KR910008642B1

KR910008642B1 - 신규한 단백질 감미료의 제조방법

Info

Publication number: KR910008642B1
Application number: KR1019890700263A
Authority: KR
Inventors: 조중명
Original assignee: 주식회사 럭키; 허신구; 럭 키 바이오테크 코포레이션
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-02
Publication date: 1991-10-19
Also published as: JPH02500717A; WO1988010303A1; AU1939788A; ES2012530A6; EP0323489A1; BR8807102A; GR1000110B; IN168525B; KR890701740A; GR880100384A; AU619193B2

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

신규한 단백질 감미료의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 제조합 기술에 의한 신규한 단백질 감미료의 제조방법에 관한 것이다.

[배경기술]

모넬린은, 서부 아프리카에서 서식하는 Dioscorephyllum comminsii라는 식물의 열매인 "이상한 액과(Serendipith berries)"의 수액에 존재하는 매우 단맛의 물질이다. 이 물질은 동질성 물질로 정체되어지는바. 탄수화물이 전혀 함유되지 않은, 분자량 1.1×10⁴의 염기성 단백질인 것으로 나타났다. 모넬린은 열대 식물에서 찾아볼수 있는 몇몇 감미료 또는 조미료들 중에서 그 특성이 가장 잘 알려진 물질로, 크기가 거의 비슷한 2개의 서브유니트가 비공유결합으로 결합되어 있다. 이 2개의 서브 유니트는 서로 동일하지 않으며, 모넬린의 맛을내는 능력은 2개의 서브유니트와 하나의 단일 메르캅탄기에 연유하는 것으로 이를 차단하면 단막이 상실된다.

식물 원료로부터 천연생성물을 추출하는 것의 불확실성 및 비용 때문에, 단백질 감미료를 생산하기 위한 다른 경로가 실질적인 관심을 끌고 있다. 재조합 기술은 다양한 종류의 단백질을 합성할 기회를 제공하였다. 그러나, 재조합 기술을 사용할 경우, 유전자를 제조하기 위한 전략을 개발하고 단백질이 숙주세포에서 성공적으로 발현되었는가를 입증해야 하며 생리활성을 나타내는 단백질로 분리하는 것이 필요하다. 많은 경우에, 천연적으로 발생된 시퀸스를 수정하는 것이 필요하여, 유용한 생성물 생산의 성공에 대한 불확실성은 실질적으로 증가되어진다.

관련문헌 : Morris et al., J. Biol. Chem. (1973)248 : 534∼539에 모넬린의 특성이 설명되어 있으며, 그밖에 Cagan, Science(1973)181 : 32∼35 ; Wlodawer and Hodgson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1975)72 : 398∼399 ; Bohak and Li, Biochimica et Biophysica Acta(1976)427 : 153∼170 ; Hudson and Biemen, Biochem. Biophys. Res. Comn.(1976)71 : 212∼220 ; Jirgenson, Biochem. Biophys. Acta(1976)446 : 255∼261 및 Van der Wel and Loeve, FEBS Left. (1973)29 : 181∼183에도 모넬린의 특성에 대해 설명되어 있다. 미합중국 특허 제 3,998,798호에는 천연모넬린의 제조방법이 설명되어 있다.

[발명의 개요]

본 발명에서는, 단맛을 내는 능력을 갖는 신규한 단백질을 발현시키기 위하여, 신규한 DNA 오픈 리딩 프레임(DNA open reading frames)과 그 오픈 리딩 프레임을 사용하여서 된 구성물 및 발현 시스템이 제공되어지며, 상기 단백질은 모넬린의 아미소나 시퀸스의 대부분을 사용한다. 상기 단백질은 2개의 서브유니트를 가진 모넬린과는 달리 하나의 분자로서, 단일 시퀸스로 규정한다.

[발명의 개시]

본 발명에서는 신규한 단백질 감미료와 그의 제조방법 및 제조방법에 이용되는 중간체, 특히 헥산중간체가 제공되어진다. 상기 감미료는 천연 모넬린을 모델로 한 것으로서 모넬린의 독립된 2개의 서브유니트가 하나의 연속 시퀸스로 함께 연결되어 있다. 2개의 서브유니트는 그들 사이의 연결부위에 인접된 아미노산을 수정하거나, 또는 시퀸스를 연장하여서 된 짧은 연결체를 삽입하는 것에 의해 그 끝과 끝이 연결될 수 있다.

