LU83015A1 - Procede de detection de cellules cancereuses par des anticorps et procede de preparation de ceux-ci - Google Patents
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Description
2 1 r
La présente invention est relative à des antigènes nucléolaires trouvés dans une large gamme de cancers de l'être humain et non trouvés dans des tissus non cancéreux correspondants et à des anticorps et des antisérums spécifiques à ce ou ces antigènes nucléolaires pour des buts de diagnostic.
Les découvertes antérieures sur des animaux expérimentaux ont indiqué, la présence dans des tumeurs d'antigènes nucléaires et nucléolaires qui n'ont pas été trouvés dans des * * tissus non cancéreux (R. K. Busch et cons*, Cancer Res. 34, 2362, 1974 ; Yeoman et cons., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 3258, 1976 ; Busch et Busch, Tumori (33, 347, 1977 ; Davis et cons., Cancer Res. 3J3, 1906, 1978 ; Marashi et cons., Cancer Res. 3j3, 59, 1979) . Dans ces études antérieures, des anticorps ont été préparés pour des nucléoles de cellules normales et néoplasiques de rats par immunisation de lapins (R. K. Busch et cons·/ supra ; Busch et Busch, supra ; Davis et cons., supra). Une large fluorescence nucléolaire a été démontrée dans les cellules fixées à l'acétone par la méthode d'immuno-fluorescence indirecte. On a également découvert que les bandes d'immunopré-v · cipitine dans des gels de Ouchterlony formés par des antisérums à des antigènes nucléolaires d'hépatome ce Novikoff extraits de nucléoles d'hépatome de Novikoff de rat diffèrent des bandes d'immunoprécipitine correspondantes produites par des antigènes nucléolaires de foie et des antisérums nucléolaires anti-foie (Busch et Busch, supra).
En outre, une spécificité est apparue lorsque de l'antisérum nucléolaire antitumeur absorbé par des extraits nuclé^i^ / /
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3 res de foie a produit une fluorescence nucléolaire positive dans des cellules d'ascite d'hépatome de Novikoff mais pas dans des cellules de foie. Réciproquement, de l'antisérum nucléolaire anti-foie absorbé par des extraits nucléolaires de tumeur "n'a pas produit de fluorescence nucléolaire de tumeur détectable mais a produit une fluorescence positive dans des nucléoles de foie (Davis et cons., supra).
Dans la mesure où une analyse à l'immunofluorescence indique que des différences sont observables dans des frottis de tumeur et des frottis de cellules de rat normales, fixés par de l'acétone, (en particulier après absorption des antisérums par des noyaux et nucléoles de foie normal), des essais ont été effectués pour utiliser ces antisérums aux antigènes nucléolai-res de tumeur de rat dans l'examen d'échantillons de tissus correspondants provenant de tumeurshumaine s. Des études avec des anticorps aux nucléoles de tumeur de rongeur ont montré qu'une immunofluorescence positive n'a pas été trouvée dans des nucléoles de tumeur d'être humain. Au vu de cela, on a commencé suivant l'inven'tion une nouvelle série d'expérimentations pour trouver les antigènes nucléolaires de l'être humain. Une immu- v . nofluorescence positive a alors été trouvée dans les tissus de tumeur d'être humain avec des antisérums et des anticorps à ces nouvelles préparations nucléolaires de tumeur d'être humain.
Dans ces études, les anticorps sont absorbés par des produits nucléaires placentaires acoustiquement traités ainsique par da sérum de fbe tus de veau (Busch et cens., 39,3 02 4, 197 9 ; Davis et cons., Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 16_, 892, 1979 ; Smetana et cons., Life/-,/
Sei. 25, 227, 1979). ! f/ il i r 4
La présente invention résulte d'études conçues pour utiliser ces nouveaux antigènes nucléolaires humains à la détection d'une large gamme de néoplasmes de l'être humain.
Le Tableau I ci-dessous présente un sommaire des tumeurs de l'être humain dans lesquelles une large immunofluorescence nucléolaire a été trouvée avec les anticorps aux nucléoles de tumeur de l'être humain. Ces études ont permis la découverte surprenante et inattendue qu'un grand nombre de tumeurs humaines contiennent des antigènes nucléolaires communs qui montrent une immunofluorescence positive avec des antisérums ou des fractions d ' immunoglobuline de tels antisérums (Busch et cons., supra).
TABLEAU I
LARGE IMMUNOFLUORESCENCE NUCLEOLAIRE DANS DES TUMEURS HUMAINES. (Provenance : Busch et cons., 1979) I. Carcinomes 1. Vessie, cellule de transition 2. Cerveau astrocytome glioblastome 3. Côlon, adénocarcinome (4) „ métastase : foie carcinome transplantable (GW-39) 4. Glande exocrine, carcinome 5. Oesophage, carcinome à cellules squameuses 6. Foie, carcinome primaire 7. Poumon : adénocarcinome (2) cellules en grains d'avoine (2) cellules squameuses (5) / 8. Mélanome, matastases cérébrales malignes /-/ / / 9. Prostate : adénocarcinome (4) f 7
J
« * * I __ 5 110. Peau : carcinome baso-cellulaire (2) carcinome à cellules squameuses (7) métastase : ganglion lymphatique « 11. Estomac : adénocarcinome métastase : foie métastase : ganglion lymphatique 12. Thyroïde ; carcinome (2) II. Sarcome s 1. Myoblastome malin de la lèvre métastase au ganglion lymphatique cervical . 2. Sarcome ostéogénique (3), biopsie, culture de tissu 3. Sarcome synovial 4. Lymphome (4), pas de Hodgkin III. Néoplasmes hématologiques 1. Maladie de Hodgkin (voir Sternberg, 5) 2. Leucémie : CLL (5), cellules velues (rate) 3. Lymphocytome, rate 4. Myélome multiple (5) 5. Dermatomycose 6. Leucémie myéloïde aiguë' (5) 7. Leucémie myéloïde chronique (5) 8. Leucémie monocytaire aiguë' (2) IV. Cultures 1. Carcinome du sein 2. Adénocarcinome du côlon 3. HeLa 4. HEp-2 5. Carcinome de la prostate (3) 6. Carcinome à cellules squameuses (3)
Les chiffres entre parenthèses dans le Tableau ci-dessuè // • t 6 représentent le nombre de cas.
Dans les tissus non cancéreux, des tumeurs bénignes et des états inflammatoires, des résultats négatifs sont généralement obtenus ainsi qu'il est indiqué dans le Tableau II ci-dessous (Busch et cons., supra).
