KR920005659B1 - Process for preparing insulin derivatives - Google Patents

Abstract

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Description

인슐린 유도체의 제조방법Method for preparing insulin derivatives

본 발명은 등전점이 5.8 내지 8.5인 일반식(I)의 인슐린 유도체 및 생리학적으로 허용되는 이의 염의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to the preparation of insulin derivatives of general formula (I) having isoelectric points of 5.8 to 8.5 and physiologically acceptable salts thereof.

(I)

(I)

상기식에서 R¹은 H 또는 H-Phe을 나타내고 R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성을 L-아미노산 라디칼을 나타내며 R³¹은 이 구조중에 0 내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 말단 카복실 그룹은 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서, 락톤으로서 유리형으로 존재하거나 CH₂OH로 환원될 수 있는 생리학적으로 허용되는 탄소수 50 이하의 염기성 유기 그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical which can be genetically encoded, and R ³¹ represents 0-3α-amino acid in the structure and any terminal carboxyl group As the ester functional group, as the amide functional group, it represents a physiologically acceptable basic organic group having 50 or less carbon atoms which can be present in the free form as lactone or can be reduced to CH ₂ OH.

현재, 일반적으로, 혈당을 낮추어주는 호르몬 인슐린 제제는 당뇨병 치료를 위해 비경구적으로 투여된다. 인슐린은 간단한 용액의 형태로는 작용 지속 시간이 매우 짧은 특별한 성질 및 대사작용을 하기 때문에 당뇨병 환자의 혈당을 지속적으로 조절하기 위해서는 계량 기구로 계속 주입하거나, 일일 수회 주사하거나 서작용성 인슐린 제제를 사용해야 한다. 주사부위에서 거의 용해되지 않는 인슐린의 상태(예 : 결정 또는 무정형 상태)가 여기에서 서작용성 원리로써 특히 중요하다. 또한, 서서히 재용해되면서 특정 작용 시간에 걸쳐 인슐린을 방출하는 아연 인슐린 결정 또는 프로타민 인슐린 결정은 더욱 연구해야될 과제이다.Currently, generally, hormone insulin preparations that lower blood sugar are administered parenterally for the treatment of diabetes. Insulin is a simple solution that has special properties and metabolisms with very short duration of action, so it is necessary to continue to inject into the measuring device, to inject several times a day, or to use a slow-acting insulin preparation to continuously control the blood sugar of diabetics. do. The state of the insulin, such as a crystalline or amorphous state, which hardly dissolves at the injection site is of particular importance here as a slow-acting principle. In addition, zinc insulin crystals or protamine insulin crystals, which are slowly re-dissolved and release insulin over a specific time of action, are subjects for further study.

개개 환자의 요구에 가능한한 부합하는 작용 특성을 가지는 인슐린 제제를 다양하게 구비함으로써 치료면에서 상당히 유용함이 최근에서야 입증되었다. 오진 때문에 망막증, 신경증, 신장병증 및 미세- 및 거대-협심증을 포함하는 당뇨병의 지체된 합병증이 특히 고혈당증 또는 저혈당증과 같은 증상 이외에 문제시되고 있다.It has only recently been proven to be of great utility in terms of treatment by having a variety of insulin preparations with action characteristics as closely as possible to the needs of the individual patient. Due to misdiagnosis, delayed complications of diabetes, including retinopathy, neurosis, nephropathy and micro- and macro-angina, are particularly problematic in addition to symptoms such as hyperglycemia or hypoglycemia.

당뇨병 환자의 경우에 인슐린이 결핍된다 함은 신체가 더 이상 지연적인 호르몬 균형을 유지할 수 없음을 의미한다.Insulin deficiency in diabetics means that the body can no longer maintain a delayed hormonal balance.

본 발명의 목적은 당뇨병 환자에 있어서 더 적합한 호르몬 균형을 유지하게 해주거나 이제까지의 통상의 인슐린 제제를 투여함으로써 나타나는 호르몬 균형보다도 더 우수한 균형을 유지할 수 있게 하는 인슐린 유도체 또는 상응하는 약제학적 제제를 제조하는데에 있다.It is an object of the present invention to prepare insulin derivatives or corresponding pharmaceutical formulations which allow for a more suitable hormonal balance in diabetics or a better balance than the hormonal balance seen by administration of conventional insulin formulations up to now. Is in.

본 발명에 따라, 이 목적은 한가지 이상의 인슐린 유도체(들) (이의 B쇄가 C-말단 부위에서 염기성 유기 그룹을 포함한다) 및 이들 인슐린 유도체를 활성 화합물로 함유하는 약제학적 제제에 의해서 달성되었다.According to the invention, this object has been achieved by one or more insulin derivative (s) whose B chain comprises a basic organic group at the C-terminal site and pharmaceutical preparations containing these insulin derivatives as active compounds.

B쇄의 C-말단상에 Arg-OH 또는 Arg-Arg-OH 라디칼을 포함하는 인슐린 유도체가 이미 기술되었다. 공지된 바와 같이, 이들 유도체는 생체내에서 프로인슐린이 인슐린으로 효소적으로 전환될때 천연 중간체로서 형성되며, 또한 췌장 추출물중에서도 소량이 발견된다. 언급한 라디칼은 통상적으로 트립신 및/또는 카복시펩티다제 B 또는 유사한 특성을 갖는 효소에 의해서 분해되며, 변형되지 않은 인슐린은 분리된다.Insulin derivatives containing Arg-OH or Arg-Arg-OH radicals on the C-terminus of the B chain have already been described. As is known, these derivatives are formed as natural intermediates when the proinsulin is enzymatically converted to insulin in vivo and is also found in small amounts in pancreatic extracts. The radicals mentioned are typically degraded by trypsin and / or carboxypeptidase B or enzymes with similar properties, and unmodified insulin is isolated.

일반식(I)의 인슐린 유도체중에서, 특히 R³¹은 일반식 -XnS의 라디칼이고, 여기에서 n은 0, 1, 2 또는 2 또는 3이며, X는 천연의 중성 또는 염기성 L-아미노산, 바람직하게는 염기성 L-아미노산, 특히 Arg, Lys, His 또는 Orn의 동일하거나 상이한 라디칼 및/또는 이들에 상응하는 D-아미노산의 동일하거나 상이한 라디칼을 나타내고 S는 OH이거나, 또는 카복실 그룹을 차단하고, n이 0인 경우에 양전하를 띄거나 또는 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하거나, n＞0인 경우에, 그러한 라디칼을 포함할 수 있는 생리학적으로 허용되는 그룹을 나타내며, C-말단-X-S는 또한 상응하는 알코올로 환원되는 아미노산의 라디칼을 나타내거나 또는 n이 2 또는 3인 경우에 호르세린락톤 라디칼을 나타낼 수 있다.Among the insulin derivatives of general formula (I), in particular R ³¹ is a radical of general formula -XnS, wherein n is 0, 1, 2 or 2 or 3 and X is a natural neutral or basic L-amino acid, preferably Represents the same or different radicals of basic L-amino acids, in particular of Arg, Lys, His or Orn and / or of the corresponding D-amino acids and S is OH or blocks a carboxyl group and n is 0 represents a basic radical that can be positively charged or quantized, or if n> 0, it represents a physiologically acceptable group that can contain such radicals, and C-terminal-XS also corresponds to It may represent a radical of the amino acid is reduced to an alcohol or when the n is 2 or 3, it may represent a Horerin lactone radical.

일반식(I)의 바람직한 인슐린 유도체는 R³⁰이 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내고 a) R¹이 H를 나타내며 R³¹은 a1) 카복실 그룹을 차단하고 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하는 생리학적으로 허용되는 그룹 S^B, a2.1) X^N-S^B(여기에서, X^N는 천연의 중성 L-아미노산 또는 이의 D-형 아미노산의 라디칼을 나타낸다). a2.2) X^B-S(여기에서, X^B는 천연의 염기성 L-염기성 L-아미노산 또는 이의 D-형 아미노산의 라디칼을 나타내고, S는 OH 또는 카복실 그룹을 차단하고 임의로 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하는 그룹을 나타낸다), a2.3) 상응하는 알코올로 환원되는 염기성 아미노산 X^B의 라디칼 Y, a3.1) -Xn-S(여기에서, n은 2 또는 3이고, X는 라디칼 X^N및/또는 X^B를 나타내며, 라디칼 X가 모두 X^N이면, S는 S^B만을 나타낼 수 있다), a3.2) -Xn-Y(여기에서, n은 1또는 2이다), a3.3) -X^B-Z, -X^B-X^N-Z, -X^N-X^B-Z 또는-X^B-X^B-Z(여기에서 Z는 Y이거나 호모세린-락톤 라디칼을 나타낸다)을 나타내거나, 또는 b) R¹이 H-Phe를 나타내며 R³¹은 b1) a1)에서 정의한 바와 같거나, b2.1) a2.1)에서 정의한 바와 같거나, b2.2) Lys-OH, D-Lys-OH, D-Arg-OH, Hyl-OH, D-Hyl-OH, Orn-OH, D-Orn-OH, Cit-OH, D-Cit-OH, D-Cit-OH, His-OH 또는 D-His-OH를 나타내거나, b2.3) X^B-S'(여기에서 S'는 OH를 제외한 S의 의미와 같다)을 나타내거나, b2.4) a2.3)에서 정의한 바와 같거나, b3.1) X-X'-OH 또는 X-X'-OH(여기에서, X'는 b2.2)에서 정의한 바와 같다)를 나탄내거나, b3.2) X₂-S'를 나타내거나 b3.3) a3.1) (여기에서, n은 3이다)에서 정의한 바와 같거나, b3.4) a3.2) 또는 a3.3)에서 정의한 바와 같은 화합물이다.Preferred insulin derivatives of formula (I) are those in which R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical which can be genetically encoded, a) R ¹ represents H and R ³¹ blocks a1) a carboxyl group and is positively charged or Physiologically acceptable group S ^B , a2.1) comprising basic radicals that can be quantized X ^N -S ^B (where X ^N represents a radical of a natural neutral L-amino acid or D-type amino acid thereof) ). a2.2) X ^B -S, wherein X ^B represents a radical of a natural basic L-basic L-amino acid or a D-type amino acid thereof, and S blocks an OH or carboxyl group and is optionally positively charged or quantized A2.3) radical Y of basic amino acid X ^B reduced to the corresponding alcohol, a3.1) -Xn-S, where n is 2 or 3, and X represents the radicals X ^N and / or X ^B , and if the radicals X are all X ^N, then S may represent only S ^B ), a3.2) -Xn-Y, where n is 1 or 2 , a3.3) -X ^B -Z, -X ^B -X ^N -Z, -X ^N -X ^B -Z or -X ^B -X ^B -Z, where Z is Y or a homoserine-lactone radical Or b) R ¹ represents H-Phe and R ³¹ is as defined in b1) a1), b2.1) as defined in a2.1), or b2.2) Lys- OH, D-Lys-OH, D-Arg-OH, Hyl-OH, D-Hyl-OH, Orn-OH, D-Orn-OH, Cit-OH, D-Cit -OH, D-Cit-OH, His-OH or D-His-OH, b2.3) X ^B -S '(where S' is the same as S except OH), or b2.4) as defined in a2.3) or b3.1) X-X'-OH or X-X'-OH, where X 'is as defined in b2.2) or b3.2) represents X ₂ -S 'or as defined in b3.3) a3.1) (where n is 3), or in b3.4) a3.2) or a3.3) Compound as defined.

B1 위치에 페닐알라닌을 포함하는 인슐린 유도체가 특히 바림직하다. B30 위치에 Ala, Thr 또는 Ser을 함유하는 것이 또한 바람직하다.Particular preference is given to insulin derivatives comprising phenylalanine at the B1 position. It is also preferred to contain Ala, Thr or Ser at the B30 position.

본 발명에 따른 화합물의 A쇄와 (B2-29)쇄는 소 또는 돼지 인슐린; 특히 사람 인슐린의 서열과 같다.Chain A and (B2-29) of the compound according to the present invention may be selected from bovine or porcine insulin; In particular the sequence of human insulin.

아미노산 라디칼 X, X^N및 X^B와 라디칼 Y 및 Z는 각각 독립적으로 D 또는 L-배위일 수 있다. 그러나, L-배위가 모든 이들 라디칼의 경우에 바람직하다. 하기 L-아미노산이 유전학적으로 암호될 수 있다 :

및

(밑줄친 것은 중성 아미노산임).The amino acid radicals X, X ^N and X ^B and the radicals Y and Z may each independently be D or L-coordinated. However, L-coordination is preferred for all these radicals. The following L-amino acids can be genetically encoded:

And

(Underlined are neutral amino acids).

중성의 천연 아미노산에는 특히, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro 또는 Hyp가 포함된다. 염기성의 천연 아미노산에는 특히, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit 또는 His가 포함된다.Neutral natural amino acids include, in particular, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asn, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro or Hyp. Basic natural amino acids include, in particular, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit or His.