본 발명의 아미노산 시퀸스는 그 대부분이 모넬린 서브유니트의 아미노산 시퀸스로서, 일반적으로 모넬린 시퀸스와 적어도 80% 이상의 상동성을, 보다 일반적으로는 모넬린 시퀸스와 적어도 90%이상의 상동성을 갖는다.

아미노산 시퀸스는 삽입이나 삭제 또는 치환에 의해 변화될 수 있는데, 삽입 및 삭제할 경우 일반적으로 9개의 아미노산을 초과하지 않으며 보다 일반적으로는 6개의 아미노산을 초과하지 않고, 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있는바 다음의 표에 같은 줄에 있는 아미노산들을 보존적 치환을 지정한다. 대부분의 경우, 극성 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환될 수 없으며, 지방족 아미노산은 방향족 아미노산으로 치환될 수 없다.

대부분의 경우, 보존적 치환이 바람직하며, 서브유니트 II의 41 및 42위치의 시스테인와 메티오닌은 존속시키도록 한다(표제 구성물과는 다른 모넬린과 관련된 아미노산의 번호붙이기로서, 천연 모넬린 서브유니트의 번호붙이기에 의거한 것이다).

천연 모넬린의 X선 3차 구조 결정과 관련된 문헌(Wlodawer, A. and Hodgson, K. O., Proc. Natl. Scad. Sci., U. S. A., 72, 398(1975) ; Tomlinson, G. E. and Kim, S. H., J. Biol. Chem. 256, 12476(1981)에 의하여 B사슬의 46번째 아미노산인 이소루이신이 A 사슬의 6번째 아미노산인 글라이신과 수소결합을 하고 있으며, 그 사이의 8개 아미노산들(타이로신, 글루타민산, 아스파라진, 글루타민산, 알지닌, 글루타민산, 이소루이신, 라이신)이 일정한 구조를 이루고 있지 않으며, 신축성이 있는 구조를 하고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기의 사실들을 근거로하여, 본 발명에서는 여러 변종들, 즉, 상기한 8개 아미노산들이 제거된 변종들을 유전자 조작하고 발현시켰을 때 단맛을 유지하고 있음을 확인하였고, 아미노 말단의 5개 아미노산을 제거하였을 때에도 단맛을 유지함을 확인하였으며, 각각의 루프지역 아미노산들의 변종도 단맛에 변화가 없음을 확인하였고, 또한 카르복시 말단의 2개의 아미노산을 제거 또는 치환하였을 때에도 단맛을 유지함을 확인하여, 전체 94개의 아미노산으로 이루어진 단일 가닥의 유지함을 확인하여, 전체 94개의 아미노산으로 이루어진 단일 가닥의 모넬린에서 상기한 약 20개 아미노산이 제거 및 다른 아미노산으로 치환시켜도 단맛의 변화가 없음을 확인하였다.

본 발명의 단백질은 N-말단으로서 서브 유니트 II 또는 서브유니트 I 중 어느것을 가져도 좋으며, 특히 서브유니트 II를 갖는 것이 좋다. 본 구성물에 따르면, 생성물은 N-말단 메티오닌을 가질 수도 있고 갖지 않을수도 있다. 2개의 서브유니트는, 일반적으로 10개이하 보다 일반적으로 8개 이하의 짧은 연결체를 이용하여 연결시키거나, 혹은 직접 연결 바람직하게는 연결부위의 아미노산들을 수정하여 직접연결시킬 수 있다. 연결체를 형성하기 위한 연결부위의 아미노산들은 극성 연결을 위해 제공되는바, 서브유니트 말단에 존재하는 아미노산 중 적어도 50수% 이상 일반적으로는 적어도 75수% 이상이 극성이 되도록 하며, 편리하게는, 적어도 25수%이상 일반적으로는 약 50수%를 자연상태로 두도록 한다. 이렇나 아미노산들은 한 루프(loop)의 서브유니트 I 으로부터 올 수 있다.

연결과 관련하여, 연결부위는 서브유니트의 천연 시퀸스중 10개 이하 일반적으로는 6개 이하의 아미노산을 연결체로서 포함한다. 서브유니트 II의 C-말단을 서브유니트 I의 N-말단과 연결시키는데 있어서, 연결부위는 서브유니트 II의 He(46)와 서브유니트 I의 Gly(6)에 존재하며, 만일 중재 아미노산이 있다면, 연결체인 이들을 포함한다.

