KR920005048B1 - 인터로이킨-2의 안정화 조성물 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

인터로이킨-2의 안정화 조성물의 제조방법
본 발명은 약제로서 유용한 인터로이킨-2 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
인터로이킨-2(이하에서는 때때로 약자 IL-2로 표기한다)는 생체내 면역조절에 중요한 역할을 담당하고 암의 제거 또는 면역절충 상태로부터의 회복 또는 그 개선에 직접적 또는 간접적으로 공헌하고 있는 것으로 간주되는 T세포 및 천연 킬러세포의 성장인자로서 역할을 담당할 수 있는 단백질이다[Nature, 302, 305-310(1983)]. 이러한 생리학적 활성을 갖고 있기 때문에, IL-2는 새로운 형태의 항암제 또는 면역결핍에 대한 치료제로 이용될 것이 매우 기대되고 있다.
본 발명자는 IL-2가 불안정하고 냉동 또는 동결건조과정 중에 또는 동결건조후의 보존과정중에 특히 동결건조중의 건조단계에서 그 활성을 쉽게 상실하고 동결건조된 IL-2 제제를 재용해시켜 수득한 용액이 통상적으로 혼탁한 것으로 발견하였다. 이러한 사실들은 IL-2를 치료를 목적으로 하여 사용하는데 있어 매우 불리한 점이다.
이러한 상황하에서, 본 발명자는 집중적인 연구를 수행하여 안정한 IL-2 조성물을 생산하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인체 혈청알부민, 환원 화합물 또는 그 둘을 동시에 함유하고 pH가 3∼6인 용액상의 IL-2조성물을 제공한다.
본 발명을 실행함에 있어서, IL-2는 어떠한 포유동물에서 유래한 것이어도 좋지만 특히 인체 유래 IL-2가 바람직하다. IL-2는 천연물 또는 재조합 DNA가 술에 의한 생성물이어도 좋지만 후자가 바람직하다.
IL-2는 보통 IL-2 수용액의 형태로 사용한다.
IL-2의 바람직한 예는 유전자 조작에 의해 생성된 비글리코실화 인체 IL-2로써 하기의 일반식을 갖는다.
Figure kpo00001
식중 X는 메티오닌 또는 수소이다. 또한 이들의 혼합물도 쓰인다.
상기 식(I)에서, 각 아미노산은 생화학 명명법의 IUPAC-IUB에 의거한 약어로 나타내었다.
IL-2는 바람직하게는 20,000∼80,000활성단위/mg의 비활성을 갖고 또 이것은 1∼80,000활성단위/ml, 바람직하게는 10∼50,000활성단위/ml, 더 바람직하게는 50∼5,000활성단위/ml의 활성을 갖는 IL-2 수용액의 형태로서 유용하게 사용된다. 본 발명을 실시함에 있어 원료물질인 상기의 IL-2 수용액은 바람직하게는 염화나트륨 같은 염을 함유하지 않아야 한다. IL-2 정제 과정중에 상기의 용액이 염에 오염된 경우에는 사용하기전에 한외여과등으로 염을 제거하는 것이 바람직하다.
인체 혈청알부민(이하에서는 약어"HSA"로 표기한다)은 어느 등급이어도 괜찮다. 그러나 본 발명에 따른 조성물을 임상학적으로 적용할때에는, 상기의 HSA는 비경구투여에 허용되는 품질이 바람직하다.
예를들면, 건강한 사람의 혈장을 원료로 하여 에탄올 부분분리법의 콘(Cohn)의 여섯번째 방법으로 부분분리하고 정제한 HSA를 출발물질로 사용한다[J.Am.Chem.Soc.68, 459-475(1946)].
상기한 HSA는 또한 안정제로서 아세틸트립토판 소듐 또는 소듐 카프릴레이트를 함유할 수도 있다.
