes. Por lo tanto, en ciertos aspecto, se contempla que un sujeto humano que tiene un nivel de sangre en glucosa por arriba de aproximadamente 200 mg/dL es un sujeto adecuado para tratamiento con los métodos de o uso de medicamentos proporcionados por la presente invención. Un sujeto en riesgo de tener diabetes, por ejemplo, un sujeto humano en riesgo de tener diabetes, ee puede identificar por una valoración de uno o más de los varios factores conocidos que están asociados con un riesgo incrementado de desarrollar diabetes, incluyendo historia familiar de diabetes, ciertos grupos étnicos o raciales, una historia de diabetes gestacional, obesidad, en particular, altos niveles de grasa visceral o abdominal, un estilo de vida sedentario, edad, alta presión sanguínea, esquizofrenia, etc., así como metabolismo alterado de glucosa, incluyendo tolerancia deteriorada a glucosa (IGT) o prediabetes . En ciertas modalidades, la complicación vascular es una complicación macrovascular; en otras modalidades, una complicación microvascular. En varias modalidades, la complicación se selecciona del grupo que consiste de una cardiopatía, una nefropatía, una neuropatía y una retinoptía. En una modalidad, la complicación es una complicación cardiovascular o una complicación cerebrovascular. En otra modalidad, la complicaciones una complicación de la vasculatura periférica. En modalidades preferidas de los presentes métodos, la medición del nivel del fragmento de CTGF o del CTGF en la muestra biológica consiste en detectar y cuantificar los niveles de CTGF o de un fragmento de CTGF usando cualquiera de los varios ensayos descritos en la Publicación Internacional No. WO 03/024308, referencia que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. (Ver, por ejemplo, Ejemplo 5 en la Publicación Internacional No. WO 03/024308) . La muestra biológica es, en aspectos preferidos, una muestra derivada de fluidos corporales, secreciones, tejidos o células, incluyendo, pero no limitado a, saliva, sangre, orina, suero, plasma, vitreo, etc. Se examinó la pertinencia y significado del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) como un marcador de diagnóstico indicativo de riesgo incrementado de desarrollo de complicaciones vasculares en pacientes diabéticos en un estudio transversal. Se estudiaron los niveles de circulación (es decir, en plasma) y urinarios de CTGF y de fragmento N de CTGF en 1,050 pacientes . diabéticos tipo 1 del cohorte de Ensayo de Control y Complicaciones de Diabetes/Estudio de Epidemiología de Intervenciones y Complicaciones en Diabetes (DCCT/EDIC) . Se encontró que los sujetos diabéticos hipertensos tienen niveles significativamente mayores de log en plasma de fragmento N de CTGF que los sujetos normotensos (3±0.04 ng/ml vs 3.21±0.03 ng/ml, P = 0.0005). El análisis por regresión determinó que los niveles del fragmento N de CTGF correlacionaban de manera positiva y significativa con presión sanguínea sistólica como variables continuas (P<0.0001). El análisis de regresión univariable y multivariable mostró una asociación positiva independiente de entre los niveles del fragmento de CTGF y el log de la velocidad de excreción de albúmina (AER) (P<0.0001). En análisis categóricos, los pacientes con macroalbiminuria tienen un nivel significativamente mayor del fragmento N de CTGF que los sujetos diabéticos microalbuminúricos con un normoalbuminuricos (P<0.0001). El análisis de regresión univariable y multivariable demostró que log de fragmento N de CTGF se asocio independiente y significativamente con el espesor intima-media de carótida común (IMT), un marcador sustituto para enfermedad macrovascular (P<0.0428). Finalmente, el riesgo relativo (RR) para IMT de carótida incrementado que es mayor en pacientes con niveles elevados del fragmento N de CTGF y magroalbuminura que en pacientes con fragmento N-CTGF en plasma normal y albuminuria Normal (RR = 4.76; 95 % intervalo de confianza de 95 %, 2.21 -10.25, P < 0.0001) . Los presentes hallazgos demuestran que, en sujetos diabéticos tipo 1, los niveles del fragmento N de CTGF se elevan en asociación con presión sanguínea incrementada; se correlacionan independientemente con AER y se elevan categóricamente en pacientes con macroalbuminuria; se asocian independientemente con IMT de carótida; y se asocian positivamente con IMT mayor. Por lo tanto, los niveles en plasma de CTGF son un marcador de riesgo de enfermedad vascular diabética. Los presentes hallazgos muestran una asociación positiva, significativa entre los niveles de