본 발명에 따른 화합물의 B쇄의 C-말단에서 유리 카복실 작용기를 차단할 수 있는 그룹에는 무엇보다도, 에스테르 및 아미드 그룹, 특히(C₁내지 C₆)-알콕시, (C₃내지 C₆)-사이클로알콕시, NH₂, (C₁내지 C₆)-알킬아미노, 디-(C₁내지 C₆)-알킬아미노는 아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, (C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 트리-(C₁내지 C₄)-암모니오-(C₂내지 C₆)-알콕시, 아미노-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, [(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노[디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노 또는 [트리(C₁내지 C₄)-알킬암모니오]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, 특히 -O-[CH₂]p-NR₂, -O-[CH₂]p-NR₃, -NH-[CH₂]p-

R₂또는 -NH-[CH₂]p-N

R₃(여기에서 p는 2 내지 6이고 라디칼 R은 동일하거나 상이하며, 수소 또는 (C₁내지 C₄)-알킬을 나타낸다)와 같은 염기성 그룹이 포함된다.Among the groups capable of blocking free carboxyl functionality at the C-terminus of the B chain of the compounds according to the invention are, among other things, ester and amide groups, in particular (C ₁ to C ₆ ) -alkoxy, (C ₃ to C ₆ ) -cyclo Alkoxy, NH ₂ , (C ₁ to C ₆ ) -alkylamino, di- (C ₁ to C ₆ ) -alkylamino is amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, (C ₁ to C ₄ ) -alkyl Amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, di- (C ₁ to C ₄ ) -alkylamino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, tri- (C ₁ to C ₄ ) -ammonio- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, [(C ₁ to C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino [di- (C ₁ To C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino or [tri (C ₁ to C ₄ ) -alkylammonio]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, especially —O— [CH ₂ ] p-NR ₂ , -O- [CH ₂ ] p-NR ₃ , -NH- [CH ₂ ] p-

R ₂ or -NH- [CH ₂ ] pN

Basic groups such as R ₃ , where p is 2 to 6 and the radicals R are the same or different and represent hydrogen or (C ₁ to C ₄ ) -alkyl, are included.

본 발명에 따른 인슐린 유도체계에는 하기 화합물이 예로써 언급될 수 있으나, 이들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.In the insulin derivative system according to the present invention, the following compounds may be mentioned by way of example, but they do not limit the present invention.

데스-Phe^B1-돼지의 인슐린-Arg^B31-OHDeath-Phe ^B1 -Pig's Insulin-Arg ^B31 -OH

데스-Phe^B1-사람의 인슐린-Arg^B31-OHDeath-Phe ^B1 -Human Insulin-Arg ^B31 -OH

데스-Phe^B1-돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OHDeath-Phe ^B1 -Pig's Insulin-Arg ^B31- Arg ^B32 -OH

데스-Phe^B1-사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OHDeath-Phe ^B1 -Human Insulin-Arg ^B31- Arg ^B32 -OH

돼지의 인슐린-Arg^B31-OCH₃ Porcine Insulin-Arg ^B31 -OCH ₃

사람의 인슐린-Arg^B31-OCH₃ Human Insulin-Arg ^B31 -OCH ₃

소의 인슐린-Arg^B31-OCH₃ Bovine Insulin-Arg ^B31 -OCH ₃

돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OCH₃ Pig's insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OCH ₃

사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OCH₃ Human Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OCH ₃

데스-Thr^B30-사람의 인슐린-Val^B30-Arg^B31-OHDeath-Thr ^B30 -Human Insulin-Val ^B30- Arg ^B31 -OH

데스-Thr^B30-사람의 인슐린-Val^B30-Arg^B31-Arg^B32-OHDeath-Thr ^B30 -Human Insulin-Val ^B30- Arg ^B31- Arg ^B32 -OH

사람의 인슐린-Lys^B31-OHHuman Insulin-Lys ^B31- OH

사람의 인슐린-D-Arg^B31-OHHuman Insulin-D-Arg ^B31 -OH

사람의 인슐린-D-Arg^B31-Arg^B32-OHHuman Insulin-D-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH

사람의 인슐린-Arg^B31-D-Arg^B32-OHHuman Insulin-Arg ^B31 -D-Arg ^B32 -OH

사람의 인슐린-Lys^B31-Arg^B32-OHHuman Insulin-Lys ^B31 -Arg ^B32 -OH

사람의 인슐린-Arg^B31-Lys^B32-OHHuman Insulin-Arg ^B31- Lys ^B32 -OH

사람의 인슐린-Argininol^B31 Human Insulin-Argininol ^B31

사람의 인슐린-Val^B31-Arg^B32-OHHuman Insulin-Val ^B31 -Arg ^B32 -OH

사람의 인슐린-Val^B31-Arg^B32-Arg^B33-OHHuman Insulin-Val ^B31 -Arg ^B32 -Arg ^B33 -OH

사람의 인슐린-Arg^B31-Argininol^B32 Human Insulin-Arg ^B31 -Argininol ^B32

사람의 인슐린-Lys^B31-Arg^B32-Arg^B33-OHHuman Insulin-Lys ^B31 -Arg ^B32 -Arg ^B33 -OH

사람의 인슐린-Arg^B31-NH₂ Human Insulin-Arg ^B31 -NH ₂

사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-NH₂ Human Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -NH ₂

사람의 인슐린-Orn^B31-OHHuman Insulin-Orn ^B31 -OH

사람의 인슐린-Leu^B31-Cit^B32-OHHuman Insulin-Leu ^B31 -Cit ^B32 -OH

사람의 인슐린-(B30)-OCH₂CH₂-NH₂ Human Insulin- (B30) -OCH ₂ CH ₂ -NH ₂

사람의 인슐린-(B30)-NH-CH₂CH₂-NH₂ Human Insulin- (B30) -NH-CH ₂ CH ₂ -NH ₂

사람의 인슐린-Arg^B31-O-CH_2-CH₂-NH₂ Human Insulin-Arg ^B31 -O-CH _2- CH ₂ -NH ₂

사람의 인슐린-Arg^B31-CH_2-CH₂-N(CH₃)₂ Human Insulin-Arg ^B31 -CH _2- CH ₂ -N (CH ₃ ) ₂

사람의 인슐린-(B30)-O-CH₂-CH₂-

(CH₃)₃ Human Insulin- (B30) -O-CH ₂ -CH _2-

(CH ₃ ) ₃

사람의 인슐린-(B30)-NH-CH₂-CH₂-

(CH₃)₃ Human Insulin- (B30) -NH-CH ₂ -CH _2-

(CH ₃ ) ₃

사람의 인슐린-Leu^B31-O-CH₂-CH₂-CH₂-

(C₂H₅)₃ Human Insulin-Leu ^B31 -O-CH ₂ -CH ₂ -CH _2-

(C ₂ H ₅ ) ₃

사람의 인슐린-Trp^B31-Trp^B32-Trp^B33-NH(CH₂)₆-

[N(CH₂)₃CH₃]₃ Human Insulin-Trp ^B31 -Trp ^B32 -Trp ^B33 -NH (CH ₂ ) _6-

[N (CH ₂ ) ₃ CH ₃ ] ₃

본 발명은 또한 a) 일반식(Ⅱ)의 데스-옥타펩타이드(B23-30)-인슐린을 일반식(Ⅲ)의 펩타이드와 축합시키고, 경우에 따라 라디칼 R³⁰및 R³¹에 존재하는 유리 COOH, OH, SH, NH₂, 구아니디노 및/ 또는 이미다졸 그룹을 공지된 방법으로 보호하며, 적절하게는 공지된 방법으로 존재하는 보호 그룹을 제거하거나, b) 트립신 또는 트립신-유사 엔도펩티다제의 존재하에 R¹이 H 또는 H-Phe를 나타내고 C-말단 R³⁰-R³¹이 함께 OH를 나타내는 일반식(Ⅰ)의 데스-B30 인슐린을 일반식(Ⅳ)의 화합물과 반응시키고, 경우에 따라 존재하는 유리 COOH, OH, SH, W-NH₂, 구아니디노 및/또는 이미다졸 그룹을 자체가 공지된 방법으로 보호한 다음, 적절하게는 자체가 공지된 방법으로 존재하는 보호 그룹을 제거하거나, 또는 c) R³¹중의 L-배위에 있는 아미노산 라디칼을 포함하는 인슐린 유도체를 제조하기 위해 화학적 및/또는 효소적으로 프로인슐린, 프로인슐린 동족체 또는 프로프로인슐린 동족체 또는 이들 화합물의 중간체를 분해함을 특징으로 하여, 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention also provides a process for a) condensing des-octapeptide (B23-30) -insulin of formula (II) with a peptide of formula (III) and optionally present free COOH present in the radicals R ³⁰ and R ³¹ , Protects OH, SH, NH ₂ , guanidino and / or imidazole groups by known methods, suitably removes protecting groups present in known methods, or b) trypsin or trypsin-like endopeptidase Des-B30 insulin of formula (I), wherein R ¹ represents H or H-Phe and C-terminal R ³⁰ -R ³¹ together represent OH, reacts with a compound of formula (IV) Thus protecting the free COOH, OH, SH, W-NH ₂ , guanidino and / or imidazole groups present in a known manner and then suitably removing the protecting groups present in a known manner. or, c) R ³¹ in the insulin comprises an amino acid radical in the L- coordination A method for producing an insulin derivative of general formula (I), characterized by degrading proinsulin, proinsulin analogs or proproinsulin analogs or intermediates of these compounds chemically and / or enzymatically to prepare a conductor. will be.

(II)

(II)

H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S²)-Thr(S²)-Pro-Lys(S³)-R³⁰-R³¹(Ⅲ)H-Gly-Phe-Phe-Tyr (S ² ) -Thr (S ² ) -Pro-Lys (S ³ ) -R ³⁰ -R ³¹ (III)

H-R³⁰-R³¹(Ⅳ)HR ³⁰ -R ³¹ (Ⅳ)

상기식에서, R¹은 Phe 또는 결합을 나타내고 S¹은 3급-부톡시카보닐(Boc), 3급-아밀옥시카보닐(Aoc) 또는 메틸설포닐에톡시카보닐(Msc) 라디칼과 같은 양자 가용매분해에 의해서 또는 β-제거반응에 의해서 분해될 수 있는 아미노 보호 그룹을 나타내며, R³⁰및 R³¹은 상기에서 정의한 바와 같고 S²는 수소, Bzl 또는 Bu^t를 나타내며, S³는 Boc, Moc, Fmoc 또는 Z와 같은 우레탄-보호 그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ represents Phe or a bond and S ¹ protons such as tert-butoxycarbonyl (Boc), tert-amyloxycarbonyl (Aoc) or methylsulfonylethoxycarbonyl (Msc) radicals Represents an amino protecting group that can be degraded by solvolysis or by β-elimination, wherein R ³⁰ and R ³¹ are as defined above and S ² represents hydrogen, Bzl or Bu ^t , and S ³ represents Boc, Urethane-protecting groups such as Moc, Fmoc or Z.

변형 공정 a)에서는, 예를 들어, 데스-옥타펩타이드-(B23-30)-인슐린의 N_α ^A1, N_α ^B1-비스-Boc 유도체를 직접 1-하이드록시벤조트리아졸의 존재하에 축합제로서 사용되는 디사이클로헥실카보디이미드의 당량보다 약간 작은 1당량의 일반식(Ⅲ)화합물과 미합중국 특허 제4, 029, 642호에 기술된 제조방법에 의해서 반응시킨다.In the modification process a), for example, N _α ^A1 , N _α ^B1 -bis-Boc derivatives of des-octapeptide- (B23-30) -insulin are directly condensed in the presence of 1-hydroxybenzotriazole. The reaction is carried out by the preparation method described in US Pat. No. 4, 029, 642 with one equivalent of the general formula (III) compound which is slightly smaller than the equivalent of the dicyclohexylcarbodiimide used.

이 변형 공정에서는 대개 카복실 그룹을 보호할 필요가 없기 때문에, 에스테르화 과정 및 알칼리 가수분해 과정중에 생길 수 있는 인슐린 유도체의 손실을 피할 수 있다. 반응하지 않은 데스-옥타펩타이드, 및 일반식(Ⅳ)의 화합물과 Asp^A21-OH의 축합에 의해서 생성되는 펩타이드는 그들의 서로 다른 분자 크기 및 전하 No.에 따라 세파덱스^R-LH20에서 분배 크로마토그라피시키거나, 세파덱스^R-G75 또는 G50 초정밀기에서 겔 크로마토그라피시킴으로써 쉽게 제거할 수 있다.This modification process usually does not need to protect the carboxyl groups, thus avoiding the loss of insulin derivatives that may occur during the esterification and alkali hydrolysis processes. Unreacted des-octapeptides, and peptides produced by the condensation of the compounds of formula (IV) with Asp ^A21 -OH, were chromatographed on Sephadex ^R- LH20 according to their different molecular size and charge No. Or by gel chromatography on a Sephadex ^R- G75 or G50 ultraprecision machine.