N-말단이 서브 유니트 II에 존재할 때, 연결부위의 야생형 아미노산 중 하나 이상을 제거 또는 치환시킬 수 있는바, 일반적으로 10개 이하의 아미노산을 제거 또는 치환시키며 일반적으로는 6개 이하의 아미노산을 제거 또는 치환시킨다. 일반적으로, 제거되거나 치환된 아미노산중 75%이하가 서브유니트 중의 하나와 관련되도록 한다.

바람직한 연결체로는 다음과 같은 시퀸스를 포함한다.

aa_x ¹-aa_x ²-aa_x ³-aa_x ⁴-aa_x ⁵-aa_x ⁶-aa_x ⁷-aa_x ⁸

여기서, 하나의 아미노산만은 존재할 필요가 있으며, 각 아미노산들은 다음과 같이 정의되는 바,

aa¹는 A,D,E,K,R 또는 Y이며,

aa²는 Y,A,D,E,N,Q,R,T,K 또는 S이며,

aa³는 N,Q,S,T,D,E,R,A 또는 Y이며,

aa⁴는 F,W,Y,S,T,D,E,K 또는 R이며,

aa⁵는 D,E,K,R,L 또는 T이며,

aa⁶는 D,E,V,I,L,K 또는 R이며,

aa⁷는 G,A,V,I,L,K 또는 R이며.

aa⁸는 K 또는 R이고,

x는 0 또는 1이며 적어도 하나 이상의 x는 1이다.

바람직한 조성은 다음과 같다.

aa¹은 Y 또는 E이고,

aa²는 D,E,Y 또는 K이며,

aa³는 N,T,A 또는 Y이며,

aa⁴는 R,S,K 또는 E이며

aa⁵는 E,D,R 또는 T이며,

aa⁶는 K,D,E 또는 R이며,

aa⁷는 G,I, 또는 L이며,

aa⁸는 K 또는 R이다.

시퀸스가 처음의 2개의 아미노산으로서 Y 및 E를 가질 경우 1 내지 4개의 x가 0의 값을 갖을 수 있으며, 처음의 2개의 아미노산으로서 그 밖의 아미노산을 가질 경우 0 내지 5개의 x가 0의 값을 갖을 수 있다. 즉, 상기 사슬은 일반적으로 3 내지 8개, 보다 일반적으로는 4내지 8개의 아미노산을 갖는다.

특히, 연결부위가 Y-E-N-E-R-E-I-K일 때 페닐알라닌인 제거된다. 다른 연결체로서 Y-E-N-R-E-D-I-K, Y-K-T-R-E-D-I-K, Y-E-R-E-I-K, Y-E-N-I-K, Y-E-I-K, Y-Y-A-S-D-K-L-K, Y-A-S-D-K-L, Y-A-S-D-K, Y-S-D-K, E-D-Y-K-T-R-G-R 및 E-D-Y-T-R이 포함된다. 일반적으로 사슬 내에 Y-E-D-K 또는 R중 적어도 하나 이상이 존재하도록 하며, 바람직하게는 E,D,K 또는 R중 적어도 하나이상이 존재하도록 한다. 연결체를 위한 바람직한 아미노산은 Y,I,S,I,D,E,K,R,N 또는 Q로서, 연결체의 아미노산중 50%이상을 상기 아미노산그룹 중에서 선택하도록 한다.

변환, 삽입, 삭제 및 치환의 총수는 일반적으로 12개보다 일반적으로는 10개의 아미노산을 초과하지 않도록 한다. 이때, 치환을 먼저 세며, 이어서 삭제 또는 삽입을 세어 총수를 센다.

표제 조성물은 재조합 기술에 의해 제조되어질 수 있다. 발현을 위해서는 유전자가 제공되어져야만 하는 바, 서브유니트 I 및 II의 시퀸스는 천연 원료로부터 제놈 DNA 또는 cDNA로 얻어질 수 있다. 이외는 다른 방법으로서, 바람직한 이중-가닥 (double-strand)을 얻기 위해 함께 결찰되어질 단일-가닥 (single-stranded)들을 제조하기 위한 전략이 개발되어질 수 있다. 결과되어진 결찰된 이중-가닥 DNA가 적당한 오픈 리딩 프레임을 갖는 것을 확실시하기 위해서는, 시퀸스들을 헤테로듀플럭싱(heteroduplexing)하는 것을 최소화하도록 설계한다. 실시예에서 사용된 전략이 특히 바람직하다.

