KR940010860B1 - Novel composition for nucleic acid purification - Google Patents

Abstract

내용 없음.No content.

Description

핵산 정제용 조성물Nucleic Acid Purification Compositions

본 발명은 진핵 및 원핵 세포 및 비루스 배양물로부터 핵산을 정제 또는 분리하는 공정에 유용한 시약 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to reagent compositions useful for the process of purifying or separating nucleic acids from eukaryotic and prokaryotic cells and virus cultures.

생물공학의 실행에 있어서, 핵산 단편은 통상 원핵 및 진핵 및 비루스 배양물로부터 분리된다. 이들 단편의 분리는 그의 서열화, 진단 및 기타 연구 분석을 위한 탐침으로서의 용도 및 전체 단백질 또는 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자로의 조합을 가능하게 한다. 전통적으로 핵산은 오염된 단백질 함유 물질(즉, 박테리아 및 비루스 배양물로부터 수득한 것)을 세제(예를들어, 소듐 도데실설페이트, SDS) 및 염 용액(예를들어, 아세트산 칼륨)의 존재하에 용해(lysis)하고, 페놀 또는 클로로포름 또는 그의 혼합물로 추출(탈단백질화)함으로써 분리된다. 이러한 공정은 일반적으로 핵산을 세포 또는 비루스 배양물의 지질 및 단백질 오염물로부터 침전시킴으로써 분리하는 것이다.In the practice of biotechnology, nucleic acid fragments are usually isolated from prokaryotic and eukaryotic and viral cultures. Isolation of these fragments allows their use as probes for sequencing, diagnostic and other research analysis and combinations into genes encoding entire proteins or polypeptides. Traditionally, nucleic acids have been contaminated with protein containing material (ie, obtained from bacterial and viral cultures) in the presence of detergents (e.g. sodium dodecylsulfate, SDS) and salt solutions (e.g. potassium acetate). It is dissolved by lysis and extracted (deproteinated) with phenol or chloroform or mixtures thereof. This process is generally isolated by precipitating nucleic acid from lipid and protein contaminants of a cell or virus culture.

박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하는데 적용되는 상기 공정의 공지, 공용의 예로는 비른보임과 돌리의 "재조합 플라스미드 DNA를 스크리닝하기 위한 급속한 알칼리 추출 공정"(H.C.Birnboimand J.Doly Nucleic Acids Res.7;1513-l523(1979))에 기재되어 있다. 통상적인 방법에서, 이들 2단계,즉 용해 및 탈단백질화는 용해 단계의 시약이 탈단백질화에 포함된 시약과 혼합되지 않기 때문에 따로 수행되어야만 한다.Known, common examples of such processes that are applied to isolate plasmid DNA from bacterial cultures include the following: "Rapid Alkali Extraction Process for Screening Recombinant Plasmid DNA" by Birnboimand J. Doly Nucleic Acids Res.7; 1513-l523 (1979). In conventional methods, these two steps, ie dissolution and deproteination, must be performed separately because the reagents of the dissolution step are not mixed with the reagents involved in the deproteination.

결과적으로, 오염물로부터 핵산의 용해 및 탈단백질화는 2단계 공정을 필요로 한다.As a result, the dissolution and deproteinization of nucleic acids from contaminants requires a two step process.

본 발명은 (a) 약 1.6 내지 2.4M 아세트산 칼륨 ; (b) 약 5 내지 15중량%의 페놀; (c) 약 5 내지 15중량%의 클로로포름 ; 및 (d) 전체 조성물의 pH가 3.5 내지 5.5가 되기에 충분한 양의 아세트산을 함유하며 ; (a)의 양이 (b) 및 (c)의 총량 1 내지 3부피부에 대하여 4부피부인, 세포 또는 비루스 배양물로부터 핵산을 분리하는데 유용한 안정한 단일상 수성 조성물에 관한 것이다.The present invention provides a composition comprising (a) about 1.6 to 2.4 M potassium acetate; (b) about 5 to 15 weight percent phenol; (c) about 5 to 15 weight percent chloroform; And (d) an amount of acetic acid sufficient to bring the pH of the total composition to 3.5 to 5.5; A stable single phase aqueous composition useful for isolating nucleic acids from cell or virus cultures in which the amount of (a) is 4 parts by volume with respect to 1 to 3 parts by volume of the total amount of (b) and (c).