3급-부틸 보호 그룹을 제거하기 위해서는 반응 생성물을 트리플루오로아세트산으로 실온에서 30내지 60분 동안 처리해야 한다. 이 반응에서 인슐린 유도체의 손실은 없다. 메틸설포닐 에톡시카보닐 라디칼이 N-보호 그룹으로 선택되면, β-제거에 의한 분해를 위해 알칼리로 처리해야한다. 반응 조건은 인슐린 유도체의 손실이 없도록 하는 조건(예 0.1N, NaOH, 0℃, 5초)이다. 출발 물질로서 사용되는 돼지로부터 얻어지는 N_α A1, N_α ^B1-비스-Boc-데스-B_23-30-옥타펩타이드-인슐린은 예를 들어 다음과 같은 경로로 제조된다 : 돼지의 인슐린을 N-에틸 모폴린의 존재하에 디메틸 포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 물의 혼합물중에서 과량의 3급-부톡시카보닐-N-하이드록시석신이미드 에스테르와 반응시킨다. 따라서 예상되는 N_α ^A1, N_α ^B1-N_B29-트리스-Bocㅡ 인슐린이 얻어진다.To remove the tert-butyl protecting group, the reaction product must be treated with trifluoroacetic acid for 30 to 60 minutes at room temperature. There is no loss of insulin derivatives in this reaction. If the methylsulfonyl ethoxycarbonyl radical is selected as the N-protecting group, it must be treated with alkali for degradation by β-elimination. Reaction conditions are conditions such that there is no loss of insulin derivatives (eg 0.1 N, NaOH, 0 ° C., 5 seconds). N obtained from pig used as starting material_α A1, N_α ^B1-Bis-Boc-des-B_23-30Octapeptide-insulin is prepared, for example, by the following route: Excess tert-butoxycarbonyl in porcine insulin in a mixture of dimethyl formamide, dimethylsulfoxide and water in the presence of N-ethyl morpholine React with N-hydroxysuccinimide ester. So N expected_α ^A1, N_α ^B1-N_B29-Tris-Boc-Insulin is obtained.

소량의 트립신을 전기 영동에 의해 출발 물질이 더 이상 감지되지 않을때까지 디메틸포름아미드 및 트리스 완충액(pH 7.5)중 이 화합물 용액에 가한다. N_α ^A1, N_α ^B1-비스-Boc-데스-B_23-30-옥타펩타이드-인슐린을 세파덱스^R-LH20에서 분배 크로마토그라피시켜서 정제한다.A small amount of trypsin is added to this compound solution in dimethylformamide and Tris buffer (pH 7.5) until the starting material is no longer detected by electrophoresis. N _α ^A1 , N _α ^B1 -bis-Boc-des-B _23-30 -octapeptide-insulin is purified by partition chromatography on Sephadex ^R- LH20.

이 화합물을 pH 약 7내지 8에서 펩타이드 화학 방법에 의해 공지된 방법으로 제조된 1몰의 일반식(Ⅲ)의 펩타이드, 1 내지 2몰의 1-하이드록시 벤조트리아졸 및 약 0.9몰의 디사이클로헥실 카보디이미드와 디메틸포름아미드 중에서 반응시킨다(비교 Chem. Ber.103(1970), page 788). 조 생성물을 분배 크로마토그라피에 의해 정제하고 실온에서 트리플루오로아세트산/아니솔로 처리하여 보호 그룹을 제거한다. 에테르로 침전시키고, 물로 등전 침전시킨 다음 세파덱스^R-G75 또는 G50 초정밀기 상에서 크로마토그라피시킨 후의 화합물은 전기영동적으로 순수하며 공지의 방법으로 결정화할 수 있다. 이렇게 수득된 인슐린 유도체는 생물학적으로 완전한 활성을 갖는다.This compound is prepared by a known method by peptide chemistry at pH about 7 to 8, 1 mole of general formula (III) peptide, 1-2 moles of 1-hydroxy benzotriazole and about 0.9 mole of dicyclo React in hexyl carbodiimide and dimethylformamide (Compare Chem. Ber. 103 (1970), page 788). The crude product is purified by partition chromatography and treated with trifluoroacetic acid / anisole at room temperature to remove protective groups. The compound after being precipitated with ether, isoelectrically precipitated with water and chromatographed on a Sephadex ^R- G75 or G50 ultra-precision machine is electrophoretically pure and can be crystallized by known methods. The insulin derivatives thus obtained have biologically complete activity.

본 발명에 따른 공정에 출발 화합물로 사용되는 데스-Phe^B1-인슐린은, 예를 들어 독일연방공화국 특허 제2, 005, 658호 또는 유럽 특허 제A-46, 979호에 기술되어 있다.Des-Phe ^B1 -insulins used as starting compounds in the process according to the invention are described, for example, in German Patent No. 2, 005, 658 or European Patent No. A-46, 979.

변형 공정 b)에서 출발 화합물로 사용되는 데스-B30-인슐린은, 예를 들어, 유럽 특허원 제46, 979호 또는 문헌(Hoppe-Seyler's Z.Physiol. Chem.359(1978) 799)에 기술되어 있다. 변형 공정 b)에서 사용되는 일반식(Ⅳ)의 출발 물질은 펩타이드 화학 방법에 의해 자체가 공지된 방법으로 제조된다. 일반식(Ⅳ)의 화합물을 위해 사용될 수 있는 보호 그룹은 문헌(M.Bodanzyky et al., Peptide Synthesis, Ind.Ed.1976, Wiley ＆ Sons)에 상술되어 있다.Des-B30-insulin used as starting compound in the modification process b) is described, for example, in EP 46, 979 or in Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978) 799. have. The starting material of formula (IV) used in the modification process b) is prepared by methods known per se by the peptide chemistry method. Protective groups that can be used for compounds of general formula (IV) are detailed in M. Bodanzyky et al., Peptide Synthesis, Ind. Ed. 1976, Wiley & Sons.

데스-B30-인슐린과 일반식(Ⅳ)의 화합물을 pH 5 내지 9, 20 내지 40℃의 온도에서 유기-수용 용매계중의 트립신 또는 트립신-유사 엔도펩티다제 존재하에 미합중국 특허 제4, 320, 196호에 기술된 것과 유사한 방법에 의해서 서로 축합시킨다. 생성된 인슐린 유도체는 통상적인 펩타이드 화학 방법에 의해서 분리될 수 있다. 사람 또는 영장류로부터 얻어지는 프로인슐린은 변형 방법 c)의 출발 물질로서 유전공학에 의해 제조된다. Arg(B31)과 di-Arg(B31-32) 유도체는 트립신 또는 트립신-유사 효소로 간단히 분해시켜서 얻을 수 있다. 그러나, 또한 상응하는 프리프로인슐린 유도체이 분해에 의해서, 천연적으로 B31 또는 B32에 생기는 아르기닌 대신에 다른 중성 또는 염기성 아미노산을 암호화함으로써, 신규한 인슐린 유도체를 생성할 수 있는 비교적 간단한 플라스미드를 만들 수 있다.Des-B30-insulin and a compound of formula (IV) were prepared in the presence of trypsin or trypsin-like endopeptidase in an organic-aqueous solvent system at a temperature of pH 5-9, 20-40 ° C. Condensate with each other by a method similar to that described in 196. The resulting insulin derivatives can be isolated by conventional peptide chemistry methods. Proinsulins obtained from humans or primates are produced by genetic engineering as starting material for the modification method c). Arg (B31) and di-Arg (B31-32) derivatives can be obtained by simple digestion with trypsin or trypsin-like enzyme. However, it is also possible to produce relatively simple plasmids which, by digestion of corresponding preproinsulin derivatives, encode other neutral or basic amino acids instead of the arginine naturally occurring in B31 or B32.

재조합된 DNA 방법을 사용하는 프로인슐린 제조방법은 프로인슐린의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA서열의 형성이 필요하며, 이는 분리하거나 작제하여 또는 이 둘의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 다음에 프로인슐린 DNA를 판독 단계에서 적절한 클로닝(cloning) 및 발현 캐리어(expression carrier)에 삽입한다. 캐리어는 적절한 미생물을 형질전환시키고 수득된 형질전환된 미생물을 발효시킴에 따라 프로인슐린 유전자를 함유하는 벡터의 다른 복제물이 형성되며 프로인슐린, 프로인슐린 유도체 또는 프로인슐린 전구체(또는 프리프로인슐린 유도체)가 발현된다.Proinsulin preparation methods using recombinant DNA methods require the formation of a DNA sequence encoding the amino acid sequence of proinsulin, which can be accomplished by isolation, construction, or a combination of the two. Proinsulin DNA is then inserted into the appropriate cloning and expression carrier in the reading step. As the carrier transforms the appropriate microorganism and ferments the obtained transformed microorganism, another copy of the vector containing the proinsulin gene is formed and the proinsulin, proinsulin derivative or proinsulin precursor (or preproinsulin derivative) Expressed.

발현 물질이 프로인슐린 전구체인 경우, 이와 같은 물질은 일반적으로 그의 말단 아미노 그룹에서 프로인슐린 또는 프로인슐린 유도체가 삽입된 유전자 서열에 의해 대개 발현되는 단백질 단편에 결합되는 프로인슐린 아미노산 서열을 함유한다. 프로인슐린 아미노산 서열은 특정하게 분해될 수 있는 부위, 예를 들어 메티오닌을 통해 단백질 단편에 결합된다. 생성된 프로인슐린 아미노산 서열은 예를 들어, 독일연방공화국 특허 제A 3, 232, 036호에 기술된 바와 같이 융합된 유전자 생성물로부터 분해되며, 정제후 프로인슐린이 분리된다.When the expression material is a proinsulin precursor, such material generally contains a proinsulin amino acid sequence that is bound to a protein fragment that is usually expressed by a gene sequence into which a proinsulin or proinsulin derivative is inserted in its terminal amino group. Proinsulin amino acid sequences are linked to protein fragments through sites that can be specifically cleaved, such as methionine. The resulting proinsulin amino acid sequence is cleaved from the fused gene product, as described, for example, in Federal Patent Application A 3, 232, 036, and the proinsulin is isolated after purification.

이 방법으로 얻어지는 프로인슐린 또는 프로인슐린 유도체의 효소적 분해는 문헌(참조, Excerpta Medica International Congress Series No.231, page 292 et seq.) 또는 독일연방공화국 특허원 제P 32 09 184호(HOE 85/F 407)에 기술된 것과 유사한 방법에 의해서 수행된다.Enzymatic digestion of proinsulin or proinsulin derivatives obtained by this method can be found in the literature (see Excerpta Medica International Congress Series No. 231, page 292 et seq.) Or in the Federal Republic of Germany Patent Application No. P 32 09 184 (HOE 85 / Carried out by a method similar to that described in F 407).

공지된 아르기닌(B30) 및 디-아르기닌(B31-32) 유도체 및 유전 공학에 의해 얻어지고 R³¹중에 천연의 L-아미노산을 갖는 공지된 유도체 이외에, 분자의 순 전하(net charge)가 변형되지 않은 인슐린 또는 데스-Phe^B1-인슐린과 비교할때 하나 이상의 양 전하에 의해 증가되도록 특징으로서, 하나 또는 여러개의 염기성 그룹을 갖고/갖거나 유리 카복실 그룹이 부재인 일련의 신규한 인슐린 유도체를 기술된 반합성법에 의해 얻을 수 있다.In addition to known arginine (B30) and di-arginine (B31-32) derivatives and known derivatives obtained by genetic engineering and having natural L-amino acids in R ³¹ , the net charge of the molecule is not modified. Semisynthetic methods described as a series of novel insulin derivatives characterized by increased by one or more positive charges as compared to insulin or des-Phe ^B1 -insulin, with one or several basic groups and / or without free carboxyl groups Can be obtained by

이러한 유도체에는 예를 들어, B31 위치에 천연 아미노산 L-리신, L-히스티딘 또는 L-아르기닌 대신에, 이들의 D-에난티오머 또는 측쇄에 염기성 그룹(예를 들어, 오르니틴 또는 하이드록시리신)을 포함하는 통상의 D- 또는 L-아미노산 동족체를 함유하는 유도체가 포함된다. 아미노산 대신에, 콜린 에스테르 그룹이 예를 들어 B31의 위치에 존재할 수 있으며, 이 경우에는 2개의 순 양전하가 얻어진다. B31 위치의 아미노산 또는 아미노산 동족체는 유리 카복실 말단을 갖거나, 간단한 알코올(예 : 메탄올 또는 에탄올)로 에스테르화되거나, 또는 간단한 질소 염기(예 : 암모니아 또는 모노- 또는 디-메틸아민)로 아미드화될 수 있으며 ; 또한, 예를 들어 콜린으로 에스테르화될 수 있다. 중성 또는 다른 천연의 염기성 아미노산 또는 상기에 기술된 아미노산 유도체중 하나는 B32 위치에 다음에 올 수 있으며, 유사한 방법으로, 이의 카복실 그룹은 유리되거나 에스테르화 또는 아미드화될 수 있다. 또한 이 경우에, 콜린 에스테르 그룹 또는 다른 중성 또는 염기성 아미노산 또는 아미노산 동족체가 계속 이어질 수 있다.Such derivatives include, for example, basic groups (eg ornithine or hydroxylysine) in their D-enantiomers or side chains, instead of the natural amino acids L-lysine, L-histidine or L-arginine at the B31 position, for example. Derivatives containing conventional D- or L-amino acid homologues including are included. Instead of amino acids, choline ester groups can be present, for example, at the position of B31, in which case two net positive charges are obtained. The amino acid or amino acid homologue at position B31 may have a free carboxyl terminus, be esterified with a simple alcohol such as methanol or ethanol, or amidated with a simple nitrogen base such as ammonia or mono- or di-methylamine Can; It can also be esterified, for example, with choline. Neutral or other natural basic amino acids or one of the amino acid derivatives described above may follow the B32 position and in a similar manner, the carboxyl groups thereof may be free or esterified or amidated. Also in this case, choline ester groups or other neutral or basic amino acids or amino acid analogs can continue.

