KR920008369B1 - 프로테아제의 단리방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

프로테아제의 단리방법

제1도는 본 발명의 실시예 1에서 지렁이 현탁액의 방치시간과 프로테아제 용해활성과의 관계를 나타낸 그래프 및 전기영동사진.

제2도는 본 발명의 실시예 1에서 한외여과막 통과후의 분자량크기에 따른 각 분획의 전기영동사진.

제3도는 본 발명의 실시예 1에서 음이온교환컬럼의 단계를 거친후 각 분획의 전기영동사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 프로테아제의 단리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 지렁이 추출물의 불순혼합물로부터 막여과공정과 음이온교환수지컬럼을 연속적으로 사용하여 불순물을 분리시키면서 일정범위의 단백질 가수분해 활성을 갖는 효소들을 효율적으로 분리해내는 프로테아제의 단리방법에 관한 것이다.

지렁이는 고대 동양 의학에서 혈관장해에 관한 질환에 이미 널리 사용되어 왔으며, 특히 해열, 경련치료, 혈액순환촉진, 반신불수치료, 고혈압치료등 혈관질환치료에 효과가 있다고 알려져 있다(중약 대사전 : 강소신의학원편, 2112(1980), 한약임상응용 : 488-489). 또한 지렁이의 체강내에는 단백질 가수분해 활성을 갖는 단백질이 존재하는 것으로 알려져 있다(Comp. Biochem. Physiol., 25,1061. 1986).

이러한 효과와 성분을 지닌 지렁이 현탁액에는 탄수화물, 리피드, 헥산등과그들의 분해산물들을 포함하고 있을 뿐만아니라, 지렁이 표피등 다른 여러가지 불순물들을 함유하고 있다.

따라서, 지렁이 분말 또는 현탁액상에서 단백질 가수분해능이 없는 불필요한 물질들을 제거하고 단백질 가수분해 활성을 가지는 효소를 얻기 위해서는 별도의 분리단계가 필요하다.

그런데, 단백질은 자체의 특수기능을 수행함에 있어서 구조적 안정성에 의존하는 고분자물질이기 때문에 용매조성물중, pH, 온도 및 염농도 그리고 단백질의 추출시간은 활성에 매우 큰 영향을 미치고 때로는 회복할 수 없는 단백질 변성이 초래될 수 있으므로, 천연공급원으로부터 단백질을 예비정제시키는 초기단계가 매우 중요하다.

이러한 단백질 추출방법으로서, 기존의 일본특허공개공보 소 59-63184호 및 소 59-184131호의 방법에서는 원료가 되는 출발물질에서 겔컬럼을 첫단계에서 사용하였는바, 이 방법은 비용이 많이 들고 특히 처리하는 시간이 길어야하므로 역가각 떨어질 뿐만 아니라 높은 수율을 얻기 어렵고, 많은 양의 시료를 처리할 수 없다는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위해서 일본특허공개공보 소 64-75431호에서는 단백질을 예비정제시키는 초기단계에서 겔컬럼을 사용치 않고 바로 음이온교환컬럼을 사용하였으나, 이경우에는 많은 저분자량의 펩타이드 또는 단백질들이 포함되어 있으므로 컬럼의 효율이 매우 떨어지게 되므로 대량 생산이 어렵게 된다.

따라서, 본 발명은 단백질 정제시 막여막과와 음이온교환수지컬럼을 연속적으로 시행함으로써 불필요한 불순물들을 효율적으로 제거하고 단백질 가수분해능이 있는 단백질들을 효소역가가 높은 상태로 빠른 시간내에 대량으로 얻을 수 있도록 하는 프로테아제의 단리방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 지렁이 추출물로부터 단백질 가수분해 활성을 가지고 있는 단백질 분획만을 분리함에 있어서, 지렁이 추출물 현탁액으로부터 공지의 방법으로 얻은 침전물분획을 막여과와 음이온교환수지컬럼과정을 차례로 수행하여 분리시키되 막여과는 디스크막 또는 스파이럴/할로우파이비 캇트릿지를 사용하고 음이온교환수지컬럼은 DEAE(디에틸아미노에틸)음이온교환수지를 이용하여 분리시키는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 단리방법이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 지렁이로부터 얻은 침전분획을 막여과장치와 음이온교환수지컬럼을 연속적으로 통과시키는 것에 그 특징을 두고 있는바, 본 발명에서 사용하는 막여과장치중이 막여과수지는 디스크막을 사용할 경우에는 분자량 1,000∼300,000달톤이상의 차단막을 사용하고, 스파이럴/할로우파이버캇트릿지를 사용할 경우는 분자량 1,000∼300,000달톤이상 차단막을 사용한다.