HSA의 첨가량은 상기한 범위내의 IL-2 농도를 갖는 IL-2 수용액 1ml당 바람직하게 0.1∼50mg, 더 바람직하게는 0.5∼20mg이다.
환원 화합물은 바람직하게는 생리적으로 허용되는 환원 화합물이고 따라서 글루타치온(환원된 형태; 이하에서는 간단히 글루타치온이라 한다), 티옥트산, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 모노티오글리세롤, 디티오트레이톨 및 1∼7 탄소원자를 함유하는 티오알카논산(예, 티오글리콜산, 티오말산), 및 아스코르브산 및 그들의 염 같이 설퍼를 함유하는 환원 화합물을 포함한다. 바람직한 것은 글루타치온, 티옥트산, N-아세틸시스테인 및 아스코르브산 등의 산성화합물이고, 특히 바람직한 것은 글루타치온 및 아스코르브산이다.
상기한 환원화합물은 단독으로 또는 둘 또는 이상을 병행하여 사용할 수 있다.
이러한 환원 화합물은 상기한 범위내의 농도를 갖는 IL-2 수용액 1ml당 0.01mg 보다 적지 않은 양, 특히 바람직하게는 0.05∼20mg의 양을 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 HSA 및 환원화합물을 상기한 범위내에서 병행하여 사용하거나 둘중 하나만을, 바람직하게는 HSA 하나만을 사용하기도 한다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물은 나아가 아미노산, 특히 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 알라닌 및 프롤린 같은 모노아미노지방족 아미노산 및 고리족 아미노산, 글루코오스 및 만노오스 같은 단당류, 소르비톨 및 만니톨 같은 당알코올, 및 그의 생리적으로 허용되는 염 및 유도체들 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 물질을 함유할 수 있다. 이들 부가적인 첨가물 중에 글리신이 특히 바람직하다.
상기한 부가적 첨가물들은 상기한 IL-2 수용액 1ml당 단당류 및 당알코올은 10∼100mg의 양 그리고 아미노산은 5∼50mg의 양이 바람직하다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물은 나아가 염화나트륨 같은 등장제, 숙신산, 타르타르산 또는 시트르산 같은 완충용액, 및/또는 계면활성제를 함유할 수 있다. 그러나 IL-2 조성물은 동결건조과정중의 안정성이라는 관점에서 볼때 염화나트륨이 없는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물을 pH 3∼6, 바람직하게는 3∼5.5, 더욱 바람직하게는 3.5∼4.5로 하기 위해서는, 산성 환원화합물 또는 글루탐산 같은 산성 아미노산을 이용하여, 또는 더 필요하거나 산성 화합물을 함유하지 않았을 경우에는 염산 또는 인산 같은 무기산, 또는 숙신산, 타르타르산 또는 시트르산 같은 유기산 완충용액을 이용하여 특정된 범위내에서 상기 조성물의 pH를 조절한다.
상기 IL-2 조성물의 안정성은 IL-2 조성물 용기내의 공간을 제거하거나, 그 공간을 질소로 채움으로써 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물은 바람직하게는 수용액, 동결물질, 동결건조물 등의 형태, 특히 동결건조물의 형태를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물은 하기와 같은 방법으로 생산할 수 있다 : 1∼80,000활성단위/ml 농도의 IL-2 수용액에 HSA 및/또는 환원화합물을 예정된 농도만큼 가한 후, 상기한 방법대로 pH 조정을 한다.
예를들면, 단당류, 당알코올 및 아미노산을 상기한 각각의 농도대로 가할 수 있다. 만약 필요하다면 등장제, 계면활성제등을 더 가할 수 있다. HSA외의 다른 물질들을 가할 경우에 pH 조정은 상기한 방법대로 최종 수용액이 상기 범위내의 pH를 갖도록 실시한다. 이렇게하여 수득한 IL-2 조성은 하기에 설명할 방법에 따라 동결물 또는 동결건조물을 생산해내는 원료물질로 이용된다.