모든 이들 인슐린 유도체는 분자 표면상의 부가 양전하가 중성 범위로 이동되는 분자의 등전점을 결정해주는 일반적인 특성을 지니고 있다. 유도체에 따라 5.8 내지 8.5, 특히 6.2 내지 8.2의 동전점을 갖는다. 따라서, 중성 범위에 있는 유도체는 각각의 등전점을 가짐으로써 pH 5.4에서 최대 불용성인 변형되지 않은 인슐린 또는 프로인슐린보다 용해도가 작은 반면, 통상 중성범위에서는 용해된 형태를 갖는다.All these insulin derivatives have the general property of determining the isoelectric point of a molecule in which the added positive charge on the surface of the molecule is shifted to the neutral range. Depending on the derivative, it has a coin point of 5.8 to 8.5, in particular 6.2 to 8.2. Thus, derivatives in the neutral range have a respective solubility point, so that they are less soluble than unmodified insulin or proinsulin at pH 5.4, which are maximally insoluble, while usually in dissolved form in the neutral range.

인슐린과 프로인슐린의 용해성은 등전점 이상의 영역, 즉 특히 아연 이온을 첨가함으로써 특정 치료 효과가 있는 중성 범위에 의해 영향을 받는다. 여기에서 아연은 인슐린의 헥사메릭 상태 및 그의 결정화하려는 경향을 안정화시킴으로써 데포제(depot principle)로서 작용한다. 이들 응고물은 다시 피하조직에서 용해된다.The solubility of insulin and proinsulin is influenced by the region above the isoelectric point, ie the neutral range with particular therapeutic effects by adding zinc ions. Zinc acts here as a depot principle by stabilizing the hexameric state of insulin and its tendency to crystallize. These coagulum again dissolves in the subcutaneous tissue.

또 다른 최근의 데포제 원리는 염기성 단백질, 예를 들어 글로빈 또는 프로타민과의 복합체로서 인슐린 또는 프로인슐린의 결정화이다.Another recent depot agent principle is the crystallization of insulin or proinsulin as a complex with basic proteins such as globin or protamine.

프로인슐린이 용액 또는 기술된 데포제중의 하나와 관련하여 사용되면, 변형되지 않은 완전히 활성인 인슐린을 방출하기 위하여 단백질 분해의 감소가 더 필요하다. 이론에 따르면 표면의 생물학적으로 활성인 영역중 일부인 수용체-결합 영역이 프로인슐린중에서 존재하는 C-펩타이드에 의해서 차단되기 때문에, 접촉 프로인슐린은 인슐린의 생물학적 활성의 약 1/8만을 나타낸다, 균일한 프로인슐린만이, 즉, 사람의 서열을 갖는 프로인슐린만이 당뇨병을 치료하는데 적합함은 재론의 여지가 없다(비교예 : 독일연방공화국 특허 제 A1-3, 232, 036호). 이중 구조의 프로인슐린은 월등한 면역 유전성을 갖는다. 이와 관련하여, 사람의 프로인슐린은 또한 C-펩타이드 부분에서 다양한 성질을 나타낼 수 있다.If proinsulin is used in connection with a solution or one of the described depots, further reduction of proteolysis is needed to release the unmodified fully active insulin. The theory suggests that contact proinsulin represents only about one-eighth of the biological activity of insulin, because the receptor-binding region, which is part of the biologically active region of the surface, is blocked by the C-peptide present in proinsulin. There is no argument that only insulin, ie only proinsulin with human sequence, is suitable for treating diabetes (Comparative Example: German Patent Application A1-3, 232, 036). Dual structures of proinsulin have superior immunogenicity. In this regard, human proinsulin may also exhibit various properties in the C-peptide moiety.

돼지의 인슐린-Arg^B31OH과 상용하는 디아르기닌 유도체는 각각 문헌(Chance, Excerpta Medica International Congress Series No.231, pages 292, 293)에 의한 조사에 따라, 변형되지 않은 돼지 인슐린 활성의 62%, 66%를 갖는다.Diarginine derivatives that are compatible with insulin-Arg ^B31 OH in pigs are 62%, 66% of unmodified porcine insulin activity, as investigated by Chance, Excerpta Medica International Congress Series No.231, pages 292, 293, respectively. Has%

놀랍게도, 인슐린-Arg^B31-OH, 인슐린-Arg^B31-Arg^B32OH 및 B쇄가 염기성 C-말단 유기 그룹을 갖는 다른 인슐린 유도체는 프로인슐린과는 대조적으로 변형되지 않은 인슐린의 활성과 거의 같은 정도의 생물학적 활성을 갖는다.Surprisingly, insulin-Arg ^B31 -OH, insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 OH, and other insulin derivatives in which the B chain has a basic C-terminal organic group are roughly equivalent to the activity of unmodified insulin in contrast to proinsulin. Have biological activity.

따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 및 활성 화합물로 구성되는 당뇨병 치료용 약제에 관한 것이며, 여기서 활성 화합물은 R¹이 H 또는 H-Phe이고, R³⁰이 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성 L-아미노산의 라디칼을 나타내며, R³¹은 구조중에 0 내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 말단 카복실 그룹이 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서 락톤으로서 유리형태로 존재하거나 CH₂OH로 환원될 수 있는 생리학적으로 허용되는 탄소수 50이하의 염기성 그룹을 나타내는 등전점이 5.8 내지 8.5인 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 및 그의 생리학적으로 무독한 염에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a medicament for treating diabetes, consisting of a pharmaceutically acceptable carrier and an active compound, wherein the active compound is a neutral compound wherein R ¹ is H or H-Phe and R ³⁰ is genetically encoded. Represents a radical of L-amino acid, R ³¹ is a physiological structure in which 0-3α-amino acid is involved in the structure and any terminal carboxyl group is present in free form as ester functional group, lactone as amide functional group or reduced to CH ₂ OH The present invention relates to an insulin derivative of general formula (I) having a isoelectric point of 5.8 to 8.5 and a physiologically toxic salt thereof having a scientifically acceptable basic group of 50 or less carbon atoms.

본 발명에 따른 약제는 또한 그의 작용이 데포 보조제(아연 또는 프로타민설페이트) 없이도 개시될 수 있는 완전히 신규한 서작용성 제제이다. 데포 작용은 단백질 화학에서 유도된 고유의 물리적 원리, 즉 인슐린 유도체가 등전점에서 거의 녹지 않는다는 원리에 기인한다. 생리적 조건하에서 유도체의 재용해는 부가 염기성 그룹을 제거함으로써 이루어지며, 이것은 유도체에 따라 트립신 또는 트립신-유사물 및/또는 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B-유사물 및/또는 에스터라제 활성에 의해서 이루어진다. 분해된 특정 그룹은 순수한 생리학적 대사물질(예 : 아미노산, 오르니틴 또는 콜린)이거나 또는 쉽게 대사될 수 있는 생리학적으로 허용되는 물질이다.The medicaments according to the invention are also completely novel slow-acting agents whose action can be initiated without depot adjuvant (zinc or protamine sulfate). Depot action is due to the inherent physical principle derived from protein chemistry, that is, insulin derivatives hardly dissolve at isoelectric points. Re-dissolution of derivatives under physiological conditions is accomplished by removal of additional basic groups, which depending on the derivative is trypsin or trypsin-like and / or carboxypeptidase B or carboxypeptidase B-like and / or esterase By activity. Specific groups degraded are pure physiological metabolites (eg amino acids, ornithine or choline) or physiologically acceptable substances that can be easily metabolized.

여전히 이종 구조의 C-펩타이드 부분을 함유하는 문헌에 기술된 중간체와는 대조적으로, 이들 신규한 약제의 활성 화합물로서 사용되는 인슐린 유도체는 상응하는 인슐린 그 자체보다 더 강력한 면역 효과를 갖지 못한다.In contrast to the intermediates described in the literature which still contain C-peptide portions of heterologous structures, the insulin derivatives used as active compounds of these novel agents do not have a stronger immune effect than the corresponding insulin itself.

상기 언급한 찬스의 너무 작은 활성치는, 가능하게는 측정 오차 또는 조사된 분획의 부적합한 순도로부터 야기되어진다. 어떤 경우이건, 약제중 활성 화합물로서의 그들의 유용성은 이제까지는 알려지지 않았다.(아마도 이 사실에 기인함).Too small active values of the above mentioned chances result from possible measurement errors or inadequate purity of the fraction investigated. In any case, their usefulness as active compound in drugs has not been known so far (probably due to this fact).

본 발명에 따른 제제는 활성 화합물로서 하나 이상의 일반식(Ⅰ)의 신규한 인슐린 유도체 또는 인슐린-Arg^B31-OH 또는 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH를 함유한다.The preparations according to the invention contain at least one novel insulin derivative of general formula (I) or insulin-Arg ^B31 -OH or insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH as active compound.

그들의 pH값은 2.5 내지 8.5인 것이 바람직하며, 적합한 등장제, 적합한 방부제 및 경우에 따라, pH 5.0 내지 8.5의 적절한 완충액을 함유한다.Their pH value is preferably between 2.5 and 8.5 and contains suitable isotonic agents, suitable preservatives and, if appropriate, appropriate buffers of pH 5.0 to 8.5.

기술된 유도체의 전형적인 사용 형태는 등전점 이하에서 생리학적으로 허용되는 부형제중 용액의 형태인 생성물이다. 용액의 pH는 전형적으로 5.0일 수 있으며, 산 변형되지 않은 인슐린 pH(전형적으로 pH 3.0) 보다 월등히 높다. 어떤 경우에는, 더 중성의 주사 용액이 허용성의 관점에서 월등한 이점을 준다.Typical forms of use of the described derivatives are products in the form of solutions in physiologically acceptable excipients below the isoelectric point. The pH of the solution can typically be 5.0 and is significantly higher than the acid unmodified insulin pH (typically pH 3.0). In some cases, more neutral injection solutions offer superior advantages in terms of tolerance.

pH가 중성이고 생리학적으로 허용되는 부형제로 기술된 유도체의 무정형 또는 결정 침전물의 현탁액은 또 다른 통상적인 사용 형태이다.Suspensions of amorphous or crystalline precipitates of derivatives described as neutral and physiologically acceptable excipients are another common form of use.

그러나, 또한 부가 데포제에 의해서, 예를들어, 아연 또는 프로타민설페이트를 부가함으로써 생리학적 pH 범위에서 유도체의 고유한 거의 녹지 않는 용해성을 심화시킬 수 있다. 아연의 부가량은 Zn²⁺/100인슐린 단위의 100㎍까지, 전형적으로 Zn²⁺/100인슐린 단위의 50㎍일 수 있다. 프로타민의 양은 100단위(프로타민 설페이트 기준) 당 0.28mg 내지 0.6mg일 수 있다. 구체적으로 인슐린의 기본적인 양이 치료학적으로 유용하므로, 이 경우에 특히 작용 지속 시간이 긴 제제를 제조할 수 있으며, 앞으로 지금까지 보다 더 광범위하게 사용될 것이다. 이미 인슐린 계량 단위를 이용한 치료로부터 인지되었다.However, it is also possible to augment the inherent little insoluble solubility of the derivative in the physiological pH range by addition of zinc or protamine sulfate, for example by addition depots. The amount of zinc added may be up to 100 μg of Zn ^{2 +} / 100 insulin units, typically 50 μg of Zn ^{2 +} / 100 insulin units. The amount of protamine may be 0.28 mg to 0.6 mg per 100 units (based on protamine sulfate). In particular, since the basic amount of insulin is therapeutically useful, it is possible in this case to prepare formulations with particularly long duration of action, which will be used more widely in the future. It has already been recognized from treatment with insulin metering units.

인슐린 유도체와 혼화성인 적절한 생리학적으로 허용되는 부형제는 통상의 방법으로, 예를들어, 글리세롤, 염화나트륨 또는 글루코오즈에 의해 혈액과 등장화된 멸균 수용액이며 이들은 또한 통상 하나의 방부제, 예를들어, 페놀, m-프레졸 또는 p-하이드록시 벤조산 에스테르를 함유한다. 부형제 매질은 또한 완충 물질, 예를들어 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨 또는 인산 나트륨을 함유할 수 있다. 희산(전형적으로 HCl) 또는 희알칼리(전형적으로 NaOH)를 사용하여 pH를 조절한다.Suitable physiologically acceptable excipients that are miscible with the insulin derivatives are sterile aqueous solutions which are isotonic with the blood in conventional manner, for example by glycerol, sodium chloride or glucose, and they are usually also one preservative such as phenol , m-presol or p-hydroxy benzoic acid ester. The excipient medium may also contain a buffer material such as sodium acetate, sodium citrate or sodium phosphate. Dilute acid (typically HCl) or rare alkali (typically NaOH) is used to adjust the pH.

