KR950004014B1 - METHOD FOR PURIFICATION OF Ñß-INTERFERON - Google Patents
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Abstract
Description
제1도는 CM-세파로즈를 이용한 알파 인터페론의 분리도를 나타낸 것이다.1 shows the separation of alpha interferon using CM-Sepharose.
제2도는 산화-환원제를 이용하여 인터페론 이량체를 단량체로 변환시킨 결과를 비환원(non-reducing)SDS-PAGE 한것을 나타낸 것이다.2 shows a non-reducing SDS-PAGE of the result of converting an interferon dimer into a monomer using an oxidation-reducing agent.
제3도는 재조합 알파 인터페론의 C18 역상 고압 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.3 shows the results of C18 reverse phase high pressure chromatography of recombinant alpha interferon.
본 발명은 재조합 알파 인터페론의 정제시에 정제 수율을 높이는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정제 과정시에 발생하는 다이설파이드 결합에 의한 재조합 알파 인터페론 이량체를 산화-환원 작용을 이용하여 단량체로 변환시킴으로써 단백질의 정제 수율을 증대시키는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for increasing the purification yield during the purification of recombinant alpha interferon, and more particularly, to convert the recombinant alpha interferon dimer by disulfide bonds generated during the purification process into monomers using an oxidation-reduction action. The present invention relates to a method for increasing the purification yield of a protein.
인터페론은 1957년 아이삭(Isaacs)과 린덴만(Lindenmann)이 닭을 인플루엔자 A바이러스로 감염시켰을때 바이러스의 번식을 억제하는 인자가 있다는 것을 발전하여 최초로 알려지게 되었다(Isaacs 및 Lindenmenn, J.,Proc, R. Soc. Lond., B147,258-267,1957).Interferon first became known in 1957 when Isaac and Lindenmann developed a factor that inhibited the reproduction of viruses when chickens were infected with the influenza A virus (Isaacs and Lindenmenn, J., Proc, R. Soc. Lond., B 147 , 258-267,1957).
그 후, 수많은 연구결과에서 인터페론이 향바이러스 성질 뿐만 아니라 세포대 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 알려졌으며, 인터페론은 또한 직접적인 항증식 효과(anti-proliferativeeffect)가 있는 것으로 밝혀졌는 바, 이를 이용하여 항암제로서의 가능성이 제시되었다.Subsequently, numerous studies have shown that interferon acts as a regulator of not only the antiviral properties but also the expression, structure, and function of cell-to-cell genes, and interferon also has a direct anti-proliferative effect. This suggests a possibility as an anticancer agent.
알파-인터페론은 B-세포 분열인자(mitogen), 외래 거대분자, 바이러스 또는 암세포 등에 의해 백혈구(B-세포, T-세포, 거식세포)가 자극받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20종 이상의 인터페론 유전자가 존재함이 알려져 있으며, 대부분 165 또는 166개의 아미노산으로 구성되었다.Alpha-interferon is produced when white blood cells (B-cells, T-cells, macrophages) are stimulated by B-cell mitogens, foreign macromolecules, viruses or cancer cells. It is known to exist and consists mostly of 165 or 166 amino acids.
최초의 임상실험에 사용된 알파 인더페론은 셴다이 바이러스(Sendai Virus)로 자극된 연층 백혈구(buffycoat leukocyte)에서 얻어진 것으로, 이 당시 단백질의 순도는 약 1%에 지나지 않았었다(Cantell, K. 및 Hirvonen,Tex. Re. Biol. Med.,35, 138-144,1977).The alpha inferferon used in the first clinical trials was obtained from buffery leukocytes stimulated with Sendai Virus, at which time the protein purity was only about 1% (Cantell, K. and Hirvonen, Tex. Re. Biol. Med ., 35 , 138-144,1977).
