KR880001758B1 - Process for preparing lymp cell against cancer - Google Patents

Abstract

Lymphocytes which are toxic to cancer cells and specific for a glyco- related antgen (GRA) of such cells are prepd. by sensitising leucocytes to a GRA. GRA is isolated from human cancer cells by complexing with a lectin e.g. groundnut or soya lectin for galactose specificity, or Dolictis agglutin or Luma bean lectin for acethylgalactosamine. Particulary the GRA is a component of cancer cell membranes and combines with a lectin specifically at the galactose or N-acetylgalactosamine terminal gp. Sensitised cells destroy cancer cells carrying the corresponding GRA and are specific since GRA do not occur on normal cells.

Description

암세포에 대항하는 임파구의 제조방법Method of producing lymphocytes against cancer cells

제1도는 도디(Daudi)암세포의 현미경사진이다.1 is a photomicrograph of Daudi cancer cells.

제2도는 제1도 암세포의 GRA-1-K-T에 의한 플라크(Plque)의 형성을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 2 is a micrograph showing the formation of plaque by GRA-1-K-T in FIG. 1 cancer cells.

제3도는 KATO-Ⅲ암세포의 현미경사진이다.3 is a micrograph of KATO-III cancer cells.

제4도는 제3도 암세포의 GRA-1-K-T에 의한 플라크의 형성을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 4 is a micrograph showing the formation of plaques by GRA-1-K-T in FIG. 3 cancer cells.

제5도는 BT-Ⅰ암세포의 현미경사진이다.5 is a micrograph of BT-I cancer cells.

제6도는 제5도 암세포의 GRA-1-K-T에 의한 플라크의 형성을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 6 is a micrograph showing the formation of plaques by GRA-1-K-T in FIG. 5 cancer cells.

제7도는 MKN-45암세포의 현미경사진이다.7 is a micrograph of MKN-45 cancer cells.

제8도는 제7도 암세포의 GRA-1-K-T에 의한 플라크의 형성을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 8 is a micrograph showing the formation of plaques by GRA-1-K-T in FIG. 7 cancer cells.

제9도는 MOLT암세포의 현미경사진이다.9 is a micrograph of MOLT cancer cells.

제10도는 제9도 암세포의 GRA-1-K-T에 의한 플라크의 형성을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 10 is a micrograph showing the formation of plaques by GRA-1-K-T in FIG. 9 cancer cells.

제11도는 감작되지 않은 인체 말초혈액 임파구의 혼합물로 처리된 BT-1의 현미경사진이다.11 is a micrograph of BT-1 treated with a mixture of unsensitized human peripheral blood lymphocytes.

제12도 및 제13도는 각각 GRA-1-K-T를 투여한, 암게 걸린 마우스의 암세포조직의 현미경사진이다.12 and 13 are photomicrographs of cancer cell tissues of cancer-bearing mice to which GRA-1-K-T was administered, respectively.

제14도는 GRA-M-1을 투여한, 암에 걸린 마우스군에서의 암의 상태를 보여주는 현미경사진이다.FIG. 14 is a micrograph showing the state of cancer in a group of mice with cancer administered GRA-M-1.

제15도는 GRA-M-1을 투여하지 않은, 암에 걸린 마우스군의 암의 상태를 나타내는 현미경사진이다.FIG. 15 is a micrograph showing the state of cancer in a group of mice with cancer who did not receive GRA-M-1.

제16도는 GRA-M-1을 투여하지 않은, 암에 걸린 마우스군의 암세포조직을 보여주는 현미경사진이다.FIG. 16 is a micrograph showing cancer cell tissue from a group of mice with cancer who were not administered GRA-M-1.

제17도는 GRA-M-1을 투여한, 암에 걸린 마우스군의 암세포 조직의 현미경사진이다.Figure 17 is a micrograph of cancer cell tissue from a group of mice with cancer administered GRA-M-1.