TABLEAU II
IMMUNOFLUORESCENCE NEGATIVE DANS DES TISSUS HUMAINS (Provenance : Busch et cons., 1979) ' I. Tissu normal 1. Vessie 2. Moè'lle osseuse (lignes hémotlastiques , 5) 3. Poitrine 4. Sang de caillot blanc (3) 5. Vésicule biliaire 6. Intestin grêle, cryptes de Lieberkuhn 7. Gros intestin 8. Rein 9. Foie (2) 10. Poumon (adjacent à une tumeur) 11. Glande lymphatique 12. Lymphocytes normaux (2) 13. Pancréas : 14. Epiphyse 15. Hypophyse * 16. Placenta 17. Prostate 18. Peau 19. Estomac 20. Thyroïde II. Tissu à croissance bénigne 1. Adénome du sein 2. Adénomes parathyroïdiens (2) 3. Hyperplasie de la prostate (Ξ) /
/V
4. Adénomes de la thyroïde (3) /./ goitres nodulaires (2) Jf i ' 7 III. Maladies inflammatoires 1. Colite ulcéreuse chronique i 2. Glomérulonéphrite ! 3. Granulome et fibrose du poumon 4. Foie : cirrhose, hépatite 5. Lupus aigu (glande mammaire et peau) 6. Pemphigus bulleux 7. Ulcère gastrique 8. Hyperplasie inflammatoire des glandes lymphatiques (4) , 9. Mononucléose infectieuse. (5) » 1 IV. Cultures 1. Fibroblastes du sein 2. Lymphocytes, stimulés à la ΡΗΆ.
Les chiffres entre parenthèses représentent le nombre de cas.
Ces résultats, initialement obtenus par immunofluorescence, ont été vérifiés et étendus aux méthodes à 11immunoperoxydase .
La présente invention est basée sur la découverte surprenante et inattendue que des antigènes nucléolaires communs sont trouvés, dans une large gamme de cellules cancéreuses humaines mais ne sont pas trouvés dans des cellules humaines normales. Les antigènes sont des protéines qui peuvent avoir un contrôle des gènes ou d'autres fonctions et qui sont persistantes à travers la mitose en un lieu périchromosomique.Des aspects importants de l'invention sont la découverte des antigènes nucléolaires communs trouvés dans des cellules cancéreuses humaines, l'isolement et la purification des antigènes nucléolaires,la production d'antisérums et d'anticorps spécifiques à ces antigènes, les procédés de diagnostic utilisant des antisérums et des antiV^ ' - / 1 * 8 corps spécifiques à ces antigènes pour détecter les cellules cancéreuses humaines, et une trousse de diagnostic contenant soit des anticorps soit des antisérums spécifiques à ces antigènes nucléolaires soit encore les deux.
Les antigènes ont été trouvés dans une large gamme de cancers humains y compris des cancers du système nerveux central, du tractus gastro-intestinal, du tractus génito-urinaire' du poumon, de la peau, des tissus formant le sang et des glandes endocrines et exocrines." Par exemple, les celluleSchumaines malignes comprennent les cellules HeLay . le carcinome "de la prostate, d feutres carcinomes, des sarcomes et des néoplasmes hématologiques. Les antigènes peuvent être extraits à partir de noyaux ou de nucléoles de cellules malignes humaines. Les antigènes n'ont pas été trouvés dans des tissus non cancéreux correspondants. Dans l'utilisation des procédés de diagnostic suivant la présente invention pour détecter des cellules malignes, approximativement 1% de faux négatifs et 3% de faux positifs ont été détectés. Les faux négatifs représentent des tissus cancéreux nécrotiques ou des tumeurs non réactives pour des raisons inconnues. Les faux positifs représentent deux cas de "tissus prénéoplasiques" et de faibles positifs dans des régions focales occasionnelles dans un "tissu hyperplasique". Deux régions positives focales sont identifiées comme "régions prénéoplasiques" ou comme transformation néoplasique focale dans des tissus inflammatoires gastro-intestinaux.
Les antigènes comprennent une espèce principale et au moins une et éventuellement plusieurs espèces d'antigène mineures.
. / L'espèce d'antigène principale en provenance de cellules cancé- -·· *— · -i-m'-jn.. *'· · — - -*·»*»-» ······· “ “J i.·. I«H% .ia-.tiu«. J» i» »—» ι 11 —1 i ' ' —- *~ 9 reuses humaines (a) présente un point isoélectrique pi distinct de l'ordre de 6,0 à 6,7 et approximativement de 6,3, lorsqu'il est déterminé par concentration isoélectrique, pH de 3 à 10, gel de polyacrylamide, (b) a un poids moléculaire approximatif de 50.000 à 60.000 daltons ainsi qu'il est déterminé par électrophorèse sur gel à deux dimensions avec une seconde dimension SDS (dodécylsulfate de sodium), (c) est en partie étroitement liée à de la ribonucléoprotéine (RNP) nucléaire et nucléolaire et en partie soluble dans du Tris-HCl 0,01 M, à pH de 8, et (d) est à la fois nucléolaire et extranucléolaire, mais reste "intranu-cléaire" ou associée à un chromosome pendant la division cellulaire .
La deuxième espèce d'antigène qui a été détectée présente un pi d'approximativement 6,0 (détecté par les mêmes procédés que pour l'espèce principale d'antigène) et son poids moléculaire est également de 50.000 à 60.000 daltons. Il est possible qu'elle représente un produit modifié de l'antigène principal, mais il n'a pas été déterminé si elle est structurellement apparentée. . L'espèce d'antigène mineure est en concentration relativement plus petite que l'espèce principale d'antigène.
Les antigènes sont également présents dans des particules de ribonucléoprotéine nucléolaires obtenues par ultracentrifugation d'extraits Tris, décrits dans la suite. L'antigène présent dans ces particules est plus étroitement lié aux protéines et à de l'acide ribonucléique (ARN) que l'antigène dans la fraction soluble Tris. Il n'est pas encore clair si les antigènes dans la particule de ribonucléoprotéine sont identiques à ceux dans la fraction surnageante, mais leurs points isoélectri-/ // 10 ques sont les mêmes et ils absorbent les anticorps aux antigènes. Les antigènes nucléolaires présents dans des fibrilles, probablement du réseau de ribonucléoprotéine nucléaire, sont également vus dans des cellules de cancer par microscopie optique. Ce sont des structures extranucléolaires qui peuvent représenter des éléments dont les particules de ribonucléoprotéine sont dérivées.
Il reste à déterminer si les antigènes représentent une substance qui est présente en concentrations élevées dans dans les cellules cancéreuses et en très faibles concentrations dans les cellules non cancéreuses ou s'ils sont des antigènes foetaux ainsi qu'on l'a trouvé auparavant dans les études comparatives sur des antigènes de l'hépatome de Novikoff du rat et des cellules de foie normales de rat (Yeoman et cons., 1976).