본 발명은 각종의 핵산 분리 공정에 사용하기 위한 독특한 안정한 단일상 수성 조성물을 제공하는 것이다. 놀랍게도 이 시약 조성물은 통상 물에 불용성인 추출 성분이 수성 용해 성분에 완전히 용해되어 안정한 시약 조성물을 형성하는 것이 발견되었다. 본 발명의 종래의 2단계 분리 기술을 조합하여 핵산 단편의 분리공정을 단순화한 것이다. 예기치않게도, 본 발명의 신규 조성물은 2단계 분리 기술보다 분리 기술에 의한 핵산 분리 생성물의 수율을 증가시킨다.The present invention provides a unique stable single phase aqueous composition for use in various nucleic acid separation processes. Surprisingly, it has been found that the reagent composition is usually insoluble in water, in which the extraction component is completely dissolved in the aqueous dissolution component to form a stable reagent composition. The conventional two-step separation technique of the present invention is combined to simplify the separation of nucleic acid fragments. Unexpectedly, the novel compositions of the present invention increase the yield of nucleic acid separation products by separation techniques over two-stage separation techniques.

본 발명은 1.6M 내지 약 3.2M 아세트산 칼륨, 약 5 내지 15중량%의 페놀, 약 5 내지 15중량%의 클로로포름 및 pH 3.5 내지 5.5를 제공하기에 충분한 양의 아세트산을 함유하는 안정한 단일상 수성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 임의로 0 내지 약 1.2중량%의 이소아밀 알코올을 함유할 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 그와 함께 또 다른 임의 성분인 0 내지 0.12중량%의 8-히드록시퀴놀린을 함유한다.The present invention provides a stable single phase aqueous composition containing 1.6 M to about 3.2 M potassium acetate, about 5 to 15 weight percent phenol, about 5 to 15 weight percent chloroform and an amount of acetic acid sufficient to provide a pH of 3.5 to 5.5. It is about. The composition of the present invention may optionally contain 0 to about 1.2 weight percent isoamyl alcohol. Or together with another optional ingredient 0-0.12% by weight of 8-hydroxyquinoline.

이 조성물의 주요 성분인 아세트산 칼륨 및 페놀/클로로포름은 페놀과 클로로포름의 성분 총량 약 1 내지 3부피부에 대해 4부피부의 아세트산 칼륨의 비가 바람직하다. 바람직한 조성물은 4:1비율의 조성물이다. 바람직한 예에서, 조성물의 성분은 2.4M 아세트산 칼륨, 10M 아세트산, 10% 페놀, 10%클로로포름, 0.2%이소아밀 알코올 및 pH 5의 0.02% 히드록시퀴놀린이다. 이 바람직한 용액은 60ml 5M 아세트산 칼륨, 12ml 클로로포름,40ml 아세트산, 12ml 페놀,1ml 이소아밀 알코올 및 pH 5의 0.012g 8-히드록시퀴놀린이다.Potassium acetate and phenol / chloroform, which are the main components of this composition, preferably have a ratio of 4 parts of potassium acetate to about 1 to 3 parts by weight of the total amount of phenol and chloroform. Preferred compositions are compositions in 4: 1 ratio. In a preferred example, the components of the composition are 2.4M potassium acetate, 10M acetic acid, 10% phenol, 10% chloroform, 0.2% isoamyl alcohol and 0.02% hydroxyquinoline at pH 5. This preferred solution is 60 ml 5M potassium acetate, 12 ml chloroform, 40 ml acetic acid, 12 ml phenol, 1 ml isoamyl alcohol and 0.012 g 8-hydroxyquinoline at pH 5.

이 시약 조성물의 놀라운 현상은 페놀의 용해도를 변화시킨다는 것이다. 이러한 사실은 이러한 성분의 조합이 아세트산 칼륨 용액의 이온 강도를 변화시키고, 용액과 페놀이 혼화할 수 있게 하며, 무한정의 시간동안 안정하게 한다는 것을 나타낸다.A surprising phenomenon of this reagent composition is that it changes the solubility of phenol. This fact indicates that the combination of these components changes the ionic strength of the potassium acetate solution, allows the solution and phenol to mix, and stabilizes for indefinite time.