인슐린 유도체는 또한 알카리금속염 또는 암모늄염의 형태로 본 발명에 따른 제제에 사용될 수 있다. 한개 이상의 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체의 목적하는 양을 각각의 경우 서로 독립적으로 용해되고, 무정형이고/이거나 결정형의 다른 인슐린 유도체와 혼합할 수 있다. 때때로 제제를 열 또는 여러 물질들과 접촉시의 기계적 스트레스에 노출시킬 경우 단백질의 침전을 방지하는 적합한 양의 안정화제를 본 발명에 따른 제제에 가하는 것이 유용하다. 이러한 안정화제는 예를 들면, 유럽 특허 제A-18, 609호, 독일연방공화국 특허 제A-3, 240, 177호 또는 제 WO-83/00288호에 기술되어 있다.Insulin derivatives can also be used in the preparations according to the invention in the form of alkali metal salts or ammonium salts. The desired amount of one or more insulin derivatives of general formula (I) or insulin derivatives of general formula (I) may in each case be dissolved independently of one another and mixed with other insulin derivatives in amorphous and / or crystalline form. Sometimes it is useful to add a suitable amount of stabilizer to the formulation according to the invention, which prevents precipitation of the protein when the formulation is exposed to heat or mechanical stress upon contact with various substances. Such stabilizers are described, for example, in European Patents A-18, 609, Federal Republic of Germany Patents A-3, 240, 177 or WO-83 / 00288.

또한 적당량의 공지된 서작용성 물질, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 글로빈 또는 아연중 하나를 함유할 수 있는 본 발명에 따른 제제중에서, 이러한 서작용성 물질은 총량의 활성 화합물과 또는 이의 부와 또는 하나 이상의 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 제제는 일반식(Ⅰ)의 여러가지 인슐린 유도체를 서작용성의 여러가지 다른 보조제와 혼합하여 함유할 수 있다.In formulations according to the invention which may also contain an appropriate amount of known slow acting substances, for example one of protamine sulfate, globin or zinc, such slow acting substances may be combined with a total amount of the active compound and or It may be used in admixture with one or more insulin derivatives of general formula (I). The formulations may contain various insulin derivatives of general formula (I) in admixture with various other slow-acting auxiliaries.

본 발명은 활성 화합물로서 a) R¹은 H 또는 H-Phe을 나타내고 R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내며, R³¹은 이 구조중에 0내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 말단 카복실 그룹은 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서, 락톤으로서 유리형으로 존재하거나 CH₂OH₂로 환원될 수 있는 생리학적으로 허용되는 탄소수 50이하의 염기성 그룹을 나타내는 등전점이 5.8 내지 8.5인 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 및 b) R¹은 H 또는 H-Phe를 나타내고, R³⁰이 Ala, Thr 또는 Ser을 나타내며, R³¹이 OH를 나타내는 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 그의 염 및 경우에 따라, 프로인슐린 및 C-펩타이드를 함유하는 활성 화합물과 생리학적으로 허용되는 부형제로 이루어진 약제에 관한 것이다.In the present invention, as an active compound, a) R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical which can be genetically encoded, and R ³¹ represents 0 to 3α-amino acids in the structure. And any terminal carboxyl group has an isoelectric point of 5.8 to 8.5, which represents a physiologically acceptable basic group having up to 50 carbon atoms which may exist freely as ester functional groups, as amide functional groups, as lactones or be reduced to CH ₂ OH ₂ . Insulin derivative of formula (I) and b) R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents Ala, Thr or Ser, and R ³¹ represents OH, or an insulin derivative or physiological And salts thereof and optionally, active compounds containing proinsulin and C-peptide and physiologically acceptable excipients.

(I)

(I)

기술한 유도체를 그들 자체로 또는 혼합물로서 사용하는 이외에, 순수한 서작용성 인슐린으로서 또는 공지된 데포 부형제와의 혼합물로서, 여러 방법으로 안정한 용해된 성분으로 쉽게 제조되는 인슐린과의 혼합물을 제조할 수 있다. 따라서 매우 우수한 효과를 얻을 수 있다.In addition to using the described derivatives by themselves or as mixtures, it is possible to prepare mixtures with insulin which are readily prepared with stable dissolved ingredients in a number of ways, either as pure slow acting insulins or as mixtures with known depot excipients. . Therefore, a very good effect can be obtained.

특히 적합한 생성물은 바람직하게는 동일한 화합물로부터 얻어진 용해되고/변형되지 않은 인슐린과 함께 서방출 성분으로서 작용하는 하나 이상의 유도체의 중성 혼합물이다. 그러나, 또한 각각의 경우에 용해 성분으로서 프로인슐린 및/ 또는 C-펩타이드를 그 자체로서 또는 인슐린과 혼합하여 사용할 수 있다. 이들 조성물은 모든 혼합비에서 안정하다는 특징을 지닌다. 이들은 근래에 치료적으로 일반화되고 있는 중간 활성 인슐린 생성물의 제조용으로 꼭 필요하다.Particularly suitable products are neutral mixtures of one or more derivatives which preferably serve as sustained release components with dissolved / unmodified insulin obtained from the same compound. However, in each case it is also possible to use the proinsulin and / or C-peptides as such or in combination with insulin as the dissolution component. These compositions are characterized by being stable at all mixing ratios. They are essential for the preparation of moderately active insulin products that are becoming therapeutically common in recent years.

또한, 본 발명에 따르는 제제는 일반식(Ⅰ)의 여러가지 다른 인슐린 유도체 및/또는 일반식(Ⅰ)의 여러가지 다른 인슐린을 함유할 수 있다. 더구나, 다른 치료적으로 유용한 혼합물은 또한 예를들어 용해 형태 또는 NPH 결정 형태 또는 다른 통상적인 서작용성 형태인 유도체 및 인슐린 및/또는 프로인슐린 및/또는 데스-Phe^B1-인슐린 및-또는 C-펩타이드의 혼합물을 사용할 수 있다. 이 방법으로 작용 지속 시간이 매우 길고 그중에서도 상이한 기본 프로파일을 갖는 생성물을 제조할 수 있다. 지금까지의 경험에 의하면 예를 들어, 유사한 소 인슐린 생성물의 경우와 같이 이의 작용 시간은 실제 초-서방출형이 아니기 때문에 아연 결정형 또는 NPH 결정형인 사람의 인슐린을 사용하는 것이 특히 바람직하다.In addition, the preparations according to the invention may contain various other insulin derivatives of general formula (I) and / or various other insulins of general formula (I). Moreover, other therapeutically useful mixtures may also be used, for example, in soluble form or in NPH crystal form or other conventional slow-acting derivatives and insulin and / or proinsulin and / or des-Phe ^B1 -insulin and-or C-. Mixtures of peptides can be used. In this way it is possible to produce products with very long durations of action, inter alia with different basic profiles. Experience to date has shown that it is particularly preferable to use human insulin which is either zinc crystalline or NPH crystalline since its action time is not really ultra-sustained, as is the case for similar bovine insulin products.

인슐린 및/또는 프로인슐린 및/또는 데스-Phe^B1-인슐린 및/또는 C-펩타이드 및 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체는 또한 알칼리 금속염 또는 암모늄염 형태로 사용할 수 있다.Insulin and / or proinsulin and / or des-Phe ^B1 -insulin and / or C-peptide and insulin derivatives of general formula (I) can also be used in the form of alkali metal salts or ammonium salts.

변형되지 않은 인슐린 및/또는 프로인슐인 및/또는 데스-Phe^B1-인슐린 및/또는 C-펩타이드 및 인슐린 유도체의 혼합비는 인슐린 0 내지 99%, 프로인슐린 0 내지 99%, 페닐알라닌-(B1)-인슐린 0 내지 99%, C-펩타이드 0 내지 99% 및 인슐린 유도체 1 내지 100%(이들 펩타이드의 총량을 기준으로 함)로 변할 수 있다.The mixing ratio of unmodified insulin and / or proinsulin and / or des-Phe ^B1 -insulin and / or C-peptide and insulin derivatives is 0-99% insulin, 0-99% proinsulin, phenylalanine- (B1) -0 to 99% insulin, 0 to 99% C-peptide and 1 to 100% insulin derivatives (based on the total amount of these peptides).

인슐린의 등전점보다 낮은 pH를 갖는, 예를 들어 인슐린 유도체 및 인슐린 또는 프로인슐린의 산 용액도 또한 본 발명에 따른 사용형태이다.Also used in accordance with the invention are solutions according to the invention, for example insulin derivatives and acid solutions of insulin or proinsulin having a pH lower than the isoelectric point of insulin.

바람직한 제제의 pH의 2.5 내지 8.5이고 용액 또는 현탁액이다.Preferred formulations have a pH of 2.5 to 8.5 and a solution or suspension.

기술된 사용 형태는 전형적으로 적합한 등장제(예 : 글리세롤 또는 염화나트륨) 및 미생물 공격에 적합한 제제(예 : 페놀, m-크레놀 또는 p-하이드록시벤조산 에스테르)를 적절한 용량으로 또한 함유하는 수성 매질중에 용해되거나 현탁된다. 이러한 생리학적으로 허용되는 부형제는 또한 pH의 범위가 5.0 내지 8.5인 완충 물질(예 : 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄)을 부가적으로 함유할 수 있다. 희산(통상 HCl), 또는 희알칼리(통상 NaOH)용액은 용해시키고 pH값을 조절하기 위해 사용된다.The use forms described typically comprise aqueous isotonic agents (e.g., glycerol or sodium chloride) and agents suitable for microbial attack (e.g., phenol, m-crenol or p-hydroxybenzoic acid esters) in an aqueous medium that also contain suitable doses. Dissolved or suspended. Such physiologically acceptable excipients may also additionally contain buffering substances (eg, sodium acetate, sodium citrate, sodium phosphate or tris- (hydroxymethyl) -aminomethane) having a pH in the range of 5.0 to 8.5. . Dilute acid (usually HCl), or dibasic alkali (usually NaOH) solution is used to dissolve and adjust the pH value.

인슐린 성분 및/ 또는 프롤인슐린 성분 및/또는 데스-Phe^B1-인슐린 성분 및/또는 C펩타이드 성분 및 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 성분은 각각의 경우 서로 독립적으로 용해된 형태, 무정형 및/또는 결정형일 수 있다. 각각의 경우, 인슐린 성분 및/또는 프로인슐린 성분 및/또는 데스-Phe-인슐린 성분 및/또는 C-펩타이드 성분 및 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 성분의 목적하는 어떤 부분은 결정형일 수 있으며, 각 경우 인슐린 성분 및/또는 프로인슐린 성분 및/또는 데스-Phe-인슐린 성분 및/또는 C-펩타이드 성분 및 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 성분의 다른 부분은 무정형일 수 있으며, 각 경우 나머지 부분은 용해된 형태일 수 있다.The insulin component and / or the proinsulin component and / or the des-Phe ^B1 -insulin component and / or the C peptide component and the insulin derivative component of the general formula (I) are in each case dissolved form, amorphous and / or crystalline independently of each other. Can be. In each case, any desired portion of the insulin component and / or the proinsulin component and / or the des-Phe-insulin component and / or the C-peptide component and the insulin derivative component of formula (I) may be crystalline, and each The insulin component and / or the proinsulin component and / or the des-Phe-insulin component and / or the C-peptide component and other portions of the insulin derivative component of general formula (I) may be amorphous, in each case the remaining portion is soluble. It may be in the form.

제제는 서작용성 보조제(데포 보조제)(예 : 프로타민 설페이트, 글로빈 또는 아연)를 적절량(0 내지 100㎍/100I.U.)함유할 수 있다.The formulations may contain an appropriate amount (0-100 μg / 100 I.U.) of slow acting adjuvant (depot adjuvant) such as protamine sulfate, globin or zinc.

이러한 서작용성 제제는 총 함량 또는 이의 부의 활성 화합물과 혼합하여 사용될 수 있다. 제제는 또한 서작용성을 갖는 여러개의 상이한 보조제를 또한 함유할 수 있다.Such slow-acting agents can be used in admixture with the active compounds in total content or parts thereof. The formulations may also contain several different adjuvants with slow action.

따라서 다양하고 매우 우수한 조절 작용 특징은 본 발명에 따른 치료제로 분명히 달성될 수 있으며; 도입시 이는 특히 지연된 당뇨병 합병증과 관련이 되어야만 한다.Thus, various and very good regulatory action features can be clearly achieved with the therapeutic agents according to the invention; At the time of introduction this should in particular be associated with delayed diabetes complications.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명 하고 있다.The following examples further illustrate the invention.

