KR960011522B1 - 리파아제 및 리파아제 추출물, 그들의 제조방법 및 이를 함유한 지방물질 흡수기능장애 치료용 약제 - Google Patents

Abstract

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Description

리파아제 및 리파아제 추출물, 그들의 제조방법 및 이를 함유한 지방물질 흡수기능장애 치료용 약제

본 발명은 리파아제 활성을 보유하는 효소 및 이를 함유하는 추출물에 관한 것으로서, 이들은 산성 또는 중성에 가까운 배지내에서 안정하고 활성이 있는 생성물인 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 그들의 제조방법과 약제의 형태로 치료에 이용되는 그들의 용도에 관한 것이다.

가수분해효소에 속하는 이들 리파아제는 박테리아, 진균류, 식물 및 동물처럼 서로 다른 유기체들내에서 발견된다. 생물체내에서 그들의 중요한 작용은 소화 현상을 연구중이던 1900년경에 알려졌다.

사람 및 동물에게 중요한 에너지원이 되는 식품중 대표적인 지방성 물질이 동화작용(assimilation)을 수행하기 위해서는 이들 효소의 작용이 필수적임이 입증되었다. 실제로 그들의 이러한 특성은 치료목적으로 이용되어 왔다.

사람 및 일반적인 포유동물을 대상으로 많은 연구가 실시되어 왔다. 그 결과 소화 현상에 있어서, 이 효소가 필수적인 촉매 기능을 갖고 있음이 발견되었으며, 특히 이때 이 효소는 소화 작용시 유화되거나 비유화된 지방을 가수분해시키는데 관여한다. 상기 비유화 지방은 트리글리세라이드 경우에서 글리세롤과 같이 단일 작용성 알코올 또는 다 작용성 알코올과 다양한 분자량의 지방산 사이에서 형성된 에스테르로부터 주로 형성된다. 이러한 효소계가 결핍하거나 결핍되면 흡수기능 장애가 유발되며, 때로는 상당한 체중감소 및 현저한 식욕 불량 상태와 같은 심각한 결과를 초래할 수 있다. 이러한 상태는 어린이는 물론 성인에게도 나타날 수 있으며, 이들 환자의 자연적인 리피아제 결핍증세(lipase deficincies)를 보완코저 외인성의 효소계를 치료에 사용할 수 있음이 입증되었다. 사용되는 조성물에는 동물 기관의 추출물을 포함하는데 이 추출물은 리파아제를 분비하여, 정상적으로 유기체내에서 지방의 동화 작용을 할 수 있도록 체내에서 작용한다. 이러한 기관은 구강-위-장 관계내에서 서로 다른 레벨로 분포되어 있으며, 가장 널리 공지된 것은 구강 및 췌장에 분포한 기관들이다.

포유동물의 구강 분비물은 지방산 에스테르를 가수분해할 수 있는 효소를 상당량 포함하고 있다. 이들은 위(胃)의 선구 에스테라제 및 구강 리파아제로서, 가수분해성기질 또는 비가수분해성 기질상에 작용하는 이들의 활성 용량에는 약간의 차이가 있을 뿐이지 동일한 효소이다.

J. H. Nelson 등은 이 효소를 및 그들의 특성에 관한 많은 연구를 실시했다(Journal of Dairy Science, 1976, 60(3), pp. 327-362). 특히, 이유하지 않은 어린 동물에 있어서 이들의 존재 및 유용성이 입증되었다. 송아지, 어린염소,어린양에게서 얻어진 위의 선구 에스테라제의 판매가 상당한 실적으로 올리고 있다. 이들은 송아지의 설사치료용 수의약제로서, 처음에는 액체 추출물 및 농축된 분말 형태로 시판되었지만 현재는 농축분말 형태로 시판되고 있다. 또한 이 제품은 미합중국 특허 제3256150호(이 특허는 분말형의 조성물을 경구투여하여 흡수기능 이상증세를 치료하는 방법에 관한 것이다)에 설명된 바와 같이 사람의 치료용으로도 사용되고 있다. 이 조성물은 부분적으로 이유하지 않은 상태의 동물의 구강에서 얻어지는 식용 조직을 포함하며, 더 바람직하게는 송아지, 어린염소, 또는 어린양의 혀 및 그 인근 조직을 포함한다. 후자를 사용하는 경우 다량의 기관을 얻기 위해서는 식용목적으로 많은 어린 동물을 희생시켜야 하므로 그 실시가능성이 매우 낮고, 비경제적이기 때문에 상업적으로 성공을 이끌지는 못했다.

실시면이나 경제적인 문제를 해결하기 위해, 영국 특허 제2 142 337호는 리파아제 결핍 증세를 치료하기 위해, 쥐 또는 사람의 혀 리파아제(lingual lipase)를 제안하고 있다. 이 효소는 유전 공학적 기법에 의해 제조된다.

십이지장 단계에서, 췌장액내의 리파아제 또한 부분적으로 분해되었거나 분해되지 않은 지방물질을 동화시키는데 매우 유용한 활성을 나타낸다. 따라서 췌장에서 효소 분비가 결핍하면 흡수기능 장애(malabsorption phenomena)가 유발되며, 지방물질의 소화 및 동화작용에 이상을 초래한다. 사람에게 있어서, 구강경로로 투여되는 췌장대체 약제는 동물의 췌장을 주성분으로 하는 조성물의 형태로 시판된 것이 있으며, 이때 사용되는 동물들은 그들이 섭취하는 음식물이 사람의 것과 유사한 돼지, 소 같은 초식동물이다. 그러나 1973년 군터 코르데스(Gunter Cordes)에 의해 이들 효소의 특성을 연구한 결과에 의하면, 상기한 치료 방법들은 신뢰도가 없음이 입증되었다. 이러한 기관의 효소계는 37℃의 산성 매체내에서 급격히 파괴되어 비활성화되며, 또한 위까지 전달되는 동안 그들의 활성을 유지하는 것은 불가능하다. 이러한 약제의 활성을 보존키 위한 해결방안이 제시되었다. 영국 특허 제1 139 991호는 제산제 특성을 갖는 염과 화합시킨 췌장 효소를 포함하고 있는 조성물을 제시한바 있는데, 이때 상기 염의 기능은 자연적인 위산도를 감소시키므로써 효소 전달 과정중에 효소의 특성을 보존시키는 것이다. 동일한 방법으로 시메티딘(cimetidine)같은 H2 수용체의 결합체 화합물을 사용하는 방법이 Regan P.T. 등(1978), Hubbar V.S 등(1980) 및 Gon P., Bradbear 등(1981)에 의해 제안되었다.

또한 효소의 활성을 보존하기 위해 위-내성(gastro-resistant) 필름으로 약제를 코팅하여 장의 매체내에서 용해되어 주활성 성분을 십이지장내로 방출하도록 하거나, 최근에는 직경 3㎜ 정도의 마이크로스피어(microspheres)중에 효소약제를 혼입시켜 사용하는 방법 등 다각적인 시도가 행해지고 있다. 그러나, 이들 방법은 일시적인 해결책에 지나지 않으며, 환자에게 부작용 또는 미확인 효능 등을 나타낼 위험 부담을 안고 있다.

즉 췌장 질병은 장기간의 치료를 요하는 경우가 많고, 이때 상기 방법들을 적용하면 위산도를 반복하여 저하시키게 됨으로써 박테리아 및 그들의 증식에 대한 고유의 방어기능이 부분적으로 감소될 우려도 있다. 이러한 사실은 식이성 중독성의 경우에서 나타나는 것으로 Weber A.M.에 의해 1982년에 설명되었다.

이들 생성물을 코팅하는 방법 또한 특정경우, 즉 췌장기능 부전증 같은 것으로 인해 위-장관내에 비정상적인 pH가 형성되어서, 위-보호막이 바람직한 위치에서 용해되지 않을 수도 있으므로 사용시 완전한 안전성을 보장할 수 없다.

종이 다른 동물의 위 내용물중에 리파아제 활성이 존재함이 지적되어 왔다. 이러한 활성의 기원에 관해서는 오랜동안 논란이 있어 왔으며, 타액에 의해 전달된 구강 분비물 때문이거나 췌장액이 십이지장으로 역류했기 때문이라는 설도 있다. 그러나 최근에 Fink C.S. 등(Am. J. Physiol., 1985, 248, pp. 68-72)은 토끼의 위액샘의 분산상태로 보아 리파아제 활성이 pH 5.8 내지 6.1에서 최대라고 설명하였다. 참고문헌(Chemical Abstracts, Vol 97, No. 15, 11. 10. 1982, p. 477, No. 1248320, Columbus, Ohio, U.S.A.)에 의하면, 이유했거나 이유하지 않은 어린 토끼의 위장에서 지방분해 활성이 나타났다고 보고되었다. 이 활성은 pH 7에서 최대치를 나타낸다. 특허출원 WO 86/01532는 리파아제의 결핍증세를 치료하는데 유용한, 사람의 위 리파아제에 상응하는 단백질을 유전 공학에 의해 제조하는 방법을 제시하고 있다.

리파아제에 대한 연구 및 이들을 사용한 여러 실험을 통해 이 효소의 중요성이 명백히 밝혀졌으며, 비록 이들의 분포가 포유동물의 특정 기관 및 분비물내로 한정되어 있음이 입증되었고, 유기체가 지방물질을 동화하기 위해서는 이들의 작용이 필수요소임이 인식되었을지라도, 사실상 기술적이고 경제적으로 가치있는 제조방법으로 제조되며, 지방물질 특히 트리글리세라드를 구강-위-장(bucco-gastro-intestinal tract)을 통해 동화시킬 수 있는 리파아제 또는 리파아제 조성물은 종래 기술에서는 제안된 바 없다.

본 발명은 산성배지내에서 시간이 경과되어도 활성이 변하지 않으며, 구강-위-장의 산도(acidity), 즉 pH가 3 내지 7인 배지내에서 글리세라이드류를 효과적으로 가수분해시킬 수 있는 라파아제 및 리파아제 추출물을 개발함으로써 종래 기술의 문제점을 해결하였다. 종래 기술에 의한 생성물과 비교하는 경우, 본 발명의 생성물은 특히 치료학상으로 소화 과정중에 그들의 기능이 구강과 십이지장 사이의 경로를 따라 트리글리세라이드류를 확실히 가수분해한다는 점에서 부인할 수 없는 장점이 있으며, 또한 다량의 원료를 저렴한 가격으로 용이하게 구입할 수 있다는 장점도 갖고 있다.

