LT6274B - Imaging of melanocytes by confocal reflection microscopy method in histological skin sections - Google Patents

Abstract

The invention relates to a system for skin melanocytes reflection testing in histological skin sections using confocal reflection microscopy method, and for testing its reflective properties of healthy human skin and melanocytic skin tumors, moles and melanoma, as well as the use of system.

Description

Technikos sritis Išradimas susijęs su melanocitų vaizdinimu odos histologiniuose pjūviuose, naudojant konfokalią atspindžio mikroskopiją, ir melanocitų atspindžio savybėmis sveikoje žmogaus odoje ir melanocitiniuose odos navikuose - apgamuose ir melanomose. Šis išradimas taip pat susijęs su tokiu vaizdinimu, kaip neinvaziniu diagnostikos būdu.FIELD OF THE INVENTION The invention relates to the imaging of melanocytes in histological sections of the skin using confocal reflection microscopy, and to the properties of melanocyte reflection in healthy human skin and melanocytic skin tumors - birthmarks and melanomas. The present invention also relates to such imaging as a non-invasive diagnostic method.

Technikos lygisTechnical level

Konfokali atspindžio mikroskopija (KAM) yra naujas neinvazinis būdas, skirtas in vivo odos tyrimui. Kadangi lazerio spindulys praeina odos ląsteles ir kitas odos struktūras, turinčias skirtingas šviesą laužiančias savybes (atspindžio indeksą), atspindėta šviesa yra sugaunama ir informacija padorojama kompiuterinės įrangos pagalba, gaunant dvimatį vaizdą. Mikroskopas leidžia pateikti gana detalius vaizdus, gautus iš skirtingų odos lygių/gylių, kurie naudojami histologiniuose tyrimuose. Pirmieji tyrimai buvo atliekami, nustatant sveikos odos įvairių ląstelių populiacijas, esančias skirtinguose ląstelių lygiuose.Confocal Reflection Microscopy (CAM) is a new non-invasive method for in vivo skin testing. Since the laser beam passes through the skin cells and other skin structures with different light-breaking properties (reflection index), the reflected light is captured and the information is decoded by computer hardware to obtain a two-dimensional image. The microscope allows you to present fairly detailed images from different skin levels / depths used in histological studies. The first studies were conducted to identify populations of different skin cells at different levels of the skin.

In vivo konfokali atspindžio mikroskopija yra daug žadanti nauja technologija, naudojama odos melanomos neinvazinėje diagnostikoje (1-2). Medicinos praktikoje tyrimas pradėtas naudoti 1995 m., kai M Rajadhyaksha su bendraautoriais žurnale Journal of Investigative Dermatology paskelbė, jog melaninas duoda stiprų kontrastą odoje, tiriant ją in vivo konfokaliu atspindžio mikroskopu (3). Tačiau lig šiol nėra tikslių duomenų apie melanocito atspindžio savybes tiriant odą in vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu. Įvairių autorių duomenimis, tiriant šiuo metodu melanocitas gali atrodyti kaip šviesi šakota ląstelė (4). Bendru tyrėjų sutarimu, melanomos diagnozavimas in vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu remiasi melanocitų su kontrastuojančia citoplazma ir hipokontrastiniais branduoliais radimu (5). Ex vivo arba histologinių odos pjūvių konfokalios atspindžio mikroskopijos metodas kartu su imunohistochemijos metodais galėtų teikti papildomos informacijos apie odos melanocitų atspindėjimą.In vivo confocal reflection microscopy is a promising new technology used in non-invasive diagnostics of skin melanoma (1-2). In medical practice, the study was launched in 1995 when M Rajadhyaksha and co-authors in the Journal of Investigative Dermatology reported that melanin gives a strong contrast to the skin by examining it in vivo with a confocal reflection microscope (3). However, to date, there are no accurate data on melanocyte reflectance properties in skin in vivo confocal reflection microscopy. According to various authors, melanocyte may appear as a bright branched cell (4). In a joint agreement, the in vivo diagnosis of melanoma by confocal reflection microscopy is based on the discovery of melanocytes with contrasting cytoplasm and hypocontrast nuclei (5). An ex vivo or histological cut-off confocal microscopy method, in conjunction with immunohistochemical methods, could provide additional information on skin melanocyte reflection.

Paraiškoje US2012170828 aprašyta konfokalios atspindžio mikroskopijos panaudojimas melanomos įvertinimui, naudojant 3D konfokalinius vaizdus ir panaudojant tam kompiuterinę įrangą.US2012170828 describes the use of confocal reflection microscopy for the evaluation of melanoma using 3D confocal images and the use of computer hardware.