[제조 실시예 1]Production Example 1

사람 인슐린-(B30)-O-CH₂-CH₂-

(CH₃)₃ Human Insulin- (B30) -O-CH ₂ -CH _2-

(CH ₃ ) ₃

5g의 돼지 인슐린을 45ml의 디메틸포름아미드, 25ml의 디메틸설폭사이드, 0.5ml의 N-에틸모폴린 및 2.5ml의 물에 용해시킨다. 1.5g의 3급-부톡시카보닐-N-하이드록시석신이미드를 실온에서 가하고 교반한 다음 6시간 동안 반응시킨다. 다음에 반응물을 정치시키고 1적의 빙초산을 가한 다음 생성물을 에테르로 침전시키고 여과한다. 잔사를 360ml의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 이 용액을 320ml의 트리스 완충액(0.05M, CaCl₂중의 0.01M, pH 7.5)으로 희석한다. 20mg의 트립신부를 36℃에서 1시간 간격으로 가한다.5 g of pig insulin are dissolved in 45 ml of dimethylformamide, 25 ml of dimethylsulfoxide, 0.5 ml of N-ethylmorpholine and 2.5 ml of water. 1.5 g of tert-butoxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide is added at room temperature, stirred, and reacted for 6 hours. The reaction is then left to stand, one drop of glacial acetic acid is added and the product is precipitated with ether and filtered. The residue is dissolved in 360 ml of dimethylformamide and the solution is diluted with 320 ml of Tris buffer (0.05 M, 0.01 M in CaCl ₂ , pH 7.5). 20 mg of trypsin is added at 36 ° C. in 1 hour intervals.

총 12시간 부가후에, 아세트산으로 pH를 4.5로 맞춘 다음 용액을 증발시킨다. n-부탄올-빙초산-물(2 : 1 : 10)계중의 분배 크로마토그라피에 의한 세파덱스

-LH20 칼럼(8×200cm)상에서의 물질의 정제로 3.25g의 Nα^A1, Nα^B1-비스-Boc-데스-B_23-30-옥타펩타이드 인슐린(돼지)를 수득한다. 여기에서는 더 이상 산 및 염기성 전기영동시 출발 물질이 나타나지 않는다. 물질의 아미노산 분석이 정확하다. Boc 그룹의 제거후에는, 더 이상 인슐린 활성이 나타나지 않는다. 이 물질(3.25g)을 100mg의 1-하이드록시벤조트리아졸, 750mg의 HCl·Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OCH₂CH₂-

(CH₃)₃·HCl 및 0.5ml의 N-에틸모폴린과 함께 30ml의 디메틸포름아미드 중에 용해시킨다. 다음에, 120mg의 디사이클로헥실 카보디이미드를 실온에서 가하고 반응물을 24시간 동안 교반한다. 침전된 디사이클로 헥실우레아를 여과하여, 생성물을 에테르로 다시 침전시킨다.After a total of 12 hours addition, the pH is adjusted to 4.5 with acetic acid and then the solution is evaporated. Sephadex by partition chromatography in n-butanol- glacial acetic acid-water (2: 1: 10) system

Purification of the material on -LH20 column (8x200 cm) yields 3.25 g of Nα ^A1 , Nα ^B1 -bis-Boc-des-B _23-30 -octapeptide insulin (pig). There is no longer a starting material here upon acid and basic electrophoresis. The amino acid analysis of the substance is accurate. After removal of the Boc group, insulin activity no longer appears. This material (3.25 g) was added to 100 mg of 1-hydroxybenzotriazole, 750 mg of HClGly-Phe-Phe-Tyr (But) -Thr-Pro-Lys (Boc) -Thr (But) -OCH ₂ CH ₂ -

Dissolve in 30 ml of dimethylformamide with (CH ₃ ) ₃ .HCl and 0.5 ml of N-ethylmorpholine. Next, 120 mg of dicyclohexyl carbodiimide is added at room temperature and the reaction is stirred for 24 hours. The precipitated dicyclo hexylurea is filtered, and the product is precipitated again with ether.

침전물을 여과하여 제거하고, 에테르로 세척하고 건조시킨다. 물질을 상기 계중의 세파덱스

-LH 20상에서 분배 크로마토그라피에 의해 정제한다. 아세톤과 에테르로 침전시켜 주요 피크로부터 2.6g의 물질을 분리한다. 건조된 아직 보호되지 않은 유도체를 5ml의 트리플루오로아세트산 및 1ml의 아니솔의 혼합물과 실온에서 60분 동안 반응시킨다. 다음에 에테르를 가하여 조 물질을 용액으로부터 침전시키고 얼음으로 냉각시킨다. 건조된 침전물을 물에 용해시키고 수성 암모니아로 침전시킨 다음 원심 분리한다. 생성물을 세파덱스

-G50 초정밀기 또는 G75상의 10% 농도의 아세트산중에서 정제한다. 사람의 인슐린-(B30)-OCH₂CH₂

(CH₃)₃-을 동결 건조에 의해서 목적하는 피크 분획으로 부터 분리할 수 있다(결정후의 수득량 : 1.2g). 이렇게 수득된 인슐린 유도체는 생물학적 시험에서 사람 인슐린의 활성과 동등한 활성을 나타낸다.The precipitate is filtered off, washed with ether and dried. Sephadex in the system

Purification by partition chromatography on -LH 20. Precipitate with acetone and ether to separate 2.6 g of material from the main peak. The dried yet unprotected derivative is reacted with a mixture of 5 ml of trifluoroacetic acid and 1 ml of anisole for 60 minutes at room temperature. Ether is then added to precipitate the crude from the solution and cooled with ice. The dried precipitate is dissolved in water, precipitated with aqueous ammonia and centrifuged. Sephadex Product

Purification in acetic acid at 10% concentration on G50 ultra precision machine or G75. Human Insulin- (B30) -OCH ₂ CH ₂

(CH ₃ ) ₃ − can be separated from the desired peak fraction by freeze drying (yield after crystallization: 1.2 g). The insulin derivatives thus obtained exhibit activity equivalent to that of human insulin in biological tests.

일반식(Ⅲ)의 옥타펩타이드는 통상의 펩타이드 축합법에 의해서 하기 축합, 도식에 따라 제조된다 :Octapeptide of general formula (III) is prepared according to the following condensation scheme by the conventional peptide condensation method:

일반식(Ⅲ)의 옥타펩타이드를 위한 합성도식Synthetic Scheme for Octapeptide of General Formula (III)

아미노산 및 원소분석은 이론에 따른다.Amino acid and elemental analysis is theoretical.

[제조 실시예2]Preparation Example 2

돼지 프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의한 돼지 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 제조Preparation of Porcine Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH by Trypsin Degradation from Porcine Proinsulin

350mg의 돼지 프로인슐린을 25ml의 0.1M 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)중에 용해시킨다. 500㎍의 트립신을 실온에서 이 용액에 가하고 수시간 동안 혼탁을 일으킨다. 반응이 끝났을때, 침전물을 원심분리하여 산조건하에 용해한 다음 아세테이트 필름 전기영동 또는 HPLC를 사용하여 분석한다. 침전물을 재생시켜 세척한 다음 자체가 공지된 방법으로 후처리하거나 0.5M 이하의 염화나트륨 경사를 사용하여 0.05M 아세테이트(pH4.0)와 함께 양이온 교환기상에서 정제한다. 적합한 분획을 합하여 침전시킨다. 세척후 재결정화하면, 104mg의 돼지 인슐린-Lys^B31-Arg^B32-OH가 수득되며, 이것은 아미노산 분석에 의해 확인되며 HPLC 및 등전점 조성에 의해서 균일한 것으로서 특징지어진다.350 mg of pig proinsulin is dissolved in 25 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5). 500 μg of trypsin is added to this solution at room temperature and turbid for several hours. At the end of the reaction, the precipitate is centrifuged to dissolve under acidic conditions and then analyzed using acetate film electrophoresis or HPLC. The precipitate is regenerated and washed and then worked up in a manner known per se or purified on a cation exchanger with 0.05 M acetate pH 4.0 using a sodium chloride gradient below 0.5 M. Suitable fractions are combined and precipitated. Recrystallization after washing gives 104 mg of pig insulin-Lys ^B31 -Arg ^B32 -OH, which is confirmed by amino acid analysis and characterized as homogeneous by HPLC and isoelectric point composition.

인슐린 유도체 돼지 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 는 B31 위치에서 변형된 상응하는 돼지의 프로인슐린으로부터 유사한 방법으로 수득된다.Insulin Derivative Pig Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH is obtained in a similar manner from the proinsulin of the corresponding pig modified at the B31 position.

약제drugs

[실시예 1]Example 1

40I.U./ml의 약산성 용해제형인 돼지로부터 수득된 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH (돼지의 프로인슐린으로 부터 트립신 분해에 의해 제조함) 및 이의 데포 활성 :Insulin-Arg ^B31- Arg ^B32- OH (prepared by trypsin digestion from pig's proinsulin) and its depot activity obtained from a pig in the form of a 40 I.U./ml weakly acidic solubilizer:

돼지로부터 수득된 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OHInsulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH Obtained from Pigs

(27I.U./mg) 14.8mg(27 I.U./mg) 14.8 mg

글루코즈(일수화물), 결정 540.0mgGlucose (monohydrate), Crystalline 540.0mg

메틸 P-하이드록시벤조에이트 10.0mg10.0 mg methyl P-hydroxybenzoate

상기 성분을 물에 용해하여 총용적을 10ml로 만든다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 4.5로 한다.The ingredients are dissolved in water to bring the total volume to 10 ml. 1N HCl or 1N NaOH is added to pH 4.5.

이와 같은 용액은 0.4I.U./kg의 용량으로 토끼에게 사용한 경우 현저한 데포 작용을 나타낸다. 혈당 커브곡선 아래의 면적은 40I.U./ml의 표준생성물의 경우와 동일하다.Such solutions show significant depot action when used in rabbits at a dose of 0.4 I.U./kg. The area under the blood glucose curve is the same as for the standard product of 40 I.U./ml.

[실시예 2]Example 2

돼지의 인슐린으로부터 반합성에 의해 제조되고, 40I.U./ml의 중성 제형인 사람의 인슐린-(B30)-콜린 에스테르 및 이의 데포활성 :Insulin- (B30) -choline esters of human and depot activity thereof prepared by semisynthesis from insulin of porcine and in neutral formulation of 40 I.U./ml:

사람의 인슐린-(B30)-콜린 에스테르 14.3mlHuman Insulin- (B30) -Choline Ester 14.3ml

(28I.U./mg)(28 I.U./mg)

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

m-크레졸 27.0mgm-cresol 27.0 mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물에 용해하여 총용적을 10ml로 만든다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.3으로 한다.The ingredients are dissolved in water to bring the total volume to 10 ml. 1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.3.

이와 같은 현탁액은 0.4I.U./kg의 용량으로 토끼에게 사용할 경우 뛰어난 데포 작용을 나타낸다.Such suspensions show excellent depot action when used in rabbits at a dose of 0.4 I.U./kg.

[실시예 3]Example 3

반합성에 의해 돼지의 인슐린으로부터 제조되고, 40I.U./ml의 NPH 결정형인 사람의 인슐린-Arg^B31-OH 및 이의 현저한 지연 작용 :Insulin-Arg ^B31 -OH and its prominent delayed action in humans prepared from pig insulin by semisynthesis and of NPH crystalline form 40 I.U./ml:

사람의 인슐린-Arg^B31-OH 14.5mgHuman Insulin-Arg ^B31 -OH 14.5mg

(27.5I.U./mg)(27.5 I.U./mg)

프로타민 설페이트 1.3mgProtamine Sulfate 1.3mg

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

mㅡ크레졸 15.0mgm-cresol 15.0 mg

페놀 6.0mgPhenolic 6.0mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.3으로 한다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml. 1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.3.

이와 같은 결정성 현탁액은 0.4I.U./kg의 용량으로 토끼에게 사용시 현저한 지연 작용을 나타낸다.Such crystalline suspensions exhibit a significant delay in use in rabbits at a dose of 0.4 I.U./kg.

[실시예 4]Example 4

둘다 돼지의 인슐린으로부터 반합성에 의해 제조되고, 40I.U./ml의 아연을 함유하는 현탁액 형태인 사람의 인슐린-Arg^B31-OH와 사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 의 혼합물 및 이의 현저한 지연 작용Both are prepared by semisynthesis from pig's insulin and are a mixture of human insulin-Arg ^B31 -OH and human insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH in the form of a suspension containing 40 I.U./ml of zinc and significant Delay

사람의 인슐린-Arg^B31-OH 7.3mgHuman Insulin-Arg ^B31 -OH 7.3mg

(27.5I.U./mg)(27.5 I.U./mg)

사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 7.4mgHuman Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH 7.4mg

(27.0I.U./mg)(27.0 I.U./mg)

염화 아연(무수물) 0.46mgZinc Chloride (anhydride) 0.46mg

아세트산나트륨 14.0mgSodium Acetate 14.0mg

메틸 P-하이드록시벤조에이트 10.0mg10.0 mg methyl P-hydroxybenzoate

염화나트륨 80mgSodium chloride 80mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.0으로 한다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml. 1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.0.

이와 같은 용액은 0.4I.U./kg의 용량으로 토끼에게 사용시 상당한 지연 작용을 나타낸다.Such solutions exhibit a significant delay in use in rabbits at a dose of 0.4 I.U./kg.