이 시약 조성물은 실온(25℃)에서 적어도 30일 동안 안정하며, 적어도 60일 동안 안정하게 저장 가능하다.The reagent composition is stable at room temperature (25 ° C.) for at least 30 days and can be stably stored for at least 60 days.

본 발명의 안정한 조성물은 다수의 용해 및 추출 시약을 본 발명의 조성물로 대체함으로써 박테리아 배양물로 부터의 플라스미드 DNA의 정제 및 박테리오파지 M13으로부터 단일 가닥 주형 DNA의 분리를 포함한 각종 표준 DNA 분리 공정에 유용하다. 본 발명의 시약은 또한 포유류 세포로 부터의 핵산 분리와 같이 다른 조직원 예를들어, 원핵 세포뿐만 아니라 진핵 세포로부더 DNA 및 RNA를 분리하기 위해 당업자에게 공지된 표준 용해 및 추출 기술 대신에 이용될 수 있다.The stable compositions of the present invention are useful for a variety of standard DNA separation processes including purification of plasmid DNA from bacterial cultures and separation of single stranded template DNA from bacteriophage M13 by replacing multiple lysis and extraction reagents with the compositions of the present invention. . The reagents of the present invention may also be used in place of standard lysis and extraction techniques known to those of skill in the art to separate DNA and RNA from other tissue sources, such as prokaryotic cells as well as eukaryotic cells, such as nucleic acid separation from mammalian cells. have.

본 발명의 시약 조성물은, 티.매니아티스(Molecular Cloning-A Laboratory Mannual, Cold SpringHarbor Laboratory,1982)에 기술된 바와 같은 수작업 DNA 분리 공정 또는 하기의 실시예 2에 기술된 바와 같은 자동화 공정에 이용될 수 있다. 상기 2유형의 공정에서, 본 발명의 조성물은 분리된 핵산의 수율을 효과적으로 증가시키며 본 시약의 사용에 의해 수행되는 용해 및 탈단백 기능의 조합으로 인해 공정상의 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 증명된다.The reagent composition of the present invention can be used in a manual DNA separation process as described in T. Maniatis (Molecular Cloning-A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) or in an automated process as described in Example 2 below. Can be. In these two types of processes, it is demonstrated that the compositions of the present invention can effectively increase the yield of isolated nucleic acids and increase process efficiency due to the combination of solubilization and deproteinization functions performed by the use of this reagent.

본 발명의 시약 조성물은 그의 안정성으로 인해 핵산 분리 공정에 유용한 시약의 키트의 일부일 수 있다. 또는, 이 조성물은 자동화 분리 공정에 사용할 수 있는 용기, 예를들면 자동화 분리 장치에서 대체 가능하게 적합한 용기에 포함될 수 있다.The reagent compositions of the present invention may be part of a kit of reagents useful for nucleic acid separation processes because of their stability. Alternatively, the composition may be included in a container that can be used in an automated separation process, such as a container alternatively suitable for an automated separation device.

하기의 실시예는 본 발명의 조성물의 바람직한 예 및 자동화 핵산 분리 공정에서의 그의 용도를 설명하는것이다.The following examples illustrate preferred examples of the compositions of the present invention and their use in automated nucleic acid separation processes.

[실시예 1]Example 1

시약 조성물의 제조Preparation of Reagent Compositions

본 발명에 따른 조성물은 다음과 같이 제조한다.The composition according to the invention is prepared as follows.

제 1용액은 48ml의 5M 아세트산 칼륨을 32ml의 빙초산과 혼합함으로써 제조한다(이 용액에서 아세트산에 대한 아세트산 칼륨의 비가 3 : 2 중량비인 것이 바람직하다.). 9.9ml의 페놀, 0.1중량%의 8-히드록시퀴놀린, 9.9ml의 클로로포름 및 0.2ml의 이소아밀 알코올을 순서대로 가함으로써 제 2용액을 제조한다. 이들 2용액을 함께 혼합함으로써 pHl 5의 안정한 단일상 조성물을 형성한다,The first solution is prepared by mixing 48 ml of 5M potassium acetate with 32 ml of glacial acetic acid (the ratio of potassium acetate to acetic acid in this solution is preferably 3: 2 by weight). A second solution is prepared by sequentially adding 9.9 ml of phenol, 0.1 weight% of 8-hydroxyquinoline, 9.9 ml of chloroform and 0.2 ml of isoamyl alcohol. These two solutions are mixed together to form a stable single phase composition of pHl 5,