만일 이때 그 분자량이 너무 크면 다당류등과 같은 고분자물질의 오염의 문제가 생기고, 너무 적을 경우 고압이 막에 걸리게 되고, 용액의 용출속도가 느리게 되는 문제가 발생하고 저분자량 문질의 오염을 제거할 수가 없게 된다.

또한, 음이온교환수지컬럼과정은 음이온교환수지로써 DEAE(Diethylaminoethyl)를 사용하는데, 이때 염화나트륨의 농도는 0mM에서 500mM까지 단계적으로 변화시키면서 실시한다. 이러한 염화나트륨의 단계적 농도변화는 대량 분취를 위한 것으로 연속적 농도변화 보다는 훨씬 간편한 공정이다.

이러한 본 발명의 프로테아제 단리방법을 상세한 공정으로 설명하면, 우선 지렁이의 몸체에 있는 오물을 제거하고 살아있는 상태 그대로 10∼35℃, 바람직하기로는 20∼25℃의 온도를 유지하면서 등장액에 3∼12시간정도 방치한다. 이는 지렁이의 생리적 기능을 극대화시키기 위한 것으로서, 이렇게하면 지렁이의 체내에 있는 오물이 대부분 배출되게 된다. 그후 물로 지렁이를 깨끗이 세척하고 인산염완충액에 넣은후 호모게나이저로 분쇄하여 지렁이 현탁액을 얻는다.

이렇게 얻어진 지렁이 현탁액을 10∼35℃, 바람직하게는 20∼25℃의 온도에서 서서히 교반하면서 수일간 방치시키면 단백질 가수분해 활성이 초기에는 급격히 증가하다가 그 이후에는 완만히 증가하는 양상을 나타내게 된다.

이에 대해서는 첨부도면 제1도에 나타낸 바와 같이 초기에는 급격하게 프로테아제 활성을 나타내다가 그 후부터는 완만하게 증가됨을 알 수 있다.

따라서, 이렇게 단백질 활성이 증가하므로 적절한 시간, 바람직하기로는 100∼150시간동안 방치시킨 지렁이 현탁액을 원심분리하고 그 상등액을 25∼55％ 황산암모늄을 이용하여 황산암모늄 부분분리법[J. Biol. Chem., 222, 705.1986]으로 처리하여 첨전물분획을 얻는다.

이 침전물을 다시 인산염완충액에 넣고 1,000∼300,000달톤이상, 바람직하기로는 10,000∼200,000이상의 차단막을 이용하여 막여과를 실시한다. 이로한 막여과후 얻어진 성분중의 프로테아제 활성회수율은 93％이상이 된다.

따라서, 이러한 막여과과정을 통하게되면 불순혼합물로부터 저분자령의 물질과 일정분자량 이하의 펩타이드나 단백질 부산물들을 단백질 가수분해 효소들의 손실없이 매우 빠른 시간내에 제거할 수가 있게 된다.

그다음으로는 막여과후 얻은 분획에 인산완충액을 넣고 희석시킨다음, 음이온교환수지컬럼에 통과시켜 단백질 혼합물중에 존재하는 미부착 불순물을 제거한다.

상기한 바와 같은 분리과정을 거치게 되면 막여과와 음이온 교환수지컬럼을 차례로 이용하므로서, 막의 용출능을 이용하여 일정범위의 분자량 크기를 가진 단백질만을 얻고, 음이온교환수지컬럼시 컬럼에 미부착 분순단백질드를 제거함으로써 최종적으로는 75％이상, 보통으로는 78±3％의 매우 높은 회수율로 프로테아제를 단리해낼 수 있고, 그 분리시간도 일주일 정도에 불과하여 기준의 겔컬럼을 사용시 15일이상 걸리는 것에 비해 약 2배 이상 빠르게 단축할 수가 있게 된다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따르면 종래와는 달리 지렁이 추출물로부터 막여과와 음이온교환수지컬럼 과정을 연속적으로 수행하며 간단하고 경제적인 방법으로도 고수율의 단백질 가수분해효소인 프로테아제를 다량으로 분리해낼 수가 있다는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명한다.