일단, 이중-가닥 시퀸스를 설계한 후, 다양한 단일-가닥 단편을 합성하여 통상의 기술로 함께 결찰시킨다. 그 다음, 코딩(coding)부분을 이용하여 발현 카셋트(cassette)를 제조한다. 발현 카세트는, 오픈 리딩 프레임에서의 전사 방향에 따라 5'-말단에 전사 및 해독 개시 조절 부분(transcriptronal and translational initiation regulatory regions)을, 전사방향에 따라 오픈리딩 프레임의 3'-말단에 전사 및 해독 종료 부분(transcriptional and translational termination regions)을 포함시킨다.

오늘날, 매우 다양한 유전자들의 전사 및 해독 조절 부분을 포함하는 많은 벡터가 있다. 이러한 벡텨의 개시 및 종료 부분은 폴리링커(polylinker)에 의해 분리되어 있고, 오픈 리딩 프레임은 그들의 전사 및 해독 조절하에 존재하기 위해 개시부분과 종료부분사이에 삽입되어져 있다. 벡터는, 특정한 발현숙주에 따라 상업적으로 이용가능하거나, 혹은 문헌에 설명되어져 있어서 필요한 기능을 갖는 이용할만한 절편으로부터 제조되어질 수 있다. 대부분의 경우, 벡터는 낮거나 높은 일반적으로는 1000이하의 복제수를 갖는 복제 시스템을 포함하며, 제거되어질 벡터로는 어느 것을 사용하여도 좋다. 이와는 다른 방법으로서, 여분염색체(extrachromosomal)를 이용하는 대신, 벡터와 숙주제놈 사이의 상동성을 부여하여 통합(integration)의 기회를 증가시킬 수 있다. 통합시킬 경우에는 발현 카세트와 앞 뒤 일렬로 증폭 유전자(amplifying gene)가 제공될 수 있다. 증폭유전자로는 디하이드로폴레이트 리덕타제, 메탈로티오네인 또는 티미딘 키나아제등이 포함된다. 이러한 유전자는 발현 숙주에서 발현되기 위해 적당한 전사 및 해독조절 부분을 동반한다. 원핵생물을 이용할 경우, 폴리시스트론성 메세이지(polycistronic message)가 이용될 수 있는 바, 증폭유전자와 감미료유전자는 같은 전사 및 해독 조절 부분에 의해 조절되어질 수 있다.

일반적으로, 벡터에는 표제 단백질이 발현되었을 때 발현카세트를 포함하는 그들의 숙주세포중에서 선별할 수 있도록 표지물(makrer)을 포함시킨다. 표지물로서는 생물독 내성, 특히 항생물질 또는 중금속 등에 대한 내성, 기본유기영양을 제공하는 영양요구성 숙주에 대한 상보성 및 바이러스감염에 대한 저항성 등이 포함될 수 있다. 하나 이상의 표지물이 존재할 수 있으며, 특히 하나의 표지물을 구성물에 삽입하여 이용하여서, 특정능력의 소멸로써 발현 카세트의 존재여부를 확인할 수 있다.

전사 개시 부분으로서 사용될 수 있는 것으로 trp, lac, gal, his등의 유전자와 관련된 것,λP_L,λP_R, P₄프로모터와 같은 바이러스 프로모터, 또는 adh-1, adh-2, mat, gal, pgk, pyk, pho5, mA, gapdh, amy, dpfr등의 유전자와 관련된 것들과 같은 효모 프로모터등이 있다. 연결 프로모터 부분에는 tac, adh-2/gapdh, gal/gapdh, cye/gal전자 개시 부분과 같은 것들이 사용될 수 있다. 미합중국 특허 제4,418,149호, 4.304.8363호, 4,363,877호 및 4,366,246호에 예시되어 있다.

전사의 정도를 증가시키기 위해 인핸서(enhancers)와 같은 특별한 시퀸스가 이용되어질 수 있는 바, 다양한 인핸서가 숙주 범위내의 다양한 유전자와 관련된 문헌에 제시되어 있다.

