LU85868A1 - IMMUNOACTIVE COMPONENTS IMMOBILIZED IN A POROUS MATERIAL - Google Patents

IMMUNOACTIVE COMPONENTS IMMOBILIZED IN A POROUS MATERIAL Download PDF

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LU85868A1
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Eugeen P E Bosmans
Henri J Martins
Jef C M Raus
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Willems Inst Dr L
Univ Limburg
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Description

* *î* * î

COMPOSANTES IΜί· ~T>-C ACTlVES IMîwB-IL-I SEESCOMPONENTS IΜί · ~ T> -C ACTlVES IMîwB-IL-I SEES

\ - Γ'λ1»5 *01 s Z MAT X ZRE tC Pu T Si.· COP^slSSarCS® s^*-.*** 05 Un ,!imunoassay" constitue une technique analyti que Das sa sur 1 'ϊιιιγ.ι^θ c1 ur. antxgene pour Iss sites ö1 êssocicticn c'en anticrèr.e sur un anticoros. Les anti— cènes ou les antxcorcs sent rareres directement ou indirectement avec ur. isotope, une er.zyre, eu flucrocnrome 10 ou uns auure sur-stance nesurêDie · On etac_xt ces courcss d*étalonnage sur la base ce données obtenues après incubation d'échantillons eux contiennent des concentrations differentes, rais connues, d’antigene ou d’anticorps. Après une incubation, or. sépare les complexes associés 15 d1(antigène-anticorps}r ce l’antigène ou de l’anticorps libre. Ensuite, on mesure la quantité ce complexe formé ou d'antigène ou d'anticorps restant libre au moyen de détecteurs spécifiques dépendant du marqueur utilisé. Ce processus est répété cour ur. certain nombre c'échantil-20 Ions qui contiennent des quantités bxen déterminées d’antigènes ou c’anticoros et les résultats obtenus sont présentés sous forme d’un craphioue. Or. v porte la cuan-tité de marqueur que l'on mesure dans le complexe antigène-anticorps, ou bien dans l’antigène ou 11 anticorps 25 estent- 0p. fonction ess diversss conc0np.pGP.iops dBe.nti— cène ou ganticorps. Lorsque cette courbe g * étalonnéçe a 11 s 6 6 a cette rr'"* co*"s* £*6 i ^ ^ r- - · ~ _ tr erb tcst-rce sur et cc.rbcrt f Ze ρ··β·—^et cire ^ di w- JL . μ· 0 X .G C'» I 1* ·; ' - —*·—- ·- '*“* ü v-, ί· Ci ^ ^ ^ d d. ** *“ î— T *·*’ ,** > ce 1‘anticorps ou eu complexe antigène-anticorps par\ - Γ'λ1 "5 * 01 s Z MAT X ZRE tC Pu T Si. · COP ^ slSSarCS® s ^ * -. *** 05 A,! Imunoassay" constitutes an analytical technique that Das sa on 1 ϊιιιγ. ι ^ θ ur antxgene for Iss sites ö1 essocicticn it anticrèr.e on an anticoros. Anticenes or antxorcs are rare directly or indirectly with ur isotope, an er.zyre, had flucrocnrome 10 or a auure sur-stance nesurêDie · We etac_xt these calibration courses on the basis of this data obtained after incubation of samples they contain different concentrations, known raises, of antigen or antibody.After an incubation, or. separates the associated complexes D1 (antigen-antibody) r antigen or free antibody. Then measure the amount of this complex formed or of antigen or antibody remaining free by means of specific detectors depending on the marker used. This process is repeated in ur number a sample of 20 ions that contain specific bxen quantities of antigens or c'antoros and l The results obtained are presented in the form of a graph. Or. V carries the cuan-tity of marker that is measured in the antigen-antibody complex, or in the antigen or 11 antibodies 25 estent- 0p. ess diversss function conc0np.pGP.iops dBe.nti— cene or g Antibody. When this curve g * calibrated at 11 s 6 6 at this rr '"* co *" s * £ * 6 i ^ ^ r- - · ~ _ tr erb tcst-rce sur et cc.rbcrt f Ze ρ ·· β · - ^ and wax ^ di w- JL. μ · 0 X .G C '»I 1 * ·; '- - * · —- · -' * “* ü v-, ί · Ci ^ ^ ^ d d. ** * “î— T * · *’, **> this 1‘ antibody or had antigen-antibody complex by

Une autre variante de cette technique est basée sur l'addition au mélange d'un deuxième anticorps qui Ce fait précipiter sélectivement l'anticorps (avec l'antigène qui y est associé}, ce qui laisse finalement uniquement l'antigène non associé en solution. L'antigène non associé est alors sépare du complexe antigène-anticorps par centrirugstion ou car un autre moyen » certains 10 chercheurs ont fixé l'anticorps ou l'antigène sur la paroi d'un récipient en nlasticue et puis on introduit dans le récipient un échantillon contenant un antigène ou un anticorps. Le mélange ainsi obtenu est incubé et puis on sépare le complexe antigène-anticorps formé de 15 l’antigène ou de 1'anticorps libre en vidant simplement le récipient.Another variant of this technique is based on the addition to the mixture of a second antibody which selectively precipitates the antibody (with the antigen associated with it), which ultimately leaves only the unassociated antigen in solution. The unassociated antigen is then separated from the antigen-antibody complex by centrirugstion or because another means "some 10 researchers have fixed the antibody or the antigen on the wall of a plastic container and then introduced into the container a sample containing an antigen or an antibody The mixture thus obtained is incubated and then the antigen-antibody complex formed is separated from the antigen or free antibody by simply emptying the container.

