MX2007011479A - Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican a los mismos. - Google Patents

Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican a los mismos.

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Carlos Simoes-Nunes
Peter Rahbek Oestergaard
Aurelia Seon
Anna-Maria Klunter
Leonardo De Maria
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Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos aislados y secuencias de acido nucleico aisladas que codifican los polipeptidos, asi como tambien a metodos para producir y utilizar los polipeptidos en el alimento para animales. Un ejemplo de un polipeptido de la invencion es la proteina denominada L12 de Bacillus licheniformis ATCC 14580, la cual mejora la Relacion de Conversion de Alimento (FCR) y/o actua como un modulador de la microflora del intestino. La invencion se refiere ademas al uso probiotico de cepas de Bacillus las cuales producen proteinas relacionadas con L12.

Description

PO IPEPTIDOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN A LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos aislados y secuencias de ácido nucleico aisladas cjue codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico, asi como también a métodos para producir y utilizar los polipéptidos en un alimento para animales, por ejemplo para mejorar la Relación de Conversión de Alimento (FCR, por sus siglas en inglés) y/o para la modulación de la microflora del intestino. Un ejemplo de un polipéptido de la invención es la proteína denominada L12 de Bacillus licheniformis ATCC 14580, la cual tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos +1 a +85 de la SEC ID NO : 2 en este documento (en lo sucesivo los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2). La invención también se refiere al uso probiótico en el alimento para animales de cepas de Bacillus las cuales producen proteínas relacionadas con L12.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Técnica Anterior El documento WO 03/093453 describe, en el Ejemplo 1, el diseño de una célula hospedante mejorada de Bacillus REF. :185726 licheniformis la cual no produce una proteína extracelular pequeña codificada por los nucleótidos 601 a 978 de la SEC ID NO: 133 del documento WO 03/093453, la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 134 del documento WO 03/093453. Las SEC ID NOs 133 y 134 del documento WO 03/093453 están incluidas en el presente listado de secuencias como las SEC ID NOs 3 y 4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4 en este documento es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO : 2 en este documento. El documento WO 03/093453 no describe un polipéptido aislado que tenga los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2. El documento WO 03/093453 tampoco describe una secuencia de ácido nucleico aislada que tenga los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l. El número de acceso de GenPept YP_081375 es una proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580. El número de acceso de GenPept YP_081375 es idéntico a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO: 2 en este documento. La secuencia de la proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580 también ha sido introducida en UniProt B/TrEMBL con el número de acceso primario Q65CU4. Esta secuencia también es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO: 2 en este documento. La secuencia de nucleótidos que codifica YP_081375 tiene el número de acceso de GenBank NC_006270. El número de acceso de GenBank NC_006270 es idéntico a los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO : 1 en este documento. Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que los polipéptidos relacionados con parte de esta secuencia hipotética de Bacillus licheniformis, específicamente los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2, tienen un gran potencial para el uso en el alimento para animales . El número de acceso de SWISSPROT Q.8DQM5 es una proteína hipotética de 115 aminoácidos spr0600 de Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255 / R6) . La secuencia también se da a conocer en "Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6" por Hoskins y colaboradores, J. Bacteriol. 183:5709 (2001). Q8DQM5 no comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2. Martínez y colaboradores, Microbiology (1999), vol. 145, páginas 3155-3161 dan a conocer, en la Figura 3, la secuencia de 91 aminoácidos deducida de la lactococcina pre-bacteriocinogénica 972 con una porción madura C-terminal de 66 aminoácidos prevista. El porcentaje de identidad de cada uno del pre-polipéptido y el polipéptido maduro con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 es inferior a 33%. Una investigación de las bases de datos de nucleótidos con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l (que codifica los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2) reveló un fragmento de ADN de 47% de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID N0:1. Este fragmento es parte de una secuencia que resulta de un proyecto de secuenciación aún en progreso. El organismo del cual se deriva el fragmento es denominado la cepa Bacillus (Geobacillus) stearothermofilus 10. El trabajo de secuenciación se realiza en la Universidad de Oklahoma (http://www.genome.ou.edu/bstearo.html). No existe una publicación de alguna de las secuencias de aminoácidos que corresponda potencialmente a este fragmento de ADN y por lo tanto tampoco existe una indicación de alguna utilidad potencial de alguna secuencia de aminoácidos codificada. Un producto probiótico en el alimento designado BioPlus2BMR es ofrecido para su venta por Chr . Hansen A/S, 10-12 Boege Alié, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca. El producto contiene una cepa de Bacillus licheniformis la cual sin embargo no produce una proteína relacionada con L12 (véase el E emplo 6 en este documento) . Un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, cepas especiales de Bacillus, así como también métodos para el uso de los polipéptidos y las cepas de Bacillus en el alimento para animales.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33%; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones restrictivas bajas con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID N0:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) ; (c) una variante del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2 que comprende una sustitución, supresión, extensión y/o inserción de uno o más aminoácidos; (d) una variante alélica de (a) o (b) ; y (e) un fragmento de (a) , (b) , (c) o (d) ; con la condición que el polipéptido no sea los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4. La presente invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos y a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico así como también a métodos para producir y utilizar los polipéptidos dentro del alimento para animales. La presente invención se refiere además al uso en el alimento para animales de una cepa de Bacillus la cual es positiva en la prueba del Ejemplo 6 en este documento, específicamente el ADN de la cual, cuando se recolecta y se utiliza como una plantilla de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb.
El Polipéptido, sus Características y Uso En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2 de al menos 33%; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivas bajas con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) ; (c) una variante del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión, extensión y/o inserción de uno o más aminoácidos; (d) una variante alélica de (a) o (b) ; y (e) un fragmento de (a) , (b) , (c) o (d) ; con la condición que el polipéptido no sea los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4. La invención también se refiere al uso en el alimento para animales de los polipéptidos definidos anteriormente y/o de un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4, así como también al uso de cualquiera de éstos en la preparación de una composición para el uso en el alimento para animales. Esos polipéptidos mejoran la utilización del alimento para animales al mejorar la relación de conversión de alimento (FCR) y/o al modular la microflora del intestino. La condición anterior (que el polipéptido no sea los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4) sirve para desconocer los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 134 del documento WO 03/093453, véase la sección de la Técnica Anterior. La condición es opcional; en las modalidades alternativas de la misma (i) el polipéptido no incluye una parte de péptido de señal, (ii) el polipéptido no incluye una parte de propéptido y/o (iii) el polipéptido ee un polipéptido maduro. En las modalidades alternativas adicionales, el polipéptido comprende, en caso distinto tiene o consiste (esencialmente) de, 50-120 aminoácidos, preferiblemente 55-115, 60-110, 65-105, 70-100, 75-95, o mucho más preferiblemente 80-90 aminoácidos. En una primera modalidad particular, el polipéptido tiene, consiste esencialmente de o consiste de una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33% tal como, por ejemplo, el polipéptido de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2. Otros ejemplos específicos son los polipéptidos de los aminoácidos 1-85 de cualquiera de las SEC ID NOs: 8, 9 y 10 (identificadas como similares a L12 en base a la prueba de PCR del Ejemplo 6 en este documento) . Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano o fungal. En una segunda modalidad particular, el polipéptido es un polipéptido de bacterias Gram-positivas tal como un polipéptido de Bacillus o una variante del mismo, por ejemplo un polipéptido de Bacillus licheniformis derivado por ejemplo de Bacillus licheniformis ATCC 14580, la cual es la cepa de tipo natural de Bacillus licheniformis y está disponible cuando se solicite de the American Type Culture Collection, ATCC. Las cepas preferidas de Bacillus licheniformis son positivas en la prueba del Ejemplo 6 en este documento, tales como las siguientes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689 y ATCC 53757. En una tercera modalidad particular, el polipéptido mejora la utilización en el alimento para animales al mejorar la relación de conversión de alimento (FCR) y/o al modular la microflora del intestino. En modalidades alternativas, el polipéptido mejora la digestibilidad del alimento para animales y/o mantiene la salud de los animales al ayudar en la digestión apropiada y/o apoyar la función del sistema inmune . La FCR puede determinarse en base a un ensayo de crecimiento de pollos de cría que comprende un primer tratamiento en el cual el polipéptido se agrega al alimento para animales en una concentración de 5 mg por kg de alimento y un segundo tratamiento (control) sin la adición del polipéptido al alimento para animales, cada tratamiento consiste de 8 grupos de 6 pollos macho, los pollos son alimentados con granulos de una dieta de maíz/SBM48 ad libitum, la FCR se calcula como la captación de alimento en g/ave con relación a la ganancia de peso en g/ave durante los días 8-29 del ensayo, la FCR para el primer tratamiento se mejora con relación a la FCR del segundo tratamiento. En una modalidad particular, el ensayo de crecimiento es un ensayo en jaulas. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 5. La FCR también puede determinarse en base a un ensayo de crecimiento de pollos de cría que comprende un primer tratamiento en el cual el polipéptido se agrega al alimento para animales en una concentración de (i) 2.5, (ii) 5.0 o (iii) 7.5 mg por kg de alimento y un segundo tratamiento (control) sin la adición del polipéptido al alimento para animales, cada tratamiento consiste de 10 grupos de 6 pollos macho, los pollos son alimentados con granulos de una dieta de maíz/SBM48 ad libitum, la FCR se calcula como la captación de alimento en g/ave con relación a la ganancia de peso en g/ave para los días 8-29 del ensayo, la FCR para el primer tratamiento se mejora con relación a la FCR del segundo tratamiento. En una modalidad particular, el ensayo de crecimiento es un ensayo en jaulas. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 9. La FCR también puede determinarse en base a un ensayo de crecimiento de pollos de cría que comprende un primer tratamiento en el cual el polipéptido se agrega al alimento para animales en una concentración de 7.5 mg por kg de alimento y un segundo tratamiento (control) sin la adición del polipéptido al alimento para animales, cada tratamiento consiste de 12 grupos de 20 pollos (6 grupos de 20 hembras, 6 grupos de 20 machos), los pollos son alimentados con granulos de una dieta basada en trigo, arroz y harina de semilla de soya ad libitum, la FCR se calcula como la captación de alimento en g/ave con relación a la ganancia de peeo en g/ave para los días 1-36 del ensayo, la FCR para el primer tratamiento se mejora con relación a la FCR del segundo tratamiento. En una primera modalidad particular, los pollos se alojan en corrales sobre el piso con lecho de virutas de madera. En una segunda modalidad particular, los pollos eon alimentados con una dieta de inicio en el periodo de los días 1-22 y una dieta de crecimiento en el periodo de los días 22-36, ambas basadas en trigo, arroz y harina de semilla de soya y con una compoeición como ee mueetra en la Tabla 9. Para detallee adicionales, véaee el Ejemplo 12. Como ee eabe generalmente, una FCR mejorada es más baja que la FCR de control. En lae modalidadee particularee, la FCR ee mejorada (es decir, reducida) en comparación con el control por al menos 1.0%, preferiblemente al menos 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4% o al menos 2.5%. En modalidades particulares adicionales, la FCR es mejorada (es decir reducida) en comparación con el control por al menos 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9% o al menos 3.0%. En modalidades particulares aún adicionales, la FCR es mejorada (es decir, reducida) en comparación con el control por al menos 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7% o al menos 3.8%. El término "intestino" utilizado en este documento designa el tracto gastrointestinal o digestivo (también referido como el conducto alimentario) y se refiere al sistema de órganos dentro de animales multicelulares el cual toma alimento, lo digiere para extraer la energía y los nutrientee y expele el deeperdicio reetante. El intestino puede dividiree en tracto gastrointestinal superior e inferior, el primero que comprende la boca y el estómago y el posterior que comprende los intestinoe. Loe inteetinoe pueden dividiree en intestino delgado y grueso. Los componentes básicos del intestino delgado, no obstante con diferencias entre especies de animales, son duodeno, yeyuno e íleon. Los componentes básicos del intestino grueso eon intestino ciego, colon y recto (cloaca) . El término "microflora" del intestino utilizado en este documento se refiere a los cultivoe microbianos naturales que residen en el intestino y que mantienen la salud al ayudar en la digestión apropiada y/o apoyar la función del sistema inmune. El término "modular" utilizado en este documento en conexión con la microflora del intestino eignifica generalmente cambiar, manipular, alterar o ajuetar la función o eetado del miemo en un animal ealudable o que funciona normalmente, ee decir un ueo no terapéutico. La modulación es en respueeta a loe polipéptidoe y/o lae cepae de Bacillue de la invención. Los siguientes son ejemplos particulares no limitantes del efecto de modulación de la microflora del intestino obtenido por el polipéptido de la invención (cambios comparados con un control sin el polipéptido de la invención) - para detalles adicionales, véase el Ejemplo 8: (i) un incremento en el número de bacterias anaeróbicas facultativas totales in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de cría, determinado preferiblemente después del cultivo de contenidos del íleon-recto y/o intestino ciego, respectivamente, en agar Brucella complementado con 5% vol/vol de sangre de oveja después de la incubación en un gabinete anaeróbico a 37°C durante cinco días; (ii) un incremento en el número de Escherichia coli in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de cría, determinado preferiblemente despuée del cultivo de los contenidos del íleon/recto y/o intestino ciego, respectivamente, en medios cromogénicos de Coli-ID, aeróbicamente, a 37°C durante 24 horas ; (iii) ningún cambio sustancial, o un incremento, en las bacterias de ácido láctico totales in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de cría, determinado preferiblemente después del cultivo de los contenidoe del íleon-recto y/o intestino ciego, respectivamente, en agar MRS, en un gabinete anaeróbico, a 37°C durante 48 horas; (iv) ningún cambio euetancial en Lactobacillue spp. total in vivo, por ejemplo en lechones, determinado preferiblemente despuée del cultivo de los contenidos del íleon-recto en agar Rogosa, en un gabinete anaeoróbico a 37°C durante 48 horas; (v) una disminución en el número de otras Enterobacteriaceae (diferentes de E. coli) in vivo, por ejemplo en lechones, determinada preferiblemente despuée del cultivo de los contenidos del íleon-recto en medios cromogénicos de Coli-ID, aeróbicamente, a 37°C durante 24 horas ; (vi) una dieminución en el número de Enterococcue epp . in vivo, por ejemplo en lechonee, determinada preferiblemente después del cultivo de los contenidos del íleon-recto en un agar de Enterococci, aeróbicamente a 37°C durante 48 horas; y/o (vii) una disminución en la frecuencia con la cual aparece in vivo Clostridium perfringens, por ejemplo en lechones, determinada preferiblemente después del cultivo de los contenidos del íleon-recto en agar TSN después del calentamiento de la muestra a 80°C durante 10 minutos en un gabinete anaeróbico a 46°C durante 24 horas. Aún además, también con relación al efecto modulador de la microflora del intestino y con referencia a un control sin el polipéptido de la invención, el polipéptido de la invención preferiblemente: (viii) es más activo in vitro contra los cocos Gram-positivos que las bacterias Gram-negativas, exhibiendo específicamente una reducción más fuerte de los primeros, por ejemplo para los cocos Gram-positivoe y lae bacteriae Gram-negativas aisladas de los contenidos intestinalee de lechones y/o pollos de cría; (ix) es más activo in vitro contra Clostridium spp., por ejemplo Clostridium perfringens, que las bacterias Gramnegativas, exhibiendo específicamente una reducción más fuerte del primero, por ejemplo para Clostridium perfringens y bacterias Gram-negativas aisladae de los contenidos intestinales de lechones y/o pollos de cría; (x) no influye euetancialmente en el crecimiento in vitro de microorganiemoe benéficos, tales como bacterias, por ejemplo aisladae de los contenidos intestinales de lechones y/o pollos de cría; y/o (xi) no influye euetancialmente, por ejemplo reduce, en el crecimiento in vitro de microorganiemos perjudiciales, tales como bacterias, por ejemplo aisladas de los contenidos intestinalee de lechones y/o pollos de cría. Para detalles con relación a las modalidades (viii)-(xi), véase por favor el último párrafo del Ejemplo 8. En la modalidad (x) , los microorganismos benéficos se seleccionan preferiblemente de Lactobacillus spp., tal como Lactobacillus salivarius DSM 18070, para el cual el valor MIC90 ee al menos 1000 microgramos/ml, preferiblemente al menos 2000, 3000, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 o al menos 7000 microgramos/ml, in particular al menos 4170 microgramos/ml . Por consiguiente, el polipéptido de la invención tiene un valor MIC90 contra Lactobacillus salivariue DSM 18070 de al menoe 1000 microgramos/ml, preferiblemente al menos 2000, 3000, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 o al menos 7000 microgramoe/ml, en particular al menoe 4170 microgramoe/ml . En la modalidad (xi) , loe microorganismoe perjudiciales se seleccionan preferiblemente de Enterococcus, Staphylococcus, Cloetridium (preferiblemente Cloetridium perfringene) ; tal como Enterococcus faecalis DSM 18047, para el cual el valor MIC90 es inferior a 4000 microgramos/ml, preferiblemente inferior a 3000, 2000, 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 o inferior a 70 microgramos/ml, preferiblemente un valor MIC90 de 50-80, más preferiblemente 60-70 microgramos/ml. Por consiguiente, el polipéptido de la invención tiene un valor MIC90 contra Enterococcus faecalis DSM 18047 inferior a 4000 microgramos/ml, preferiblemente inferior a 3000, 2000, 1000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 o inferior a 70 microgramos/ml, preferiblemente un valor MIC90 de 50-80, más preferiblemente 60-70 microgramos/ml. El valor MIC90 designa la concentración inhibitoria mínima requerida para inhibir el crecimiento de 90% de los organismos. Para los presentes propósitoe, el valor MIC90 ee define como aquella concentración del polipéptido de la invención que se requiere para reducir la densidad del cultivo, determinada como OD595 en un 90% con relación a un control sin el polipéptido de la invención. El valor OD595 se determina después de la incubación bajo condiciones de incubación apropiadas (las cuales dependen del organismo en cueetión, como ee mueetra en la Tabla 5 del Ejemplo 8) . La determinación del valor MIC90 puede haceree por medio de un método de dilución de caldo de microtítulo, utilizando aproximadamente 105 CFU/ml de las bacterias puras en caldo de soya tríptico, agregando el polipéptido de la invención en diluciones dobles eerialee, utilizando agua como control. Para detallee adicionales, véase el Ejemplo 8. El valor MICgo se indica generalmente en este documento en la unidad de microgramo del polipéptido puro por ml (microgramo/ml). En modalidades particulares aún adicionales, el polipéptido de la invención: (xii) tiene un valor MICg0 para una bacteria Gram-negativa, tal como una cepa de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium o Proteus mirabilis, el cual es al menos 50% más alto que un valor MICgo para un coco Gram-positivo, tal como una cepa de Enterococcus o Staphylococcus , por ejemplo Enterococcus faecalis, preferiblemente Enterococcus faecalis DSM 18047 -en sub-modalidadee preferidae de eete documento, el valor MIC90 del primero es preferiblemente al menos 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% o al menos 500% más alto que el valor MICgo del último. En una cuarta modalidad particular (véase el Ejemplo 11 para los detalles), el polipéptido de la invención en su forma nativa (es decir no desnaturalizada) , no es degradado por (i) pepsina (pH 3.5, 40aC, 2 horae); (ii) pancreatina (pH 7.0, 409C, 4 horae); y/o (iii) pepeina seguida por pancreatina (pepsina a pH 3.5, 402C, 2 horas -seguida por pancreatina a pH 7.0, 40aC, 4 horas) - para todas las modalidades (i) -(iii) evaluado por medio de SDS-PAGE (véase el Ejemplo 10) . En una quinta modalidad particular (véase el Ejemplo 7 para los detalles) , el polipéptido de la invención tiene las siguientee temperaturae de deenaturalización, determinadas por medio de la Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC, por sus siglas en inglés): (i) al menos 54aC a pH 2.5, (ii) al menos 68aC a pH 4.0 y/o (iii) al menos 59aC a pH 7.0; preferiblemente (iv) 55°C a pH 2.5; (v) 69°C a pH 4.0; y/o (vi) 60°C a pH 7.0.
