LV13886B - Farmaceitiska kompozīcija mitohondriju kompleksa I protekcijai pret ksenobiotiku izsauktiem bojājumiem - Google Patents

Description

-1Izgudrojuma apraksts

Farmaceitiska kompozīcija mitohondriju kompleksa I protekcijai pret ksenobiotiku izsauktiem bojājumiem.

Izgudrojums attiecas uz farmāciju, konkrēti uz farmaceitiskajām kompozīcijām, kuras nodrošina mitohondriju kompleksa I aizsardzību pret medikamentu izraisītiem bojājumiem

Ir zināms, ka mitohondrijiem ir būtiska loma šūnas apgādē ar enerģiju pateicoties adenozīntrifosfata (ATF) sintēzei tajās un šūnas dzīvotspējas uzturēšanā. Mitohondriālais deficīts jeb mitohondriju funkcionētspējas samazināšanās tiek uzskatīta par galveno cēloni tādām saslimšanām kā diabēts un aptaukošanās (B.B. Lowell, G.I. Shulman, Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes, Science 307 (2005) 384-387), neirodeģeneratīvās saslimšanas Parkinsona slimība, Alcheimera slimība (T.L. Michael, M.F. Beal, Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases, Nature 443 (2006) 787-795), oftalmoplēģija (M.J. Longley, S. Clark, C. Yu Wai Man, G. Hudson, S.E. Durham, R.W. Taylor, S. Nightingale, D.M. Tumbull, W.C. Copeland, P.F. Chinnery, Mutant POLG2 disrupts DNA polymerase gamma subunits and causes Progressive extemal ophthalmoplegia, Am. J. Hum. Genet. 78 (2006): 10261034), miopātija (S. DiMauro, Mitochondrial myopathies, Curr. Opin. Rheumatol. 18(2006) 636-641).

Mitohondriālo disfunkciju izsauc virkne ārstniecībā lietojamo medikamentu, tādi kā citostatiskās vielas, antibiotikas, HIV ārstēšanas preparāti u.c. īpašu toksicitāti uzrāda nukleozīdu reversās transkriptāzes inhibitoru klases preparāti - AZT, stavudīns, lamivudīns, didanozīns un citi (L. Lamperth, M.C. Dalakas, F. Dagani, J. Anderson, R. Ferrari, Abnormal skeletal and cardiac muscle mitochondria induced by zidovudine (AZT) in human muscle in vitro and in an animal modei, Lab. Invest. 65 (1991) 742-751. J.S. Modica-Napolitano, AZT causes tissue-specific inhibition of mitochondrial bioenergetic function, Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 (1993)170-177.).

-2īr zināms, ka AZT izraisa dramatisku disfunkciju elpošanas ķēdē, nomainot aerobo elpošanu uz anaerobo. Vienlaikus samazinās ATF sintēze, pastiprinās oksidatīvais stress un brīvo radikālu uzkrāšanās (W. Lewis, Mitochondrial dysfunction and nucleoside reverse transcriptase inhibitor therapy: experimental clarifications and persistent clinical questions, Antiviral Res. 58 (2003), 189-197), notiek deģeneratīvas izmaiņas mitohondriju ultrastruktūrā (T. Corcuera, M.J. Alonso, A. Picazo, F. Gomez, M. Roldan, M. Abad, E. Munoz, A. Lopez-Bravo, Hepatic morphological alterations induced by zidovudine (ZDV) in an experimental modei, Pathol. Res. Pract. 192 (1996) 182-187) kam seko šūnas bojāeja (F. Petit, B. Fromenty, A. Owen, J. Estaquier, Mitochondria are sensors for HIV drugs, Trends Pharmacol. Sci. 26 (2005) 258-264).