Patente US2008319322 aprašytas neinvazinis in vivo tyrimas, kuris skirtas nervų ligų, susijusių su diabetu, ŽIV ir kitais susirgimais, įvertinimui arba stebėjimui. Žinomas būdas, aprašytas VV02013001113, kuriame konfokalios mikroskopijos pagalba yra gaunami histologiniai X-gal štamo vaizdai, taip pat naudojant fluorescenciją, tokiu būdu gaunant X-gal nuosėdų lokalizacijos ir išplitimo kryptis ląstelių lygyje. Tačiau tiriama visai kitokia medžiaga. Žinomas US2011206254, kuriame aprašytas odos pigmentacijos tyrimas, naudojant difuzinį atspindžio vaizdą. Šis būdas yra naudojamas hemoglobino ir melanino pasiskirstymo nustatymui, taip pat odos paviršiaus komponentų atspindžio nustatymui. Trūkumas yra tas, kad naudojant šį būdą nėra galimybės nustatyti melanocitų atspindžio savybių. Žinoma EP2068888 neinvazinė mechanoreceptorių kiekį nustatanti sistema, korioje naudojamas konfokalios mikroskopijos būdas, tačiau šis būdas netiria melanocitų atspindžio savybių. Išradimo esmė Išradimo tikslas - atlikti ir įvertinti odos melanocitų vaizdinimą ex vivo, naudojant konfokalios atspindžio mikroskopijos metodą ir ištirti jų atspindį sveikoje žmogaus odoje ir melanocitiniuose odos navikuose - apgamuose ir melanomose.US2008319322 describes a non-invasive in vivo study for evaluating or monitoring nerve diseases associated with diabetes, HIV and other diseases. A known method is described in VV02013001113, wherein confocal microscopy provides histological images of X-gal strain, also using fluorescence, thereby obtaining localization and propagation directions of X-gal at the cellular level. However, a completely different material is being studied. US2011206254, which describes a skin pigmentation assay using a diffuse reflection image. This method is used to determine the distribution of hemoglobin and melanin, as well as to determine the reflection of skin surface components. The drawback is that using this method there is no possibility to detect melanocyte reflection properties. It is known that EP2068888 is a non-invasive mechanism for determining mechanoreceptor levels, using confocal microscopy in the cell, but this method does not investigate the properties of reflection of melanocytes. OBJECT OF THE INVENTION The object of the invention is to perform and evaluate ex vivo visualization of skin melanocytes using the confocal reflection microscopy method and to investigate their reflection in healthy human skin and melanocytic skin tumors - birthmarks and melanomas.

Konfokali atspindžio mikroskopija yra vienas iš neinvazinių odos tyrimo būdų, padedančių atskirti įvairias mikrostruktūras pagal šviesos atspindžio skirtumus. Medicinoje jis naudojamas žmogaus audinių tyrimams ex vivo, t.y. tirti histologinius audinių pjūvius, arba in vivo, t.y. tirti audinius ląsteliniu lygiu gyvai esamuoju laiku išvengiant invazijos į organizmą. In vivo konfokalios mikroskopijos tyrimai šiuo metu atliekami odoje, akyse, vidaus organų (pvz., skrandžio) gleivinėse.Confocal reflection microscopy is one of the non-invasive skin test methods that help to distinguish different microstructures by the differences in light reflectance. In medicine, it is used for ex vivo research on human tissues, i. to examine histological tissue sections, or in vivo, i.e. Tissue research at the cellular level in the current time, avoiding invasion into the body. In vivo confocal microscopy studies are currently performed in the skin, eyes, mucous membranes of the internal organs (eg stomach).

Melanino turinčios ląstelės kontrastuoja tiriant konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu. Melanocitas yra melaniną sintetinanti odos ląstelė. Melanino sintezė vyksta melanosomose šioms pereinant brendimo stadijas nuo I iki IV. Imunohistocheminiai metodai gali būti naudojami siekiant nustatyti skirtingas melanosomų stadijas melanocituose. Melan-A reaguoja su visomis (t.y. I-IV stadijų) melanosomomis, HMB45 specifiškai reaguoja su nebrandžiomis II stadijos melanosomomis (5). III-IV stadijos melanosomos turi melanino. Pagal melanosomų stadiją imunohistochemiškai vertinamas melanocitų brandumas. Melanomai būdingi atipiniai melanocitai pasižymi sutrikusiu brendimu. Atipinių melanocitų atspindžio savybės yra ypač svarbios diferencinei gerybinių ir piktybinių melanocitinės kilmės odos navikų diagnostikai.Melanin-containing cells are contrasted by confocal reflection microscopy. Melanocyte is a melanin synthesizing skin cell. Melanin synthesis takes place in melanosomes during these transition stages from I to IV. Immunohistochemical methods can be used to detect different stages of melanosomes in melanocytes. Melan-A reacts with all (i.e., I-IV stages) melanosomes, HMB45 specifically reacts with non-mature stage II melanosomes (5). Melanosomes of stage III-IV have melanin. According to the melanosomal stage, the maturity of melanocytes is evaluated immunohistochemically. Melanocytic atypical melanocytes are characterized by impaired puberty. Reflection properties of atypical melanocytes are particularly important for differential diagnosis of benign and malignant melanocytic skin tumors.

Melanocitų atspindžio nustatymui buvo panaudota neinvazinė odos melanocitų vaizdinimo odoje sistema, apimanti (a) konfokalaus atvaizdo mikroskopą, skirtą gauti pageidaujamos odos srities melanocitų atspindžio duomenis; (b) imunohistocheminį dažymą, siekiant gauti imunohistocheminį vaizdą bei (c) kompiuterį, skirtą odos melanocitų vaizdinimui. Tiriant šia sistema buvo nustatyta, kad melanocitų citoplazma bei branduolio atspindys priklauso nuo imunohistocheminio tyrimo intensyvumo. Melanocitai buvo identifikuoti kompiuteriu pagal juose esančių melanosomų šviesos intensyvumo charakteristikas.A non-invasive skin melanocyte imaging system incorporating (a) a confocal image microscope for obtaining the data of the melanocytes of the desired skin region has been used to detect melanocyte reflection; (b) immunohistochemical staining to obtain an immunohistochemical image and (c) a computer for imaging skin melanocytes. Melanocyte cytoplasm and kernel reflection were determined by the intensity of the immunohistochemical assay. Melanocytes were identified by computer according to the light intensity characteristics of the melanosomes contained therein.