[실시예 2]Example 2

박테리아 세포로부터 플라스미드 DNA의 분리Isolation of Plasmid DNA from Bacterial Cells

5ml의 SOBM 배지(Maniatis et al., 상기에서 설명, p 69)에 이.콜리(E.coli) JM101 박테리아 세포 및 M13mp19 박테리오파지를 접종하고,37℃에서 밤새 배양한다. 세포를 3000rpm의 속도로 10분 동안 원심분리함으로써 농축한다. 배지를 제거한 후, 생성된 펠렛을 0.3ml의 50mM 글루코오스, 10mM 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA) 및 10mM Trris-Cl, pH7.5에 재현탁시키고, 실온에서 2분 동안 교반한다. 교반 직후, 0.6ml의 0.2N NaOH 및 1% SDS를 가하고, 용액을 실온에서 15초 동안 서서히 교반한 후, 30초 동안 배양하고, 다시 15초 동안 교반한다.5 ml of SOBM medium (Maniatis et al., Described above, p 69) are seeded with E. coli JM101 bacterial cells and M13mp19 bacteriophage and incubated overnight at 37 ° C. Cells are concentrated by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. After removing the medium, the resulting pellet is resuspended in 0.3 ml of 50 mM glucose, 10 mM ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) and 10 mM Trris-Cl, pH7.5 and stirred at room temperature for 2 minutes. Immediately after stirring, 0.6 ml of 0.2N NaOH and 1% SDS are added and the solution is slowly stirred at room temperature for 15 seconds, then incubated for 30 seconds and stirred for another 15 seconds.

이 용액에 0.54ml의 실시예 1의 조성물을 가한다. 이 혼합물을 15초 동안 서서히 교반하고, 30초 동안배양한 후, 다시 15초 동안 교반하고, 3000rpm에서 15분 동안 원심분리한다.To this solution is added 0.54 ml of the composition of Example 1. The mixture is stirred slowly for 15 seconds, incubated for 30 seconds, then stirred for 15 seconds again, and centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm.

생성된 상층액을 0.8미크론 공극 크기 셀룰로오스 아세테이트 필터 및 5ml 리시버 튜브(Schilecher and Schuell)로 된 시험관에 옮긴다. 1.3ml의 이소프로판올을 튜브에 가하고, 서서히 교반한 후, 실온에서 2분동안 배양한다. DNA를 필터에 결합시키기 위해 튜브의 내용물을 실온에서 3000rpm으로 4분 동안 원심분리한다. DNA가 필터에 결합하는 동안, 0.5ml의 70% 에탄올을 튜브에 가하고, 다시 2분 동안 원심분리한다. 이 단계를 3회 더 반복하여 오염물을 완전히 제거한다.The resulting supernatant is transferred to a test tube of 0.8 micron pore size cellulose acetate filter and 5 ml receiver tubes (Schilecher and Schuell). 1.3 ml of isopropanol is added to the tube, stirred slowly and incubated for 2 minutes at room temperature. The contents of the tube are centrifuged at 3000 rpm for 4 minutes at room temperature to bind the DNA to the filter. While the DNA is bound to the filter, 0.5 ml of 70% ethanol is added to the tube and again centrifuged for 2 minutes. Repeat this step three more times to remove contaminants completely.

리시버 튜브를 제거하고, 1.5ml의 뚜껑없는 에펜도르프 튜브로 대체한다. 10mM Tris-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA 및 20㎍/ml RNase A를 함유한 시약 용액 0.1ml를 튜브에 가하고, 실온에서 30분 동안 배양하여 DNA가 필터로부터 이틸되도록 한다.튜브 빛 내용물을 3000rpm으로 실온에서 4분 동안 원심분리한다.Remove the receiver tube and replace with 1.5 ml unopened eppendorf tube. 0.1 ml of reagent solution containing 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA and 20 μg / ml RNase A is added to the tube and incubated for 30 minutes at room temperature to allow DNA to escape from the filter. Tube light contents at 3000 rpm Centrifuge for 4 minutes at room temperature.