예를들어, IL-2 조성물의 동결물은 상기 수용액을 -80°∼-20℃에서 동결시킴으로써 생산할 수 있다. 상기 동결된 조성물은 바람직하게는 -80°∼-10℃에서 보관한다.
예를들어, IL-2 조성물의 동결건조물은 상기한 동결된 조성물을 감압하에 공지의 방법대로 건조시키거나 또는 상기의 수용액 또는 상기의 동결된 조성물을 녹여 만든 수용액을 상기 방법대로 동결시키고, 원하는 대로 분배한 후 공지의 방법에 의해 감압하에 생성된 동결된 조성물을 건조시킴으로써 생산할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 용액 형태의 IL-2 조성물은 상기한 방법에 의해 생산된 IL-2, HSA 또는/및 환원 화합물, pH 조정제 등을 함유한 동결건조물을 단당류, 당알코올, 아미노산을 함유하고 필요하다면 염산으로 pH를 조정한 용매에 재용해시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 동결건조된 IL-2 조성물을 주사용 제제로 생산할 경우에는 각각 멸균 여과를 시킨 IL-2 함유 수용액과 첨가물 함유 수용액을 혼합하거나 또는 IL-2 함유 수용액 및 첨가물 함유 수용액의 혼합물을 멸균 여과시켜 정제한 후, 혼합물을 무균 상태로 바이알 등에 분배하고 바이알내의 혼합물을 상기 방법대로 동결건조처리하는 것이 바람직하다.
동결건조물을 아미노산, 단당류 또는 당알코올 등을 함유하는 수용액에 용해시킬 경우에는, 수용액을 멸균여과시킨 후 앰풀 등에 분배하고 용매로 사용하기 전에 오토클레이브하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물은 보관, 동결 및 동결건조 과정중에 생기는 IL-2 활성의 감소가 최소이고, 동결건조물로 사용할때 그를 용해시킨 용액이 맑고 투명하다는 특성에서 유리하다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물, 특히 동결건조물의 형태는 개선된 외곽을 가지며 용기벽에의 흡착이 효과적으로 방지된다.
동결건조했을때 아미노산을 함유한 조성물 또는 개선된 외관을 보인다. 또한 주사에 의한 투여시의 고통도 효과적으로 경감된다.
단당류 함유 조성물 또한 주사에 의한 투여시 고통 완화 효과를 갖는다.
본 발명이 제공한 IL-2 조성물중에, 동결건조물은 안정화된 IL-2 분말로 수득할 수 있으며 비경구 투여를 위한 제제로서 유리하게 사용될 수 있다. 주사용 제제로 사용할때, 동결건조물을 예를들면 0.5∼100ml의 주사용 증류수 또는 생리 식염수에, 또는 효과적인 사용을 위해 동결건조물과 조성이 비슷한, 즉 글리신 같은 아미노산, 글루코오스 등의 단당류 또는 필요하다면 pH 조정제로서의 만나톨 같은 당알코올을 함유한 수용액 0.5∼100ml에 용해시키고, 그 용액을 근육내 또는 정맥 내 투여한다. 상기 조성물은 또한 적당한 담체, 부형체 또는 희석제를 이용하여 만든 구강, 비강, 눈 또는 귀를 통한 투여용 제제의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 IL-2 조성물은 독성이 낮으며, 공지의 IL-2 제제와 같은 목적 및 같은 방법으로 사용할 수 있다.
본 명세서내에 활성단위(U)로 나타낸 IL-2 활성 데이타는 하기의 방법에 의해 얻었다 : 즉, IL-2 함유시험시료를 IL-2 농도의존방식으로 증식할 수 있는 생쥐 세포주의 배지내 현탁액에 가한다. 배양후, 삼중수소화 티미딘의 흡수를 지표로 삼아 상기 세포주의 증식을 결정한다. 분석에 있어, 표준 IL-2(IU.ml)를 항상 시험시료와 비교하면서 사용하고 그 둘의 활성비로부터 시험 사료의 활성을 활성단위로 계산한다.