Tomēr nav skaidrs, vai tieši šie procesi ir galvenie faktori, kas izsauc mitohondriju disfunkciju, jo ir labi zināms, ka AZT un citi apgrieztās transkriptāzes inhibitori inhibē cilvēku DNS polimerāzi-γ, un tāpēc bloķē mitohondriālās DNS replikāciju, kas savukārt nosaka šo preparātu toksicitāti (Dalakas M.C. Retroviral myopathies. In. Engel A.G., Franzini-Armstrong C. (editors). Myology. New York; McGrawHill, 1994, 1419-1437.)

AZT inducētā kardiotoksicitāte pelēm izpaužas gan kā morfoloģiskās deģeneratīvas un iekaisuma - izmaiņas sirds audos, gan kodola faktora κ-Βρ65 pārmērīgā ekspresijā (V. Klusa, J. Pupure, S. Isajevs, J. Rumaks, V. Gordjushina, A. Kratovska, I. Taivans, S. Svirskis, L. Vīksna, I. Kalvinsh, Protection of azidothymidine-induced cardiopathology in mice by mildronate, a mitochondriatargeted drug, Bas. Clin. Pharmacol. Toxicol. 99 (2006) 323-328).

No tā izriet, ka jebkurš no šiem procesiem , kā arī to kopums var tikt uzskatīts par cēloni anti-HIV preparātu, tai skaitā azidotimidīna (AZT) izraisītajās sirds un skeleta muskulatūras patoloģijās, periferās neiropātijās, aknu steatozē, aizkuņģa dziedzera iekaisumā, kā arī muguras smadzeņu supresijā (W. Lewis, Mitochondrial dysfunction and nucleoside reverse transcriptase inhibitor therapy: experimental clarifications and persistent clinical questions, Antiviral Res. 58 (2003) 189-197).

-3Apskatot enerģijas ražošanas procesu šūnās ir jāsecina, ka visu barības vielu oksidēšanas gala stadija ir NADH un FADH2 veidošanās mitohondriju matriksā. Elektronu transporta ķēdes oksidē šos reducētos kofaktorus, pārnesot elektronus vairākpakāpju procesā uz O2 molekulu, kas kalpo kā galējais elektronu akceptors, kas akumulē brīvo enerģiju, lai to tālāk nodotu ATF sintēzei.

Mitohondriālo elektronu pārnesi kopumā nodrošina 4 lieli biomolekulu kompleksi (I-ĪV), kas secīgi katalīzē atsevišķas elektronu pārneses stadijas. Kompleks I ir pats komplicētākais, un cilvēku gadījumā sastāv no vismaz 40 dažādiem polipetīdiem ar totālo masu apmēram lMDa. Bieži šo kompleksu sauc arī par NADH dehidrogenāzi vai par NADH-ubihinona oksidoreduktāzi, un tas katalīzē elektronu pārnesi no NADH uz ubihinonu (koenzīmu Q).

NADH oksidēšanās sākas ar 2 elektronu un 2 protonu pārnesi no NADH + H⁺ uzflavinamononukleotīdujebFMN:

NADH + H⁺ + FMN------------ NAD⁺ + FMNH₂

Šie elektroni tiek transportēti caur vairākiem FeS centriem uz ubihinonu, kas var būt kā viena, tā divu elektronu akceptors, jo spēj veidot stabilu semihinonu. Būdami lipofīli ubihinons un ubihinols brīvi pārvietojas membrānās un var kalpot kā elektronu pārneses molekulas no kompleksa I un kompleksa II uz kompleksu

III. Paralēli divu elektronu pārneses procesam no kompleksa I uz ubihinonu arī 4 protoni tiek izsūknēti no mitohondriālā matriksa uz citosolu. Diemžēl visai maz ir zināms par šī procesa molekulārajiem mehānismiem.