Plus récemment, on a cherché à associer des antigènes et des anticorps à eu dextrane lui-même, έ de la cellulose et â des produits similaires. Après incubation 20 le complexe antigène-anticorps esc séparé de manière simple des antigènes ou ces anticorps non associés.More recently, attempts have been made to associate antigens and antibodies with eu dextran itself, cellulose and similar products. After incubation, the antigen-antibody complex esc is simply separated from the antigens or these non-associated antibodies.

Dans toutes ces méthodes, on détermine 1‘antigène ou l'anticorps associe et on mesure, à 1'aide d'un courbe d'étalonnage, la quantité d'antigène ou £!anticorps 25 qui était présente dans l’échantillon inconnu.In all of these methods, the antigen or antibody associated is determined and the amount of antigen or antibody which was present in the unknown sample is measured using a standard curve.

^ ___ i «U. — * h r ^ ί-.^- Î.__- __*r ~ - - / - j_ ce p.usieurs anticen.es et anticorps __eurs rapports res — oectirs ne sont p-as cetermines a~'rec précision.^ ___ i "U. - * h r ^ ί -. ^ - Î .__- __ * r ~ - - / - j_ this p.usieurs anticen.es and antibodies __eurs reports respect - ectirs are not cetermines to ~ 'rec precision.

But de la présente invention >Aim of the present invention>

VV

qui permet de fixer divers antigènes ou anticorps en ces J- GuOr 1 LU:iS Dl wH Œ ..... ... —J. J.6 manière que 1 ‘ inmuncsorbant ainsi préparé puisse être employé dans des déterminations immunologiques indivi-05 Quelles ou multiples.which allows to fix various antigens or antibodies in these J- GuOr 1 LU: iS Dl wH Œ ..... ... —J. J.6 way that the absorbent thus prepared can be used in individual or multiple immunological determinations.

Objet de la présente invention L'invention porte sur un irr unes:rbant utilisable dans les déterminations i~molog 2 r u e s . le sortant (ad-1G serbant) hydrophile ou hydrophobe est à rase d'une matrice poreuse par exemple en polytétrafluorétnylène (PïFE) où se trouve attaché d’une manière non covalente un polymère organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe, insoluble dans l'eau, tel que le pclyacrylami-15 de, la cellulose, le silioaçel, le latex ou un polymère analogue, auquel sont associés par covalence des antigènes et-'ou ces anticoros en des Quantités bien déterminées et, s'il s'agit de divers antigènes et."eu anticorps, en des proportions bien déterminées encre-eux.OBJECT OF THE PRESENT INVENTION The invention relates to an irr a: rbant usable in determinations i ~ molog 2 r u e s. the hydrophilic or hydrophobic outgoing (ad-1G serbant) is level with a porous matrix, for example made of polytetrafluoroethylene (PIEF) to which is attached in a non-covalent manner an organic or inorganic polymer, hydrophilic or hydrophobic, insoluble in water, such as pclyacrylami-15 of, cellulose, silioase, latex or a similar polymer, with which are covalently associated with antigens and -or these anticoros in well determined quantities and, if they are various antigens and antibodies, in well-defined proportions.

20 De préférence la porosité est comprise entre 20 et 80% en volume.Preferably the porosity is between 20 and 80% by volume.

L'invention concerne également le procédé mis en ΟΘ13VITS pOlir réciLlSeir uH tlw-L. ^TiïïnuriC'SOr'Oc.n't-f fi 25 EIerrtent.s essentiels ce 11 cr.vent.ionThe invention also relates to the process set in V13VITS pOlir réciLlSeir uH tlw-L. ^ TiïïnuriC'SOr'Oc.n't-f fi 25 essential EIerrtent.s ce 11 cr.vent.ion

Selon I " invention les aroïcères ou les eniieoros _ __ / ^ .__ « _ . K _ __ .According to the invention, the aroic or eniieoros _ __ / ^ .__ "_. K _ __.

tr-le cens l;eeu ow' evei** ere — r ' ^ s ^ ** rccrc'" - —J p- ^ ^ ^ ^ ^ Ä - * s~' ~ *- · _ ^ J- _ - _ U ^ - w % * *- en diverses orcOomions ims le '"‘etnre ce "nsef ces >tr-le cens l; eeu ow 'evei ** ere - r' ^ s ^ ** rccrc '"- —J p- ^ ^ ^ ^ ^ Ä - * s ~' ~ * - · _ ^ J- _ - _ U ^ - w% * * - in various orcOomions ims the '"' etnre ce" nsef ces>

VV

A_ L ' incorporation eu polymère insoluble cens la ma-trice de base peut se faire par voie sèche.A_ The incorporation of an insoluble polymer which allows the basic matrix to be made by dry process.