Taip pat buvo nustatyta, kad kompiuteriu pateikiamos melanocitų citoplazmos atspindžio savybės priklauso nuo melanosomų brandumo stadijos. Epidermio sluoksnyje tarp keratinocitų išsidėstę melanocitai dažniau buvo hipokontrastiniai nei ryškiai kontrastuojantys, kontrastuojantis branduolys buvo matomas tiek sveikos odos melanocituose, tiek apgamo nevocituose, o melanomos ląstelės (atipiniai melanocitai) buvo tiek hipo-, tiek ižo-, tiek hiperkontrastinės keratinocitų atžvilgiu, daroma išvada, kad melanocito citoplazmos atspindžio savybės skiriasi priklausomai nuo melanosomų brandumo stadijos.It was also found that the computerized melanocyte cytoplasm reflection properties depend on the maturity of melanosomes. In the epidermal layer, melanocytes, which are located between keratinocytes, were more likely to be hypocontrast than brightly contrasting, the contrasting nucleus was visible both in healthy skin melanocytes and in non-cytocytes, and melanoma cells (atypical melanocytes) were both hypo-, echo-, and hyper-contrast keratinocytes, concluding that melanocyte cytoplasm reflection properties differ depending on the maturity of melanosomes.

Melanocito citoplazma, turinti nebrandžias I-II stadijos melanosomas, yra pralaidi šviesai, o branduolys - kontrastuojantis, tuo tarpu melanocito citoplazma, turinti brandžias III-IV stadijos melanosomas, kurios pasižymi stipriomis šviesą laužiančiomis savybėmis, yra šviesi, o branduolys - tamsus.Melanocyte cytoplasm, which has non-primitive melanosomes of stage I-II, is permeable to light and the nucleus is contrasting, while melanocytic cytoplasm with mature III-IV melanosomes, which have strong light-breaking properties, is bright and the nucleus dark.

Odos melanocitų vaizdinimo odoje sistema yra skirta melanomos atspindžio savybėms nustatyti, siekiant gautą informaciją panaudoti paciento būsenos įvertinimui arba stebėjimui, kur panaudojimas apima: (a) konfokalaus atvaizdo mikroskopą, skirtą odos melanocitų vaizdinimui; (b) imunohistocheminį dažymą, skirtą reakcijos brandumui nustatyti bei (c) kompiuterį, skirtą skaitmeninių vaizdų analizei.The skin melanocyte imaging system is designed to determine the properties of melanoma reflection in order to use the information obtained to evaluate or monitor the condition of a patient, the use comprising: (a) a confocal image microscope for imaging skin melanocytes; (b) immunohistochemical staining for determining the maturity of the reaction; and (c) a computer for analyzing digital images.

Tirti melanocitai bei ląstelių lizdus sudarantys nevocitai identifikuoti kompiuteriu pagal juos sudarančių melanosomų šviesos intensyvumo charakteristikas. Šis išradimas yra panaudojamas melanocitų atspindžio įvertinimui tiek sveikoje odoje, tiek melanocitiniuose odos navikuose. Šis išradimas gali būti taikomas keratomos, melanomos, apgamo, lentigo tyrimui ir nustatymui.Melanocytes and non-cytocytes, which form cell nests, were identified by computer according to the light intensity characteristics of the melanosomes forming them. The present invention is used to evaluate melanocyte reflection in both healthy skin and melanocytic skin tumors. The present invention can be applied to the study and detection of keratoma, melanoma, mole, lentigo.

BrėžiniaiDrawings

Fig. 1. Normalios odos histologinis pjūvis (53 m. pacientas; lokalizacija - vidinis riešo paviršius; odos fototipas I-II): (A) ex vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu padaryta nuotrauka; (B) HMB45 imunohistocheminio tyrimo rezultatų vaizdas. Rodyklėmis pažymėti bazinio epidermio sluoksnio melanocitai, kurių citoplazma nekontrastuoja (t.y. tamsi), o nežymus kontrastas matomas branduoliuose.FIG. 1. Histological incision of normal skin (53-year-old patient; localization - internal wrist surface; skin phototype I-II): (A) photo taken ex vivo by confocal reflection microscopy; (B) Image of the results of an immunohistochemical study of HMB45. The arrows mark the melanocytes of the basal epidermal layer, which are not cytoplasmic (i.e., dark) and have a slight contrast in the nuclei.

Fig. 2. Spitz nevusas: kliniškai 3 mm diametro amelanotinė papulė su aiškiais kraštais, 56 metų amžiaus pacientei vidiniame riešo paviršiuje; odos fototipas II: (A) ex vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu atlikta nuotrauka; (B) HMB45 imunohistocheminio tyrimo rezultatų vaizdas.FIG. 2. Spitz Uncle: Clinically 3 mm diameter amelanotic papule with clear edges, 56 years old on the inner wrist surface; skin phototype II: (A) photo taken ex vivo by confocal reflection microscopy; (B) Image of the results of an immunohistochemical study of HMB45.

Fig. 3. Melanoma iri situ (pigmentinis navikas, 53 metų amžiaus pacientė; šlaunies oda; odos fototipas II): (A) ex vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodu atlikta nuotrauka; (B) Melan-A imunohistocheminio tyrimo rezultatų vaizdas (melanocitai yra Melan-A teigiami, jų citoplazma rudos spalvos). Dauguma melanocitų (melanomos ląstelių) yra hipo- arba izokontrastinės, palyginti su keratinocitais.FIG. 3. Melanoma iri situ (pigmental tumor, 53-year-old patient; thigh; skin phototype II): (A) Ex vivo photo taken by confocal reflection microscopy; (B) Image of Melan-A immunohistochemical results (melanocytes are Melan-A positive, their cytoplasm brown). Most melanocytes (melanoma cells) are hypo- or isocontrastal to keratinocytes.

Fig. 4. Kairėje - in vivo KAM gautas vaizdas (0.5 x 0.5 mm; gylis - 30 pm žemiau str. comeum) paviršiniame epidermio-dermos jungties lygyje; dešinėje - koreliuojantis to paties naviko mikropreparato histologinis vaizdas (HE dažymas, 20x). Iri vivo KAM požymiai: tankių ląstelių klasteriai deformuoja dermos papiląs (tamsios žiedinės struktūros). Stebima odos architektonikos atipija, kartu su kolageninių skaidulų proliferacija (balkšvos spalvos dermos papilos) bei melanofagais (pavienės šviesą atspindinčios ląstelės matomomis tamsiose dermos papilose) papilinėje dermoje.FIG. 4. Left - in vivo KAM image (0.5 x 0.5 mm; depth - 30 pm below Art. Cumumum) at the surface of the epidermal - dermal joint; right - correlating histological view of the same micropreparation of the same tumor (HE dyeing, 20x). Iri vivo KAM Signs: Dense cell clusters deform the dermal papilla (dark circular structures). An asthma of skin architectonics is observed, along with the proliferation of collagen fibers (white dermis papillas) and melanophages (single reflective cells visible in dark dermal papillas) in papillary dermis.

Histopatologijos diagnozė: displazinis apgamas su vidutinio laipsnio citologine atipija.Diagnosis of Histopathology: Dysplastic Bumblebee with Moderate Cytological Atypical.

Tinkamiausi įgyvendinimo variantaiThe most appropriate implementation options

Tyrimo eiga 1. Pacientų atranka (VUOI įtarus apgamų atipiją ar odos melanomą); 2. Odos naviko dermoskopijos ir in vivo konfokalios odos mikroskopijos tyrimai (VUOI) 3. Odos naviko ekscizija (VUOI); 4. Odos navikų morfologijos tyrimai, galutinės patologijos diagnozės nustatymas ir histologijos preparatų skenavimas (VPC); 5. In vivo odos konfokalios odos mikroskopijos ir histologijos preparatų vaizdų analizė; 6. Sukauptų duomenų analizė statistiniais tyrimo metodais; 8. Eksperimentinis histologinių odos pjūvių konfokalios atspindžio mikroskopijos tyrimas.Study Procedure 1. Patient Selection (VUOI suspected birthmark or skin melanoma); 2. Skin Tumor Dermoscopy and In vivo Confocal Skin Microscopy (VUOI) 3. Skin Tumor Excision (VUOI); 4. Investigations of morphology of skin tumors, diagnosis of definitive pathology and scanning of histological preparations (VPC); 5. In vivo analysis of skin confocal skin microscopy and histology images; 6. Analysis of accumulated data by statistical research methods; 8. Experimental investigation of histological skin incision confocal reflection microscopy.

Po chirurginio gydymo/ekscizinės biopsijos ir odos naviko histologinio ištyrimo tiriamieji suskirstyti į tris grupes remiantis galutine patologijos diagnoze, nustatyta Valstybiniame patologijos centre (VPC): I grupė - pacientai, kuriems diagnozuoti gerybiniai melanocitinės kilmės odos navikai (melanocitiniai apgamai) neturintys citologinės atipijos požymių (n=25), II grupė - pacientai, kuriems diagnozuoti displaziniai apgamai (n=69) ir III grupė - pacientai, kuriems diagnozuotos odos melanomos (n=44). Remiantis TNM klasifikacija 9 iš 44 odos melanomos buvo 0 stadijos (melanoma in situ), 35 - invazinės t.y. I-IV stadijos; vidutinis odos melanomos storis pagal Breslovv -1,35 mm.Following surgical / excision biopsy and histological examination of the skin tumor, the subjects were divided into three groups based on the final diagnosis of pathology established by the State Pathology Center (VPC): Group I - patients diagnosed with benign melanocytic skin tumors (melanocytic moles) with no cytological atypical symptoms ( n = 25), Group II patients diagnosed with dysplastic moles (n = 69) and Group III patients with skin melanoma (n = 44). Based on TNM classification, 9 of the 44 skin melanomas were stage 0 (melanoma in situ), 35 - invasive i. Stages I-IV; average skin melanoma thickness according to Breslovv -1.35 mm.

Atrinktų atipijos požymių turinčių odos navikų in vivo odos konfokalios atspindžio mikroskopijos tyrimas atliktas naudojant VivaScope 1500 aparatą (Lucid, JAV), laikantis gamintojo pateiktų rekomendacijų standartinei tyrimo procedūrai (MAVIG mokymo kursai Vilnius, 2010, 2 priedas). Tyrimo procedūros metu odos tvirtinimui prie in vivo konfokalios mikroskopijos aparato naudoti vienkartiniai objektyviniai stikliukai, iš vienos pusės klijuojami audinių klijais prie odos, iš kitos - prie metalinio žiedo, tvirtinamo magnetais prie konfokalios sistemos (nuotr). Imersijai ant odos paviršiaus lašintas Crodamol aliejus (JAV), tarp objektyvinio stiklelio ir lazerio naudotas ultragarsui skirtas gelis. Tyrimo metu konfokalios atspindžio mikroskopijos vaizdai skenuoti visame, tačiau ne didesniame nei 8 mm naviko plote 30, 60 ir 90 pm nuo odos paviršiaus. Jei navikas buvo didesni nei 8 mm, konfokalios mikroskopijos tyrimas buvo atliekamas daugiausia dermoskopinės atipijos požymių turinčioje naviko vietoje.The in vivo skin confocal reflection microscopy study of selected atypical skin tumors was performed using a VivaScope 1500 apparatus (Lucid, USA), following the manufacturer's recommendations for a standard test procedure (MAVIG Training Course Vilnius, 2010, Appendix 2). In the course of the study procedure, disposable objective glasses were applied to the skin for attachment to an in vivo confocal microscopy machine, glued to the skin on one side, and to a metal ring attached to the confocal system (photo). For skin immersion, Crodamol oil (US) is applied to the skin surface, and an ultrasonic gel is used between the lens slide and the laser. During the study, confocal reflection microscopy images were scanned across the entire, but not larger than, 8 mm tumor area at 30, 60, and 90 pm from the skin surface. If the tumor was larger than 8 mm, the confocal microscopy study was performed mainly on the tumor site with dermoscopic signs.