Tāpat ir zināms, ka mitohondrijos pastāv trausls līdzsvars starp radikāliem, kas tur veidojas un antioksidatīvajām sistēmām, kas kontrolē to līmeni. Jebkuras novirzes no šī līdzsvara, ir saistītas ar pataloģiskām izmaiņām, pirmkārt, mitohondriālo membrānu caurlaidības izmaiņām attiecībā pret Ca joniem un citām homeostāzi ietekmējošām vielām līdz pat apoptozei, nekrozei un šūnu bojāejai.

No šī viedokļa ir skaidrs, ka nepieciešams atrast farmakoloģiski akceptējamas vielas, kas spētu selektīvi protektēt kādu no dažādu šūnu tipu mitohondriju elpošanas kompleksiem 1-IV, vai arī ATF sintāzi (kompleks V) pret dažādu toksisku vielu iedarbību, tajā skaitā pret veselu virknes medikamentu kaitīgo iedarbību uz mitohondrijiem.

-4Tā kā elpošanas ķēde sākas tieši ar NADH reduktāzi kā vienu no būtiskākajiem un jūtīgākajiem fermentu kompleksiem, tad šī izgudrojuma mērķis bija atrast tādu farmaceitisku kompozīciju, kas spētu aizsargāt mitohondrijus tieši NADH reduktāzes līmenī.

Ir zināma virkne aģentu, kas inhibē šo fermentu - tostarp rotenenons, 1metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridīns (MPTP) u.c., kuras līdz ar to var izmantot, lai modelētu NADH reduktāzes bojājumus, ko izsauc fannakoloģiskie aģenti un citi ksenobiotiķi. Šo kompleksu tāpat bojā NO radikāls.

Tāpat ir zināmas vielas, kas aizsargā šūnas no oksidatīvā stresa galvenokārt reducējošie fermenti (superoksīd-dismutāze, katalāze, glutationperoksidāze), vai antioksidanti - tādi kā vitamīns E, ubihinons, idebenons, vitamīns C vai to atvasinājumi.

Uz atsevišķiem šūnu tipiem - piemēriem neironiem, ir parādīts, ka iedarbojoties ar muskarīna receptora aktivātoriem (oksotremorīnu M), tos var aizsargāt pret tāda medikamenta kā kamptotecīna kā ari rotenona (kompleksa 1 inhibītora) izsaukto mitohondriju inhibīciju (P.De Samo, S.A.Shestopal, T.D.King, A.Zmijewska, L.Song, R.S.Jope. J.Biol.Chem., Vol. 278, 11086-11093, 2003). Tomēr šo vielu nevar lietot klīniskajā praksē, jo tam piemīt konvulsijas izraisoša darbība.

Šobrīd klīniskajā praksē vispār nav neviena korekti pierādītas iedarbības medikamenta, kas, piemēram, spētu aizsargāt neironus pret šūnu nāvi (neiroprotektanti) vai normalizēt bojātu neironu darbību (neirorestaurātori) (T.M.Dawson, V.L.Dawson. Neuroprotective and neurorestorative strategies for Parkinson’s disease. Nature Neuroscience supplement, P. 1058-1061, vol.5, Nov.2002.).

Mēs negaidīti atklājām, ka izgudrojuma mērķi - aizsargāt šūnu mitohondriālo NADH reduktāzi pret ksenobiotiku nelabvēlīgo ietekmi - var sasniegt, izmantojot farmaceitisku kompozīciju, kas satur 3-(2,2,2trimetilhidrazīnija)propionāta dihidrātu (mildronātu).

Šo preparātu plaši lieto bijušās PSRS teritorijā kā antiišēmisku vielu un citoprotektoru, kuras darbības mehānisms, kā izriet no literatūras datiem, ir