또 다른 특병한 시퀸스로서, 단백질의 분비 및 프로세싱(processing)을 위한 시그널 리더(singal leader)가 있다. 수 많은 시그널 리더들이 많은 문헌에 설명되어 있으며, 광범위한 단백질에 유효하다는 것을 보여 왔다. 그러므로, 하나의 시그널 리더가 효과적이지 않다면, 다른 이용할만한 시그널 리더들을 시험할 수 있다. 시그널 시퀸스의 예로서 미합중국 특허 제 4,336,336호, 4,338,397 및 4,546,082호 등이 있다.

만일 시그널 시퀸스를 함유시킨다면, 시그널 시퀸스를 감미료를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 5'-말단에 연결하여 메티오닌 코돈을 제공하도록 하며, 오픈 리딩 프레임을 메티오닌과 함께 적당한 리딩 단계에 위치하도록 한다. 따라서 전구 단백질은, N-말단으로부터 C-말단으로 진행하면서, 시그널 시퀸스, 프로세싱시그널 및 단백질 감미료를 포함하게 되며, 전구 단백질이 분비될 때 시그널 시퀸스와 프로세싱 시그널은 효소작용으로 제거된다. 많은 프로세싱 시그널이 알려졌는 바, 이들은 숙주와 분비 및 시그널 시퀸스를 제거하는 프로세싱을 위해 사용된 효소작용시스템을 기초로 한다.

본 발명에서는 다양한 숙주가 사용되어질 수 있는 바, 원핵생물과 진핵생물 모두가 가능하다. 일반적인 숙주로서 E.coli, B. Subtilis, B.licheniformis, S.cerevisie, K.lactis, Streptomyces 및 Aspergillis niger 등을 예로 들 수 있으며, 각 속(genera)의 구성원들도 사용될 수 있다. 대부분의 경우, 미생물 발현 숙주로서, 특히 원핵생물이 사용된다.

발현 카세트만을 갖거나 또는 발현카세트를 벡터나 다른 구성물의 일부분으로서는 갖는 발현 숙주를 형질 전환시키기 위해서, 그 숙주의 특성에 따라 다양한 기술이 사용될 수 있다. 발현 카세트의 도입은, 결찰, 형질전환, 형질감염(tranfection), 형질도입(transduction) 및 융합 등에 의해 수행되어질 수 있다. 본래의 숙주세포 또는 원형질체, 특히 재생산된 원형질체 등이 외인성 DNA의 도입을 위해 사용될 수 있다.

일단, 숙주가 형질전환되면, 선택배지에서 배양시켜서 표지물 또는 관련된 발현 카세트를 갖는 그들의 숙주를 선별할 수 있다. 항생물질내성을 이용할 경우, 영양소는 항생물질내성 유전자 부재하에서의 항생물질 세포독성의 수준으로 포함될 수 있다. 영양요구성 상보의 경우, 영양배지는 필요한 대사물질이 부족되게 한다. 생성물이 세포질에 생산되고 존속되면, 세포가 성장하기에 충분한 시간이 지난 후에 세포를 용해시키고 종래의 정제방법에 따라 목적하는 단백질을 얻어낸다. 이러한 정제방법들로는 액체-액체추출, HPLC, 크로마토그라피, 전기영동 등이 있다. 그 다음, 생성물은 겔 제거(gel exclusion), 크로마토그라피 등에 의해 보다 정제되어질 수 있다.

결과된 생성물은 감미료로서 다양한 방법으로 이용되어질 수 있는 바, 통조림 제품이나 탄산음료에 첨가하여 이용되거나 커피 또는 차 등과 같은 다양한 음료수에 첨가하기 위한 분말 또는 액체로서 이용되어질 수 있으며, 요리, 추윙껌, 크림치약, 양치질약, 치아위생제, 약제, 햄이나 소세지 등의 육류제품, 인스턴트스프, 요구르트, 후식, 곡물, 동물먹이 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 목적물인 감미료는 액체 또는 분말로 제조될 수 있다. 액체일 경우 안정제, 완충제, 살균약 또는 프로테아제 억제제 등과 같은 다른 첨가물이 결합될 수 있다. 수용액 매체에는 감미료가 일반적으로 0.1 내지 90중량%의 조성으로 존재하도록 한다. 분말의 경우, 종래의 식품증량물인 다양한 부형제가 첨가되어질 수 있다.