제18도는 C.B.B방법에 따르는 단백질 염색법을 사용하여 GRA를 SDS겔 전기영동시킨 결과를 보여주는 다이아그람이다.FIG. 18 is a diagram showing the results of electrophoresis of GRA on SDS gel using protein staining according to the C.B.B method.

제19도 내지 제21도는 PAS방법에 따르는 당착색법을 사용하여 GRA를 SDS겔 전기 영동시킨 결과를 보여주는 다이아그람이다.19 to 21 are diagrams showing the results of SDS gel electrophoresis of GRA using a glycosylation method according to the PAS method.

제22도는 C.B.B. 방법에 따르는 단백질 염색법을 사용하여 GRA를 SDS겔 전기영동시킨 결과를 도식적으로 설명한 것이다.22 shows C.B.B. SDS gel electrophoresis of GRA using the protein staining method according to the method is illustrated schematically.

제23도는 X 5563 면역마우스 비장세포 및 X 5563세포를 이식한 C 3 H/HE 마우스에서의 종양 성장속도를 보여주는 그라프이다.23 is a graph showing tumor growth rate in C 3 H / HE mice transplanted with X 5563 immunomous splenocytes and X 5563 cells.

본 발명은 암세포에 대항하는 임파구[이후에서는 킬러세포(Killer cell)라 칭함]의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 암세포로부터 유도된 당관련 항원(glycorelated antigen)(이 항원은 이후에서는 "GRA"라 칭함)을 갖는 암세포에 대해 특이적으로 작용하여 암세포를 파괴하는 킬러세포의 제조방법에 관한 것이다. 그외에도 본 발명은, 활성성분으로서, 더욱 특히 킬러세포 또는 GRA를 함유하는 신규한 항암제에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing lymphocytes (hereinafter referred to as killer cells) against cancer cells. More particularly, the present invention relates to a method for producing killer cells that specifically destroy cancer cells by specifically acting on cancer cells having a glycorelated antigen derived from cancer cells (the antigen is hereinafter referred to as "GRA"). will be. In addition, the present invention relates to a novel anticancer agent containing, as an active ingredient, more particularly killer cells or GRA.

특히 세포-개재된 면역반응에서 주역할을 하는 면역반응 작동세포, T임파구는 외래세포 항원에 의한 이식에 대해 거부반응을 일으키지만, 암세포에 대해서는 전혀 인지할 수 없거나 매우 한정된 억제작용만을 나타낸다. 따라서 암세포는 생체내에서 파괴되지 않고 증식하여 마침내는 암환자를 사망에 이르게 한다.In particular, immune response effector cells, T lymphocytes, which play a major role in cell-mediated immune responses, cause rejection for transplantation by foreign cell antigens, but have no recognizable or very limited inhibitory effects on cancer cells. Thus, cancer cells proliferate without destroying in vivo, and eventually cause cancer patients to die.

그러나, 생체세포가 외래세포를 인지할 수 있는 메카니즘은 완전히 규명되어 있지 않으며, 이러한 시스템에 관련된 기초물질의 특성에 대한 많은 연구가 시도되어 왔다. 예를 들면, 돌리코스 비플로러스 응집소(Oilichos biflorus agglutinin;DBA) 및 땅콩 응집소(PNA)와 같은 렉틴을 사용하여 마우스 백혈병 세포 또는 배아 암세포상의 세포표면을 표지한다[참조 : Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448-455(1979), 상기문헌 96(4) 1547-1553(1980), J.Biochem. 89 473-481(1981) 및 Cell 81 183-191 Sept.1979.].However, the mechanism by which living cells can recognize foreign cells is not fully elucidated, and much research has been attempted on the properties of the basic substances involved in such a system. For example, lectins such as Oilichos biflorus agglutinin (DBA) and peanut aggregate (PNA) are used to label cell surfaces on mouse leukemia cells or embryonic cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 89 (2) 448-455 (1979), supra 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 473-481 (1981) and Cell 81 183-191 Sept. 1979.].