[실시예 1]

물로 지렁이 몸체에 있는 오물을 제거한 후 증류수로 만든 등장액 15ℓ(0.9％ 나트륨 w/v)로 살아있는 지렁이 5㎏을 방치한다. 8시간을 방치하여(온도 25℃)지렁이 체내에 있는 오물을 배설시킨후 물로 지렁이를 깨끗하게 세척한다.

오물을 제거한 지렁이에 소디움애자이드(NaN₃0.01％, w/v)를 포함한 10ℓ의 인산완충액(phosphate buffer, 10mM, pH7.0)에 산 지렁이를 넣어 치사시킨후 초고속호모게나이저로 17,000rpm에서 1분간 3회씩 분쇄하여 지렁이 현탁액을 얻었다.

지렁이 현탁액 상태로 온도 25℃에서 서서히 교반하면서 방치하였으며, 그 결과는 제1도에 나타나 있는 바, 이 도표는 지렁이 현탁액의 방치시간과 피브린용해활성(％)과의 관계를 나타낸 것이다.

그리고, 제1도내의 전기영동사진은 기질로 소의 혈청알부민을 사용하여 현탁액의 방치시간에 따른 단백질 가수분해 활성을 나타낸 것이다. 레인 1은 기질인 수의 혈청 알부민만을 넣은 것이고, 레인 2, 3, 4는 각각 1, 2, 4일간 방치한 현탁액과 반응시킨 것이다. 이러한 결과는 단백질 가수분해 활성의 증가와, 비례하게 피브린 평판의 용해면적(mm²)도 증가하는 양상을 부여준다.

위와 같이 25℃에서 교반상태로 120시간동안 반응시킨 지렁이 현탁액 7.5ℓ를 취해 고속 원심분리(30,000×g, 60분간 4℃)하였다. 원심분리한 상등액에 황산암모니움 부분분리법(염석)으로 25∼55％ 황산암노니움을 0℃에서 처리하였다. 이때 단백질 변성으로 인한 효소활성을 최소화하기 위해 서서히 저어주면서 황산암모니움을 첨가하였다. 처리액을 1시간동안 방치하여 완전히 균질화시킨 후 원심분리(15,000×g, 60분간 4℃)하여 25∼55％ 황산암모니움 침전물 분획 256.5g을 얻었다.

침전물중에서 62.7g을 인산완충용액(phosphate buffer. pH7.4 20mM)2ℓ에 녹인후, 분자량 10,000달톤 이상의 차단막을 이용하여 한외여과막을 수행하였다. 한외여과시 압력인 100psi(7bar)이하로 하였으며, 상층액의 부피가 300ml 정도되면 인산 완충용액 100ml를 첨가하는 방식으로 3회 반복하였고 상기의 모든 과정은 4℃에서 수행하였다.

제2도의 레인 1은 분자량 측정용 대조구이고, 레인 2는 막을 통과하여 한외여과된 액을 나타내며, 레인 3은 막을 투과하지 않고 남아있는 분자량 10,000달톤이상의 단백질들을 나타낸 것이다. 전체 단백질 가수분해 활성은 94.4±3.0％ 정도 회수되었으며, 레인 3의 피브린 분해활성은 172㎟/㎎이었다. 전기영동 결과 여과된 액(레인 2)에서는 분자량 10,000달톤이상의 단백질 띠를 발견할 수 없었다.

이러한 결과는 단백질 가수분해 활성을 나타내는 단백질이 분자량 10,000달톤이상임을 보여주고, 또한 전기영동 결과 대부분의 단백질이 단일상태에서 분자량이 60,000달톤이하로 나타나는 것으로 보아 활성화 상태도 300,000달톤이하로 보인다.

레인 2,3의 시료를 동량씩 취해서 동결건조한 결과는 다음 표 1에서 나타냈다.

[표 1]

한외여과후 분자량이 10,000달톤이상인 분획에 인산완충액(phosphate buffer, pH7.4, 20mM)을 넣어 최종 부피가 2500ml가 되도록 희석시킨 후, 미리 평형시킨 음이온교환수지컬럼(DEAE Sepharose CL-6B 4.4×46㎝)에 5ml/min의 유속으로 통과시켜 단백질 혼합물을 컬럼에 부착시켰다.