한편, 감미료를 독립적인 생성물로서 제공하기보다는, 발현 카세트를 식물에서 이용할 수 있도록 제조할 수 있다. 특히, 발현 카세트를 식물의 구성적 또는 조절성 전사 개시 부분 기능을 이용하여 제조함으로써, 과일, 야채, 메론 등의 생성물의 단맛을 증가시킬 수 있다. 다양한 구성물이 문헌에 설명되어져 있는 바, 식물에서 구성적 또는 조절성 전사 개시 부분을 이용하는 다양한 유전자의 발현을 논의하고 있다. 전사 개시 부분으로는 옥토파인, 만노파인, 노팔린 등과 같은 다양한 오파인 개시 부분이 있다. 그밖에 카울리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 같은 식물성 바이러스의 전사 개시 부분이 사용될 수도 있다. 다른 전사 개시 부분, 특히 유도가능한 부분, 보다 특별하게는 세포 분화와 관련된 부분으로는 리불로스-1,3-바이포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유니트 또는 큰 서브유니트 전사 개시 부분, 과일 특이성 프로모터, 열 쇼크 프로모터 등이 포함된다.

다음의 실시예는 실례를 제시한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

[실시예 1]

1. 올리고뉴클레오티드의 합성과 정제

다음의 올리고머를 Applied Biosystems 380B DNA합성기를 이용하여 합성하였다.

상기 올리고머들을 요소-폴리아크릴아미드, 겔 전기영동으로 분리시키고 Seppak C18 칼럼(Whatman)을 통과시켜 정제하였다.

모넬린 서브유니트 및 연결체에 해당하는 유전자에 의해 코드화되어 진 아미노산 시퀸스와 결찰전략은 다음과 같다.

＜결찰 전략＞

2. 올리고머의 어닐링과 결찰 및 융합된 모넬린 유전자의 분리 각 올리고머들을 37℃에서 45분 동안 30μl의 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM ATP, 5units의 T4폴리뉴클레오티드 키나아제를 함유하는 반응혼합물 중에서 인산화시켰다. 각 반응혼합물들을 한데 모아서, 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, Speed-Vac하에서 건조시켰다. 건조된 펠렛을 5㎕의 증류수에 용해시키고, 7μl의 결찰 완충용액(0.2M Tris-HCl, pH 7.5, 0.1M MgCl₂0.1M DTT)을 첨가하였다.

상기 용액을 95℃의 수조에 두고 밤새도록 실온으로 천천히 식혔다. 상기 혼합물에 7μl의 10mM ATP, 40units의 T4 DNA 리가아제(NEW England Biolabs, Inc.) 및 2μl의 물을 첨가하였다.

상기 반응 혼합물을 실온에서 10분간 놓아둔 후, 페놀/클로로포름으로 추출하고, 침전시키고, 건조시킨 후, 85μl의 물에 재용해시켰다. 결찰된 올리고머 혼합물을 제한효소 Nde I와 Sal I (New England Biolabs, Inc.)로 처리하였다. 293염기쌍 단편을 7% 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동시켜서 분리시키고 밴드를 전기용출시킨 후, Elutip-D 칼럼 (S ＆ S Co.)을 이용하여 정제시켰다.

3. 분자클로닝

융합된 합성 모넬린 유전자를 클로닝하기 위해 M13mp19RF를 이용하였다. 우선, M13mpRF를 Xbal/Sal I (New England Biolabs, Inc.)로 절단하였다. 큰 단편을 분리하여, 상기의 방법으로 정제하였다. 다음과 같은 합성 Xba I/Nde I 어댑터를 합성하고,

어댑터를 상기에서 설명한 바와 같이 정제시켰다. Nde I/Sal I로 절단되고, 어닐링되고 융합된 합성 모넬린 단편을 10μl의 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂10mM DTT, 200units의 T4 DNA 리가아제 (N. E. Biolabs, Inc.)중에서 Xba I/Sal I-처리된 M13mp19 MON-1RF 및 Xba I / Nde I 어댑터와 함께 조합하고, 4℃에서 밤새도록 방치하여서, M13mp19 MON-1RF를 얻었다. 형질전환은 5μl의 결찰 혼합물을 200μl의 E.coli JM101 적합 세포에 첨가하여 수행되었으며 (Messing, J. Methods in Enzymology(1993) 101:20-78), 디데옥시 DNA 시퀸싱 및 M13mp19MON-1RF의 제조는 Messing, J.(1983)Methods in Enzymology 및 Sanger, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA(1985) 74 : 5463-5467에 설명되어진 바에 따라 실시하였다.