특히, IL-2 의존 생쥐 세포주[NKC 3; Hinuma etal., Biochemical and Biophysical Research Communications. 109, 363(1982)]는 20% FCS(태내송아지 혈청)을 가한 인체 IL-2 함유 조정배지를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2존재하에 37℃에서 준배양함으로써 유지시킨다. 세포를 무혈청 RPMI 1640 배지로 두번 세척하고 20% FCS 첨가-RPMI 1640 배지에 6×105세포/ml의 농도가 되도록 재현탁시킨다.
모든 IL-2 함유 시험 시료를 96웰의 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트(Nunc.덴마아크)의 제1열 웰에 50μℓ씩 분배하고, 각 웰 마다 50μℓ의 20% FCS 첨가 RPMI 1640 배지를 이용하여 제12열이 될때까지 2배씩 희석해 나간다. 그리고 상기 NKC3 세포 현탁액을 50μℓ씩 각 웰에 가한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 24시간 동안 배양을 실시하는데, 20시간 배양후 각 웰에 1μCi의 삼중수소화 티미딘(Amersham, 영국)을 가한다. 세포수집기(Flow, 미국)를 사용하여 유리 여과기에 세포를 수집하고 액체 섬광계수기를 이용하여 삼중수소화 티미딘의 흡수를 측정한다. 동시에, 표준 IL-2 시료의 삼중수소화 흡수를 측정하는데 있어서도 동일한 방법을 수행한다.
활성 단위(U)의 계산을 프로피트 방법[Journal of Immunology, 120, 2027(1978)]에 따라 수행한다. 표준 IL-2 시료(37℃, 5% CO2존재하에 40μg의 콘카나발린 A 및 15ng/ml의 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트를 가한 10% FCS 첨가 RPMI 1640 배지에서 5×106/ml의 인체 말초 혈액 림포사이트를 48시간 배양한 배양 상층액의 활성을 1U/ml로 정의한다. 희석물중의 최대 흡수를 100%으로 간주하고, 각 희석 단계의 흡수 %를 계산한다. 얻어진 수치를 보통 확률지에 플로트하고 50% 흡수에 해당하는 희석률을 그래프를 통해 결정한다.) 각 IL-2 함유시료에 대해, 동일한 방법으로 50% 흡수에 해당하는 희석률을 결정한다.
시료의 IL-2 농도(U/ml)를 하기의 식을 이용하여 계산한다 :
Figure kpo00002
하기의 참고예에 기재된 형질 전환된 에스케리키아 콜리 DH 1/pTF4는 일본국 재단법인 발효연구소(IFO)에 IFO-14299로 기탁되어 있으며, 1984년 4월 6일부터는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소(FRI)에 FREM BP-628로 기탁되어 있다.
하기의 실시예 및 참고예에서 본 발명이 보다 자세히 설명한다. 그러나 본 발명이 거기에 국한되는 것은 아니다.
실시에에서 사용한 원료용액은 참고예에 설명한 방법에 의해 수득한 비글리코실화 인체 IL-2 단백질 용액이다.
[실시예 1]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜 조제한 2,450활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 10mg의 글루타치온 또는 아스코르브산 함유 용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨 후 가한다. 이렇게 수득한 두 수용액(각 1ml, 각각 pH 3.4 및 pH 3.5)을 바이알에 넣어 -40℃에서 동결시키고 동결건조시킨다. 그리고 바이알내의 빈 공간을 N2가스로 채우고 밀봉한다.
글루타치온 또는 아스코르브산을 함유하지 않은 수용액 동일량과 글루타치온 또는 아스크로브산 대신 동결건조제조에 자주 쓰이는 만니톨 25mg을 함유한 수용액 동일량을 대조로 사용하여 동일 방법으로 동결건조시킨다.
이 동결건조물을 각각 1ml의 주사용 증류수에 용해시키고, 용해도(정화도) 및 역가를 검사한다. 역가에 대하여는, 동결건조전의 수용액의 역가를 100%로 간주하고 잔류%를 계산한다. 제1표의 결과가 나타내듯이, 본 발명에 IL-2 조성물은 대조에 비해 용해도 및 잔류역가에 있어 월등하게 우세하다.
[표 1]
Figure kpo00003
[실시예 2]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜 제조한 7,680활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 2mg의 글루타치온 또는 아스크로브산 함유용액(0.5ml)을 멸균여과한 후 가한다. 이렇게 수득한 두 수용액(각 1ml, 각각 pH 3.6 및 pH 3.7)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 동결건조시키고, 동결건조물에 대해 조작후 즉시 용해도에 대해 그리고 25℃에서 한달간 보조후 용해도 및 잔류 역가에 대한 검사를 한다. 얻은 결과를 제2표에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00004
[실시예 3]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜 제조한 7,680활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 5ml의 HSA, 2mg의 글라타치온 또는 아스크로브산 함유하는 용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨 후 가한다. 이렇게 얻은 두 수용액(각 1ml, pH 4.1 및 pH 4.2)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 동결건조시키고, 동결건조물에 대해 실시예 2에서와 동일한 방법으로 용해도 및 잔류역가를 검사한다.
그 결과를 제 3 표에 나타내었다.
[표 3]
Figure kpo00005
[실시예 4]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜 제조한 7,680 활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 5mg의 HSA, 9mg의 염화나트륨 및 2mg의 글루타치온 또는 아스크로브산을 함유하는 용액(0.5ml)을 멸균 여과한 후 가한다. 두 수용액(각 1ml, pH 4.1 및 pH 4.2)을 실시예 1에서와 같은 방법으로 동결건조하고, 동결건조물에 대해 실시예 2에서와 동일한 방법으로 용해도 및 잔류역가 검사를 실시한다.
결과를 제 4 표에 나타내었다.
[표 4]
Figure kpo00006
실시예 5
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과하여 제조한 7,680활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 50mg의 만니톨 및 2mg의 글루타치온 또는 아스코르브산 함유 용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨 후 가한다. 이렇게 하여 수득한 두 수용액(각 1ml, 각각 pH 3.4 및 pH 3.6)을 실시예 1에서와 같은 방법으로 동결건조시키고 결건조물에 대해 실시예 2에서와 동일한 방법으로 용해도 및 잔류역가를 검사한다.
결과를 제 5 표에 나타내었다.
[표 5]
Figure kpo00007
* 25℃에서 6일간 보관후 측저한 데이타.
[실시예 6]
원료 용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과하여 제조한 23,350 활성단위의 인체 IL-2 함유 수용액(0.5ml)에 5mg의 글루타치온 및 23mg의 글리신 완충용액을 함유하는 수용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨후 가한다. 이렇게 얻은 수용액(1ml, pH 3.7)을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 동결건조시키고, 동결건조물에 대해 조작후 즉시 및 40℃에서 3주간 보존한후에 용해도 및 잔류역가에 대한 검사를 실시한다.
결과를 제 6 표에 나타내었다.
[표 6]
Figure kpo00008
[실시예 7]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과하여 조제한 1,790 또는 130 활성단위의 인체 IL-2 함유수용액(0.5ml)에 2mg의 글루타치온, 5mg의 HSA 및 9mg의 염화나트륨을 함유하는 수용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨 후 가한다. 이렇게 수득한 두 수용액(각 1ml, 둘다 pH 3.9)을 실시예 1과 동일한 방법으로 동결건조하고, 조작후 즉시 및 40℃에서 1주일간 보존한후 동결건조물의 용해도 및 잔류역가에 대해 검사한다.
결과를 제 7 표에 나타내었다.