G5 Description détaillée ce 1*inventionG5 Detailed description of this 1 * invention

La méthode utilisée tour immobiliser ces compt— * . . - . v ,__ c; ~ c; r ^ ** · *» **\ ^ s" t*ÄC ^ o ~ ^ ^ χ·'·· ä *“> ä ^ t* -· w? W* * - - -r w «.· ' k. . · m ·. c ' M W ·*. * — **,««.·.« W' ti i A W- w» W —- ·«-· V-i fcr- W ^-——w _ ^ ^ ^ ^ ^ w c „34 4?ί — _____ . ^ -__^.— 4 i_’SS -ac UX 0O0 S wUi. 000,^0710 0UIT0 c..;!'!-' ^ 00S OQj>k»I70 10 supports insolubles dans l'eau sont la cellulose, le po- lyacrvlamice, le silicacel, un latex, le sécharose, /f 1‘agarcse, etc.The method used to immobilize these accounts— *. . -. v, __ c; ~ c; r ^ ** · * "** \ ^ s" t * ÄC ^ o ~ ^ ^ χ · '·· ä * “> ä ^ t * - · w? W * * - - -rw«. ·' k .. · M ·. C 'MW · *. * - **, ““. ·. “W' ti i A W- w” W —- · “- · Vi fcr- W ^ -—— w _ ^ ^ ^ ^ ^ wc „34 4? ί - _____. ^ -__ ^ .— 4 i_'SS -ac UX 0O0 S wUi. 000, ^ 0710 0UIT0 c ..;! '! -' ^ 00S OQj> k» 170 water-insoluble carriers are cellulose, polyacrylamide, silica gel, latex, seecose, agar, etc.

La technique utilisée comporte essentiellement les étapes suivantes : 15 - on mélange ensemble le polymère poreux insoluble, ac tivé, non activé ou couplé par l'antigène ou anticorps avec la matrice poreuse de base à l'état pulvérulent pour former ur. mélange sec, - on soumet ce mélange sec à un traitement c'agglonéra-2G tion pour former ces agglomérats, - on soumet les agglomérats formés â ur: traitement de broyage pour former des agglomérats broyés, - on presse ensemble les agglomérats broyés pour former • t y»" -%·*- - rp c. ci—· 25 — or. soumet le comprime à des laminaces ~uscu1 à obten— uxor: c * ur: ri 2.π ou c u.00 θ u x. Z. 2.0 __ — — _ ___ *- „ r — ' Τ.Γ- -* 9 -, -, *. * - _ t· r-t ~ ~ -- , - Λ i ^ ^ ^ -The technique used essentially comprises the following steps: - the porous insoluble, activated, non-activated or coupled by antigen or antibody polymer is mixed together with the basic porous matrix in the pulverulent state to form ur. dry mixture, - this dry mixture is subjected to a treatment agglomerated to form these agglomerates, - the agglomerates formed are subjected to: grinding treatment to form crushed agglomerates, - the crushed agglomerates are pressed together to form • ty »" -% · * - - rp c. Ci · · 25 - or. Subjects the tablet to laminaces ~ uscu1 to obtain— uxor: c * ur: ri 2.π or c u.00 θ u x. Z. 2.0 __ - - _ ___ * - „r - 'Τ.Γ- - * 9 -, -, *. * - _ t · rt ~ ~ -, - Λ i ^ ^ ^ -

JJ

f- ^ Ο Ο Γ' S t Ô. U S f3· OS po ! VT' S^SS ” rj S C- Jl ' ” -L S S / C* w r · ~ ~ ^ *“ 0 idenrique ou diffêrenres, ecrporrant- ces quantirés connues de composés biologiques et cens un rapport connu de ces polymères ainsi chargés.f- ^ Ο Ο Γ 'S t Ô. U S f3 · OS po! VT 'S ^ SS ”rj S C- Jl'” -L S S / C * w r · ~ ~ ^ * “0 identical or different, including- these known quantities of biological compounds and supposed a known ratio of these polymers thus charged.

05 Dans certains cas c‘application, il peur erre in téressant que iesdit.es polymères poreux insolubles soient, de ncitiiGc chiirierues cif fér^ros - o-e.zr exerroXe îiv·-ärophoc-es et hyarophyles afin ce f ispeser de techniques g‘acrivarion différenciées.05 In some cases this application, it may be interesting that iesdit.es porous insoluble polymers are, of ncitiiGc chiirierues cif fér ^ ros - oe.zr exerroXe îiv · -ärophoc-es et hyarophyles so that f ispeser g ' differentiated acrivarion.