그러나, 이제까지 알려진 바로는, 특이적으로 암세포에 대항할 수 있는 새로운 임파구, 및 임파구의 면역반응을 이용하여 항암제를 제공하는데 있어서 괄목할 만한 연구는 행하여 지지 못했다.However, as far as is known, no significant studies have been carried out in the provision of new lymphocytes that can specifically fight cancer cells, and anticancer agents using the immune response of lymphocytes.

암세포에 대한 숙주의 면역반응, 및 이를 암치료에 적용하는 방법에 관한 광범위한 연구결과로서, 분화된 정상세포에서는 발견되지 않는, 암세포 특이성 항원에 있어서, 숙주에 대해 면역원으로서 작용하며 암세포에 대해 특이적 면역반응을 야기시키는 매우 높은 면역원성을 갖는 GRA가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 또한, GRA가 임파구를 감작시키는데 사용되는 경우 GRA를 함유하는 암세포에 대해 특이적으로 작용하는 킬러세포를 수득할 수 있으며, 이 킬러세포를 숙주에 투여하면, 이들은 GRA를 인지하고 GRA를 함유하는 암세포에 작용하여 이들을 파괴하므로, 이들이 암의 치료 및 예방에 있어서 탁월한 효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명은 하나의 실시 태양으로서 킬러세포를 제공한다.As a result of extensive research on the host's immune response to cancer cells and how to apply them to cancer treatment, cancer cell specific antigens, which are not found in differentiated normal cells, act as immunogens against the host and are specific for cancer cells. It has been found that there is a GRA with very high immunogenicity causing an immune response. In addition, when GRA is used to sensitize lymphocytes, killer cells can be obtained that act specifically against cancer cells containing GRA, and when administered to the host, they recognize GRA and cancer cells containing GRA. Acting on and destroying them, it has been found that they have an excellent effect in the treatment and prevention of cancer. Therefore, the present invention provides killer cells as one embodiment.

다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 킬러세포의 제조방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for producing killer cells.

또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 활성성분으로서 킬러세포 또는 GRA를 함유하는 항암제를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides an anticancer agent containing killer cells or GRA as an active ingredient.

본 발명의 킬러세포는, 예를 들면 GRA가 임파구를 감작시키는데 사용되는 방법으로 제조할 수 있다.Killer cells of the present invention can be produced, for example, by the method in which GRA is used to sensitize lymphocytes.

상기 방법에서 사용되는 GR는 인체 또는 동물의 GRA를 함유하는 암세포, 예를 들면 배양된 암세포, 이식된 암세포, 자연발생암세포, 화학물질 또는 바이러스-유도된 암세포, 및 수술한 조직으로부터 유도된 암세포로부터 다음 방법에 따라 수득할 수 있다.GR used in the method is derived from cancer cells containing human or animal GRAs, such as cultured cancer cells, transplanted cancer cells, naturally occurring cancer cells, chemical or virus-derived cancer cells, and cancer cells derived from surgical tissues. It can be obtained according to the following method.