10μl의 생성된 용액을 새로운 에펜도르프 듀브에 넣는다. 1.2μl의 10×EcoR I 완충액(New England Biolabs)을 1단위의 EcoR I 제한 효소와 함께 가하고, 생성된 용액을 37℃에서 2시간 동안 배양한다. DNA 단편을 함유한 용액을 겔 전기 영동에 의해 분석하여 선형화된 7.2kb의 M13mp19 벡타 DNA를 제조한다.10 μl of the resulting solution is placed in a new Eppendorf Dive. 1.2 μl of 10 × EcoR I buffer (New England Biolabs) is added with 1 unit of EcoR I restriction enzyme and the resulting solution is incubated at 37 ° C. for 2 hours. The solution containing the DNA fragments is analyzed by gel electrophoresis to produce linearized 7.2 kb M13 mp19 vector DNA.

매니아티스 등에 의해 기술된 공정을 동일한 배양물을 정제하는데 적용할 때, 전기 영동 겔 데이타는 본발명의 조성물을 이용한 상기 공정과 같은 결과를 나타내었다. 그러나, 자동화 공정에 본 발명의 조성물을 사용함으로 인한 시간 절약은 약 10∼15퍼센트이다. 또한, 수작업 및 자동화 DNA 플라스미드 분리 공정에서, 본 발명의 조성물을 사용하면 상당히 높은 수율의 분리된 DNA 단편을 얻을 수 있다.When the process described by Maniatis et al. Was applied to purify the same culture, electrophoretic gel data showed the same results as the above process using the composition of the present invention. However, the time savings from using the compositions of the present invention in automated processes are about 10-15 percent. In addition, in manual and automated DNA plasmid separation processes, the compositions of the present invention can be used to obtain significantly higher yields of isolated DNA fragments.

본 발명의 조성물의 수많은 변형 및 용도가 당업자에게 예측될 수 있을 것이다. 그러한 변형은 첨부된 특허 청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 믿어진다.Numerous variations and uses of the compositions of the invention may be expected to those skilled in the art. Such modifications are believed to be encompassed by the appended claims.

Claims (3)

(a) 약 1.6 내지 2.4M의 아세트산 칼륨 ; (b) 약 5 내지 15중량%의 페놀 ; (c) 약 5 내지 15중량%의 클로로포름 ; 및 (d) 조성물의 pH가 3.5 내지 5.5가 되기에 충분한 양의 아세트산을 함유하며, (a)의 양이 (b) 및 (c)의 총량 1 내지 3부피부에 대해 4부피부인, 세포 또는 비루스 배양물로부터 핵산을 분리하는데 유용한 안정한 단일상 수성 조성물.(a) about 1.6 to 2.4 M potassium acetate; (b) about 5 to 15 weight percent phenol; (c) about 5 to 15 weight percent chloroform; And (d) a sufficient amount of acetic acid to bring the pH of the composition to 3.5 to 5.5, wherein the amount of (a) is 4 parts by volume relative to 1 to 3 parts by volume of (b) and (c) or A stable single phase aqueous composition useful for separating nucleic acids from virus culture. 제 1 항에 있어서, (e) 0 내지 약 1.2중량%의 이소아밀 알코올 : 및 (f) 0 내지 약 0.12중량%의 히드록시퀴놀린을 더 함유하는 조성물.The composition of claim 1, further comprising (e) 0 to about 1.2 weight percent isoamyl alcohol: and (f) 0 to about 0.12 weight percent hydroxyquinoline. 제 1 항에 있어서, (a) 2. M의 아세트산 칼륨 ; (b) 10M의 아세트산 ; (c) 10중량%의 페놀 ; (d)10중량%의 클로로포름 ; (e) 0.2중량%의 이소아밀 알코올 ; 및 (f) 0.02중량%의 히드록시퀴놀린을 함유하는 조성물.The method of claim 1, wherein (a) 2. M potassium acetate; (b) 10 M acetic acid; (c) 10% by weight of phenol; (d) 10% by weight of chloroform; (e) 0.2% by weight of isoamyl alcohol; And (f) 0.02% by weight of hydroxyquinoline.