Toutes les phases pour obtenir et analyser des échantillons de tissu humain, du sang et du sérum de tumeurs humaines et d'autres tissus de patients suspectés de cancer sont approuvées par le Human Research Committee du Baylor College of Medi-cine, Houston, Texas et des hôpitaux affiliés. Les coupes de tumeurs humaines sont obtenues à partir de coupes congelées de spe cimens chirirgicaux, de biopsie ou de spécimens de cryostats pré servés, principalement en provenance du Department of Pathology du Houston Vétérans Administration Medical Center, et aussi de la Michigan Cancer Foundation de Detroit, Michigan, et du Departement de Medicine Interne, Charles University de Prague, Tchécoslovaquie. Ces coupes sont analysées pour la présence d'antigènes nucléolaires par des techniques d'immunofluorescence indi-/ recte et à 1'immunoperoxydase. // i · * 11
La purification des antigènes est obtenue par extraction de noyaux ou de nucléoles à l'aide de 10 mM de Tris HCl/0,1 mM de PMSF/pH 8 à six reprises dans un rapport de 20 vo-j lûmes pour 1 volume de noyaux ou de nucléoles. L'extrait est centrifugé tout d'abord à 27.000 x g pendant 10 minutes et ensuite à 100.000 x g pendant 16 heures. On utilise du sulfate d'ammonium à une saturation de 40% pour éliminer les éléments contaminants. La fraction de sulfate d'ammonium à 40 - 100% 1 est recueillie par centrifugation et dialysée contre
20 mM de Tris HCl/pH 7,6. Les antigènes sont Chromatographiés sur des colonnes de cellulose DE-52 (1 x 10 cm) . On élue les antigènes dans la fraction de 0,15M de NaCl/0,1 mM de PMSF/pH
7,6. Des gels de concentration isoélectrique sont utilisés pour identifier et purifier les antigènes. Ces gels contiennent 4% d'acrylamide/8M d'urée/2% d'ampholines (pH de 3,5-10). Les antigènes, à des pi de 6,3 et de 6,0 respectivement, sont enlevées à partir des gels. Sur des gels de dodécyl sulfate de sodium (SDS), on a trouvé une tache principale pour chacun de ces antigènes.
On prépare des noyaux ou nucléoles de cellules HeLa par récolte de cellules HeLa à partir de bouteilles de culture de Spinner (7 à 8 litres). Les cellules peuvent être et sont en une phase souche de 7-8 x 10 cellules/ml. On centrifuge les cellules à 800 x g pendant 8 minutes pour former des boulettes ou pellets cellulaires. Les boulettes cellulaires sont mises en suspension dans une solution saline tamponnée par du phosphat (PBS) (0,15 M de NaCl, 0,01 M de phosphate, pH de 7,2) par homo- / / généisation douce avec un pilon en Teflon lâche et on centrifugé 12 à 800 x g pendant 8 minutes. On lave les cellules une seconde fois avec du PBS et on pèse les boulettes cellulaires. Les boulettes cellulaires sont mises en suspension, avec homogénéisation douce, dans 20 volumes de tampon standard de réticulocyte (RSB), à un pH de 7,4, et on laisse gonfler pendant 30 minutes sur de la glace. On centrifuge alors les cellules à 1000 x g pendant 8 minutes et on remet en suspension, avec une homogénéisation douce, dans du tampon RSB plus 1/20 de volume du détergent , Nonidet P40 (10% dans du RSB). Le volume final de Nonidet est de 0,5%. On homogénéise les cellules avec un homogénéiseur Dounce à 20-60 battements jusqu'à ce que les cellules soient brisées et que les noyaux soient dégagés et libérés du cytoplasme. On centrifuge alors les cellules à 1000 x g pendant 8 minutes, on les remet en suspension, avec une homogénéisation douce, dans 0,88 M de saccharose, 0,5 mM d'acétate de Mg (20 x poids-volume) et on centrifuge à 1500 x g pendant 20 minutes.
La boulette résultante contient les noyaux HeLa qu'on utilise pour préparer les extraits d'antigène décrits ci-dessous. Les noyaux en provenance d'autres cellules malignes humaines peuvent être obtenus d'une manière semblable.
Pour l'isolation de nucléoles, la boulette nucléaire telle que préparée ci-dessus est ensuite mise en suspension, avec une douce homogénéisation, dans 0,34 M de saccharose, 0,5 mM d'acétate de Mg, en utilisant 2 ml de saccharose pour chaque gramme de cellules d'origine. Les noyaux sont traités par voie acoustique (avec un dispositif acoustique de Branson) avec des impulsions de 10 secondes (et un repos de 10 secondes). Le temps / total est compris entre environ 60 à 110 secondes. Les nucléoles // * · 13 libérés sont contrôlés par un examen microscopique. Pour visualiser les nucléoles, ils sont colorés avec de l'Azur C (la solution est constituée de 1% d'Azur C dans 0,25 M de saccharose). La préparation doit être exempte de noyaux à la fin de la période de traitement acoustique. La fraction soumise à un traitement acoustique est disposée en dessous de trois fois son volume de 0,88 M de saccharose (sans acétate de Mg) et on centrifuge à 1500 x g pendant 20 minutes. La boulette résultante contient les nucléoles HeLa qui peuvent être utilisés comme immunogène.
On obtient habituellement avec le procédé ci-dessus (Busch et Smetana, 1970) une purification satisfaisante et la microscopie optique a montré que la qualité de ces préparations est essentiellement satisfaisante. Cependant, une analyse au microscope électronique a indiqué la présence de chromatine et d'éléments de contamination nucléaires. Le problème clef dans la purification appropriée de ces préparations est la quantité limitée des cellules HeLa d'origine dans les cultures, ce qui limite le nombre de phases de repurification. Les nucléoles préparés à partir de 5 à 10 g de préparations de cellules de HeLa, plutôt que les quantités de 0,5 à 1 g utilisées dans les études précédentes, fournissent une matière suffisante pour une purification appropriée. Les conditions de croissance des cellules HeLa et l'isolement de noyaux placentaires sont essentiellement les mêmes que celles précédemment rapportées (Davis et cons., 1979).
