KR910005631B1 - Bu-3420t 항종양 항생제 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

BU-3420T 항종양 항생제
제1도는 BU-3420T의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도면임(KBr중).
제2도는 DMSO-d6중의 트리아세틸 BU-3420T의 양성자 자기공명 스팩트럼(400MHz)을 나타낸 도면임.
본 발명은 BU-3420T로 표시하는 신규의 항종양 화합물 및 그의 트리아세테이트 유도체에 관한 것이다. 이 두가지 화합물 모두 항세균, 항진균 및 항종양 활성을 갖는다.
BU-3420T의 구조를 살펴보면 결합된(conjugated) di-yne 부분이 포함되어 있는 것으로 나타난다. 이 평범하지 않은 관능가는 최근 각각 Actinomadura 균주(미합중국 특허 제4,675,187호 참고) 및 Micromonospora 균주(항미생물 제제 및 화학요법에 관한 제26차 인터사이언스 회의 프로그램 및 초록, 1986년 9월. 초록 제227호 참고)가 생산하는 극히 강력한 항종양 항생제인 에스페라미신류(J. Am, Chem. Soc. 109 3462-3464, 1987) 및 칼리케미신류 (J. Am. Chem. Soc. 109 3466-3468, 1987)에서 발견되었다.
에스페라미신 A1과A2는 각각 미합중국 특허 제4,530,835호에 기재된 CL-1577A 및 B와 동일한 것으로 믿어진다. 이 에스페라미신은 또한 미합중국 특허 제4,578,271호에 기재된 항생제인 WS-6049A 및 B와도 구조적으로 연관되어 있다. CL-1577-B4로 표시되는 CL-1577A 또는 B의 단편은 미합중국 특허 제4,661,353호에 기재되어 있으며 BBM-1675C 및 D로 표시되는 에스페라미신 A1또는 A2의 단편은 영국출원 공개 제2,179,649A호에 기재되어 있다.
본 발명은 진균 및 그램-양성, 그램-음성 및 혐기성세균에 대해 광범위한 활성을 나타내는 항생제 BU-3420T 및 그의 트리-O-아세틸 유도체를 제공한다. 또한, 이 화합물들은 생체외 및 생체내에서도 항종양 활성을 나타낸다.
BU-3420T는 실질적인 양이 얻어질 때까지 침수성 호기적 조건하에서 자화성 탄소원 및 질소원을 함유하는 수성 영양배지에서 BU-3420T를 생산하는 균주인 Micromonospora chersina를 배양한다음 상기 배양 배지로부터 BU-3420T를 회수함으로써 얻는다. BU-3420T의 트리아세테이트 유도체는 무수아세트산을 이용하는 등에 의해서와 같이 BU-3420T를 아세틸화시켜 제조할 수 있다.
또다른 측면에서는 포유류 숙주에 있어서 세균성, 진균성 또는 암종감염을 치료하는데 유용한, 세균억제, 진균억제 또는 종양억제 유효량의 BU-3420T나 또는 그의 트리아세테이트 유도체 및 약리학적으로 유효한 담체를 포함하는 약리적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 측면에서는 동물 숙주에게 항진균 또는 항세균 유효량의 BU-3420T나 또는 그의 트리아세테이트 유도체, 또는 그의 약리적 조성물을 투여함에 의한 상기 숙주에 있어서의 세균 또는 진균감염의 치료방법이 제공된다.
마지막으로, 본 발명은 동물 숙주에게 종양 억제량의 BU-3420T나 또는 그의 트리아세테이트 유도체, 또는 그의 약리적 조성물을 투여함으로써 상기 숙주에 있어서의 종양 발육을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 BU-3420T 항생제는 BU-3420T-생산 균주인 Micromonospora chersina의 발효에 의해 생산된다. 바람직한 생산미생물은 Micromonospora chersina의 발효에 의해 생산된다. 바람직한 생산미생물은 Micromonospora chersina의 새로운 균주로서 본 명세서에서는 Micromonospora chersina 균주 M956-1이라 표시한다. 이 균주는 인도의 Gujarat주에서 채취한 토양 시료로부터 분리되었다. M956-1균주의 생물학적으로 순수한 배양체를 워싱턴 디.씨.에 소재하는 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁하고 기탁번호 ATCC 53710를 부여 받았다. M956-1 균주의 주요특성에 기초해서, 이 균주는 Micromonospora 속으로 분류되었으며, 관련된 종류와 M956-1 균주를 비교 연구한 결과 이 균주는 이속의 새로운 종으로 분류되어야 하는 것으로 나타났다.
균주 M956-1은 다음의 특성을 갖는다.
[형태]
균주 M956-1은 길고, 가지가 여럿 달려 있으며 단편화되지 않는 영양 균사체(폭 0.5μm)를 형성한다. 기균사체는 형성되지 않으나, 흔적 기균사는 종종 어떤 배치에서 관찰된다. 영양 균사에서 하나의 포자가 생성된다. 스캐닝 전자 마이크로그래프는 이 포자가 줄기가 없이 구형의(1,2-1.8μm) 모양을 하며 짧거나 긴 단축성 담포자체 상에서 생성되어 균주집락으로 발달함을 보여준다. 담포자체 끝부분에 단일 포자의 측생짝 또는 트리플릿도 관찰된다. 포자 표면에는 짧고 뭉뚝한 돌기가 나있다.
[배양 특성]
균주 M956-1의 생육은 ISP 배지 제2호, 제4호 및 Bennett'아가에서는 보통이었고, Czapek' 수크로스-질산염아가, ISP 배지 제5호 및 제7호를 포함하는 많은 배지에서는 부진하였다. 영양 균사의 색깔은 무색에서 엷은 오렌지빛 황색에 이른다음, 포자 형성 후에는 엷은 올리브 회색 또는 검은색으로 변했다. 두꺼운 포자 집단이 ISP 배지 제2호와 Benett' 아가상에 형성되었다.
멜라닌 색소 및 기타 진단성 염료는 생산되지 않는다. 형광성 황색 확산성 염료가 28℃에서 1개월후 Czapek' 수크로스-질산염 아가 및 ISP 배지 제4호에서 생산되었다. 균주 M956-1의 배양 특성을 다음의 표1에 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00001
28℃에서 3주일간 배양시키면서 관찰.