근래에는 유전공학의 발달에 힘입어 생리활성을 갖는 유전자 재조합 인간 알파 인터페론을 이용한 임상실험 결과 여러고형암의 치료에 효과가 있는 것으로 판명되었다. 특히, 방광암(bladder cancer)(Torti, F.M. 등,J. Clin.Onco.,3, 506-512, 1985), 신장암(Vugrin, D. 등,Cancer treat. Rep.,69, 817-820,1985)등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 C형 간염 바이러스의 치료에도 효과가 있음이 알려지는 등(Davis, G. G. 등,N. En l, J. Med.,321,1501-1506,1989 ; Bisceglie, A. D. 등,N. En gl. J. Med.,321, 1506-1510,1989) 의약품 치료제로서의 적용법위가 날로 확대되고 있다.Recently, clinical trials using genetically modified human alpha interferon, which has bioactivity, have been shown to be effective in the treatment of various solid cancers. In particular, bladder cancer (Torti, FM et al ., J. Clin . Onco ., 3 , 506-512, 1985), kidney cancer (Vugrin, D. et al . , Cancer treat.Rep., 69 , 817-820, . 1985), and said to be effective for, in recent years, such as such as (Davis, GG is known that the effect in the treatment of hepatitis C virus, N. En l, J. Med, 321, 1501-1506,1989; Bisceglie, AD et al., N. En gl. J. Med ., 321 , 1506-1510,1989).
천연형 알파 인터페론을 얻기 위한 방법으로 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse-phase high performance liquid chromatography)(Rubinstein, M. 등,Arch Biochem. Biophys., 210, 307-318, 1981)를 이용하거나,혹은 단일항체 치환성 컬럼(Berg, K. 및 Heron, I.,Methods Enzymol.,78, 487-499,1981)등을 이용하여 비교적 순도가 높은 단백질들을 얻는 기술이 알려져 있다.As a method for obtaining a native alpha interferon, reverse-phase high performance liquid chromatography (Rubinstein, M. et al. , Arch Biochem. Biophys ., 210, 307-318, 1981) or single Techniques for obtaining relatively high purity proteins are known using antibody substitution columns (Berg, K. and Heron, I., Methods Enzymol ., 78 , 487-499,1981).
활성을 갖는 재조합 인간 알파 인터페론을 얻기 위한 방법으로서 단일 항체 친화성 칼럼을 이용하여 선택적으로 인간 알파 인터페론을 다른 오염 단백질로부터 분리한 후, 여러 칼럼을 이용하여 수차례 더 정제하는 방법은 이미 고안된 바 있었다(Tarnowski, S. J. 등,Methods Enzymol.,119, 153-165, 1986 ; Pestka, S. 및 Tarnowski, S. J.,Pharmac. Ther.,29, 299-319, 1985). 그러나, 이 방법은 그 효과는 우수하나 인간 알파 인터페론에 대하여 선택적인 단일 항체를 대량 생산해야 되는 결점을 갖고 있었다.그 밖에, 재조합 인간 알파 인터페론의 정제에 Cu-킬레이트 칼럼(Thatcher, D. R. 및 Panayotatos, N.,Methods Enzymol.,119, 166-177,1986)등을 이용한 예가 있다.As a method for obtaining a recombinant human alpha interferon with activity, a method of selectively separating human alpha interferon from other contaminating proteins using a single antibody affinity column and then further purifying several times using several columns has been devised. (Tarnowski, SJ et al., Methods Enzymol ., 119 , 153-165, 1986; Pestka, S. and Tarnowski, SJ, Pharmac. Ther ., 29 , 299-319, 1985). However, this method has the disadvantage that the effect is good but the mass production of a single antibody selective against human alpha interferon. In addition, the purification of recombinant human alpha interferon has been performed by Cu-chelate columns (Thatcher, DR and Panayotatos, N., Methods Enzymol ., 119 , 166-177, 1986).
알파 인터페론(αA)는 1번기와 98번의 시스테인기 사이에 다이설파이드기가 연결되어 있고, 29번과 138번의 시스테인기사이에 다른 하나의 다이설파이드기가 연결되어 있다. 그러나, 재조합 알파 인터페론이 효모나 대장균에서 발현될 때 인터페론 내의 2개의 다이설파이드 결합이 제대로 형성되지 않고 환원된 상태로 존재하며, 단백질 자체도 변성된 형태로 세포내에서 유지된다.Alpha interferon (αA) has a disulfide group connected between the 1 and 98 cysteine groups, and another disulfide group is connected between the 29 and 138 cysteine groups. However, when recombinant alpha interferon is expressed in yeast or Escherichia coli, the two disulfide bonds in the interferon are not formed properly but remain in a reduced state, and the protein itself is maintained in the cell in a denatured form.