Identidad e Hibridización, Fragmentos y Variantes La relación entre dos secuenciae de aminoácidos es descrita por el parámetro "identidad". Para propósitos de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del programa Needle del paquete EMBOSS (http://embo8s.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global deecrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución utilizada es BLOSUM62, la penalización por abertura de espacio es 10 y la penalización por exteneión de espacio es 0.5.
El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención"; por ejemplo los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 y una secuencia de aminoácidos diferente ("secuencia extraña") se calcula como el número de apareamientos exactos en un alineamiento de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", cualquiera que sea la más corta. El resultado se expresa en un porcentaje de identidad. Un apareamiento exacto ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la "eecuencia extraña" tienen reeiduos de aminoácidoe idénticos en las mismas posicionee del traslapo (en el ejemplo de alineamiento posterior éste es representado por "|") . La longitud de una secuencia es el número de residuoe de aminoácidoe en la secuencia (por ejemplo la longitud de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 es 85) . En el ejemplo de alineamiento meramente hipotético a continuación, el traelapo es la secuencia de aminoácidos "HTWGER-NL" de la Secuencia 1; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de la Secuencia 2. En el ejemplo, un espacio es indicado por un "-". Ejemplo de alineamiento hipotético: Secuencia 1: ACMSHTWGER-NL l lll II Secuencia 2: HGWGEDANLAMNPS En una modalidad particular, el porcentaje de identidad de una eecuencia de aminoácidos de un polipéptido con, o para, los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 se determina al i) alinear las dos secuencias de aminoácidos utilizando el programa Needle, con la matriz de suetitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por exteneión de espacio de 0.5; ii) contar el número de apareamientos exactos en el alineamiento; iii) dividir el número de apareamientos exactos por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos y iv) convertir el resultado de la división de iii) en porcentaje. En el ejemplo hipotético anterior, el número de apareamientos exactos es 6, la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos ee 12, por coneiguiente el porcentaje de identidad ee 50%. En caeo distinto, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como también el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, es determinado por el programa "align" el cual es un alineamiento Needleman-Wunsch (es decir un alineamiento global) . El programa se utiliza para el alineamiento del polipéptido, así como también eecuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 se utiliza para alineamientos de polipéptidos y la matriz de identidad por defecto se utiliza para alineamientos de nucleótidos. La penalización para el primer reeiduo de un eepacio ee -10 para polipéptidoe y -16 para nucleótidoe. Las penalizaciones para reeiduoe adicionalee de un eepacio eon -2 para polipéptidos y -4 para nucleótidos. "Align" es parte del paquete FASTA versión v20u6 (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988) , "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Seneitive Sequence Comparieon with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de proteínas FASTA utilizan el algoritmo Smith-Waterman ein limitación eobre el tamaño de eepacio (véaee "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197). Véaee también Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17. En lae modalidadee preferidae, el grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 es al menos 35% o al menos 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o al menos 99%. Los polipéptidos con cualquiera de estoe gradoe de identidad con loe aminoácidoe 1-85 de la SEC ID NO : 2 son referidos como polipéptidos homólogos. En una modalidad alternativa, el grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 es 32%. En modalidades particulares, los polipéptidos de la invención comprenden (o tienen o coneieten de) una eecuencia de aminoácidoe que difiere por (i) 57, 55, 50, 45, 40, 35, 30 o 25 aminoácidoe de loe aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2; o por (ii) 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2; o por (iii) 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad particular adicional, los polipéptidos comprenden (o tienen o conei ten de) una secuencia de aminoácidoe que difieren por 4, 3 o 2 aminoácidoe o por 1 aminoácido de loe aminoácidoe 1-85 de la SEC ID NO : 2. Un fragmento de, por ejemplo, loe aminoácidoe 1-85 de la SEC ID NO: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos suprimidos de la terminación amino y/o carboxilo de esas secuencias de aminoácidos. En una modalidad, un fragmento consiste al menos de 30, 35, 40, 45, 50 o al menos 55 aminoácidos. En otra modalidad, un fragmento contiene residuos de al menos 65 aminoácidos o residuoe de al menoe 70 aminoácidos o residuos de al menos 75 aminoácidos o residuos de al menos 80 aminoácidos o residuos de al menos 81 aminoácidos o residuos de al menos 82 aminoácidos o residuos de al menos 83 aminoácidos o residuos de al 84 aminoácidos. Una variante alélica indica cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el miemo locue cromoeómico. Una variación alélica eurge naturalmente a través de la mutación y puede dar por resultado el polimorfiemo dentro de poblacionee . Lae mutacionee genéticas pueden ser taciturnas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. La presente invención también se refiere a polipéptidos aisladoe loe cualee eon codificadoe por eecuencias de ácido nucleico las cuales se hibridizan bajo condiciones de restricción muy bajas o bajas o intermedias o intermedias-altae o altas o muy altas con una sonda de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo las mismas condiciones con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , (ii) una subeecuencia de (i) o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritech y T. Maniatie, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, eegunda edición, Cold Spring Harbor, Nueva York) . En una modalidad particular, la eonda de ácido nucleico ee eelecciona entre lae secuencias de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) anteriores. La subsecuencia de nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l puede ser de al menos 100 nucleótidos o en otra modalidad de al menos 50, 150, o 200 nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l o una subsecuencia de la misma, así como también la eecuencia de aminoácidoe de loe aminoácidoe 1-85 de la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la miema, se pueden utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar el ADN que codifica polipéptidos que tienen un potencial para el uso en el alimento para animales a partir de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos bien conocidos en el campo. En particular, estas sondas pueden utilizarse para la hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo los procedimientoe de inmunotraneferencia Southern eetándar, a fin de identificar y aislar el gen correspondiente en las mismas. Estae eondae pueden eer considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25 y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. Se pueden utilizar eondae máe grandes. Pueden utilizarse sondae tanto de ADN como de ARN. Las sondae son etiquetadas típicamente para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . Eetas sondas están incluidas por la presente invención. De esta manera, una genoteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otros organismos puede seleccionarse para el ADN que ee hibridiza con lae eondas descritae anteriormente y que codifica un polipéptido que tiene la actividad deseada. El ADN genómico u otro ADN de estos otros organiemos puede separarse por medio de la electroforesis de gel de agarosa o poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado puede transferiree a e inmovilizarse sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. A fin de identificar un clon o ADN que es homólogo con la SEC ID N0:1 o una subeecuencia de la miema, el material portador ee utiliza en una inmunotraneferencia Southern. Para propóeitoe de la preeente invención, la hibridación indica que la eecuencia de ácido nucleico ee hibridiza con una eonda de ácido nucleico etiquetada que correeponde a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N0:1, su cadena complementaria o una eubeecuencia de la miema, bajo condiciones de restricción muy bajas a muy altas. Las moléculas a las cuales se hibridiza la sonda de ácido nucleico bajo estae condiciones son detectadas utilizando una película de rayos X. En una modalidad particular, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico la cual codifica los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 o sub-secuencias de la misma. En otra modalidad, la sonda de ácido nucleico es los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 (la región madura que codifica polipéptidos de la SEC ID NO:l). Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones restrictivas muy bajas a muy altas se definen como la prehibridación e hibridación a 42 °C en SSPE 5X, SDS al 0.3%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón recortado o desnaturalizado y ya eea formamida al 25% para condiciones restrictivas muy bajas y bajas, formamida al 35% para condicionee restrictivas intermedias e intermedias-altas o formamida al 50% para condiciones restrictivas altas y muy altas, siguiendo los procedimientos estándar de inmunotransferencia Southern. Para las sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces cada 15 minutoe utilizando 2 x SSC, SDS al 0.2% preferiblemente a al menoe 45°C (condicionee restrictivae muy bajae) , máe preferiblemente a al menos 50°C (condiciones restrictivae bajae), máe preferiblemente a al menoe 55°C (condiciones restrictivae intermediae) , máe preferiblemente a al menoe 60°C (condicionee reetrictivas intermedias-altae) , aún máe preferiblemente a al menoe 65°C (condicionee reetrictivae altas) y mucho más preferiblemente a al menos 70°C (condiciones restrictivae muy altas) . Para las sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones restrictivas se definen como la prehibridación, hibridación y lavado pos-hibridación de 5°C a 10°C abajo de la Tm calculada utilizando el cálculo de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M pH 7.6, EDTA 6 mM, NP-40 al 0.5%, eolución de Denhardt IX, pirofoefato de sodio 1 mM, foefato monobásico sódico 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientoe eetándar de inmunotraneferencia Southern. Para lae sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en SSC 6X más SDS al 0.1% durante 15 minutos y dos veces cada 15 minutos utilizando SSC 6X de 5°C a 10°C abajo de la Tm calculada. La presente invención también se refiere a variantes del polipéptido que tienen una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más aminoácidos . Las secuenciae de aminoácidoe de los polipéptidoe variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 por una ineerción o eupreeión de uno o máe reeiduoe de aminoácidoe y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de carácter menor, es decir sustituciones de aminoácidos conservadorae que no afectan eignificativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de 1 a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino- o carboxilo-terminales, tal como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido conector pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina. Loe ejemploe de eustituciones conservadoras están dentro del grupo de los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Por consiguiente, por ejemplo, la invención se refiere a un polipéptido que tiene, o que comprende, una secuencia como se establece en la SEC ID NO: 2, preferiblemente la parte madura de la misma, en donde las suetituciones de aminoácidos conservadoras comprenden reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos básicos (arginina, lisina e hietidina) , entre loe aminoácidoe ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico, entre los aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , entre los aminoácidos hidrófobos (alanina, leucina, isoleucina y valina) , entre los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y entre los aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) o cualquier combinación de los mismos o fragmentos activos de los mismoe. Como ee define en eete documento, un polipéptido "aielado" o "puro" es un polipéptido el cual está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo, al menos 80% puro, preferiblemente al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% o al menos 90% puro, más preferiblemente al menos 91% 92%, 93%, 94%, 95% o al menos 96% puro, como se determina por medio de SDS-PAGE (por ejemplo, por medio de la tinción con coomassie y la exploración subsecuente por medio de métodos conocidos en el campo - véase los Ejemplos 2 y 4) . La pureza también puede determinaree por medio de la CLAR, preferiblemente la CLAR de faee inverea (por ejemplo, utilizando una columna C18 Watere µ-Bondapak, Faee móvil A: TFA al 0.1%, Fase móvil B: Acetonitrilo + TFA al 0.1%, detección a 280 nm - véase el Ejemplo 10) . La pureza en SDS-PAGE, así como también la pureza en CLAR, ee refiere a la cantidad del polipéptido de la invención, con relación a la cantidad de la proteína total. En modalidades alternativas, el polipéptido puede ser al menos 20%, 40%, 60% o al menos 70% puro. La cantidad de proteína total puede determinaree por medio de cualquier método conocido en el campo, por ejemplo el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methode of Analysis 14a edición, Aeeociation of Official Analytical Chemists, Washington DC) y la cantidad del polipéptido de la invención puede determinarse por medio de SDS-PAGE y la exploración eubeecuente, también por medio de métodoe conocidoe en el campo.
Los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindibles en los cuales se fusiona otro polipéptido en la terminación N o la terminación C del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce el fusionar una secuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) que codifica otro polipéptido a una eecuencia de ácido nucleico (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en el campo e incluyen la ligadura de las secuenciae de codificación que codifican los polipéptidos de manera que estén dentro de la estructura y que la expresión del polipéptido fusionado sea bajo control del (los) miemo (e) promotor (ee) y el terminador. En una modalidad eepecífica, el polipéptido es una variante alergénica baja, dieeñada para invocar una reepuesta inmunológica reducida cuando se expone a animales, inclusive el hombre. El término respuesta inmunológica debe entenderse como cualquier reacción por el sistema inmune de un animal expuesto al polipéptido. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles incrementados de IgE en el animal expuesto. Las variantes alergénicas bajae pueden prepararee utilizando técnicae conocidae en el campo. Por ejemplo, el polipéptido puede conjugaree con porciones de polímeroe que protegen porciones o epítopos del polipéptido implicado en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicaree en el acoplamiento químico in vitro del polímero con el polipéptido, por ejemplo como ee describe en los documentos WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 y/o WO 99/00489. La conjugación puede implicarse además o alternativamente a la misma en el acoplamiento in vivo de polímeros con el polipéptido. Esta conjugación puede lograrse por medio de la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Otra manera para proporcionar variantes alergénicas bajas es la ingeniería genética de la eecuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido para causar que los polipéptidos se oligomericen por sí miemos, ocasionando que los monómeros de polipéptidos puedan proteger a los epítopos de otros monómeros de polipéptidos y disminuyendo con lo cual la antigenicidad de los oligómeros. Estos productos y su preparación se describen en por ejemplo el documento WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden identificarse por medio de varios métodos tales como el método de exhibición de fagos descrito en los documentos WO 00/26230 y WO 01/83559, o el planteamiento aleatorio descrito en el documento EP 561907. Una vez que se ha identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos puede alterarse para producir propiedades inmunológicas alteradas del polipéptido por medio de técnicas de manipulación de genes conocidas tales como la mutagénesis dirigida al sitio (véase por ejemplo los documentos WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse en proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al epítopo.
Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probiótico En un eegundo especto, la invención ee refiere al ueo en el alimento para animalee de una cepa de Bacillue, el ADN del cual, cuando ee recolecta y ee utiliza como una plantilla de ADN en la reacción de PCR con lae SEC ID NOe : 6 y 7 como cebadoree, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb. Eeta prueba eirve para identificar cepas con un gen similar a L12, véase el Ejemplo 6 en este documento. Estas cepas de Bacillus también pueden utilizarse en la preparación de una composición para el uso en el alimento para animales. Estos usos son, por ejemplo, con el propósito de mejorar la relación de conversión de alimento (FCR) y/o de modular la microflora del intestino. En una primera modalidad particular, la cepa de Bacillus es un microorganismo probiótico. El termino "probiótico" se refiere en general a una bacteria no patógena que se proporciona como alimento a los animales, inclusive aves, como una forma para prevenir la colonización por bacteriae patógenas. El concepto básico es promover la colonización de superficies mucosas como una forma para bloquear la colonización por agentes patógenos serioe . Los probióticos también pueden definiree como microorganismos vivos, o soportables, los cuales afectan de manera benéfica el balance intestinal de humanos y animales saludables y que funcionan normalmente, incrementando con lo cual preferiblemente la ganancia de peso vivo y/o mejorando la conversión de alimento. En una segunda modalidad particular, la cepa de Bacillus se utiliza en la forma de esporas. Las esporas pueden ser exoesporaeo, preferiblemente, endoeeporae . Una endoeepora ee cualquier espora que es producida dentro de un organismo (usualmente una bacteria) . Las endoesporas pueden eobrevivir a travée de periodoe de teneión ambiental y por lo tanto son capaces de sobrevivir el paso del ambiente severo (ácido) del tracto gastrointeetinal euperior, mientrae que solo ejerce su efecto una vez que alcanza los intestinos, donde se formarán células vegetativas normales . En una tercera modalidad particular, el fragmento de PCR, cuando es purificado y secuenciado codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2. Las modalidades particulares del primer aspecto de la invención (el polipéptido y su uso en el alimento para animales) también son aplicables a este aspecto de la invención. En modalidades particulares adicionales, la cepa de Bacillus es una cepa de Bacillus licheniformis, seleccionada preferiblemente de las siguientes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689 y ATCC 53757. Un subgrupo preferido incluye Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) y Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) . En modalidades particulares aún adicionales, la cepa de Bacillus para el uso de acuerdo con la invención (i) no es Bacillus licheniformis DSMZ 5749, (ii) no es Bacillus subtilie DSMZ 5750 y/o (iii) no ee Bacillue licheniformis FERM BP-266. Las cepas de (i) y (ii) eetán incluidas en el producto BioPlus 2BMR, véaee por ejemplo, en documento EP 1472933. La cepa de (iii) ee describe en el documento GB 2138023. Para una clasificación taxonómica e identificación de bacterias se hace referencia a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986), volumen 2, ISBN0-683-0783 ; véase por ejemplo la página 1104 sección 13, Endospore forming Gram positive rods and cocci; página 1105 Genue Bacillus; páginas 1105-1129 description of the genus; páginas 1130-1138 description of the individual Bacillus epecies, por ejemplo en la página 1132 Bacillus licheniformis) . En caso distinto, se puede utilizar el análisis de secuencias 16SrRNA bien conocido (véase por ejemplo Johansen y colaboradoree, Int. J. Syet. Bacteriol, 1999, 49, 1231-1240, en particular la eección de Métodos en la página 1233, 2a columna); o se pueden coneultar expertoe en taxonomía, por ejemplo de DSMZ u otroe institutos depositarioe reconocidoe . Lae cepae de Bacillue, talee como lae cepas de Bacillus licheniformis, son conocidae en el campo y están disponiblee de, por ejemplo, colecciones de cultivos como ATTC mencionada anteriormente o pueden aislarse de la naturaleza. Las preparaciones de células de Bacillus vivas o soportablee pueden prepararse como es sabido en el campo. Los ejemplos de estas células son células vegetativas y esporas tales como endoesporae . En una modalidad, ee utiliza un extracto de fermentación de la cepa de Bacillus, por ejemplo en forma de un licor de fermentación secado por pulverización . La prueba del Ejemplo 6 es una reacción PCR, en este ejemplo conducida con ADN aislado de varias cepas de Bacillus licheniformie . En una modalidad particular de eeta prueba, el ADN utilizado como plantilla para la reacción PCR es ADN cromosómico el cual puede aislaree por medio de métodoe conocidos en el campo. El resultado de la prueba del Ejemplo 6 es positivo cuando se obtiene un fragmento de PCR del tamaño correcto. En el Ejemplo 6, el tamaño correcto se indica como 0.4kb. En una modalidad particular, el tamaño correcto es entre 0.35kb y 0.44kb (=350pb-440pb) . En modalidades alternativas, el tamaño correcto es 330-430pb, 340-420pb, 350-410pb, 360-400pb, 370-390pb o 385-395pb. El tamaño de las secuencias de codificación (CDS) de la SEC ID N0:1 es aproximadamente 380pb (específicamente 378pb) .
Secuencias de Acido Nucleico La invención también ee refiere a una eecuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica polipéptidos, la cual (a) codifica el polipéptido de la invención; (b) se hibridiza bajo condiciones restrictivas muy bajas con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (i) ,- y/o (c) tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l de al menos 48%; con la condición que la secuencia de ácido nucleico no sea (iv) la SEC ID NO: 3 y no sea (v) los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO: 3 y no sea (vi) los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO : 1. La presente invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención . En cuanto a la condición anterior, se hace referencia a la eección de la técnica anterior en eete documento. Por coneiguiente, la renuncia de responsabilidades (iv) se refiere a la SEC ID NO: 133 del documento WO 03/093453, la renuncia de responeabilidades (v) se refiere a los nucleótidos 601 a 978 de la misma y la renuncia de responeabilidadee (vi) se refiere al número de acceeo de GenBank NC_006270. Estas renuncias de responeabilidades son opcionales; en modalidades alternativas de las mismae, la eecuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido el cual (i) no incluye una parte de péptido de eeñal (ii) no incluye una parte de propéptido y/o (iii) ee un polipéptido maduro. En lae modalidadee alternativae adicionalee, la eecuencia de ácido nucleico comprende, en caeo distinto tiene, o consiete (eeencialmente) de, 150-360 nucleótidoe, preferiblemente 165-345, 180-330, 195-315, 210-300, 225-285 o mucho máe preferiblemente 240-270 aminoácidoe. La identidad y la hibridación ee definen en una eección previa. En una primera modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido el cual mejora la utilización del alimento para animales al mejorar la relación de conversión de alimento (FCR) y/o modular la microflora del intestino . Una secuencia de ácido nucleico particular de la invención son los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , ésta última corresponde a la región de codificación de polipéptido madura. Otras secuenciae de ácido nucleico particulares de la invención son aquellas que codifican el polipéptido de los aminoácidos 1-85 de cualquiera de las SEC ID NOs : 2 , 8, 9 y 10. La presente invención también incluye secuencias de ácido nucleico las cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2, la cual difiere de las partes correspondientee de la SEC ID N0:1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también ee refiere a subsecuenciae de la SEC ID NO:l las cualee codifican fragmentos de la SEC ID NO: 2. Una subsecuencia de la SEC ID NO : 1 es una secuencia de ácido nucleico incluida por la SEC ID NO : 1 excepto que se han suprimido uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' . Preferiblemente una subsecuencia contiene al menos 150 nucleótidos, más preferiblemente al menos 165, 180, 195, 210, 225, 240, 270, 285, 300, 315, 330 o mucho máe preferiblemente al menos 345 nucleótidoe. La preeente invención también ee refiere a eecuenciae de nucleótidos las cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido y la cual tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l de al menos 48%. Para determinar el grado de identidad de nucleótidos, se utiliza el programa "align" el cual ee referido anteriormente. En lae modalidadee preferidae, el grado de identidad con loe nucleótidoe 124-378 de la SEC ID N0:1 ee al menoe 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o al menoe 99%. En modalidadee alternativas, el grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 es al menos 32% o al menos 35%, 37%, 40%, 42%, 45% o al menos 47%. La presente invención también se refiere a secuenciae de ácido nucleico mutantes que comprenden al menos una mutación en los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO J , en la cual la secuencia de ácido nucleico mutante codifica un polipéptido el cual (i) consiste de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o (ii) es una variante de la secuencia de (i), en donde la variante comprende una sustitución, supreeión y/o ineerción de uno o máe aminoácidoe o (iii) es una variante alélica de la secuencia de (i) o (iv) es un fragmento de la secuencia de (i) . Las técnicas utilizadas para aislar o clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido son conocidas en el campo e incluyen el aislamiento del ADN genómico, preparación de ADNc o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención a partir de este ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, por medio del uso de la reacción en cadena de la polimerasa bien conocida (PCR, por sus siglas en inglés) o la selección con anticuerpos de genotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructuralee compartidae. Véaee por ejemplo Innis y colaboradores, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sue siglae en inglés) , tranecripción activada ligada (LAT, por eue eiglae en inglés) y amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA, por sus siglae en inglée) . La secuencia de ácido nucleico puede clonarse a partir de una cepa de Bacillus, preferiblemente Bacillus licheniformis, u otro organismo o un organismo relacionado y de esta manera, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificadora de polipéptidos de la secuencia de ácido nucleico. El término "secuencia de ácido nucleico aislada" utilizada en este documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo es al menos aproximadamente 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente 40% pura, más preferiblemente al menos aproximadamente 60% pura, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 80% pura y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente 90% pura determinado por medio de la electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico aislada puede obtenerse por medio de procedimientos de clonación estándar que se utilizan en la ingeniería genética para reubicar la secuencia de ácido nucleico de su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, una ineerción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula hoepedante donde eerán replicadas múltiples copias o clones de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser genómica, ADNc, ARN, semisintética, de origen sintético o cualquier combinación de los mismos. La modificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la sínteeie de polipéptidoe euetancialmente eimilares al polipéptido. El término "suetancialmente eimilar" al polipéptido se refiere a formae del polipéptido que no eon de origen natural. Eetoe polipéptidoe pueden diferir en alguna forma dieeñada a partir del polipéptido aielado de su fuente natural, por ejemplo variantes que difieren en la termoestabilidad, estabilidad hacia el pH, estabilidad hacia enzimas digestivas, alergenicidad o similaree. La secuencia variante puede conetruirse sobre la base de la secuencia de ácido nucleico presentada como la parte que codifica polipéptidos de la SEC ID N0:1, por ejemplo una subsecuencia de la misma, y/o por medio de la introducción de suetitucionee de nucleótidoe que no dan origen a otra eecuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico, pero que corresponden al uso de codones del organismo hospedante propuesto para la producción del polipéptido o por medio de la introducción de suetitucionee de nucleótidos que pueden dar origen a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la suetitución de nucleótidos véase, por ejemplo, Ford y colaboradores, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Los polipéptidos alergénicos bajos pueden prepararse por ejemplo como se describiera anteriormente . La presente invención también se refiere a secuenciae de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido y que se hibridiza bajo condiciones restrictivae muy bajae, preferiblemente condicionee reetrictivas bajas, más preferiblemente condiciones restrictivas intermedias, más preferiblemente condiciones restrictivas intermedias-altas, aún más preferiblemente condiciones restrictivas altas y mucho más preferiblemente condiciones reetrictivas muy altas con una sonda de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo las mismae condicionee con la eecuencia de ácido nucleico de la SEC ID N0:1 o su cadena complementaria; o variantes alélicas y subsecuenciae de la misma (Sambrook y colaboradores, 1989, supra), como se define en este documento. La presente invención también se refiere a eecuencias de ácido nucleico aisladae que eon producidas al (a) hibridizar un ADN bajo condiciones restrictivae muy bajae, bajae, intermediae, intermediae-altae, altas o muy altas con (1) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subsecuencia de (i) o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) ; y (b) aislar la secuencia de ácido nucleico. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica un fragmento de polipéptido. La presente invención se refiere además a métodos para producir una secuencia de ácido nucleico mutante, que comprende introducir al menos una mutación en la secuencia codificadora de polipéptidos madura de la SEC ID NO:l o una subeecuencia de la misma, en donde la secuencia de ácido nucleico madura codifica un polipéptido el cual consiete de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2; o un fragmento de la miema . La introducción de una mutación en la eecuencia de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede realizarse por medio de la mutagénesis dirigida al sitio utilizando cualquiera de los métodos conocidos en el campo. Es particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticoe que contienen la mutación deeeada. Loe cebadores de oligonucleótidos, cada uno complementario para las cadenas opuestae del vector, se extienden durante la variación cíclica de la temperatura por medio de la ADN polimerasa Pfu. Con la incorporación de los cebadores, se genera un plásmido mutado que contiene mellas escalonadas. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con Dpnl el cual es específico para que el ADN metilado o hemimetilado digiera la plantilla de ADN precursora y seleccione el ADN sintetizado que contiene una mutación. También ee pueden utilizar otros procedimientos conocidos en el campo .
Construcciones de Acido Nucleico La presente invención también ee refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico de la presente invención unida de manera operable a una o más secuenciae de control que dirigen la expreeión de la secuencia de codificación en un hospedante de expresión adecuado. Los hospedantee de expresión adecuados son células hospedantes de Bacillus, el ADN de las cuales, cuando se recolectan y se utilizan como una plantilla de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, como se describe en el Ejemplo 6, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb. Los ejemplos de células hospedantes adecuadas se mencionan en la sección posterior titulada "células hospedantee" . Se entenderá que la expresión incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido inclusive, pero no limitado a, la transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción y eecreción. Una "conetrucción de ácido nucleico" ee define en este documento como una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, la cual se aisla de un gen de origen natural o la cual ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico combinado y yuxtapuesto de una manera que no existiría de otra manera en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo del término cásete de expresión cuando la construcción de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención. El término "secuencia de codificación" se define en este documento como una secuencia de ácido nucleico que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia de codificación son determinados generalmente por un sitio de enlace de ribosoma (procariotes) o por medio del codón de inicio ATG (eucariotes) localizados precisamente en dirección 5' del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia terminadora de transcripción localizada precisamente en dirección 3' del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, ADN, ADNc y secuenciae de ácido nucleico recombinantes. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede manipularse en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácido nucleico antes de eu ineerción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de ácido nucleico utilizando los métodos de ADN recombinante son bien conocidas en el campo . El término "secuencias de control" se define en este documento para incluir todoe loe componentee que eon necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la eecuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Eetae eecuencias de control incluyen, pero no están limitadas a, una secuencia líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, eecuencia promotora, eecuencia de péptidos de señal y terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de detención de tranecripción y traducción. Lae eecuenciae de control pueden proveeree con conectoree con el propóeito de introducir eitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de lae eecuencias de control con la región de codificación de la eecuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. El término "unido de manera operable" ee define en eete documento como una configuración en la cual una eecuencia de control ee coloca apropiadamente en una poeición con relación a la eecuencia de codificación de la eecuencia de ADN de tal manera que la secuencia de control dirija la expresión de un polipéptido. La secuencia promotora, es decir una eecuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula hospedante para la expresión de la secuencia de ácido nucleico, contiene secuenciae de control de tranecripción que median la expreeión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad tranecripcional en la célula hoepedante preferida que incluye loe promotoree mutantee, truncadoe e híbridoe y ee puede obtener a partir de genee que codifican polipéptidoe extracelularee o intracelularee ya eea homólogos o heterólogoe para la célula hoepedante. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de lae construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedante de Bacillus licheniformis la cual es positiva en la prueba del Ejemplo 6 en este documento son los promotores obtenidos a partir del gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilue (amyM) , gen de alfa-amilaea de Bacillue amyloliquefaciene (amyQ) , un promotor CryllIA (véaee el documento WO 99/43835) , así como también el promotor endógeno L12 de cualquiera de las células hospedantee específicas de Bacillus licheniformis mencionadas posteriormente . La secuencia terminadora de transcripción, es decir una secuencia reconocida por una célula hospedante para terminar la transcripción, se une de manera operable a la terminación 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedante preferida puede utilizarse en la presente invención. Los terminadores preferidos de las células hospedantes de Bacillus licheniformis mencionadas anteriormente son los terminadores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y el terminador endógeno L12 de cualquiera de esas células hospedantes. La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula hospedante. La secuencia líder se une de manera operable a la terminación 5' de la eecuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedante preferida puede utilizarse en la presente invención. La región de codificación de péptidos de señal codifica una eecuencia de aminoácidoe unida a la terminación amino de un polipéptido que dirige el polipéptido codificado en la vía secretoria de la célula. En una modalidad preferida, la región de codificación de péptidos de señal es los nucleótidos 1-123 de la SEC ID NO:l los cuales codifican los aminoácidos -41 a -1 de la SEC ID NO : 2. De acuerdo con el software SignalP Versión 3.0, el péptido de señal previsto de la SEC ID NO: 2 es los aminoácidos -41 a -2. Esto significa que la proteína madura prevista inicia en el aminoácido -1 de la SEC ID NO: 2, específicamente Ala. Sin embargo, de acuerdo con el Ejemplo 2 en este documento, la N-terminal de la proteína madura inicia con el aminoácido +1 de la SEC ID NO : 2 , específicamente Trp, lo cual significa que la parte de péptido de señal abarca de los aminoácidos -41 a -1 de la SEC ID NO: 2, la cual es un aminoácido más larga que lo previsto. Por lo tanto, los aminoácidos -1 a +85 de la SEC ID NO: 2 son una forma madura alternativa de la proteína L12, la cual también es parte de la presente invención. Por coneiguiente, cualquier reivindicación y cualquier declaración en eete documento que se refiere a los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 también puede referirse por lo tanto, o alternativamente, a los aminoácidos -1 a +85 de la SEC ID NO: 2. El miemo caeo es para cualquier reivindicación y cualquier declaración en este documento con referencia a la parte correspondiente de la SEC ID NO:l: los nucleótidos 121-378 de la SEC ID NO : 1 pueden ser referidos además, o en caso distinto, los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1. Del mismo modo, cualquier referencia en este documento a la parte de señal de la SEC ID NO: 2 también puede ser, o en caso distinto, los aminoácidos -41 a -2 de la SEC ID NO: 2. La parte correspondiente de la SEC ID NO : 1 es los nucleótidos 1-120 de la SEC ID NO : 1. Cualquier reivindicación y cualquier declaración en este documento con referencia a la parte de péptidos de señal también puede referiree por lo tanto o alternativamente, a loe nucleótidoe 1-120 de la SEC ID NO J .