컬럼에 부착되지 않는 물질들을 상기 완충용액으로 충분히 씻어준다음, 인산완충용액(20mM, pH7.4)/염화나트륨(Sodium chloride 250mM, 500mM)용액으로 각각 200ml씩 용출시켜 컬럼에 부착된 단백질 가수분해 활성을 가진 효소들을 얻었다. 용출된 수용액에 존재하는 염을 제거하기 위해 스파이럴 막 캇트릿지(spiral membrane cartridges)를 사용하였다. S10Y10막을 사용하였고, 입력은 60psi(4.1bar)으로 여과하였다.

이 결과를 나타내는 전기영동 사진은 제3도와 같은바, 제3도의 레인 1은 분자량 측정용 대조구이고, 레인 2는 음이온교환수지컬럼(DEAE Sepharose CL-6B 4.4×46cm)에 부착된 단백질을 250mM 염화나트륨으로 용출시킨 분획이고, 레인 3은 500mM 염화나트륨으로 용출시킨 분획이다. 전기영동 결과 대부분의 단백질이 단일 상태에서 분자량이 60,000달톤 이하로 나타나는 것으로 보아 활성화 상태도 300,000달톤이하로 보인다. 레인 2,3의 시료의 단백질 가수분해 활성을 비교하여 다음 표 2에 나타냈다.

[표 2]

최종적으로 얻은 프로테아제 분획은 250mM 염화나트륨 용출분획이 4.1g이고, 500mM 염화나트륨 분획이 2.3g으로 전체적으로 6.4g을 얻었다. 따라서 프로테아제의 최종 활성회수율은 78±3％로 매우 높게 나타났으며, 분리 시간도 기존의 방법에 비해서 2배 이상 빠르게 단축할 수 있다.

[실시예 2]

지렁이 현탁액 7.5ℓ를 가지고 상기 실시예 1과 같은 방법으로 단백질을 분리하되 원심분리 방법 대신 할로우파이버캇트릿지(hollow fiber cartridges : 분자량 1,000,000이상 차단)를 이용하여 최종 프로테아제 분획 6.2g을 얻었다.

[비교예]

지렁이 추출물 현탁액으로부터 공지의 방법으로 얻은 침전물 분획 60g을 처리하는데 있어서 겔컬럼 사용시 컬럼크기가 10×50cm인 경우 4g을 한번에 처리할 수 있으나 본 실시예에 있어서 60g을 한번에 처리할 수 있을 뿐만아니라 같은 크기의 스파이럴/할루우파이버캇트릿지를 사용할 경우 이의 10배량에 해당하는 양을 동시에 처리할 수 있다. 뿐만 아니라 처리시간도 겔컬럼의 고압액체 크로마토그래피를 이용할 경우 1시간가량 소요되며, 저압액체 크로마토그래피에서는 한번 처리하는데 통상 10시간 이상이 소요되므로 60g을 처리하려면 최소한 15시간에 많게는 150시간 이상이 걸리게 되나 스파이럴/할로우파이버를 이용한 한외 여과를 수행할 겨우 4시간정도면 충분하다.

이상의 실험결과로부터 본 발명의 실시예와 기존 방법으로 비교해 본 결과 다음 표 3과 같은 결과를 얻었다.

[표 3]

Claims (3)

1. 지렁이 추출물로부터 단백질가수분해 활성을 가지고 있는 단백질분획만을 분리함에 있어서, 지렁이 추출물 현탁액으로부터 공지의 방법으로 얻은 침전물분획을 막여과와 음이온교환수지컬럼과정을 차례로 수행하여 분리시키되 막여과는 디스크막 또는 스파이럴/할로우파이버 캇트릿지를 사용하고 음이온교환수지컬럼은 DEAE(디에틸아미노에틸)음이온교환수지를 이용하여서 분리시키는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 단리방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 막여과 과정에서 막여과수지로 사용된 디스크막은 그 분자량이 1,000∼300,000달톤이상을 차단하는 막인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 단리방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 막여과 과정에서 막여과수지로 사용된 스파이럴/할로우파이버캇트릿지는 그 분자량이 1,000∼1,000,000달톤이상의 차단막인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 단리방법.