따라서 본 발명자들은 "재조합 인간 알파 인더페론 정제 방법" 대한민국 특허출원 90-13450)에서 재조합알파 인터페론을 β-머캅토에탄올이나 디티오트레이톨과 같은 환원제가 함유된 단백질 변성제를 이용하여 용해시킨 후, 단백질을 재구성(refolding)시켜서 차례로 액상 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 방법을 출원한 바 있다. 이 방법으로 얻어진 재조합 알파 인터페론을 고순도와 고역가를 지닌 의약품 제제에 적합한 물질이었다.Therefore, the present inventors dissolve the recombinant alpha interferon using a protein denaturant containing a reducing agent such as β-mercaptoethanol or dithiothritol in the "recombinant human alpha inderferon purification method" Korean Patent Application No. 90-13450, The method has been filed by refolding the protein and subsequently purifying it using liquid column chromatography. The recombinant alpha interferon obtained by this method was a suitable material for pharmaceutical preparations having high purity and high titer.
양이온 교환 크로마토그래피를 이용하면 천연형과 같은 구조의 2개의 다이설파이드 결합이 유지된 알파인터페론과 29번과 138번의 다이설파이드 결합만 연결되고 1번과 98번의 시스테인기들은 환원된 부분 산화형의 인터페론, 그리고 다이설파이드기로 서로 연결된 인터페론 이량체(dimer)를 효율적으로 서로 분리할수 있으며, 특히, 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 이량체이 알파 인터페론과 단량체의 알파 인터페론을 분리할 수 있다. 그러나, 의약품 제제로서 바람직한 알파 인터페론은 1-98과 29-138사이의 다이실파이드기가 유지된 천연형과 같은 구조의 형상을 유지하여야 하므로, 부분 산화형 및 이량체의 알파 인터페론은 정제 과정에서 제거된다. 따라서 재조합 알파인터페론의 정제 수율은 불가피하게 낮아질 수 밖에 없는 경향이 있었다.Using cation exchange chromatography, only the alpha interferon retaining two disulfide bonds of the natural form and the disulfide bonds of Nos. 29 and 138 are connected, and the cysteine groups of Nos. 1 and 98 are reduced partially oxidized interferons. And, interferon dimers (dimers) connected to each other by disulfide groups can be efficiently separated from each other, and in particular, dimers can separate alpha interferons and alpha interferons of monomers using gel filtration chromatography. However, alpha interferon, which is preferred as a pharmaceutical formulation, must maintain the shape of a natural form with a disilide group maintained between 1-98 and 29-138, so that partial interoxidation and dimer alpha interferon are removed during purification. do. Therefore, the purification yield of recombinant alpha interferon tends to be inevitably lowered.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 양이온 교환 크로마토그래피 후에 얻어지는 인터페론 이량체dimer)를 적절한 산화-환원제(redox agent)를 이용하여 인터페론 단량체로 변화시켜서 정제수율을 증가시키는 방법을 개발하였다.Accordingly, the present inventors have diligently studied to solve the above problems, and have developed a method of increasing the purification yield by converting an interferon dimer obtained after cation exchange chromatography into an interferon monomer using an appropriate redox agent. It was.
저 분자량의 다이설파이드와 티올(thiol)기들로 구성된 산화반응을 이용하여 환원된 단백질의 다이설파이드 형성을 촉진하는 방법은 일반적으로 널리 알려져 있다. 이 산학환원제를 이용할 경우 올바르게 결합되지 않은 단백질의 다이설파이드기를 재배치(reshuffling)하여서 복원ℓ재산화(renaturationℓreoxidation)의 속도와 수율을 증가시키는 것으로 알리져 있다(Scheele, G. 및 Jacoby, R.,J. Biol, Chem.,257,12277-12282, 1982).It is generally known to promote the disulfide formation of reduced proteins using oxidation reactions consisting of low molecular weight disulfide and thiol groups. It has been reported that the use of this academy-reducing agent increases the rate and yield of reconstitution l reoxidation by reshuffling proteins that are not bound correctly (Scheele, G. and Jacoby, R., J.). . Biol, Chem., 257, 12277-12282, 1982).