-5balstīts uz karnitīna līmeņa pazemināšanu organismā un līdz ar to taukskābju betaoksidēšanas ātruma ierobežošanu.( M.Dambrova, E.Liepinsh, I.Kalvinsh. Mildronate: Cardioprotective Action through Camitine-Lowering Effect. Trends Cardiovascular medicine. P.275-279, p. 2Vol,12, No6, 2002.). Ir zināms, ka šis preparāts var aizsargāt mitohondriālās membrānas pret išēmijas izsauktiem bojājumiem. Tomēr līdz šim tiek uzskatīts, ka šis protektīvais efekts ir saistīts ar mildronāta spēju samazināt tādu membrānaktīvu savienojumu uzkrāšanos mitohondrijos, kādi ir taukskābju aktivizētās formas - acil-KoA un acil-kamitīns. Šie metabolīti uz lipīdus saturošām membrānām, tai skaitā mitohondriju membrānām, darbojas kā deterģenti. Līdz ar to tika uzskatīts, ka mildronāta protektīvie, it īpaši kardioprotektīvie efekti galvenokārt ir saistīti ar mildronāta spēju samazināt šo deterģentu līmeni un iegūtais efekts balstās tīri uz fizikālu parādību - deterģentu izsaukto bojājumu līmeņa samazinājumu. Par to, ka mildronāts specifiski spētu aizsargāt mitohondriālo NADH reduktāzi pret ksenobiotiķu izsauktiem bojājumiem literatūrā nekādu datu nav.

Vēl jo vairāk, bija zināms, ka mildronāts (meldonijs) aizsargā eksperimentālos dzīvniekus no AZT izsauktām blaknēm un bija arī parādīts, ka šis efekts ir saistāms mildronāta spēju novērst NF kBp65 aktivitātes un tās daudzuma pieaugumu kardiomiocītos, kas rezultējas tādu fizioloģisku noviržu kā perivaskulārās un stromālās edēmas, mikardiālo taukaudu izsauktas deģenerācijas un leikocītu infiltrācijas ar tai sekojošu kardiomiocītu nekrozi. (Latvijas patents LV 13544 B (pieteikums Nr. P-05-95) V.Kluša, S.Isajevs, J.Pupure, J.Rumaks, V.Gordjušina, I.Taivans, I.Kalviņš. Farmaceitiskā kompozīcja uz apgrieztās transkriptāzes inhibitora un meldonija bāzes). Par to, ka mildronāts spētu aizsargāt mitohondriju elpošanas ķēdi, konkrēti kompleksu 1 pret ksenobiotiku, tai skaitā AZT izsauktajiem bojājumiem literatūrā nekādu datu nebija.

Šī izgudrojuma ietvaros mēs negaidīti atklājām, ka mildronāts spēj aizsargāt arī NADH reduktāzi pret dažādu ksenobiotiku ietekmi, tai skaitā arī pret specifiska NADH reduktāzes blokatora rotenona, kā ari AZT izsauktajiem mitohondriju bojājumiem.

-6Līdz ar to mūsu atklātā mildronāta spēja aizsargāt mitohondriālo NADH reduktāzi pret ksenobiotiku kaitīgo ietekmi ļauj rekomendēt izmantot šo farmaceitisko kompozīciju pie veselas virknes pataloģiju, kuru patoģenēzē svarīga loma ir tieši mitohondriālās NADH reduktāzes bojājumiem, jo ir zināms, ka mitohondriālo funkciju depresija ir novērojama pie Alcheimera slimības, Parkinsona slimības, hipertenzijas, kardiomiopātijas, hipertiroidisma, Hantingtona slimības, noguruma un samazinātu darbaspēju gadījumos, mitohondriālajām encefalomiopātijām, laktāta acidozes, diabēta, mialgijām, mioglobinūrijas, miopātijas sindromiem, audzējiem, optiskās atrofijas, rabdomilīzes, pēkšņas zīdaiņu nāves, Vilsona slimības. Par mildronāta efektivitāti pie daudzām no šīm iespējamām indikācijām literatūrā ziņu nav. Tāpēc mūsu atklātā mildronātu saturošas farmaceitiskas kompozīcijas spēja protektēt mitohondriālo NADH reduktāzi būtiski paplašina tā pielietošanas sfēru un sniedz bioķīmisko pamatojumu šīs kompozīcijas bioķīmiskās un farmakoloģiskās darbības mehānismam.

Atbilstoši eksperimentā lietotajām mildronāta devām, klīniski pielietojamās mildronāta devas farmaceitiskajās kompozīcijās, kas paredzētas perorālai, parenterālai vai arī vietējai ievadīšanai ir robežās no 100-2000 mg dienā. Farmaceitiskās kompozīcijas perorālai pielietošanai var tikt izgatavotas, pielietojot standarta metodes un farmaceitiski akceptējamas palīgvielas un šķīdinātājus. Šis kompozīcijas var tikt izgatavotas kā tablešu, tā kapsulu, kaplēšu, granulu, pulvera, suspensiju, vai šķīdumu formā, bet vietējai ievadīšanai var tikt izgatavoti tādās ārstnieciskās formas kā plāksteri, ziedes, gēli, putas, šķīdumi, emulsijas un suspenzijas. Ārstēšanas kursu ilgums ir atkarīgs no konkrētās pataloģijas un svārstās robežās no 10 dienām līdz trim mēnešiem, bet ārstēšanas kursi var tikt atkārtoti pēc vajadzības.

Izgudrojuma būtību ilustrē, bet neierobežo pētījumi, kas tika veikti uz žurku aknas izolētiem mitohondrijiem, nosakot mitohondriālo bioenerģētiku, oksidatīvo stresu un mitohondriālās membrānas caurlaidības maiņu (mitochondrial permeability transitiori) dažādu ksenobiotiķu ietekmē un tika izvērtēta mildronātu saturošo kompozīciju spēja uzlabot samazināto mitohondriju

-7funkcionētspēju. Kā viena no ksenobiotikām tika izmantots AZT, kas var izraisīt ari mitohondriālo procesu disfunkciju.

Visos eksperimentos izmantoja Wistar žurku tēviņus (250-350 g), kuri tika turēti standartizētos laboratorijas apstākļos (22±0,5 °C, 12 h gaismas - tumsas cikls) ar brīvu pieeju standarta laboratorijas barībai un dzeramajam ūdenim. Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar Eiropas Savienības Direktīvas 86/609/EEC vadlīnijām “European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes” (1986).

Žurku aknu mitohondriji tika izolēti, centrifugēti, noteikts proteīna daudzums, izmantojot vērša seruma albumīnu kā standartu. Skābekļa patēriņš tika mērīts polarogrāfīski ar Clark-veida elektrodu. Mitohondriju aktivizēšana notika ar lOmM glutamātu / 5mM malātu vai lOmM sukcinātu.

Lai ierosinātu stāvokļa-3 elpošanu, tika pievienots adenozīndifosfats (ADP, 50 - 100μΜ). Elpošanas atjūgšana tika ierosināta, pievienojot ΙμΜ ptrifluorometoksifenilhidrazonu (FCCP). Elpošanas kontroles koeficients (respiratory control ratio, RCR) un adenozīndifosfata pret skābekli koeficients (ADP/O) tika aprēķināti pēc iepriekš aprakstītas metodes (B. Chance, G.R. Williams, The respiratory chain and oxidative phosphorylation, Adv. Enzymol. 17 (1956) 65-134).

Mitohondriju transmembrānas potenciāls (ΔΨ) tika mērīts netieši, balstoties uz lipofīlā katjona tetrafenilfosfonija (TPP⁺) aktivitāti un izmantojot TPP⁺-selektīvu elektrodu, pēc iepriekš aprakstītas metodes (N. Kamo, M. Muratsugu, R. Hongoh, N. Kobatake, Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenylphosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady State, J. Membr. Biol. 49 (1979) 105-121).

Lai noteiktu Ca²⁺-ierosināto mitohondriju membrānas caurlaidības maiņu (rnitochondrial permeability transition, MPT), tika izmantoti skābekļa un TPP⁺ elektrodi.