[표 7]
Figure kpo00009
[실시예 8]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과하여 제조한 1,860 또는 116 활성단위의 인체 IL-2 함유수용액(0.5ml)에 2mg의 글루타치온, 1mg의 HSA 및 23mg의 글리신 완충용액을 함유하는 수용액(0.5ml)을 멸균 여과시킨 후 가한다. 두 수용액(각 1ml, pH 3.8 및 pH 3.9)을 실시예 1과 동일한 방법으로 동결건조하고 조작후 즉시 및 40℃에서 1주일간 보존한후 동결건조물의 용해도 및 잔류역가에 대해 검사한다.
결과를 제 8 표에 나타내었다.
[표 8]
Figure kpo00010
[실시예 9]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과하여 조제한 17,600 활성단위의 인체 IL-2를 함유하는 수용액(0.5ml)에 5mg의 HSA를 함유하고 pH가 4인(염산으로 조절한다) 멸균시킨 수용액(0.5ml) 또는 5mg의 HSA 및 9mg의 염화나트륨을 함유하고 pH가 4인(염산으로 조절한다) 멸균시킨 수용액(0.5ml)을 가한다. 이렇게 얻어진 두 수용액(각 1ml)을 바이알에 넣고, -40℃에서 동결시키고, 동결건조시킨다. 그 후에 바이알 내의 빈 공간을 N2가스로 채우고 바이알을 밀봉한다.
이 동결건조물을 조작후 바로 또는 40℃에서 0.5개월 동안 보존한후 각각 1ml의 주사용 증류수에 용해시키고 용액에 대해 용해도(정화도) 및 역가 검사를 실시한다. 역가에 관해서는, 동결건조시키기 전의 수용액의 역가를 100%로 잡고 여기에 근거하여 잔류 %를 계산하였다. 제 9 표에 나타낸 결과가 지시하듯이 본 발명에 따른 IL-2 조성물은 용해도 및 잔류역가에 있어서 현저하게 뛰어나다.
[표 9]
Figure kpo00011
[실시예 10]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜서 제조한 4,115 활성단위/ml의 인체 IL-2를 함유하는 수용액(0.5ml)에 5mg의 HSA, 5mg의 HSA+9mg의 염화나트륨, 5mg의 HSA+23mg의 글리신, 또는 5mg의 HSA+50mg의 만니톨을 함유하고 pH가 4.0(염산으로 조절한다)인 멸균시킨 수용액(0.5ml)을 가한다. 얻어진 4종류의 수용액(각 1ml)을 바이알에 넣고, -40℃에서 동결시키고, 동결건조시킨다. 그후에 바이알의 빈 공간을 N2가스로 채우고 각 바이알을 밀봉한다. 대조로서는, IL-2만의 수용액 및 pH조절제를 함유하지 않는 여러 종류의 IL-2 수용액을 동량 사용하고, 상기의 것과 동일한 방법으로 동결건조시킨다.
이 동결건조물들에 대해 외관 검사를 한후, 각각 1ml의 주사용 증류수, 0.9% 생리 식염수, 5% 글루코오스 수용액, 5% 소르비톨 수용액 또는 5% 만니톨 수용액에 재용해시키고, 용액들에 대해 pH 및 용해도(정화도) 검사를 한다.
제10표에 나타낸 결과대로, 본 발명에 따른 IL-2 조성은 대조물에 비해 그 용해도에 있어 현저하게 뛰어나다. 특히 HSA 및 글리신이 함유되고 약 4의 pH를 갖는 동결건조물은 용해도에서 뛰어나다.
[표 10]
Figure kpo00012
[실시예 11]
실시예 9의 방법에 의해 얻고 여과를 통해 대장균을 제거하고 1,620 또는 128 활성단위의 IL-2, 5mg의 HSA 및 23mg의 글리신을 함유하며 pH가 4.0인(염산으로 조정한다) 두 수용액(각 1ml)을 실시예 9의 것과 동일한 방법으로 동결건조시키고 동결건조물에 대해 조작후 즉시 그리고 40℃에서 1주, 2주 및 4주일간 보존한후 실시예 9의 것과 동일한 방법으로 용해도 및 잔류역가 검사를 실시한다.