본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리파아제 추출물 또는 리파아제의 제조 방법에 관한 것이다 :

a) 리파아제 추출물을 수득하기 위한 방법을 하기 단계를 포함한다 :

㉠ 성체인 토끼 또는 말의 위저부(stomach fundus) 1중량부와 pH 1.5 내지 5로 산성인 수성 배지 1-10 부피부를 4 내지 30℃에서 1분 내지 15시간 동안 접촉시킨 후, 리파아제 부분을 포함하는 수용액과 고형물질을 수득하는 단계;

㉡ 상기 고형물질로부터 수용액을 분리하여 분리 수용액을 수득하는 단계;

㉢ 상기 분리 수용액에 적당량의 수용성염을 첨가하고, 목적하는 리파아제 추출물이 염석되기 충분한 시간동안 정치시켜 상청액을 수득하는 단계; 및

㉣ 상기 상청액으로부터 목적하는 리파아제 추출물을 분리 및 수거하는 단계.

b) 탈염된 리파아제 추출물을 수득하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다 :

㉠ 수성상에 상기 리파아제 추출물을 용해시키는 단계 :

㉡ 차단 한계치(cutoff threshold)가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 상기 수성상을 여과하여 탈염된 리파아제 추출물 용액을 수득하는 단계; 및

㉢ 상기 탈염된 리파아제 추출물 용액을 동결 건조하여 탈염된 리파아제 추출물을 수득하는 단계.

c) 탈지된 리파아제 추출물을 수득하기 위한 방법은 위저부로 구성된 상기 리파아제 추출물을 함유하는 고형부분, 리파아제 추출물 및 탈염된 리파아제 추출물중 하나로 탈지 공정을 실시하는 단계를 포함한다.

d) 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물을 수득하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다 :

㉠ pH가 2 내지 7인 완충제중에 상기 리파아제 추출물을 용해시켜 완충용액을 수득하는 단계;

㉡ pH가 2 내지 7인 상기 완충용액을 배제 한계치(exclusion limit)가 1,000,000달톤 이상인 분자체상에서 크로마토그래피하고, 완충용액중의 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물을 함유하는 배제된 용출 분획분을 수거하는 단계;

㉢ 상기 배제된 용출 분획분을 차단 한계치가 10,000달톤인 막상에서 여과하여 탈염된 분획분을 수득하는 단계; 및

㉣ 상기 탈염된 분획분을 동결 건조하여 목적하는 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계.

e) 탈지된 농축 리파아제 추출물을 수득하기 위한 방법 e1) 또는 방법 e2)는 각각 하기 단계를 포함한다 :

e1) ㉠ 상기 리파아제 추출물을 물에 용해시켜 리파아제 추출물을 함유하는 수용액을 수득하는 단계;

㉡ 상기 리파아제 추출물을 함유하는 수용액을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 여과하여 염이 없는 용액을 수득하는 단계;

㉢ 상기 염이 없는 용액을 이온 교환 지지체상에 흡착시키는 단계;

㉣ 이온세기가 시간을 함수에 따라 점차 증가하는 용출제로 지지체를 탈착시킨 후, 리파아제 활성을 보유하며, 탈지된 농축 리파아제 추출물을 포함하는 용출 분획분을 수거하는 단계;

㉤ 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 상기 리파아제 활성을 보유하는 용출 분획분을 여과하여 탈염된 용출 분획분을 수득하는 단계; 및

㉥ 이 탈염된 용출 분획분을 동결 건조하여 목적하는 탈지된 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계, 또는

e2) ㉠ 상기 방법 d)에서 수득한 pH가 2 및 7인 완충용액을 분자체상에서 크로마토그래피하는 단계;

㉡ 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 55,000달톤인 체류된 용출 분획분을 수거하는 단계;

㉢ 상기 농축된 리파아제 추추물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 50,000인 체류된 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 여과하여 탈염 탈지된 농축 리파아제 추출물 용액을 수득하는 단계; 및

㉣ 상기 용액을 동결 건조하여 목적하는 탈지된 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계.

f) 리파아제를 수득하기 위한 방법 f1) 또는 방법 f2)는 각각 하기 단계를 포함한다 :

f1) ㉠ 상기 방법 e1)에서 수득한 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며, 리파아제 활성을 보유하는 용출 분획분을 사용하여 분자체상에서 크로마토그래피하는 단계;

㉡ 분자량이 45,000 내지 50,000달톤이며, 리파아제를 함유하는 용출 분획분을 수거하는 단계;

㉢ 상기 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 여과하여 리파아제를 함유하는 탈염된 용액을 수득하는 단계; 및

㉣ 리파아제를 함유하는 상기 탈염된 용액을 동결 건조하여 목적하는 리파아제를 수득하는 단계, 또는

f2) ㉠ 상기 방법 e2)에서 수득한 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 55,000달톤에 해당하는 용출 분획분을 이온 교환 지지체에 흡착시키는 단계;

㉡ 이온세기가 시간의 함수에 따라 증가하는 용출제로부터 지지체를 탈착시키는 단계;

㉢ 리파아제를 함유하며, 리파아제 활성을 나타내는 용출 분획분을 수거하는 단계;

㉣ 상기 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 여과하여 리파아제를 포함하는 탈염된 용출 분획분을 수득하는 단계; 및

㉤ 상기 리파아제를 함유하는 탈염된 리파아제를 수득하는 단계.

본 명세서에서 사용한 탈지된(delipidated)이란 용어는 본 발명에 따른 리파아제를 지방이 배제된 상태로 포함하고 있는 생성물을 의미한다. 본 발명은 필수적으로 리파아제 특이활성(specific activity)이 1 내지 100U/mg 단백질인 추출물을 수득할 수 있는 추출 방법 A 및 상기 추출물을 토대로 특이활성이 100U/mg 단백질 이상인 농축 리파아제 분획분을 수득할 수 있는 분리방법 B 및 특이활성이 거의 1,000U/mg 단백질인 순수한 리파아제를 수득하기 위한 최종 정제 방법을 포함한다. 이하, 기관 표본을 선택적으로 채취하는 단계 뿐 아니라 상기한 본 발명의 방법 A 및 방법 B를 기술한다.

본 발명의 방법은 성체인 토끼를 사용하는 방법으로, 이를테면 생후 1개월 이상, 바람직하게는 생후 2개월 이상된 토끼를 이용한다. 이들은 성체(adult-sized)이므로 식용으로도 가능하며, 위를 제거하여도 그의 상업적 가치는 감소하지 않는다. 본 발명은 이유하거나 이유하지 않은 어린 토끼의 위는 사용하지 않는데, 이러한 토끼들의 리파아제는 본 발명에 따른 리파아제의 최적 pH와 상이한 pH에서 최대의 리파아제 활성을 나타내며, 토끼의 크기가 작기 때문에 위장의 크기도 작고, 희생된 토끼의 판매가 불가능하다는 점등 원가면에서 바람직하지 않은 요인을 많이 지니고 있기 때문이다.

같은 이유로 성체인 말, 특히 생후 1년 이상, 바람직하게는 생후 3년 이상된 말의 위를 사용한다.

토끼의 경우 목적하는 리파아제는 위저부에서 주로 발견되며, 그 위치는 안트럼(antrum)의 하부에서 부터 위의 상부까지라는 것이 밝혀졌다. 또한 리파아제는 위저부의 만곡부(the greater curvature of the fundus)의 상부에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 따라서 토끼의 전(全) 위 또는 가장 큰 만곡 부위의 상부를 덮는 위의 일부를 이용할 수 있다. 말의 경우도 리파아제가 저부에 주로 존재하기 때문에 상기와 동일한 논리가 적용된다. 저부(fundus)란 위의 돌출된 부위이므로, 나머지 부분으로부터 이를 절단이 매우 용이하며, 수거, 저장, 수송 작업 등도 용이하다.

상기 기관의 이러한 표본 준비는 선택적이며, 이러한 과정은 위의 준비, 조직의 선택, 단편화(fragmentation) 및 탈지 작업으로 구성된다. 이러한 처리 방법의 선택은 입수한 기관의 특성 및 상태에 따라 결정되며, 특히 목적하는 리파아제 생성물의 순도 및 질에 의해서도 결정된다. 예를 들어 다음 도표는 바람직한 과정 및 예비 작업의 순서도이다.

[방법 A]

우선 예비작업 과정은 도살장에서 수거된 위로부터 존재하는 불순물 및 오염물질, 그리고 인접기관들(식도, 소자, 비장)을 제거하고, 그후 임의로 안트럼을 분리 및 제거하는 단계로 구성된다. 조직들은 단편화하기 전에 냉동시켜 -20℃로 유지시킨다. 단편화 작업은 수동으로 할 수 있으며, 기구를 이용하여 최대 크기가 5cm 정도 또는 그 이하인 불균칙한 크기의 단편을 수득할 수 있다.

탈지 단계는 본 발명의 방법을 수행하는 과정에서 수득한 조직 또는 고체 추출물을 저분자량의 케톤 및 알콜과 같은 비등점이 낮은 친수성 용매를 이용하여 마쇄 또는 추출하므로써 균질화하는 단계로 구성된다. 임의의 경우, 아세톤이 가장 일반적으로 사용되는 용매이며, 처리된 생성물을 탈수시키며, 부분적으로 탈지시킬 수 있다.

본 발명에 따른 균질화 작업 및 생성물의 제조 과정중에 실시된 모든 작업들은 25℃ 이하, 그리고 바람직하게는 10℃ 이하의 온도에서 실시되는데, 이는 활성 주성분의 변성을 최대한 방지하기 위함이다. 이러한 비가역적 변성현상은 추출조건 및 사용되는 용매의 작용에 의한 화학적이거나 생리화학적인 현상이다.

일반적으로 기관을 마쇄시켜 균질화하기 위해서는, 처리하려는 생성물 1중량부에 대해 용매 1 내지 10부를 사용한다. 마쇄 과정은 크기가 2mm 미만인 조직입자로 구성된 분자산체를 얻기 위해 Warring blender형의 효율적인 장비를 사용하여 25℃ 이하의 온도에서 실시한다. 상기 장비를 사용하여 10,000 내지 30,000rpm의 속도에서 30초 내지 5분 동안 마쇄하면, 크기가 2mm 미만인 조직 입자로 구성된 분산체가 수득된다.

불용성 분획분은 경사분리, 여과 또는 원심분리로 분리한다. 일반적으로 약 50mbar 정도의 공업적 진공하에서 여과시키는 방법을 사용한다. 이 경우 수득된 분(粉)상의 불용성 물질을 탈지시켜, 균질한 조성을 갖게하여 직접 추출방법 A에 사용하거나, 약 25℃의 온도 및 약 20mbar의 진공하에서 잔류 용매를 제거한후, 더 효율이 높은 탈지 작업에 사용하거나, 본 발명의 방법에 의해 수득된 일부 탈지된 리파아제 추출물로서 임의로 사용할 수 있다.

이러한 작업은 탄화수소, 에테르, 케톤, 알콜 또는 카본 할라이드 같은 지방물질을 용해시킬 수 있는 용매들을 단독으로 또는 혼합물 상태로 사용하여 상기 생성물들을 바람직한 정도까지 탈지처리시키는 과정을 포함한다. 이들 용매는 그들의 비등점이 80℃ 또는 그 이하이므로 쉽게 제거시킬 수 있다. 이러한 용매에는 펜탄, 헥산, 석유에테르, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 카본 테트라클로라이드 및 디클로로에탄 등이 있다.

탈지 작업은 동일 용매 또는 다른 용매로 연속적으로 수차 추출 처리하여 적합한 정도로 탈지된 생성물이 수득될 때까지 동일한 처리 과정을 반복하는 것이다.

본 발명에 의해 제조된 고체상태의 리파아제 추출물내의 지방 함량은 상기 방법을 변형시킨 방법에 의해 정량한다. 100 내지 105℃에서 6시간 동안 생성물의 샘플을 건조시킨 후, 주변 온도에서 메탄올; 클로로포름의 혼합물(25 : 75v/v)을 사용하여 3시간 동안 지방을 추출한다. 불용물질은 여과하고, 용매은 증발시켜 제거한다. 초기 샘플 중량과 용매증발 후 수득한 잔여물 중량의 비교를 통해 지방 함량을 결정할 수 있으며, 일반적으로 지방 함량은 탈지된 추출물에 대해 1% 이하이다.