Ūdeņraža peroksīda (H2O2) veidošanās tika mērīta fluorometriski, izmantojot modificētu iepriekš aprakstītu metodi (G. Barja, The quantitative measurement of

-8H₂O₂ generation in isolated mitochondria, J. Bioenerg. Biomembr. 34 (2002) 227233).

Visi eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes ar dažādiem mitohondriju paraugiem. Rezultāti izteikti kā vidējais ± standartkļūda. Vidējie lielumi tika salīdzināti izmantojot ANOVA, statistiskā ticamība izteikta pie p<0,05.

Visi reaģenti saņemti no Sigma (St Louis, MO, USA), izņemot azidotimidīnu un mildronātu: ADP, rotenons (kompleksa I inhibitors), ptrifluorometoksifenilhidrazons (FCCP, elpošanas ķēdes atjūdzējs, uncoupler). antimicīns A (kompleksa III inhibitors), ciklosporīns A (mitohondriju caurlaidības maiņas inhibitors, inhibitor of mitochondrialpermeability transition).

katalāze (antioksidantu enzīms), barotņu komponenti.

AZT, 3’-azido-3’-deoksitimidīns (Retrovir* 100 mg kapsulas, The Wellcome Foundation Ltd., London, MAS /9307/MRS /BQTG93-10). Mildronāts [3-(2,2,2-trimetilhidrazīnija)propionāta dihidrāts] ražots A/s “Grindex”.

Piemērs 1. AZT inducētās izmaiņas mitohondriju bioenerģētikā.

AZT būtiski samazina stāvokļa-3 (t.i. skābekļa patēriņu substrāta un ADP klātbūtnē) elpošanu par 30% (5 mM jeb 5pmol AZT/mg proteīna) un 62% (10 mM jeb lOpmol AZT/mg proteīna), izmantojot glutamātu /malātu kā elpošanas substrātu. Sukcināta-stimulētā elpošanā AZT (lOmM) samazina stāvokļa-3 elpošanu par 23%. AZT arī būtiski samazina FCCP izraisīto elpošanas atjūgšanu glutamāta /malāta-stimulētā mitohondriju elpošanā par 17% un 45% (attiecīgi 5 un 10 mM), taču tas neietekmē FCCP elpošanas atjūgšanu sukcināta-stimulētā elpošanā (1. attēls). Eksperimentāli tika noskaidrots, ka AZT būtiski samazina elpošanas kontroles koeficientu (respiratory control ratio (RCR) - kas ir stāvokļa3/stāvokļa-4 attiecība un norāda sajūga stingrumu starp elpošanu un fosforilēšanu), ADP/O koeficientu {ADP to oxygen ratio - attiecību starp ATP sintēzi un skābekļa patēriņu, mērot skābekļa koncentrācijas samazināšanos stāvokļa-3 elpošanas laikā pēc ADP pievienošanas) un mitohondriju membrānas potenciālu (Δ!Ρ), kad glutamāts /malāts lietots kā substrāts (2.attēls, 1. tabula). Tas liecina, ka AZT izraisītie mitohondriju bojājumi galvenokārt norisinās kompleksa

-9I līmenī. Tātad, AZT izraisītā mitohondriālā disfunkcija var tikt izmantota kā modelis tādu preparātu meklējumiem, kuras spētu aizsargāt mitohondriālo kompleksu I no bojājumiem.