4. 발현 벡터의 구성

합성 융합 모넬린 DNA(293bp)를 M13mp19 MON- 1RF로부터 분리하여 정제시켰다. trp O, P(Pharmacia, Inc. : Cat. #27-4930-01)을 포함하는 벡터 pDR720을 Sma I / PvuII로 절단하고, 둔단 결찰 (blunt-end ligation)시켜서 ptrp322를 제조하였다. ptrp322를 Hpa I/Sal I 으로 절단하고 2.5kbp의 큰 단편을 분리해냈다. 다음과 같은 합성 Hpa I/Nde I 어댑터를 Applied Biosystems 380B DNA 합성기를 이용하여 합성하였다.

상기의 합성 융합 모넬린(293bp)과 Hpa I/Sal I - 처리된 ptrp322벡터 및 Hpa I/Nde I 합성 어뎁터를 10μl의 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 200units의 T4 DNA리가아제(N.E.Biolabs, Inc.)존재하에 14℃에서 밤새도록 결찰반응시켜서, ptrp322H MON-1을 얻었다. 이러한 플라스미드로 E. coli W3110(ATCC 27325)를 형질전환시키는 것과 재조합된 클론의 선별은 상기와 같이 실시하였다.

5. 합성 융합 모넬린 유전자 발현의 확인

유전자 발현 연구를 위하여, W3110에 삽입되어져 있는 ptrp322H MON-1 50μl를 루리아 브로드(Luria Broth)로 밤새도록 배양하여서, 0.4% 카사미노산과 10μg/ml 비타민 B₁ 및 40μg/ml 암피실린을 함유하는 M9 내지 5ml에 접종시키고, 온도가 조절되는 진탕 보온기(a temperature controlled- shaking incubator)안에서 37℃에서 0D₆₅₀cm값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그 다음, 0.1mg의 인돌아크릴산을 상기 반응 혼합물에 50μg/ml의 농도가 되도록 첨가하고, 상기 혼합물을 약 8시간동안 더 방치한다. 배양된 세포를 Beckman J6원심분리기에서 2500rpm으로 5분간 펠렛화시켰다. 라엠리(Laemmli)단백질 시료 완충용액을 세포펠렛에 첨가하여 95℃에서 5분 동안 가열한 후, DNA를 15% 라엠리 SDS-폴리아크릴아미드겔로 300V에서 2.5시간 동안 전기영동시켰다(Laemmli, Nature(1970)227 : 680-685). 겔을 코오마시 블루 브릴리안트 염료(Coomassie blue brilliant dye)로 염색하여서 생성물이 정확한 분자량을 갖는지를 확인하였다. 발현된 생성물을 분리하여 단맛을 갖는지를 확인하였다.

상기 순서에 따라 수정된 DNA 시퀸스가 제조되어지는 바, 연결부위의 아미노산들은 다양할 수 있다. 다음의 시퀸스들은 서브유니트 II 이소루이신(아미노산 46) (Bohak and Lee, supra, 번호붙이기)을 서브유니트 II의 글리신 (아미노산 6)에 연결하는 시퀸스를 지정한다.

사용된 코돈은 3개에서 지정한 코돈을 제외하고는, MON-1 구성물에서 지정한 것과 같은 것인바, S.cerevisiae 해당효소(glycolytic enzymes)에 의해 발탁된 코돈이 사용되었다. 그러한 시퀸스는 AAG,ACT,AGA이다.

상기의 결과로부터, 모넬린 시퀸스를 기초로한 신규한 단백질 감미료가 다양한 방법을 이용하여 안정한 단일-사슬 단백질로 생산되어질 수 있다는 사실이 증명되어졌다. 생성물을, 천연 원료로서 분리해내지 않고, 미생물 숙주를 이용하여 효과적이고도 경제적으로 제조할 수 있어서, 안정하며 한결같은 공급이 가능한 감미료를 얻을 수 있게 되었다. 또한, 단맛을 내는 특성에는 영향을 미치지 않고도 아미노산의 구조에 변화를 줄 수 있어서, 화학적 물리적 안정성, 저장기간, 성형 및 정제의 용이, 단맛의 증가 등 다른 편의를 제공할 수 있다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물과 특허출원물은 본 발명이 속한 분야에서 숙련된 자들의 기술수준의 것이다. 모든 간행물과 특허출원물은 개개의 간행물과 특허출원물이 참고로 반영되도록 특별하게 개별적으로 지정된 것처럼, 여기에 같은 범위에서 참고로 반영되어졌다.