[실시예 5]Example 5

돼지의 인슐린으로부터 반합성에 의해 제조되고, 100I.U./ml의 약산성의 용해제형인 사람의 인슐린-Arg^B31-Lys^B32-OCH₃및 이의 지연 작용 :Insulin-Arg ^B31- Lys ^B32- OCH ₃ and its delayed action in humans prepared semi-synthesically from pig insulin and in the form of a weakly acidic solubilizer of 100 I.U./ml:

사람의 인슐린-Arg^B31-Lys^B32-OCH₃37.0mgHuman Insulin-Arg ^B31 -Lys ^B32 -OCH ₃ 37.0mg

(27.0I.U./mg)(27.0 I.U./mg)

아세트산나트륨 14.0mgSodium Acetate 14.0mg

메틸 P-하이드록시벤조에이트 10.0mg10.0 mg methyl P-hydroxybenzoate

염화나트륨 80.0mgSodium Chloride 80.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총 용적을 10ml로 만든다. 1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 6.0으로 한다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml. 1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 6.0.

이와 같은 용액은 토끼에게 사용시 상당한 지연 작용을 나타낸다.Such solutions have a significant delay in use in rabbits.

[실시예 6]Example 6

세균기원의 영장류의 프리프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의해 제조된 사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 와 혼합된 NPH 결정 형태인 세균기원의 영장류의 프리프로인슐린의 트립신 분해에 의해 제조된 사람의 인슐린-Arg^B31-OH :Of humans prepared by trypsin digestion of preproinsulin of bacterial primates in the form of NPH crystals mixed with insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH of humans prepared by trypsin digestion from preproinsins of bacterial primates Insulin-Arg ^B31 -OH:

사람의 인슐린-Arg^B31-OH 11.1mgHuman Insulin-Arg ^B31 -OH 11.1mg

(27.5I.U./mg)(27.5 I.U./mg)

사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 3.7mgHuman Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH 3.7mg

(27.0I.U./mg)(27.0 I.U./mg)

프로타민 설페이트 1.0mgProtamine Sulfate 1.0mg

황산이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium dihydrogen sulfate dihydrate 21.0mg

m-크레졸 15.0mgm-cresol 15.0 mg

페놀 6.0mgPhenolic 6.0mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다. 1N NaOH 또는 1N HCL을 가해 pH를 7.2로 한다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml. 1N NaOH or 1N HCL is added to bring the pH to 7.2.

이 현탁액은 토끼에게 사용시 상당한 지연 작용을 나타낸다(0.4I.U./kg).This suspension has a significant delay in use in rabbits (0.4 I.U./kg).

[실시예 7]Example 7

돼지의 프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의해 제조한 40I.U./ml의 중성 제형인 돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 및 이의 20% 또는 40% 용해된 돼지 인슐린(40IU/ml)과의 혼합물 :With insulin-Arg ^B31- Arg ^B32- OH and 20% or 40% dissolved pig insulin (40 IU / ml) in pig, a neutral formulation of 40 I.U./ml prepared by trypsin digestion from pig proinsulin Mixtures:

돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 14.8mgPig Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH 14.8mg

(27.0I.U./mg)(27.0 I.U./mg)

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

페놀 6.0mgPhenolic 6.0mg

mㅡ크레졸 15.0mgm-cresol 15.0 mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.3으로 한다. 유사한 매질 또는 동일 매질중에서 40I.U./ml를 함유하는 돼지 인슐린 용액을 혼합하면 이의 용적%는 20% 및 40%가 된다. 총 함량과 상등액중 함량을 HPCL를 이용해 측정하는데, 각 경우 측정은 즉시와 4℃에서 3개월 저장한 뒤에 시행한다.1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.3. Mixing porcine insulin solutions containing 40 I.U./ml in a similar medium or the same medium results in 20% and 40% of their volume. The total content and the content in the supernatant are measured using HPCL, in which case the measurements are taken immediately and after 3 months storage at 4 ° C.

돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH를 HPLC에 의해 돼지의 인슐린으로부터 분리한다. 상등액중에서 유도체는 전혀 검출되지 않는다. 즉, 불용성 성분은 용해되지 않은 것이다. 반대로, 침전을 세척한 후 인슐린은 검출되지 않는데, 이는 침전되지 않은 것을 의미한다.Pig's insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH is separated from pig's insulin by HPLC. No derivative is detected in the supernatant. In other words, insoluble components are not dissolved. In contrast, after washing the precipitate, no insulin is detected, meaning that it has not precipitated.

[실시예 8]Example 8

돼지의 인슐린으로부터 트립신 분해에 의해 제조되고, 용해된 돼지의 25%(활성) 프로인슐린과 혼합한 40IU/ml의 중성 제형인 돼지의 인슐린-Arg^B31-OH 및 이의 데포(depot) 작용 :Insulin-Arg ^B31- OH and its depot action in pigs, 40 IU / ml in neutral formulation, prepared by trypsin digestion from pig insulin and mixed with 25% (active) proinsulin in dissolved pigs:

돼지의 인슐린-Arg^B31-OH 10.9mgInsulin-Arg ^B31- OH 10.9 mg in pigs

27.5IU/mg27.5 IU / mg

돼지의 프로인슐린 30.3mgPig's Proinsulin 30.3mg

3.3IU/mg3.3 IU / mg

아세트산나트륨 14.0mgSodium Acetate 14.0mg

메틸 P-하이드록시벤조에이트 10.0mg10.0 mg methyl P-hydroxybenzoate

염화나트륨 80.0mgSodium Chloride 80.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.0으로 한다.1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.0.

이와 같은 현탁액은 대조 데포 생성물(Optisulin^(R)데포 CS)과 유사한 데포 작용을 개에서 나타낸다.Such suspensions exhibit a depot action in dogs similar to the control depot product (Optisulin ^(R) depot CS).

[실시예 9]Example 9

돼지의 프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의해 제조되고 NPH 결정 형태이며, 돼지의 인슐린으로부터 에드만 분해에 의해 제조된 40IU/ml의 중성 제형인 25% 데스-페닐알리닌-(B1)-돼지 인슐린과 혼합된 돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 및 이의 지연 작용 :Mixed with 25% des-phenylalanine- (B1) -pig insulin, a neutral formulation of 40 IU / ml, prepared by trypsin digestion from pig proinsulin and in NPH crystal form, prepared by Edman digestion from pig insulin -Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH and its delayed action in porcine pigs:

돼지의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 11.1mgInsulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH 11.1 mg in pigs

27.0IU/mg27.0 IU / mg

데스-페닐 알라닌-(B1)-돼지 인슐린 3.6mgDes-phenylalanine- (B1) -pig insulin 3.6mg

28.0IU/mg28.0 IU / mg

프로타민 설페이트 1.0mgProtamine Sulfate 1.0mg

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

페놀 6.0mgPhenolic 6.0mg

m-크레졸 16.0mgm-cresol 16.0 mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.3으로 한다.1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.3.

이와 같은 현탁액은 개에서 데포제와 유사한 작용을 나타낸다.Such suspensions have a similar effect to depots in dogs.

[실시예 10]Example 10

돼지의 프로인슐린으로부터 반합성에 의해 제조되고, 40I.U./ml의 중성 제형인 40% 사람의 인슐린 및 20%(중량) 사람의 C 펩타이드와 혼합된 사람의 인슐린-(B30)-콜린 에스테르 및 이의 중간정도의 지속 작용 :Human insulin- (B30) -choline ester prepared by semisynthesis from pig insulin and mixed with 40% human insulin and 20% (weight) human C peptide in a neutral formulation of 40 I.U./ml and Its moderate lasting action:

사람의 인슐린-(B30)-콜린 에스테르 7.2mgHuman Insulin- (B30) -Choline Ester 7.2mg

(28IU/mg)(28 IU / mg)

사람의 인슐린 7.2mgHuman insulin 7.2mg

(28IU/mg)(28 IU / mg)

사람의 C 펩타이드 3.6mg3.6 mg of human C peptide

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

m-크레졸 27.0mgm-cresol 27.0 mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.3으로 한다.1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.3.

이와 같은 현탁액은 개의 경우, 혼합 생성물(예. Komb-H-Insulin^(R), Hoechst)과 비교할 만한 작용 양상을 나타낸다.Such suspensions exhibit a mode of action comparable to mixed products (eg Komb-H-Insulin ^(R) , Hoechst) in dogs.

[실시예 11]Example 11

돼지의 프로인슐린으로부터 반-합성에 의해 제조되고, 40IU/ml의 제형인 50% 아연 사람 인슐린 결정과 혼합된 사람의 인슐린-Arg^B31-Lys^B32-OCH₃및 이의 지연 작용 :Insulin-Arg ^B31 -Lys ^B32 -OCH ₃ and its delayed action in humans, prepared semi-synthetically from porcine proinsulin and mixed with 50% zinc human insulin crystals in a 40 IU / ml formulation:

사람의 인슐린-Arg^B31-Lys^B32-OCH₃7.4mgHuman Insulin-Arg ^B31 -Lys ^B32 -OCH ₃ 7.4mg

(27.0IU/mg)(27.0 IU / mg)

사람의 인슐린 7.4mgHuman insulin 7.4mg

(28.0IU/mg)(28.0 IU / mg)

무수 염화아연 0.23mgAnhydrous Zinc Chloride 0.23mg

아세트산나트륨 14.0mgSodium Acetate 14.0mg

메틸 P-하이드록시벤조에이트 10.0mg10.0 mg methyl P-hydroxybenzoate

염화나트륨 80.0mgSodium Chloride 80.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총 용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N HCl 또는 1N NaOH를 가해 pH를 7.0으로 한다.1N HCl or 1N NaOH is added to bring the pH to 7.0.

이와 같은 제제는 토끼에서 현저한 서방출 작용을 나타낸다(0.4IU/kg).Such preparations show significant slow release action in rabbits (0.4 IU / kg).

[실시예 12]Example 12

둘다 이 콜라이에서 발현시킨 영장류의 프로인슐린으로부터 트립신 분해에 의해 제조되고, 40IU/ml의 제형인 40%의 결정성 NPH-사람 인슐린과 혼합된, 30%의 사람 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH와 혼합한 사람 인슐린-Arg^B31-OH 및 이의 현저한 서방출 작용 :Both were prepared by trypsin digestion from proinsulin of primates expressed in this coli and mixed with 40% crystalline NPH-human insulin in a 40 IU / ml formulation, 30% human insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH Human insulin-Arg ^B31 -OH in combination with its prominent sustained release action:

사람의 인슐린-Arg^B31-OH 4.4mgHuman Insulin-Arg ^B31 -OH 4.4mg

(27.5IU/mg)(27.5 IU / mg)

사람의 인슐린-Arg^B31-Arg^B32-OH 4.4mgHuman Insulin-Arg ^B31 -Arg ^B32 -OH 4.4mg

(27.0IU/mg)(27.0 IU / mg)

사람의 인슐린 5.7mgHuman insulin 5.7mg

프로타민 설페이트 0.5mgProtamine Sulfate 0.5mg

인산 이수소나트륨 이수화물 21.0mgSodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate 21.0mg

m-크레졸 15.0mgm-cresol 15.0 mg

페놀 6.0mgPhenolic 6.0mg

글리세롤 160.0mgGlycerol 160.0mg

상기 성분을 물과 혼합하여 총용적을 10ml로 만든다.The ingredients are mixed with water to bring the total volume to 10 ml.

1N NaOH 또는 1N HCl를 가해 pH를 7.3으로 한다.Add 1N NaOH or 1N HCl to bring the pH to 7.3.

이와 같은 현탁액은 토끼에서 상당히 지연된 장기-지속성 작용을 나타낸다.Such suspensions exhibit a significantly delayed long-lasting action in rabbits.