얻어진 결과를 제11표에 나타내었다.
[표 11]
Figure kpo00013
[실시예 12]
원료용액을 주사용 증류수로 희석하고 멸균 여과시켜 제조한 2,450 활성단위의 인체 IL-2를 함유하는 수용액(0.5ml)에 주사용 증류수(0.5ml), 10mg의 글루타치온, 글루타치온 디소듐염, 아스코르브산 또는 소듐아스코르베이트를 함유하는 멸균 여과액(0.5ml) 또는 염산에 의해 산성상태로 조정되고 10mg의 글루타치온 디소듐염 또는 소듐 아스코르베이트를 함유하는 멸균 여과액(0.5ml)을 가한다. 이렇게 해서 얻어진 7종류의 수용액을 바이알에 넣고, -40℃에서 동결시키고, 동결건조 시킨다. 그후에 바이알내의 빈 공간을 N2가스로 채우고 바이알을 밀봉한다. 이 동결건조물들을 각 1ml의 주사용 증류수에 재용해 시키고, 용액에 대해 pH 및 용해도(정화도) 검사를 실시한다. 제12표에 나타낸 결과가 지시하듯이, 본 발명에 따른 IL-2 조성물은 대조에 비해 용해도에 있어 월등하게 뛰어나다.
[표 12]
Figure kpo00014
참고예
비글리코실화 인체 IL-2 단백질용액의 제조방법
(i) 한국 특허출원 제 7430/1984호 명세서의 실시예 3에서 수득한 인체 IL-2 유전자 함유 형질전환체 에스케리키아콜리(이.콜리) DH1/pTF4를 250-ml 에를렌마이어 플라스크 내의 1% 박토 트립톤(디프코 실험실, 미합중국), 0.5% 박토 효모추출액(디프코 실험실, 미합중국), 0.5% 염화나트륨 및 7μg/ml 테트라시클린을 함유하는 액체 배지(pH7.0) 50ml에 접종한 후 회전 진탕 배양법으로 37℃에서 밤새 배양한다. 배양액을 0.5% 카사미노산, 0.5% 글루코오스 및 7μg/ml 테트라시클린을 함유하는 M9 배지 2.5l를 포함하는 5l용 단지 발효기에 옮기고 37℃에서 4시간 동안 통기와 교반을 실시한 후, 3-β-인돌릴아크릴산(25μg/ml)을 가하고 동일 조건하에서 4시간 동안 더 배양한다. 이렇게 하여 수득한 배양액(2.5l)을 원심분리하고 세포를 수집하고 -80℃에서 동결시키고 보존한다.
(ii) 상기(i)에서 수득하고 동결상태에서 보관시킨 세포(37.5g)을 7M 구아니딘 히드로클로라이드 및 0.1M 트리스. HCl을 함유하는 500ml의 여과용매(pH7.0)에 균일하게 현탁시키고, 현탁액을 4℃에서 1시간동안 교반한다. 생성된 분해물 용액을 28,000×g에서 20분간 원심분리하여 453ml의 상층액을 수득한다.
(iii) 상기(ii)에서 수득한 상층액을 0.01M 트리스. HCl 완충용액(pH8.5)을 이용하여 투석하고 19,000×g에서 10분 동안 원심분리한다. 얻어진 상층액(458ml)을 단백질 흡착을 효과적으로 하기 위해 사전에 미리 0.01M 트리스. HCl 완충용액(pH8.5)으로 평형화한 DE52(DEAE-셀루로오스, 화트만, 영국)컬럼(50ml 부피)에 채운다. 선형 NaCl 농도 구배(0∼0.15M NaCl, 1l)를 형성함으로써 IL-2를 용출시킨다. 활성분획(105ml)을 합하고, YM-5막(아미콘, 미합중국)을 이용하여 10.2ml로 농축시키고, 0.1M 트리스. HCl(pH8.0)-1M NaCl 완충용액으로 평형화한 세파크릴 S-200(파미시아, 스웨덴)컬럼 (500ml부피)을 이용하여 겔 여과시킨다. 활성분획(56ml)을 YM-5막을 이용하여 4.9ml로 되게 농축시킨다. 얻어진 농축물을 울트라포어 RPSC(알텍스, 미합중국)컬럼 및 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용출계를 이용하여 고수율 액체 크로마토그래피한다.