이러한 탈지정도는 최종 생성물에 부여되는 형태에 따라 결정되는데, 예를 들어 정제형이냐 분말형이냐에 따라 감각 수용성 정도에 차이를 나타내므로 그에 상응하는 생성물로 형성된다. 탈지정도는 종래의 시험법에 의해 모든 고온 추출성 지방물질을 정량한 후, 매번의 탈지 처리시 액체상의 표본 분획분을 추출하여 얻어진 냉각된 추출물의 양을 결정하여 최종 평가한다.

이 작업은 궁극적으로 적절한 장치중에서 처리를 요하는 물질 1중량부와 선택된 탈지용 용매 5 내지 100부를 혼합하고, 15초 내지 15분 동안 25℃ 이하의 온도에서 처리하는 단계를 포함한다. 탈지된 생성물은 용매로부터 여과 또는 원심분리로 분리하며, 바람직한 정도로 탈지하기 위해서는 동일한 방법을 수차례 적용하여 재처리할 수 있다.

더욱 바람직하게는 처리하려는 생성물 1중량부에 대해 아세톤, 에테르, 클로로포름 및 그들의 혼합물과 같은 바람직한 용매 5 내지 25부피부를 첨가하고, 0 내지 10℃의 온도에서 30초 내지 10분 동안 격렬하게 교반시킨다. 탈지 또는 부분탈지된 불용성 물질은 진공 여과로 분리한다. 불완전하게 탈지된 경우, 불용성 물질을 동일한 방법으로 재처리한다. 바람직한 정도로 탈지하기 위해, 상기 작업을 보통 2 내지 5회 재실시할 수 있다.

전술한 바와 같이, 리파아제의 특이활성이 1 내지 100U/mg 단백질인 본 발명의 생성물을 제조하기 위해서는 분리방법 A가 필수적이다. 이 방법 A는 전술한 작업에 의해 임의로 준비된 위를 산성인 수성 배지중에서 처리하는 단계를 포함한다. 이때 위전체를 사용할 수도 있으며, 또는 그들의 일부를 사용할 수도 있고, 또는 아세톤 같은 용매를 사용하여 마쇄후 균질시켜 얻어진 분말 물질을 사용할 수도 있으며, 이 분말 물질을 탈지된 형태로 사용할 수도 있다. 두번째 작업은 수용성 염을 첨가하여 리파아제 생성물을 염석시키는 단계를 포함한다.

더 명확히 설명하면, 산성인 수성 배지중에서의 추출 작업은 적합한 산 용액과 함께 상기 물질을 격렬하게 교반한 후, 여과, 원심분리 또는 임의로 경사분리하여 주활성 성분을 포함하는 액상을 분리하는 단계를 포함한다. 통상적으로 물질 1g에 대해 pH를 2 내지 4로 조정한 산 용액 1 내지 100ml를 사용한다.

상기 수성상의 산도는 적절한 pH를 얻기 위해 적합한 세기를 보유하는 산을 이용하여 조절한 pKa가 5이하인 강한 광물산 또는 유기산을 사용한다. 옥살산, 타르타르산, 말산, 구연산, 말레산, 포름산, 젖산 및 아세트산 또는 황산, 인산 및 염산이 가장 널리 사용된다.

이 작업을 조직 단편에 대해 실시하는 경우, 펩신같은 프로테아제를 첨가함으로써 산성인 수성 배지내로 리파아제가 추출되는 정도를 향상시킬 수 있다. 작업조건은 민감한 주활성 성분이 비가역적으로 변성되지 않도록 채택하여야 하며, 특히 25℃ 이상의 온도에서 변성되지 않도록 선택하여야 한다. 일반적으로, 추출단계는 사용하는 혼합기의 작업효율에 따라 0 내지 20℃의 온도에서 1분 내지 15시간 동안 구성분들을 격렬하게 혼합하여 수행한다.

바람직한 방법으로 처리하려는 물질 1g에 대해 pH를 2 내지 4±0.1로 조정한 염산 용액 3 내지 60ml를 사용한다 : pH 2인 용액은 물 2ℓ에 37% 염산 2.0ml를 가함으로써 수득할 수 있다.

이렇게 수득한 혼합물을 0 내지 20℃ 사이의 온도에서 5 내지 60분 동안 격렬하게 교반하여 균질화시킨다. 그후, 수성상은 여과, 경사분리 또는 원심분리하여 분리한다. 원심분리는 가장 적합한 조건, 즉 15분 내지 1시간 동안 온도 4 내지 20℃의 온도에서 3,000 내지 12,000rpm의 속도로 수행한다. 분리는 여과로도 가능하며, 이 경우 진공 또는 압력 여과 시스템을 사용하여 작업 속도를 증가시키는 것이 바람직하다.

따라서, 상기 혼합물은 한외여과, 냉동 및 동결 건조로 농축시켜, 고체 형태의 추출물을 수득할 수 있으며, 그후 전술한 방법에 따라 임의로 탈지시킬 수 있다.

이 경우, 우선 혼합물을 물-글리콜 혼합물 또는 고체 이산화탄소-아세톤 혼합물로 -20 내지 -70℃로 냉각시켜 냉동시킨다. 이러한 작업은 그 후속 단계인 동결 건조용 장비로 채택한 용기중에서 실시한다. 동결 건조 단계는 10^-1mbar 이하의 진공하에서 수행한다. 승화시켜 제거된 물을 -50℃ 이하의 온도에서 트랩을 사용해 응축시키고, 특히 암모니아 또는 프레온을 사용해 -80℃로 냉각시킨다.

수득한 무정형 탈수 생성물을 탈지 및 방법 A에 의해 추출하기 이전에 0℃ 이하의 온도에서 동결마쇄(cryogrinding)하여 냉각 분말화시킨다.

본 발명에 따른 모든 동결 건조 작업은 동일한 방법으로 실시한다.

방법 A의 두번째 작업은 전술한 작업과정중에 얻어진 산 수용액중에 포함된 리파아제 활성물질을 침전시키는 단계를 포함한다. 이 침전과정은 염석법에 의해 수행되는데, 이는 용액에 수용성 염을 첨가시키는 것이다. 양이온으로서 이들 염은 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 암모늄을 포함하며, 음이온으로서 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 및 설페이트를 포함한다. 그러나 바람직한 염들은 다가음이온, 특히 포스페이트와 설페이트의 조합물이다. 칼슘 및 바륨 같은 알칼리 토금속 양이온들은 단백질의 비가역적 변성을 일으키므로 제외된다. 바람직한 염은 암모늄 설페이트이다.

이때, 처리하려는 산용액 1ℓ에 대해 결정형 암모늄 설페이트 80 내지 700g을 0 내지 20℃의 온도에서 교반하면서 첨가한다.

염이 거의 완전히 녹을 때까지 계속 교반한다. 그후, 이 혼합물을 0 내지 20℃의 온도에서 정치시켜 활성 물질을 최대로 염석시키는 데는 15분 내지 20시간이 소요된다. 상기 용액은 통상적인 방법인 경사분리, 여과, 또는 원심분리로 제거한다.

특히 바람직한 방법으로는, 상기 염석 작업을 0 내지 10℃ 사이의 온도에서, 처리하려는 산 용액 1ℓ당 암모늄 설페이트 100 내지 600g을 첨가시켜 실시하는 것이다. 그리고 이 용액을 대략 10℃에서 30 내지 60분 동안 정지시켜, 리파아제 활성을 보유하는 불용성 물질을 적정량 침착시키고, 이를 4 내지 10℃의 온도 및 50mbar의 진공하에서 여과하거나, 3,000 내지 10,000rpm의 속도로 10 내지 45분 동안 원심분리하여 분리한다. 이렇게 수득한 생성물에는 활성물질 및 처리과정중에 투입된 여러 물질을 비롯한 각종 광물성염 및 다른 생물학적 물질들이 포함되어 있다.

이들은 공업적인 작업에 사용할 수 있다. 그러나 약학적인 작업을 위해서는, 부수적인 염을 제거할 필요가 있고, 이는 막여과(투석법 또는 한외 여과법)에 의해 이루어지며, 후자의 방법이 더 바람직하게 사용된다. 불용성 물질을 물에 재용해 시킨 후, 용액을 한외 여과시키되, 막에 물을 첨가시켜 생성물을 일정부피로 유지시키며, 막의 조직은 저분자량의 물질을 통과시킬 수 있는 것으로서 고분자량의 효소같은 생성물은 투과시키지 않고 체류된다.

염석으로 수득한 불용성 물질을 물에 용해시키고, 묽은 염산을 첨가하여 상기 용액의 pH를 2 내지 7로 조절하고, 상기 산 용액을 탈염용의 차단 선택성이 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 접선 순환(tangential circulation)시켜 한외여과한다. 본 발명의 방법에서 모든 탈염 작업은 동일한 방법으로 수행한다.

여과작업 동안 연동펌프를 사용하여 가능한 한 빠르게 일정한 유속을 유지할 수 있다. 그러나 막상에서 유체의 압력을 조절하여야 하며, 그 압력은 응집 현상을 일으키지 않도록 1bar 이상을 초과해서는 안된다. 이러한 조건하에서 200cm²막은 1시간당 2 내지 3ℓ의 여액을 처리할 수 있다.

여과후, 분자량이 막의 차단 선택 분자량 보다 큰 물질을 함유하는 체류된 산출물을 이미 언급한 방법 및 작업조건하에 대략 10²mbar의 높은 진공에서 전술한 장치로 한외여과하여 2 내지 5배 농축시키고, 그후 냉동 및 동결 건조시킨다.

상기 작업에 의해 본 발명의 생성물인 리파아제 특이활성이 1 내지 100U/mg 단백질인 추출물을 수득할 수 있다.

방법 B를 사용하여, 이러한 추출물들을 적절한 방법으로 처리하면 본 발명의 생성물인 농축 추출물 및 순수한 리파아제 분획분을 수득할 수 있다.

이 방법은 두 종류의 정제작업, 즉 유기 화합물의 특별한 이온화 능을 이용한 이온 교환 크로마토그래피와 적절한 지지체를 사용하여 분자량 및 크기가 상이한 화합물들은 분리할 수 있는 겔 여과법으로 구성되어 있다. 전술란 작업들이 탈지단계를 포함하지 않을 경우, 겔 여과법이 바람직하다.

리파아제 추출물이 이전 단계에서 탈지된 경우, 농축된 리파아제 추출물을 수득하기 위해서 상기 두 작업 중 어느 것을 사용하여도 무방하나, 이온 교환 크로마토그래피가 바람직하다.

리파아제를 수득하기 위해서는 상기 두 작업을 연속적으로 수행하여야 하며, 그 수행순서는 일정 규칙이 없다.

이와 같은 정제방법을 요약해 보면 다음과 같다. 이온 교환 크로마토그래피는 이온화기능을 이용하여 적절한 매체중에서 수용성 물질에 음성 및 양성 전하를 획득케하여 이들을 반대전하로 하전된 지지체에 부착시켜 정제하는 방법이다. 지지체에 고정된 생성물의 용출은 그들 결합력의 함수에 따라 점진적으로 이루어지며, 이방법을 이용하면 혼합물로부터 생성물을 분리할 수 있다.

단백질 구조를 가진 효소들은 아미노 작용부와 카르복실 작용부를 모두 가지고 있어, 이 분자의 등전 pH에서의 전하는 0을 나타낸다. 등전 pH 이하로 용액을 산성화하면 카르복실 작용부에 작용하여 효소는 양으로 하전되는 반면, 역으로 알카리화하면 아미노 작용부에 작용하여 생성물은 음으로 하전된다.