plasma de CTGF y lipoproteína de baja densidad (LDL) , demostrando que LDL puede modular los niveles de CTGF en pacientes diabéticos . Adicionalmente, los reportas anteriores han mostrado que la expresión de CTGF en células endotelialee aórticas humanas de células mesangiales se induce por LDL (Sohn et al (2005) Kidney Int 67:1286-1296). La inducción de CTGF por LDL en células mesangiales se midió mediante activación autocrina que TGF-ß y vía activación de cinasa NH2-terminal c-Jun (Sohn et al (2005) Kidney Int 67:1286-1296), sugiriendo que CTGF proporciona una ruta a través de la cual las lipoproteínas pueden promover la esclerosis vascular en diabetes. La microalbuminuria, o marcador de nefropatía diabética en pacientes diabéticos tipo 1, significa alto riesgo para falla y enfermedad renal progresiva. La microalbuminuria se ha asociado con mortalidad cardiovascular incrementada en poblaciones de sujetos tanto diabéticos como no diabéticos y también esta asociada con disfunción endotelial glomerular y generalizada (Stehouwer et al (1992) Lancet 340:319-323). Identificación de biomarcadores que contribuyen al desarrollo de microalbuminuria puede proporcionar entendimiento de los mecanismos de la agresión vascular diabética. Como se muestra en la presente, los niveles del fragmento N de CTGF en plasma y orina de pacientes con macroalbuminuria fueron dos veces mayores que los niveles en pacientes con microalbuminuria o con una velocidad normal de excreción de albúmina. Estos hallazgos sugieren que CTGF es un marcador para nefropatia progresivo. Los análisis de regresión univariables y multivariables revelaron asociaciones independientes y positivas entre los fragmentos N de CTGF y la AER. Estos hallazgos están de acuerdo con los reportes anteriores de la literatura que demuestra una asociación entre el fragmento N de CTGF y la AER y llevada a cabo en un número mucho más pequeño de pacientes diabéticos tipo 1. (Ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 03/024308). Los presentes ejemplos proporcionan la primera evidencia de una asociación entre el fragmento N de CTGF y presión sanguínea diastólica y sistólica elevada. Estos datos demuestran que sujetos diabéticos con hipertensión documentada a pesar de su presión sanguínea actual o uso de medicamentos anti-hipertensión, presentan un nivel significativamente mayor de fragmento N de CTGF en plasma que los sujetos diabéticos normotensos. Este hallazgo es de significado debido a que el riesgo de lesión renal progresiva y enfermedad cardiovascular en diabetes se acentúa por hipertensión. Los estudios que tienen como finalidad controlar la presión sanguínea con inhibidores de ACE (ACEI) han demostrado desaceleradas significativamente el desarrollo de lesión renal diabética (Lweis et al (1993) N Engl J Med 329:1456-1462). Los efectos benéficos conferidos con la terapia de ACEI se pueden atribuir ya sea una disminución en la conversión de algiotensina I a la angiotensina II o a la disminución en la degradación de bradiquinina (Gainer et al (1998) N Engl J. Med. 339:1285-1292). Se ha mostrado un incremento significativo en los niveles en plasma del fragmento de N de CTGF en pacientes diabéticos tratados con ACEI . Este incremento en los niveles de CTGF en plasma en respuesta a la terapia con ACEI se puede atribuir a la potenciación de los niveles de bradiquinina en lugar de una disminución en la formación de angiotensina II. A este respecto, los presentes estudios de muestras (datos no mostrados) que la bradiquinina induce la expresión de CTGF en células endoteliales aórticas humanas así como células del músculo liso vascular y esta regulación se medía mediante activación autocrina de TGF-ß. La presente invención demuestra además una asociación independiente y positiva entre los niveles en plasma del fragmento N de CTGF y el espesor de intima-media de carótida interna, marcadores reconocidos para enfermedad vascular coronaria así como cerebral en pacientes con diabetes tipo 1 (The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes and Complications Research Group (2003) N Engl J Med 348:2294-2303). Dada la asociación entre la hiperglicemia y la hiperlidemia con el espesor de intima-media y la influencia de LDL e hiperglicemia en la regulación de CTGF, el CTGF puede ser una ruta mecanística a través de la cual las lipoproteínas y la hiperglicemia median sus efectos perjudiciales al promover lesión vascular en pacientes diabéticos. En resumen, los hallazgos en el presente estudio demuestran que los niveles en