괄호안의 숫자 및 색깔은 ISC-NBC 표기를 따름.
* 약자 : G : 생육, WM : 영양 균사의 색깔, SL : 포자형성, DP : 확산성 염료.
[생리학적인 특징]
생육 온도는 18℃에서 49℃ 범위이다. 15℃ 및 50℃에서는 생육이 관찰되지 않는다. 최적 생육은 37℃와 44℃사이에서 관찰된다. 젤라틴은 액화시키고 전분은 가수분해시킨다. NaCl 내성은 3% NaCl에서는 관찰되나 4% NaCl에서는 관찰되지 않는다. 티로신 활성은 음성이다.
Pridham-Gottlieb' 무기 배지중의 진단적인 당의 이용은 다음과 같다 : L-아라비노스, D-크실로스, 수크로스, 멜리바이오스, 라피노스 및 가요성 전분은 이용하고, 글리세롤, D-아라비노스, D-리보오스, L-람노오스, 셀룰로스, 이노시톨 및 D-만니톨은 이용하지 못하며, 락토오스와 살리신은 경계 이용한다. 상기 무기 배지에서의 결과와는 달리, Luedemann'이다. 유기 배지에서는 라피노스가 이용되지 않는다. α-갈락토시다제의 활성은 양성적이며 β-크실로시다제 및 α-만노시다제의 활성은 음성적이다. M956-1균주의 생리적 특징을 다음 표2에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00002
* Czapek' 수크로스-질산염 브로쓰에서는 양성적이고 펩톤-질산염 브로쓰에서는 음성적임
** 기초배지 : PG : Pridham-Gottlieb'무기배지(ISP 배지 제9호), 및 Ld : Ludemann' 효모 추출 CaCO3배지
[세포 화학]
균주M956-1의 정제된 세포벽은 meso-디아미노피멜산과 글리신은 함유하나 3-히드록시디아미노피멜산은 함유하지 않는다. 전세포 가수분해 생성물 및 정제된 세포벽은 용이하게 검색할 수 있는 양의 글루코스와 만노오스, 그리고 흔적량의 크실로스와 아라비노스를 함유한다. 따라서, 이 균주는 타잎 Ⅱ세포벽 및 패턴 D 전세포 당에 속한다.
존재하는 인지질은 포스파티딜-글리세롤, 포스파티딜-이노시톨 및 포스파티딜-에탄올아민류이고 따라서 그 타잎은 P-Ⅱ이다. 질량 스펙트럼은 주요한 메나퀴노스가 MK-9(H4)와 MK10(H4)임을 나타낸다. 글리콜레이트테스트는 양성이고 : 따라서 이 균주는 팹티도글리칸내에 글리콜릴-뮤라민산을 갖는다.
[분리학적 위치]
Luedemann(Luedemann, G.M. Genus Micromonospora Orskov 1923, p. 846-855. R.E. Buchanan 및 N.E. Gibbons(편집), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 제8판, 1974. The Williams and Wilkins Company, 볼티모어) 및 Kawamoto등, Kaqamoto, I., T. Oka 및 T. Nara : Cell wall composition of Micromonospora olivoasterospora, Micromonospora sagamiensis and related organisms. J. Bacteriol. 146 : 527-534, 1981 : Kawamoto, I., T. Oka 및 T. Nara : Carbon and nitrogen utilization by Micromonospora strains. Agric. Biol. Chem. 47 : 203-215, 1983)에 따르면, 균주 M-956-1의 다음 특성은 Micromonospora의 분류학에 특징적인 것이다.
1) 짧고 뭉뚝한 돌기가 달린 포자, 2) 세포벽중 3-히드록시 이성체 없이 meso-디아미노피멜린산, 3) 세포벽중 대량의 글루코스 및 만노오스와 흔적량의 크실로스 및 아라비노스, 4) 무색, 엷은 황색에서 밝은 황색빛 오렌지색의 영양 균사 그러나 특징적인 염료는 없음, 5) 당 이용성, 멜리바이오스와 라피노스는 이용, 그러나 D-만니톨, L-람노오스, D-아라비노스 및 D-리보오스는 이용하지 않음, 6) 글리코시다제의 활성, α-갈라토시다제에서는 양성적이고 β-크실로시다제와 α-만노시다제는 음성적임.
균주 M-956-1과 23종의 Micromonospora의 분화적 특성을 표 3에 나타내었다. 포자형성후의 흑색화에 덧붙여, 대부분의 Micromonospora종은 각 균주에 다양한 색소체를 구성하는 세포내 또는 세포외의 특이한 염료에 의해 특징화된다. 그러나, M956-1 균주, M. globosa, M. inositola, M. aurantiaca, 및 M. echinospora subsp. pallida는 단지 밝은 황색빛 오렌지색의 영양 균사를 형성하므로 비-색소형이다. 표4에 나타낸 바와 같이, 상기 4종은 균주 M956-1과는 구별되는 현저한 차이점을 갖는다.
M. chalcea와 균주 M956-1은 모두 집락내의 단축성 담포자체, 특징적 염료의 결여, 형광성 황색 염료의 생성, 당 이용성 측면 및 세포벽 조성등의 공통 특성을 갖는다. M. chalcea는 훨씬 작은 돌기가 달린 포자, 적색빛 오렌지색에서 적자색의 영양 균사의 형성, Luedemann'배지에서 라피노스의 이용성, 셀룰로스의 분해 및 45℃에서의 생육 불능성등에 있어 본 발명의 균주로부터 분화된 것인 듯하다.
따라서, 균주 M956-1은 Micromonospora의 새로운 종으로 분류되어야 할 것으로 여겨지며, Micromonospora chersina sp. nov.로 표시될 것으로 제안된다(chersina, Gr. f. adj. khersinos : ＂living in dry land＂이 미생물이 살고 있는 사반나 식물식생을 지칭)
[표 3]
Figure kpo00003
[표 4]
Figure kpo00004
본 발명은 상술한 특정의 바람직한 균주 M956-1나 또는 상기 설명에 전적으로 부합하는 미생물들을 사용하는 것에 국한되지 않음을 이해하여야 한다. 특히 X선 조사, 자외선 조사, 니트로겐 머스타드, 파지노출 등과 같은 통상적인 수단에 의해 제조할 수 있는 다른 BU-3420T-생산 변종 변이균주를 포함하도록 의도된다.