El método de SignalP V. 3.0 ee deecribe en Bendtsen y colaboradoree in Journal of Molecular Biology 2004, 340(4), páginae 783-95. Véase también Nielsen y colaboradores en Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systeme for Molecular Biology (ISMB 6) , AAAI Press, Menlo Park, California, páginas 122-130, 1998 (V. 2.0) y Nielsen y colaboradores en Protein Engineering 10, 1-6 (1997) (V. 1.1) .
Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una conetrucción de ácido nucleico de la invención, tal como los vectores de expreeión recombinantee que comprenden una eecuencia de ácido nucleico de la preeente invención, un promotor y eeñalee de detención de transcripción y traducción. Las diversas secuencias de ácido nucleico y de control descritas anteriormente pueden unirse conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en estoe eitioe. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede expresarse al insertar la secuencia de ácido nucleico o una conetrucción de ácido nucleico que comprende la eecuencia en un vector apropiado para la expreeión. En la creación del vector de expreeión, la secuencia de codificación se localiza en el vector de manera que la secuencia de codificación se une de manera operable con las secuenciae de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda eometeree convenientemente a procedimientoe de ADN recombinante y pueda causar la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La eelección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedante en la cual debe introducirse el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedante, se integra en el genoma y se replica junto con el (los) cromosoma (e) en los cuales ha sido integrado. Además, se puede utilizar un vector o plásmido individual o dos o más vectores o plásmidos los cuales contienen juntos el ADN total a introducirse en el genoma de la célula hospedante o un transposón. Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables los cuales permiten la fácil selección de células transformadae . Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resietencia a biocidae o reeistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxotrofos y similaree. Loe ejemplos de marcadoree eeleccionablee bacterianoe eon los genes dai de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis o marcadores los cuales confieren resietencia a antibióticoe tal como reeietencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Loe vectoree de la preeente invención contienen preferiblemente un (unos) elemento (s) que permite (n) la integración estable del vector en el genoma de la célula hospedante o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para la integración en el genoma de la célula hospedante, el vector puede depender de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración eetable del vector en el genoma por medio de la recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias adicionales de ácido nucleico para dirigir la integración por medio de la recombinación homologa en el genoma de la célula hospedante. Las secuenciae de ácido nucleico adicionales hacen posible que el vector sea integrado en el genoma de la célula hospedante en una (unas) ubicación(es) preciea(e) en el(loe) cromosoma (e) . Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación preciea, loe elementoe de integración deben contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1,500 pares de basee y mucho más preferiblemente de 800 a 1,500 pares de basee, los cuales son sumamente homólogos con la secuencia objetivo correspondiente para aumentar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedante. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ácido nucleico codificadoras o no codificadorae . Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedante por medio de la recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que hace posible que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedante en cuestión. Los ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli y pUBllO, pEl94, pTAl060 y pAMßl que permiten la replicación en Bacillus. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación la cual hace que su funcionamiento sea seneible a la temperatura en la célula hoepedante (véase, por ejemplo, Ehriich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75: 1433) . Más de una copia de una secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede insertarse en la célula hospedante para incrementar la generación del producto génico. Un incremento en el número de copias de la secuencia de ácido nucleico puede obtenerse al integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de célula hospedante o al incluir un gen marcador seleccionable, amplificable con la secuencia de ácido nucleico donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y por lo cual las copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico, pueden seleccionarse para cultivar las células en presencia de un agente seleccionable apropiado. Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritoe anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos para una persona experta en el campo (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989, supra).
El polipéptido de la invención también puede ser co-expresado junto con al menos otro componente de interés para el alimento para animales, tal como un polipéptido con una actividad enzimática deseada para el uso en un alimento para animales. El polipéptido de la invención y al menos otro polipéptido pueden ser co-expresadoe de diferentee vectoree, de un vector, o utilizando una mezcla de ambae técnicae.
Células Hospedantes La invención se refiere además a una célula hospedante recombinante de Bacillus que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención y/o un vector de expreeión de la invención. El ADN de la célula hoepedante, cuando es recolectado y utilizado como una plantilla de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb. En una modalidad particular, el fragmento de PCR, cuando ee purificado y eecuenciado codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2. Las modalidadee particulares del primer aspecto de la invención (en particular aquellas descritae en las secciones tituladas "El Polipéptido, sue Características y Uso" e "Identidad e Hibridización, Fragmentos y Variantes") también son aplicables a las células hospedantes de la invención. Por ejemplo, en las modalidades particulares adicionales de la célula hospedante de Bacillus de la invención, el fragmento de PCR, cuando es purificado y secuenciado, codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 35% o al menos 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o al menos 99%. En modalidades particulares aún adicionales, la célula hospedante de Bacillus ee una célula hoepedante de Bacillue licheniformis, seleccionada preferiblemente de las siguientee cepae de Bacillus licheniformie : ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689 y ATCC 53757. Un subgrupo preferido incluye Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) y Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) . Estas células hospedantes se utilizan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención ee introduce en la célula hospedante de manera que el vector ee mantiene como un integrante cromoeómico o como un vector extracromoeómico auto-replicante como se describe al principio. El término "célula hospedante" incluye cualquier progenie de la célula precursora que no sea idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La introducción de un vector en una célula hospedante bacteriana puede efectuarse, por ejemplo, por medio de la transformación de protoplastos, (véase, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115) , utilizando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751) o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278) .
Métodos de Producción La invención también se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, el método comprende (a) cultivar una célula hospedante recombinante de la invención para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La invención se refiere además a un método para producir un polipéptido de la invención, el método comprende (a) cultivar una cepa de Bacillus, el ADN de la cual, cuando se recolecta y ee utiliza como una plantilla de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOe : 6 y 7 como cebadoree, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4 kb; y (b) recuperar el polipéptido. Loe ejemploe de célulae hoepedantee se mencionan en la sección anterior titilada "Células hospedantee". La presente invención también ee refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una célula hospedante recombinante de Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) o Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) bajo condiciones conducentes para la producción del polipéptido, en donde la célula hospedante comprende una secuencia de ácido nucleico mutante que comprende al menos una mutación en los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , en la cual la secuencia de ácido nucleico mutante codifica un polipéptido el cual (i) consiste de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o (ii) es una variante de la secuencia de (i), en donde la variante comprende una suetitución, eupresión y/o inserción de uno o máe aminoácidos o (iii) es una variante alélica de la secuencia de (i) o (iv) es un fragmento de la secuencia de (i) . En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente que es adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, la célula puede cultivaree por medio del cultivo en matraz agitador, fermentación a pequeña o gran eecala (inclusive las fermentaciones continuas, discontinuae por lotes alimentados, por lotes alimentados repetidos o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado o bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo toma lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y salee inorgánicae, utilizando procedimientoe conocidoe en el campo. Loe medioe adecuados están disponiblee de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con compoeiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de the American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, el polipéptido puede recuperaree directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede recuperarse de los lisados de células. Los polipéptidos pueden detectarse utilizando métodos conocidos en el campo que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicoe: un análisis de gel SDS-PAGE que revela una banda de un peso molecular relativo, Mr, de aproximadamente 12 kDa; y/o la determinación de la secuencia N-terminal, en muestrae purificadas y/o en la banda de un Mr de 12 kDa, como un recorte del gel SDS-PAGE. En el último caeo, la N-terminal debe tener preferiblemente una identidad con la SEC ID NO : 5 de al menoe 33% o al menos 35%, 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97% o al menos 99%, el porcentaje de identidad se determina como se describiera en general anteriormente) . El polipéptido resultante puede recuperarse por medio de métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente por medio de procedimientos convencionales que incluyen, pero no están limitados a, centrifugación, filtración (tal como ultrafiltración y/o diafiltración) , extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención pueden purificaree por medio de una variedad de procedimientoe conocidoe en el campo que incluyen, pero no están limitados a, la cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque y de exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéricos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
Composiciones y Usos En un aspecto aún adicional, la presente invención se refiere a composicionee que comprenden un polipéptido y/o una cepa de Bacillus de la preeente invención. Lae composicionee de polipéptidoe pueden prepararee de acuerdo con métodos conocidos en el campo y pueden estar en la forma de un líquido o una composición eeca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en la forma de un material granulado o un material microgranulado. El polipéptido que será incluido en la composición puede estabilizaree de acuerdo con métodoe conocidos en el campo. Los ejemplos particulares de composicionee de la invención son los siguientes : Un aditivo de alimento para animales que comprende (a) i) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4 y/o ii) un polipéptido de la invención; y (b) al menos una vitamina liposoluble, (c) al menos una vitamina soluble en agua, (d) al menos un mineral traza y/o (e) al menos un macromineral ; una composición de alimento para animales que tiene un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende i) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO : 4 y/o ii) un polipéptido de la invención; un aditivo de alimento para animales que comprende (a) una cepa de Bacillus como se definiera en la sección titulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probiótico"; y (b) al menos una vitamina liposoluble, (c) al menos una vitamina soluble en agua, (d) al menos un mineral traza y/o (e) al menos un macromineral ; y una composición de alimento para animales que tiene un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende una cepa de Bacillus como se definiera en la sección titulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probiótico" . Las denominadas mezclas previas son ejemplos de aditivos de alimento para animales de la invención. Una mezcla previa eepecifica una mezcla preferiblemente uniforme de uno o máe micro-ingredientee con un diluyente y/o portador. Lae mezclas previas se utilizan para facilitar la dispersión uniforme de microingredientes en una mezcla más grande . Los ejemplos de usos preferidos de acuerdo con la invención se proporcionan anteriormente (en las secciones tituladas "El Polipéptido, sus Características y Uso" y "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probiótico") y se detallan adicionalmente más adelante.
Alimento para Animales El término animal incluye todos los animales . Los ejemplos de animales son rumiantes y no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y ganado vacuno, por ejemplo vacas tales como ganado vacuno para carne y vacas lecheras. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdo o porcino (que incluye, pero no eetá limitado a, lechones, cerdos en desarrollo y cerdas); aves de corral tales como pavos, patos y pollos (inclusive pero no limitado a pollos de cría, gallinas ponedoras) ; peces (inclusive pero no limitado a salmón, trucha, tilapia, bagre y carpa) y crustáceoe (inclueive pero no limitado a camarones y langostinos) . El término alimento o composición de alimento significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuado para o hecho expresamente para la captación por un animal . En el uso de acuerdo con la invención, el polipéptido y/o la cepa de Bacillus pueden proporcionarse como alimento al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último. En una modalidad particular, el polipéptido, en la forma en la cual se agrega al alimento, o cuando se incluye en un aditivo de alimento, está bien definido. El término bien definido significa que la preparación del polipéptido es al menos 50% pura, determinado como se describiera previamente o por medio de la cromatografía de exclueión de tamaño (véaee el Ejemplo 12 del documento WO 01/58275) . En otrae modalidadee particularee, la preparación del polipéptido bien definida ee al menoe 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menoe 95% pura. La preparación del polipéptido bien definida ee ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al alimento un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos entrometidos o contaminantes. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo que consiste en obtener resultadoe coneietentee y constantes y la capacidad para optimizar una dosificación basada en el efecto deseado. Sin embargo, para el uso en un alimento para animales, el polipéptido no necesita ser aquel polipéptido puro; puede incluir por ejemplo otros polipéptidos tales como enzimas de alimento para animales, caso en el cual podría denominarse una preparación del polipéptido. La preparación del polipéptido se puede (a) agregar directamente al alimento (o utilizarse directamente en un proceso de tratamiento de proteínas) o (b) se puede utilizar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos de alimento o mezclas previas que se agregan subsecuentemente al alimento (o se utilizan en un proceso de tratamiento) . El grado de pureza descrito anteriormente se refiere a la pureza de la preparación del polipéptido original, ya sea utilizado de acuerdo con (a) o (b) anteriores . Las preparaciones de polipéptidos con purezas de este orden de magnitud se pueden obtener en particular utilizando métodos recombinantes de producción, dado que no se obtienen muy fácilmente y también están sujetae a una variación mucho más alta de lote a lote cuando el polipéptido se produce por medio de métodos de fermentación tradicionales. En el presente contexto, el término Relación de Conversión de Alimento o FCR, se utiliza a manera de sinónimo con el término conversión de alimento. La FCR se calcula como la captación de alimento en g/animal con relación a la ganancia de peso en g/animal, véase por ejemplo la Tabla 2 en el Ejemplo 5. El polipéptido puede agregarse al alimento en cualquier forma, puede estar como un polipéptido relativamente puro o en una mezcla con otros componentes hechos expresamente para la adición al alimento para animales, es decir en forma de aditivos de alimento para animales, tal como las denominadas mezclas previas para alimento para animalee. Con la excepción del polipéptido y/o la cepa de Bacillus de la invención, los aditivos de alimentos para animalee de la invención contienen al menoe una vitamina liposoluble y/o al menos una vitamina soluble en agua y/o al menos un mineral traza y/o al menos un macromineral. Además, los ingredientes de aditivos para alimentos opcionales son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina y luteína; compuestoe aromáticos; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliineaturadoe ; eepeciee generadoras de oxígeno reactivo; y/o al menos una enzima seleccionada entre fitasa (EC 3.L3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactoeidaea (EC 3.2.1.22); proteaea (EC 3.4.- .- ), fosfolipasa Al (EC 3. L32); fosfolipaea A2 (EC 3.1.1.4); lipofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipaea C (EC 3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6). En una modalidad particular, esas otras enzimas están bien definidas (como se definiera anteriormente para las preparaciones de polipéptidos). Los ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP's, por sus siglas en inglés) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1 , Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina y Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinae y Eetatinas, inclusive los compuestos y polipéptidos descritos en los documentos WO 03/044049 y WO 03/048148, así como también variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad anti-microbiana. Los ejemplos de polipéptidos anti-fúngales (AFP's, por eus siglae en inglés) son los polipéptidos Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como también variantes y fragmentos de los mismoe loe cualee retienen la actividad antifungal, como se describe en los documentos WO 94/01459 y WO 02/090384. Los ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliineaturadoe C18, C20 y C22 tal como ácido araquidónico, ácido docosohexaenóico, ácido eicosapentaenóico y ácido gamma-linoleico . Loe ejemploe de eepeciee generadorae de oxígeno reactivo eon productoe químicoe tales como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa. Usualmente las vitaminae lipoeolublee y eolublee en agua, aeí como también loe minerales traza forman parte de una denominada mezcla previa hecha expresamente para la adición al alimento, mientras que los macrominerales se agregan usualmente por separado al alimento. Cualquiera de esos tipos de composiciones, cuando son enriquecidos con un polipéptido o una cepa de Bacillus de la invención, es un aditivo de alimento para animales de la invención. En una modalidad particular, el aditivo de alimento para animales de la invención se hace expresamente para incluirse (o se prescribe como que tiene que ser incluido) en las dietas o el alimento para animales a niveles de 0.01 a 10.0%; más particularmente de 0.05 a 5.0%; o de 0.2 a 1.0% (el % eignifica g de aditivo por 100 g de alimento) . Eeto ee aeí en particular para lae mezclae previae . Lo siguiente son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes : Los ejemplos de vitaminas liposolublee eon vitamina A, vitamina D3 , vitamina E y vitamina K, por ejemplo vitamina K3. Loe ejemploe de vitaminae eolubles en agua son vitamina B12, biotina y colina, vitamina Bl, vitamina B2 , vitamina B6 , niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato. Los ejemplos de minerales traza son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto. Los ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio. Los requerimientos nutricionales de esos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones /cerdoe) se listan en la Tabla A del documento WO 01/58275. Un requerimiento nutricional significa que esoe componentee deben proporcionaree en la dieta en lae concentraciones indicadas.