1010

Exemoles d'execution de l'invenrion L'invenrion sera décrire plus en dérail en référence aux exemples d'exécution de l'invenrion, donnés uniquement à titre d ‘ illustration sans caractère lirrdta-15 tir.Examples of execution of the invenion The invenion will be described in more detail with reference to the examples of execution of the invenion, given solely by way of illustration without lirrdta-15 shooting character.

Exemole "* uerre recmoue pemer ce cerisrer en meme rems des anticorps humains dirigés contre le cyrorégaiovirus 20 et ces anricoms humains diricés contre ce® —er ' c®-nes de surface de 1 * hépatite E. Les deux ar.riçsnes sont associés, par des réactions différentes, à un support en po— lyacrylamide qui esr ensuite incorporé dans une marrice en PTFE « 25 1. On hydrate 10 ç de polyacrylarrdde 'dimensions oss ctcituXôs jT-ietot’éttss Xittts c θycXu£^tExample "* uerre remembers pemer this cherryer in the same rems of human antibodies directed against the cyroregaiovirus 20 and these human anricoms directed against this surface of the hepatitis E. The two arriages are associated, by different reactions, to a polyacrylamide support which is then incorporated into a PTFE matrix. 25 1. 10 ç of polyacrylarrd 'of bone dimensions ctcituXôs jT-ietot'éttss Xittts c θycXu £ ^ t are hydrated

Cette susDsnsior. est ttiteÎ i r j r s~ t G6t"dô.nt 5 *p — _ f -- 5 c 4. On ajoute 70 ni de solution d'antigène (1 mg es prccssns,·· r.x î cens nu tampon su pnospnate· L'antigène gu cytomégalovirus est obtenu, entre autres,, à partir d'un extrait ce glycine-hydroxy-05 de ce sodium d‘une culture de fibroblastes conta minée par le cy tot-égalovirus ayant un effet cytc— pathocene ce ?1%.This susDsnsior. est ttiteÎ irjrs ~ t G6t "dô.nt 5 * p - _ f - 5 c 4. 70 μl of antigen solution are added (1 mg es prccssns, ·· rx î cens nu tampon su pnospnate · Antigen gu cytomegalovirus is obtained, inter alia, from an extract of this glycine-hydroxy-05 of this sodium from a culture of fibroblasts contaminated by cy tot-equalovirus having a cytc-pathocene effect at 1%.

L· antagene ce sur rare ce i nepatite E est or-tenu notamment à partir ce plasma hur.ain conte-10 nant iscit anticene» l'antigene meme est, par ex emple, isolé du plasma par chromatographie d’af-f ini uê âvsc css c.ntloorDs γγοποοΙοπεϊοι cirices contre l'antigene ce surface ce l’hépatite E.The antigen this on rare this i nepatite E is or-held in particular from this hur.ain plasma containing-10 nant iscit anticene "the same antigen is, for example, isolated from the plasma by af-f ini chromatography uê âvsc css c.ntloorDs γγοποοΙοπεϊοι cirices against the antigen this surface this hepatitis E.

Les deux antigènes sont incubés 'séparément 15 pendant 1 heure avec ur. gel de polyacrylamide ac tive .The two antigens are incubated separately for 1 hour with ur. active polyacrylamide gel.

5. Après 1'incubation, ces gels sont lavés 5 fois au moyen de 10" ici de tarpon au phosphate Ç cf.5. After the incubation, these gels are washed 5 times using 10 "here of phosphate tarpon Ç cf.

20 6. Les groupes alcéhyfiques libres ci gel activé20 6. The Free Alcoholic Groups Under Activated Gel

sont bloqués par une incubation de 4 heures au moyen d ’ êthanclamne féthanolamine C,1K, dHare blocked by a 4 hour incubation with ethanclamne fethanolamine C, 1K, dH

=7,6).= 7.6).

7. Ensuite, les gels sont lavés 3 fois au moyen 25 de 100 ml de tampon au phosphate (0,G2K, pH = 7,2,- apres quoi le tampon est éliminé et les * _ __ __ / - / r - ___" - __ -v* b " „ 2 _ . - . - - - paisseur, 71 est tes sic le de produire rlusie-rs 7 y cl w "C. ΙΓ $ B· ir C- n * S 3 0 '-i ΞΓ S · 9. à. partir ΰβ C£tt£ rêUllie OU ûSC£~pû Ce petits disques ce 5 mm de diamètre. Ces disques sont examinés par détermination immunologique.7. Next, the gels are washed 3 times with 100 ml of phosphate buffer (0, G2K, pH = 7.2, - after which the buffer is removed and the * _ __ __ / - / r - ___ "- __ -v * b" „2 _. -. - - - thickness, 71 is your sic le to produce rlusie-rs 7 y cl w" C. ΙΓ $ B · ir C- n * S 3 0 '- i ΞΓ S · 9. from ΰβ C £ tt £ réUllie OR ûSC £ ~ pû These small discs this 5 mm in diameter These discs are examined by immunological determination.