[BU-3420T의 제조]
BU-3420T는 수성 영양배지에서 침수성 호기적 조건하에서 Micromonospora chersina sp. nov.의 BU-3420T-생산균주, 바람직하게는 Micromonospora chersina 균주 M956-1(ATCC 53710) 또는 그의 변종이나 변이주의 특성을 갖는 균주를 배양함으로써 생산한다. 생산 미생물을 자와성 탄소원, 예컨대 L-아라비노스, D-크실로스, 수크로스, 멜리바이오스, 라피노스 또는 가용성 전분등이 함유된 영양배지에서 생육시킨다. 이 영향배지에는 어분, 팹톤, 대두분, 땅콩분, 면실분 또는 코온 스팁리쿼같은 자화성 질소원도 함유되어야 한다. 영양 무기염도 배지중에 포함될 수 있다. 이러한 염류로는 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 클로라이드, 브로마이드, 질산염, 탄산염 또는 기타 이온을 제공할 수 있는 보통의 염을 들 수 있다.
BU-3420T의 생산은 예컨대 18℃-49℃와 같이 이 미생물의 생육이 만족할만한 온도이면 어느 온도에서든 유효하며, 대체로 약 28℃의 온도에서 수행된다.
발효는 플라스크나 또는 여러 용량의 실험실 또는 산업규모의 발효조에서 수행할 수 있다. 탱크 발효를 이용할 경우, 미생물의 사면, 또는 토양 배양체 또는 동결건조 배양체와 함께 배양배지 소량을 접중함으로써 영향 브로쓰에 증식(vegetative) 접종물을 생성시키는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 활성 접종물을 얻은 후, 대규모 BU-3420T 생산을 위해 이를 발효 탱크 배지의 무균적으로 옮긴다. 증식 접종물이 그안에서 생산되는 배지는 생산 미생물이 양호하게 생육되는한 탱크내에서 사용되는 것과 같거나 다를 수 있다.
일반적으로, BU-3420T의 최적 생산은 약 3-4일간의 정치기간후에 이루어진다. 항생물질 생산은 시험 미생물로서 Bacillus subtilis를 이용하여 페이퍼 디스크-한천 확산 분석법에 의해 모니터할 수 있다.(pH8.0)
[분리 및 정제]
BU-3420T는 예컨대, 용매 추출 및 크로마토그래피와 같은 종래의 분리 및 정제 공정에 의해 발효 브로쓰로부터 분리시킬 수 있다. 다음의 실시예5는 실제로 순수한 형태로 BU-3420T를 얻기 위한 바람직한 분리 및 정제방법을 설명한다.
실시예3은 BU-3420T의 트리아세틸 유도체의 제조를 설명한다. 이 유도체는 불활성 유기용매중에서 BU-3420T를 무수아세트산과 같은 아세틸화제와 반응시켜 얻을 수 있다.
[BU-3420T 및 BU-3420T 트리아세테이트의 생리적 특성]
BU-3420T는 청색의 무정형 고체로서 얻어지고, 그의 트리아세테이트는 오렌지색 침상으로 나타난다. BU-3420T는 디메틸 술폭시드, 디메틸포름아미드 및 디옥산에 용해되고, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올 및 에탄올에는 약간만 용해되며, 물과 n-헥산에는 불용성이다. 이 아세테이트는 클로로포름, 메탄올 및 에탄올과 같은 유기용매에서는 훨씬 향상된 용해성을 나타낸다. BU-3420T와 아세테이트의 분자구조는 마이크로분석, 질량스펙트럼 및 아세테이트의13C-NMR 데이터, BU-3420T 및 아세테이트의 대조 스팩트럼 분석에 기초하여 각각 C30H19NO9와 C36H25NO12로 확립되었다. 이 두 화합물의 물리-화학적 자료를 표5에 요약하였다. BU-3420T의 IR 스펙트럼(제1도)는 3420, 3350, 2930, 1660, 1630, 1587, 1480, 1385, 1300, 1280, 1180 및 785cm-1에서 흡수밴드를 갖는다. 1630cm-1에서의 카르보닐 흡수는 분자내에 퀴논기가 있음을 암시한다. 아세테이트의 IR 스팩트럼은 BU-3420T의 흡수밴드에 덧붙여 1770cm-1에서 강한 카르보닐 흡수를 나타내며, 이는 에놀(페놀)아세테이트의 생성을 가리키는 것이다. BU-3420T의1H-NMR은 1개의 메틸(δ : 25ppm), 3개의 아세틸 메틸 92.34, 2.36 및 2.44ppm), 1개의 OCH3(3.79ppm), 3개의 메틴(3.55, 4.78 및 5.04ppm), 2개의 올레핀 양성자(6.05 및 6.07ppm) 및 3개의 방향성 양성자(7.62×2 및 8.03ppm)를 나타낸다. δ : 9.41과 12.37ppm에서의 2개의 다른 양성자는 D2O 첨가와 함께 소실된다. BU-3420T의 스팩트럼은 아세테이트의 것과 비슷하나, 후자의 것에서 관찰되는 3개의 아세틸 메틸 시그날은 결여되어 있다.13C-NMR에서,BU-3420T아세테이트는 4개의 메틸(δ : 18-21ppm), 3개의 메틴(31-43ppm), 1개의 OCH3(57.7ppm), 6개의 콰터너리(63-99ppm), 16개의 sp2(114-153ppm) 및 6개의 카르보닐 탄소(167-183ppm)를 포함하여 36개의 탄소 시그날을 나타낸다.