En caso distinto, el aditivo de alimento para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A del documento WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres o cuatro y así sucesivamente hasta los trece o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, al menos este componente individual se incluye en el aditivo de la invención en tal cantidad para proporcionar una concentración en el alimento dentro del rango indicado en la columna cuatro, o columna cinco o columna seis de la Tabla A. Las composicionee o dietae de alimentos para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas para aves de corral y cerdos pueden estar caracterizadas como ee indica en la Tabla B del documento WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además estas dietas para peces tienen usualmente un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg. El documento WO 01/58275 correeponde al documento US 09/779334 el cual ee incorporado por eete acto a manera de referencia. Una composición de alimento para animales de acuerdo con la invención tiene un contenido de proteína cruda de 50-800 g/kg y además comprende al menos un polipéptido y/o al menoe una cepa de Bacillue como se describe y/o reclama en este documento. Además, o en caso distinto (al contenido de proteína cruda indicado anteriormente) , la composición de alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg. En las modalidades particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína y/o lisina está dentro de cualquiera de los rangos 2 , 3 , 4 o 5 en la Tabla B del documento WO 01/58275 (R. 2-5) . La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir la Proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno es determinado por medio del método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a edición, Association of Official Analytical Chemiste, Washington DC) . La energía metabolizable puede calcularse en base a the NRC publication Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, eubcommittee on ewine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national reeearch council. National Academy Preee, Waehington, D.C., páginas 2-6 y the European Table of Energy Valúes for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry reeearch and exteneion, 7361 DA Beekbergen, Los Paíeee Bajoe. Grafiech bedrijf Poneen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. El contenido dietético de calcio, fóeforo disponible y aminoácidos en las dietas completas para animales se calcula en base a las tablas de alimento tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenetelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelyetad. ISBN 90-72839-13-7. En una modalidad particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una proteína o fuente de proteínas vegetal. También puede contener una proteína animal , tal como harina de carne y hueso y/o harina de pescado, típicamente en una cantidad de 0-25%. El término proteínas vegetales utilizado en este documento se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada de o que se origina de proteínas o derivados de proteínas vegetales, inclusive proteínas modificadas. En las modalidades particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60% (p/p) .
Las proteínas vegetales pueden derivarse de fuentes de proteínas vegetales, tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, talee como harina de eemilla de eoya, harina de lupino y harina de semilla de colza. En una modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo semilla de soya, lupino, chícharo o fríjol. En otra modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo betabel, betabel azucarero, espinaca o quinua. Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son la eemilla de colza, eemilla de giraeol, semilla de algodón y col . Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, tritical y sorgo. En modalidades particulares aún adicionales, la composición de alimento para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-30% de centeno; y/o 0-40% de harina de semilla de soya; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y hueso; y/o 0-20% de suero de leche. Las dietas para animales pueden manufacturarse por ejemplo como un alimento amasado (no granulado) o alimento granulado. Típicamente, los forrajes molturados se mezclan y se agregan cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificacionee para lae eepeciee en cuestión. El (los) polipéptido (s) y/o la cepa de Bacillue pueden agregarse como formulaciones sólidae o líquidae. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólida se agrega típicamente antes o durante el paso de mezclado; y una preparación de polipéptido líquida se agrega típicamente después del paso de granulación. El polipéptido también puede incorporarse en un aditivo o mezcla previa del alimento. La concentración final del polipéptido en la dieta está dentro del rango de 0.01-200 mg de proteína por kg de dieta, por ejemplo en el rango de 0.1-20 mg de proteína por kg de dieta animal. El polipéptido y/o la cepa de Bacillus deben aplicarse naturalmente en una cantidad efectiva, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la conversión de alimento. Se contempla actualmente que el polipéptido se administra en una o más de las siguientee cantidadee (rangoe de doeificación) : 0.01-200; 0.01-100; 0.5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50; 1-10 o 0.10-10, todoe estos rangos son en mg de proteína de polipéptido por kg de alimento (ppm) . En una modalidad particular, el rango de dosificación es 1-9, 1-8, 2-7, 2-6 o 2-5 ppm. Los ejemplos de un rango de dosificación particularmente preferidos son: 0.5-15.0, 1.0-12.5, 1.5-10.0 y 2.5-7.5 ppm. La cantidad del polipéptido es determinada como se describe para la proteína L12 en el Ejemplo 10. Se contempla actualmente que la cepa de Bacillus se administra en una o más de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 10 E2-14, 10 E4-12, 10 E6-10, 10 E7-9, preferiblemente 10 E8 CFU/g de alimento (la designación E significa exponente, específicamente por ejemplo 10 E2-14 significa 102-1014) . Para determinar el mg de proteína de polipéptido por kg de alimento, el polipéptido se purifica de la compoeición de alimento y la dosificación en mg de proteína de polipéptido por kg de alimento se calcula por ejemplo como se describe en el Ejemplo 10. Los mismos principios aplican para determinar el mg de proteína de polipéptido en los aditivos de alimento.
Depósito de Material Biológico El siguiente material biológico, el cual se aisló de contenidos intestinales de pollos de cría, como se describe en el Ejemplo 8, ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con DSMZ (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zehikulturen GmbH, Maecheroder Weg Ib, D-38124 Braunechweig, Alemania) y ee lee proporcionó loe siguientes números de acceso: Depósito Número de Acceso Fecha de Depósito Enterococcus faecalis DSM 18047 10 de Marzo de 2006 Lactobacillus salivarius DSM 18070 16 de Marzo de 2006 Los depósitos fueron hechos por Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880, Dinamarca. Estas cepas han sido depositadae conforme a lae condicionee que aeeguran que el acceso a los cultivos estará disponible durante el estado de pendiente de eeta solicitud de patente para uno determinado por el Comisionado de Patentee y Marcas Comerciales que tiene derecho al mismo conforme a 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. Los depósitoe repreeentan un cultivo sustancialmente puro de las cepas depositadas. Los depósitoe están disponibles como eea requerido por lae leyes de patente extranjeras en países en donde se presentan las contrapartes de la presente eolicitud o eu progenie. Sin embargo, ee debe entender que la dieponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la práctica de la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por una acción gubernamental . La invención descrita y reclamada en este documento no debe limitarse en su alcance por las modalidades específicae que se describen en este documento, puesto que estas modalidades se proponen como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se propone que cualquier modalidad equivalente está dentro del alcance de esta invención. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradae y descritas en este documento llegarán a ser aparentes para aquellas personas expertas en el cappo a partir de la descripción precedente. También se propone que estae modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, dominará la presente descripción inclusive las definiciones. Varias referencias se citan en este documento, las descripcionee de lae cualee ee incorporan a manera de referencia en su totalidad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN E emplos Ejemplo 1: Fermentación en Matraz Agitador de Bacillus licheniformis La cepa de Bacillus licheniformis ATCC 14580 se propagó durante toda la noche durante 37°C en un medio de agar TY (caldo TY solidificado con 2% de agar) y se inoculó en un matraz agitador que contenía 100 ml de caldo TY con la siguiente composición. Triptona: 20 g/1, Extracto de levadura: 5 g/1, FeCl2, 4H20: 7 mg/l, MnCl2, 4H20: 1 mg/l, MgS04, 7H20: 15 mg/l, pH 7.3. El matraz agitador se incubó a 37°C durante 20 horas con una velocidad de agitación de 225 rpm. Las células se retiraron por medio de la centrifugación. La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida del sobrenadante reveló una banda de un peso molecular relativo de 12 kDa que corresponde al polipéptido deseado. El polipéptido de la invención se designa "la proteína L12", debido a su peso molecular relativo de 12 kDa, por medio de SDS-PAGE (sin embargo, el peso molecular teórico puede calcularse para 9591.56 Da).
Ejemplo 2: Purificación de la fermentación en matraz agitador de Bacillus licheniformis El caldo de fermentación del Ejemplo 1 se centrifugó (20000 x g, 20 minutos) y los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente de los productos precipitados. Los sobrenadantes combinados se filtraron a través de una placa Seitz EKS" a fin de retirar las células de Bacillus. El producto filtrado de EKS^ se ultrafiltró y se diafiltró en casetes de corte 3k Filtron101 a fin de concentrar las proteínas y reducir la conductividad en el producto filtrado de Seitz EKS1^. El producto concentrado de Filtron1111 se filtró a través de otra placa Seitz EKS^. El pH del producto concentrado se ajustó a pH 4.5 con CH3COOH al 20%. Algo (no la proteína L12) en la solución se precipitó por medio del ajuste del pH y este producto precipitado se retiró por medio de la filtración a través de una placa Seitz K-250MR. El producto filtrado de K-250MR se aplicó a una columna SP-sefaróse FF^ de 100 ml equilibrada en CH3COOH 20 mM, H3B03 50 mM, CaCl2 1 mM ajustada a pH 4.5 con NaOH. Después de lavar intensamente la columna con el amortiguador de equilibrio, la proteína L12 se evaluó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 0.5M) en el mismo amortiguador. Las fracciones que contenían la proteína L12 se identificaron por medio del análisie de SDS-PAGE y eeae fracciones se acumularon y se diluyeron 10 veces con agua desmineralizada para reducir la conductividad de la acumulación. La acumulación se aplicó a una columna SOURCE Sm de 8 ml equilibrada en el miemo amortiguador de equilibrio (CH3COOH 20 mM, H3B03 50 mM, CaCl2 1 mM, ajuetada a pH 4.5 con NaOH) y deepuée de lavar intensamente la columna con el amortiguador de equilibrio, la proteína L12 ee eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0--> l.OM) en el miemo amortiguador. Lae fraccionee de la columna se analizaron por medio del análieis de SDS-PAGE y las fracciones que contenían la proteína L12 se acumularon, el pH se ajustó a pH 8 con NaOH al 3% y la acumulación se dejó en la habitación fría hasta el siguiente día. El ajuste a pH 8 causó que la proteína L12 se precipitara y al siguiente día el producto precipitado de L12 se recolectó por medio de la centrifugación (5000 x g, 10 minutos).
El producto precipitado de la proteína L12 se lavó con Tris/HCl 20 mM, pH 8 para incrementar la pureza de la proteína L12 precipitada. Despuée de una segunda centrifugación (5000 x g, 10 minutos) el producto precipitado de la proteína L12 se disolvió en un volumen mínimo de (CH3COOH 20 mM, H3B03 50 mM, CaCl2 1 mM, NaCl 100 mM ajustado a pH 4.5 con NaOH) y se aplicó a una columna de exclusión de tamaño Superdex 75" de 300 ml equilibrada en el mismo amortiguador . La columna Superdex 75MR se eluyó con el mismo amortiguador y las fracciones de la columna se analizaron por medio del análisis de SDS-PAGE. Las fracciones, donde solo se observó una banda en el gel de SDS-PAGE, teñido con coomassie, se acumularon como la preparación de proteína L12 purificada. Se agregó Glicerol a las fracciones L12 acumuladas a una concentración final de 50% (p/p) . La proteína L12 formulada con glicerol se almacenó fría en un refrigerador. La preparación era esencialmente pura como se determinó en un gel de SDS-PAGE teñido con coomassie (una banda) .
Características ; El peso molecular relativo determinado por medio de SDS-PAGE fue: Mr = 12kDa. Tse secuencia N-terminal fue: WVNPGYHYQYPSEGG (SEC ID NO: 5) .
Ejemplo 3: Fermentación de alimentación discontinua de Bacillus licheniformis Un proceso de fermentación de alimentación discontinua de Bacillus licheniformis ATCC 14580 se condujo como se describe a continuación. Todos los medios se esterilizaron por medio de métodos conocidos en el campo. A menos que se describa de otra manera, se utilizó agua potable. Las concentraciones de los ingredientes referidas en las siguientee recetae eon antee de cualquier inoculación. Medios Agar LB: 10 g/1 de peptona de caseína (tal como, catálogo de Fluka número 95039, digestión tríptica de caseína) ; 5 g/1 de extracto de levadura (manufacturado por medio de la autólisie de Saccharomycee cerevieiae, por ejemplo el número de catálogo 9512 de Organotechnie S.A., 27, avenue Jean Mermoz, F-93120 La Courneuve, Francia); 10 g/1 de cloruro de sodio; 12 g/1 de Bacto-agar (LB-agar (Miller) , Merck número de catálogo. 110283) ajustado a pH 7.0 +/- 0.2. Amortiguador M-9: di-fosfato ácido de sodio, 2H20 8.8 g/1; foefato diácido de potasio 3 g/1; cloruro de eodio 4 g/1; sulfato de magnesio, 7H20 0.2 g/1 (se utiliza agua desionizada en este amortiguador) . PRK-50: 110 g/1 de sémola de soya; Di-fosfato ácido de sodio, 2H20 5 g/1; antiespumante (tal como, por ejemplo, Struktol SB2121, Schill & Seilacher, Hamburg, Alemania) 1 ml/l: pH ajustado a 8.0 con NaOH/H3P0 antes de la esterilización. Medio de relleno: Triptona (Hidrolizado de caseína tal como, por ejemplo, digestión pancreática de caseína Bacto Tryptone^ número de catálogo 211699) 30 g/1; sulfato de magnesio, 7H20 4 g/1; difosfato ácido de potasio 7 g/1; difosfato ácido de sodio, 2H20 7 g/1; disulfato de amonio 4 g/1; ácido cítrico 0.78 g/1; vitaminas (dicloreto de tiamina 34.2 mg/l; riboflavina 2.9 mg/l; ácido nicotínico 23 mg/l; D-pantotenato de calcio 28.5 mg/l; piridoxal-HCl 5.7 mg/l; D-biotina 1.1 mg/l; ácido fólico 2.9 mg/l); metales traza (MnS0 , H20 39.2 mg/l; FeS0 , 7H20 157 mg/l; CuS04, 5H20 15.6 mg/l; ZnCl2 15.6 mg/l); Antiespumante (Struktol SB2121, véase anteriormente) 1.25 ml/l; el pH ee ajustó a 6.0 con NaOH/H3P0 antes de la esteriliación. El monopropilenglicol (MPG) 24 ml/l ee agregó 28 y 47 horas despuée de la inoculación (ee decir después de aproximadamente 1 y 2 días, respectivamente) , se agregó en total 48 ml/l de MPG. Medio de alimentación: Glucosa 1H20 820 g/1.
Procedimiento de Fermentación: La cepa de Bacillue licheniformis ATCC 14580 se desarrolló sobre superficies oblicuas de agar LB durante un día a 37 °C. El agar entoncee ee lavó con el amortiguador M-9 y ee midió la deneidad óptica (OD, por eue eiglae en inglée) a 650 nm de la suspeneión de células resultante. Los matraces agitadores de inoculo (con 100 ml de medio PRK-50) se inocularon con un inoculo de OD (650 nm) x ml de suspensión de células = 0.1 (lo cual significa que la cantidad requerida de inoculo en ml se encuentra al dividir 0.1 por la OD (650 nm) de la suspeneión de célulae de inoculo) . Loe matracee agitadores se incubaron a 37°C a 300 rpm durante 20 horas. Los fermentadores utilizados fueron fermentadores de laboratorio estándar equipados con un sistema de control de temperatura, control de pH con agua amoniacal y ácido fosfórico, electrodo de oxígeno disuelto para medir >20% de saturación de oxígeno a través de la fermentación completa. La fermentación en el fermentador principal (tanque de fermentación) se inició por medio de la inoculación del fermentador principal con el cultivo de crecimiento de un matraz agitador de inoculo. El volumen inoculado fue 10% del medio de relleno (80 ml para 720 ml de medio de relleno, dando por reeultado 800 ml de caldo inicial deepuée de la inoculación) . Los parámetros de fermentación fueron: Temperatura 41°C; pH entre 6.8 y 7.2 (utilizando agua amoniacal y ácido fosfórico, control 6.8 (agua amoniacal), ácido fosfórico 7.2). Aeración: 1.5 litros/minuto/kg del peeo del caldo de fermentación, agitación: 1500 rpm. El medio de alimentación se agregó como sigue: velocidad de alimentación inicial 0.05 g/minuto/kg al inicio de la fermentación, incrementando linealmente a 0.16 g/minuto g/kg despuée de 8 horae y permaneciendo a 0.16 g/minuto/kg haeta el final de la fermentación (por referencia al peso de partida del caldo de fermentación, precisamente después de la inoculación) . Después de 3 días (70 horas) , el caldo de fermentación ee recolectó y ee purificó como ee deecribiera en el Ejemplo 4 a continuación.