Claims (12)

유전공학에 의해 제조될 수 있는 사람, 소 또는 돼지의 프로인슐린을 트립신 또는 트립신-유사(trypsin-like) 엔도펩티다제를 사용하여 효소적으로 분해시킴을 특징으로 하여, 아미노산 라디칼 R³¹이 L배위이고 등전점이 5.8 내지 8.5인 하기 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법The amino acid radical R ³¹ is characterized by the enzymatic digestion of human, bovine or swine proinsulin, which can be produced by genetic engineering, with trypsin or trypsin-like endopeptidase. Process for preparing an insulin derivative of formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof having a coordination and an isoelectric point of 5.8 to 8.5

상기식에서, R¹은 H또는 H-Phe을 나타내고, R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성을 L-아미노산 라디칼을 나타내며, R³¹은 이 구조중에 0 내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 말단 카복실 그룹은 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서, 락톤으로서 유리 형태로 존재하거나 CH₂OH로 환원될 수 있는 탄소수 50이하의 생리학적으로 허용되는 염기성 유기 그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical which can be genetically encoded, and R ³¹ represents 0-3α-amino acid in this structure and is optionally terminated. The carboxyl group represents a physiologically acceptable basic organic group having up to 50 carbon atoms which may exist in free form as ester functional group, as amide functional group, as lactone or be reduced to CH ₂ OH. 제1항에 있어서, R³¹이 일반식 -XnS(여기에서, n은 0, 1, 2 또는 3이며, X는 천연의 중성 또는 염기성 L-아미노산의 동일하거나 상이한 라디칼을 나타내며, S는 OH이거나, 또는 카복실 그룹을 차단하고, n이 0인 경우에 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하거나, n＞0인 경우 상기와 같은 라디칼을 포함하는 생리학적으로 허용되는 그룹을 나타내며, C-말단-X-S는 또한 상응하는 알코올로 환원되는 아미노산 라디칼을 나타내거나 또는 n이 2 또는 3인 경우에, 호모세린-락톤 라디칼을 나타낼 수 있다)의 라디칼을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The compound of claim 1, wherein R ³¹ is of the formula —XnS wherein n is 0, 1, 2 or 3, X represents the same or different radical of a natural neutral or basic L-amino acid and S is OH , Or blocks a carboxyl group and contains a basic radical that can be positively charged or quantized when n is 0, or a physiologically acceptable group comprising such radicals when n> 0, C The terminal-XS also represents an amino acid radical that is reduced to the corresponding alcohol or, when n is 2 or 3, may represent a homoserine-lactone radical) or an insulin derivative of formula (I) A method of making a physiologically acceptable salt thereof. 제1항에 있어서, R³⁰이 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내고, R¹이 H를 나타내며, R³¹은 카복실 그룹을 차단하고 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하는 생리학적으로 허용되는 그룹 S^B; X^N-S^B(여기에서, X^N는 천연의 중성 L-아미노산 라디칼을 나타낸다); X^B-S(여기에서, X^B는 천연의 염기성 L-아미노산 라디칼을 나타내고, S는 OH 또는 카복실 그룹을 차단하고 임의로 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하는 그룹을 나타낸다); 상응하는 알코올로 환원되는 염기성 아미노산 X^B의 라디칼 Y ; -Xn-S(여기에서, n은 2 또는 3이고, X는 라디칼 X^N또는 X^B및 이들의 조합을 나타내며, 라디칼 X가 모두 X^N이면, S는 S^B만을 나타낼 수 있다 ; -Xn-Y(여기에서, n은 1또는 2이다) ; -X^B-Z, -X^B-X^N-Z, -X^N-X^B-Z 또는-X^B-X^B-Z(여기에서, Z는 Y이거나 호모세린-락톤 라디칼을 나타낸다)을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The radical of claim 1, wherein R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical that can be genetically encoded, R ¹ represents H, and R ³¹ blocks a carboxyl group and is a basic radical that can be positively charged or quantized. Physiologically acceptable group S ^{B including} ; X ^N -S ^B , wherein X ^N represents a natural neutral L-amino acid radical; X ^B -S, wherein X ^B represents a natural basic L-amino acid radical, and S represents a group comprising a basic radical that blocks an OH or carboxyl group and can optionally be positively charged or quantized; Radical Y of basic amino acid X ^B which is reduced to the corresponding alcohol; -Xn-S, where n is 2 or 3, X represents the radical X ^N or X ^B and combinations thereof, and if the radicals X are all X ^N , S can represent only S ^B ; -Xn- Y, where n is 1 or 2; -X ^B -Z, -X ^B -X ^N -Z, -X ^N -X ^B -Z or -X ^B -X ^B -Z, where Z Is Y or represents a homoserine-lactone radical). A method of making an insulin derivative of formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof. 제1항에 또는 제2항에 있어서, R¹이 H-Phe를 나타내는 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The process according to claim 1 or 2, wherein R ¹ represents H-Phe or a physiologically acceptable salt thereof. 제1항에 있어서, R³⁰이 Ala, Thr 또는 Ser을 나타내는 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The method of claim 1, wherein an insulin derivative or a physiologically acceptable salt thereof, wherein R ³⁰ represents Ala, Thr or Ser. 제1항에 있어서, A쇄 및 (B2-29)쇄가 사람 인슐린의 서열을 갖는 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법The method of claim 1, wherein the A chain and the (B2-29) chain prepare an insulin derivative or physiologically acceptable salt thereof having the sequence of human insulin. 제2항에 있어서, S가(C₁내지 C₆)-알콕시, (C₃내지 C₆)-사이클로알콕시, NH₂, (C₁내지 C₆)-알킬아미노, 디-(C₁내지 C₆)-알킬아미노, 아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, (C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 트리-(C₁내지 C₄)-암모니오-(C₂내지 C₆)-알콕시, 아미노-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, [(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, [디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노 또는 [트리-(C₁내지 C₄)-알킬암모니오]-(C₂내지 C₆)-알킬 아미노를 나타내고, S^B는 아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, (C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노-(C₂내지 C₆)-알콕시, 트리-(C₁내지 C₄)-암모니오-(C₂내지 C₆)-알콕시, 아미노-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, [(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노, [디-(C₁내지 C₄)-알킬아미노]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노 또는 [트리-(C₁내지 C₄)-알킬암모니오]-(C₂내지 C₆)-알킬아미노중의 하나인 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The compound of claim 2, wherein S is (C ₁ to C ₆ ) -alkoxy, (C ₃ to C ₆ ) -cycloalkoxy, NH ₂ , (C ₁ to C ₆ ) -alkylamino, di- (C ₁ to C ₆ ) -alkylamino, amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, (C ₁ to C ₄ ) -alkylamino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, di- (C ₁ to C ₄ ) -alkyl Amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, tri- (C ₁ to C ₄ ) -ammonio- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, [( C ₁ to C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, [di- (C ₁ to C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino or [tri -(C ₁ to C ₄ ) -alkylammonio]-(C ₂ to C ₆ ) -alkyl amino, S ^B is amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, (C ₁ to C ₄ )- Alkylamino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, di- (C ₁ to C ₄ ) -alkylamino- (C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, tri- (C ₁ to C ₄ ) -ammonio- ( C ₂ to C ₆ ) -alkoxy, amino- (C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, [(C ₁ to C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino, [di- (C ₁ to C ₄ ) -alkylamino]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino or [tri- A process for preparing an insulin derivative or a physiologically acceptable salt thereof, which is one of (C ₁ to C ₄ ) -alkylammonio]-(C ₂ to C ₆ ) -alkylamino. 일반식(Ⅱ)의 데스-옥타펩타이드(B23-30)-인슐린을 일반식(Ⅲ)의 펩타이드와 축합시킴을 특징으로 하여, 등전점이 5.8 내지 8.5인 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.Insulin derivatives or physiological formulas of formula (I) having an isoelectric point of 5.8 to 8.5, characterized by the condensation of the des-octapeptide (B23-30) -insulin of formula (II) with the peptide of formula (III) Method for preparing the salt thereof is acceptable.

H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S²)-Thr(S²)-Pro-Lys(S³)-R³⁰-R³¹(Ⅲ)H-Gly-Phe-Phe-Tyr (S ² ) -Thr (S ² ) -Pro-Lys (S ³ ) -R ³⁰ -R ³¹ (III) 상기식에서, R¹은 H 또는 H-Phe를 나타내고, R³⁰은 유저학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내며, R³¹은 이 구조중에 0 내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 밀단 카복실 그룹은 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서, 락톤으로서 유리 형태로 존재하거나 CH₂OH로 환원될 수 있는 탄소수 50 이하의 생리학적으로 허용되는 염기성 유기 그룹을 나타내며, R¹'은 Phe 또는 결합을 나타내고, S'은 3급-부톡시-카보닐(Boc), 3급-아밀옥시카보닐(Aoc) 또는 메틸설포닐에톡시카보닐(Msc) 라디칼과 같은, 양자 가용매 분해 또는 β-제거반응에 의해서 분해될 수 있는 아미노 보호그룹을 나타내며, S²는 수소, Bzl 또는 But를 나타내며, S³는 Boc, Moc, Fmoc 또는 Z와 같은 우레탄 보호그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical that can be user-encoded, and R ³¹ represents 0-3α-amino acid in this structure The carboxyl group represents a physiologically acceptable basic organic group having up to 50 carbon atoms which may exist in free form as ester functional group, as amide functional group, as lactone or be reduced to CH ₂ OH, and R ¹ ′ represents Phe or a bond , S ′ is proton solvation or β-removal reaction, such as tert-butoxy-carbonyl (Boc), tert-amyloxycarbonyl (Aoc) or methylsulfonylethoxycarbonyl (Msc) radical Represents an amino protecting group that can be decomposed by, S ² represents hydrogen, Bzl or But, and S ³ represents a urethane protecting group such as Boc, Moc, Fmoc or Z. 제8항에 있어서, 라디칼 R³⁰및 R³¹에 존재하는 유리 COOH, OH, SH, NH₂, 구아니디노 및 이미다졸 그룹중 하나 이상의 그룹을 자체가 공지된 방법으로 보호한 다음 존재하는 보호그룹을 제거함을 특징으로 하는 방법.The protecting group according to claim 8, wherein at least one of the free COOH, OH, SH, NH ₂ , guanidino and imidazole groups present in the radicals R ³⁰ and R ³¹ is protected by known means and then the protecting group present Characterized in that for removing. 트립신 또는 트립신과 유사한 엔도펩티다제의 존재하에 R¹이 H-Phe를 나타내고 C-말단 R³⁰-R³¹이 함께 OH를 나타내는 일반식(Ⅰ)의 데스-B 30-인슐린을 일반식(Ⅳ)의 화합물과 반응시킴을 특징으로 하여, 동전점이 5.8내지 8.5인 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.Des-B 30 -insulin of formula (I) wherein R ¹ represents H-Phe and C-terminal R ³⁰ -R ³¹ together represent OH in the presence of trypsin or tryptic-like endopeptidase, is represented by And an insulin derivative of formula (I) having a coin point of 5.8 to 8.5, or a physiologically acceptable salt thereof.

(I)

(I) H-R³⁰-R³¹(IV)HR ³⁰ -R ³¹ (IV) 상기식에서, R¹은 H 또는 H-Phe를 나타내고, R³⁰은 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내며, R³¹은 이 구조중에 0 내지 3α-아미노산이 관여하며 임의의 말단 카복실 그룹은 에스테르 작용기로서, 아미드 작용기로서, 락톤으로서 유리 형태로 존재하거나 CH₂OH로 환원될 수 있는 탄소수 50이하의 생리학적으로 허용되는 염기성 그룹을 나타낸다.Wherein R ¹ represents H or H-Phe, R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical which can be genetically encoded, and R ³¹ represents 0-3α-amino acid in this structure and is optionally terminated. The carboxyl group represents a physiologically acceptable basic group having up to 50 carbon atoms which may exist in free form as ester functional group, as amide functional group, as lactone or be reduced to CH ₂ OH. 제10항에 있어서, 존재하는 유리 COOH, OH, SH, W-NH₂, 구아니디노 및 이미다졸 작용기중 하나 이상의 그룹을 자체가 공지된 방법으로 보호한 다음, 존재하는 보호그룹을 제거함을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 10, characterized in that one or more groups of free COOH, OH, SH, W-NH ₂ , guanidino and imidazole functional groups present are protected by known methods and then the protective groups present are removed. How to. 제1항에 있어서, R³⁰이 유전학적으로 암호화될 수 있는 중성의 L-아미노산 라디칼을 나타내고 R¹이 H-Phe를 나타내며 R³¹은 카복실 그룹을 차단하고 양전하를 띄거나 양자화될 수 있는 염기성 라디칼을 포함하는 생리학적으로 허용되는 그룹 S^B; X^N-S^B(여기에서, X^N는 천연의 중성 L-아미노산 라디칼을 나타낸다); Lys-OH, Hyl-OH, Orn-OH, Cit-OH, 또는 His-OH ; X^B-S'(여기에서 S'는 OH를 제외한 S의 의미와 같다) ; 상응하는 알코올로 환원되는 염기성 아미노산 X^B의 라디칼 Y ; X-X'-OH 또는 -X'-X-OH(여기에서, X'는 Lys-OH, Hyl-OH, Orn-OH, Cit-OH, 또는 His-OH를 나타낸다) ; X₂-S' ; -Xn-S(여기에서, n은 3이고, X는 라디칼 X^N또는 X^B및 이들의 조합을 나타내며, 라디칼 X가 모두 X^N이면, S는 S^B만을 나타낼 수 있다) ; -Xn-Y(여기에서, n은 1또는 2이다) 이거나, -X^B-Z, -X^B-X^N-Z, -X^N-X^B-Z 또는-X^B-X^B-Z(여기에서, Z는 Y이거나 호모세린-락톤 라디칼을 나타낸다)을 나타내는, 일반식(Ⅰ)의 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.The radical according to claim 1, wherein R ³⁰ represents a neutral L-amino acid radical that can be genetically encoded, R ¹ represents H-Phe, and R ³¹ blocks a carboxyl group and is a basic radical that can be positively charged or quantized. Physiologically acceptable group S ^{B including} ; X ^N -S ^B , wherein X ^N represents a natural neutral L-amino acid radical; Lys-OH, Hyl-OH, Orn-OH, Cit-OH, or His-OH; X ^B -S ', where S' is the same as S except OH; Radical Y of basic amino acid X ^B which is reduced to the corresponding alcohol; X-X'-OH or -X'-X-OH, wherein X 'represents Lys-OH, Hyl-OH, Orn-OH, Cit-OH, or His-OH; X ₂ -S '; -Xn-S, where n is 3, X represents the radical X ^N or X ^B and combinations thereof, and S may represent only S ^B if the radicals X are all X ^N ; -Xn-Y, where n is 1 or 2, or -X ^B -Z, -X ^B -X ^N -Z, -X ^N -X ^B -Z or -X ^B -X ^B -Z ( Wherein Z is Y or represents a homoserine-lactone radical). A method of making an insulin derivative of formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof.