LV14963B

LV14963B - Endoteliālās disfunkcijas korektors

Info

Publication number: LV14963B
Application number: LVP-13-88A
Authority: LV
Inventors: Ivars KALVIŅŠ; Anatolijs Birmans; Māris VĒVERIS
Original assignee: Tetra, Sia
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2015-10-20
Also published as: LV14963A; WO2014209092A1

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

IZGUDROJUMA NOZARE [0001] Izgudrojums attiecas uz līdzekļiem, kas uzlabo slimīgu stāvokli, ko izraisījusi endoteliāla disfunkcija. Konkrētāk, tas attiecas uz meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls kombinācijas ar statīnu otro medicīnisko pielietojumu trombozes ārstēšanai.

TEHNIKAS LĪMENIS [0002] Viena no galvenajam problēmām medicīna ir kardiovaskularas slimības, piemēram, infarkts un insults, kas rada nopietnus draudus cilvēku veselībai un dzīvībai. Miokarda infarktu un insultu izraisa traucējumi apgādē ar asinīm, kas parasti ir artēriju trombozes sekas.

[0003] Tromboze un trombotiskas vai tromboemboliskas komplikācijās pašreiz ir viens no galvenajiem mirstības cēloņiem. Tas norāda uz problēmas aktualitāti un joprojām pastāvošu drošu līdzekļu trūkumu minētās problēmas atrisināšanai. Joprojām ir vajadzīgi jauni prettrombu līdzekļi ar lielāku terapeitisko platumu un mazāk izteiktām blakusparādībām (asiņošanu u.c.).

[0004] Hemostatiskā sistēma ietver trombocītus, asins koagulācijas faktorus un endoteliālās šūnas, kas izklāj asinsvadus. Normālā stāvoklī endoteliālo šūnu veselums un pareiza darbība novērš trombocītu pielipšanu, koagulācijas faktoru aktivēšanu un trombu veidošanos.

[0005] Klīnikā endoteliālā disfunkcija rada komplikācijas kardiovaskulārās slimībās un, līdztekus trombozes un tromboembolijas riskam, palielina pēkšņas nāves iespējamību (dzīvību apdraud trombu veidošanās vitālo orgānu - sirds un smadzeņu asinsvados un to izraisītā ietekme uz apgādi ar asinīm) (Lowenberg EC et al, Netherl J Med 2010;68(6):242-250); Wu KK et al, Annu Rev Med 1996;47:315-331; Vanhoute PM, Circ J 2009;73(4):596-601; Achneck HE et al, Circulation 2010;122:2068-2077). [0006] Aspirīna labvēlīgo ietekmi uz dažādām kardiovaskulārām slimībām parasti izskaidro ar tā pretsalipes aktivitāti, bet ir noskaidrots, ka tā iedarbība uz endoteliālo funkciju arī ir būtisks faktors (Husain S. et al, Circulation 1998;97:716-720. Kharbanda RR et al, Circulation 2002;105:2600-2604; Taubert D. et al, Br J Pharmacol 2004; 143(1): 159-165; US6596708, RU 2364392). Acetilsalicilskābes kompleksie sāļi ar bāziskām aminoskābēm un glicīnu ir aprakstīti kā parenterāli ievadāmi līdzekļi kardiovaskulāru slimību gadījumā (W02006128600).

[0007] Ir norādes, ka statīnu terapijas labvēlīgā ietekme uz kardiovaskularām slimībām rodas, modulējot endoteliālo funkciju (Schāfer K. et al, Thromb Haemost 2005;93(l):145-52; Bauersachs J., Widder JD, Pharmacol Rep 2008;60:119-126; Li M. et al, Vascul Pharmacol 2007 Jan;46(l):l-9, Epub 2006 Jun 21) un NO veidošanos (Dilaveris P. et al, Curr Vasc Pharmacol 2007;5:227-37; Yokoyama S. et al, J Cardiovasc Pharmacol 2005;45:375-381; Asahi M et al, J Cereb Blood Flow Metab, 2005;25:722-729; Martinez-Gonzālez J, Badimon L, Curr Pharm Des 2007; 13(17):1771-86; Laufs U, Eur J Clin Pharmacol 2003;58(l 1):719-31, Epub 2003 Feb 18).

[0008] Ziņots, ka statiņi samazina trombozes risku un maina trombocītu ievainojamību (Libby P, Aikawa M, Clin Cardiol 2003;26(l Suppl 1):111-114). Statīnu ietekme uz endoteliālo funkciju un trombozes risku ir analizēta (Rosenson RS, Am J Cardiovasc Drugs 2001; 1(6):411-20) un HMG-CoA reduktāzes inhibitori ir piedāvāti asinsvadu endoteliālās disfunkcijas normalizēšanai (WO9513063).

[0009] Ir eksperimentāli pierādījumi, ka statiņi ietekme artēriju un vēnu trombu veidošanos (Alfon J et al, Thromb Haemost 1999;81:822-827; Obi C et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009;29(9): 1271-1276) un asins recēšanuZkoagulāciju (Owens AP et al, J Clin Invest 2012;122:558-568; Ramcharan AS et al, J Thromb Haemost 2009;7(4):514-520).