세포막 성분은 상기에 기술된 암세포로부터 분리한 다음, GRA가 렉틴과 결합하고 용이하게 분리될 수 있는, 말단 갈락토오즈 또는 말단 N-아세틸갈락토오즈아민과 특이적으로 결합 하는 렉틴으로 처리한다. 갈락토오즈-결합 렉틴의 적절한 예로는 땅콩 렉틴, 리시니스 콤뮤니스(Ricinus communis)렉틴, 대두(Glycin max)렉틴, 및 돌리코스 비플로러스(Dolichos biflolus)렉틴(DBA)이 있다.[참조 : J.B.C. 250, 8518-8523(1975) ; Biochem. Biophys. Res. Comm. 62, 144(1975) ; Z. Jmmunitaetsforch, 138, 423-433(1969) ; Br.J.Exp Pathol., 27, 228-236(1946) ; Proc. Nath. Acad. Sci. USA, 75, No.5, 2215-2219(1978) ; Biochemistry, 13, 196-204(1974) ; 및 Carbohydrate Research, 51, 107-118(1976)]. N-아세틸갈락토오즈아민-결합 렉틴의 적절한 예로는 돌리코스 콩(Dalichos biforus)응집소, 망상의 오렌지 렉틴, 헬릭스 포마티아 렉틴, 리마-콩(Phaseolus limensis)렉틴, 대두(Glycin max)렉틴, 및 바우히니아 콩(Bauhinia purpurea)렉틴이 있다.The cell membrane components are isolated from the cancer cells described above and then treated with lectins that specifically bind with terminal galactose or terminal N-acetylgalactoseamine, where GRA can bind and easily separate lectins. Suitable examples of galactose-binding lectins include peanut lectins, Ricinus communis lectins, Glycin max lectins, and Dolichos biflolus lectins (DBA). JBC 250, 8518-8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm. 62, 144 (1975); Z. Jmmunitaets forch, 138, 423-433 (1969); Br. J. Exp Pathol., 27, 228-236 (1946); Proc. Nath. Acad. Sci. USA, 75, No. 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974); And Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976). Suitable examples of N-acetylgalactoseamine-binding lectins include Dalichos biforus agglutinates, reticular orange lectins, helix pomatia lectins, Phaseolus limensis lectins, Glycin max lectins, and Bauhinia beans (Bauhinia purpurea) lectin.

암 세포막 성분은 균질화법 및 용해제를 사용하는 가용화방법과 같은 공지의 방법으로 분리시킬 수 있다. 암세포를 생리식염수 또는 적절한 완충액중에서 균질화시킨 다음 침전된 부분은 원심분리와 같은 방법에 의해 수거하고 용해제를 사용하여 생리식염수 또는 완충액중에 용해시키고, 상등액부분은 원심분리와 같은 방법으로 분리시키는 방법을 사용하는 것이 더 유리하다. 사용될 수 있는 용해제로는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 트리톤 X-100(TRITONX-100 ; Wako Pure chemical Industries Ltd. 제품), NP-40(Shellco.,Ltd. 제품), 디기토닌, 및 우레아, 및 음이온성 계면활성제, 예를 들면 나트륨 도대실 설포네이트(SDS)등과 같이 세포막을 용해시킬 수 있는 것으로 알려진 계면활성제가 포함된다.Cancer cell membrane components can be separated by known methods such as homogenization and solubilization using a solubilizer. The cancer cells are homogenized in physiological saline or an appropriate buffer, and the precipitated portion is collected by a method such as centrifugation, dissolved in physiological saline or buffer using a soluble agent, and the supernatant portion is separated by a method such as centrifugation. It is more advantageous to do that. Solvents that may be used include nonionic surfactants such as Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (manufactured by Shellco., Ltd.), digittonin, and urea. And surfactants known to be able to dissolve cell membranes such as anionic surfactants such as sodium hexyl sulfonate (SDS) and the like.

이렇게하여 수득된 세포막 성분으로부터, 렉틴의 성질을 이용한 물리화학적 또는 생화학적 방법에 의해 렉틴과 결합할 수 있는 GRA를 분리시킬 수 있다. 이러한 방법의 예로는 렉틴을 함유하는 컬럼 담체를 이용하는 친화성 크로마토그라피, GRA항체등을 사용하는 면역침전법, 투석법, 겔여과법, 전기영동법, 당단백질침전제(예 : 폴리에틸렌 글리콜 및 아세톤)를 사용하는 물리적 침전법 및 이들의 병용방법등이 포함된다. 렉틴을 함유하는 컬럼 담체를 이용하는 친화성 크로마토 그라피가 더욱 바람직하며, 컬럼 담체는 불용성 지지체상에 렉틴을 고정시킴으로써 쉽게 제조될 수 있다. 이와 같이 불용성 지지체상에 렉틴을 고정시키는 것은 생물물질이 고정화에 통상적으로 사용되는 공지의 방법으로 수행할 수 있다. 이들 방법중에서, 브롬화시안 활성화 다당류법 및 N-하이드록시숙시미드 에스테르를 사용하는 고정화법을 사용하는 것이 바람직하다. 브롬화시안 활성화 다당류법은 불용성 지지체를 브롬화시안으로 처리한 다음, 이렇게하여 수득된 활성화된 생숭물을 완화한 조건하에서 렉틴과 커플링 반응시켜서 렉틴을 고정시키는 방법이다. 불용성 지지체를 브롬화시안으로 처리하는데 있어서, 예를 들면, 수산화나트륨 밑 탄산수소나트륨과 같은 염기성 화합물을 사용하여 pH를 7.5 부터 12까지 조정하고, 지지체를 물, 아세토니트릴, 또는 pH 7.5내지 12로 유지시킨 완충액[예 : 0.1M 탄산수소나트륨 완충액(pH 약 8.7) 및 0.01M 인산염 완충액(pH 약 7.7)]과 같은 용매중 실온에서 약1내지 12분 동안 처리한다. 사용되는 브롬화시안의 양은 보통 불용성 지지체의 양과 동일한 것이 바람직하다.From the cell membrane components thus obtained, GRAs capable of binding to lectins can be separated by physicochemical or biochemical methods utilizing the properties of the lectins. Examples of such methods include affinity chromatography using column carriers containing lectins, immunoprecipitation using GRA antibodies, dialysis, gel filtration, electrophoresis, glycoprotein precipitants (e.g. polyethylene glycol and acetone). Physical precipitation and combinations thereof. More preferred is affinity chromatography using column carriers containing lectins, which can be readily prepared by immobilizing the lectins on an insoluble support. As such, the immobilization of the lectin on the insoluble support may be performed by a known method in which a biological material is commonly used for immobilization. Among these methods, it is preferable to use the cyanide brominated activated polysaccharide method and the immobilization method using N-hydroxysuccimid ester. The cyanide-activated polysaccharide method is a method of treating an insoluble support with cyanide bromide and then immobilizing the lectin by coupling reaction with the lectin under relaxed conditions. In treating an insoluble support with cyanide bromide, the pH is adjusted from 7.5 to 12 using a basic compound such as, for example, sodium hydrogen carbonate under sodium hydroxide, and the support is maintained at water, acetonitrile, or pH 7.5 to 12. In a solvent such as 0.1 M sodium hydrogencarbonate buffer (pH about 8.7) and 0.01 M phosphate buffer (pH about 7.7) at room temperature for about 1 to 12 minutes. The amount of cyanide bromide used is usually preferably the same as the amount of insoluble support.

본 발명에는, 모든 생물물질에 낮은 비특이적 흡착성을 나타내고, 높은 다공성을 가지며, 완화한 조건하에서 생물물질을 고정화시킬 수 있는 작용그룹을 함유하고, 화학적 및 물리적으로 충분히 안정한 공지된 불용성 지지체는 어떠한 것이라도 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 불용성 지지체로는 셀룰로오즈(예 : 아미노에틸 셀룰로오즈, 카복시메틸 셀룰로오즈, 브로모아세틸 셀룰로오즈 및 P-아닐리노 셀룰로오즈)로 만들어진 지지체, 가교 결합된 덱스트란 지지체[예 : 세파덱스 및 CM-세파덱스(파마시아 코포레이션 제공)]및 아가로오즈 지지체[예 : 세파로오즈 2B, 세파로오즈4B, 및 세파로오즈 6B(파마시아 코포레이션 제품)]등이 포함된다.In the present invention, any known insoluble support having a low non-specific adsorption to all biological materials, having a high porosity, and containing a functional group capable of immobilizing the biological materials under moderate conditions, and which is chemically and physically stable enough Can be used. Insoluble supports that can be used include supports made of cellulose (e.g., aminoethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, bromoacetyl cellulose and P-anilino cellulose), crosslinked dextran supports [e.g. Sephadex and CM-Sephadex (Provided by Pharmacia Corporation)] and agarose supports such as Sepharose 2B, Sepharose 4B, and Sepharose 6B (from Pharmacia Corporation).

상기에서 수득된 브롬화시안 활성화된 지지체를 렉틴과 커플링시키는 반응에 있어서, 브롬화시안-활성화된 지지체를 렉틴의 30 내지 80배의 양으로 사용하여, 이들을 0.1몰/l의 탄화수소나트륨 수용액(0.5몰/l의 염화나트륨 함유 ; pH:8.4)와 같은 적절한 용매중, 0 내지 40℃, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 약 10 내지 20시간 동안 반응시킨다. 이러한 방법으로 렉틴을 함유하는 친화성 크로마토그라피용 담체를 제조할 수 있다.In the reaction of coupling the cyanide brominated activated support obtained above with lectin, the cyanide brominated-activated support is used in an amount of 30 to 80 times the amount of lectin, and these are used in an aqueous solution of 0.1 mol / l aqueous sodium hydrogen carbonate (0.5 mol). / l sodium chloride; pH: 8.4) in a suitable solvent for 0 to 40 ℃, preferably 2 to 8 ℃ for about 10 to 20 hours. In this way, a carrier for affinity chromatography containing lectins can be prepared.

상기와 같이 제조된, 렉틴을 함유하는 담체를 사용하여 크로마토그라피에 의해, 원하는GRA를 담체중에 함유되어 있는 렉틴과 결합시키고 이를 컬럼에 넣는다. 계속해서, 예를 들면 렉틴과 결합할 수 있는 물질을 컬럼에 통과시켜 교환 반응을 수행하거나, 또는 다른 방법으로 흡착분리제(용출용액), 예를 들면 고농도의 염, 티오시안화 칼륨 수용액 및 질산염 완충액을 컬럼에 통과시켜 처리해서 원하는 GRA를 수득한다.Chromatography using a carrier containing a lectin prepared as described above binds the desired GRA with the lectin contained in the carrier and puts it in a column. Subsequently, an exchange reaction can be carried out, for example, by passing a substance capable of binding to lectin through a column, or alternatively, an adsorptive separation agent (eluent), for example, a high concentration of salt, potassium thiocyanate solution and nitrate buffer. Is treated by passing through a column to give the desired GRA.

교환반응에서, 갈락토오즈-결합 렉틴을 함유하는 친화성 크로마토그라피용 담체를 사용하는 경우 렉틴과 결합할 수 있는 물질의 예로는 말단 갈락토오즈-결합렉틴(예 : 갈락토오즈), 말단 갈락토오즈를 함유하는 이당류 및 말단 갈락토오즈를 함유하는 과당류와 결합살 수 있는 물질을 들 수 있으며, N-아세틸갈락토오즈아민-결합 렉틴을 함유하는 친화성 크로마토그라피용 담체를 사용할 경우 렉틴과 결합살 수 있는 물질의 예로는 말단 N-아세틸갈락토오즈아민-결합 렉틴(예 : N-아세틸갈락토오즈아민), 말단 N-아세틸갈락토오즈아민을 함유하는 이당류 및 말단 N-아세틸 갈락토오즈아민을 하유하는 과당류와 결합할 수 있는 물질을 들수 있다.In the exchange reaction, when a carrier for affinity chromatography containing galactose-linked lectins is used, examples of the material capable of binding to lectins include terminal galactose-linked lectins (eg galactose), terminal galls. A substance capable of binding to a disaccharide containing lactose and a fructose containing terminal galactose, and lectin when a carrier for affinity chromatography containing N-acetylgalactoseamine-linked lectin is used. Examples of substances which can be combined with are terminal N-acetylgalactoseamine-linked lectins (e.g., N-acetylgalactoseamine), disaccharides containing terminal N-acetylgalactoseamine and terminal N-acetylgallate. And substances capable of binding to fructose containing lactoseamine.