plasma del fragmento de N de CTGF son un marcador de riesgo independiente para enfermedad vascular en pacientes con diabetes tipo 1, y que el CTGF sirve como un marcador de diagnóstico indicativo de riesgo incrementado de desarrollo y progreso de enfermedad vascular. Ejemplos La invención se entenderá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se propone que sean solo de ejemplo de la invención. Estos ejemplos se proporcionan solo para ilustrar la invención reivindicada. La presente invención no se limita en el alcance por las modalidades ejemplificadas, que se proponen como ilustraciones de aspectos individuales de la invención únicamente. Cualquier método que sea funcionalmente equivalente dentro del alcance de la invención. Varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente llegarán hacer evidentes por aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras anexas. Estas modificaciones se proponen que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1: Métodos del Presente Estudio Se usaron los siguientes métodos en los presentes estudios: Población de Estudio La población de estudio fue el cohorte DCCT/EDIC de Norteamérica, comprendido de 1,325 pacientes diabéticos tipo 1 de los 1,441 sujetos originales de DCCT. El cohorte de DCCT original (Ensayo de Control y Complicaciones de Diabetes) consistió de hombres y mujeres entre las edades de 13-40 años con 1-15 años de diabetes a la entrada del estudio (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986), enrolados entre 1983 y 1989. La mitad de la población de pacientes se asignó al asar al tratamiento convencional de diabetes y la otra mitad se asignó al tratamiento intensivo de diabetes. En 1993, el estudio de DCCT se detuvo después de un tiempo promedio de seguimiento de 6.5 años, cuando se mostró claramente que el tratamiento intensivo reduce los riesgos de retinopatía, nefropatía y neuropatía (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986). Los pacientes entonces se invitaron a enrolarse en el EDIC, un estudio observacional longitudinal multicentro del desarrollo de complicaciones macrovasculares y progreso adicional de complicaciones microvasculares (EDIC Research Group (1999) Diabetes Care 22:99-111). En la línea base de EDIC en 1994, la edad promedio del cohorte de DCCT/EDIC fue de 35 años (intervalo 19-50 años) . Cincuenta por ciento del cohorte fueron varones, y la distribución media de la diabetes fue de 12 ± 5 años. Las muestras de plasma en ayuno se recolectaron en los sujetos para las mediciones de CTGF y se enviaron directamente a las clínicas de EDIC participantes a la Medical University of South Carolina (MUSC) . La junta de revisión institucional de la MUSC y todas las clínicas participantes de DCCT/EDIC aprobaron el estudio, y se obtuvo el consentimiento informado escrito de cada paciente participante. Procedimientos de EDIC En el aniversario aproximado del enrolamiento del DCCT, cada sujeto de EDIC tiene una historia anual estandarizada y examen físico, incluyendo una evaluación detallada de salud general, manejo de diabetes, ocurrencia de complicaciones diabéticas, desarrollo de nuevas enfermedades, y medicamentos usados. Las evaluaciones anuales incluyeron HbAlc, electrocardiogramas en reposo, y mediciones de presión sanguínea (BP) en brazo. Las mediciones de presión sanguínea y de HbAlc se realizaron al mismo tiempo del muestreo sanguíneo. Se midió la presión sanguínea en el brazo derecho usando un esfigmomanómetro de columna de mercurio en tanto que el paciente estaba en la posición sentada. Se valoró la función renal cada segundo año e incluyó mediciones de la velocidad de excreción de albúmina urinaria (AER) en una colección estandarizada de 4 horas. (Ver The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986). Se define la microalbuminuria por el DCCT como una AER 40-299 mg/24 horas, y la macroalbuminuria como una AER > 300 mg/24 h. La excreción normal de albúmina se define como una AER < 40 mg/24 h. Aproximadamente noventa y ocho por ciento de todas las mediciones de AER se llevaron a cabo en el espacio de un año del muestreo sanguíneo. Ultrasonografía y Análisis por Imágenes Se llevó a cabo la ultrasonografía de la carótida en 1,325 pacientes (92 % del cohorte original de DCCT) como parte del examen de línea base de EDIC y se realizó entre Junio de 1994 y Abril de 1995 (2 años antes de las métodos de CTGF) como se describe anteriormente (Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (EDIC) . Research Group (1999) Diabetes 48:383-390).