Apgamo displazijai būdingi odos struktūros pakitimai matomi tiriant in vivo konfokalia odos vaizdinimo sistema analizuoti ir vertinti skaitmeniniuose mozaikiniuose (Vivablock) vaizduose 30, 60 ir 90 μΐη nuo odos paviršiaus. Normaliam epidermiui būdinga “medaus korio” vaizdą primenanti struktūra vertinta 30 pm nuo odos paviršiaus (1 pav.). Jos nebuvimas, t.y. netvarkingas ląstelių išsidėstymas, kai nelieka aiškių ląstelių ribų buvo vertinamas kaip “būdingos epidermio struktūros praradimas” (2 pav.). Tame pačiame lygyje matomos šviesios atipinės ląstelės, šakotos ar stambios (didesnės nei 20 pm) vertintos kaip “pedžetoidinė infiltracija” (3 pav.). 60 ir 90 pm nuo odos paviršiaus gylyje vertinti ląstelių lizdai, jų homogeniškumas bei ribos. Neturintys aiškių ribų arba vientisumo ląstelių lizdai vertinti kaip “diskoheziniai” arba atipiniai pavienių ląstelių lizdai (4 pav.). Tuo tarpu, įprasti šviesių monomorfiškų ląstelių lengvai atskiriamas ribas turintys lizdai vadinti “tankių ląstelių lizdais” (5 pav.).Changes in skin structure characteristic of dysplastic dysplasia are seen in the in vivo confocal skin imaging system for analyzing and evaluating Vivablock images 30, 60 and 90 μ 30η from the skin surface. The typical honeycomb image of the normal epidermis is estimated at 30 pm from the skin surface (Figure 1). Its absence, i.e. The disordered cell placement when there are no clear cell boundaries was seen as "a characteristic loss of epidermal structure" (Figure 2). At the same level, light atypical cells, branched or large (greater than 20 pm) are seen as "pediatric infiltration" (Figure 3). Cell sockets, their homogeneity and boundaries were evaluated at depths of 60 and 90 µm from the surface of the skin. Those who do not have clear boundaries or integrity cells are considered to be "disco-lean" or atypical single-cell sockets (Figure 4). Meanwhile, nests with lightly separable boundaries of normal monomorphic cells are referred to as "dense cell nests" (Figure 5).

Odos navikų morfologijos tyrimai, galutinės patologijos diagnozės nustatymas ir histologijos preparatų skenavimasMorphology studies of skin tumors, diagnosis of the final pathology and scanning of histological preparations

Galutinė patologijos diagnozė ir melanocitų atipijos požymiai nustatyti Valstybiniame patologijos centre gydytojui patologui atlikus morfologijos tyrimų vertinimą. Hematoksilinu ir eozinu dažyti histologijos preparatų vaizdai skenuoti Aperio ScanScope GL objektinių stiklelių skeneriu (Aperio Technologies, Vista, CA, JAV) 20x padidinimu.The final diagnosis of the pathology and the signs of melanocyte atypical disease were determined by the State Pathology Center after the assessment of morphology studies by a pathologist. Images of haematoxylin and eosin stained histology preparations were scanned at a 20x magnification of Aperio ScanScope GL lens slide scanner (Aperio Technologies, Vista, CA, USA).

In vivo odos konfokalios odos mikroskopijos ir histologijos preparatų vaizdų analizėIn vivo analysis of skin confocal skin microscopy and histology images

Tirtų navikų in vivo odos konfokalios mikroskopijos vaizdų ir skenuotų H/E dažytų tų pačių navikų mikropreparatų vaizdų analizė atlikta gydytojo dermatologo. Analizuoti anksčiau kitų tyrėjų aprašyti melanocitinių odos navikų in vivo odos konfokalios atspindžio mikroskopijos diagnostiniai kriterijai/požymiai, skirti citologinei atipijai apibūdinti.An analysis of the in vivo skin confocal microscopy images of the tumors investigated and the images of the micropreparations of the same tumors stained by H / E were performed by a dermatologist. Diagnostic criteria / traits of melanocytic skin tumors in vivo skin confocal reflection microscopy described by other investigators for characterizing cytological atypical were analyzed.

Statistinei analizei naudoti penki in vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos vaizduose vertinti kriterijai - epidermio struktūra, pedžetoidinė infiltracija, tankių, nehomogeniškų arba diskoheziniai ląstelių lizdai. Jie analizuoti ir lyginti su histologiniuose vaizduose matomais pakitimais skenuotuose hematoksilinu ir eozinu dažytuose navikų mikropreparatuose. In vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos ir H/E dažytų mikropreparatų vaizdų koreliacija parodyta pav.Five criteria for in vivo confocal reflection microscopy were used for statistical analysis: epidermal structure, pediatric infiltration, dense, non-homogeneous, or dyslexic cell sockets. They were analyzed and compared with the hematoxylin and eosin-stained tumor micropreparations scanned in histological images. The correlation between in vivo confocal reflection microscopy and H / E stained micropreparation images is shown in Fig.

Ryškiai melanocitinei atipijai būdingi in vivo odos konfokalios atspindžio mikroskopijos citologinės atipijos požymiai vertinti gerybiniuose, displaziniuose ir piktybiniuose melanocitiniuose odos navikuose.Signs of cytological atypical atypical atopic skin confocal reflection microscopy typical of melanocytic atypic were assessed in benign, dysplastic and malignant melanocytic skin tumors.