05 10. La détermination immunologique est effectuée comme suit : un petit disque est incubé avec 0,5 ml c'une dilution au 1/200 de sérum de patients (dilution dans une solution de sel physiologique tamcornee au onosc-rate, r· 7 » 2, oui contrent 1%05 10. The immunological determination is carried out as follows: a small disc is incubated with 0.5 ml of a 1/200 dilution of patient serum (dilution in a solution of physiological tamcornee salt with onosc-rate, r · 7 »2, yes counter 1%

~/CN~ / CN

10 c! albumine bovine et 0,2% de 70ΤΞΙ" V£r 20}. L'incu bation s'effectue à la température ambiante perçant meure. tn meme temps que -i.es ecnantliiOns inconnus, on met en oeuvre un échantillon de contrôle positif et un négatif (pour l'antigène de 15 surface ce l'hépatite B et le cytomégalovirus).10 c! bovine albumin and 0.2% of 70ΤΞΙ "V £ 20}. The incubation is carried out at ambient temperature piercing dies. At the same time as -i.es ecnantliiOns unknown, a positive control sample is used and negative (for surface antigen ce hepatitis B and cytomegalovirus).

11. Après 1'incubation, les casques sont Lavés 5 fois avec 3 mb de tampon de lavage (solution ce11. After incubation, the helmets are washed 5 times with 3 mb of washing buffer (solution ce

NaCl 0,15 molaire tamponnée au^qfhosphate, pH = - - * *7 . Ο'”· ^ γ^^τιτ ~ ber “ Γ ~ > qcl ^T")' ’··^'* V 2 20 12. 200 microlitres d'une solution d'anticorps antanurriarns learcues a la terex^ta se sont ancures avec les petits disques pendant 1 heure.0.15 molar NaCl buffered with ^ qphosphate, pH = - - * * 7. Ο '”· ^ γ ^^ τιτ ~ ber“ Γ ~> qcl ^ T ")' '·· ^' * V 2 20 12. 200 microliters of a solution of antianurriarns antibodies learned in terex ^ ta are anchors with small disks for 1 hour.

13. Les disques sont ce nouveau lavés 5 fois avec 3 ml ce tampon de lavage ( solution ce NaCl 0,15 25 molaire tamponnée au phosphate, pH = 7,2, qui vv-. — . j- p ST c. A. — m- O "" vWUw.a.wiàw ü ; J1, uC j. ► ta- v· r t»'p. jn “ ' rp >·-< ·: r cl· G“1 ~ **T * Λ Γ T-' " 16. La quantité de produit ferré enn'-.tatiruerrer.t 813. The discs are again washed 5 times with 3 ml of this washing buffer (0.15 molar NaCl solution, phosphate buffered, pH = 7.2, which vv-. -. J- p ST c. A. - m- O "" vWUw.a.wiàw ü; J1, uC j. ► ta- v · rt »'p. Jn“' rp> · - <·: r cl · G “1 ~ ** T * Λ Γ T- '"16. The quantity of enemy rail product -. Tatiruerrer.t 8

VV

% ·» 5 déviation? standard au-dessus ou contrôle n-éga- . - * / --n · - ' _ _ .· j - Î.li | ± ^CiècuxUl JL. ΟΠ SSl COnSICc-S ~ c - — — «% · »5 deviation? standard above or n-ega- control. - * / --n · - '_ _. · j - Î.li | ± ^ CiècuxUl JL. ΟΠ SSl COnSICc-S ~ c - - - «

La limite de 95%, déterminée sur une grande série de sérums négatifs, se trouve dans cette méthode 05 aux alentours d'une densité optique de 0,200, mais celle-ci doit être ce nouveau déterminée expérimentalement pour chaque application.The 95% limit, determined on a large series of negative sera, is found in this method 05 around an optical density of 0.200, but this must be this new experimentally determined for each application.

Ex envoie 2 10 Dosage de protéine C réactive (C.F. .F.) dans du sérum de patient? au moyen c'un irrunos?sa y enzymatique appliqué suivant une technique en sandwich. Dans cette application, la fraction de gammaglobuline d'un sérum anti-C.R.F. hyperimmur.isé est associée par covalence è 15 un polymère de polyacrylamice enfermé dans une feuille de PîFE poreuse. De petits ciscues contenant cet anticorps sont incubés avec du sérum ce patients et une série d'étalons. On fart ensuite réagir 1'antigène associé avec un anticorps .marqué par une enzyme. Après êlimirs-20 tion par lavage de la fraction conjuguée non associée, on ajoute un substrat. La réaction enzymatique cinétique mesurée constitue une mesure de l’antigène présent. On peut effectuer une détermination quantitative par comparaison avec les valeurs obtenues pour les étalons.Ex sends 2 10 Assay of reactive protein C (C.F. .F.) In patient serum? by means of an enzymatic irrunos its applied in a sandwich technique. In this application, the gamma globulin fraction of an anti-C.R.F. hyperimmured is covalently associated with a polyacrylamice polymer enclosed in a sheet of porous PFE. Small ciscuses containing this antibody are incubated with this patient's serum and a series of standards. The associated antigen is then reacted with an antibody labeled with an enzyme. After washing off the unassociated conjugate, a substrate is added. The kinetic enzymatic reaction measured constitutes a measure of the antigen present. A quantitative determination can be made by comparison with the values obtained for the standards.