[0010] Trombotisku komplikāciju samazināšanās statīnu ietekmē novēroja klīnikā (Yamawaki T et al, Fukuoka Igaku Zasshi 2007;98(6):260-269; Lowenberg EC et al, J Thromb Haemost 2008;72(2):232-237; Rodriguez AL, J Thromb Thrombolysis. 2012; 33(4):371-82).[0011] Uzskata, ka statiņi labvēlīgi ietekme ka artēriju, ta ari vēnu trombozi (Lijfering WM et al, Semin Thromb Hemost 2011;37:885-896). Statīnu labvēlīgā ietekme uz vēnu trombozi un tromboemboliju piesaistīja nopietnu uzmanību klīniskajos pētījumos (Ray JG et al, Arch Intem Med 2001;161(l l):1405-10; Glynn RJ et al, N Engl J Med 2009;360(18):1851-1861; Khemasuwan D et al, Am J Med 2011; 124(9):852-859; Paraskevas KI et al, Current Medical Research and Opinion 2009;25(7): 1807-1809; Lacut K et al, Fundam Clin Phaimacol 2004;18:477-82; Undas A et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:287-94), ko diemžēl pilnībā neapstiprināja vēlākā randomizēto pētījumu meta-analīze par 105759 pacientiem, kas bija iesaistīti statīnu monoterapijā (Rahimi K et al, PLoS Med 2012;9(9):el001310). [0012] Tālākie eksperimenti parādīja, ka in vitro statiņi pastiprina aspirīna pretsalipes darbību (Luzak B et al, Eur J Clin Invest, 2012;42:864-72). Ārstēšana ar statiņiem var izraisīt nozīmīgu asins koagulācijas kaskādes sastāvdaļu daudzuma samazināšanos (Szcezklik A et al, Med Sci Monit 2001 ;7(6): 1381-5. Undas A, Brummel-Ziedins KE, Mann KG, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25(2):2878-94. Epub 2004, Nov 29). [0013] Statīnu un aspirīna kombinācijas terapija tiek intensīvi pētīta. Statiņiem un aspirīnam ir aditīvs efekts kardiovaskulāro notikumu samazinājumā (Athyros VG et al, Platelets 2005; 16(2):65-71. Musial J et al, Thromb Haemost 2001;85(2):221-5). WO9811896 ir aprakstītas farmaceitiskas kombinācijas, kas ietver HMG-CoA reduktāzes inhibitoru kombinācijā ar trombocītu salipšanas inhibitoru (aspirīnu, klopidogrelu, dipiridamolu u.c.) trombotisku oklūziju inhibēšanai un kardiovaskulāru un cerebrovaskulāru notikumu ārstēšanai un profilaksei. US 6,235,311 ir aprakstīta aspirīna un statīna kombinācija miokarda infarkta riska samazināšanai. W02009022821 un W02012081905 ir aprakstīts kombinēts preparāts kardiovaskulāru slimību ārstēšanai, kas ietver HMG-CoA reduktāzes inhibitoru un aspirīnu. US 7,598,233 ir aprakstīta farmaceitiskā zāļu forma trombozes ārstēšanai, kas ietver HMG-CoA reduktāzes inhibitoru un aspirīnu. W02007045353 ir aprakstīta aspirīna sāļu ar bāziskām aminoskābēm un glicīnu kombinācija ar HMG-CoA inhibitoru.

[0014] Meldonijs ir pazīstams kardiovaskulārs līdzeklis ar eksperimentāli (Veveris M et al, Baltie J Lab Anim Sci 2002;12(l-2):l 16-122. Artyushkova EV et al, Chelovek i ego zdorovye (in Russian) 2010;No.3:5-10. Vilskersts et al, Pharmacological Reports 2011;63:752-762) un klīniski pierādītu (Geichenko VP, Kuryata AV, Muzhchil OV, Rossiyskiy kardiologicheskiy zhumal (in Russian) 2005; No.4:64-67. Khlebodarov FE, Mikhin VP, Gorlova AV, Rossiyskiy kardiologicheskiy zhumal (in Russian) 2009;No.4:37-42. Khlebodarov FE, Turikov PYu, Mikhin VP Rossiyskiy kardiologicheskiy zhumal (in Russian) 2009;No.6:34-40. Shabalin AV et al, Adv Gerontol (in Russian) 2006; 19:116-19) labvēlīgu efektu uz endoteliālo disfunkciju. [0015] Mildronāta kombinācija ar statiņiem endoteliālās disfunkcijas, stenokardijas un diabēta ārstēšanai aprakstīta W02006099244; patenta pieteikumā US20110275649 tā piedāvāta statīnu izraisīta diabēta ārstēšanai (bez eksperimentāliem datiem).

[0016] Meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls aprakstīts W02010151095 kā pretsalipes līdzeklis dažādu patoloģiju ārstēšanai, ko inducējusi trombocītu salipšana, kā pretiekaisuma un antihiperlipidēmisks līdzeklis. Pieteikumā W02012158003 meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls ir aprakstīts kā koagulācijas faktora XII inhibitors un tā kombinācija ar varfarīnu kā antikoagulācijas līdzeklis.