상기의 이론적 근거에 착안하여 실험한 결과 본 발명자들은 다이설파이드 결합으로 연결된 알파 인터페론 이량체를 적정 비율의 산화된 티올과 환원된 티올기들을 이용할 경우 블안전한 알파 인터페론 이량체가 분리되며 안정한 천연형과 같은 단량체의 단백질로 구성되는 것을 보여 주었다. 따라서, 본 발명에 의거하면 일반적으로 사용되어지는 재조합 알파 인터페론의 정제시에 정제 수율을 상당히 높일 수 있게 되었다.Based on the above theoretical basis, the present inventors have found that when an appropriate amount of oxidized thiol and reduced thiol groups are used for the alpha interferon dimer linked by disulfide bond, the unsafe alpha interferon dimer is separated and stable natural form It was shown that the monomer is composed of protein. Therefore, according to the present invention, it is possible to considerably increase the purification yield in purifying recombinant alpha interferon which is generally used.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다,Hereinafter, the present invention will be described in detail as follows.
본 발명은, 재조합 알파 인터페론을 정제하는데 있어서, (가) 재조합 알파 인터페론을 단백질 변성제를이용하여 용해시키고, 다시 단백질을 재구성(refolidng)한 다음 ; (나) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 ; (다) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하며 ; (라) 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 알파 인터페론은 이량체를 산화-환원제를 이용하여 알파 인터페론 단량체로 변환시켜 전체 알파 인터페론의 정제수율을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 이량체에서 얻어진 알파 인터페론은 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻어진 초기의 인터페론 단량체와 물리학적, 생물학적 성질을 비교할 때 다른점은 발견할 수 없었다.The present invention provides a method for purifying recombinant alpha interferon, which comprises: (a) dissolving the recombinant alpha interferon using a protein denaturant, and then refolidng the protein; (B) performing anion exchange chromatography; (C) performing cation exchange chromatography; (D) The alpha interferon obtained by cation exchange chromatography is characterized in that the dimer is converted into an alpha interferon monomer using an oxidation-reducing agent to increase the purification yield of the total alpha interferon. The alpha interferon obtained from the dimer did not find any difference when comparing the physical and biological properties of the initial interferon monomer obtained from cation exchange chromatography.
본 발명에 사용된 효모 세포는 효모용 발현벡터에 클로닝하여 알파 인터페론의 유전자를 함유하고 있는 Luck-α-IFN-1Y로서 한국종균협회(KFCC)에 1991년 4읠 17일자로 기탁번호 KFCC-10715로 기탁되었다.The yeast cells used in the present invention are Luck-α-IFN-1Y containing the gene of alpha interferon cloned in the yeast expression vector and dated April 17, 1991 to KFCC, Accession No. KFCC-10715. Was deposited.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 이와 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The following examples are merely illustrative of the invention and do not limit the scope of the invention. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples.
(실시예 1)(Example 1)
알파 인터페론이 발현된 효모(Saccharomyces cerevisiae) lkg을 완충용액(20mM Tris-HCl, 1M 우레아, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 8.0)에 호모지나이저(Beckman 사)로 현탁시킨 후 0.5 내지 0.75mm의 유리구슬을 넣은 다이노밀에서 750mlℓ분의 속도로 분쇄시켰다. 여기서 얻어진 분쇄된 효모 용액을 12,000rpm(4℃, Beckman JA-14로우터)으로 50분 동안 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물을 회수하였다. 모아진 침전물에 다시 2ℓ의 완충용액(20mM Tris-HCl, lM 우레아, 1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, pH 8.0)을 넣어 호모지나이저(Beckman 사)로 현탁시킨 후, 12,000rpm (Beckman JA-14로우터)에서 50분간 원심분리하여서 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 또 다시 2ℓ의 1M 구아니딘용액(구아니딘 HCl, Amresco 사)에 호모지나이저로 현탁시킨 후 12,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 침전물을회수하였다. 이때, 회수된 침전물의 질량은 약 600g 이었다.Alpha interferon-expressed yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) lkg was suspended in a buffer solution (20mM Tris-HCl, 1M urea, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 8.0) with a homogenizer (Beckman) and 0.5-0.75mm of glass It was pulverized at a rate of 750 ml l in a dynomill with beads. The ground yeast solution obtained here was centrifuged at 12,000 rpm (4 ° C., Beckman JA-14 rotor) for 50 minutes to discard the supernatant and recover the precipitate. The collected precipitate was added again with 2 L of buffer solution (20 mM Tris-HCl, lM urea, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, pH 8.0) and suspended with a homogenizer (Beckman), followed by 12,000 rpm (Beckman JA- Sediment was recovered by centrifugation for 50 minutes). The recovered precipitate was further suspended with a homogenizer in 2 L of 1M guanidine solution (Guanidine HCl, Amresco) and centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes to recover the precipitate. At this time, the mass of the recovered precipitate was about 600g.