On prépare un extrait Tris de HeLa par mise en suspeiv- sion des noyaux HeLa dans un tampon de NaCl-EDTA lo x poids/// . / « · 14 volume, 1 g de noyaux/10 ml de tampon (tampon : 0,075 M de NaCl, 0,025 M de Na EDTA/pH de 8, 1 mM de PMSF). Le fluorure de phé-nylméthylsulfonyle (PMSF) est réalisé à une concentration de 100 mM dans de l'alcool isopropyligue. Il est ajouté à chaque solution avant l'extraction. La suspension est homogénéisée avec un homogénêiseur Dounce à 20 battements et elle est centrifugée à 3000 x g pendant 5 minutes. On recueille le surnageant. On répète les extractions ci-dessus sur la boulette nucléaire à encore deux reprises. L'extrait au NaCl-EDTA n'est pas utilisé dans le présent traitement d'antigène ; par conséquent il est évacué. La boulette nucléaire est mise en suspension dans 10 x poids/volume de 0,01 M de Tris-HCl, pH de 8, 1 mM de PMSF et on homogénéise avec un homogénêiseur Dounce pendant 20 battements, bien que 0,01 M de Tris-HCl, pH de 7-9, soit satisfaisant. On recueille le surnageant et on le conserve sur de la glace. Pendant les extractions au Tris, les noyaux se brisent et la chromatine est libérée. La fragmentation nucléaire est contrôlée par un examen microscopique. On remet la boulette en suspension dans un tampon Tris et on laisse les noyaux "gonfler" pendant 15 minutes sur de la glace. On les homogénéise ensuite sur un homogénêiseur Dounce pendant 20 battements et on centrifuge à 12.000 x g pendant 10 minutes. On conserve le surnageant. On remet la boulette en suspension et elle offre une apparence pelucheuse blanchâtre. On 1'homogénéise à nouveau dans un homogénêiseur Dounce pendant 20 battements et on centrifuge à 27.000 x g pendant 30 minutes. On recueille / le surnageant et on le combine avec les surnageants précédents / // provenant des extraits au Tris. /// i Ù K » 15 β·
Les extraits au Tris sont ensuite concentrés à l'aide d'une membrane Amicon UM-10 ou PM-10 Diaflo. D'une manière générale, le volume au commencement est d'environ 50 ml et il est concentré à 4-5 ml. La concentration finale de protéine est d'environ 4 à 5 mg/ml. Le lapin peut être immunisé avec cet extrait au Tris.
En suivant le procédé ci-dessus, des extraits peuvent également être préparés à partir de nucléoles HeLa et à partir de noyaux ou de nucléoles d'autres cellules malignes humaines.
Pour l'immunogène Tris, on dilue 250 ul d'extrait au Tris (4 à 5 mg/ml) tel que préparé ci-dessus avec 250 ul de PBS. On combine cela avec l'adjuvant de Freund tel que décrit pour l'immunogène nucléolaire ci-dessous.
Les anticorps sont préparés par immunisation de lapins avec des préparations nucléolaires de cellules HeLa, comme suit : les nucléoles HeLa sont pesés (20 à 30 mg, poids humide) et on les met en suspension de manière uniforme dans 0,5 ml de solution saline tamponnée - par 0,01 M de phosphate, à pH de 7,2. On les mélange ensuite avec 0,6 ml d'adjuvant complet de Freund (GIBCO), de la manière suivante : les nucléoles en suspension sont placés dans une seringue de 5 ml et l'adjuvant de Freund dans une deuxième seringue. Dans chaque seringue, une aiguille de calibre 18, dont la pointe a été enlevée# est attachée. Les aiguilles sont alors reliées par une pièce de tube en polyéthylène, I.D. 0,047 (Clay-Adams). Les contenus des seringues sont mélangés jusqu'à ce que la préparation devienne épaissie et difficile à forcer à travers le tube. ^ ^ /
On rase le dos du lapin et on injecte par voie intrâ- 7/ 16 dermique, en six endroits, 0,1 ml/endroit. Les 0,4 à 0,5 ml restants sont injectés, à moitié par voie sous-cutanée (sous la peau lâche du haut du dos) et à moitié par voie intramusculaire (dans le muscle de la cuisse). Les injections sont effectuées une fois par semaine pendant 3 semaines avec des quantités semblables de nucléoles à chaque fois. La première saignée est effectuée 7 à 10 jours après la troisième semaine d'immunisation. Une coupe pour oreille de lapin (Bellco) et une pompe à vide sont utilisées pour recueillir le sang. On laisse le sang (approximativement 45 à 50 ml) coaguler pendant 3 à 4 heures à la température ambiante. La partie de sérum est éliminée du tube et centrifugée à 1000 x g pendant 30 minutes (ce qui sédimente n'importe quelle cellule de sang rouge libre). Le sérum limpide est recueilli et il est alors absorbé (ou conservé congelé jusqu'à ce qu' il soit prêt pour le procédé d'absorption). Le caillot de sang peut être réfrigéré pendant la nuit. Cela libère quelques ml supplémentaires de sérum. Le sérum de chaque saignée est examiné en ce qui concerne la présence d'anticorps nucléolaires. par le procédé d'immunofluorescence indirecte.
D'autres hôtes non humains (par exemple une chèvre, un mouton, un cheval, un poulet, etc.) peuvent être immunisés par des préparations de nucléoles de cellules malignes humaines en vue de mettre en lumière les antisérums ou anticorps aux. antigènes nucléolaires suivant la présente invention. Les antisérums peuvent aussi être préparés par immunisation d'animaux hôtes non humains à l'aide d'extraits (par exemple un extrait Tris) de noyaux ou nucléoles de cellules malignes humaines.
/ L'absorption d'antisérum antinucléolaire est effectuée / !/ « 17 » par une première absorption de l'antisérum de lapin par 20% de sérum humain normal et 20% de sérum de veau foetal (GIBCO). On ajoute 20% du sérum humain normal à l'antisérum de lapin (4 ml/ 20 ml) et on laisse incuber pendant 1 heure dans un bain d'eau agité à une température de 37°C. On enlève le flacon, on ajoute 20% de sérum de veau foetal (4,8 ml/24 ml) et on laisse incuber pendant 1 heure dans un bain d'eau agité d'une température de 37 °C. On enlève le flacon et on laisse incuber pendant 1 heure » supplémentaire à la température ambiante tout en mélangeant par . » un brassage modéré toutes les 15 minutes. On centrifuge alors à une vitesse de 15.000 x g pendant 30 minutes et on sépare et conserve le surnageant (sérum absorbé). On convertit le sérum absorbé en la forme immunoglobuline (Ig) en suivant le procédé donné pour la précipitation au (NH^^SO^ du sérum, décrite dans la suite.