[0017] Meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls kombinācija ar statiņiem aprakstīta W02010151095 pielietojumam dislipidēmijas, hiperlipidēmijas un aterosklerozes profilaksei un/vai ārstēšanai.

IZGUDROJUMA KOPSAVILKUMS

TEHNISKĀ PROBLĒMA [0018] Joprojām saglabājas neapmierināts pieprasījums pēc jauniem endoteliālās disfunkcijas korektoriem, kas būtu noderīgi kā antitrombotiski līdzekļi.

PROBLĒMAS RISINĀJUMS [0019] Jauna sinerģiska pretsalipes līdzekļa un HMG-CoA reduktāzes inhibitora statiņa kombinācija var būtiski samazināt trombozes risku.

IZGUDROJUMA IZDEVĪGIE EFEKTI [0020] Aprakstītais izgudrojums piedāvā antitrombotisku līdzekli trombozes ārstēšanai, kas ietver meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāli kombinācijā ar statiņu.

ĪSS IZGUDROJUMA APRAKSTS [0021] Aprakstīta sinerģiska terapeitiska kombinācija trombotisku stāvokļu profilaksei un ārstēšanai, kas ietver terapeitiski aktīvu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls kā endoteliālās disfunkcijas korektoru un terapeitiski aktīvu daudzumu statiņa kā HMG-CoA reduktāzes inhibitoru.

DETALIZĒTS IZGUDROJUMA APRAKSTS [0022] Turpmākajā tekstā lietotie saīsinājumi un termini un to nozīmes:

Ach - Acetilholīna hlorīds (Sigma)

ASA - Acetilsalicilskābe (Sigma-Aldrich)

L-NAME - N-Nitro-L-arginīna metilestera hidrogēnhlorīds (Sigma-Aldrich)

MASA - Meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls (iegūts saskaņā ar W02010151095)

MD - Meldonijs (Mildronāts, Grindeks)

NO - Slāpekļa monoksīds

NP - Nātrija nitroprusīds (Sigma-Aldrich)

LLO - laiks līdz oklūzijai

FeCb (dzelzs trihlorīds) - Sigma-Aldrich

Simvastatīns - (Artemis Biotech Ltd.)

HMG-CoA - 5-Hidroksi-3-metilglutaril-koenzīms A

EKSPERIMENTĀLĀ DALA

Vielu ietekme uz eksperimentālu endoteliālo disfunkciju un ar to saistīto paaugstināto trombozes risku

Metode [0023] Šūnu endoteliālās disfunkcijas modelēšanai tika izmantots eksperimentāli radīts NO deficīts, ko izraisīja NO sintēzes bloķētajā L-NAME atkārtota ievadīšana (Pokrovskiy M et al, Experim Klin Pharmacol 2008;71(2): 29-31. Pokrovskiy M et al, Int J Hypertens 2011 ;2011:515047). Eksperimentos tika izmantoti Wistar žurku tēviņi (280-330 g). Dzīvnieki tika turēti grupā pa 7-8 piemērotos būros klimatizētā telpā

22±1 °C temperatūrā ar relatīvo mitrumu 60±5%, 12/12 stundu gaismas/tumsas ciklu un brīvu piekļuvi barībai un ūdenim.

Visi eksperimenti tika veikta saskaņā ar Eiropas Kopienas Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīvu (86/609/EEK) par eksperimentālo dzīvnieku aprūpi. Tika pieliktas iespējamas pūles, lai samazinātu dzīvnieku ciešanas un samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu.

[0025] Dzīvnieki tika randomizēti šādās grupās: a) intaktu dzīvnieku grupa - saņēma ūdeni; b) eksperimentālās endoteliālās disfunkcijas grupa - dzīvniekiem reizi dienā ievadīja i.p. NO sintāzes inhibitoru L-NAME devā 25 mg/kg un p.o. ūdeni atbilstoši protokolam, c) ārstētā endoteliālās disfunkcijas grupa - dzīvnieki saņēma L-NAME un pārbaudāmo vielu.

[0026] Eksperiments tika veikts saskaņā ar diviem protokoliem: 1) profilakses un 2) ārstēšanas. 1) Saskaņā ar profilakses eksperimenta protokolu profilakses grupas dzīvnieki papildus L-NAME reizi dienā 7 dienas saņēma pa kanili kuņģī pārbaudāmo vielu, intaktā un L-NAME grupas - ūdeni. 2) Saskaņā ar ārstēšanas protokolu pārbaudāmo vielu ievadīja uz izveidojušās endoteliālās disfunkcijas fona - sākot ar eksperimenta 5. dienu - tūlīt pēc L-NAME ievadīšanas 5., 6. un 7. dienā tika p.o. ievadīta pārbaudāmā viela vai ūdens (intaktajai grupai vai L-NAME grupai).