(실시예 2)(Example 2)
회수된 침전물 600g에 1.8ℓ의 6M 구아니딘용액(6M 구아니딘용액 HCl, 20mM Tris-HCl, 100mM β-머캅토에탄을, pH 8.0)을 넣어 4℃에서 밤새 교반하며 용해시켰다. 다음날 침전물이 녹아있는 용액을12,000rpm(4℃, Beckman 사 JA-14로우터)으로 30분동안 원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 가라앉혀 제거하고 상등액만을 모았다. 이때 모아진 상등액은 진한 갈색을 띄며 약 2.1ℓ가 되는데 여기서 6ℓ의완층용액(20mM Tris-HCl, 0.lmM PMSF, pH 8.0)을 잘 저으면서 넣어주어 4배로 희석시킨 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액을 한외여과막을 이용하여 2ℓ로 농축시킨 후, 4℃에서 50ℓ의 완충용액(20mM Tris-HCl, 0.12M NaC1, 0.1mM PMSF, pH 8.0)에 3번 투석시켰다.1.8 g of 6M guanidine solution (6M guanidine solution HCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM β-mercaptoethane, pH 8.0) was added to 600 g of the recovered precipitate, and the mixture was dissolved at 4 ° C. overnight. The next day, the dissolved solution was centrifuged at 12,000 rpm (4 ° C, Beckman JA-14 rotor) for 30 minutes to settle and remove the undissolved precipitate and collect only the supernatant. At this time, the collected supernatant was dark brown and became about 2.1 L. Here, 6 L of complete solution (20mM Tris-HCl, 0.lmM PMSF, pH 8.0) was added well, and diluted 4 times, followed by centrifugation to obtain a supernatant. The supernatant was concentrated to 2 L using an ultrafiltration membrane and dialyzed three times in 50 L buffer (20 mM Tris-HCl, 0.12 M NaC1, 0.1 mM PMSF, pH 8.0) at 4 ° C.
(실시예 3)(Example 3)
투석이 완료된 용액을 12,000rpm(4℃, Beckman 사 JA-14로우터)으로 30분간 원심분리하여 투석시키는 동안 생성된 침전물을 가라앉혀 제거한 다음 상등액만을 모은 후, 동일 완충용액(20mM Tris-HCl, 0.12m NaCl, pH 8.0)으로 평형시킨 DEAE-셀룰로즈(Whatman 사) 컬럼에서 10cm/시간의 용출 속도로통과시켜 겔에 붙지 않고 흘러나오는 단백질용액을 모아서 50ℓ의 완충용액(50mM Na-아세테이트, pH4.5)에 3회 투석시켰다.The dialysis solution was centrifuged at 12,000 rpm (4 ° C, Beckman JA-14 rotor) for 30 minutes to allow the precipitate to settle down, and then remove only the supernatant and collect the same supernatant (20 mM Tris-HCl, 0.12). m NaCl, pH 8.0) was passed through a DEAE-cellulose (Whatman) column at 10 cm / hour elution rate to collect the protein solution flowing out of the gel without sticking to 50 L of buffer solution (50 mM Na-acetate, pH 4.5). 3 times).
투석이 완료된 단백질 용액을 12,000rpm(4℃, Beckman 사 JA-14로우터)으로 30분간 원심분리하여 투석시키는 동안 생성된 침전물을 가라앉혀 제거한 후 상등액을 취했다.The dialysis solution was centrifuged at 12,000 rpm (4 ° C, Beckman's JA-14 rotor) for 30 minutes, and the resulting precipitate was allowed to settle down to remove the supernatant.