25 Dans un processus servant d'exemple on réalise iSS Dp ë X~ S U. X ΟΠ S S O 0 Va. Π Ο Θ S * » (crooseur des orer-ules = 4C rrucuDr. éorss , Lûr.uoe25 In an example process we realize iSS Dp ë X ~ S U. X ΟΠ S S O 0 Va. Π Ο Θ S * "(orer-ules crooseur = 4C rrucuDr. Éorss, Lûr.uoe

2 ^ £ ' 0 X ^ USiO-^· 4 O 0 Λ- " r. ” — ^ O“*** " “"-mm. *- ~ΓΥ* C ÄVJ2 ^ £ '0 X ^ USiO- ^ · 4 O 0 Λ- "r.” - ^ O “***" “" -mm. * - ~ ΓΥ * C ÄVJ

d'une solution de Γ& Cl C 1Ξ ^rl-oire uEouunnèe su o / \of a solution of Γ & Cl C 1Ξ ^ rl-oire uEouunnèe su o / \

KK

%: f.%: f.

. J___ i _ _ V - - „ 3· Le Ci.u tar a .l c eny c e est. ensuite e^mme par levage en 5 opérations âe lavage au moyen de 100 ml de tampon au phosphate 0,IM, pH = 7,2.. J___ i _ _ V - - „3 · Le Ci.u tar a .l c eny c e est. then even by lifting in 5 washing operations using 100 ml of phosphate buffer 0.1 IM, pH = 7.2.

05 4. La feuille activée est transférée dans 50 ml d’une solution d’anticorps anti-C.E.?., en une concentration adaptée, dans eu tarpon au phosphate (pH = 7,2). Cette concentration varie entre 1 me er 0,001 mg/mi suivant la qualité de 1 * antisê-10 rum.05 4. The activated leaf is transferred to 50 ml of an anti-C.E.?. Antibody solution, in an appropriate concentration, in eu phosphate tarpon (pH = 7.2). This concentration varies between 1 st 0.001 mg / mi depending on the quality of 1 * antisê-10 rum.

5. Acres une incubation ce 1 heure a 4 decrês Celsius la protéine non associée est éliminée par lavage en 5 opérations ce lavage au moyen de 100 ml ce tampon.5. After an incubation for 1 hour at 4 Celsius, the unassociated protein is removed by washing in 5 operations, this washing using 100 ml of this buffer.

15 6. Les groupes aldêhvdiques libres du gel activé15 6. Aldehvdic Groups Free from Activated Gel

sont bloqués par une incubation de 4 heures au moyen c’éthanolamine {êthanolamine 0,IM, pEare blocked by a 4 hour incubation using ethanolamine {ethanolamine 0, IM, pE

— f i C / · 7. On sèche la feuille et on y estampe ces petits 20 ersoues ce r mur. es ciaretre* S. Pour la détermination quantitative, or trans- V , r . , . „ ...- f i C / · 7. We dry the sheet and stamp these little 20 ersoues this r wall. es ciaretre * S. For quantitative determination, or trans- V, r. ,. „...

^.SS C Θ G X C S C2.SC BS C X Π S CSS "C U D Θ S^ .SS C Θ G X C S C2.SC BS C X Π S CSS "C U D Θ S

^ O ci Γ θϋΚ ΰ’Τ.Γ^.β G Θ S DUDêS c)Vc!it UCS Ce Γ-2 Clt-0 Τ-Οΰδ-β C «i r ΓΠ-. / t 25 of Les sccucs è. tesccr àiicss ^nr* ^c-xs cens un tcercDCT. ce ci I ucior. * soi ucicn ce Ne CI 0 · 15 inc— f— 4 r-, - _ ___ _ ^ m / -U r J? * ^ V« + ,riiiJ A c· 4- ”, ~ ~ - rr U. . ' v r. - r v- c — “P'rit1 „ ^ U „ „ ' _ ___ ___ - __ . . V . _v _______ _ ^ y ___ f __ _ ___ _ .^ O ci Γ θϋΚ ΰ’Τ.Γ ^ .β G Θ S DUDêS c) Vc! It UCS Ce Γ-2 Clt-0 Τ-Οΰδ-β C "i r ΓΠ-. / t 25 of Les sccucs è. tesccr àiicss ^ nr * ^ c-xs cens un tcercDCT. this ci I ucior. * soi ucicn ce CI 0 · 15 inc— f— 4 r-, - _ ___ _ ^ m / -U r J? * ^ V "+, riiiJ A c · 4-", ~ ~ - rr U.. 'v r. - r v- c - “P'rit1„ ^ U „„ '_ ___ ___ - __. . V. _v _______ _ ^ y ___ f __ _ ___ _.

ml d'un tarpon de lavage ( solution de ire 21 C, 1:ml of a washing tarpon (ire 21 C solution, 1:

VV

Λ 10 ·.Λ 10 ·.