[0027] 7. dienā, divas stundas pēc pētāmo vielu ievadīšanas, dzīvnieki, kas bija saņēmuši ūdeni un/vai L-NAME, tika narkotizēti (etamināla nātrijs, 50 mg/kg i.p.) un kreisajā miega artērijā tika ievietots katetrs asinsspiediena un sirdsdarbības ātruma mērīšanai, otrs katetrs vazoaktīvās vielas ievadīšanai tika ievietots labās kājas vēnā. Asins plūsmas parametru reģistrācija tika veikta ar sistēmu Polygraph RM 6100 (Nihon Kohden, Japāna).

[0028] Endoteliālās disfunkcijas un petamas vielas koriģējoša efekta novērtēšanai kopējās arteriālā asinsspiediena izmaiņas, ko izraisīja no endotēlija atkarīgā un neatkarīgā vazodilatācija, tika izmantota zināmā metode (Kochkarov V et al, Fundamental pharmacology and pharmacy: materiāls of 2^nd Russia-Chinese intemational scientific conference of pharmacology. Perm, 2006:98-99. Pokrovskiy M et al, Int J Hypertens 2011 ;2011:515047). Kā līdzeklis no endotēlija atkarīgās vazodilatācijas novērtēšanai tika lietots acetilholīns (Ach) devā 40 mkg/kg i.v., kamēr no endotēlija neatkarīgo vazodilatāciju novērtēja, lietojot nātrija nitroprusīdu (NP) devā 30 mkg/kg i.v..

[0029] Endoteliālās disfunkcijas līmenis tika izteikts ka endoteliālās disfunkcijas koeficients (EDK), kas parāda NP izraisīto izmaiņu attiecību pret ACh izraisītajām izmaiņām (Pokrovskiy M et al, Int J Hypertens 2011;2011:515047). Iegūtie dati tika matemātiski apstrādāti, izmantojot Microsoft Excel programmu, un rezultāti izteikti kā vidējais ± vidējā standarta kļūda (Vidējais±VSK). Dažādo grupu rezultāti tika salīdzināti, izmantojot vienfaktora analīzi saskaņā ar ANOVA un Stjūdenta t-testu. P<0,05 tika uzskatīta par nozīmīgu.

Rezultāti [0030] Vazoaktīvo vielu Ach vai NP ievadīšana intaktās grupas dzīvniekiem izraisīja līdzīgas izmaiņas asinsspiedienā, t.i., vienādu vazodilatāciju. Endoteliālās disfunkcijas koeficients (EDK) bija tuvu vienam (1. tabula).

[0031] Atkārtota L-NAME ievadīšana izraisīja arteriālā spiediena paaugstināšanos un pastiprinātu reakciju uz NP (no endotēlija neatkarīgu vazodilatāciju), bet reakcija uz Ach (no endotēlija atkarīga vazodilatācija) bija ievērojami samazināta, kas apmēram piecas reizes palielināja EDK. Pētāmo vielu profilaktiskais efekts izraisīja zināmu LNAME izsauktās endoteliālās disfunkcijas samazināšanos, kas izpaudās kā būtisks

EDK samazinājums (salīdzinot L-NAME+ MD100, L-NAME+ ASA5 un L-NAME+ MASA 5, 10 un 25 mg/kg/dienā devas; skat 1. tabulu).

[0032] MASA ievadīšana bija būtiski efektīvāka EDK samazināšanā nekā MD vai ASA (1. tabula). Jāpievērš uzmanība faktam, ka MASA 5 mg/kg/dienā deva izraisīja līdzīgu efektu, kā MD devā 100 mg/kg/dienā (EDK, attiecīgi, 3,03 un 3,01. 1. tabula).

[0033] 1. tabula. Pētāmo vielu profilaktiskais efekts uz no endotēlija neatkarīgu/atkarīgu vaskulāro reakciju un endoteliālās disfunkcijas koeficients (EDK) dzīvniekiem ar L-NAME izsauktu NO deficīta modeli; Vidējais ± VSK; N 7-8

Grupa	No endotēlija neatkarīga vaskulārā reakcija uz NP, vienības	No endotēlija atkarīga vaskulārā reakcija uz Ach, vienības	EDK NP/Ach
Intaktā	1387±239,2**	1303±154,5*	l,07±0,16***
L-NAME	3619±193,6	685±95,8	5,28±0,79
L-NAME+MD5	3492±159,3	820±132,5	4,25±0,32
L-NAME+MD25	3532±274,0	952±114,0	3,71±0,58
L-NAME+MD100	3618±283,7	1204±121,2*	3,01±0,50*
L-NAME+ASA5	4070±350,2	1251±99,4*	3,25±0,43*
L-NAME+MASA5	3632±162,8	1265±127,3*	3,03±0,39**^a
L-NAME+MASA10	3576±212,3	1625±153,6**	2,20±0,44***^abc
L-NAME+MASA25	3471±204,7	1752±169,4**	l,98±0,52***^abc
*P<0,05 pret L-NAM3	-t

**P<0,005 pret L-NAME ***P<0,0005 pret L-NAME ^aP<0,05 pret L-NAME+ MD 5 ^bP<0,05 pret L-NAME+ MD 25 ^cP<0,05 pret L-NAME+ASA 5 [0034] Terapijas režīma (arstešana tika uzsāktā, kad attīstījās endoteliala disfunkcija) tikai MASA nozīmīgi samazināja EDK, pie tam efekts bija nozīmīgi lielāks nekā no MD 5, MD 25 un ASA (2. tabula).