[표 5]
Figure kpo00005
[표 6]
Figure kpo00006
Figure kpo00007
[구조결정]
BU-3420T는 중성 용액중에서 240,287,395,568 및 597nm에서 최대 UV 흡수도를 나타낸다. 알칼리성 용액에서의 흡수도 및 그의 전이는 δ-로도마이시논과 유사하다(J. Antibiotics 33 : 1331-1340, 1980 : J. Antibiotics 33 : 1341-1347, 1980참조). BU-3420T를 아세틸화하면 트리-O-아세틸 유도체가 생성되며 이것은 244,313 및 482nm에서 UV흡수를 나타낸다. 그의 IR 스펙트럼은 에놀-아세테이트를 가리키며1H-NMR은 BU-3420T이 3개의 방향족 양성자(δ : 7.32, 2H 및 7.42ppm)가 아세틸화에 의해 다운-필드(down-field)전이 함을 보여준다(7.62, 2H 및 8.03ppm).13C-NMR은 2개의 퀴논 카르보닐 탄소(180.6 및 182.7ppm)가 존재함을 암시한다. 이들 스펙트럼 자료의 분석은 항생물질 아세테이트에 대한 다음의 1,4,6-트리아세톡시-8,9-치환 안트라퀴논구조(부분구조 A)를 타나내준다. 따라서, 이 분자의 나머지 부분은1H- 및13C-NMR자료에 기초해서 1개의 C-CH3, 1개의 OCH3, 3개의 -CH, 2개의 -CH=, 2개의 C=, 6개의 4급 탄소 및 1개의 카르보닐기를 가짐에 틀림이 없다. 6개의 4급 탄소들중, 4개의 탄소는 δ : 88.8, 89.6, 97.3 및 99.4ppm에서 나타나며 이는 결합된 di-yne 구조를 강력히 암시하는 것이다. 이 부분에 대한 부가적인 증거는 부분 구조(B)를 나타내는1H-13C 긴 범위의 상관 실험(COLOC)에 의해 제공되었다. 이 흔하지 않은 관능가는 각각 Actinomadura 균주(미합중국 특허 4,675,187호)와 Micromonospora 균주 (Program and Abstracts of 26th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy : 1986년 9월, 초록 제227호)가 생산하는 에스페라미신(J. Am. Chem. Soc. 109 : 3462-3464, 1987)과 칼리케미신(J. Am. Chem. Soc. 109 : 3466-3468, 1987)에서 최근발견되었다. 여러 가지 NMR실험을 고려해볼 때 상기에서 지적된 구조(A 및 B)에 덧붙여 다음의 구조들이 유도되었다.
Figure kpo00008
트리아세틸-BU-3420T의 완전한 구조는 X-선 크리스탈로그래피에 의해 설명되었다. 결과적으로, BU-3420T의 구조는 다음과 같이 결정되었다. 지정된 구조는 이 항생물질 및 그의 트리아세테이트의 경우 얻어진 모든 스펙트럼 데이터(표6)과 일치하는 것이다.
Figure kpo00009
BU-3420T 및 그의 트리아세테이트 유도체의 생물 활성생체외 항세균 및 항진균 활성
BU-3420T 및 그의 아세테이트의 최소 억제농도(MICs)를 연속 한천 희석법으로 측정하였다. 영양 한천(Eiken)과 GAM 한천 배지(Nissui)를 각각 호기성 및 혐기성 세균에 사용하였다. 표7은 카나마이신 A 및 클린다마이신과 비교한 BU-3420T의 생체의 항세균 활성을 나타낸다. 그램-양성 호기성 세균에 대해, BU-3420T와 그의 아세테이트는 매우 강력한 활성을 나타낸 반면, 그램-음성 세균은 감수성이 민감하지 않았다. 또한, 이 두가지 모든 화합물은 혐기성 그램-양성 및 음성 세균에 대해 클린다마이신보다 훨씬 더 활성적이었다. 어떠한 카나마이신- 및 클린다마이신-내성 세균은 이 두화합물 모두에 감수성을 나타내었다. 전체적으로, BU-3420T 아세테이트는 호기성 및 혐기성 세균에 대해 BU-3420T보다 2 내지 8배 더 강력하였다.
BU-3420T 및 그의 아세테이트의 생체외 항진균 활성은 Sabouraud 댁스트로스 한천에서도 결정하였다. 표8에 나타난 바와같이, BU-3420T 아세테이트는 암포테리신 B에 더 민감한 Cryptococcus neoformans를 제외하고는 시험된 모든 균주에 대해 암포테리신 B보다 현저하게 더 활성적이었다. 이들의 항세균 활성과 유사하게, BU-3420T 아세테이트는 BU-3420T보다 생체외 항진균 활성에 있어 4 내지 64배나 더 강력하였다.
[생체내 활성 및 급성 독성]
BU-3420T의 생체내 효능을 Staphylococcus aureus Smith로 실험적으로 감염시킨 마우스에서 평가하였다. 마우스에게 돼지의 위장 뮤신의 5% 현탁액(American Laboratory 오마하, 네브라스카)중의 병원체를 치사량의 100배로하여 복강내로 주입하였다. BU-3420T는 세균을 주입하기 직전에 마우스에게 근육투여하였다. 평균 감염방지 투여량(protective dose : PD50)을 결정하기 위해 마우스를 관찰하였다. 표9에 나타난 바와같이, BU-3420T는 생체내 효능은 양호하였고 그의 PD50은 0.13mg/kg인 것으로 밝혀졌다. BU-3420T는 마우스에게 5mg/kg의 근육내 투여후 어떠한 독성도 나타내지 않았다.
[표 7]
Figure kpo00010
[표 8]
Figure kpo00011
[표 9]
Figure kpo00012
[BU-3420T의 항종양 활성]
BU-3420T와 그의 아세테이트 유도체를 몇가지 쥐 및 사람의 종양세포주에 대한 생체외 세포독성 및 종양-산생마우스에 있어서의 생체내 항종양 활성에 대해 시험하였다. 생체외 및 생체내 실험 모두에서 미토마이신 C를 대조화합물로 사용하였다. B16-F10(쥐의 흑색종), P388(쥐의 백혈병), P388/VCR(빈크리스틴-내성 P388) 및 모저(Moser : 인체 결장-직장암종) 세포를 송아지 태아 혈청(FCS, 10%) 및 카나마이신(60mcg/ml)이 보강된 강화 Eagle최소 필수배지(MEM)에 대수기까지 배양시키고, HCT-116(인체 결장암종)세포를 FCS(10%), 페니실린(100μ/ml) 및 스트렙토마이신(100mcg/ml)이 보강된 Naccoy' 5A 배지에서 배양시킨다음, 수확하여 각각 1.5×105, 1.2×104, 2.5×105및 3.0×105세포/ml의 농도의 시험물질과 함께 96- 또는 24- 웰조직 배양판의 웰에 접종하였다. 이들은 5% CO2및 95% 공기의 습한 대기중에서 37℃로 하여 72시간 동안 정지시켰다. B16-F10, 모저 및 HCT-116세포에 대한 세포독성 활성은 생존 세포를 0.006% 중성 레드용액으로 염색시킨후 540nm에서 색깔에 의해 측정하였다. 다른 한편, P388 및 P388/VCR세포에 대한 세포독성 활성은 생존 세포의 수를 세어 측정하였다. 결과는 표 10에 요약하였다. BU-3420T는 시험한 쥐 및 사람의 종양세포주 모두에 대해 강력한 세포독성을 나타내었다. 비록 사람의 종양세포주, 모저 및 HCT-116세포는 쥐의 종양세포주, B16-F10보다 미토마이신 C에 약간 더 내성을 갖는 것으로 나타났지만, 이들은 역으로 BU-3420T에 대하여는 6-12배 더 민감하였다. 게다가, BU-3420T는 VCR-민감세포 및 내성 P388세포 모두에 대해 동일한 세포독성을 나타내었다. BU-3420T의 아세테이트 유도체의 세포독성은 특히 모저 세포에 대해 모화합물 보다 훨씬 더 강력하였다.