이와 같이 단백질이 양쪽성을 지니고 있으므로 양이온 교환 크로마토그래피법 또는 음이온 교환 크로마토그래피법에 의해 단백질을 정제할 수 있다.

이 방법에 사용되는 지지체들은 용출제에 불용성이며, 이온성 작용부를 제공하는 물질이다.

지지체의 주된 유형은 수지, 3차원의 스티렌 및 폴리비닐벤젠계, 치환된 셀룰로오즈, 덱스트란 유도체 또는 아가로오즈 유도체이다. 아가로오즈 유도체중 Pharmacia사는 매우 신속한 분리를 위해서 상당히 가교 결합된 아가로오즈 중합체로 된 지지체(상표명 : 패스트 플로우)를 추전한다.

그들의 구조에 있어서, 서로 다른 지지체들은 설폰 작용부, 카르복실 작용부, 인산 작용부 및 아르센 작용부 같은 양이온 교환을 위한 이온성 작용부를 보유하며, 또한 1차, 2차 또는 3차 아민 작용부와 같은 음이온 교환 작용부를 보유하는 등 다른 이온성 작용부들을 포함하고 있다.

바람직한 방법으로는, 본 발명에 따른 생성물은 설포프로필 라디칼을 보유하여, 결과적으로 양이온 교환자로 작용하는 지지체인 패스트 플로우 S 및 직경 2.6mm, 높이 30cm의 세파로즈 형(Pharmacia) 컬럼에서 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하거나, 동일한 지지체를 함유하나 용량이 적은(1ml) 패스트 플로우모노 S형(Pharmacia)컬럼을 사용하여 정제한다.

정제하려는 추출물은 pH가 3 내지 5, 특히 4인 완충용액중에 용해시킨다. 완충제의 예는 하기한다.

a) 나트륨 아세테이트 20mM/ℓ

나트륨 클로라이드 100mM/ℓ

아세트산을 가함 pH 4

b) 나트륨 아세테이트 20mM/ℓ

아세트산을 가함 pH 4

추출물 용액은 정제용으로 사용되는 완충제로 미리 평형을 유지시킨 겔상에 침착시킨다. 후속 단계는 사용되는 컬럼의 작용부 유형에 따라 다르다.

모노 S형 컬럼의 경우, 추출물은 완충제 b)중에 용해시킨다. 생성물은 동일한 완충제로부터 출발하여 점차 고농도의 다른 유형의 완충제를 사용하여 정제시키되, 단 후자의 완충제는 1ℓ당 나트륨 클로라이드 500mM을 포함한다. 이때, pH 4의 용출제 구배를 형성하기 위해 1ℓ 당 0 내지 500mM의 나트륨 클로라이드를 포함하는 용출제를 사용한다. 이온세기를 점차적으로 변형시킴으로써 1ℓ당 250mM의 나트륨 클로라이드 농도에서 농축된 리파아제 추출물을 함유하는 분획분을 분리할 수 있다.

S 세파로오즈형 컬럼의 경우, 정제된 생성물은 완충제 a)중에 용해시켜 컬럼상에 위치시킨다. 용출은 동일한 완충제로 수행하고, 그후 나트륨 아세테이트 20mM/ℓ와 나트륨 클로라이드 200mM/ℓ로 구성된 용액으로 용출을 실시하여 목적하는 추출물이 농축된 리파아제 분획분을 용출시킬 수 있다.

이러한 정제 방법은 염석 이후 방법 a)에서 얻어진 추출물에 적용함으로써, 특이활성이 100 내지 500U/mg 단백질인 농축된 리파아제 추출물을 함유한 분획분을 수득할 수 있다.

상기 정제 방법에 의해 수득한 수성 분획분은 리파아제를 수득하기 위해 보완적인 정제방법에 사용하거나, 투석법 또는 한외여과법으로 탈염시킨 후, 전술한 방법으로, 냉동 및 동결 건조하여 무정형 고체 형태의 농축된 리파아제 추출물을 수득할 수 있다. 분자 체 형태의 겔상에서 여과함으로써 분자의 크기에 따라, 이를 테면 그의 부피 또는 디멘젼에 따라 분자를 분리할 수 있다. 사용되는 불용성 겔은 적용되는 분자의 크기에 따라 다양한 3차원 시스템으로 형성된다.

서로 다른 크기의 분자 혼합물에서는 겔의 시스템에 적합한 크기의 생성물만 체류되는 반면, 그 보다 큰 크기의 분자는 체류되지 않고 신속하게 용출될 것이다. 겔상에 체류된 분자의 경우, 그들의 크기에 따라 체류시간이 결정되고, 이들 생성물의 용출 또한 분자 크기에 비례하여 그 크기가 작을수록 오래 지체되는 경향을 나타낸다.

하기한 겔들은 이와 같은 분리 특성을 보유한다.

-세파덱스 G ; 에피클로로히드린으로 가교된 덱스트란으로 구성됨.

-바이오겔 P ; N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드로 가교된 폴리아크릴아미드 사슬임.

-울트로겔 및 세파크릴 ; 폴리아크릴아미드 및 아가로오즈 그리드가 혼합된 것.

본 발명의 생성물은 세파크릴형의 폴라아크릴아미드 겔로 처리함이 바람직하다. 탈지되지 않은 추출물은 그 배제 한계치가 1,000,000달톤 이상인 체를 사용하여 처리한다.

정제하려는 생성물 수용액은 1 내지 7ℓ의 겔을 포함하며, 높이가 약 1m인 컬럼상에 위치시킨다.

그후, 나트륨 클로라이드 100 내지 500mM 및 디나트륨 포스페이트 10 내지 30mM 포함하는 pH 6인 용액으로 용출시킨다. 용출액을 분획분으로 수거한 후, 각 분획분에 대해 리파아제 활성 보유 여부를 조사한다. 활성을 나타내는 분획분을 투석 또는 한외여과로 탈염한 후, 냉동 및 동결 건조하여 목적으로 농축 리파아제 추출물을 고체 형태로 수득한다.

탈지된 리파아제 추출물을 분자량이 30,000 내지 55,000달톤, 바람직하게는 45,000 및 55,000달톤인 물질을 분리시키는 체로 처리한다. 정제된 이 생성물의 수용액을 400 내지 500ml의 겔을 포함하는 높이가 약 1m인 컬럼상에 위치시킨다.

그후, 나트륨 클로라이드 200mM/l를 포함하며, pH가 6인 용액으로 용출한다. 용출액을 분획분으로 수거하고, 어느 분획분이 리파아제 활성을 보유하는지 조사한다. 이렇게 수득한 리파아제 활성을 보유하는 분획분을 이용해 리파아제를 수득하기 위해 보완적인 정제 방법을 사용하거나, 투석 또는 한외여과로 탈염한 후, 고체 형태의 농축 리파아제 추출물을 수득하기 위해 냉동 및 동결 건조하며, 특정 경우 탈지시킨다.

본 발명에 따른 방법은 송아지, 양, 돼지, 가금류, 토끼 및 말의 위에 적용된다. 그러나 놀랍게도 돼지 위장에서 수득한 리파아제 물질 및 리파아제와는 대조적으로 토끼 및 말의 위로부터 수득한 것은 pH 4 내지 5, 바람직하게는 4.5에서 최대 활성을 보이는 반면, 돼지의 경우는 pH 6 내지 7에서 최대의 리파아제 활성을 보인다는 것이 확인되었으며, 이 결과로부터 돼지의 리파아제는 위장 배지내에서 활성을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있다.

또한 돼지 위에서 추출된 추출물과는 대조적으로 토끼 및 말 위의 추출물은 놀랍게도, 산성 배지중에서 배양한 후에도 리파아제 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 토끼 또는 말 위의 추출물은 pH 2, 37℃에서 2시간 동안 배양시, 활성이 저하되지 않았으나, 동일한 방법으로 처리한 돼지 위의 리파아제 경우 pH 4이하에서는 활성을 나타내지 않았다.

또한, 말 및 돼지 위의 추출물의 활성을 pH 3 내지 9의 범위에서 조사한 결과, pH 3 내지 7에서 상기 추출물들의 리파아제 활성은 약 pH 4.5에서 나타나는 최대 활성의 50% 이상 또는 그와 동등한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 시험 프로토콜은 다음에서 설명된다.

토끼 및 말 위의 추출물의 리파아제가 광범위한 활성 범위를 갖고 있으며 산성 배지중에서도 변성에 대한 저항성이 우수하다는 놀라운 특성은 그들을 사람 및 동물에 있어서 병인학적 리파아제 결핍증을 치료하기 위한 대체제로 사용할 수 있음을 입증하고 있다.

또한, 라엠리(Laemmli) 방법에 의해 측정한 결과, 본 발명은 분자량이 49,000달톤인 리파아제에 관한 것으로, 상기 분자량중 9,000달톤은 당에 의한 것이고 40,000달톤은 단백질에 의한 것이며, 다음과 같은 아미노산으로 구성된다 :

Asp. Asn : 45 : Thr : 19 : Ser : 28 : Glx : 30 : Pro : 29 : Gly : 25 : Ala : 28 : Val : 27 : Met : 8 : Ile : 18 : Leu : 26 : Tyr : 16 : Phe : 18 : Lys : 17 : His : 7 : Arg : 10 : Cys : 9 및; Trp : 6, 그들의 N-말단부 서열은 Lys-Ser-Ala-Pro-Thr-Asn-Pro-Ser-Glu-Glu-Val-Asn-Met-X-Ile-Ser-Glu-Met-Ile-Ser-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Pro-Lys-Tyr-Glu-Val-Val이며, 여기에서 x는 미확인 아미노산이며, 이것의 리파아제 특이활성은 가고우리(Gargouri) 방법에 따르면 1,000U/mg 단백질 이상이고, pH 3 및 7에서의 활성은 최대 활성(pH 약 4.5에서 얻어진 활성임)의 50%이며, 37℃ 및 pH 2에서 2시간 동안 배양후에도 그들의 활성은 유지된다. 또한 지방분해 작용에 관여하는 그들의 특이적 아미노산은 시스테인으로 펩신에 저항성이 있고, 키모트립신 및 트립신에 의해 분해되며, 그들의 등전 pH는 5.7 내지 7.1 사이이고, 이들은 토끼의 위저부를 사용하여 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된다.

본 발명은 또한, 가고우리 방법에 의한 특이활성이 1,000U/mg 단백질 이상이고, 최대 활성은 pH 4.5에서 얻어지며, pH 3 및 7에서의 활성이 최대 활성의 거의 50%이고, 37℃ 및 pH 2에서 2시간 동안 배양후에도 활성을 보유하며, 말의 위로부터 본 발명의 제조방법에 의해 제조될 수 있는 리파아제에 관한 것이다.

본 발명은 가고우리 방법에 의한 리파아제의 특이활성이 100 내지 1,000U/mg 단백질이고, 그들의 최대 활성이 pH 약 4.5에서 나타나며, pH 3 및 7에서 그들의 활성이 최대 활성의 거의 50% 정도이며, 37℃ 및 pH 2에서 2시간 동안 배양하여도 그 활성을 유지하며, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조될 수 있음을 특징으로 하는 임의의 수용액중의 탈지 또는 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물에 관한 것이다.