[0035] 2. tabula. Pētāmo vielu terapeitiskais efekts uz no endotēlija neatkarīgu/atkarīgu vaskulāro reakciju un endoteliālās disfunkcijas koeficients (EDK)

dzīvniekiem ar L-NAN	E izsauktu NO deficīta modeli; Vidējais ± VSK; N 7-8
Grupa	No endotēlija neatkarīga vaskulārā reakcija uz NP, vienības	No endotēlija atkarīga vaskulārā reakcija uz Ach, vienības	EDK NP/Ach
Intaktā	1395±193,5**	1294±137,8**	l,08±0,17***
L-NAME	3667±295,6	693±101,3	5,29±0,58
L-NAME+MD5	3628±285,3	780±98,3	4,65±0,41
L-NAME+MD25	3678±273,7	865±138,5	4,18±0,35
L-NAME+MD100	3651±320,8	915±121,7*	3,99±0,49
L-NAME+ASA5	3763±374,1	833±114,6	4,26±0,36
L-NAME+MASA5	3650±289,5	1133±152,8*^a	3,22±0,30**^ac
L-NAME+MASA10	3629±254,9	1222±158,l**^ac	2,97±0,44** ^abc

L-NAME+MASA25

3535+270,4

1218+177,5* ^a

2,90+0,50**^abc

*P<0,05 pret L-NAME **P<0,005 pret L-NAME ***P<0,0005 pret L-NAME ^aP<0,05 pret L-NAME+ MD 5 ^bP<0,05 pret L-NAME+ MD 25 ^cP<0,05 pret L-NAME+ASA 5 [0036] Terapijas režīmā MASA 5 mg/kg/dienā devā izraisīja EDK izmaiņas, kas bija lielākas nekā MD devā 100 mg/kg/dienā (EDK, attiecīgi, 3,22 un 3,99. 2. tabula). Salīdzinot MD, ASA un MASA efektivitāti profilakses un terapijas režīmos, jāievēro, ka tikai MASA samazināja endoteliālās disfunkcijas izpausmi terapijas režīmā (skat. ietekmi uz EDK un uz no endotēlija atkarīgo vaskulāro reakciju uz Ach, kas bija pēc būtības līdzīga intaktās grupas reakcijai. 2. tabula). Šāds MASA efekts varētu būt ieguvums klīnikā endoteliālās disfunkcijas ārstēšanai un endotēlija funkcijas atjaunošanā.

[0037] Nākama eksperimentu sērija bija vērsta uz pētāmo vielu pārbaudi eksperimentālajā trombozē.

[0038] Endotēlija šūnu funkcionālais stāvoklis ir viens no galvenajiem faktoriem normālas asins reoloģijas nodrošināšanā un trombozes attīstībā vai profilaksē. Tāpēc endotēlija disfunkcija ievērojami pasliktina sirds un asinsvadu slimības ar palielinātu trombozes risku (Lowenberg EC et al, The Netherland J of Medicine 2010;68(6):242250).

[0039] Ir konstatēts, ka dzīvnieks ar eksperimentāli (ar L-NAME) nomāktu endotēlija NO sintāzi ir ievērojami mazāk izturīgs pret išēmisku epizodi (Gaballa M et al, Cardiovasc Res 1999;42:627-635).

[0040] Lai objektīvi novērtētu endoteliālās disfunkcijas ietekmi uz trombozi un pētāmo vielu efektus, tika veikti paralēli eksperimenti ar intaktu dzīvnieku grupu un dzīvniekiem, kuriem izveidojusies endoteliālā disfunkcija (izsaukta ar atkārtotu LNAME ievadīšanu). Pamatojoties uz orientējošo eksperimentu datiem (1. un 2. tabulas), kuros MASA bija efektīvs endoteliālās disfunkcijas izveidošanās samazināšanā terapijas režīmā, tāds pats protokols tika izmantots trombozes eksperimentā.

Metode [0041] Tika izmantots žurku eksperimentālās trombozes modelis, kas balstās uz FeCb inducētu arteriālo trombozi (Kurz K et al, Thromb Res 1990:269-280. Wang X, Xu L, Thromb Res 2005:115-100).

[0042] Tika izmantoti Wistar žurku tēviņ ar masu 340-400 g. Dzīvnieki tika randomizēti divās paralēlās grupās: 1) bez endoteliālās disfunkcijas, 2) ar endoteliālo disfunkciju. Dzīvniekiem izraisīja endoteliālo disfunkciju, ievadot L-NAME (25 mg/kg/dienā i.p.) 7 dienas; intaktie dzīvnieki saņēma līdzīgu apjomu sterila 0.9 % NaCl šķīduma. Saskaņā ar protokolu, sākot ar 5. dienu, dzīvnieki 3 dienas saņēma p.o. vai nu pētāmo vielu vai ūdeni tūlīt pēc L-NAME vai NaCl šķīduma ievadīšanas.