Histologinių odos pjūvių paruošimasPreparation of histological skin sections

Parafininis formalinu fiksuoto audinio stulpelis pjaustomas 3 μητι storio pjūviais mikrotomu. Tada pjūviai panardinami į karšto vandens vonelę, perkeliami ant mikroskopavimo stikliuko ir išdžiovinami karštoje orkaitėje.Paraffinic formalin fixed tissue column is cut into 3 μητι thickness microtome. The incisions are then immersed in a hot water bath, transferred to a microscope slide and dried in a hot oven.

Ex vivo konfokali atspindžio mikroskopijaEx vivo Confocal Reflection Microscopy

Ex vivo konfokaliai atspindžio mikroskopijai atlikti naudojami histologiniai odos pjūviai. Šiuo metodu jie tiriami Nikon “Eclipse ΤΕ2000Γ mikroskopu, turinčiu C1si konfokalią skenavimo sistemą (objektyvas: x60 Plan Apo VC oil, 1.4 skaitinė apertūra). Apšvietimui naudojamas 515 nm bangos ilgio argono jonų lazeris, atspindžiui aptikti -standartinis 12 bitų RGB detektorius ir 500-530 nm praeinamumo filtras. Vaizdas apdorojamas programine jranga Nikon EZ-C1 Bronze version 3.80 ir ImageJ 1.45.Histological skin incisions are used for ex vivo confocal microscopy. With this method, they are tested on a Nikon Eclipse ΤΕ2000Γ microscope with C1si confocal scanning system (lens: x60 Plan Apo VC oil, 1.4 numerical aperture). For illumination use a 515 nm wavelength argon ion laser, a standard 12-bit RGB detector for detection and a 500-530 nm pass-through filter. Image processing software Nikon EZ-C1 Bronze version 3.80 and ImageJ 1.45.

Gavus histologinių odos pjūvių konfokalius vaizdus atliekamas šių pjūvių imunohistocheminis tyrimas.Immunohistochemical examination of these sections is performed after receiving histological images of the cutaneous confocal sections.

Imunohistocheminiai tyrimaiImmunohistochemical studies

Imunohistocheminiai tyrimai su monokloniniais pelės antikūnais melanosomai (HMB45) ir Melan-A atliekami naudojant multimerinę technologiją, pagrįstą detekcijos sistema ultraView Universal DAB (Ventana, Tucson, AZ). HMB45 (klonas HMB45; DAKO, Glostrup, DK) ir Melan-A antikūnai (klonas A103; DAKO, Glostrup, DK) padengiami naudojant 1:200 tirpalo praskiedimą (ekspozicijos trukmė 32 minutės), po to seka automatinis imunodažymas Ventana BenchMark Ultra (Ventana, Tucson, AZ) ir ląstelių kondicionavimas (standartinis kondicionierius CC1) 95 °C 64 minutes.Immunohistochemical studies with monoclonal mouse antibodies melanosomes (HMB45) and Melan-A are performed using multimeric technology based on detection system ultraView Universal DAB (Ventana, Tucson, AZ). HMB45 (clone HMB45; DAKO, Glostrup, DK) and Melan-A antibodies (clone A103; DAKO, Glostrup, DK) are coated using a 1: 200 dilution solution (exposure time 32 minutes) followed by autoimmune Ventana BenchMark Ultra (Ventana , Tucson, AZ) and Cell Conditioning (Standard Conditioner CC1) 95 ° C for 64 minutes.

Ex vivo odos konfokalios odos mikroskopijos ir histologijos preparatų vaizdų analizėEx vivo analysis of skin confocal skin microscopy and histology images

Kadangi tiriant odą in vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos būdu negalima pasakyti, kuri ląstelė yra keratinocitas, o kuri melanocitas, atlikome odos histologinių pjūvių ex vivo konfokalios mikroskopijos ir imunohistocheminius tyrimus, kad būtų galima įverinti melanocitų atspindį.Because in vivo skin confocal microscopy confocal reflection can not tell which cell is keratinocyte, and which melanocyte, we performed ex vivo confocal microscopy and immunohistochemical examinations of skin histological increments to evaluate melanocyte reflection.

Atlikta sveikos odos (Fig. 1), Spitz apgamo (Fig. 2) ir odos melanomos (Fig. 3) ex vivo konfokali atspindžio mikroskopija. Gauti vaizdai (Fig. 1-3 A) gretinti su imunohistocheminiais vaizdais (Fig. 1-3 B). Rodyklėmis pažymėti melanocitai. Jų citoplazmos ir branduolio atspindys vertintas lyginant su keratinocitų atspindžiu.Ex vivo confocal microscopy of healthy skin (Fig. 1), Spitz birthmark (Fig. 2) and skin melanoma (Fig. 3) was performed. The obtained images (Fig. 1-3A) are compared with immunohistochemical images (Fig. 1-3B). The arrows are marked with melanocytes. Their cytoplasm and nucleus reflection was evaluated in comparison to the reflection of keratinocytes.

Apgamo ląstelės (nevomelanocitai) turi kontrastuojančius branduolius, o citoplazmos kontrastas tiriant konfokaliu atspindžio mikroskopu yra neryškus, tiesiogiai koreliuoja su stipresne HMB45 reakcija (dešinėje nuotraukoje teigiama nevomelanocitų reakcija nudažo citoplazmą ruda spalva). Rodyklėmis pažymėti melanocitai yra hipokontrastiniai tiriant konfokaliu atspindžio mikroskopu, palyginti su aplink išsidėsčiusiais keratinocitais.Cytoplasmic cells (nevomelanocytes) have contrasting nuclei, and the contrast of cytoplasm by confocal reflection microscopy is blurred, directly correlated with a stronger HMB45 reaction (in the right picture a positive nevomelanocyte response stains the cytoplasm brown). The arrowheaded melanocytes are hypocontrastic by confocal reflection microscopy compared to the around keratinocytes.