— ·~^ ' ^ -- '—j—r r~ ' - 2_ ^."p, ^ Q —,'- -, — — _ 7-Γ — "7 2 Ο Ρ 7 η ,ι, -----,. (t) χ _ »,ηηΝ ^ z.j ; .- · ~ ^ '^ -' —j — rr ~ '- 2_ ^. "P, ^ Q -,' - -, - - _ 7-Γ -" 7 2 Ο Ρ 7 η, ι, --- - ,. (t) χ _ ”, ηηΝ ^ z.j; .

11. On ajoure ensuite aux disques, en 1 heure, ur. anticorps anti-C.R.P., conjugué avec ce la per- 05 oxydase, porté à une dilution appropriée dans une scluuion de Na Cl 0,15 molaire tamponnée au phosphate, pH = 7,2, contenant 1% d * albumine de boeuf et 2, 5 % de TwE-EN .11. We then open the discs, in 1 hour, ur. anti-CRP antibody, conjugated with this peroxidase, brought to an appropriate dilution in a 0.15 molar phosphate buffered NaCl scluuion, pH = 7.2, containing 1% of bovine albumin and 2, 5% TwE-EN.

12. Apres 5 opérations de lavage au moyen de 3 ir.i 10 de tampon de lavage (solution de NaCl 0,15 molaire rançonnée au chosbhste, cH = 7,2, 0,5% de ^ _1_-._____ h--1 j, on agou^e ttw ncrc-titres te suDstra>- (10 mg d * orthcphénylènedianir.e, 10 ml de tampon au citrate et au phosphate, pH = 6,0,- C,1N et 10 15 microlitres de peroxyde d’hydrooène â 30%) et on incube pendant 30 minutes a 22 degrés Celsius en l'absence de lumière, 13. On arrête la réaction gu substrat au moyen de 1 ml d1 HCl IN.12. After 5 washing operations using 3 ir.i 10 of washing buffer (0.15 molar NaCl solution ransomed with chosbhste, cH = 7.2, 0.5% of ^ _1 _-._____ h-- 1 day, we touw e ttw ncrc-titles te suDstra> - (10 mg of orthcphenylenedianir.e, 10 ml of citrate and phosphate buffer, pH = 6.0, - C, 1N and 10 15 microliters of peroxide of 30% hydroene) and incubated for 30 minutes at 22 degrees Celsius in the absence of light, 13. The reaction was stopped on the substrate using 1 ml of IN HCl.

20 14. On mesure la densité ottirue des lieu! des susmentionnés à 492 nn. A\ec la densité optique cas étalons, or. établit une courbe d'étalonnage sur laquelle on peut lire la concentration en C.R.F. des éehanriilons de sérum.20 14. We measure the density of places! of the above at 492 nn. With the optical density standard cases, gold. establishes a calibration curve on which the concentration of C.R.F. serum samples.

- w ----- w ----

Claims (9)