[0043] 7. dienā, divas stundas pēc L-NAME, pētāmās vielas vai ūdens ievadīšanas, žurkas tika narkotizētas ar pentobarbitāla nātriju (50 mg/kg, i.p. un pēc tam 10 mg/kg/stundā) un novietotas uz apsildāma operāciju galda, lai uzturētu ķermeņa temperatūru ap +37 °C. Pēc iegriezuma kaklā, no apkārtējiem audiem, blakusesošās vēnas un vagus nerva tika atdalīta kreisā miega artērija, uz kuras tika uzlikta plūsmas zonde (elektromagnētiskā asins plūsmas mērierīce MFV 1200, Nicon Kohden,

Japāna) asins plūsmas reģistrēšanai. Pēc 15 minūšu ilga stabilizācijas perioda tika izraisīta tromboze, uzliekot uz artērijām divus (2x1 mm) filtrpapīra gabaliņus, kas piesūcināti ar 15% FeCb šķīdumu.

[0044] Trombozes laiks tika reģistrēts kā laiks, kurā asins plūsma pilnīgi apstājās un izteikts kā laiks līdz oklūzijai (LLO). Rezultāti tika analizēti ar Microsoft Excel 2007 programmu. Dati tika izteikti kā vidējais ± vidējā standarta kļūda (Vidējais±VSK) 7-8 dzīvniekiem. Atšķirības starp dažādām eksperimentālajām grupām tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena ANOVA ar atkārtotiem salīdzinājumiem (Tukey tests). P<0,05 tika uzskatīta par nozīmīgu.

Rezultāti [0045] Kontroles grupā FeCb inducētā tromboze izraisīja miega artērijas oklūziju ar LLO 25,3 min. Eksperimentāli inducētā endoteliālā disfunkcija būtiski saīsināja LLO uz 18,1 min; atšķirība no kontroles grupas bija 28,5%. Skat. 3. tabulu.

[0046] 3 . tabula. Eksperimentālās endotelialas disfunkcijas ietekme uz LLO un pētāmo vielu efekts; Vidējais±VSK; N= 7-8.

Grupa	Sākuma stāvoklis (bez endoteliālās disfunkcijas)	Endoteliala disfunkcija (ar L-NAME)	L-NAME efekts
	LLO, min %	LLO, min %	Efekta samazinājums %
Kontrole	25,3±1,97 100	18,^2,58¹ 100	28,5
MD 5 mg/kg x 3	27,6±2,11 109	20,5±2,56¹ 113	26
MD 25 mg/kg x 3	32,3±3,34 128	25,1±3,13 139	22,3
ASA 5 mg/kg x 3	37,7±2,63** 149	29, l±2,80*’ 161	22,8
MASA 5 mg/kg x 3	39,3±3,26**^a 156	32,6±2,78**^a 180	17,3
MASA 10 mg/kg x 3	46,7±3,50**^ab 185	39,7±2,76***^abc 219	15

*P<0,05 pret kontroli **P<0,005 pret kontroli ***p<0,0005 pret kontroli ^JP<0,05 pret Sākuma stāvokli / dzīvniekiem bez endoteliālās disfunkcijas ^aP<0,05 pret MD 5 ^bP<0,05 pret MD 25 ^cP<0,05 pret ASA 5 [0047] Pētāmo vielu ievadīšana palielina LLO abas grupas bez endotelialas disfunkcijas un grupā ar L-NAME izsauktu endoteliālo disfunkciju. Jāatzīmē, ka MASA salīdzinoši efektīvāk nekā MD un ASA pagarina LLO endoteliālās disfunkcijas apstākļos, skat. 3. tabulu.

[0048] MASA devā 10 mg/kg nozīmīgi samazināja L-NAME ietekmi uz LLO, ar P<0,0005, pārsniedzot MD5, MD 25 un ASA 5 efektu uz LLO.

[0049] Tādā veidā mēs parādījām, ka MASA efektīvāk par ASA vai MD samazina trombozi (palielina LLO) un endoteliālās disfunkcijas apstākļos MASA terapeitiskais efekts nozīmīgi pieaug, pretēji ASA vai MD efektam (3. tabula).

Secinājums [0050] MASA nozīmīgi samazina endoteliālo disfunkciju, kas izraisīta, eksperimenta pazeminot NO līmeni, kad to ievada kā profilakses, tā arī terapijas režīmā. Ievadot terapijai uz endoteliālās disfunkcijas fona, MASA efektīvāk par MD vai ASA samazināja endoteliālo disfunkciju un asinsvadu trombozes risku. Iegūtie dati norāda uz ieguvumu, ko var dot MASA klīnikā trombozes profilaksei un/vai terapijai, kā arī citās slimībās, kas saistītas ar endoteliālo disfunkciju.