(실시예 4)(Example 4)
50mM 소디움 아세테이트, pH 4.5로 투석된 단백질 용액을 같은 완충용액으로 평형화된 CM-Sepharose 칼럼에 15cm/시간의 속도로 투여한 다음 겔에 붙지 않고 나오는 단백질의 피크가 다 떨어질 때까지 같은 완충용액으로 씻어주었다. 50mM 소디움 아세테이트, 0.12M 소디움 클로라이드, pH 4.5인 완충용액을 같은 속도로 계속 흘려보내 알파 인터페론을 용출시켰다. 피크가 다 떨어지면 50mM 소디움 아세테이트, 0.5M 소디움 클로라이드 pH 4.5인 완충용액을 흘려주어 다시 단백질을 용출시켰다.The protein solution dialyzed at 50 mM sodium acetate, pH 4.5 was administered to the CM-Sepharose column equilibrated with the same buffer at a rate of 15 cm / hour and then washed with the same buffer until the peak of the protein was released without sticking to the gel. gave. Alpha interferon was eluted by continued flow of 50 mM sodium acetate, 0.12 M sodium chloride, pH 4.5 buffer at the same rate. When the peaks ran out, 50 mM sodium acetate and 0.5 M sodium chloride pH 4.5 were passed through the buffer to elute the protein again.
CM-Sepharose 칼럼에 의한 알파 인터페론 분리를 280mm에서 흡광도를 측정하여 기록한 크로마토그램이 제1도에 나타나 있다. 제1도에서 검은 막대 부분(가)는 부분 산화된 알파 인터페론이 함유된 분획이며, 검은 막대(나)는 천연형과 동질한 알파 인터페론이 주 함유된 분획이며, 검은 막대(다)는 이량체가 주성분이 분획이다. 제1도에서 부분 산화형 알파 인터페론이 먼저 칼럼에서 용출되며(가), 천연형과 동일한 알파 인터페론인 주 단백질이 이어서 용출되며 (나), 마지막으로 0.5M 소디움 클로라이드의 조건에서 알파인터페론 이량체가 칼럼에서 용출되어 나온다(다). 천연형과 동일한 구조의 알파 인터페론에서 소량 함유된 부분 산화된 알파 인터페론을 제거하기 위하여, CM-세파로즈 칼럼을 이용하게 재분리를 수행하여 고순도의 알파 인터페론을 얻었다.The chromatogram of the alpha interferon separation by CM-Sepharose column measured by absorbance at 280 mm is shown in FIG. In FIG. 1, the black bar portion (a) is the fraction containing partially oxidized alpha interferon, the black bar (b) is the fraction mainly containing alpha interferon homogeneous with the natural form, and the black bar (c) is the dimer. The main component is fraction. In FIG. 1, the partially oxidized alpha interferon is eluted from the column first, the main protein, which is the same alpha interferon as the native form, is subsequently eluted, and finally the alpha interferon dimer is subjected to the column under conditions of 0.5 M sodium chloride. Eluted from (c). In order to remove a small amount of partially oxidized alpha interferon contained in the same type of alpha interferon structure, re-separation was performed using a CM-Sepharose column to obtain a high purity alpha interferon.
(실시예 5)(Example 5)
15% 비환원 에스. 디. 에스-폴리아크릴 아마드겔 전기 영동(non-reducing SDS-PAGE)하여 확인된 인터페론 이량체(제1도의 다)를 모아서 20mM 트리스-염산(pH 8.0) 완충용액에 투석하였다.15% non-reduced S. D. Interferon dimers identified in S-polyacrylamide gel electrophoresis (non-reducing SDS-PAGE) (C in FIG. 1) were collected and dialyzed in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer.