Medición de CTGF Se midió CTGF en plasma y orina usando ensayos de ELISA descritos anteriormente. (Ver, por ejemplo, publicación internacional número WO 03/024308, a todo lo largo de la especificación, referencia que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . (Ver Gilbert et al (2003) Diabetes Care 26:2632-2636). De forma breve, se usaron pares de anticuerpos monoclonales específicos de CTGF para construir dos diferentes ELISA diseñados para capturar y detectar CTGF entero (ensayo W) o fragmentos de CTGF N-terminales + CTGF entero (ensayo de N+W) . En el ensayo, se revistieron placas de microtítulo (Maxisorb, Nunc, Rochester, NY) durante la noche a 4°C con un anticuerpo monoclonal anti-CTGF (10 µg/ml) usado para capturar CTGF, entonces se lavaron y bloquearon con PBS que contiene BSA al 1 % durante al menos 2 horas. Un diferente mAb anti-CTGF de no bloqueo cruzado de aquél usado como mAb de captura, conjugado directamente a fosfatasa alcalina, se usó para detección. Se usó para-nitrofenil-fosfato (PNP) como el sustrato para la reacción colorimétrica. La placa se leyó a 405 nm (Lector de Placa Vmax, Molecular Devises, Sunnyvale, CA) . Las curvas normales se generaron usando normas de rhCTGF en triplicado con cada conjunto de muestras. Las muestras se diluyeron 1:10 en amortiguador de ensayo que contiene 50 µg/ml de heparina, 0.1 % de Tritón X- 100, BSA al 0.1 % antes de que se valore en duplicado; CV en duplicados estaba dentro de 15 % . Se usó un ajuste cuadrático a la curva estándar para calibración. Los experimentos de recuperación de picos que usan CTGF humano recombinante demostraron detección cuantitativa en muestras de pacientes. Las sensibilidades de ensayo (LLOQ) son 0.6 ng/ml para muestras de orina en el ensayo de N+W y de 5 ng/ml para muestras de suero en el ensayo W o ensayo N+W. Los anticuerpos usados en el ELISA son específicos para CTGF, y no reaccionan de forma cruzada con los miembros de la familia de CCN, cyr61 y nov. Aunque se midió el contenido de CTGF en orina usando el ensayo N+W, la forma de CTGF presente en la orina como se midió por estos ensayos fue esencialmente el fragmento N. Dentro de la corrida, el % de CV fue 5 % y entre la corrida del % de CV fue de 15 % . Análisis Estadístico Los niveles medidos de CTGF en plasma y orina siguieron una distribución torcida y la transformación Box-Cox al CTGF se aplicó. La transformación logarítmica convirtió los datos de CTGF al natural a normalidad; de esta manera, se usó el fragmento N de CTGF transformado logarítmicamente en los análisis de la presente. Además, se usó la transformación logarítmica de AER para proporcionar normalidad de los residuos. Se usaron pruebas T para analizar resultados continuos versus cada co-variable de manera separada. Se usaron pruebas de chi cuadrado para analizar resultados discretos versus cada co-variable. Se computaron coeficientes de correlación de Pearson así como correlación no paramétrica de Spearman para valorar la asociación entre el fragmento N de CTGF logarítmico en plasma y cada uno de BP, AER, e IMT. El fragmento N de CTGF logarítmico en plasma, log de AER, e IMT de carótida se usaron todos como resultados en análisis de regresión. En particular, cuando el fragmento N de CTGF logarítmico en plasma fue el resultado, se usaron ANOVA y ANCOVA para determinar las diferencias entre los niveles medios del fragmento N de CTGF logarítmico en plasma en plasma y orina entre los sub-grupos de nefropatía. Con los resultados de log de AER e IMT de carótida, se usaron los resultados de los análisis univariables para desarrollar modelos iniciales para regresiones lineales múltiples, a los cuales se aplicaron entonces los procedimientos de selección de modelo regresivo para eliminar las variables que tienen pruebas parciales no significativas y/o variables que fueron co-lineales. Se consideró el fragmento N de CTGF logarítmico en plasma como una co-variable en los modelos de regresión para ambos resultados de log AER e IMT. Se consideró log AER como una co-variable en el modelo para IMT de carótida. Estos modelos de regresión