본 발명은 또는 가고우리 방법에 의한 리파아제 특이활성이 1 내지 100U/mg 단백질이며, 그들의 최대 활성이 pH 4.5 정도에서 나타나고, pH 3 및 7에서의 활성이 최대활성의 50%이며, 37℃ 및 pH 2에서 2시간 동안 배양후에도 활성이 유지되며, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조할 수 있음을 특징으로 하는 탈지 또는 탈지되지 않은 리파아제 추출물에 관한 것이다.

이와 같은 펩신-저항성 추출물은 트립신에 의해 분해되며, 지방분해활성에 관여하는 아미노산으로 시스템인을 보유하고 있다.

상기 생성물은 다음과 같이 효소 및 효소 추출물에 대해 통상적으로 실시하는 특성 규명 방법으로 특성을 측정한다 :

a : 특이활성

b : pH 함수에 따른 활성

c : 산성 배지중에서 배양후 리파아제 활성의 저항성

d : 겉보기 분자량의 결정

e : 트리글리세라이드에 대한 활성

f : 등전 pH의측정

g : 지방 분해 활성에 관여하는 필수 아미노산의 존재 결정

h : 프로테아제에 대한 저항성 측정

i : 당의 존재 결정

이하, 이같은 측정을 위해 사용되는 방법을 요약 정리한다.

a : 특이활성의 측정

특이활성이란 mg으로 표시되는 샘플의 단백질 양과 효소 활성의 비율로 정의된다. 리파아제 활성은 트리부티린(tributyrin)을 기질로 사용하는 Y. Gargouri(Aix-Marseille University PhD thesis, 1985)에 의한 적정방법으로 측정한다. 적정은 리파아제의 의해 유리된 상기 부티르 산을 pH 6의 일정한 pH에서 37℃의 온도를 유지하면서 0.1N 소다 용액으로 중화시킴으로써 실시한다. 이러한 시험 조건에서, 효소활성은 시험되는 생성물의 작용에 의해 1분내에 유리된 산을 마이크로 몰수로 나타낸 것이다.

실제로 본 시험은 37℃의 일정한 온도로 조절된 적정 셀(cell)내에 0.50ml의 트리부티린 및 14.50ml의 나트륨 타우로데속시콜레이트 및 소혈청 알부민 등장 용액(조성; 100mg의 소혈청 알부민, 2mM 나트륨 타우로 데속시콜레이트, 9% NaCl 등장 용질 1ℓ를 가한다)을 투입시키는 단계를 포함한다.

전자기적 교반하에서 자동 적정기를 사용하여, 혼합물에 0.1N 소다 용액을 첨가시킴으로써 ph를 6으로 조절한다. 상기 pH로 안정화시킨 후, 적정하려는 효소화합물의 수용액 1ml 내지 0.5ml를 정확히 정량하여 첨가한다. 이 실험 조건하에서 2분 동안 pH를 6으로 유지하는데 필요한 0.1N 소다 용액의 양으로부터 전술한 정의에 따라 리파아제 활성을 계산할 수 있다.

단백질은 폴린-시오칼튜 시약(Folin Cliocalteu reagent)의 존재하에서 정량한다. 알카리 매체중의 구리 이온 및 상오 포스포-몰리브도-텅스텐 시약의 존재하에서 착색된 복합체가 형성되며, 이 복합체의 색 강도는 단백질 양에 비례한다(Lowiry 등, 1951). 기지량의 소혈청 알부민을 사용해 제조된 표준 물질과 착색 정도를 비교함으로써 시험 샘플의 단백질 농도를 정량할 수 있다.

b. pH에 따른 활성

pH에 따른 활성은 전술한 적정방법에 사용되는 pH 3 내지 9의 범위에서 측정한다. 적정 혼합물에 0.1N 소다 용액 또는 0.1N 염산 용액을 첨가하여 시험하려는 pH 값으로 유도한다. 효소 용액을 첨가하고 2시간 동안 상기 pH 값을 유지시킨다.

부티르산의 해리 상수(pKa=4.75)에 의하면 pH 6에서는 직접적정이 가능하며, 이 적정은 pH5까지는 보정 인자를 가지고 있고 상기 pH 이하의 값에서는 소위 재적정을 나타낸다.

c. 산성 배지에서 배양후 리파아제 활성의 저항성

본 연구는 시험 생성물을 37℃ 및 pH가 3 내지 9인 수용액 중에서 최고 2시간 동안 배양시킨 후 리파아제 활성을 측정하는 것이다.

조사하려는 효소 추출물의 수용액은 0.1N 염산 또는 소다 용액을 첨가하므로써 다른 pH 값으로 조정한다. 상기 용액들을 37℃로 일정하게 조절한 배스(bath)에 위치시킨다. 샘플을 0, 30분, 1시간 및 2시간마다 취하고, 기질로서 트리부티린을 함유한다. 신속하게 pH를 6으로 조절한 후, 리파아제 활성을 측정하기 위해 0.1N 소다 용액을 첨가하여 pH를 6으로 유지하면서 2분간 적정한다. 이렇게 측정한 리파아제 활성과 배양하지 않은채로 pH 6에서 직접 적정한 동일 생성물의 대조용 샘플(t=0의 시간에서의 샘플)을 비교함으로써 실험 조건하에서 배양한 후의 리파아제 활성(%)을 결정할 수 있다.

d. 겉보기 분자량의 측정

겉보기 분자량은 라엠리 방법(Laemmli method : Nature, 1970, 227, pp. 680-685)에 의한 전기영동법으로 측정하는데, 이 방법은 샘플을 나트륨 도데실 설페이트로 처리하고, 5% 겔 및 12.5% 겔(중량/부피)로 연속적으로 구성한 폴리아크릴아미드 겔내에서 이동정도를 관찰하는 것이다. 분자량(14,000 내지 94,000달톤)을 알고 있는 단백질을 동일하게 처리한다. 그 다음 상기 단백질을 육안 관찰할 수 있도록 쿠마지 블루(Coomassie blue)로 처리한 후, 샘플의 겉보기 분자량을 표준 단백질의 이동정도 및 그 위치에 따른 분자량과 비교하여 결정한다. 상기 방법에 의하면 토끼 위에서 수득 정제한 리파아제는 분자량이 48,000달톤임을 확인할 수 있다(실시예 6).

e. 리파아제 또는 리파아제 추출물의 활성 측정

리파아제 또는 리파아제 추출물의 활성은 세종류의 트리글리세라이드 기질들에 대해 조사한다. 즉, 이들 트리글리세라이드는 짧은 사슬을 보유하는 트리부티린(C₄), 중간 사슬을 보유하는 리프로실(LIPROCILE : C₈C₁₀), 긴 사슬을 보유하는 인트라리피드(INTRALIPIDE, 30% 대두유)들이다.

실제로 2U를 0.5ml의 트리부티린 또는 0.5ml의 리프로실 또는 30% 인트라리피드 용액 5ml에 첨가하고, 활성이 10U인 리파아제는 9% NaCl 완충제, CaCl₂150nM 및 소혈청 알부민 중에서 배양했다.

pH에 따른 활성의 연구 결과 트리부티린의 경우 약 pH 5에서, 리프로실의 경우 약 pH 6에서, 인트라리피드의 경우 pH 4에서 최대 활성을 나타냈다.

산출된 리파아제 생성물의 활성은 전술한 기질에 대해 pH 5에서 측정하였다. 리프로실 및 인트라리피드에 대해 관찰된 활성은 각각 트리부티린에 대해 관찰된 것의 50 내지 75% 및 25 내지 40%를 나타냈다.

f. 등전 pH의 측정

앰포라이트(ampholyte)에 의해 형성된 pH 구배상에 단백질을 위치시키고, 전기장을 형성시키면, 단백질은 그 자신의 등전 pH까지 이동한다. 구배는 폴리카르복실산 및 폴리아미노 지방족 산으로 구성된 분자량 1,000 또는 그 이하의 고분자 전해질 혼합물로 형성되며, 이들의 등전 pH는 2 내지 11 사이에 존재한다.

리파아제 추출물 2 내지 5μg을 미리 만들어 놓은 수평 겔상에 위치시키고, 전기장을 형성시켜 단백질을 약 1시간 정도 이동시킨다. 질화은 시약으로 처리하여 밴드의 존재를 육안으로 확인하였다. 리파아제의 pH는 5.7 내지 7.1이다. 상기 pH 영역에서 다양한 밴드가 나타나는 이유는 단백질에 결합된 당 사슬의 불균질성 때문이다.

g. 지방 분해활성에 있어서 필수 아미노산 존재의 결정

본 연구는 리파아제 또는 리파아제 추출물에 상기 효소의 활성을 억제하는 성질이 있는 시약을 첨가함으로써 실시된다. 본 실험에서 사용한 시약은 DNTB(5,5'-디티오-비스-2-니트로벤조산) 및 4PDS(4,4'-디티오피리딘)으로 이들은 특정 pH 조건에서 단백질의 유리 설피드릴기에 부착된다. 부착후, 이 시약들은 하기하는 착색된 작용기를 유리한다; DNTB는 5-티오-3-니트로 벤조산을 유리하며, 이는 420nm의 파장에서 적정될 수 있다. 4PDS는 4-티오피리돈 작용기를 유리하며, 이것은 324nm 파장에서 관찰 및 정량할 수 있다.

1ml의 분광 분석기용 셀(cell)내에 pH 8의 트리스 염산 완충제를 넣고 0.25M 산 리파아제 및 과량의 상기 시약을 가한 후 배양시켰다. 시간을 달리하여 유리된 화합물의 흡광 정도를 측정하고, 그 농도를 몰랄 흡광 계수를 사용하여 계산하였다;

(E l_cm, M=420nM에서 13 600)

(E l_cm, M=324nM에서 19 800)

동시에, 샘플을 취하여 a)에서 설명한 방법에 의해 잔류하고 있는 지방 분해활성을 측정했다.

정제된 리파아제의 리파아제 활성은 상기 시약들에 의해 전체적으로 억제되었다. 또한 이와 같은 시험에 의하면 하나의 자유 설피드릴 기가 지방 가수분해 활성에 참여하고 있으며, 이 작용기는 시스테인이라는 아미노산에 속하는 것임이 확인되었다. 동일 조건하에서 처리된 리파아제 추출물도 억제되었다.

h. 프로테아제에 대한 저항성 측정

본 연구는 돼지의 위에서 분비되는 돼지 펩신, 그리고 돼지 췌장에서 십이지장내로 분비되는 돼지의 키모트립신 및 트립신을 이용하여 수행하였다. 리파아제 추출물 및 리파아제를 키모트립신 및 트립신에 대해서는 pH 7.5에서 2시간 동안 배양시키고, 펩신에 대해서는 37℃, pH 2에서 동안 배양시켰다. 샘플을 매 15분 간격으로 일정하게 채취하여, 잔류한 리파아제 활성을 a)에서 설명한 방법으로 측정하였다. 펩신 2mg을 pH 2의 완충제 중에서 리파아제 또는 리파아제 추출물 3mg과 혼합한다. 동일한 방법으로 pH 7 완충제 중에서 트립신 또는 키모트립신 2mg과 리파아제 또는 리파아제 추출물 3mg을 함께 혼합한다. 참고용으로 사용된 물질의 활성은 c)에서 측정된 것이다.