Ex vivo konfokalios atspindžio mikroskopijos metodais vaizdinami tiek odos keratinocitai, tiek ir melanocitai, o kartu su imunohistocheminiais metodais įvertinamas odos melanocitų atspindys ir sveikoje odoje, ir melanocitiniuose odos navikuose.Ex vivo confocal reflection microscopy is used to visualize both skin keratinocytes and melanocytes, and in combination with immunohistochemical methods to evaluate skin melanocyte reflection in both healthy skin and melanocytic skin tumors.

Remiantis atlikto tyrimo rezultatais, kad epidermio sluoksnyje tarp keratinocitų išsidėstę melanocitai dažniau buvo hipokontrastiniai nei ryškiai kontrastuojantys, kontrastuojantis branduolys buvo matomas tiek sveikos odos melanocituose, tiek apgamo nevocituose, o melanomos ląstelės (atipiniai melanocitai) buvo tiek hipo-, tiek ižo-, tiek hiperkontrastinės keratinocitų atžvilgiu, daroma išvada, kad melanocito citoplazmos atspindžio savybės skiriasi priklausomai nuo melanosomų brandumo stadijos. Nebrandžias (I-II stadijos) melanosomas turintys melanocitai gali turėti tiek hipokontrastinę, tiek šviesai pralaidžią citoplazmą bei kontrastuojantį branduolį.According to the results of the study, melanocytes, which are located between keratinocytes in the epidermis layer, were more likely to be hypocontrast than brightly contrasting, the contrasting nucleus was visible both in healthy skin melanocytes and in the non-cytotoxic, and melanoma cells (atypical melanocytes) were both hypo-, tertiary, and hypertrophic. for keratinocytes, it is concluded that the properties of melanocyte cytoplasm reflection differ according to the maturity of melanosomes. Melanocytes with non-invasive (stage I-II) melanocytes may have both a hypocontrast and a light-transmissive cytoplasm and a contrasting nucleus.

LITERATŪRA 1. Bušam KJ, Charles C, Lohmann CM, Marghoob A, Goldgeier M, Halpern AC. Detection of intraepidermal malignant melanoma in vivo by confocal scanning laser microscopy. Melanoma Res. 2002 Aug; 12(4):349-55. 2. Gerger A, VViltgen M, Langsenlehner U, Richtig E, Hom M, Weger W, et ai. Diagnostic image analysis of malignant melanoma in in vivo confocal laser-scanning microscopy: A preliminary study. Skin Res Technol. 2008 Aug;14(3):359-63. 3. Rajadhyaksha M, Grossman M, Esterovvitz D, Webb RH, Anderson RR. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin: Melanin provides strong contrast. J Invest Dermatol. 1995 Jun;104(6):946-52. 4. Bušam KJ, Charles C, Lee G, Halpern AC. Morphologic features of melanocytes, pigmented keratinocytes, and melanophages by in vivo confocal scanning laser microscopy. Mod Pathol 2001;14(9):862-8. 5. Scope A, Benvenuto-Andrade C, Agero AL, Malvehy J, Puig S, Rajadhyaksha M, et ai. In vivo reflectance confocal microscopy imaging of melanocytic skin lesions: Consensus terminology glossary and illustrative images. J Am Acad Dermatol. 2007 Oct;57(4):644-58. 6. Naoki Oiso and Akira Kavvada (2011). The Stage of Melanogenesis in Amelanotic Melanoma, Melanoma in the Clinic - Diagnosis, Management and Complications of Malignancy, Prof. Mandi Murph (Ed.), ISBN: 978-953-307-571-6, InTech, DOI: 10.5772/18628.LITERATURE 1. Bush, KJ, Charles C, Lohmann CM, Marghoob A, Goldgeier M, Halpern AC. Detection of intraepidermal malignant melanoma in vivo by confocal scanning laser microscopy. Melanoma Res. August 2002; 12 (4): 349-55. 2. Gerger A, Viltil M, Langsenlehner U, Richtig E, Hom M, Weger W, et al. Diagnostic image analysis of malignant melanoma in vivo confocal laser scanning microscopy: A preliminary study. Skin Res Technol. August 2008; 14 (3): 359-63. 3. Rajadhyaksha M, Grossman M, Esterovvitz D, Webb RH, Anderson RR. In vivo confocal scanning laser microscopy of human skin: Melanin provides strong contrast. J Invest Dermatol. 1995 Jun; 104 (6): 946-52. 4. Bush Bush, Charles C, Lee G, Halpern AC. Morphologic features of melanocytes, pigmented keratinocytes, and melanophages by in vivo confocal scanning laser microscopy. Mod Pathol 2001; 14 (9): 862-8. 5. Scope A, Benvenuto-Andrade C, Agero AL, Malvehy J, Puig S, Rajadhyaksha M, et al. In vivo reflectance confocal microscopy imaging of melanocytic skin lesions: Consensus terminology glossary and illustrative images. J Am Acad Dermatol. 2007 Oct; 57 (4): 644-58. 6. Naoki Oiso and Akira Kavvada (2011). The Stage of Melanogenesis in Amelanotic Melanoma, Melanoma in the Clinic - Diagnosis, Management and Complications of Malignancy, Prof. Mandi Murph (Ed.), ISBN: 978-953-307-571-6, InTech, DOI: 10.5772 / 18628.