se ajustaron para otras co-variables tal como edad, HbAlc, duración de diabetes, género, y grupo de tratamiento de DCCT. El cuadrado del coeficiente de correlación parcial múltiple se calculó para estimar el incremento en el porcentaje de la varianza de la variable dependiente clarificada al introducir esa variable en un modelo que incluyó todas las otras co-variables. Se realizó el ajuste de Bonferroni para múltiples comparaciones. Se realizaron todos los análisis estadísticos usando SAS (v. 91) . Las mediciones de la tendencia central se expresaron como media ± SD, en donde se determinó el significado estadístico usando una prueba bilateral y el significado se asumió para p < 0.05. Ejemplo 2: Niveles de Fragmento N de CTGF en Cohorte de DCCT/EDIC de Pacientes Diabéticos Tipo 1 Las características clínicas de la población de estudio en la cual se realizaron mediciones de CTGF se muestran en la Tabla 1 (características clínicas del cohorte de DCCT/EDIC por género*). Los niveles de circulación de plasma y la velocidad de excreción urinaria del fragmento N de CTGF se midieron en 1,052 pacientes diabéticos tipo 1. La relación del fragmento N de CTGF logarítmico con parámetros bioquímicos en el cohorte de pacientes se muestra en la Tabla 2 (análisis de regresión univariable para predecir niveles de fragmento N de CTGF logarítmico) . El coeficiente de regresión univariable en la Tabla 2 se puede interpretar como el cambio en el fragmento. N de CTGF logarítmico medio para un cambio unitario en una co-variable determinada . Otra interpre tación es exp ( ß ) es aproximadamente igual al incremento relat ivo en el f ragmento N de CTGF para un incremento uni tario en una co-vari abl e . Tabla 1 Masculino Femenino Parámetro N Media ± SD N Media ± SD P Edad 562 39.9116.74 452 39.0917.20 0.0632 Peso (Kg) 561 86.83±14.84 451 72.52114.95 0.0001 BMI (kg/m2) 551 27.06±3.86 439 26.34+4.33 0.0055 Relación cintura- 550 0.8910.06 438 0.7710.06 0.0001 cadera Duración de diabetes 562 17.15+4.66 452 17.6914.89 0.0743 (años) HbAlc (%) 555 8.2311.31 447 8.22+1.37 0.8643 Grupo DCCT 562 1.5010.50 452 1.4710.50 0.2870 SBP (mm de Hg) 551 122113.3 439 116113.82 '0.0001 DBP (mm de Hg) 551 77.0919.27 439 72.6019.01 0.0001 MBP (mm de Hg) 551 92.2619.61 439 87.0819.55 0.0001 LDL (mg/dl) 529 118.5131.19 423 110.0129.82 0.0001 Colesterol total 533 189.7136.24 424 188.2133.75 0.5162 (mg/dl) Triglicéridos (mg/dl) 533 98.02170.88 424 77.21149.33 0.0001 HDL (mg/dl) 533 51.62112.85 424 62.69114.82 0.0001 Masculino Femenino Parámetro N Media 1 SD N Media 1 SD Log AER (mg/ 24 h) 553 2.7711.46 446 2.4811.26 0.0011 IMT común (mm) 520 0.601510.0900 415 0.562010.0761 0.0001 IMI interno (mm) 511 0.674010.2433 401 0.614810.1842 0.0002 % hipertenso 554 0.4410.49 442 0.2610.44 0.0001 % de inhibidores de 562 0.1410.35 442 0.1010.30 0.325 ACE * Variables evaluadas entre grupos usando prueba de t- y chi-cuadrada para variables continuas y categóricas, respectivamente . Tabla 2 95 % de Cl Variables independientes Efecto Inferior Superior P Plasma Edad 0.0129 0.0070 0.0188 0.0001 Peso (kg) 0.0010 -0.0015 0.0035 0.4533 BMI (kg/m2) 0.0034 -0.0068 0.0136 0.5145 Relación Cintura-Cadera 0.3557 -0.1325 0.8439 0.1513 Duración de Diabetes (años) 0.0124 -0.0038 0.0210 0.0047 HbAlc (%) -0.0170 -0.0480 0.0140 0.2826 Grupo DCCT 0.1031 0.0208 0.1853 0.0141 SBP (mm de Hg) 0.0039 0.0010 0.0069 0.0091 DBP (mm de Hg) 0.0005 -0.0040 0.0049 0.8393 Log AER (mg/24 h) 0.0779 0.0481 0.1077 0.0000 95 % de Cl Variables independientes Efecto Inferior Superior P LDL 0. .0016 0.0002 0. .0029 0, .0270 Colesterol Total 0. .0016 0.0004 0, .0028 0, .0079 Triglicéridos 0. .0006 0.0000 0. .0013 0. .0672 HDL 0, .000 -0.0028 0. .0029 0, .9851 IMT de Carótida 0, .2767 0.0811 0. .4723 0, .0056 Interna IMT de Carótida 1.1659 0.6744 1.6573 0.0000 Común Género % (masculino) -0.0374 -0.1203 0.2704 0.3765 Inhibidores de ACE 0.1888 0.0643 0.3133 0.0030 ORINA Edad -0.0044 -0.0113 0.0026 0.2166 Peso (kg) 0.0037 0.0008 0.0067 0.0129 BMI (kg/m2) 0.0050 -0.0066 0.0167 0.3968 Relación Cintura-Cadera 1.0875 0.5222 1.6527 0.0002 Duración