상기의 발명이, 명확한 이해를 목적으로 실례와 실시예의 방식으로 상세하게 설명되어졌을지라도, 첨부된 청구 범위 안에서 어떠한 변화와 수정이 가능하다는 것은 명백할 것이다.

Claims

하나의 펩타이드 링키지를 통해 함께 공유결합된 모넬린의 서브유니트들의 아미노산 시퀸스와 적어도 80%이상의 상동성을 갖는 아미노산 시퀸스로 이루어진 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 시퀸스.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 N-말단으로 서브유니트 II를 갖고 C-말단으로 서브유니트 I을 갖는 것임을 특징으로 하는 DNA 시퀸스.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 시퀸스에 존재하는 모넬린 야생형 시퀸스 Ile(46)과 Gly(6)사이의 중재 시퀸스는 총 10개 이하의 아미노산으로 구성되며 치환, 삭제 또는 삽입에 의해 수정된 것임을 특징으로 하는 DNA 시퀸스.
제3항에 있어서, 상기 중재 시퀸스는 다음의 구조식으로 표시되는 시퀸스임을 특징으로 하는 DNA 시퀸스.

aa_x ¹-aa_x ²-aa_x ³-aa_x ⁴-aa_x ⁵-aa_x ⁶-aa_x ⁷-aa_x ⁸

여기서, aa¹은 Y 또는 E이고,

aa²는 D,E,Y 또는 K이며,

aa³은 N,T,A 또는 Y이며,

aa⁴는 R,S,K 또는 E이며,

aa⁵는 E,D,R 또는 T이며,

aa⁶은 K,D,E 또는 R이며,

aa⁷은 G,I 또는 L이며,

aa⁸은 K 또는 R이다.

X는 0 또는 1DLAUM 적어도 하나의 x는 1이다.
제4항에 있어서, 상기 중재 시퀸스는 Y-E-N-E-R-E-I-K, Y-E-N-R-E-D-I-K, Y-K-T-R-E-D-I-K, Y-E-R-E-I-K, Y-E-N-I-K, Y-E-I-K, Y-Y-A-S-D-K-L-K, Y-A-S-D-K, Y-A-S-D-K, Y-S-D-K, E-D-Y-K-T-R-G-R 또는 E-D-Y-T-R임을 특징으로 하는 DNA 시퀸스.
전사 방향에 따라, 전사 및 해독 개시 조절 부분과, 제1항 내지 5항에 일치하는 DNA 시퀸스로서 그의 5'-말단에 메티오닌을 갖는 DNA 시퀸스 및, 전사 및 해독 조절 종료 부분으로 이루어져 있으며, 상기조절 부분이 미생물숙주에서 기능을 갖는 발현 카세트.
전사 방향에 따라 전사 및 해독 개시 조절부분과 제1항 내지 5항에 따른 DNA 시퀸스로서 그의 5'-말단에 메티오닌을 갖는 DNA 시퀸스 및 전사 및 해독 종료 조절부분으로서 이루어져 있으며 상기 조절부분이 미생물 숙주에서 기능을 갖는 발현 카세트를 함유하는 미생물 숙주.
모넬린의 2개의 서브유니트와 80%이상의 상동성을 갖는 단백질 감미료를 제조하는데 있어서, 전사방향에 따라 전사 및 해독 개시조절부분과 제1항 내지 5항에 일치하는 DNA 시퀸스로서 그의 5'-말단에 메티오닌을 갖는 DNA 시퀸스 및 전사 및 해독 종료부분으로 이루어져 있으며 상기 조절부분이 미생물 숙주에서 기능하는 발현 카세트를 함유하는 미생물숙주를 영양소중에서 배양함으로써 상기 DNA 시퀸스를 발현 시켜서 단일 사슬로 이루어진 단백질 감미료를 제조한 후, 그로부터 상기 단백질 감미료를 분리해내는 것을 특징으로 단백질 감미료의 제조방법.