투석이 끝난 용액을 시스테인(cysteine, Sigma 사)과 시스타인(cystine, Sigma 사)을 첨가하여 농도가각각 5mM과 0.5mM가 되도록 해준 다음 교반시키며 4℃ 또는 상온에서 5시간 이상 방치해 두었다. 에스.디. 에스-폴리 아크릴아미드젤 전기 영동(SDS-polyacrylamide ge1-electrophoresis)으로 분석 하여 이량체가 단량체로 전환된 것을 확인한 후 50mM 소디움 아세테이트 pH 4.5완충용액에 시료를 투석하였다. 제2도는 15% 비 환원(non-reducing) SDS-PAGE상에서 알파 인터페론 이량체(가)를 상기 방법을 이용하여 알파 인터페론 단량체(나)로 전환시킨 결과를 보여 준 것이다. 산화된 글루타치온(oxidized glutathione)과 환원된 글루타치온(reduced glutathione)을 사용하여도 같은 결과를 얻었다.After the dialysis solution, cysteine (Sigma) and cysteine (cystine, Sigma) were added so that the concentrations were 5 mM and 0.5 mM, respectively, and the mixture was left to stand at 4 ° C or room temperature for at least 5 hours. S.D. After analysis by S-polyacrylamide ge1-electrophoresis (SDS-polyacrylamide ge1-electrophoresis) to confirm that the dimer was converted to the monomer, the sample was dialyzed in 50mM sodium acetate pH 4.5 buffer solution. Figure 2 shows the results of the conversion of alpha interferon dimer (A) to alpha interferon monomer (B) using the above method on a 15% non-reducing SDS-PAGE. The same results were obtained using oxidized glutathione and reduced glutathione.
(실시예 6)(Example 6)
투석이 끝난 시료는 다시 실시예 4의 방법을 통하여 단량체 알파 인터페론을 분리하였다. 이때 실시예 4에 의해 분리된 알파 인터페론과, 이량체로부터 얻은 알파 인터페론 단량체의 생물학적 역가를 비교하였다.The dialysis sample was again isolated from the monomer alpha interferon by the method of Example 4. In this case, the biological titers of the alpha interferon separated by Example 4 and the alpha interferon monomer obtained from the dimer were compared.
(실시예 7)(Example 7)
상기 실시예 4에서 얻은 알파 인터페론 부분 산화형(제1도의 가)과 이량체(제1도의 다)를 모아서 실시예 5의 방법에 의하여 실험을 할 경우 정제 수율면에서 증가된 결과를 얻을 수 있었다.When the alpha interferon partial oxidation type (A in FIG. 1) and the dimer (C in FIG. 1) collected in Example 4 were collected and tested by the method of Example 5, an increased result in terms of purification yield was obtained. .
(실시예 8)(Example 8)
농축된 단백질용액을 완충용액(20mM NH4-아세테이트, 0.12M NaC1, pH 4.5)으로 미리 평형시킨 S-300(Pharmacia 사 제품, 재질 : 교차결합된 아가로즈)에서 3cm/시간의 용출속도로 통과시켜서 겔여과크로마토그래피하였다. 여기서 얻어진 분획을 비환원(non-reducing) SDS-PAGE하여 다량체(oligomeric) 알파 인터페론이 거의 포함하지 않은 단량체 알파 인터페론만을 함유하는 분획을 모아 20ℓ의 PBS(phosphate buffered saline) 완충 용액에 3번 투석시켰다.The concentrated protein solution was passed through S-300 (Pharmacia, Material: Cross-linked Agarose) at 3 cm / hour in a pre-equilibrated buffer (20 mM NH 4 -acetate, 0.12 M NaC1, pH 4.5). Gel filtration chromatography. The fractions obtained here were non-reducing SDS-PAGE to collect fractions containing only monomeric alpha interferons containing almost no oligomeric alpha interferon and dialyzed three times in 20 L of PBS (phosphate buffered saline) buffer solution. I was.
정제된 알파-인터페론의 생리활성 측정Determination of Biological Activity of Purified Alpha-Interferon
상기의 방법에 의해 최종 정제된 재조합 알파 인터페론의 생리활성도를 측정하기 위하여 세포병변 효과(cytopathic effect)를 이용한 항바이러스 역가를 결정하였다. T 75 플라스크에서 배양한 숫송아지 신장 세포 부유액(MDBK, 3.5×105세포/ml)을 96공(孔) 플레이트에 100㎕씩 넣어 37℃, 5% CO2배양기에서 18내지 24시간 동안 배양하였다.Antiviral titers using the cytopathic effect were determined to measure the physiological activity of the recombinant alpha interferon finally purified by the above method. Male calf kidney cell suspension (MDBK, 3.5 × 10 5 cells / ml) incubated in a T 75 flask was placed in a 96-well plate in 100 μl and incubated for 18 to 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. .