MASA.. ASA, un MD atsevišķi un kombinācijā ar simvastatīnu ietekme uz eksperimentālo trombozi [0051] Simvastatīna, ASA, MD vai MASA atsevišķi un kombinācijā ar simvastatīnu profilaktiskais efekts tika pārbaudīts eksperimentālā artērijas trombozē žurkām.

Metodes [0052] Tika izmantots modificēts žurkām ar dzelzs trihlondu izraisītas trombozes modelis (Kurz K et al, Thromb Res 1990,60:269-280; Wang X, Xu L, Thromb Res 2005;115:95-100. Optimization of ferric chloride induced thrombosis modei in rats: J Pharm Toxicol Methods 2010;61:287-291).

Tika izmantoti Wistar žurku tēviņi ar masu 310-360 g. Dzīvnieki tika turēti klimatizētā telpā 22±1 °C temperatūrā ar relatīvo mitrumu 60±5% un 12/12 stundu gaismas/tumsas ciklu, brīvu pieeju barībai un ūdenim.

[0053] Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar Eiropas Kopienas Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīvu (86/609/EEK) par eksperimentālo dzīvnieku aprūpi. Tika pieliktas iespējamas pūles, lai samazinātu dzīvnieku ciešanas un samazinātu izmantoto dzīvnieku skaitu.

[0054] Dzīvnieki tika randomizēti grupās pa 10 un 3 dienas pēc kārtas reizi dienā saņēma ūdeni (kontroles grupā) vai turpmāk norādītās vielas p.o.: MASA 15 (15 mg/kg x 3), MASA 30 (30 mg/kg x 3), MD (25 mg/kg x 3), ASA (5 mg/kg x 3), MD+ASA (25+5 mg/kg x 3) vai simvastatīnu (5 mg/kg x 3). Arī pētāmo vielu kombinācijas ar simvastatīnu tika ievadītas p.o. šādā veidā: MASA 15 + simvastatīns (15+5 mg/kg x 3), MASA 30 + simvastatīns (30+5 mg/kg x 3), MD + simvastatīns (25+5 mg/kg x 3) vai ASA + simvastatīns (5+5 mg/kg x 3). Simvastatīns tika lietots 5 mg/kg/dienā lielā devā, jo bija parādīts, ka šī deva ir pietiekama, lai ietekmētu vairākus regulējošos faktorus, tostarp NO sistēmu, t.i., izraisa tā saukto plejotropo efektu (Tuuminen R et al, Circulation 2011;124:1138-1150. Arora R, Hare DL, Zulli A, J Atheroscler Thromb 2012;19:705-711).

[0055] Žurkas tika anestezētas ar pentobarbitālnātriju (50 mg/kg i.p. un pēc tam 10 mg/kg/st) un novietotas uz operāciju galda ar kontrolētu temperatūru, lai uzturētu ķermeņa temperatūru 37 °C visā eksperimenta laikā. Viena no miega artērijām tika atsegta ar iegriezumu kaklā, atdalīta no apkārtējiem audiem un vagus nerva. Uz atsegtā kopējās miega artērijas segmenta tika uzlikta plūsmas zonde (elektromagnētiskā asins plūsmas mērierice MFV 1200, Nicon Kohden, Japāna), lai reģistrētu asins plūsmu.

[0056] Pēc 15 min. ilga stabilizācijas perioda tika inducēta tromboze, uzliekot uz asinsvada virsmas divus (2x1 mm) firmas Whatman papīra sloksnītes, kas piesūcinātas ar 15% FeCb šķīdumu. Miega artērijas trombozes laiks tika reģistrēts kā laiks, kas nepieciešams, lai pilnībā apstātos asins plūsma, un parādīts kā laiks līdz oklūzijai (LLO). Ja asins plūsma grupās, kas bija saņēmušas pētāmās vielas, neapstājās 90 min. laikā, LLO tika uzrādīts kā >90 min.

[0057] Dati tika parādīti kā Vidējais±VSK. Atšķirības starp dažādām eksperimentālajām grupām tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena ANOVA ar atkārtotiem salīdzinājumiem (Tukey tests) un par ticamu tika uzskatīta vērtība P<0,05.

Rezultāti [0058] Pēc kontakta ar dzelzs trihlorīdu kontroles grupas dzīvniekiem asinsvada tromboze izveidojās un tās izraisītā pilnīgā asins plūsmas apstāšanās miega artērijā iestājās vidēji pēc 22,5 minūtēm (4. tabula).

[0059] 4. tabula. Pētāmo vielu un to kombināciju ietekme uz miega artērijas trombozi žurkām - laiks līdz oklūzijai (LLO). Vidējais+VSK; N= 8-10.