거대분자(DNA, RNA 및 단백질)합성에 미치는 BU-3420T의 억제 효과는 생체외에서 측정하였다. 배양된 L1210 세포(5×105세포/ml)를 BU-3420T와 함께 37℃에서 15분간 예비-정지시켰다. 이 배양혼합물에 동위원소로 표지시킨 전구체,3H-티미딘,14C-우리딘 또는3H-류신을 첨가하여 추가로 60분간 정지시켰다. 차가운 5% 트리클로로아세트산으로 세척한 후, 종양세포의 산-불용성 분획에 인코포레이트된 방사능을 액체 섬광계수기로 측정하였다. 표11에 나타난 바와같이, BU-3420T는 DNA 합성을 RNA와 단백질 생합성보다 각각 500배와 100배나 더 저해하였다.
BU-3420T 및 그의 아세테이트 유도체의 생체내 항종양 활성을 종양-산생 CDF1이나 BDF1마우스를 이용하여 측정하였다. 암컷의 CDF1마우스에게 0.5ml의 10% 멜라노성 흑색종 B16브레이를 복강내로 접종하였다. 시험화합물을 다음의 처리계획에 따라 마우스에게 복강내로 투여하였다 : 제1일, 2일 및 3일에 1일1회(QD×3), 제1회, 5일 및 9일에 1일1회(Q4D×3), 제1일에서 9일까지 1일 1회(QD×9). 표12에 나타난 바와같이, BU-3420T와 그의 아세테이트 유도체는 모두 그들의 T/C값이 낮은 상태로 유지되고, 최대 T/C값이 135%인 경우에도 광범위한 투여량 범위에서 우수한 항-P388 강도를 나타내었다. 이들은 최소 유효 투여량의 측면에서 미토마이신 C보다 적어도 10배 더 강력하였다. B16시스템에서는, 두가지 화합물이 모두 P388 시스템에서와 거의 유사한 결과를 나타내었다(표13).
[표 10]
Figure kpo00013
[표 11]
Figure kpo00014
[표 12]
Figure kpo00015
[표 13]
Figure kpo00016
상기와 같이 BU-3420T와 그의 트리아세틸 유도체는 강력한 항세균 및 항진균 활성을 가지며 따라서 이러한 미생물에 의해 야기되는 질병에 걸린 포유류 및 기타 동물을 치료하는데 유용하다. 덧붙여서 이 화합물들은 소독제 및 치과장비와 같은 항미생물제제의 기타 통상적인 응용에도 이용될 수 있다.
상술한 생체외 및 생체내 항종양 자료는 BU-3420T와 그의 트리아세틸 유도체가 포유류 숙주에 있어서의 악성종양의 발육을 억제하는데도 치료적으로 유효함을 나타낸다.
그러므로, 본 발명은 세균 또는 진균에 감염된 동물 숙주를 치료하는 방법으로서 상기 숙주에게 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트 또는 그의 약리적 조성물의 유효항세균 또는 항진균 투여량을 투여하는 것을 포함하는 동물숙주의 치료방법을 제공한다.
또한 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트, 또는 그의 약리적 조성물의 유효 종양-억제 투여량을 악성 종양이 있는 포유류 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 포유류에 있어서 악성 종양의 발육을 억제하는 방법도 제공한다.
또다른 측면으로, 본 발명은 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트의 항세균 또는 항진균 유효량과 불활성의 약리적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약리적 조성물도 제공한다.
또한, 본 발명은 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트의 종양 억제 유효량과 이에 배합된 약리적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약리적 조성물도 제공한다.
이 약리적 조성물은 다른 활성 항미생물 제제나 항종양 제제를 포함할 수도 있으며 바람직한 투여경로에 적합한 어떠한 약학적 형태로도 만들어질 수 있다. 이러한 조성물의 예로는 정제, 캡슐제, 알약, 분말 및 과립과 같은 경구투여용 고상조성물, 용액, 현탁액, 시럽 또는 렐릭시르제와 같은 경구투여용 액상조성물, 멸균용액, 현탁액 또는 유제와 같은 비경구투여용 조제를 들 수 있다. 이들은 또한 사용직전 멸균수, 생리식염수 또는 기타 적당한 멸균 주사용 배지에 용해시킬 수 있는 멸균 고상조성물의 형태로 제조될 수도 있다.
항미생물 제제로 사용되는 경우에는 BU-3420T나 또는 BU-3420T 트리아세테이트, 또는 그의 약리적 조성물을 활성성분의 농도가 처리하고자 하는 특정 미생물의 최소 억제농도보다는 크도록 투여한다. 항종양제로 사용할 경우에는 주어진 포유류 숙주에 대한 BU-3420T 및 BU-3420T 트리아세테이트의 최적 투여량 및 섭생은 관련 기술분야의 숙련자라면 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 물론 화합물의 실제 투여량은 조제된 특정 조성물, 적용방식 및 특정부위, 치료하고자 하는 숙주 및 질병에 따라 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 연령, 체중, 성별, 식이, 투여시기, 투여경로, 배설률, 환자의 상태, 약물배합, 반응 민감도 및 병의 위중도 등과 같은 약물의 작용을 변형시키는 많은 인자들이 고려되어야만 할 것이다.