La préparation Ig provenant de lbntisérum nucléolaire,quj a été absorbé par du sérum humain normal et du sérum de veau foetal, est à présent absorbée par un tissu humain normal (placenta ou foie). Un volume égal de produit nucléaire placentaire acoustiquement traité dans du PBS 7,2 (10 à 15 mg de protéine/ml) est ajouté à l'immunoglobuline nucléolaire absorbée (10 ml de Ig plus 10 ml de produit de traitement acoustique nucléaire) et on laisse incuber pendant 1 heure dans un bain aqueux agité d'une température de 37°C. On laisse ensuite incuber pendant 1 heure supplémentaire à la température ambiante tout en mélangeant par un brassage modéré du flacon toutes les 15 minutes et on centrifuge ensuite à 15.000 x g pendant 30 minutes. On recueille le surnageant et on reprécipite la Ig absorbée par du (NH^J^SO^ g6zil·- // 18 * » me décrit. Cette Ig peut être utilisée comme le produit anticorps final ou on peut encore le purifier par chromatographie à la diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose, comme suit î
La Ig, gui est contenue dans la solution saline tamponnée par du phosphate 0,01 M et présentant un pH de 7,2, est dialysée contre un tampon phosphate 0,0175 M présentant un pH de 6,3 (sans solution saline). Après dialyse, elle est centrifugée à 2500 x g pendant 20 minutes. On ajoute le surnageant à la colonne de DEAE (20 mg de protéine par gramme de cellulose, Whatman -. DE52) . Du IgG est élué à partir de la colonne par le tampon phosphate 0,0175 M. Après élution, la fraction de IgG est dialysée contre la solution saline tamponnée par du phosphate 0,01 M, présentant un pH de 7,2.
On suit le même procédé pour le sérum témoin qui est constitué de sérum pré immun qui est obtenu par saignée de lapin (ou d'un autre animal hôte non humain) avant que l'immunisation ne soit démarrée.
L'immunoglobuline Ig ce lapin est préparée de la manière suivante
On prépare une solution saturée de (NH^)2S0^ (760 g/1) et on ajoute un volume égal de (13^)2S0^ saturé froid, goutte à goutte, à l'antisérum, sous agitation. Un précipité blanc se forme et on laisse le précipité s'agréger pendant 1,5 heure à 2 heures sur un agitateur magnétique, à froid. On centrifuge l'antisérum précipité à 3000 x g pendant 20 minutes. On enlève le surnageant et on remet la boulette ou pellet en suspension dans du PBS, à un pH de 7,2 (approximativement la moitié du volume du sérum d'origine) . La bouleute solubilisée est placée dan^s L- » 19 » un bassin de dialyse et elle est dialysée contre 100 volumes de PBS, pendant la nuit, à froid (avec agitation magnétique).
Le bassin de dialyse est placé dans du PBS frais (100 x volume) le matin suivant et la dialyse est poursuivie pendant 6 heures.
On enlève soigneusement l’immunoglobuline du bassin de dialyse et on la centrifuge à 2500 x g pendant 20 minutes. On recueille le surnageant.
' Le procédé décrit précédemment (RK Busch et cons., 1974 ? Hilgers et cons., 1972) pour l’immunofluorescence est utilisé dans cette étude, de la manière suivante : 150 μΐ d’antisérum antinucléolaire dilué à 1/50 sont placés sur des cellules HeLa fixées par de l’acétone ou sur des spécimens de tissu fixés (de Hilgers et cons. 1972 7 RK Busch et cons., 1974). Il peut être nécessaire d’utiliser plus que 150 μΐ si le spécimen de tissu couvre une grande section de la lamelle. La dilution de 1’antisérum (As) dépend du titre d’anticorps (Ab). D’autres dilutions peuvent être utilisées jusqu'au point où les dilutions de As ou de Ab deviennent trop diluées pour fournir une réponse positive aux cellules positives connues (par exemple HeLa). On laisse incuber les lamelles dans une chambre humide pendant 45 à 50 minutes à 37°C (la chambre humide peut être constituée d'une grande boîte de Petri à laquelle a été ajouté un chiffon de papier humide). Après l'incubation, l'antisérum est éliminé par lavage de la lamelle par l'addition douce de PBS et les lamelles sont placées dans un support de lamelles et lavées dans du PBS pendant 1 heure. On change le PBS à trois reprises, à 15 minutes, 30 minutes et 45 minutes. Les lamelles sont enlevées / du PBS et plongées dans de l'eau distillée ou désionisée, à dix' // 4. % 20 reprises, par des mouvements rapides vers le haut et vers le bas. Les lamelles sont séchées à l'air froid dans un séchoir à soufflerie ou à cheveux (2 à 3 minutes) et on prend soin de ne pas les sécher excessivement. On place 150 μΐ d'antisérum antilapin de chèvre marqué par de la fluorescéine (Hyland ou Cappel) dilué à 1/10 sur les lamelles et on laisse incuber dans la chambre humide pendant 30 à 35 minutes à la température ambiante. Le deuxième anticorps est éliminé de la lamelle par un doux lavage au PBS. Les lamelles sont ensuite lavées dans du PBS pendant 1 heure avec trois changements,, à 15 minutes, 30 minutes et 45 minutes ; ou après le premier lavage à 15 minutes, on peut les placer dans du PBS frais et les abandonner dans le réfrigérateur pendant la nuit. Après le lavage final avec du PBS, on plonge les lamelles dans de l'eau désionisée ou distillée à dix reprises par des mouvements rapides vers le haut et vers le bas et on les sèche à l'air froid à l'aide d'un séchoir à soufflerie ou à cheveux (2 à 3 minutes). Une solution de glycérol et de PBS dans un rapport de 1/1 est ajoutée aux cellules ou au spécimen de tissu et recouverte d'une lamelle de recouvrement. Le spécimen peut être préservé pendant de nombreux mois si la lamelle de recouvrement est scellée par un agent de scellage, tel que du vernis à ongles clair, et s'il est conservé à froid. La lamelle est ensuite examinée au microscope à fluorescence. Une fluorescence nucléolaire n'est pas observée avec de l'immunoglobuline préimmune ou des fractions de IgG préimmunes. Les autres techniques immunologiques utilisées sont les mêmes que celles utilisées dans les études précédentes (Kendall, 1938 ; Lowry et cons., 1951 /
Dale et Latner, 1969 ; Laurell, 1972 ; Wallace et cons., 1974 /y/ « % 21
Marashi et cons.., 1979). Pour l'analyse de la localisation nu-cléolaire de l'immunofluorescence, les échantillons sont passés dans et hors d'une illumination à contraste de phase pendant l'observation de la fluorescence.
Au lieu de l'antilapin de chèvre marqué à la fluorescéine, on peut utiliser la méthode à 1'immmunoperoxydase. Par exemple 150 μΐ de dilution 1/10 ou 1/20 d'antilapin de chèvre marqué à la peroxydase sont ajoutés. L'activité localisée de la peroxydase peut être démontrée par un certain nombre de systèmes à colorants redox pour un examen au microscope optique ou électronique. D'autres enzymes peuvent servir de marques pour la méthode indirecte et de la peroxydase et d'autres enzymes peuvent être utilisés directement par marquage de l'anticorps primaire.