최초의 활성이 펩신에 대해서는 2시간 동안 변하지 않고 남아 있었다. 2시간이 지날 무렵, 키모트립신 존재하의 리파아제의 활성은 50%로 감소했고, 트립신은 2시간내에 리파아제 활성을 완전히 파괴시켰다.

i. 당의 존재 결정

본 연구는 단백질에 결합된 당 사슬을 특이적인 두개의 N-아세틸 글루코사민 사이를 절단하는 효소인 엔도글리코시다제(ENDOF)로 가수분해시켜 실시하였다.

본 발명은 이 효소로 처리된 리파아제로부터 얻어진 생성물의 겉보기 분자량을 측정하는 단계를 포함한다. d)에서 설명한 방법에 의해 가수분해하고 처리한 후, 고유 효소에서 얻어진 분자량보다 적은 40,000달톤 정도의 분자량에 상응하는 주 밴드가 형성되었다. 또한 각 아미노산의 중량을 근거로 아미노산 조성에 따른 분자량을 측정한 결과 단백질 부분의 중량은 약 40,000이었다. d)에서 설명된 라엠리 방법에 의해 결정된 중량과의 차이는 약 9,000달톤이었고, 이 분자량 차이는 효소의 당 부분에 기인하는 것이다.

정제된 리파아제는 그의 생화학적 특성, 즉 아미노산 조성 및 N-말단부 서열 등을 결정할 수 있다.

아미노산 조성은 이 단백질을 염산으로, 24, 38 및 72시간 동안 가수분해시킨 후 결정하였다. 가수분해물을 D.H. Spackmann, W.H.Stein 및 S.Moore(Anal, Chem. 1957, 228, p. 999)등에 의한 방법에 따라 자동 아미노산 분석기(Spinco-Beckman)로 분석하여, 그 결과를 M.Delaage(Biochem. Biophys. Acta., 1968, 168, p. 573)의 방법으로 처리하였다.

시스테인 잔기들은 과포름산으로 산화시켜 측정하고, 트립토판은 B.Penke, R.Ferenzi 및 K.Fouacs(Analytical Biochemistry, 1974, 60, pp. 45-50) 등에 의한 방법에 따라 메르캅토 에탄 설폰산의 존재하에서 가수분해시켜 정량하였다.

결정된 상이한 유형의 아미노산의 수는 다음과 같다 :

Asp. Asn-45 ; Thr-19 ; Ser-28 ; Glx-30 ; Pro-29 ; Gly-25 ; Ala-28 ; Val-27 ; Met-8 ; Ile-18 ; Leu-26 ; Tyr-16 ; Phe-18 ; Lys-17 ; His-7 ; Arg-10 ; Cys-9 ; Trp-6.

상기 단백질의 N-말단부의 서열은 Fred. S. Esch(Anal. Biochem., 1984, 137, pp. 39-47)에 의한 방법으로 결정하였다. 30개의 말단부 아미노산 서열은 다음과 같다 :

Lys-Ser-Ala-Pro-Thr-Asn-Pro-Glu-Val-Asn-Met-X-Ile-Ser-Glu-Met-Ile-Ser-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Pro-Ser-Glu-Lys-Tyr-Glu-Val-Val.(X : 미결정 아미노산)

본 발명은 또한 인체 및 동물에 있어서 지방물질의 흡수기능장애를 퇴치하기 위해 본 발명에 따른 리파아제 및/또는 리파아제 추출물을 주활성 성분으로 포함하고 있는 약제에 관한 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다.

[실시예 1]

방법 A에 의해 제조된 탈지되지 않은 리파아제 추출물

생후 2 내지 3개월된 토끼의 위를 도살장에서 수거하였다. 저부의 세번째 상부를 절개하여 내용물을 제거하였다. 조직을 -20℃로 냉동시킨 후, 2cm 이하로 단편화하였다.

방법 A에 의한 산성 배지중에서의 균질화 및 추출

단편화된 조직 160g을 10 내지 12℃, pH 2.5의 염산 용액 600ml에 첨가하고 0.0%(중량/중량)의 펩신을 첨가하였다. 나선형 교반기를 이용하여 약 20℃에서 45분 동안 약 900rpm의 속도로 혼합물을 교반시켜 균질화하였다.

불용성 물질은 5,000rpm에서 30분 동안 원심분리로 분리시켰다. 담황색의 산성 상청액을 분리하였다.

-부피 : 540ml

-특이활성 :

-전체활성 : 175,000U

암모늄 설페이트 침전

상기 작업에서 수득한 산성 용액을 12℃에서 교반하면서, 147g의 암모늄 설페이트를 서서히 첨가하였다. 첨가후, 용액을 15℃에서 15분 동안 정치시켰다. 염석된 침전을 3,500rpm에서 20분동안 원심분리시켜 분리하였다.

효소 분획을 포함하는 바닥부분을 175ml의 pH 6 인산염 완충액중에 용해시켰다. 몇몇 기계적인 불순물을 함유하는 담황색의 투명한 용액을 수득하였다.

-부피 : 175ml

-특이활성 :

-전체활성 : 124,250U

[실시예 2]

방법 B에 의해 제조된 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물

상기 용액을 공극 크기가 5㎛인 필터로 여과시켰다. 수득한 용액을 Pharmacia에서 공급되는 세파릴 S 300 겔(Sepharyl S 300 Gel)(높이 1m, 부피 7.5ℓ)상에서 크로마토그래피시켜 정제하였으며, 이때 용출은 전술한 pH 6의 완충액을 사용하여 115ml/시간의 유속으로 수행하였다. 목적하는 리파아제의 활성은 최초로 수거된 분획분들에서 검출되었다. 이들 분획분을 수거하여 균질한 분획분을 수득하였다.

-부피 : 830ml

-리파아제 특이활성 :

리파아제 전체활성 : 100,642U

이를 농축, 동결 건조 및 탈염시키면 효소활성이 98,000U인 탈지되지 않은 담황색의 무정형 분말 317g을 수득할 수 있었으며, 상기 분말의 특이활성은 분말 1mg당 31U였다.

pH-값의 변화에 따른 활성

pH 3 : 4,503U

pH 5 : 8,750U

pH 7 : 4,412U

산성 pH에 대한 저항성

pH 2에서 0시간 : 8,300U

pH 2에서 2시간 : 8,000U

다음과 같은 사슬을 갖는 트리글리세라이드에 대한 활성

짧은 : 8,750U

중간 : 6,829U

긴것 : 3,233U

시스테인에 특이적인 시약으로 인한 활성의 억제

DNTB 시약에 의해 pH 8에서 리파아제 활성이 완전히 억제됨.

프로테아제의 작용

분해 :

-펩신에 의해 분해되지 않음.

-키모트립신에 의해 40 내지 50% 분해됨.

-전술한 작업 조건하에서 트립신에 의해 완전히 억제됨.

[실시예 3]

방법 A에 의해 제조된 탈지된 리파아제 추출물

a. 제법

생후 2 내지 3개월된 재래종 또는 자니(Janny)종 토끼의 장기중 위부분을 도살장에서 수거하였다. 위로부터 불순물을 제거하고, 소장 및 비장, 식도 부분도 제거하였다.

균질화, 탈수 및 탈지

조직 225g을 플레임/익스플로젼-프루프(flame/explosion-proof) 장치내에서 5℃에서 2,250ml의 아세톤을 첨가한 후, 30,000rpm의 속도로 30초 동안 마쇄하였다. 불용성 물질을 Buchner 필터로 진공여과하고, 100ml의 냉 아세톤으로 세척하였다. 불용성 물질을 취하여 상기와 동일한 조건하에서 아세톤, 크롤로포름 및 디에틸에테르 같은 탈지용 용매를 이용하여 각각 3회씩 상기 조작을 반복 수행하였다.

분말은 건조기내에서 일정한 중량, 즉 45g에 도달할 때까지 진공 건조시켰다.

b. 방법 A

산 수성 추출

상기 탈지된 분말을 5℃로 예냉각시킨 pH 2.5의 염산 용액 1,125ml에 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃에서 30분 동안 교반하고, 10,000rmp에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 분획분을 분리하였다. 수성상을 분리하였다.

-부피 : 1,125ml

-리파아제 특이활성 : 7U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 75,000U

pH 2, 37℃에서 2시간 동안 배양후에도 활성의 변화는 없었다.

암모늄 설페이트 침전

4℃에서 교반하면서 상기 작업중에 수득한 산 용액에 352g의 암모늄 설페이트를 서서히 첨가하였다. 첨가후, 상기 혼합물을 같은 온도에서 30분동안 정치시키고, 10,000rpm에서 30분 동안 원심분리하였다.

원심분리 후, 상청액 물질은 경사분리하고, 효소를 포함하고 있는 하단부를 300ml의 물로 용해시켰다. 이 용액의 효소 특성을 결정하였다 :

-리파아제 특이활성 : 73U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 37,500U

상기 용액을 실시예 4에 기술한 방법 B에 의해 직접 정제시켰으며, 정제하기 이전에 하기 하는 예비처리를 수행하였다. 이 용액중에 함유되어 있는 암모늄 설페이트를 4℃에서 투석시켜 제거한 후, 교반하면서 pH 4의 완충용액(나트륨 아세테이트 20mM/ml, 나트륨 클로라이드 100mM/l 및 pH4의 아세트산을 가함) 15ℓ로 대체하였다. 한시간 후 완충액을 제거하고, 완충액을 새로운 것으로 교환하면서 상기 조작을 2회 더 반복하였다. 최종적으로 리파아제 활성이 있는 용액 300ml를 수득하였는바, 여기에는 암모늄 설페이트가 존재하지 않았다. 이 용액을 다음 실시예 4에 따라 정제하였다.

[실시예 4]

방법 B에 의해 제조된 농축 리파아제 추출물

이온 교환 크로마토그래피

정제 과정은 26mm의 직경에 60ml의 겔을 포함하는 패스트 플로우 S 세파로오즈 컬럼(Pharmacia에서 시판)상에서 실시하였다.

상기 컬럼은 투석시 사용한 것과 동일한 pH 4의 완충용액으로 미리 평형을 유지하였으며, 유속은 100ml/시간으로 하였다. 상기 용액 300ml를 투입하고, 동일 조건에서 상기 pH 4인 용액으로 용출한 후, pH 6.5에서 나트륨 아세테이트 20mM/l 및 나트륨 클로라이드 200mM/l를 포함하는 두번째 용액으로 용출하였다. 480ml 정도 용출된 후, 하기와 같은 특성을 보유하는 리파아제 활성을 함유한 용출액 40ml를 수거하였다.

-리파아제 특이활성 : 350U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 28,000U

상기 용액을 냉동하고 동결 건조시켜, 리파아제 특이활성이 생성물 1g당 10,000U인 농축 추출물 2.8g을 수득하였다.

[실시예 5]

방법 A에 의해 제조된 리파아제 추출물

a. 제법

실시예 2와 동일한 조직 50g을 균질화하고, 탈수하고, 아세톤을 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 부분 탈지시켰다. 잔류수 및 아세톤을 25℃, 40mbar의 진공하에서 제거한 후, 수득한 10g의 생성물을 방법 A에 따라 처리하였다.

b. 방법 A

실시예 2와 동일한 방법으로 수행함.

산 수성 추출

-수득한 부피 : 222ml

-리파아제 특이활성 : 2.6U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 8,850U

암모늄 설페이트 침전

원심분리 후 하단부를 취하고, 19ml의 완충용액(나트륨 클로라이드 150mM/l, 아세트산으로 pH를 3으로 조절함)으로 용해시켰다.

리파아제의 특이활성 : 17U/mg 단백질

리파아제의 전체활성 : 6,550U

이 용액은 실시예 6에 기술한 정제 작업에 사용하였다.