컬럼, 울트라 포어 RPSC(4.6×75cm) ; 컬럼온도 ; 30℃ ; 용리액 A, 0.1% 트리플루오로아세트산-99.9% 물 ; 용리액 B, 0.1% 트리플루오로아세트산-99.9% 아세토니트릴, 용출 프로그램, 0분(68%A+32% B)-25분(55%A+45%B)-35분(45%A+35%B)-45분(30%A+70%B)-48분(100%B) ; 용출속도, 0.8ml/분 ; 검출파장, 230nm. 상기 조건하에서 약 39분의 체류시간을 나타내는 활성분획을 수집하고 7.5mg의 비글리코실화 인체 IL-2 단백질[비활성, 30,000U/mg ; 출발물질로부터의 활성 회수율, 48.2% ; 단백질의 순도 9%(농도계로 측정한다)]을 함유하는 용액 15ml을 수득한다.

Claims (25)

  1. 인터로이킨-2 수용액에 인체 혈청 알부민, 환원 화합물 또는 그 둘 모두가 첨가하고, 그 용액의 pH를 3∼6이 되도록 조절함을 특징으로 하는 인체 혈청 알부민, 환원 화합물 또는 그 둘 모두를 함유하고 pH3∼6을 나타내도록 조절된 용액상의 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 인터로이킨-2가 인체 인터로이킨-2인 방법.
  3. 제1 또는 2항에 있어서, 인터로이킨-2가 재조합 인터로이킨-2인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 인체 인터로이킨-2가 비글리코실화된 인체 인터로이킨-2인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 인터로이킨-2가 20,000∼80,000 활성단위/mg의 비활성을 갖는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 인터로이킨-2가 수용액상으로서 1∼80,000 활성단위/ml의 농도인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 조성물이 염을 포함하지 않는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 조성물이 인체 혈청 알부민을 함유하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 인체 혈청 알부민의 수용액상으로서 0.1∼50mg/ml의 농도인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 조성물이 환원 화합물을 함유하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 환원 화합물이 산성 환원 화합물인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 산성 환원 화합물이 글루타치온, 티옥트산, N-아세틸시스테인, 1∼7 탄소원자의 티오알카논산 또는 아스코르브산인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 환원 화합물이 수용액상으로서 0.05∼20mg/ml의 농도인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 조성물이 인체 혈청 알부민 및 환원 화합물을 동시에 함유하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 조성물이 모노아미노 지방족 아미노산, 고리족 아미노산, 단당류, 당알코올 또는 이들을 병행하여 더 함유하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 조성물이 모노아미노 지방족 아미노산을 더 함유하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 모노아미노 지방족 아미노산이 수용액상으로서 5∼50mg/ml의 농도인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 조성물의 pH가 3∼5.5인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 조성물이 수용액, 동결물, 또는 동결건조물의 형태인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 조성물이 동결건조물의 형태인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 동결된 조성물을 얻기위해 생성된 용액을 더 동결시키는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 동결건조된 조성물을 얻기위해 생성된 용액을 더 동결건조 시키는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 수용액을 산성 환원 화합물, 산성 아미노산, 무기산 또는 완충용액 또는 유기산을 이용하여 조절하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 수용액을 무기산으로 조절하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 수용액을 산성 환원 화합물로 조절하는 방법.
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