1. tabula rāda, ka in vitro AZT samazināja mitohondriju transmembrānas potenciālu (ΔΨ), nomāca repolarizāciju, repolarizācijas koeficientu un palielināja fosforilācijas laiku, izmantojot abus mitohondriju elpošanas substrātus, taču šie efekti bija vairāk izteikti ar glutamātu /malātu (lA.tabula) nekā ar sukcinātu (lB.tabula). AZT samazināja glutamāta /malāta-stimulēto repolarizāciju par 7% (koncentrācijā 5 mM) un 12% (10 mM), repolarizācijas koeficientu attiecīgi par 12% un 27%, kā arī palielināja fosforilācijas laiku par attiecīgi 19% un 77%. AZT izraisītās mitohondriju transmembrānas potenciāla negatīvās izmaiņas traucē ATP sintēzi un līdz ar to ari normālu šūnas funkcionēšanu. AZT (5-10 mM) ievērojami stimulēja H2O2 veidošanos mitohondrijos gan inhibitora rotenona klātbūtnē, gan kontroles apstākļos (bez inhibitoriem), tādējādi darbojoties kā pro-oksidants. Tas lielākā mērā izpaudās tad, kad kā substrāts tika izmantots glutamāts /malāts (3. attēls). Tas, ka AZT nestimulēja H2O2 veidošanos abu inhibitoru rotenona + antimicīna A klātbūtnē (izmantojot kā substrātus gan glutamātu /malātu, gan sukcinātu), izslēdz kompleksa III līdzdalību H2O2 veidošanās stimulācijā. Šo pētījumu rezultāti liecina, ka AZT stimulējošā ietekme uz H2O2 veidošanos pārsvarā notiek kompleksa I līmenī.

Piemērs 2. Mildronāta protekcija pret AZT-inducētajām izmaiņām mitohondriju bioenerģētikā.

Mūsu pētījumi rāda, ka mildronāts per se koncentrācijas līdz lOmM neietekmē mitohondriālos procesus. Līdz ar to nav sagaidām tā nelabvēlīga ietekme uz intaktām šūnām un intaktu organismu. Tajā pašā laikā mildronāts novērsa AZT-radīto FCCP elpošanas atjūgšanas inhibīciju (1.attēls), taču nespēja novērst AZT-izraisīto stāvokļa-3 elpošanas inhibīciju apstākļos, kad glutamāts/malāts izmantots kā elpošanas substrāts. Mildronāts ari preventēja AZT depresējošo ietekmi uz ADP/O attiecību, kad kā substrāts tika izmantots sukcināts (2.attēls). Tas norāda, ka mildronāts spēj protektēt AZT-izraisīto mitohondriālo toksicitāti kompleksa I līmenī.

-10Mildronāts būtiski neietekmēja ΔΨ un fosforilācijas laiku, izmantojot abus elpošanas substrātus. Mildronāts būtiski uzlaboja AZT-radītās nevēlamās repolarizācijas, repolarizācijas koeficienta un fosforilācijas laika izmaiņas ar glutamātu/malātu kā substrātu (lA.tabula).

Piemērs 3. Mildronāts protektē AZT-inducēto ūdeņraža peroksīda (H2O2) veidošanos

Mildronāts per se (5-10 mM) neietekmē H₂O₂ veidošanos kontroles apstākļos, kā arī tad, kad tika lietoti inhibitori: rotenons vai rotenons + antimicīns

A abu substrātu gadījumos (3. attēls), kas liecina, ka mildronāts nedarbojas kā brīvo radikāļu (H₂O₂) savācējs. Toties mildronāta protektē mitohondrijus pret AZT izraisīto pārmērīgo H₂O₂ veidošanos, ir papildus liecība tam, ka mildronāts mitohondrijos protektē elpošanas ķēdes kompleksu I no tā bojājumiem, kurus izsauc pārmērīga H₂O₂ koncentrācija.

-11Piemērs 4. Mildronāts samazina AZT ietekmi uz Ca -izraisīto mitohondriju caurlaidības maiņu (MPT)

Ja AZT augstās koncentrācijas (5-10 mM) inducēja vidējas (ap 33%) intensitātes Ca -izraisītu MPT (4.attēls), tad mildronāts, kas pats neietekmēja šo procesu, pilnīgi reversēja AZT efektu (4. attēls).

Tādējādi mēs negaidīti atklājām, ka mildronāts spēj novērst toksisku medikamentu, piemēram, (AZT) izraisītos mitohondriju bioenerģētikas traucējumus un ūdeņraža peroksīda veidošanos mitohondriju kompleksa I līmenī, kas ir pilnīgi negaidīts un nezināms mildronāta efekts, jo līdz šim mildronāta bioloģisko iedarbību skaidroja un pamatoja ar mildronāta spēju samazināt kamitīna līmeni organismā un tādējādi kontrolēt taukskābju oksidācijas ātrumu, kam nav tieša un prognozējama sakara ar NADH reduktāzes (kompleksa 1) protekciju pret bojājumiem. Tādējādi izgudrojuma ietvaros atklātā mildronāta spēja tieši un nepastarpināti iedarboties uz mitohondriālo kompleksu 1, to aizsargājot pret toksisku vielu, tai skaitā medikamentu kaitīgo ietekmi uz mitohondrijiem atļauj rekomendēt šo vielu to slimību ārstēšanai, kuru patoģenēzē būtiska loma ir mitohondriālā kompleksa 1 bojājumiem, piemēram Parkinsona slimība, Alcheimera slimība u.c.

Claims (7)

1. IZGUDROJUMA FORMULA

   1. Farmaceitiska kompozīcija, kas paredzēta perorālai, parenterālai vai vietējai lietošanai, un satur klīniski efektīvu 3-(2,2,25 trimetilhidrazīnij)propionāta daudzumu, kā arī farmaceitiski piemērotas pildvielas, un kas atšķiras ar to, ka tā paredzēta mitohondriālā kompleksa 1 (NADH-reduktāzes) aizsargāšanai pret ksenobiotiku kaitīgo ietekmi.
2. 2. Farmaceitiskā kompozīcija pēc p-ta 1, kas atšķiras ar to, ka 3-(2,2,210 trimetilhidrazīnij)propionāts tiek lietots dihidrāta formā.
3. 3. Farmaceitiskā kompozīcija pēc p-ta 1, kas atšķiras ar to., ka 3-(2,2,2trimetilhidrazīnij)propionāts tiek lietots farmaceitiski akceptējamas sāls formā.
4. 4. Farmaceitiskā kompozīcija pēc p-ta 1, kas atšķiras ar to, ka 3-(2,2,215 trimetilhidrazīnij)propionāts ievadīšanai cilvēka organismā tiek lietots tabletes, kapsulas, kapletes, pulvera, ziedes, emulsijas, gēla vai šķīduma formā, kas nodrošina 100-2000 mg mildronāta ievadīšanu dienā.
5. 5. Farmaceitiska kompozīcija pēc p.l.- p.3., kas atšķiras ar to, ka tā

   20 paredzēta klīniskajai pielietošanai tādu ar mitohondriālā kompleksa 1 saistītu slimību ārstēšanā, kuras ietilpst saslimšanu grupā, kas sastāv no Alcheimera slimības, Parkinsona slimības, Hantingtona slimības, hipertenzijas, kardiomiopātijas, hipertiroidisma, mitohondriālajām encefalomiopātijām, laktāta acidozes, diabēta, mialgijām,

   -13mioglobinūrijas, miopātijas sindromiem, audzējiem, optiskās atrofijas, rabdomilīzes, pēkšņas zīdaiņu nāves, Vilsona slimības.
6. 6. Farmaceitiskās kompozīcijas pēc p-ta 1-4, pielietošana NADH reduktāzes aizsardzībai pret ksenobiotikām, kas pieder pie grupas,

   5 kas sastāv no apgrieztās transkriptāzes inhibitoriem azidotimidīna, lamivudīna, stavudīna.
7. 7. Farmaceitiskās kompozīcijas pēc p-ta 1-4, pielietošana NADH reduktāzes aizsardzībai pret azidotimidīna izsauktajiem bojājumiem.