[실시예 6]

방법 B에 의해 제조된 순수한 리파아제

분자 체상에서의 여과

실시예 5에서 수득한 용액을 세파크릴 S 200 겔 용액(Pharmacia에서 시판)상에서 정제하되, 컬럼은 직경 26cm, 높이 1m이고, 용출은 전술한 pH 3의 완충제를 사용하여 16ml/시간의 속도로 실시하였다. 300ml가 용출된 후, 정제된 리파아제 활성을 포함하는 부피 50ml의 용액을 수득하였다.

리파아제의 특이활성 : 257U/mg 단백질

리파아제의 전체활성 : 4,550U

이온 교환 크로마토그래피

부피가 0.98ml인 모노 S 패스트 플로우 컬럼(Prarmacia에서 시판)을 사용하여 실시하였다. 이전에 수득한 용액 50ml를 컬럼에 위치시키고, pH 4의 완충용액(0 내지 500mmole/l의 나트륨 클로라이드 선형 구배를 포함하는 20mmole/l 나트륨 아세테이트)을 사용하여 1ml/분의 속도로 용출하였다. 리파아제는 20ml의 부피로 나트륨 클로라이드 250mmole/l의 농도에서 용출되었다.

수득된 생성물은 하기 특성을 보유한다 :

-전체 단백질 중량 : 3.4mg

-리파아제 특이활성 : 1,067U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 3,630U

-겉보기 분자량(라엠리 방법) : 48,000

pH 변화에 따른 활성

pH 3 : 100U

pH 5 : 170U

pH 7 : 85U

산성 pH에 대한 저항성

pH 2에서 0시간 : 150U

pH 2에서 2시간 경과후 : 145U

분자량

분자량 밴드는 49,000에 위치하였다.

하기 사슬을 보유하는 트리글리세리드에 대한 활성

짧은 것 : 1,200U

중간 : 760U

긴것 : 300U

등전 pH의 측정

pH 5.7과 7.1 사이에 12개의 밴드가 존재함

시스테인에 특이적인 시약에 의한 활성의 억제

DNTB : DNTB 한분자가 리파아제 한분자를 240분내에 억제함.

4PDS : 4PDS 한분자가 리파아제 한분자를 60분내에 억제함.

프로테아제의 작용

분해 :

-펩신에 의해 분해되지 않음.

-키모트립신에 의해 40 내지 50% 분해됨.

-상기 작업 조건하에서 트립신에 의해 완전히 억제됨.

당의 존재 결정

천연 리파아제를 전기영동 겔에 위치시킨 결과, 분자량 밴드는 49,000에서 나타났다. 여러 시간동안 엔도 F와 함께 배양시킨 결과, 분자량 40,000 달톤의 위치에서 밴드가 관찰되었다.

[실시예 7]

방법 A에 의해 제조된 리파아제 추출물

말의 위점막을 방법 A로 직접 처리하여 제조하였다.

산 수성 추출

약 1cm²로 단편화시킨 말의 위점막 228g을 4℃로 냉각시킨 물 910ml에 투입하고, 37%(중량/부피)의 진한 염산을 첨가하고 상기 혼합물의 pH를 2.5±0.1로 조절했다. 4℃에서 30,000rpm으로 매회 30초 동안 2분 간격으로 2회 마쇄하였다. 마쇄된 물질은 40분 동안 냉전자기적 교반 상태를 유지한 후, 10,000rpm으로 30분동안 원심분리시켜 산 용액을 분리하였다.

산성용액 892ml는 용액 1ml당 15.5U의 비율 또는 단백질 1mg 당 0.74U의 비율로 리파아제 활성 물질을 함유하고 있었다. 리파아제 전체 활성은 13,800U였다.

암모늄 설페이트 침전

4℃에서 전자기적으로 교반하면서, 상기 산 용액에 500g의 암모늄 설페이트를 첨가시켰다. 이 온도에서 30분 동안 교반시킨 후, 10,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 분리하였다. 원심분리후 하단부에 위치한 물질을 9% 나트륨 클로라이드 용액 50ml에 용해시키고, 이 혼합물을 상기와 같은 조건하에서 다시 원심분리하였다.

상청액 물질이 농축 리파아제 활성을 나타냈다.

-부피 : 51ml

-리파아제 특이활성 : 192U/ml-5.6U/mg 단백질

-리파아제 전체활성 : 9,800U

상기 용액을 전술한 과정에 따라 처리하여 고체 생성물을 수득하였다.

[실시예 8]

실시예 1과 동일한 토끼의 위를 사용하였다. 안트럼(부분 A)을 저부(부분 B)로부터 분리하였다. 저부자체를 이 기관의 가로방향으로 동일한 크기를 갖도록 4등분 하였다(안트럼으로부터 분리한 것과 구분하기 위해 B₁, B₂, B₃, B₄으로 명명함). 이 다른 조직들은 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하였다. 각각의 산 추출물 중에서 수득한 리파아제 활성을 가고우리 방법에 의해 측정하여 하기와 같은 결과를 얻었다 :

A=0

B₁=0

B₂=0

B₃=0

B₄=6,000U

상기 결과로부터 리파아제 활성이 위저부의 상부(the upper part of the fundus)에 위치함을 발견하였다.

동물에서 독성부재와는 무관하게, 본 발명에 따른 생성물은 사람들에게 있어서 소화와 관련한 병리학적 이상 증세를 치료하는데 바람직한 효과를 보유한다.

유독성은 생후 7 내지 8주된 비스타 래트(Wistar rat)에서 조사하였으며, 이때 토끼의 위에서 수득한 리파아제 추출물의 포화 수용액을 경구투여 하였고, 그 비율은 동물체중 100g당 50 리파아제 U를 포함하는 용액 1ml를 4주 동안 매일 투여하였다.

상기 처리의 말미에 OCDE에서 추천하는 살아있는 동물에 대한 혈책 및 요의 혈액학적 및 생화학적 검사 및 죽은 동물에 대한 조직 병리학적 조사를 수행하였다.

처리하지 않은 대조용 그룹과 비교하는 경우, 리파아제 추출물을 투여한 동물에게서 어떠한 비정상도 관찰되지 않았다. 본 연구 결과 및 처리과정 동안 동물들이 보인 완전한 내성(tolerance)으로 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 생성물에는 유독성 및 유독성이 없다.

본 발명에 따른 생성물은 단독사용 또는 사람의 소화 증상에 사용되는 다른 효소와 병합 사용시에도 효능이 우수함이 입증되었다.

분말 또는 캡슐의 형태로 된 생성물을 매일 300 내지 6,000 리파아제 U의 비율로 만성화된 알콜성/만성 췌장염으로 고통 받는 18 내지 75세 환자들에게 그들 질환 상태의 경중에 따라 투여하였다. 처리하기 이전에 10g/24 시간 이상 또는 그에 상응하는 지방변증(steatorrhea)을 나타내는 환자들은 6개월 동안 음식과 본 생성물을 혼합하여 투여하든가 식사중에 섭취시켰다.

대부분의 경우, 지방변증이 감소하고, 대변의 양과 배변 빈도가 감소됨을 발견하였다. 또한, 복부의 통증 및 팽만감 같은 불안정증세도 감소되었다.. 빈번하게 체중 증가가 관찰되었다. 본 연구중에 불내성이 없었음을 주목해야 하며, 이같은 환자군에 특별한 효능을 나타내지 않았던 판크레아틴 같은 다른 효소가 비교했을 때도 효능이 우수했다.

또한, 췌장 섬유증으로 인해 지방 흡수 효율이 90% 이하인 유아들을 상기 시험에 사용한 용량 만큼의 생성물로 14일간 치료하였다. 본 연구동안 대변중의 지방농도, 일일 배변 횟수 및 무게등을 조사하여 고통의 강도 및 복부 팽윤 정도를 평가하였다. 그 결과, 지방변증 및 일반적인 상태가 현저히 개선되었음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 생성물은 판크레아틴 보다 더 효과적이었다.

본 발명의 생성물은 치료해야 할 병의 특성 및 심각성에 따라 적합한 약제의 형태로 투여한다. 정제, 겔라틴으로 코팅한 알약, 연질 캡슐, 그래뉼, 마이크로 그래뉼, 또는 시럽, 현탁액 및 겔과 같은 유사-액제 형태로 사용될 수 있다.

리파아제 추출물은 흡수기능 장애와 연관된 여러 증세에 활성을 갖는 다양한 물질들과 연한 사용할 수 있다. 또한 위보호제, 항궤양제, 항위식도 역류제 및 소화를 돕는 다른 활성 효소를 함께 사용할 수 있다.

상술한 약제는 통상적인 방법으로 제제되며, 이때 약학적인 조제에 주로 사용되어 활성 성분을 적절하게 희석시키기 위한 중성 투입물 같은 보조제, 즉 락토오즈, 사카로오즈, 소르비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로오즈 또는 인산염 같은 염등이 함께 사용된다. 이들을 사용함으로써 붕해성, 결합성 또는 윤활성 생성물이 제조된다. 임의로, 코팅된 정제를 얻기위해 얻어진 제형을 당으로 코팅할 수 있고, 또는 수용성 필름으로 피복할 수도 있다. 이러한 코팅의 기능은 제제 투여시 불쾌감을 감소시키는 작용을 한다.

전술한 액제 형태는 노인의학 및 소아관 용으로 바람직하며, 가향 및 착색제를 첨가시켜 감각 기관의 수용상 느낌을 개량시킬 수 있다.

상기의 다양한 제제들은 토코페롤, 아스코르브산, 소르빈산 및 그들의 염 등과 같은 항산화제 또는 보존료를 첨가함으로써 안전성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 생성물을 포함하는 약제를 예시하기 위해, 정제 및 분말제의 제조방법을 제시한다.

정제

1000 리파아제 U이 함유된 180mg의 정제 한알을 제조 하기 위한 조성.

활성이 73U/mg 단백질인 실시예 3의 생성물.

1000U을 제공하에 충분한 양, 즉 100mg.

-옥수수 전분 22mg

-디칼슘 포스페이트 30mg

-미소결정성 셀룰로오즈 15mg

-실리카 12mg

-마그네슘 스테아레이트 1mg

제법

마그네슘 스테아레이트를 제외하고, 모든 조성분을 혼합하여 수득한 생성물을 치밀화한 후, 메쉬 크기가 1mm인 그리드상에서 구경을 정한다. 산출된 과립체에 마그네슘 스테아레이트를 첨가하여 윤활처리하고, 회전기 내에서 단위체당 180mg의 비율로 압착했다.

분말

400 리파아제 U/g이 투여된 분말 1g을 제제하기 위한 조성.

활성이 17U/mg 단백질인 실시예 5의 생성물.

-400U을 제고하기에 충분한양, 즉 0.8215g

-아스코르브산 0.0025g

-락토오즈 0.0760g

-분말형태의 천연 오렌지 향 0.1000g

제법

상기 성분들을 적절한 스테인레스 강 혼합기에 투입하였다. 균질화한 후, 이 혼합물을 갈색 유리 병내에 넣고, 용접 밀폐했다.

본 발명에 따른 약제는 주활성성분 56 내지 82중량% 및 부형제 44 내지 18중량%를 포함하고 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 생성물의 유독성은 거의 없으며, 중요성이 따라 300 내지 6000 리파아제 U/일로 투여할 수 있다.