Claims (13)

IŠRADIMO APIBRĖŽTISDEFINITION DEFINITION 1. Odos melanocitų vaizdinimo odoje sistema, apimanti: (a) konfokalaus atvaizdo mikroskopą, skirtą odos melanocitų vaizdinimui; (b) imunohistochemines reakcijas, skirtas melanocitų brandumui nustatyti; (c) kompiuterį, skirtą skaitmeninei vaizdų analizei, besiskirianti tuo, kad melanocitai, kaip įvairaus brandumo ląstelės, yra identifikuojamos skaitmeniniuose vaizduose pagal melanosomų šviesos intensyvumo charakteristikas.A skin melanocyte imaging system comprising: (a) a confocal image microscope for imaging skin melanocytes; (b) immunohistochemical reactions to determine the maturity of melanocytes; (c) a computer for digital image analysis, characterized in that melanocytes, as cells of various maturity, are identified in digital images according to the light intensity characteristics of melanosomes. 2. Sistema pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad kompiuterio skaitmeniniais vaizdais pateikiamos melanocitų citoplazmos atspindžio savybės priklauso nuo melanosomų brandumo stadijos.2. The system of claim 1, wherein the melanocyte cytoplasm reflection properties of the computer digital images depend on the maturity of the melanosomes. 3. Sistema pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad sistema yra pritaikyta diferencijuoti melanosomas pagal melanocito citoplazmą, turinčią nebrandžias I-II stadijos melanosomas, kuri yra pralaidi šviesai, o branduolys -kontrastuojantis.3. The system according to claim 1 or 2, characterized in that the system is adapted to differentiate melanosome according to the melanocyte cytoplasm containing non-mature I-II melanosome, which is permeable to light and the nucleus is contrasting. 4. Sistema pagal bet kurį iš 1 - 3 punktų, besiskirianti tuo, kad sistema yra pritaikyta diferencijuoti melanosomas pagal melanocito citoplazmą, turinčią brandžias III-IV stadijos melanosomas, kurios pasižymi stipriomis šviesą laužiančiomis savybėmis, kuri yra šviesi, o branduolys - tamsus.4. The system according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the system is adapted to differentiate the melanosome according to the melanocyte cytoplasm having mature melanosomes of stage III-IV, which have strong light-breaking properties which are bright and the nucleus is dark. 5. Odos melanocitų vaizdinimo odoje sistemos pagal 1 punktą panaudojimas melanocitų atspindžio savybėms nustatyti, siekiant gautą informaciją panaudoti paciento būsenos įvertinimui arba stebėjimui in vivo KAM, kur panaudojimas apima: (a) konfokalaus atvaizdo mikroskopo, skirto odos melanocitų vaizdinimui, panaudojimą; (b) imunohistocheminių reakcijų, skirtų melanocitų brandumui nustatyti, panaudojimą; (c) kompiuterio, skirto skaitmeninei vaizdų analizei, panaudojimą; besiskiriantis tuo, kad melanocitai, kaip įvairaus brandumo ląstelės, yra identifikuotos skaitmeniniuose vaizduose pagal melanosomų šviesos intensyvumo charakteristikas.The use of a skin melanocyte imaging system according to claim 1 for determining melanocyte reflectance properties for use in evaluating a patient's condition or in vivo monitoring for use in a CAM, the use of which comprises: (a) using a confocal image microscope for imaging skin melanocytes; (b) using immunohistochemical reactions to determine the maturity of melanocytes; (c) using a computer for digital image analysis; characterized in that melanocytes, as cells of various maturity, are identified in digital images according to the light intensity characteristics of melanosomes. 6. Panaudojimas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad kompiuterio skaitmeniniais vaizdais pateikiamos melanocitų citoplazmos atspindžio savybės priklauso nuo melanosomų brandumo stadijos.Use according to claim 5, characterized in that the melanocyte cytoplasm reflection properties of the computer digital images depend on the maturity of the melanosomes. 7. Panaudojimas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad sistema yra pritaikyta diferencijuoti melanosomas pagal melanocito citoplazmą, turinčią nebrandžias I-II stadijos melanosomas, kuri yra pralaidi šviesai, o branduolys -kontrastuojantis.Use according to claim 5, characterized in that the system is adapted to differentiate melanosome according to the melanocyte cytoplasm containing non-mature I-II melanosome, which is permeable to light and the nucleus is contrasting. 8. Panaudojimas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad sistema yra pritaikyta diferencijuoti melanosomas pagal melanocito citoplazmą, turinčią brandžias III-IV stadijos melanosomas, kurios pasižymi stipriomis šviesą laužiančiomis savybėmis, kuri yra šviesi, o branduolys - tamsus.8. Use according to claim 5, characterized in that the system is adapted to differentiate melanosome by melanocyte cytoplasm having mature melanosomes of stage III-IV, which have strong light-breaking properties which are bright and the nucleus is dark. 9. Panaudojimas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad būsena yra sveika oda.9. The use according to claim 5, wherein the condition is healthy skin. 10. Panaudojimas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad būsena yra melanocitinis odos navikas.10. The use according to claim 5, wherein the condition is a melanocytic skin tumor. 11. Panaudojimas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad melanocitinis odos navikas yra keratoma, melanoma, apgamas, lentigo.11. Use according to claim 10, wherein the melanocytic skin tumor is keratoma, melanoma, moles, lentigo. 12. Panaudojimas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad melanocitinis odos navikas yra apgamas.12. Use according to claim 11, wherein the melanocytic skin tumor is a birthmark. 13. Panaudojimas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad melanocitinis odos navikas yra melanoma.13. Use according to claim 11, wherein the melanocytic skin tumor is melanoma.