Ejemplo 4: Purificación de la fermentación de alimentación discontinua de Bacillus licheniformis El caldo de fermentación del Ejemplo 3 ee centrifugó (20000 x g, 20 minutoe) y loe eobrenadantes se decantaron cuidadosamente de los productos precipitados. Los sobrenadantes combinados se filtraron a través de una placa Seitz K-250MR y luego a través una placa Seitz EKS1^ a fin de retirar el resto de las células hospedantes de Bacillus. La conductividad del producto filtrado de EKS^ fue 10 mS/cm. 100 ml del producto filtrado de EKS1^ se diluyeron lOx en CH3COOH 20 mM, H3BO3 50 mM, CaCl2 1 mM, ajustado a pH 4.5 con NaOH y el pH del producto filtrado de EKS^ diluido ee ajustó a pH 4.5 con CH3COOH al 20%. El producto filtrado de EKS1® diluido se aplicó a una columna SP-sefarose FF1® de 19 ml equilibrada en CH3COOH 20 mM, H3B03 50 mM, CaCl2 1 mM, ajuetado a pH 4.5 con NaOH. Después de lavar extensivamente la columna con el amortiguador de equilibrio, la proteína L12 se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 0.5M) en el mismo amortiguador. Las fracciones que contenían la proteína L12 se identificaron por medio del análisis de SDS-PAGE y ee acumularon y ee diluyeron 10 vecee con agua deemineralizada para reducir la conductividad de la acumulación. La acumulación ee aplicó a una columna SOURCE Sm de 8 ml equilibrada en el miemo amortiguador de equilibrio (CH3COOH 20 mM, H3BO3 50 mM, CaCl2 1 mM, ajuetado a pH 4.5 con NaOH) y después de lavar extensivamente la columna con el amortiguador de equilibrio, la proteína L12 se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> l.OM) en el mismo amortiguador. Las fracciones de la columna se examinaron por medio del análisis de SDS-PAGE y las fracciones que contenían la proteína L12 se acumularon y se aplicaron a una columna de exclusión de tamaño Superdex 75^ de 120 ml equilibrada en CH3COOH 20 mM, H3B03 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM, ajustado a pH 4.5 con NaOH. La columna Superdex 75^ se eluyó con el mismo amortiguador y las fracciones de la columna se examinaron por medio del análisie de SDS-PAGE. Las fracciones que daban origen a una banda fuerte a 12 kDa en el gel de SDS-PAGE teñido con coomassie se acumularon como la preparación de proteína L12 purificada. La preparación fue al menos 90% pura lo cual se juzgó a partir de un gel de SDS-PAGE teñido con coomaseie y el peeo molecular relativo determinado por medio de SDS-PAGE fue Mr = 12kDa. La secuencia N-terminal fue: WNVPGYHYQY (aminoácidos 1-10 de la SEC ID NO : 5 ) .
Ejemplo 5: Desempeño en el alimento para animales in vivo (ensayo en jaula) El desempeño de la proteína L12 en el alimento para animales se evaluó en un ensayo de crecimiento de pollos de cría con los siguientes parámetros: Ensayo de crecimiento: Día 8 a día 29 (día 0 = día de la eclosión) Tratamientos: A: Control; B: 5 mg de proteína L12 purificada por kg de alimento Dietas: Dieta de maíz / SBM48 (véase la composición del alimento, Tabla 1) Despuée del mezclado, el alimento ee granuló a aproximadamente 70°C (3 x 25 mm) . La proteína L12 se diluyó en 500 ml de agua y se pulverizó sobre los granulos. Para el tratamiento de control, se pulverizó la misma cantidad de agua sobre los granulos . Duplicados: 8 grupos de 6 polloe macho, ROSS PM3 , por tratamiento Alimentación: Gránuloe ad libitum Tabla 1: Composición del alimento de la dieta experimental Inaredientes (%): Maíz 4 64.34 SBM 48 5 29.20 Aceite de semilla de soya 2.50 DL-Metionina 0.08 Monofosfato de Calcio 1.50 Piedra caliza 1.18 Sal 0.10 Ti02 1 0.10 Mezcla previa no. UH 12699002 2 1.00 Contenido calculado: Proteína cruda (%) 19.0 MEN (MJ/kg) 3 12.8 Grasa cruda (%) 6.2 Lisina (%) 1.02 Metionina (%) 0.39 Metionina + Cistina (%) 0.71 1 Ti02 co o marcador ingerible se incluyó en la mezcla del alimento 2 Comercialmente disponible de DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Bélgica y que incluía Lasalocid Sódico 3 Calculado con la ecuación EC (EEC (1986) Directive de la Commiesion du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgétique des aliments compoeée deetinés a la volaille; Journal Officiel des Communautés Européennes, L 130, 53-54) 4 Materia prima para forraje; dieponible de Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Francia 5 Harina de eemilla de eoya, reeiduoe de la manufactura de aceite, materia prima para forraje; disponible de Moulin Moderne Hireinque, Hireinque, Francia Tabla 2: Desempeño de los polloe de cría machos; promedio ± stdv Producto Control L12 Tratamiento A B Dosis (proteína/kg) 0 5 mg Jaulas x aves 8 x 6 8 x 6 Ganancia de peso (g/ave) 1308 A 1375 A días 8-29 ± 61 ± 80 % 100.0 705.2 Captación de alimento (g/ave) 2095 A 21 19 A días 8-29 ± 103 ± 90 % 100.0 101.1 Conversión de alimento (g de 1.603 A 1.542 B alimento/g de ganancia) días 8-29 ± 0.028 ± 0.038 % 100.0 96.2 Prueba de Newman-Keuls: Los medios dentro de una fila, que no comparten un superíndice común, son significativamente diferentes (p < 0.05) Ejemplo 6: Cepas de Bacillus con genes similares a L12, identificados por medio de la PCR Los genes similares al gen que codifica la proteína L12 (SEC ID N0:1) se identificaron en una variedad de otras cepas de Bacillus licheniformis por medio de la PCR. El ADN para el uso como una plantilla para la reacción PCR se aisló de once diferentes cepas de Bacillus licheniformis deearrollada durante toda la noche a 37 °C en placae de agar TY (para la receta, véase el Ejemplo 1) . Un tubo de inoculación con células de cada cepa se suependió en 0.1 ml de H20 y se hirvió durante 10 minutos, se centrifugó y un sobrenadante de 5 microlitros de cada uno se utilizó como plantilla de ADN para las reacciones PCR como se describe a continuación . Las reacciones PCR se condujeron en "Perlas para PCR Pure TaqMR Ready-To_GoMR" de Amersham Biosciences: Plantilla de ADN de 5 microlitros + 2 x 1 microlitro de cebador Pep481 (SEC ID NO: 6) y Pep482 (SEC ID NO: 7) + 18 microlitros de H20. Programa de la PCR: 1) 95°C 3 minutos; 2) 95°C 10 segundoe; 3) 65°C 30 eegundos -1°C por ciclo; 4) 72°C 1 minuto; 5) Ir A 2) 9 veces; 6) 95°C 10 segundoe; 7) 55°C 30 eegundoe; 8) 72°C 1 minuto; 9) Ir A 6) 19 vecee; 10) 72°C 5 minutoe; 11) 4°C para eiempre, lo cual eignifica que deepuée del paeo 10) la temperatura ee dieminuyó a 4°C. Cebadores : Pep481 AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3 ' (SEC ID NO : 6 ) Pep482 TTAAGAATTCGAATGAAAGAGGAGGAATG-3' (SEC ID NO : 7 ) El fragmento de PCR de 0.4kb resultante de las cinco cepas positivas (positivo significa que proporciona una banda de ADN del tamaño correcto) se purificó y se utilizó en un experimento de secuenciación de ADN, utilizando nuevamente como cebadores de secuencia los cebadores Pep481 (SEC ID NO:6) y Pep482 (SEC ID NO : 7 ) . Tres de las cinco cepas positivas proporcionaron la miema eecuencia de ADN: cepa Bacillue licheniformis ATCC 14580, Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) y Bacillus licheniformis 712, dando por resultado la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En la cepa de Bacillus licheniformis 470 los cambios del ADN dieron por resultado dos cambios de aminoácidos (SEC ID NO : 9 ) , sin embargo ninguno en el péptido maduro. En la cepa de Bacillus licheniformis 009 los cambios del ADN dieron por resultado quince cambios de aminoácidos (SEC ID NO: 8), ocho de los cuales en el péptido maduro. Además, una secuencia conseneual (SEC ID NO: 10) se derivó de las SEC ID NOs : 2 , 8 y 9.
Se debe observar que en este experimento, los nucleótidos que codifican los siete aminoácidos C-terminales de la SEC ID NO : 2 se incluyen en el cebador Pep481 (SEC ID NO: 6) y por lo tanto los siete residuoe de aminoácidos C-terminales de las SEC ID NOs: 8-9 pueden no ser correctos. Sin embargo, la exactitud de las SEC ID NOs: 8-9 se confirmaron posteriormente . Una cepa de Bacillus licheniformis la cual se aisló del producto probiótico dentro del alimento designado BioPlus 2BMR (ofrecido por Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alié, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca) ee incluyó entre lae once cepae eometidae a prueba pero fue negativa. Ademáe, otras 44 cepas de Bacillus licheniformis se sometieron a prueba como se describiera anteriormente. Se encontró una respuesta de PCR positiva en 27 de estas cepas. Los ejemplos de cepas adicionales disponiblee para el público de Bacillus licheniformis las cuales se descubrió que eran positivas para L12 tienen los siguientee númeroe de depóeito: NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, ATCC 53757. NCTC ee the National Collection of Type Culturee. ATCC ee the American Type Culture Collection. NCIMB ee the National Collection of Induetrial, Marine and Food Bacteria.
Ejemplo 7: Termoestabilidad La Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) se utilizó para determinar la estabilidad respecto a la temperatura de la proteína L12 a pH 2.5, 4.0 y 7.0. La proteína L12 purificada en una concentración de aproximadamente 2 mg/ml se dializó durante la noche a 4°C contra un amortiguador apropiado y se condujo en un instrumento VP-DSC (MicroCal) con una velocidad de exploración constante de 1.5°C/minuto de 20 a 90°C. El manejo de datos se realizó utilizando el programa de cómputo MicroCal Origin (vereión 4.10) y la temperatura de deenaturalización ee definió como la temperatura en el ápice del punto máximo de entalpia. En ácido cítrico 10 mM, cloruro de eodio 50 mM, pH 2.5, se descubrió que la proteína L12 tiene una temperatura de desnaturalización de 55 aC. En acetato de sodio 10 mM, NaCl 50 mM, pH 4.0 , la proteína L12 se desnaturalizó a 69°C y en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.0 , la temperatura de desnaturalización fue 60°C.
Ejemplo 8: Modulación de microflora del intestino in vivo e in vitro La influencia de la proteína L12 sobre la microflora del intestino se evaluó a) in vivo, en lechones y pollos de cría; y b) in vitro, sobre organiemos aisladoe de la microflora del intestino.
Eetudio en lechonee Eete eetudio, el cual ee realizó de acuerdo con las regulaciones legales francesas sobre experimentos con animales vivos, se realizó para evaluar el efecto de 5 ppm de proteína L12 (5 mg de proteína L12 purificada por kg de alimento) sobre la microflora del intestino de lechones. Diez lechones (híbridos de Large-White, Landrace y Piétrain, obtenidos de GAEC Leclerc, Ostheim, Francia) de un peso corporal inicial de 25.3±1.3 kg se eometieron a una anastomosie íleo-rectal (conectando el íleon terminal al extremo del recto, eluyendo el intestino ciego y el colon) . En estoe cerdos, la microflora del íleon terminal puede recolectarse al nivel del ano y es representativa de la población bacteriana de todas las partes digestivas consecutivas de los intestinos. Despuée de la cirugía, durante la recuperación de la cirugía, y durante el periodo experimental, los animales se colocaron en jaulas metabólicas permitiendo un muestreo fácil de loe contenidos íleo-rectales . Durante el periodo experimental de seis semanas, los lechones fueron alimentados cada uno y alternativamente (en un dieeño de cuadrado latino doble, para reducir el efecto de la variación individual y también cualquier influencia potencial de la eecuencia de los tratamientos) una dieta básica complementada o sin compuestos de prueba. Las dietas estaban compuestas como sigue: Dieta A: KLIBA, disponible de Provimi-Kliba, Kaiserauget, Suiza, con 18% de harina de semilla de eoya, 53% de maíz, 13% de cebada, 6% harina de avena, 5.4% de ealvado de trigo, 1% de aceite de soya, 3.6% de minerales, vitaminas y aminoácidos sintéticos (p/p) . Dieta E: La dieta A con la adición de 5 mg/kg de la proteína L12. Las Dietas B, C y D incluyeron otros compuestoe de prueba sin relevancia para la presente invención. Los compuestoe de prueba (inclusive la proteína L12) se incorporaron en las dietas en una mezcladora Buhler^ (Buhler, Aechwill, Suiza). Lae dietas experimentales se prepararon y ee administraron a los animales en una forma amasada. Las dietas experimentales se concedieron a los animales al nivel de 2 kg al día distribuido en dos alimentos iguales a 8:00 y 15:30. Se tomaron muestrae de los contenidos íleo-rectales de cada animal en los últimos dos días de cada periodo de tratamiento y se determinaron las concentraciones de materia seca y de los diferentes constituyentes de la microflora. Los animales no mostraron ningún síntoma de toxicosie o de enfermedad durante el experimento. Su ganancia de peeo diaria durante la observación fue 1.14+/-0.1 kg lo cual es un deeempeño zootécnico muy bueno. Al final del experimento, loe animalee se sometieron a la eutanasia por medio de una inyección letal despuée de la tranquilización. Loe contenidoe de materia eeca de lae mueetrae ee determinaron deepuée del secado durante toda la noche a 105aC, 1 g de muestra, de acuerdo con el procedimiento estándar de the Association of Official Analytical Chemiste (AOAC) (1009) (Association of Official Analytical Chemiste. (1990). (Official methode of analyeie . 15a edición. Aeeociation of Official Analytical Chemiete. Arlington). El análieis de la microflora se realizó como sigue: Inmediatamente despuée de la emieión, 10 g de loe contenidoe íleo-rectales se transfirieron y se homogenizaron en matraces que contenían 100 ml de caldo de cloruro de sodio-peptona (Merck, Darmetadt, Alemania, número de catálogo 10582) . Transcurrieron menos de 5 minutos entre las emisionee y la remoción de los contenidos del íleon los cuales se tranefirieron rápidamente a una cámara anaeróbica (AES Cheminex, Combourg, Francia) . Subeecuentemente, lae mueetrae ee diluyeron en eerie en etapae repetidae 10 vecee utilizando caldo de cloruro de eodio-peptona de 10"1 a 10"8 (peeo/volumen) . Todoe loe conteoe bacterianoe ee lograron con dos placas de duplicado. Los conteos anaeróbicos facultativoe totalee representan el número promedio de colonias que crecieron en agar Brucella (Merck, Darmetadt, Alemania, número de catálogo 10490) complementado con eangre de oveja (5% vol/vol, euminietrada por AES Cheminex, Combourg, Francia) . Lae placas se incubaron en un gabinete anaeróbico a 372C durante 5 días. Las bacterias de ácido láctico se enumeraron en agar MRS (Merck, Darmstadt, Alemania, número de catálogo 110660) y Lactobacillus spp. en agar Rogosa (Merck, Darmetadt, Alemania, número de catálogo 105413). A bae placas se incubaron en un gabinete anaeróbico a 37°C durante 48 horas. Las enterobacterias se contaron en agar V.R.B.D (Merck, Darmetadt, Alemania, número de catálogo 110275) . Eecherichia coli y otrae Enterobacteriae se analizaron en un medio cromogénico Coli-ID*® (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia, número de catálogo 42017). Este medio contenía dos subetratoe cromogénicoe : Uno para la detección de beta-D-glucuronidaea (E.coli) que producía colonias rosas y uno para la detención de galactosidaea (otra Enterobacteria) que producía coloniae azules. Ambas placas se incubaron de manera aeróbica a 37° durante 24 horas. Los Enterococcus spp. ee evaluaron en agar Enterococci (Merck, Darmetadt, Alemania, número de catálogo 65009) y Staphylococcue epp. en agar Baird Parker (AES Cheminex, Combourg, Francia, número de catálogo AEB150302) deepués de la incubación aeróbica a 37°C durante 48 horas.