de Diabetes (años) -0.0075 -0.0175 0.0024 0.1392 HbAlc (%) 0.0061 -0.0296 0.0417 0.7378 Grupo DCCT 0.0420 -0.0538 0.1379 0.3899 SBP (mm de Hg) 0.0065 0.0030 0.0099 0.0002 DBP (mm de Hg) 0.0107 0.0056 0.0158 0.0001 Log AER (mg/24 h) 0.0033 -0.0316 0.0382 0.8527 LDL -0.0004 -0.0019 0.0012 0.6586 95 % de Cl Variables independientes Efecto Inferior Superior P Colesterol Total -0.0004 -0.0018 0.0010 0.5923 Triglicéridos 0.0003 -0.0005 0.0011 0.4188 HDL -0.0015 -0.0048 0.0018 0.3714 IMT de Carótida 0.1427 0.0836 0.3690 0.4146 Interna IMT de Carótida 0.2333 -0.3395 0.8060 0.4243 Común Género % -0.2091 -0.3045 -0.1137 0.0001 (masculino) Inhibidores de ACE 0.0550 -0.0882 0.1982 0.4442 El análisis univariable mostró una fuerte asociación positiva entre los niveles de fragmento N de CTGF logarítmico en plasma y la edad, duración de diabetes, grupo intensivo de DCCT, presión sanguínea sistólica, log AER, LDL, colesterol total, IMT de carótida interna, IMT de carótida común, y el uso de inhibidores de ACE. No se observó asociación entre fragmento N de CTGF logarítmico en plasma y HbAlc, género, peso, índice de masa corporal, y relación cintura-cadera . Se observó una fuerte asociación entre fragmento N de CTGF urinario logarítmico y peso, relación cintura-cadera, SBP, DBP, y género. La velocidad de excreción del fragmento N de CTGF logarítmico ahora no se vio influenciado por la edad, duración de diabetes, HbAlc, log AER, colesterol total, LDL y ACEI . Ejemplo 3: Asociación Entre Fragmento N de CTGF en Plasma y Presión Sanguínea Los resultados presentados en la Figura 1 muestran la distribución acumulativa estimada de fragmento N de CTGF logarítmico en plasma graficada para sujetos no hipertensos (n=668) e hipertensos (n=382) (todos los pacientes se diagnosticaron con hipertensión, SBP>140, DBP>90; y tratados con medicamento anti-hipertenso) . Estos resultados demuestran que los sujetos hipertensos tienden a tener mayores de fragmento N de CTGF logarítmico en plasma que los sujetos normotensos . Los valores medios del fragmento N de CTGF logarítmico en plasma para pacientes con hipertensión documentada es significativamente mayor que aquéllos para pacientes que no desarrollaron hipertensión (3.36 ± 0.04 ng/ml vs . 3.21 ± 0.03 ng/ml, P=0.0005). El nivel de CTGF en plasma medio real medido en plasma de pacientes hipertensos es 41.57 ± 3.47 ng/ml en comparación al nivel de CTGF en plasma medio real de 32.28 ± 1.81 ng/ml en pacientes normotensos, P=0.0109. También se observó una fuerte asociación entre la velocidad de excreción urinaria del fragmento N de CTGF logarítmico y SBP, DBP, y MBP (todo P=0.001). Estos resultados demuestran que los niveles de fragmento de CTGF en plasma se elevan en pacientes diabéticos tipo 1 con hipertensión. Algunos de los pacientes hipertensos estuvieron en la terapia con inhibidor de ACE (ACEI) y se examinó la influencia, si la hay, de ACEI en el nivel de los niveles de fragmento N de CTGF en plasma y orina en este cohorte de pacientes. Los resultados demuestran que los niveles de fragmento N de CTGF logarítmico en plasma medio en pacientes tratados con ACEI, 3.43 ± 0.07 ng/ml (n=126), difirieron de un nivel de fragmento N de CTGF logarítmico en plasma medio de 3.25 ± 0.02 ng/ml (n=984) en pacientes no tratados con ACEI , P=0.0159. Por otra parte, la terapia de ACEI no influenció de manera significativa la velocidad de excreción urinaria del fragmento N de CTGF logarítmico. El fragmento N de CTGF logarítmico urinario medio en pacientes tratados con ACEI fue de 2.13 ± 0.07 µg/24 h (n=122) en comparación a un fragmento N de CTGF logarítmico urinario medio de 2.08 + 0.02 µg/24 h (n=906) en pacientes no tratados con ACEI, P=0.4344.

Ejemplo 4: Relación Entre Fragmento N de CTGF y Excreción de Albúmina Se midieron los niveles de CTGF en plasma y orina en 1,052 pacientes diabéticos tipo 1 y los resultados se expresaron como media ± SE y se muestran en la Tabla 3 (niveles en plasma y orina de fragmento N de CTGF por estados de albuminuria; los valores P se comparan al grupo de línea base (AER <40) y se ajustan para la edad) .