다음의 실시예는 단지 설명 목적을 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 없다.
[실시예1]
BU-3420T의 발효
Micromonospora종 균주 No. M956-1의 잘자란 한천 슬랜트를 1% 락토오스, 3% 가용성 전분(Nichiden Kagaku), 1% 어분(Hokuyo Suisan), 0.6% CaSO4·2H2O 및 0.5% CaCO3를 함유하고 멸균전 pH를 7.0으로 조절한 종배지가 들어있는 다섯 개의 500ml용 삼각 플라스크에 접종하는데 이용하였다. 이 플라스크를 32℃에서 7일간 회전 쉐이커(200rpm)에서 와동시키고 플라스크로부터 500-ml 배양 분취액을 1.5% 가용성 전분, 0.5% 글루코오스, 1% 사탕무우 당밀(Nihon Tensai Seito)1% 어분 및 0.5% CaCO3(pH7.0)로 이루어진 제2종배지 12리터가 함유된 20리터용 교반기 발효조로 접종하였다. 250rpm에서 교반시키면서 28℃에서 92 시간동안 발효를 수행하고 이동안 분당 12리터씩 통기시켰다. 제2종배지 2리터를 상술한 제2종배지와 동일한 조성을 갖는 120리터의 생산배지가 함유된 20리터 탱크 발효조로 옮겼다. 250rpm으로 교반하면서 분당 120리터의 동기율로 하여 28℃에서 73시간동안 발효를 수행하였다. 발효 브로쓰내의 항생제 생성물을 n-BuOH로 추출하고 시험 미생물로서 Bacill us subtilis(pH8.0)를 이용하여 페이퍼-디스크 한천 확산법으로 모니터하였다. 항생제 생산은 극히 낮았으며 최대 강도는 1μg/ml 미만이었다.
[실시예2]
[BU-3420T의 분리 및 정제]
실시예1에 따라 얻은 수확 브로쓰(220리터)를 6N HCl을 이용하여 pH2.0으로 조절하고, n-부탄올(80리터)을 첨가한다음 반응 혼합물을 2시간동안 교반하였다. 혼합물을 Sharpless 원심분리기(Kokusan, No. 4A)를 이용하여 유기층과 수층으로 분리하였다. 유기추출물(68리터)을 수성 농축물(1리터)이 될 때까지 진공으로 물을 이따금 첨가함으로써 공비 농축시켰다. 침전된 침전물을 따라 내기(decantation)에 의해 수집하고 메탄올(2리터)에 용해시킨 다음 수성 여과물로 결합시켰다. 결합된 용액을 70% 수성 메탄올로 전처리시킨 Diaion HP-20(Mitsubishi Kasei, ø10×65cm) 칼럼에 채웠다. 80% 수성메탄올로 세척한 후, 활성을 80% 수성 아세톤으로 용리시켰다. 용리액을 120ml-분획으로 수집하고 이를 시험 균주로서 Bacillus subtilis PCI 219를 이용하여 페이퍼 디스크 분석으로 시험하였다. 활성 분획을 모으고 진공 증발시켜 암갈색의 유성 잔사(62g)를 얻었다. 잔사를 전개 용매로서 메탄올을 이용하여 Sephadex LH-20(Φ 4×40cm)컬럼상에서 크로마코그래피 처리하였다. 생물분석(B. subtilis PCI 219)과 TLC(SiO2, 크실렌-메틸에틸케톤-메탄올=5 : 5 : 1 v/v, Rr 0.40)를 이용하여 용리액을 모니터하고 적당한 활성 단편을 진공 농축시며 56mg의 암청색 고체를 얻었다. 이 고체를 전개 용매계로서 SiO2판(Kieselgel 60 F254, Merck)와 크실렌메틸에틸케톤-메탄올(5 : 5 : 1, v/v)을 사용하여 예비 TLC에 의해 추가 정제시켰다. Rr 0.40 부근의 청색밴드를 긁어내어 디옥산으로 추출하였다. 추출물을 농축시켜 BU-3420T(5.7mg)의 균질한 청색 시료를 얻었다.
[실시예3]
[트리아세틸 BU-3420T]
BU-3420T(15mg)를 무수 아세트산(1.5ml)과 피리딘(2ml)에 용해시키고 혼합물을 실온에서 18시간동안 정치시켰다. 얻어진 용액을 10ml의 에틸아세테이트와 혼합시키고 물(10ml)로 세척하였다. 에틸아세테이트층을 증발시킨후, 예비 TLC(SiO2플레이트, 크실렌-메틸에틸케론-메탄올=5 : 5 : 1 v/v Rr 0.33)에 의해 잔사를 정제하였다. 적절한 영역을 에틸아세테이트로 추출하고 추출물을 진공 농축시켰다. 수성 아세토니트릴로부터 잔사를 결정화시켜 오렌지빛 침상 모양의 균질한 BU-3420T 트리아세테이트를 얻었다.
[실시예4]
[바람직한 발효 공정]
[A. 쉐이크 플라스크 발효]
Micromonospora chersina(균주 M956-1, ATCC53710)를 유지시키고 시험관의 효모-말트 추출물 한천의 한천 슬랜트상에 옮겼다. 이 배지는 증류수 중의 말트 추출물(1.0%), 효모 추출물(0.4%), 덱스트로스(0.4%), 한천(1.5%) 및 탄산칼슘(0.15%)으로 이루어졌다. 각 한천 슬랜트를 옮길때마다 28℃에서 2주일간 정치시켰다. 생성상 접종물을 제조하기 위해, 슬랜트 배양물로부터 표면 배양물을 증류수중 락토오스(1.0%), 덱스트린(3.0%), 어분(1.0%), 탄산칼슘(0.5%), 황산구리(0.6%) 및 요오드화나트륨(1mg/ι)이 들어있는 멸균 배지 100ml가 함유된 500ml 용량의 삼각 플라스크에 옮겼다. 이 영양 배지를 250rpm의 회전쉐이커상에서 28℃로 하여 7일간 정치시켰다. 이 영양 배지(8% 침전물, pH7.5)5ml를 증류수중 전분(1.5%), 글루코스(0.5%), 사탕무우 당밀(1.0%), 어분(1.0%), 탄산칼슘(0.5%), 황산구리(0.005%) 및 요요드화나트륨(5mg/ι)이 들어있는 생성 배지 100ml가 함유된 500ml용 삼각 플라스크에 옮겼다. 생성 배지를 회전 쉐이커내에서 250rpm으로 교반시키면서 4일 내지 6일간 정치시켰다. 항생제 생성물은 HPLC 분석에 의하면 120-144시간째에 4.5-5.0μg/ml에 도달했다.