1. Imrnunosorbant utilisable dans les déterminations immuno logique s , caracmêrisê en ce qu'il est è base d'une matrice poreuse gu se trouve amené d'une maniéré C5 non covalente un polymère organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe, insoluble dans l'eau, auquel sont associés car ccvê.ler.ce des a:.rimènes et/ou des anticorps en des quantités hier, dscemr.ées et, s'il s'agit de divers antigènes en-ou anriiorrs, en des propor-1Q tions bien déterminées enmre_·1. Immunosorbent usable in immunological logical determinations, characterized in that it is based on a porous matrix which is brought in a non-covalent manner C5 an organic or inorganic polymer, hydrophilic or hydrophobic, insoluble in the water, which are associated because ccvê.ler.ce of: .rimenes and / or antibodies in yesterday, dscemr.ées quantities and, if it is various antigens en-or anriiorrs, in propor-1Q well determined enmre_ · 2. Immunosorbann selon la revendication 1 caractérisé en ce que la porosité de matrice est comprise entre 20 et 80% en volume.2. Immunosorbann according to claim 1 characterized in that the matrix porosity is between 20 and 80% by volume. 3. Immunosorbent selon la revendication 1 ou 2 15 caractérisé en ce que les antigènes ou les anticorps sont couplés par covalence à un polymère insoluble dans 1 ' eau qui avait déjà été préalablement incorporé â la îTi&rrice G6 r>cis6 ·3. Immunosorbent according to claim 1 or 2, characterized in that the antigens or the antibodies are covalently coupled to a water-insoluble polymer which had already been previously incorporated into the agent G6 r> cis6 · 4. Immunosorbent selon la revendication 1 ou 24. Immunosorbent according to claim 1 or 2 20 C δ. I* crC TL θ ΙΓ i S θ δΠ 06- 006 1.6S δΓ.οόο^ΠΘΕ Str/OU 06S αΠ’ΟΧΟΟΓ'ΤΟβ sont couplés à un polymère insoluble dans l'eau qui est par la suite incorporé dans la matrice de base. 5 c ΧπΐιΓι'ΰΠΟΒΟΓΟδΓίτ. selon ic. osvenciccitLion 4 οδζτδο— ΟΘ-Γ036 6Γ 0er Ό06 °c * ngn 1 r CH.nc ' *6^0 25 auxquels divers antigènes et/ou anticorps ont été sêpa- r - i- î· e , C-^UI^L.9c - mr··»θ’*- Xj**^^r>*" o*“1 c %** n vendications 2 a c oaracrérrse er: ce eue les orsératrons 4T € 12 vencications I à 7 caractérisé en ce que la matière en-dIovss corne poivrière insoluble cens l'eau esc. la cellulose, le Oolvacrylantiâe, le silicagel, un latex, le sé-pnarose, ou 11 agarcse'cv .20 C δ. I * crC TL θ ΙΓ i S θ δΠ 06- 006 1.6S δΓ.οόο ^ ΠΘΕ Str / OU 06S αΠ'ΟΧΟΟΓ'ΤΟβ are coupled to a water-insoluble polymer which is subsequently incorporated into the base matrix . 5 c ΧπΐιΓι'ΰΠΟΒΟΓΟδΓίτ. according to ic. osvenciccitLion 4 οδζτδο— ΟΘ-Γ036 6Γ 0er Ό06 ° c * ngn 1 r CH.nc '* 6 ^ 0 25 to which various antigens and / or antibodies have been separated - i- î · e, C- ^ UI ^ L .9c - mr ·· »θ '* - Xj ** ^^ r> *" o * “1 c% ** n vendications 2 ac oaracrérrse er: this had the orseratrons 4T € 12 vencications I to 7 characterized in that the material in -Idss insoluble pepper horn like water esc cellulose, Oolvacrylantiâe, silica gel, a latex, sepnarose, or 11 agarcse'cv. 5. Immuncsorbar.t selon l'une quelconque ces re vendications là“'caractérisé en ce que la matrice poreuse est en oclv-st.raf lucrétnvlène .5. Immuncsorbar.t according to any one of these re vendications there “'characterized in that the porous matrix is in oclv-st.raf lucrétnvlène. 10. Procédé pour la préparation d’un immunosor- 10 ractêrisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : — on mélange ensemble le polymère poreux insoluble, activé, non activé ou couple par 1’antigène ou anticorps avec la matrice poreuse de base à l'état pulvérulent pour formier un mélange sec, 15. on soumet ce mélange sec à un traitement d’aggloméra tion pour former des agglomérats, - or. soumet les agglomérats formés à un traitement de broyage pour former des agglomérats broyés, — ou presse ensemble les agglomérats broyés pour former 20 un comprimé et - on soumet le comprimé â ces laminages jusqu'à obtention d’un film ou d5 une feuille.10. Process for the preparation of an immunosoracterized in that it comprises the following stages: - mixing together the porous insoluble polymer, activated, not activated or coupled by the antigen or antibody with the basic porous matrix in the pulverulent state to form a dry mixture, 15. this dry mixture is subjected to an agglomeration treatment to form agglomerates, - or. subject the agglomerates formed to a grinding treatment to form crushed agglomerates, - or press the crushed agglomerates together to form a tablet and - the tablet is subjected to these laminations until a film or a sheet is obtained. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que ce film, selon l'invention est procuit de na- 25 nière pratiquement continue pour être ensuite découpée pc.IT tè3’JS ΓΓ;θνθΠ.£ cLppÜTGpZ".-.* ^ r P*" i/·' i O? *“ 0 “ 'i**' ' ."i»“ * c E, _ »·· ~ w l «. ti - ^ r ^ w „ π /" n?· ^ 1 ^ ^ jz, — -t * __ ^ cperatacr. : e mélangé spécifié cens la premiers étape 13 * ci-fessus, une compcsi t ior. constituée de tclym.eres rc— reus insolubles, de nature identique ou différentes, comportant des quantités connues de composés biologiques et cens un rapport connu ae ces polymeres ainsi cnarges.11. Method according to claim 10 characterized in that this film according to the invention is produced in a substantially continuous manner in order to then be cut pc.IT tè3'JS ΓΓ; θνθΠ. £ cLppÜTGpZ ".-. * ^ R P * "i / · 'i O? * “0“ 'i **' '. "I” “* c E, _” ·· ~ wl “. Ti - ^ r ^ w„ π / "n? · ^ 1 ^ ^ jz, - -t * __ ^ cperatacr. : e mixed specified as the first step 13 * above, a compcsi t ior. consisting of insoluble recirculcers, identical or different in nature, containing known amounts of biological compounds and believed to have a known relationship to these polymers so widely known. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce eue lesdit.es polymères poreux insolubles sont de nature chimiques différents, notamment hvdroohobes et nydrothvles afin -de discoser de technirues d’activation différence .1 B14. The method of claim 13 characterized in that eudit.es insoluble porous polymers are of different chemical nature, in particular hvdroohobes and hydrothvles in order to -discuss difference activation techniques .1 B
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