On prépare un milieu d'incubation de Karnofsky de la manière suivante :
On prélève et pèse suffisamment de diaminobenzidine (Sigma) pour que, mise en suspension dans 0,05 M de Tris-BCl, d'un pH de 7',6, la concentration soit de 0,5 mg/ml. On prépare une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,02% (dans le tampon de Tris-HCl 0,05 M). On mélange les 0,5 mg/ml de diaminobenzidine (DAB) et les 0,02% de H202 dans des proportions égales, dans un rapport de 1/1 (cette solution est fraîchement préparée chaque fois quJelle est utilisée et elle est conservée à froid pendant la préparation). On ajoute 200 à 300 μΐ du mélange de DAB et de H202 à la lamelle et on laisse incuber pendant 30 minutes dans une chambre humide à la température ambiante.
Après cette incubation, on enlève le mélange de DAB
/ // <· * 22 * » de H20 par lavage de la lamelle avec le tampon Tris-HCl 0,05 M d'un pH de 7,6 auquel on a ajouté 0,1 M de NaCl. Les lamelles sont soumises à deux lavages de 10 minutes dans 0,05 M de Tris-HCl d'un pH de 7,6, 0,1 m de NaCl. On termine le traitement des lamelles comme indiqué dans les phases 11 à 14 (à l'exception que le PBS a été changé en Tris HCl). La lamelle complétée est examinée au microscope optique.
; On prépare des lamelles de cellules HeLa pour l'immuno fluorescence, de la manière suivante : un échantillon de réserve de cellules HeLa fixées est préparé par séparation et lavage au PBS, à'un pH de 7,2, de cellules à croissance active à partir de la bouteille de culture de HeLa. Les cellules sont mises en 6 suspension de façon qu'il y ait au moins 1,5 x 10 cellules/ml. Une goutte de la suspension de cellules HeLa est placée sur chaque lamelle lavée (nettoyée au détergent, rincée à l'eau distillée ou désionisée, nettoyée à l'alcool, rincée et séchée à l'air chaud par un séchoir à cheveux), on l’étale légèrement et on la laisse sécher à la température ambiante (ou au froid pendant la nuit). Les cellules séchées sont fixées par placement des lamelles à 4°C dans de l'acétone, pendant 12 minutes. On numérote les lamelles à l'aide d'une plume de marquage sur verre à pointe de diamant. Les lamelles sont utilisées comme témoins positifs pour 1'immunofluore scence.
Les présentes études confirment que des antigènes nu-cléolaires sont présents dans des cellules cancéreuses mais qu'ils ne se trouvent pas dans des tissus non cancéreux. Les études initiales ont démontré que, à la fois dans des cultures . . /7 cellulaires de tumeurs humaines et dans des specimens en pro- / f* * 23 « venance d'échantillons soit d'autopsie soit de biopsie, une lar- » ge fluorescence nucléolaire est produite par la double technique à anticorps (immunofluorescence indirecte) et qu'un résultat correspondant n'est pas obtenu avec une série de tissus non cancéreux (Davis et cons., 1979). Dans les dernières études, plus de 60 tumeurs malignes ont été étudiées et une grande variété de témoins de tissu ont également été évalués. Il est d'un grand intérêt que cette large série de tumeurs malignes d'origine ectodermique, endodermique et mésodermique montre la présence d'un ou de plusieurs antigènes nucléolaires communs (Tableau I) .
Exemple 1
Tissus normaux. Dans 17 tissus non cancéreux, il n'y a pas de fluorescence nucléolaire à la suite d'une incubation des antisérums ou anticorps avec les différentes préparations de cellules fixées. Il est d'un intérêt particulier que, ni la couche de Malpighi de la peau, ni les cellules de la rnoëlle osseuse, ni les cryptes de Leiberkuhn ne montrent une immunofluorescence positive avec ce procédé. De plus, la variété de tissus non cancéreux adjacents aux néoplasmes est également négative ; cela comprend plusieurs tissus de types différents. Un groupe de tumeurs bénignes examiné, comprenant plusieurs types d'adénomes de la thyroïde, est également négatif (Tableau II) .
Exemple 2 Lésions inflammatoires. Pour constater si une réponse inflammatoire est en relation avec l'apparition de ces antigènes, des études ont été faites sur huit types de tissus inflammatoires.
/
Dans la plupart de ceux-ci, il n’y a pas de fluorescence notable : // 24 « dans les nucléoles des cellules étudiées. Cependant, on a trou-*_ vé des coupes dans des spécimens de colite ulcéreuse et d'ul cère gastrique qui montrent une fluorescence nucléolaire positive. Il faut noter que deux des trois coupes de cclite ulcéreuse sont négatives et qu'une seule a montré une fluorescence nucléo-laire positive définie. Dans l'ulcère gastrique, une des deux coupes analysées montre une fluorescence nucléolaire positive.
• Ces résultats sont particulièrement intéressants étant donnée la propension connue de ces lésions de subir un changement malin.
Il est d'un intérêt spécial de revoir à la fois les régions focales positives et négatives de ces lamelles dans les coupes colorées à 1'hématoxyline-éosine, celles-ci montrent qu'il y a en effet des régions dans ces lésions qui montrent non seulement des formes mitotiques mais aussi un amoncellement du revêtement épithélial. Cette découverte suggère que ces cellules peuvent constituer des lésions prénéoplasiques ou des carcinomes in situ. Il est possible que la découverte de ces régions fluorescentes puisse aider dans les décisions à prendre de procéder par chirurgie avec résections soit locales soit plus générales des lésions concernées.
Exemple 3
Artefacts. Dans l'épithélium gastrique, il y a une région de fluorescence dans chaque cellule qui est non nucléolaire, c'est- à-dire qui apparaît représenter une localisation non spécifique de l'anticorps fluorescent. Dans une crypte de l'intestin grêle, une localisation non spécifique de l'anticorps semble se produire sous la forme d'agrégats ; dans la plupart des cas, une préfiltra-^ tion des anticorps à travers un filtre Millipore de 0,45 pm éli-'' // V · 25 4 mine ces agrégats. Dans un échantillon de tissu de la poitrine, qui est négatif pour une fluorescence nucléolaire, de petites taches immunofluorescentes non spécifiques sont distribuées d'une manière générale avec des caractéristiques de localisation pas spéciales par rapport à la morphologie cellulaire. Les diamètres de ces très petits précipités non spécifiques sont de 0,5 à 0,1 pm en comparaison des diamètres nucléolaires dans les noyaux et nucléoles qui sont de 4 à 6 μτη.