Grupa	Laiks līdz oklūzijai (LLO)
min	%
Kontrole	22,5+2,18	100
ASA (5 mg/kg x 3)	32,0+2,73¹	142
MD (25 mg/kg x 3)	25,1+2,99	112
ASA+MD (5+25 mg/kg x 3)	40,0+3,97^2$*	178
Simvastatīns (5 mg/kg x 3)	29,3+2,24¹	130
MASA 15 (15 mg/kg x 3)	46,7+3,92^3$$#**	207
MASA 30 (30 mg/kg x 3)	52,2+3,94^4$$##***^c	232
ASA+simvastatīns (5 + 5 mg/kg x 3)	39,1±3,69²*	174
MD+simvastatīns (25 + 5 mg/kg x 3)	31,0+2,88¹	138
MASA 15+simvastatīns (15 + 5 mg/kg x 3)	58,5±5,67³**^&@@	260
MASA 30+simvastatīns (30 + 5 mg/kg x 3)	68,6±6,37^4ab***^&&@@@	305

^<0,05 pret kontroli ²P<0,005 pret kontroli ³P<0,0005 pret kontroli ⁴P<0,00005 pret kontroli ^#P<0,05 pret ASA ^##P<0,005 pret ASA ^$P<0,05 pret MD ^$$P<0,005 pret MD ^aP<0,05 pret MASAI 5 ^bP<0,05 pret MASA30 *P<0,05 pret simvastatīnu **P<0,005 pret simvastatīnu ***P<0,0005 pret simvastatīnu ^cP<0,05 pret ASA+MD ^&P<0,05 pret AS A+simvastatīnu ^&&P<0,005 pret ASA+simvastatīnu @P<0,05 pret MD+simvastatīnu @@p<0,005 pret MD+simvastatīnu @@@p<0,0005 pret MD+simvastatīnu [0060] MASA 15 (15 mg/kg x 3) profilaktiskā ievadīšana izraisīja nozīmīgu LLO palielināšanos, kas bija labāk izteikts kā ASA, MD vai simvastatīna efekti. MASA devas palielināšana (30 mg/kg x 3) izraisīja tālāku antitrombotiskā efekta pieaugumu un tas bija nozīmīgi labāk izteikts nekā ASA+MD efekts (1. tabula). Mūsu modelī MASA kombinācijā ar simvastatīnu izraisīja negaidītu un pārsteidzošu antitrombotiskā efekta pieaugumu: MASA 15 mg/kg + simvastatīns 5 mg/kg pagarināja LLO par 25% salīdzinājumā ar MASA 15 mg/kg, kamēr MASA 30 mg/kg + simvastatīns 5mg/kg pagarināja LLO par 31% salīdzinājumā ar MASA 30 mg/kg. Kombinācija MASA 30 mg/kg + simvastatīns 5 mg/kg nozīmīgi labāk nekā MASA 15 mg/kg vai MASA 30 mg/kg novērsa miega artērijas trombotisko oklūziju.

[0061] Mušu modeli MASA+simvastatms (15+5 vai 30+5 mg/kg) izraisīja ļoti nozīmīgu trombozes veidošanās aizkavēšanu (attiecīgi, par 260 un 305%), kas ir ievērojami augstāka nekā ASA+simvastatīna vai MD+simvastatīna izraisītā (4. tabula).

Secinājums [0062] MASA un simvastatīna kopējā lietošana izraisa sinerģisku efektu uz LLO aizkavēšanu eksperimentālajā trombozes modelī. Pētījuma rezultāti liecina, ka klīnikā MASA kombinācijā ar simvastatīnu var sniegt uzlabojumus kardiovaskulāru slimību ārstēšanā un/vai profilaksē.

Claims

1. Terapeitiska kombinācija, kas ietver terapeitiski iedarbīgu daudzumu meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāli kā endoteliālās disfunkcijas korektoru un terapeitiski iedarbīgu daudzumu HMG-CoA reduktāzes inhibitora statīna, pielietojumam trombozes profilaksei un/vai ārstēšanai.

2. Kombinācija saskaņā ar 1. pretenziju, kurā statīns ir atlasīts no grupas: atorvastatīns, cerivastatīns, fluvastatīns, lovastatīns, mevastatms, pitavastatīns, pravastatīns, rosuvastatīns, simvastatīns un to farmaceitiski pieņemamās sālis.

3. Kombinācija saskaņā ar 1. pretenziju, kurā tromboze ir saistīta ar akūtu koronāro sindromu, miokarda infarktu, nestabilu stenokardiju, hipertensiju, asinsvadu spazmu, pārejošu išēmisku lēkmi, priekškambaru fibrilāciju, insultu, artēriju sklerozi, perifero artēriju oklūziju, vēnu trombozi, dziļo vēnu trombozi, tromboflebītu, koronāro artēriju trombozi, artēriju emboliju, smadzeņu artēriju trombozi, smadzeņu emboliju, nieru emboliju, plaušu emboliju, diabētu, ķirurģisku operāciju un asins sabiezēšanos.

4. Kombinācija saskaņā ar 1. pretenziju, kurā meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls un HMG-CoA reduktāzes inhibitors tiek lietoti kā atsevišķas gatavās zāļu formas.

5. Kombinācija saskaņā ar 1. pretenziju, kurā meldonija acetilsalicilskābes pievienošanas sāls un HMG-CoA reduktāzes inhibitors tiek lietoti kā viena gatavā zāļu forma.