Después de calentar la muestra en un baño de agua a 80°C durante 10 minutos, se aisló Clostridium perfringens utilizando el agar TSN (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia, número de catálogo 51048) incubado en una cámara anaeróbica a 46°C durante 24 horas. Las identidades de colonias representativas se confirmaron adicionalmente por medio del examen microscópico despuée de la tinción Gram y la prueba bioquímica utilizando el eietema API apropiado (BioMérieux, Marcy I'Etoile, Francia) . Para cada grupo de prueba, el análieie eetadíetico de loe datos implicó el cálculo de la desviación promedio y estándar del promedio así como también un análisie de la variación seguida por la prueba "t" de Student 's para evaluar la importancia de las diferencias entre grupos. Los conteos bacterianos reepectivoe (unidades formadoras de coloniae (CFU, por sus siglas en inglés)) por gramo de materia seca del contenido del íleon (DM, por sus siglas en inglés) , +/- la desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) se presentan en la Tabla 3 a continuación, la cual también muestra la corrección en los conteos bacterianos respectivos causada por la adición de 5 ppm de proteína L12, con relación al control.
Tabla 3 : Contenido bacteriano de la microflora íleo-rectal de lechones En eete eneayo, no ee encontraron diferencias eignificativae en loe conteoe bacterianoe, eolo ee observaron efectos numéricos, pero algunas veces fueron muy fuertes. Un efecto positivo de la proteína L12 se observó en el promedio de bacterias anaeróbicas facultativas totales donde los conteos se incrementaron en 49% con relación al control . Un efecto neutro de la proteína L12 se observó en las bacterias de ácido láctico totales y Lactobacillus spp. totales, los cuales son representativos de las bacterias benéficas de la microbiota intestinal. Es el miemo caso para lae Enterobacteriae totalee. El componente principal de la población de Enterobacteriae en la microflora de loe lechonee, Eecherichia coli, se incrementó en 19% mientras que el grupo de otras Enterobacterias (diferentes de E. coli) las cuales son potencialmente patógenas se redujo en gran medida. Un efecto negativo de la proteína L12 se observó sobre la población de Enterococcus spp. Se descubrió los Clostridium perfringens en trece de las veinte muestras de control (Dieta A) , mientras que solo se encontró en seis de las veinte muestras de la dieta complementada con L12 (Dieta E) . Por lo tanto, esta población de bacterias patógenas se redujo en gran medida (en 99%) con la proteína L12.
Eetudio en polloe de cría En el eneayo de crecimiento en polloe de cría deecrito en el Ejemplo 5, también ee evaluó el efecto de la proteína L12 (5 mg de proteína L12 purificada por kg de alimento) eobre la microflora del inteetino de pollos de cría. El análisis de la microflora de doce animales por grupo se realizó como se describiera anteriormente (el estudio en lechones) , utilizando el contenido del intestino ciego, después del sacrifico del pollo de cría, como el material de partida. Los resultados de los conteos de poblaciones bacterianas en los contenidos del intestino ciego de pollos de cría se muestran en la Tabla 4.
Tabla : Contenido bacteriano de la microflora del intestino ciego de pollos de cría Se observó un efecto positivo de la proteína L12 en la flora anaeróbica facultativa total la cual incrementó estadíeticamente de manera eignificativa en 178%. Eeta variación podría explicaree por el incremento observado (numérico) de las bacterias de ácido láctico totales observadae en el grupo complementado con la proteína L12. Las bacterias de ácido láctico totales representan la población principal de la flora anaeróbica facultativa total y están compuestae principalmente de lae eepecies Lactobacillus la cuales juegan un papel importante en los beneficios otorgados por la microbiota normal para la salud del hospedante. Los conteos de Escherichia coli se incrementaron numéricamente, pero no estadíeticamente de manera eignificativa, en el grupo complementado con la proteína L12. Esto ee consietente con el incremento en los conteos de los otros dos grupos de microorganiemoe . Todoe loe animalee empleados en este experimento tuvieron microflora del intestino ciego saludable y equilibrada y no se observó una enfermedad diarreica en los animales durante el ensayo, sugiriendo que eran las cepas de Escherichia coli de loe comenealee lae cuales podrían haber sido incrementadas.
Modulación de la microflora del intestino in vitro El efecto de la proteína L12 eobre la microflora ee evaluó adicionalmente in vitro. Lae bacteriae repreeentativae de microorganiemos benéficos y dañinos de la microbiota intestinal se aislaron del contenido intestinal de lechones y pollos de cría. Sus identidades se confirmaron por medio del examen microscópico despuée de la Gram-tinción y la prueba bioquímica utilizando el eietema API apropiado (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). El efecto de la proteína L12 eobre el crecimiento bacteriano de eeas bacterias se determinó por medio del método de dilución en caldo de microtítulo que mide la absorbancia a 595 nm. Todos estos ensayos in vitro se realizaron en placas de 96 pocilios esterilizadae (placae de microtítulo Falcon 353072^, Becton Dickinson Labware, Meylan, Francia) en un volumen final de 110 microlitroe como sigue: 100 microlitros de suspensión que contenía aproximadamente 105 CFU/ml de las bacterias puras en caldo de soya tríptico (Merck, Darmstadt, Alemania, numero de catálogo 105459) se agregaron a 10 microlitros de agua que contenía la proteína L12 en diluciones serialee de 2 vecee o a 10 microlitroe de agua como control. La inhibición del crecimiento ee determinó al medir la absorbancia a 595 nm con un dispoeitivo Multiskan Ascent (ThermoLabeyeteme, Heleinki, Finlandia) deepués del tiempo apropiado de incubación a la temperatura apropiada para el crecimiento óptimo de las bacterias puras, véase la Tabla 5.
Tabla 5 : Condiciones de incubación La reducción en la densidad del cultivo se determinó al substraer la OD595 del cultivo de prueba después de 24 o 48 horas (de acuerdo con la Tabla 5) de la OD595 del cultivo de control. La reducción en la densidad del cultivo se normalizó al expresarla como un porcentaje de la OD595 del cultivo de control y el valor MICgo correspondió a la concentración de la proteína L12 requerida para reducir la densidad del cultivo en 90%, que significa inhibir el crecimiento de 90% de los organismos sometidoe a prueba (el valor MICgo se define como la Concentración Inhibitoria Mínima que se requiere para inhibir el crecimiento de 90% de los organismos) . Los resultados de estas evaluaciones se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6: MICgo contra bacteriae aisladas del contenido intestinal de lechonee y polloe de cría La proteína L12 ee máe activa contra loe cocoe y clostridia Gram-positivoe aieladoe del contenido de cerdoe y pollos de cría que las bacterias Gram-negativas aisladae de loe miemoe. Eetos resultados explicaron al menos parcialmente la influencia de la proteína L12 sobre la microbiota gastrointeetinal : El efecto observado de la proteína L12 in vitro sobre Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium confirmó la reducción observada en Enterococcus spp. observada in vivo en lechones. El efecto observado de la proteína L12 in vitro sobre especiee de Lactobacillue confirmó el deecubrimiento a partir de loe eetudios in vivo en lechones y pollos de cría que la proteína L12 no tiene una influencia negativa in vivo sobre las especies de Lactobacillus de cerdos y aves de corral . El efecto observado de la proteína L12 in vitro sobre Clostridium perfringene aielado del contenido inteetinal de polloe de cría confirmó la fuerte reducción de esta población observada in vivo en lechones.
Ejemplo 9: Desempeño en el alimento para animales in vivo (ensayo en jaulas) - varias dosificaciones El desempeño de la proteína L12 en el alimento para animales se evaluó en un ensayo de crecimiento en polloe de cría con los siguientee parámetroe : Eneayo de crecimiento: Día 8 a día 29 (día 0 = día de la ecloción) Tratamientoe : A: Control; B: 2.5, 5.0 y 7.5 mg de proteína L12 purificada por kg de alimento Dietas: Dieta de maíz / SBM48 (véase la composición del alimento, Tabla 7) Despuée del mezclado, el alimento ee granuló a aproximadamente 70°C (3 x 25 mm) . La proteína L12 ee dieolvió en 500 ml de agua y se pulverizó sobre los granulos. Para el tratamiento de control, la miema cantidad de agua ee pulverizó eobre los granulos. Duplicados: 10 grupos de 6 pollos macho, ROSS PM3 , por tratamiento Alimentación: Granulos ad libitum.
Tabla 7: Composición del alimento de la dieta experimental Ingredientes (%): Maíz 4 62.94 SBM 48 5 30.00 Aceite de semilla de soya 3.10 DL-Metionina 0.08 Monofosfato de Calcio 1.50 Piedra caliza 1.18 Sal 0.10 Ti02 1 0.10 Mezcla previa no. UH 12699002 2 1.00 1 Ti02 como marcador ingerible se incluyó en la mezcla del alimento 2 Comercialmenté disponible de DSM Nutritional Products NV, Dorpsetraat 4, B-9800 Deinze, Bélgica y que incluía Lasalocid Sódico 3 Calculado con la ecuación EC (EEC (1986) Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgétique des aliments composés destines á la volaille; Journal Officiel des Communautés Européennes, L 130, 53-54) Materia prima para forraje; disponible de Moulin Moderne Hireingue, Hirsingue, Francia 5 Harina de semilla de soya, residuoe de la manufactura de aceite, materia prima para forraje; disponible de Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinque, Francia Tabla 8: Desempeño de los polloe de cría machos; promedio ± stdev Producto Control Proteína L12 Dosis (mg/kg de alimento) 0 2.5 5.0 7.5 Jaulas x aves 10 x 6 10 x 6 10 x 6 10 x 6 Ganancia de peso (g/ave) 1366 A 1412 A 1395 A 1415 A días 8-29 ± 81 ± 90 ± 76 ± 52 % 100.0 103.3 102.0 103.6 Captación de alimento (g/ave) 2210 A 2214 A 2195 A 2207 A días 8-29 ± 96 ± 89 ± 91 ± 55 % 100.0 100.2 99.3 99.9 Conversión de alimento (g de alimento/g de ganancia) 1 .619 A 1.571 B 1.576 B 1.560B días 8-29 ± 0.034 ± 0.046 ± 0.031 ± 0.033 % 100.0 97.1 97.4 96.4 Prueba de Newman-Keule : Los medios dentro de una fila, que no comparten un superíndice común, eon significativamente diferentes (p < 0.05) Ejemplo 10: Determinación de la concentración Una preparación de proteína L12 purificada se utilizó como un estándar de proteína L12. Se preparó como se describe en el Ejemplo 4 y se formuló con glicerol como se describe en el Ejemplo 2. La pureza fue superior a 96%, medida por medio de la CLAR (utilizando un módulo de separación Waters 2690^ y un detector de luz UV Watere 2487", que detectaba a 280 nm, utilizando lae columnas ACE C18 5 µm 100Á 150x3.0 mm y Watere µ-Bondapak C18 20x3.9 mm (columna de eeguridad) , una velocidad de flujo 0.5 ml/minuto, un volumen de inyección de 10 microlitroe, faee móvil A: H20 18MO + 0.1% de TFA (Acido Trifluoroacético), faee móvil B: Acetonitrilo + 0.1% de TFA). La concentración de la proteína L12 del eetándar fue 3.6 mg de proteína pura/ml, determinado por medio del Análieie de Aminoácidoe (deecrito a continuación) . La pureza y la concentración de otrae divereae muestras de proteína L12 se determinaron por medio de un método de gel de SDS-PAGE como también se describe a continuación, por referencia a este estándar.
Análieie de Aminoácidos (AAA) - concentración del estándar de proteína L12 Los enlaces de péptidos de la muestra estándar de proteína L12 se sujetaron a la hidrólisie acida, seguida por la separación y cuantificación de los aminoácidos liberados en un Analizador de Aminoácidos Biochrom 20 Plus"* comercialmente disponible de Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la hidrólisis acida, la muestra de proteína se secó en una centrífuga al vacío, se disolvió en HCl al 18.5% (vol/vol) + fenol al 0.1% (vol/vol) y se incubó durante 16 horas a 110°C. Despuée de la incubación, la mueetra ee eecó nuevamente en la centrífuga al vacío, ee disolvió en amortiguador de carga (Citrato de Na 0.2 M, pH 2.2) y se cargó en el Analizador de Aminoácidos Biochrom 20 PlusMR. Para la cuantificación, la mueetra hidrolizada ee cargó en una columna de la resina de intercambio catiónico UltroPac numero 8, Sodium-form1 , la cual es comercialmente disponible de Bie & Berntsen A/S, número de catálogo 80-2104-15. Los amortiguadores de pH (pH 1 a pH 8) e intensidad iónica variantes se bombearon a través de la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante referido anteriormente, para separar los diversoe aminoácidos. La temperatura de la columna se controló de manera precisa, también de acuerdo con las instrucciones del fabricante (de 53 °C a 92 °C y nuevamente a 53 °C) a fin de asegurar la separación requerida. El eluyente de la columna se mezcló con reactivo de ninhidrina (Bie & Berntsen, número de catálogo 80-2038-07) y la mezcla se pasó a través del serpentín de reacción a alta temperatura del /Analizador de Aminoácidos. En el serpentín de reacción, la ninhidrina reaccionó con los aminoácidos para formar compuestos coloreados, la cantidad de los cuales fue directamente proporcional a la cantidad de aminoácido presente.
Concentración de las muestras de proteína L12 La concentración de varias muestrae de proteína L12 ee determinó por medio del siguiente procedimiento (todoe los productoe Novex referidoe son comercialmente disponibles de Invitrogen, véase www.invitrogen.com): 50 microlitros de solución de proteína L12 (0.1-1.0 mg de proteína L12 por ml) se mezclaron con 5 microlitros de EDTA al 1% (p/v) + 10 microlitros de PMSF al 6% + 10 microlitros de DTT 0.5 M + 25 microlitros de amortiguador de muestra NuPage LDS^ (NP0007 de NOVEX) en un tubo Eppendorf y el tubo se calentó a 95°C durante 5 minutos. 10 microlitros de la muestra se aplicaron a un gel prefabricado de Tris-Bis al 10% (NP0301BOX de NOVEX) . La electroforesis se realizó con un amortiguador de corrida de MES (ácido MES=2-(N-morfolino) etanosulfónico; NP0002 de NOVEX) + antioxidante (NP0005 de NOVEX) a un voltaje constante de 2OOV de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la electroforesis, el gel se agitó suavemente en ácido acético al 10% + EtOH al 50% durante 10 minutos. El gel entonces se agitó suavemente con una solución teñidora de Azul Coloidal (46-7016 de NOVEX) durante un mínimo de tres horas y se lavó por medio de la agitación suave durante 2 a 4 horae con agua deetilada con varioe cambios de agua destilada. El gel húmedo se exploró con un Deneitómetro Calibrado BioRad GS-800 equipado con un programa de cómputo Quantity One (vereión 4.6.0, BioRad) y la proteína L12 ee cuantificó de acuerdo con lae instrucciones del fabricante. El estándar de proteína L12 descrito anteriormente se utilizó como un estándar, específicamente en tres-cuatro diluciones dentro del rango de 0.1-1.0 mg/ml.