Exemple 4
Fluorescence pendant des phases du cycle cellulaire. La fluorescence nucléolaire est aisément observée dans les nucléoles de l'interphase. Dans la métaphase la fluorescence nucléolaire n'est pas observée comme une entité distincte mais est visible entre les chromosomes et la zone de jonction entre le "noyau'1 et le cytoplasme. Dans la mesure où le nucléole disparaît largement pendant la métaphase et où la synthèse de rRNA cesse dans la prophase finale, il n'est pas surprenant que la fluorescence nucléolaire ne soit pas visible sous la forme d'une entité distincte dans ces cellules (Tan et Lerner, 1972). Cependant, la . découverte que des résidus des produits immunofluorescents per sistent à travers la mitose suggère que les substructures nucléolaires (plutôt que les produits nucléolaires) contiennent les antigènes qui sont persistants épigénétiquement.
Exemple 5 Négatifs de tumeur maligne. Dans la série des tumeurs malignes, on trouve des régions négatives dans des mesures variées à travers les lamelles. En général, cela correspond soit aux parties' / / / / / j nécrotiques ou purulentes des néoplasmes. Dans un échantillon // » 1 26 « d'une tumeur du cerveau, la masse qui ne montre aucune fluorescence positive est nécrotique;plusieurs leucocytes sont présents mais il n'y a pas de structure définie. Un adénocarcinome, qui a envoyé des métastases au cerveau, ne montre pas de fluorescence positive ,* les raisons n'en sont pas claires. Dans la mesure où 61 des 63 tumeurs étudiées présentent une fluorescence nucléo-laire positive, 97% des séries étudiées sont positifs. Ces études ont à présent été étendues largement à plus de 300 spécimens de cancer humain, y compris une série de cancers du sein, de la prostate, des poumons et des tumeurs hématôlogiques, et cela avec des résultats très semblables.
Exemple 5
Marquage. Des méthodes immunochimiques directes pour la démonstration des anticorps comprennent le marquage de l'anticorps primaire à l'aide d'une ou de plusieurs des marques suivantes : un r; 125 131 14 dioisotope pour autoradxographie, tel que du I, I, C, ou 3 H ; un colorant fluorescent tel que de la fluorescéine ou de la tétraméthylrhodamine pour l'observation microscopique par fluorescence ; uh enzyme qui produit un produit fluorescent ou coloré à détecter par microscopie par fluorescence ou par microscopie optique, ou qui produit un produit électroniquement dense à observer au microscope électronique ; ou une molécule dense du point de vue électronique, telle que de la ferritine, pour une observation microscopique électronique directe.
Des méthodes immunochimiques indirectes comprennent le marquage du deuxième anticorps ou une autre liaison de protéine spécifique pour le premier anticorps avec un colorant fluorés- y cent, un composé électroniquement dense, un enzyme qui produÿ^y' ψ . ί 27 « un produit détectable à l'examen au microscope optique, à fluo- » rescence ou électronique, ou'un radioisotope détectable par autoradiographie.
Les méthodes immunochimiques indirectes pour l'observation des anticorps comprennent l'application d'anticorps ou fragments d'anticorps primaires ou secondaires hybrides (F(ab')2) dans lesquels une partie de la préparation d'anticorps hybride est spécifique pour les antigènes nucléolaires (anticorps primaire. hybride ) ou pour l'anticorps primaire (anticorps secondaire hybride), et une partie est spécifique pour une marque, telle que celle mentionnée dans le paragraphe précédent.
Des anticorps marqués conjugués et non conjugués peuvent être emballés séparément dans une solution saline tamponnée par du phosphate (PBS) ou dans d'autres agents de suspension tamponnés pour une distribution sous la forme de trousses pour diagnostic. Comme agents de suspension appropriés on peut citer la glycérine, l'héparine ou du saccharose. Comme tampons appropriés on peut citer des tampons de barbital, des tampons de morpholine , de *1'acide M0PS-3-(N-morpholino)-propane-suifonique, de l'acide hepes-N-2-hydroxypipérazine-N-2-éthanesulfonique, du Tris carbonate et des substances analogues.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux modes de réalisation décrits ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sansy^ sortir du cadre du présent brevet.
Λ
Claims (30)
1. Procédé de détection immunologique du cancer dans des coupes, frottis et préparations cytologiques exfoliées de tissu humain caractérisé par l'emploi d'anticorps mis en lumière dans des nucléoles de cellules humaines malignes ou des extraits de noyaux ou de nucléoles de telles cellules, ce procédé comprenant la mise en contact des échantillons avec lesdits anticorps et la démonstration de la localisation, des anticorps » dans les nucléoles de cellules malignes et non pas de cellules normales.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont mis en lumière dans des nucléoles isolés de cellules de la famille des cellules humaines malignes comprenant des cellules HeLa, des carcinomes, des sarcomes et des néoplasmes hématologiques.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont mis en lumière dans des nucléoles isolés de cellules du groupe comprenant les cellules HeLa ou des cellules de 'carcinome de la prostate de l'être humain.
4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont mis en lumière dans des extraits de noyaux ou de nucléoles de cellules humaines malignes provenant de la famille comprenant des cellules HeLa, des carcinomes, des sarcomes et des néoplasmes hématologiques.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont mis en lumière dans des extraits de noyaux ou de nucléoles de cellules du groupe comprenant des cel-^ Iules HeLa ou des cellules de carcinome de la prostate de l'êtré /// I*"' * · 29 A humain.
* 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont mis en lumière dans des extraits de noyaux ou de nucléoles de cellules humaines malignes obtenus par extraction avec du Tris HCl 0,01 M, à un pH de 7 à 9.
7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps sont mis en lumière dans des extraits de noyaux ou de nucléoles provenant du groupe comprenant des cellules HeLa ou des cellules de carcinome de la prostate de l'être humain, obtenus par extraction avec du Tris HCl 0,01 M, à Un pH de 7 à 9.
8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la localisation de l'anticorps est observée par une des méthodes immunochimiques directes ou indirectes.
9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la détection immunologique du cancer par des anticorps comprend le marquage des anticorps primaires par une ou plusieurs des marques suivantes : un radiosisotope détectable par autora-diographie, un colorant fluorescent détectable par microscopie par fluorescence, un enzyme qui produit un produit fluorescent % ou coloré détectable par microscopie par fluorescence ou optique, un enzyme qui produit un produit électroniquement dense détectable par microscopie électronique, et une molécule électroniquement dense détectable par observation microscopique électronique directe.
10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le radioisotope est choisi parmi le groupe comprenant/'. f 125 131T 14 . 3 f f I, I, C, et H. // / ♦ 1 30 J
11. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en c ce que le colorant fluorescent est choisi parmi le groupe comprenant de la fluorescéine et de la tétraméthylrhodamine.
12. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme qui produit un produit fluorescent ou coloré détectable par microscopie par fluorescence ou optique est de la peroxidase, de la ß-galactosidase, de la phosphatase alcaline « ou un cytochrome C.
13. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que la molécule électroniquement dense détectable par observation microscopique électronique directe est de la ferriti-ne, de l’hémocyanine, des particules virales ou des sphères de latex.
14. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la détection immunologique du cancer est effectuée par démonstration immunochimique indirecte des anticorps, ce procédé comprenant l'application d’au moins un deuxième anticorps marqué et d'une autre protéine de liaison spécifique pour les . anticorps pr-imaires ou leurs modifications.
15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que la marque est choisie parmi le groupe comprenant un colorant fluorescent, un composé électroniquement dense et un enzyme qui produit un produit détectable par un examen au microscope optique, à fluorescence ou électronique, et un radioisotope détectable par autoradiographie.
16. Procédé immunochimique indirect d'observation des anticorps mis en oeuvre suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend l'application d'au moins l'un des anticorps ι< i 31 ou fragments d'anticorps primaire ou secondaire hybrides « (F(ab')2), une partie de la préparation d'anticorps hybride étant spécifique pour les antigènes nucléolaires (anticorps primair< hybride ) ou pour l'anticorps primaire (anticorps secondaire hybride), et une partie étant spécifique pour une marque, comprenant un composé électroniquement dense pour une observation au microscope électronique, un enzyme qui fournit des produits détectables au microscope optique, par fluorescence ou électronique, ou un composé marqué par un radioisotope pour une autoradiographie.
17. Procédé de détection immunologique du cancer dans des coupes, des frottis et des préparations cytologiques exfoliées de tissu humain, caractérisé par l'emploi d'anticorps modifiés ou fragmentés mis en lumière dans des nucléoles de cellules humaines malignes ou des extraits de noyaux ou de nucléoles de telles cellules, ce procédé comprenant la mise en contact d'échantillons avec lesdits anticorps modifiés ou fragmentés, et la démonstration de la localisation des anticorps modifiés ou fragments d'anticorps par microscopie optique, microscopie à fluorescence, microscopie électronique ou autoradiographie à l'aide d'au moins un des moyens immunochimiques directs ou indirects, la localisation ayant lieu dans les nucléoles des cellules humaines malignes et non pas dans les nucléoles des cellules normales.
18. Antigènes associés aux cellules cancéreuses humaines comprenant une espèce principale et une espèce subsidiaire, l'espèce principale présentant les caractéristiques suivantes : r / un pi, sur concentration isoélectrique, d'environ 6,0 a/' / // 32 i 6,7, et un poids moléculaire d'environ 50.000 à environ 60.000 t ' daltons, . ; * · la solubilité dans du Tris HCl 0,01 M à pH 8, et sa localisation en premier lieu dans les nucléoles.
19. L'espèce principale d'antigène suivant la revendication 18, sous une forme pratiquement purifiée.
20. Procédé de préparation d'anticorps présentant une . spécificité contre les antigènes découverts dans des nucléoles et des noyaux de cellules cancéreuses humaines, caractérisé en ce qu'il comprend l'immunisation d'animaux hôtes non humains par les antigènes suivant la revendication 18, et la récolte des anticorps à partir des animaux immunisés.
21. Procédé de préparation d'anticorps présentant une spécificité contre les antigènes découverts dans des nucléoles de cellules cancéreuses humaines, caractérisé en ce qu'il comprend l'immunisation d'animaux hôtes non humains par les antigènes suivant la revendication 19 et la récolte des anticorps des animaux immunisés.
22. Procédé de préparation et d'isolement d’antigènes nucléolaires caractérisé en ce qu'il comprend l'extraction des antigènes à partir de noyaux ou de nucléoles de cellules cancéreuses humaines par du Tris HCl 0,01 M d'un pH de 7 à 9.
23. Préparation nucléaire, caractérisée en ce qu'elle comprend des extraits au Tris HCl de noyaux ou de nucléoles provenant de cellules cancéreuses humaines.
24. Procédé de purification d'antigènes nucléolaires caractérisé en ce qu'il comprend leur purification séquentielle / par précipitation au sulZate d'ammonium, une chromatographie sur / / * v 33 l colonne de DEAE,. une exclusion au gel Sephadex, un échange de 1» * cations et une chromatographie sur gel de phosphate de calcium, ·» et une concentration isoélectrique de préparation.
25. Procédé de purification d'anticorps récoltés à partir d'un animal hôte non humain induit par immunisation par un antigène nucléolaire.
26. Trousse pour diagnostic, caractérisée en ce qu'elle „ comprend des anticorps caractérisés par une spécificité contre des antigènes nucléolaires trouvés dans des cellules cancéreuses humaines, ces anticorps présentant une marque détectable par microscopie optique, à fluorescence ou électronique, par des méthodes d'examen indirect et par autoradiographie, et se trouvant dans un agent de suspension tamponné ou en solution.
27. Trousse pour diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps primaires non marqués, caractérisés par une spécificité contre des antigènes nucléolaires trouvés dans des cellules cancéreuses malignes humaines et se trouvant dans un agent de suspension tamponné ou en solution, et des réactifs marqués ou non marqués appropriés pour la détection des anticorps primaires dans des cellules malignes humaines fixées par une méthode choisie parmi le groupe comprenant la microscopie optique, la microscopie par fluorescence, la microscopie électronique et l'autoradiographie.
“ 28. Antigènes associés aux cellules cancéreuses humai nes, caractérisés en ce qu'ils comprennent une espèce principale et une espèce subsidiaire, l'espèce principale présentant les caractéristiques suivantes : un pi, sur concentration isoélectrique, d'environ 6,0/à/ / y / / - * tf. 34 l* 6,7, • un poids moléculaire d'environ 50.000 à environ 60.000 daltons, • elle est soluble dans du Tris HCl 0,01 M d’un pH de 8, et elle est localisée en premier lieu dans les nucléoles, lorsqu'elle- est préparées par le procédé suivant la revendication 22 ou par un équivalent chimique de ce dernier.
29. Espèce principale d'antigène suivant la revendi- . cation 18, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme pratiquement purifiée, lorsqu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 24 ou par un équivalent chimique de ce dernier.
30. Procédé de détection de cellules cancéreuses par des anticorps, tel que décrit ci-dessus. Dessins : - ^.....planches _____15„„ pages dont......A.........p?oe de garde ...... pr- .-ηε de description ..........¾..... 7: „as c'e revendications. ......A........abrégé descriptif Luxembourg, le Charles Munch?''
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