[B. 탱크 발효]
M956-1 균주(ATCC 53710)의 동결 영양 배양체 5ml를 락토오스(1%), 덱스트린(3.0%), 어분(1.0%), 탄산칼슘(0.5%) 및 황산칼슘(0.6%)으로 이루어진 100ml 영양 배지(VM-1)가 함유된 500ml용 삼각 플라스크에 접종하였다. 영양 배지를 250rpm으로 고정시킨 회전 쉐이커상에서 28℃에서 5일간 정치시켰다. 이 영양 배지 20ml(10% 침전물, pH7.1)를 증류수중 전분(1.5%), 글루코오스(0.5%), 사탕무우 당밀(1%), 어분(1%), 및 탄산칼슘(0.5%)이 들어있는 영양 배지(VM-2) 500ml가 함유된 2리터들이 Vitro 병에 옮겼다. 이 영양 배지를 250rpm으로 고정시킨 회전 쉐이커상에서 다시한번 28℃에서 96시간동안 정치시켰다. 얻어진 배양체(12% 침전물, pH7.4)를 중류수중 전분(1.0%), 파마메디아(0.5%), 탄산칼슘(0.1%), 황산구리(0.005%) 및 요오드화나트륨(0.5mg/ι)으로 이루어진 생성 배지 10L가 함유된 New Brunswick Microgen 발효조에 무균적으로 옮겼다. 이 미생물을 다음 조건하에서 배양하였다 : 교반속도 250rpm, 온도 30℃ 통기율 10리터/분. 항생제 생성은 HPLC 분석에 의하면 96-110시간후에 최대 2.8μg/ml에 달하였다.
또다른 실시예에서, 균주 M956-1(ATCC 53710)의 동결 영양 배양체 5ml를 영양 배지 VM-1 100ml가 함유된 삼각 플라스크에 접종시켰다. 이 영양 배지를 250rpm으로 고정시킨 회전 쉐이커상에서 28℃에서 5일간 정치시켰다. 이 영양 배지(10% 침전물, pH7.1)70ml를 영양 배지 VM-2 1400ml가 함유된 Vitro병에 옮기고 교반율 250rpm으로 고정한 회전 쉐이커상에서 28℃에서 96시간동안 정치시켰다. 얻어진 영양 배지를 증류수중 전분(1.5%), 글루코오스(0.5%), 사탕무우 당밀(1.0%), 어분(1.0%), 탄산칼슘(0.5%) 및 요오드화나트륨(5ml/ι)가 들어있는 생성 배지 30리터가 함유된 50리터의 명목상 부피의 Biolofitte 발효조에 무균적으로 옮겼다. 거품 방지제를 사용하여 거품을 조절하였다. 미생물을 다음의 발효 조건하에서 배양시켰다 : 250rpm에서 교반시키고, 온도는 30℃로 고정시키고 35리터/분의 비율로 통기시켰다. 항생제생성은 HPLC 분석에 따라 120-144시간이 지난후 2.4μg/ml에 달하였다.
[실시예5]
[바람직한 분리 및 정제 공정]
발효 브로쓰로부터 BU-3420T를 정제하는 매우 간단한 공정이 개발되었다. 이 방법을 다음에 도표로 나타내었다.
[표 14]
Figure kpo00017
[방법 및 재료]
모든 용매는 시약 등급이었고 추가 정제없이 사용하였다. 에틸아세테이트, 핵산, 톨루엔, 메탄올, 및 클로로포름은 Fisher Scientific Company ACS 등급 용매였다. 테트라히드로푸란은 American Burdick 및 Jackson Laboratories, Inc.의 방부제 없는 고순도 용매였다. 물은 Barnstead Nanopure II D3700 시리즈 카트리지 탈이온계(ASTM, CAP, NC-- Type I Reagent Grade Water)를 통과시킨 가정용 탈이온수를 말한다. 암모늄 아세테이트는 Fisher Scientific Company의 ACS HPLC 등급 시약이었다. 디칼라이트(Dicalite)는 Grefco, Inc.(Torrance, California)사가 제조한 규조토였다.
[박층 크로마토그래피(TLC)]
Analtech로 예비 피복시킨 실리카겔 GHLF판(2.5cm×10cm, 0.25mm 두께층)에서 TLC를 수행하였다. Whatman, Inc.로부터 구입한 유리실린더(6.4cm[외경]×11.5cm높이)중에서 판을 전개시키고, 판을 도입시키기 전에 10ml의 메탄올 1부, 클로로포름 9부를 담아 평형시켰다. 전개되고 공기 건조된 판을 분무 시약의 사용없이 가시광선 중에서 관찰하였다.
[분석 HPLC]
다음 요소로부터 분석적인 HPLC 시스템을 만들었다 : Waters Associates Model 600A 용매 전달계 펌프 : HP85B 컴퓨터, HP9121 디스크 드라이브, 7470A 플롯터 및 2225A 씽크 제트 프린터로 이루어진 Hewlett Packard 1040A HPLC 검색기 시스템 : Water Associates Model U6K 주입기 : Q-BEX #10015 ODS(10μ) 컬럼(4.6mm[내경]×30cm), 각 요소들을 316 스테인레스강 튜빙(1.6mm[외경]-0.23mm[내경])으로 연결시켰다. 55부의 0.1M 암모늄 아세테이트와 45부의 테트라히드로퓨란으로 구성된 용리액을 모든 분석을 위해 2ml/분의 유속으로 펌프시켰다.
[조추출물 A의 제조]
실시예 4의 일반 공정에 따라 제조한 pH7.2의 조발효 브로쓰(35L)를 폴리프로필렌 탱크중의 동부피의 에틸아세테이트(35L)와 혼합하고 공기-추진 혼합기를 사용하여 2시간동안 교반시켰다. 현탁액에 디칼라이트 4 큰 숟가락(약 2kg)을 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 센터슬렁 바스켓 원심분리기를 이용하여 여과시켰다. 여과물을 두 개의 섞이지 않는 상으로 전개시키고 이들을 분리시켰다. 유기 에틸아세테이트층을 회전 증발기 중에서 진공 농축시키고 암록청색 잔사 A를 84.2g을 얻었다.