상기 투여 속도는 환자 연령에 따라 조정되며, 일반적인 경우 일일용량이 600 내지 4,000 리파아제 U이고, 매일 식사때 3회 투여한다.

본 발명에 따른 생성물을 포함하는 약학적 조성물은 지방물질의 흡수 기능 장애, 특히 알코올성, 유전성, 과칼슘 혈증 또는 국소 췌장염 같은 각종 췌장염과 관련된 질병을 치료하는데 적합하다.

또한, 그들은 위 및 췌장의 부분 절제술 또는 전부위 절제술 같은 외과 수술후 지방 설사중 같은 후유증이 유발되었을때 이를 치료하는데도 유용하다.

또한 그들은 췌장 섬유증 및 리파아제, 코리파아제 및 엔테로키나제 결핍증 같은 증세에도 효과가 알려져 있다.

이러한 질병과 연관된 증세는 흔히 지방 변증, 설사, 복부통 및 영양 결핍 상태등이 있다. 본 발명의 생성물을 적정량 사용하여 치료하면 이 증세를 개선시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 생성물을 포함하는 조성물은 식이성 지방물질의 동화작용에 유용하다. 또한 이 생성물들은 정상인에 있어서 지방의 완전한 동화 및/또는 에너지 공급을 증대 및/또는 가속화시키기 위한 보조제로 투여할 수 있다.

Claims (23)

1. ㉠ 성체인 토끼 또는 말의 위저부(stomach fundus) 1중량부와 pH 1.5 내지 5의 산성인 수성 배지 1-10 부피부를 4 내지 30℃에서 1분 내지 15시간 동안 접촉시킨후, 리파아제 부분을 포함하는 수용액과 고형물질을 수득하는 단계; ㉡ 상기 고형물질로부터 수용액을 분리하여 분리 수용액을 수득하는 단계; ㉢ 상기 분리 수용액에 적당량의 수용성염을 첨가하고, 목적하는 리파아제 추출물이 염석되기 충분한 시간동안 정치시켜 상청액을 수득하는 단계; 및 ㉣ 상기 상청액으로부터 목적하는 리파아제 추출물을 분리 및 수거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리파아제 추출물의 제조방법.
2. ㉠ 수성상에 제1항에 따른 리파아제 추출물을 용해 시키는 단계; ㉡ 차단 한계치(cutoff threshold)가 5,000 내지 10,000달톤인 막 상에서 상기 수성상을 여과하여 탈염된 리파아제 추출물 용액을 수득하는 단계; 및 ㉢ 상기 탈염된 리파아제 추출물 용액을 동결건조하여 탈염된 리파아제 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈염된 리파아제 추출물의 제조방법.
3. 제1항에 따른 위저부로 구성된 리파아제 추출물을 함유하는 고형부분, 또는 제1항에 따른 리파아제 추출물과 지방물질을 용해시킬 수 있으며, 비등점이 80℃ 이하인 탄화수소, 에테르, 케톤, 알콜 또는 카본 할라이드 같은 용매를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈지된 리파아제 추출물의 제조방법.
4. ㉠ pH가 2 내지 7인 완충제중에 제1항에 따른 리파아제 추출물을 용해시켜 완충용액을 수득하는 단계; ㉡ pH가 2 내지 7인 상기 완충용액을 배제 한계치(exclusion limit)가 1,000,000달톤 이상인 분자체상에서 크로마토그래피하고, 완충용액중의 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물을 함유하는 배제된 용출 분획분을 수거하는 단계; ㉢ 상기 배제된 용출 분획분을 차단 한계치가 10,000 달톤인 막상에서 여과하여 탈염된 불획분을 수득하는 단계; 및 ㉣ 상기 탈염된 분획분을 동결건조하여 목적하는 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈지되지 않은 농축 리파아제 추출물의 제조방법.
5. ㉠ 제1항에 다른 리파아제 추출물을 물에 용해시켜 리파아제 추출물을 함유하는 수용액을 수득하는 단계; ㉡ 상기 리파아제 추출물을 함유하는 수용액을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000 달톤인 막상에서 여과하여 염이 없는 용액을 수득하는 단계; ㉢ 상기 염이 없는 용액을 이온 교환 지지체상에 흡착시키는 단계; ㉣ 이온세기가 시간의 함수에 따라 점차 증가하는 용출제로 상기 지지체를 탈착시키는 단계; ㉤ 리파아제 활성을 보유하며, 탈지된 농축 리파아제 추출물을 포함하는 용출 분획분을 수거하는 단계; ㉥ 차단 한계치가 5,000 내지 10,000달톤인 막상에서 상기 리파아제 활성을 보유하는 용출 분획분을 여과하여 탈염된 용출 분획분을 수득하는 단계; 및 ㉦ 이 탈염된 용출 분획분을 동결건조하여 목적하는 탈지된 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈지된 농축 리파아제 추출물의 제조방법.
6. ㉠ 제4항에서 수득한 pH가 2 및 7인 완충용액을 분자체상에서 크로마토그래피하는 단계; ㉡ 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 55,000 달톤인 체류된 용출 분획분을 수거하는 단계; ㉢ 상기 농축된 리파아제 추출물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 55,000달톤인 체류된 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000 달톤인 막상에서 여과하여 탈염 탈지된 농축 리파아제 추출물 용액을 수득하는 단계; 및 ㉣ 상기 용액을 동결건조하여 목적하는 탈지된 농축 리파아제 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈지된 농축 리파아제 추출물의 제조방법.
7. ㉠ 제5항에서 수득한 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며; 리파아제 활성을 보유하는 용출 분획분을 사용하여 분자체상에서 크로마토그래피하는 단계; ㉡ 분자량이 45,000 내지 50,000달톤이며, 리파아제를 함유하는 체류인 용출 분획분을 수거하는 단계; ㉢ 상기 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000 달톤인 막상에서 여과하여 리파아제를 함유하는 탈염된 용액을 수득하는 단계; 및 ㉣ 리파아제를 함유하는 상기 탈염된 용액을 동결건조하여 목적하는 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리파아제의 제조방법.
8. ㉠ 제6항에서 수득한 탈지된 농축 리파아제 추출물을 함유하며, 분자량이 30,000 내지 55,000 달톤에 해당하는 용출 분획분을 이온 교환 지지체에 흡착시키는 단계; ㉡ 이온세기가 시간 함수에 따라 증가하는 용출제를 사용하여 상기 지지체를 탈착시키는 단계; ㉢ 리파아제를 함유하며, 리파아제 활성을 나타내는 용출 분획분을 수거하는 단계; ㉣ 상기 용출 분획분을 차단 한계치가 5,000 내지 10,000 달톤인 막상에서 여과하여 리파아제를 포함하는 탈염된 용출 분획분을 수득하는 단계; 및 ㉤ 상기 리파아제를 함유하는 탈염된 용출 분획분을 동결건조하여 목적하는 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리파아제의 제조방법.
9. 라엠리(Laemmli) 방법에 의한 분자량이 49,000달톤이고, 그중 9,000은 당이고, 40,000은 단백질이며, 다음과 같은 유형의 아미노산을 기입한 수만큼 포함하며 ; 아미노산 유형은 Asp. Asn : 45 : Thr : 19 : Ser : 28 : Glx : 30 : Pro : 29 : Gly : 25 : Ala : 28 : Val : 27 : Met : 8 : Ile : 18 : Leu : 26 : Tyr : 16 : Phe : 18 : Lys : 17 : His : 7 : Arg : 10 : Cys : 9와 Trp : 6이고, 이때 N-말단부 서열은 Lys-Ser-Ala-Pro-Thr-Asn-Pro-Glu-Val-Asn-Met-X-Ile-Ser-Glu-Met-Ile-Ser-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Pro-Ser-Glu-Lys-Tyr-Glu-Val-Val이며, 여기에서 X는 미결정 아미노산이고, 가고우리(Gargouri) 방법에 의한 리파아제 특이 활성이 1,000U/mg 단백질 이상이고, pH 약 4.5에서 최대 활성을 나타내며, pH 3 및 7에서의 활성이 상기 최대 활성의 최소한 50%이며, 37℃ 및 pH 2의 조건하에서 2시간 동안 배양후에도 그 활성이 유지되며, 지방분해 활성에 관여하는 아미노산은 시스테인이며, 펩신에 저항할 수 있고 키모트립신 및 트립신에 의해 분해되며, 등전 pH가 5.7 내지 7.1 사이이고, 토끼의 위저부를 사용하여 제8항에 의한 방법으로 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는 리파아제.
10. 가고우리 방법에 의한 리파아제 특이 활성이 1,000U/mg 단백질 이상이고, 약 pH 4.5에서 최대활성을 나타내며, pH 3 및 7에서 활성이 최대 활성치의 최소한 50%이며, 37℃ 및 pH 2의 조건하에서 2시간동안 배양한 후에도 활성을 유지하며, 말의 위를 사용하여 제8항에 의한 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 리피아제.
11. 가고우리 방법에 의한 리파아제 특이활성이 100 내지 1,000U/mg 단백질이고, 최대 활성이 약 pH 4.5에서 나타나며, pH 3 및 7에서 활성은 그들의 최대 활성치의 최소한 50%이고, 37℃ 및 pH 2에서 2시간 동안 배양한 후에도 활성을 유지하며, 펩신에 저항하고 키모트립신 및 트립신에 의해 분해될 수 있으며, 지방분해 활성에 관여하는 아미노산 시스테인이며, 제4항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하며 수용액을 존재할 수 있는 농축 리파아제 추출물.
12. 가고우리 방법에 의한 리파아제 특이 활성이 1 내지 100U/mg 단백질이며, 최대 활성이 약 pH 4.5에서 얻어지며, pH 3 및 7에서 활성치는 그 최대 활성치의 최소한 50%를 나타내며, 37℃, pH 2에서 2시간 동안 배양하여도 그 활성을 유지하며, 펩신에 저항하고 키모트립신 및 트립신에 의해 분해되며, 지방분해활성에 관여하는 아미노산이 시스테인이며, 제1항에 의한 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 리파아제 추출물.
13. 주활성성분으로 제9항에 의한 리파아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 및 동물의 지방물질 흡수기능장애를 퇴치하기 위한 약제.
14. 주활성성분으로 제11항에 의한 농축 리파아제 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 및 동물의 지방물질 흡수기능장애를 퇴치하기 위한 약제.
15. 주활성성분으로 제12항에 의한 리파아제 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 및 동물의 지방물질 흡수기능장애를 퇴치하기 위한 약제.
16. 제1항에 있어서, 상기 ㉠단계에서는 접촉은 4 내지 20℃의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 ㉡단계에서 고체물질로부터 수용액의 분리는 25℃ 이하의 온도에서 여과하거나, 경사분리하거나, 또는 원심분리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 온도가 4 내지 20℃인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 ㉢단계는 수용성염 80 내지 700g을 첨가하고, 0 내지 20℃ 사이의 온도에서 15분 내지 20시간 동안 정치시키는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기의 염이 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 암모늄 염, 포스페이트, 설페이트, 포스테이트와 설페이트의 다가 음이온 또는 이의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제5항에 있어서, 상기 ㉢단계에서의 흡착은 양이온교환 지지체를 가지고 있는 상기 이온교환 지지체상에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제8항에 있어서, 상기 ㉠단계에서의 흡착은 양이온교환 지지체를 가지고 있는 상기 이온교환 지지체상에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 ㉠단계에는 상기 위저부를 1cm 이하의 크기로 단편화시켜 산성의 수성 배지와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.