Tabla 3 AER<40 mg/24 AER 40-299 mg/24 AER>300 mg/24 h h h (n=896) (n=105) (n=51) Variable Media SD Media SD Media SD N de CTGF log 3.227 0.657 3.297 0.542 3.750 0.921 plasma (ng/ml) (P=0.2487) (P<0.0001) N de CTGF 34.191 55.116 32.386 27.958 65.792 84.842 (P=0.8250) (P=0.0001) N de CTGF log orina 2.098 0.719 1.943 0.821 2.285 1.083 (pg/24 h) (P=0.0529) (P=0.1096) N de CTGF 10.611 10.142 9.248 7.189 18.534 30.918 (P=0.2806) (P<0.0001) Los datos demuestran que los niveles de fragmento N de CTGF en plasma y orina de pacientes con macroalbuminuria (velocidad de excreción de albúmina >300 mg/dl) fueron significativamente mayores que aquéllos en plasma y orina de pacientes con microalbuminuria (40-299 mg/dl) o pacientes con velocidad normal de excreción de albúmina (<40 mg/dl), consistente con los reportes anteriores que muestran una correlación entre el nivel del fragmento N de CTGF en orina y el grado de albuminuria. (Ver publicación internacional número WO 03/024308) . Los niveles en plasma de fragmento N de CTGF en pacientes con AER >300 mg/dl fueron 65.79 ± 11.89 ng/ml vs . 32.39 ± 2.73 ng/ml en pacientes con AER de 40-299 ng/dl y 34.19 1 1.84 ng/ml en pacientes con AER normal <40 mg/dl (P=0.0005), consistente con reportes anteriores que muestran una correlación entre el nivel del fragmento N de CTGF en orina y la velocidad de excreción de albúmina. (Ver publicación internacional número WO 03/024308) . La velocidad de excreción del fragmento N de CTGF en pacientes con AER >300 mg/dl fue 18.53 ± 4.33 µg/24 h vs . 9.25 ± 0.70 µg/24 h en pacientes con AER de 40-299 mg/dl y 10.61 + 0.34 µg/24 h en pacientes con AER normal <40 mg/dl; P=0.0001. Estos hallazgos sugieren que el CTGF sirve como un marcador de diagnóstico que identifica de forma efectiva pacientes con un peso incrementado de progreso a macroalbuminuria . La Tabla 2 muestra una asociación positiva y significativa entre fragmento N de CTGF logarítmico en plasma y velocidad de excreción en albúmina logarítmica (P=0.001, n=1052). La fuerza de la asociación del fragmento N de CTGF logarítmico en plasma con log AER se evaluó adicionalmente por análisis de regresión lineal múltiple. Se desarrolló un modelo de regresión múltiple en base al análisis de regresión univariable usada para los datos mostrados en la Tabla 2, pero con log AER como el resultado después del fragmento N de CTGF logarítmico en plasma. Se incluyeron en este modelo varias variables que tienen influencia en log AER. Las variables no significativas y las variables colineales se eliminaron por análisis de regresión regresiva para desarrollar un modelo que explique mejor el resultado como una función del marcador de diagnóstico indicativo de riesgos incrementados. Los resultados mostrados en la Tabla 4 (modelos de regresión lineal múltiple para log AER) demostraron, después de control de la edad, peso, BMI , duración de diabetes, HbAlc, grupo intensivo de DCCT, SBP, y colesterol total, una asociación significativa entre CTGF logarítmico en plasma y log AER (p<0.0001) . Estos resultados se interpretaron para mostrar que una diferencia de dos veces en el fragmento N de CTGF en plasma dio por resultado un incremento de 20 % en AER.

Tabla 4 Cl al 95 % Variable Efecto Inferior Superior P Intercepción - -5.5492 -3.1824 0.0001 4.3388 Fragmento N de CTGF 0.3183 0.1959 0.4407 0.0001 log plasma Edad - -0.0393 -0.0150 0.0001 0.0272 Peso (kg) 0.0008 0.0002 0.0161 0.0445 BMI (kg/m2) - -0.0645 -0.0050 0.00221 0.0348 Relación Cintura- 0.2832 -0.8149 1.3859 0.6143 Cadera Duración de Diabetes 0.0388 0.0219 0.0557 0.0001 (años ) HbAlc (%) 0.2414 0.1797 0.3026 0.0001 Grupo Intensivo DCCT 0.3792 0.2179 0.5405 0.0001 SBP (mm de Hg) 0.0240 0.0179 0.0301 0.0001 Colesterol Total 0.0052 0.0028 0.0076 0.0001 (mg/dl) Ejemplo 5: Espesor de Pared Arterial de Carótida y CTGF La relación entre la actividad de CTGF y el espesor de intima-media de carótida interna y/o común (IMT) se examinó para determinar si las diferencias en los niveles en las del fragmento N de CTGF se asociaron con enfermedad macrovascular. El análisis univariable demostró asociación significativa entre niveles en plasma logarítmicos de fragmento N de CTGF y el IMT de carótida interna y común (ambos P<0.0001) en 1,050 participantes (Tabla 2) . Estos hallazgos indicaron que los niveles en plasma de CTGF se relacionan positivamente a IMT de carótida, un marcador sustituto para enfermedad macrovascular. Se construyó un modelo de regresión múltiple para valorar la fuerza de la asociación del fragmento N de CTGF logarítmico en plasma y el IMT de carótida común. Realizando el análisis de regresión regresiva, el modelo que contiene el fragmento N de CTGF logarítmico en plasma, log AER, edad, y género (Tabla 5, modelos de regresión lineal múltiple para IMT de carótida común) demostraron que el fragmento N de CTGF logarítmico se asoció de manera independiente y significativa con el IMT de carótida común.