인산 완충용액(pH 7.0)으로 전체공을 세척한 후 1×105∼4×105pfu/ml의 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 100ml씩 접종하여 37℃, 5% CO2배양기에서 18 내지 24시간 동안 배양 하여 세포단층을 만든후 검액인 알파 인터페론을 2배 연속 희석하여 37℃, 5% CO2배양기에서 48시간 방치하고, 크리스탈 바이오렛으로 염색하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.After washing the whole hole with phosphate buffer (pH 7.0), inoculate 100ml of 1 × 10 5 ~ 4 × 10 5 pfu / ml of vesicular stomatitis virus (VSV) at 37 ℃, 5% CO 2 incubator. After culturing for 24 hours to form a cell monolayer, the test solution alpha interferon was diluted 2 times and left for 48 hours in 37 ℃, 5% CO 2 incubator, stained with a crystal biot and the absorbance was measured at 600nm.
재조합 인간 알파 인터페론의 단백질 농도는 TCA 침전 후 로우리(Lowly) 방법을 이용하여 측정하였다. 알파 인터페론의 포준품(Gxa-01-901-535)은 미국 국립 보건원(NIH)에서 입수하였으며 비활성은 2.0×108IU/mg 이었다.Protein concentration of recombinant human alpha interferon was measured using the Lowly method after TCA precipitation. The alpha interferon standard (Gxa-01-901-535) was obtained from the National Institutes of Health (NIH) and its specific activity was 2.0 × 10 8 IU / mg.
실시예 4에서 초기에 얻은 단량체 알파 인터페론과 실시예 5와 실시예 6에 의해서 얻은 단량체 알파 인터페론의 역가결정을 한 결과 모두 1.8×108IU/mg 이상의 비활성을 보여 주었으며 통계학적인 면에서 유의성 있는 차이를 발견하지 못했다. 따라서, 이량체 알파 인터페론을 재처리하여 얻은 단량체 알파 인터페론은 생물학적 역가면에서 CM-세파로즈 크로마토그래피 초기에 얻은 알파-인터페론 단량체와 동질성을 유지하었다.The titer of the monomer alpha interferon obtained in Example 4 and the monomer alpha interferon obtained in Examples 5 and 6 both showed inactivation of 1.8 × 10 8 IU / mg or more, and there was a statistically significant difference. Did not find. Thus, monomer alpha interferon obtained by reprocessing dimer alpha interferon remained homogeneous with alpha-interferon monomer obtained early in CM-Sepharose chromatography in terms of biological titer.
역상 고성능 크로마토그래피Reverse Phase High Performance Chromatography
CM-세파로즈 분리시 초기에 얻은 완전 산화된 알파-인터페론 단량체와 이량체부터 실시예 5와 실시예 6에서 얻은 알파 인터페론의 균질성을 측정하기 위하여 역상 고성능 크로마토그레피(reverse-phase HPLC)를 실시하였다.Reverse-phase HPLC was performed to determine the homogeneity of the alpha interferon obtained in Examples 5 and 6, starting from the fully oxidized alpha-interferon monomer and dimer obtained at the time of CM-sepharose separation. It was.
15%(v/v) 아세토니트릴(15% 아세토니트릴/0.05% 트리플루오로 아세트산/H2O)로 평형시킨 C18 칼럼(μ-Bondapak, Waters 사)에 단백질을 주입한 후 5분에 걸쳐 25%(v/v) 아세토니트릴로 급격히 선형 구배하고 다시 35분에 걸쳐 56%(v/v)의 아세토니트릴로 완만히 선형구배 하였을 때, 제3도에 나타나는 바와 같이 두 종류의 단백질 모두 같은 위치에서 칼럼에서 용출되었다. 따라서, 물리화학적 면에서도 두 방법에 의해 얻은 알파 인터페론 단량체는 동질성을 유지한다고 볼 수 있었다.Inject the protein into a C18 column (μ-Bondapak, Waters) equilibrated with 15% (v / v) acetonitrile (15% acetonitrile / 0.05% trifluoro acetic acid / H 2 O) and then 25 over 5 minutes. When rapidly linearly gradient with% (v / v) acetonitrile and then slowly linearly gradient with 56% (v / v) acetonitrile over 35 minutes, both types of proteins appear at the same position as shown in FIG. Eluted from the column. Therefore, it could be seen that the alpha interferon monomers obtained by the two methods maintain homogeneity in terms of physical and chemical aspects.
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