Ejemplo 11: Estabilidad hacia pepsina y pancreatina Proteína L12 Nativa: Proteína L12 purificada, diluida a 1 mg/ml en amortiguador de Tris/CH3COOH 10 mM pH 4.5. Proteína Ll2 desnaturalizada: una muestra de la proteína L12 purificada (1 mg/ml en amortiguador de Tris/CH3COOH 10 mM pH 4.5) ee hirvió durante 5 minutos a fin de desnaturalizar la proteína. Pepsina: Pepsina porcina (Sigma P-7000, 453 unidades/mg de un sólido) . 30000 unidades/ml se dieolvieron en ácido euccínico 10 mM pH 3.0. Pancreatina: Pancreatina porcina (Sigma P-7545, 8xUSP) . 80 mg/ml se suspendieron en amortiguador de Na-fosfato 0.5 M pH 7.0. Amortiguador de pH 3 : ácido succínico 10 mM pH 3.0. Amortiguador de pH 7 : amortiguador de Na-fosfato 0.5 M pH 7.0. Se prepararon las siguientes muestras: 1) Proteína L12 incubada con Pepsina y Pancreatina 278 microlitros de proteína L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de amortiguador de pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40°C con agitación, el pH se midió a 3.5. Entonces se agregaron 400 microlitros de amortiguador de pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina y esto fue seguido por la incubación durante 4 horas a 40°C con agitación, el pH se midió a 7.0. 2) Proteína L12 incubada con Pepeina 278 microlitroe de proteína L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de amortiguador de pH 3 se incubaron durante 2 horas 40°C con agitación (el pH 3.5 se midió). Entonces se agregaron 500 microlitros de amortiguador de pH 7 (el pH 7.0 ee midió) . 3) Proteína L12 incubada con Pancreatina 278 microlitroe de proteína L12 nativa o deenaturalizada + 222 microlitros de amortiguador de pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40°C con agitación. Entonces se agregaron 400 microlitros de amortiguador de pH 7 + 100 microlitros de suspeneión de pancreatina y eeto fue seguido por la incubación durante 4 horae a 40°C con agitación. 4) Muestra de control de proteína L12 278 microlitros de proteína L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de amortiguador de pH 3 + 400 microlitros de amortiguador de pH 7 + 100 microlitros de suepensión de pancreatina se mezclaron eobre hielo y ee mantuvieron fríos.
) Muestra de control de pepsina 100 microlitros de solución de pepsina + 400 microlitros de amortiguador pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40°C con agitación. (el pH 3.5 se midió). Entonces se agregaron 500 microlitros de amortiguador de pH 7. 6) Muestra de control de pancreatina 500 microlitros de amortiguador de pH 3 + 400 microlitros de amortiguador de pH 7 + 100 microlitros de suepensión de pancreatina se incubaron durante 4 horas a 40°C con agitación (el pH 7.0 se midió) . 7) Muestra de control de Pepsina + Pancreatina 100 microlitros de solución de pepsina + 400 microlitros de amortiguador de pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40°C con agitación (el pH 3.5 se midió). Entonces se agregaron 400 microlitros de amortiguador de pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina y esto fue seguido por la incubación durante 4 horas a 40°C con agitación (el pH 7.0 se midió) . Todas las muestrae se analizaron por medio de SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 10. Juzgada por medio de SDS-PAGE, la proteína L12 nativa no fue degradada por el tratamiento con pepsina, pancreatina o pepsina seguida por pancreatina. La proteína L12 desnaturalizada fue degradada extensivamente por el tratamiento con pepsina, pancreatina o pepsina seguida por pancreatina puesto que no fue detectable una banda de proteína L12 en el gel de SDS en las muestrae correepondientes .
Ejemplo 12: Desempeño del alimento para animales in vivo (ensayo en corral sobre el piso) Eete ejemplo evalúa loe efectoe de la proteína L12 eobre el desempeño de crecimiento de pollos de cría durante un ciclo de crecimiento completo de 36 días. Un ensayo de desempeño de crecimiento con pollos de cría se realizó del día 1 al día 36. Los animales se alojaron en corrales sobre el piso con lecho de virutas de madera. Durante el periodo de inicio (días 1-22) y durante el periodo de cultivo (días 22-36) los pollos recibieron una dieta basada en trigo, centeno y harina de semilla de soya (para la composición véase la Tabla 9). Además de un tratamiento de control sin suplemento, la proteína L12 se incluyó a una dosificación de 7.5 mg de proteína por kg de alimento. Eneayo de crecimiento: Día 1 a día 36 (día 0 = a día de ecloeión) Dietae: Dieta de trigo/centeno/SBM48 (véaee la compoeición del alimento en la Tabla 9) . Alimentación: Granulos ad libitum. Despuée del mezclado, el alimento ee granuló a aproximadamente 70°C (3 x 25 mm) . La proteína L12 ee dieolvió en 800 ml de agua para el alimento de arranque y 1200 ml de agua para el alimento cultivador, reepectivamente, y ee pulverizó eobre loe gránuloe . Para el tratamiento de control, la miema cantidad de agua ein la proteína L12 se pulverizó eobre loe gránuloe, respectivamente. Tratamientos: Control, 7.5 mg de proteína L12 por kg de alimento Duplicados: 6 grupos de 20 pollos por sexo y tratamiento (6 grupos de 20 hembras, 6 grupos de 20 machos) Tabla 9 : Composición del alimento de la dieta experimental Ingredientes (%): De arranque Cultivador Trigo 4 41.20 46.00 Centeno 4 15.00 15.00 SBM 48 34.30 30.73 Aceite de semilla de soya 5.50 4.90 DL-Metionina 0.10 0.04 DCP Di-Fosfato de Calcio 2.05 1.65 Piedra caliza 0.65 0.43 Sal 0.20 0.15 Ti02 1 - 0.10 Mezcla previa no. UH 12699002 2 1.00 1.00 Contenido calculado: Proteína cruda (%) 22.5 21.00 MEN (MJ/kg) 3 12.8 12.8 Lisina (%) 1.23 1.13 Metionina (%) 0.42 0.36 Metionina + Cistina (%) 0.91 0.73 1 Ti02 como marcador ingerible se incluyó en la mezcla del alimento 2 Comercialmente disponible de DSM Nutritional Products NV, Dorpsstraat 4, B-9800 Deinze, Bélgica y que incluía Lasalocid Sódico 3 Calculado con la ecuación EC (EEC (1986) Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgétique des aliments composés destinée a la volaille; Journal Officiel dee Communautée Européennes, L 130, 53-54) 4 Materia prima para forraje; disponible de Moulin Moderne Hirsingue, Hirsingue, Francia Harina de eemilla de eoya, reeiduoe de la manufactura de aceite, materia prima para forraje; disponible de Moulin Moderne Hirsinque, Hirsinque, Francia Tabla 10: Desempeño de los pollos de cría machos; promedio ± stdev Producto Control Proteína L12 Tratamiento A B Dosis (mg/kg) - 7.5 Número de corrales x aves 11 * x 20 11* x 20 Ganancia de peso (g) 2234 A 2278 A días 1 -36 ± 181 ± 157 (%) 100.0 102.0 Captación de alimento (g) 3671 A 3646 A días 1 -36 ± 203 ± 199 (%) 100.0 99.3 Conversión de alimento (g de alimento/g de ganancia) 1.646 A 1.602 B días 1-36 ± 0.045 ± 0.047 (%) 100.0 97.3 Prueba de Newman-Keuls: Los medios dentro de una fila, que no comparten un superíndice común, son significativamente diferentes (p < 0.05) * se excluyó una jaula debido a problemas técnicos La proteína L12 mejoró ligeramente la ganancia de peso de loe polloe (Tabla 10), ein embargo eete efecto no fue eignificativo . La captación de alimento de loe polloe que recibieron la proteína L12 no fue diferente de aquella de loe polloe de control. La relación de convereión de alimento (FCR) fue mejorada eignificativamente por la proteína L12 en comparación con el control, eepecíficamente por 2.7%.
Ejemplo 13: Alimento para animales y aditivo Aditivo de Alimento para Animalee Un aditivo de alimento para animalee ee prepara al agregar 25 g de un material granulado T reveetido que comprende la proteína L12 purificada en una cantidad de 20 g/kg (preparado como ee deecribe en el Ejemplo 3 del documento EP 569468 Bl, ein embargo con un reveetimiento de aproximadamente 7% de aceite de palma hidrogenado y aproximadamente 13% de CaC03) a la eiguiente mezcla previa (por kilo de mezcla previa) : 1100000 IE Vitamina A 300000 IE Vitamina D3 4000 IE Vitamina E 250 mg Vitamina Bl 800 mg Vitamina B2 1200 mg Ca-D-Pantotenato 500 mg Vitamina B6 2.5 mg Vitamina B12 5000 mg Niacina 10000 mg Vitamina C 300 mg Vitamina K3 15 mg Biotina 150 mg Acido fólico 50004 mg Cloruro de colina 6000 mg Fe 3000 mg Cu 5400 mg Zn 8000 mg Mn 124 mg I 60 mg Co 29.7 mg Se 9000 mg Laealocid Sódico (Avatec) 17.3 % Ca 0.8 % Mg 11.7 % Na Alimento para Animales Una dieta cultivadora para pollos de cría que tiene la siguiente composición (%, p/p) se prepara al mezclar los ingredientes. El trigo, centeno y SBM 48 son disponiblee de Moulin Moderne Hireinque, Hireingue, Francia. Deepuée del mezclado, el alimento ee granula a una temperatura deeeada, por ejemplo a aproximadamente 70°C (3 x 25 mm) .
Trigo 46.00 Centeno 15.00 Harina de Semilla de Soya (SBM 48) 30.73 Aceite de semilla de soya 4.90 DL-Metionina 0.04 DCP (Fosfato de Di-Calcio) 1.65 Piedra caliza 0.43 Sal 0.15 Ti02 0.10 Aditivo de alimento para animales (anterior) 1.00 El alimento para animales resultante comprende 5.0 mg de proteína L12 purificada por kg (5 ppm) . Las composiciones adicionales de alimento para animales y aditivo de alimento se preparan de la misma manera, sustituyendo sin embargo 25 g de material granulado CT revestido con proteína L12 por kg de mezcla previa con 1013 Unidades Formadoras de Colonias (CFU) , preferiblemente en la forma de endoesporae, de Bacillue licheniformie ATCC 14580, lo cual da por resultado un alimento para animales con aproximadamente 108 CFU por g de la composición del alimento. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndoee deecrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido aislado el cual mejora la utilización del alimento para animales al mejorar la relación de convereión de alimento (FCR) y/o modular la microflora del intestino, caracterizado porque se eelecciona del grupo que coneiste de: (a) un polipéptido que comprende una eecuencia de aminoácidoe la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones reetrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); con la condición que el polipéptido no sea los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4. 2. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (a) ee hibridiza bajo condicionee reetrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID N0:1, una subeecuencia de (i) de al menoe 100 nucleótidoe y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y/o (b) tiene un grado de identidad con loe nucleótidos 124-378 de la SEC ID N0:1 de al menos 48%, determinado por medio del programa del lineamiento que utiliza la matriz de identidad por omisión, una penalización de -16 para el primer residuo de un espacio y penalizaciones de -4 para residuoe adicionales de un espacio; con la condición que la secuencia de ácido nucleico no sea la
  2. SEC ID NO: 3, ni los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO: 3, ni los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:l.
  3. 3. Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica polipéptidos de conformidad con la reivindicación 2 unida de manera operable a una o más secuenciae de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula hoepedante de Bacillue, el ADN de la célula hoepedante que, cuando ee recolecta y ee utiliza como una plantilla de ADN para una reacción PCR con lae SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb.
  4. 4. Un vector de expreeión recombinante, caracterizado porque comprende la conetrucción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3.
  5. 5. Una célula hospedante de Bacillus recombinante, caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3 o el vector de conformidad con la reivindicación 4, el ADN de la célula hospedante que, cuando se recolecta y se utiliza como una plantilla de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb.
  6. 6. Un método para producir un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (a) cultivar una célula hospedante recombinante de conformidad con la reivindicación 5 para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido .
  7. 7. Un método para producir un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende (a) cultivar una cepa de Bacillus, el ADN de la cual, cuando ee recolecta y ee utiliza como una plantilla de ADN en una reacción PCR con lae SEC ID NOs : 6 y 7 como cebadores, conduce a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0.4kb, el fragmento de PCR que codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de suetitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por exteneión de eepacio de 0.5; y (b) recuperar el polipéptido.
  8. 8. El ueo en un alimento para animalee de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivae intermediae con (i) loe nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subeecuencia de (i) de al menoe 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
  9. 9. El uso en la preparación de una composición para el uso en un alimento para animales de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de euetitución BLOSUM62, una penalización por abertura de eepacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
  10. 10. Un método para mejorar la relación de conversión de alimento para animales (FRC) , caracterizado porque un polipéptido se agrega al alimento, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2 de al menos 33%, 7 determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de euetitución BLOSUM62, una penalización por abertura de eepacio de 10 y una penalización por exteneión de eepacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual ee codificado por una eecuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivae intermediae con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subeecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii) .
  11. 11. Un método para modular la microflora del intestino de animales, caracterizado porque un polipéptido se agrega al alimento, el polipéptido ee eelecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO : 4 ; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2 de al menos 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de eustitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual es codificado por una eecuencia de ácido nucleico la cual ee hibridiza bajo condiciones restrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID N0:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
  12. 12. Un aditivo de alimento para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido y al menos un componente adicional seleccionado, del grupo que consiste de vitaminas liposolublee, vitaminas solubles en agua, minerales traza y macrominerales, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiete de: (a) un polipéptido que tiene loe aminoácidoe 1-126 de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido que comprende una eecuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO : 2 de al menoe 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de euetitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO : 1 , (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
  13. 13. Una composición de alimento para animales, caracterizada porque tiene un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste: (a) un polipéptido que tiene los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO: 4; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO: 2 de al menos 33%, determinado por medio del programa Needle, utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización por abertura de espacio de 10 y una penalización por extensión de espacio de 0.5; y (c) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácido nucleico la cual se hibridiza bajo condiciones restrictivas intermedias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:l, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos y/o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8221743B2 (en) 2006-12-22 2012-07-17 Novozymes A/S Use of polypeptides against diseases caused by protozoans
WO2008077522A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Dsm Ip Assets B.V. Use of polypeptides as coccidiostat and /or histomonastat
BR112017013928A2 (pt) * 2014-12-29 2018-04-10 Hills Pet Nutrition Inc composição alimentar e método de uso.
CN114828866A (zh) * 2019-08-30 2022-07-29 国际生物资源有限公司 鱼用饲料添加剂配方及其制备和使用方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2138023A (en) * 1983-03-29 1984-10-17 Mitsui Toatsu Chemicals Bacillus licheniformis used in animal feeds
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5200215A (en) 1988-04-20 1993-04-06 Nabisco, Inc. Enzyme treated low moisture content comestible products
BR9306580A (pt) 1992-06-17 1998-12-08 Biotech & Biolog Scien Res Xilanase molécula de dna isolda ou recombinada codificando umaxilanase sequência de dna célula hospedeira uso de uma xilanase e molécula de dna isolada ou recombinante
DE4226528A1 (de) 1992-08-11 1994-02-17 Roehm Gmbh Batterien-Xylanase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie dafür geeigneter Bakterienstamm, Plasmid mit zugehörigem Strukturgen, sowie Backmittel und Backverfahren zur Herstellung von Brot und Backwaren unter Verwendung der Xylanase
ATE275343T1 (de) 1994-03-02 2004-09-15 Novozymes As Verarbeitung von pflantzlichem material mit xylanase
MX9606013A (es) 1994-06-03 1997-12-31 Novo Nordisk Biotech Inc Lacasas purificadas de myceliophthora y acidos nucleicos que codifican para las mismas.
EP0777737B1 (en) 1994-06-30 2005-05-04 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
GB9416841D0 (en) * 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US5733355A (en) * 1994-09-29 1998-03-31 Susumu Hibino Bacterial Preparation for agricultural use
DE69617641T3 (de) 1995-01-26 2009-10-22 Novozymes A/S Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere
BR9809348A (pt) 1997-04-30 2000-07-04 Leuven K U Res & Dev Inibidores de enzimas celulolìticas, xilanolìticas e b-glucanolìticas
ATE332968T1 (de) 1998-10-26 2006-08-15 Novozymes As Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
US6682923B1 (en) 1999-05-12 2004-01-27 Xencor Thermostable alkaliphilic xylanase
AU5132700A (en) 1999-05-12 2000-11-21 Xencor, Inc. Novel thermostable alkaliphilic xylanase
WO2001081581A2 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris
EP2311855A3 (en) * 2000-10-06 2011-05-11 Novozymes Inc. Bacillus licheniformis YvnA negative strain
AU2002230784A1 (en) 2000-11-10 2002-05-21 Xencor Novel thermostable alkaliphilic xylanase
US7521204B2 (en) * 2002-04-10 2009-04-21 Novozymes A/S Bacillus host cell
EP1472933A1 (en) * 2003-05-01 2004-11-03 Chr. Hansen A/S Improving health and/or nutritional status of an aquatic animal by aid of Bacillus licheniformis
ES2501190T3 (es) 2003-09-15 2014-10-01 Danisco Us Inc. Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas
US7494798B2 (en) * 2004-01-09 2009-02-24 Novozymes, Inc. Bacillus licheniformis chromosome
WO2008077522A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Dsm Ip Assets B.V. Use of polypeptides as coccidiostat and /or histomonastat

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