Tabla 5 Cl al 95 % Variable Efecto Inferior Superior P Intercepción 0.3981 0.3578 0.4384 0.0001 Fragmento N de CTGF log 0.0079 0.0003 0.0156 0.0428 plasma Log AER 0.0112 0.0075 0.0149 0.0001 Edad 0.0045 0.0037 0.0052 0.0001 Género - -0.0420 -0.0218 0.0001 0.0319 Se dicotomizó el IMT en categorías alta y baja en base al 75-ésimo percentil y se adaptó en un modelo de regresión logística con esto como el resultado. Los modelos logísticos ajustados para la edad confirmaron la asociación de CTGF con riesgo incrementado de IMT de carótida. Los resultados mostraron que los sujetos con altos niveles de CTGF y AER >300 mg/día tienen un riesgo significativamente mayor para IMT incrementado de carótida (riesgo relativo: 4.76; 95 % de Cl , 2.21-10.25, p>0.0001) que los sujetos con bajos niveles de CTGF y AER <40 mg/día. (Ver Tabla 6, riesgo relativo para IMTe incrementado de carótida de acuerdo al fragmento N de CTGF en plasma y AER) .

Tabla 6 AER <40 mg/día AER >40 <299 AER >300 mg/día mg/d a Alto RR=1.86 (1.30- RR=2.54 (1.21- RR=4.76 (2.21- 2.67) 5.23) 10.25) n=376 n=41 (P=0.0135) n=36 (P=<0.0001) (P=0.0007) CTGF N Bajo RR=1.00 RR=2.42 (1.13- RR=2.69 (0.59- 5.18) 12.92) n= 415 n=43 (P= 0.0224) n=9 (P=0.1989) Total n= 791 n=84 n=45 RR = Riesgo relativo (intervalo de confianza 95 % ) e IMT incrementado definido como cuartilla superior de distribución para hombres y mujeres combinados ** Los estimados se ajustaron a la edad Como se describe anteriormente, el presente estudio se basa en los datos generados del cohorte de DCCT/EDIC de pacientes diabéticos tipo 1 e índica que la enfermedad vascular diabética está enlazada a anormalidades de los niveles de CTGF. Estos hallazgos proporcionan evidencia de una asociación independiente y positiva entre los niveles del fragmento N de CTGF y marcadores sustitutos de enfermedad macrovascular (IMT común y de carótida) .

Además, los presentes hallazgos demuestran una asociación independiente entre los niveles de fragmento N de CTGF e hipertensión y microalbuminuria, ambos de los cuales son marcadores de diagnóstico indicativos de riesgos incrementados para el desarrollo de enfermedad macrovascular.

Adicionalmente, estos resultados transversales demuestran que el riesgo relativo para IMT de carótida se incrementa en sujetos diabéticos con altos niveles de CTGF. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para diagnosticar un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes en un sujeto que tiene o que está en riesgo de tener diabetes, el método está caracterizado porque comprende obtener una muestra biológica del sujeto, medir el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en esta muestra biológica, y comparar el nivel de CTGF o del fragmento de CTGF en la muestra biológica a niveles normales de CTGF o de fragmento de CTGF, donde un nivel elevado de CTGF o del fragmento de CTGF en la muestra biológica es indicativo de un riesgo de desarrollo de una complicación vascular asociada con diabetes .
2. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto que tiene o que está en riesgo de tener diabetes es un sujeto humano.
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la complicación vascular es una complicación macrovascular o una complicación microvascular.
4. 4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la complicación vascular se selecciona del grupo que consiste de una complicación cardiovascular, una complicación cerebrovascular, y una complicación de la vasculatura periférica.
5. 5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la complicación vascular es espesor incrementado de intima-media.
6. 6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel del fragmento de CTGF o de CTGF en la muestra biológica es detectable y cuantificable usando un ensayo descrito en la publicación internacional número WO 03/024308.
7. 7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra derivada de fluidos corporales .
8. 8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra biológica es orina o plasma.
9. 9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sujeto tiene diabetes tipo 1.
10. 10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sujeto tiene presión sanguínea incrementada.
11. 11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sujeto tiene microalbuminuria.