[잔사 A의 디칼라이트 크로마토그래피]
잔사 A(84.2g), 클로로포름(200ml), 및 디칼라이트(100g)의 슬러리를 500ml용 둥근바닥 플라스크에서 제조하였다. 혼합시킨 후, 회전 증발기내에서 슬러리를 건조될때까지 진공 증발시켰다. 얻어진 잔사를 플래쉬 크로마토그래피 컬럼(4.1cm[내경]×46cm)으로 건조-패킹시켰다. 다음의 용리시리즈 : 핵산3리터, 톨루엔 1리터, 및 메탄올 1리터를 이용하여 가압흐름(질소,3psi)으로 용리를 개시하였다. 회전 증발기에서 톨루엔 용리액을 건조상태까지 농축시켜 잔사 B214.2mg을 얻었다.
[잔사 B의 Sephadex LH-20 크로마토그래피]
스팩트럼 액체 크로마토그래피 컬럼(2.5cm[내경]×70cm)을 클로로포름/메탄올(1 : 1, v : v) 500ml중에 24시간동안 미리 팽윤시킨 Sephadex LH-20겔(Pharmacia Fine chemicals, 뉴저어지)로 채웠다. 용리액 3베드 부피로 하룻밤 평형화시킨후, 클로로포름/메탄올(1 : 1,v : v) 10ml중의 잔사 B를 컬럼 꼭대기에 부하시키고, 1.5ml/분의 유속으로 이동상으로 용리를 개시하였다. 최초 260ml를 수행한 후, 87개의 10ml 분획을 모았다. 각 분획으로부터의 분취액(2-3μl)을 TLC로 분석하였다. 25-40 분획을 모으고 진공 농축시켜 잔사 C7.3mg을 얻었다.
[잔사 C의 진공 액체 크로카토그래피]
프릿화 디스크가 구비된 소결된-유리 Buchner 깔때기(Kontes Scientific Glassware K-954100 Buchner 깔때기, 중간[M] 구경 10-15마이크론, 15ml 용량)를 TLC 등급 실리카겔(실리카겔 60, cat # 7730, E. Merck, Darmstadt, Germany)로 4cm 높이까지 건조 충진시켰다. 진공을 건다음 중력하에서 살살 탭핑시켜 흡착시켜서 균일하고 꽉찬 충진된 경화 케익을 얻었다. 진공을 풀고 클로로포름(30ml)을 흡착물 표면에 도포하였다. 다시 진공을 걸고 컬럼을 건조 흡입시켰다.
잔사 C(7.3mg)를 소량의 실리카겔상에서 예비 흡착시키고 컬럼 꼭대기에 균일하게 적용시켰다. 다음의 용리시리즈 : 클로로포름(500ml), 클로로포름(200ml)중 2% 메탄올, 클로로포름(200ml)중 3% 메탄올 및 클로로포름(200ml)중 5% 메탄올을 이용하여 약한 진공하에서 용리를 개시하였다. 클로로포름중 2% 메탄올과 클로로포름중 3% 메탄올 분획이 TLC 분석에 의해 R 0.35에서 자주빛 점만을 포함하는 것으로 나타났다. 이들을 수집하고 진공 농축시켜 BU-3420T 1.3mg을 얻었다.
[BU-3420T의 물리 화학적 특성]
분리된 BU-3420T는 다음의 물리적 특성 및 분광특성을 갖는다 :
[표 15]
Figure kpo00018

Claims (12)

  1. 다음의 구조식을 갖는 화합물 BU-3420T
    Figure kpo00019
  2. 다음의 일반식을 갖는 화합물 BU-3420T 트리아세테이트
    Figure kpo00020
    상기 식중 R은 CH3CO-이다.
  3. 침수된 호기성 조건하에서 자화성 탄소원과 질소원이 함유된 수성 영양 배지중에서 BU-3420T-생산균주 Micromonospora chersina sp. nov가 실제량의 BU-3420T를 생산할때까지 상기 균주를 상기 배지중에서 배양시킨 다음 배지로부터 상기 BU-3420T를 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 다음의 구조식을 갖는 BU-3420T의 제조방법.
    Figure kpo00021
  4. 제3항에 있어서, BU-3420T-생산균주가 Micromonospora chersina ATCC 53710이거나 또는 그의 변종 또는 변이주인 것이 특징인 BU-3420T의 제조방법.
  5. 침수된 호기성 조건하에서 자화성 탄소 및 질소원을 함유하는 배양 배지에서 배양시켰을 때 회수가능한 양의 항생물질 BU-3420T를 생산할 수 있는 미생물 Micromonospora chersina sp. nov. (ATCC 53710)의 생물학적으로 순수한 배양체.
  6. 다음의 구조식을 갖는 BU-3420T
    Figure kpo00022
    를 불활성 유기 용매중에서 BU-3420T의 10, 12 및 15위치에 아세틸기를 도입시킬 수 있는 아세틸화제와 반응시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 다음의 구조식을 갖는 BU-3420T 트리아세테이트의 제조방법.
    Figure kpo00023
  7. 항세균 유효량의 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트와 약리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제를 포함하는 약리적 조성물.
  8. 항진균 유효량의 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트와 약리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제를 포함하는 약리적 조성물.
  9. 종양 억제 유효량의 BU-3420T 또는 BU-3420T 트리아세테이트와 약리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제를 포함하는 약리적 조성물.
  10. 세균에 감염된 동물 숙주에게 BU-3420T나 또는 BU-3420T 트리아세테이트의 항세균 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는 세균에 감염된 동물숙주의 치료방법.
  11. 진균에 감염된 동물 숙주에게 BU-3420T나 또는 BU-3420T 트리아세테이트의 항진균 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는 진균에 감염된 동물 숙주의 치료방법.
  12. 악성 종양이 있는 포유류 숙주에게 BU-3420T나 또는 BU-3420T 트리아세테이트의 종양 억제 투여량을 투여하는 것을 포함하는 포유류의 악성 종양의 발육을 억제하는 방법.
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