이렇게하여 수득된 GRA는 갈락토오즈 및/또는 말단 N-아세틸갈락토오즈아민을 함유하는 당단백질, 당지질 및/또는 당류를 함유한다.The GRA thus obtained contains glycoproteins, glycolipids and / or sugars containing galactose and / or terminal N-acetylgalactoseamine.

이렇게하여 제조된 GRA는 동결 건조시킬수 있으며, 필요한 경우 통상적인 분리방법을 사용하여 더 정제할 수 있다. 예를 들면 갈락토오즈-결합 렉틴과 함께 분리된 GRA 제제는 N-아세틸갈락토오즈아민-결합 렉틴을 사용하여 분리시킬 수 있으며, N-아세틸갈락토오즈아민-결합 렉틴과 함께 분리된 것은 갈락토오즈-결합 렉틴을 사용하여 분리시킬 수 있다.The GRA thus prepared can be lyophilized and, if necessary, further purified using conventional separation methods. For example, a GRA preparation isolated with a galactose-binding lectin can be separated using an N-acetylgalactoseamine-binding lectin, while a GRA preparation isolated with a N-acetylgalactoseamine-binding lectin Lactose-binding lectins can be used to isolate.

본 발명에서 사용되는 임파구는 한정된 것은 아니며, 정상이거나 암에 걸린 인체 또는 동물의 어떠한 임파구라도 사용될 수 있다. 예로는 말초혈액, 골수, 임파절, 비장, 편도 및 흉선으로부터 유도된 임파구가 포함된다. 이들 임파구는 물리적 또는 화학적 방법, 표면막법등으로 분리한다.Lymphocytes used in the present invention are not limited, and any lymphocyte of a human or animal that is normal or has cancer may be used. Examples include lymphocytes derived from peripheral blood, bone marrow, lymph nodes, spleen, tonsils and thymus. These lymphocytes are separated by physical or chemical methods, surface membrane methods, and the like.

GRA를 사용한 임파구의 감작은 임파구를 GRA를 함유하는 배양배지중에서 1 내지 10일, 바람직하게는 2내지 7일동안 배양함으로써 수행한다.Sensitization of lymphocytes using GRA is carried out by culturing lymphocytes in culture medium containing GRA for 1 to 10 days, preferably 2 to 7 days.

임파구 감작에 사용되는 배양배지로는 그러한 세포배양에 통상적으로 사용되는 여러가지 통상의 영양배지를 사용할 수 있다. 바람직한 예로는 RPMI 1640 배지, 이글 MEM 배지등이 포함되며, 여기에 인체혈청, 태자송아지 혈청(FCS), 송아지 혈청, 말혈청등을 첨가할 수 있다. 배지에 첨가하는 GRA의 양은 당의 양을 기준으로 계산할때, 배지 ml당 1 내지 1000ng, 바람직하게는 1 내지 500ng이며, 배지 ml당 임파구는 1×10⁶개이다.As a culture medium used for lymphocyte sensitization, various conventional nutrient media commonly used for such cell culture can be used. Preferred examples include RPMI 1640 medium, Eagle MEM medium, and the like may be added to human serum, fetal calf serum (FCS), calf serum, horse serum, and the like. The amount of GRA added to the medium is 1 to 1000 ng, preferably 1 to 500 ng, per ml of medium, and 1 × 10 ⁶ lymphocytes per ml of medium, calculated on the basis of the amount of sugar.

배양은 통상의 방법으로, 예를 들면 pH 약 7.2 및 온도 약 37℃에서 수행한다.Cultivation is carried out in a conventional manner, for example at a pH of about 7.2 and a temperature of about 37 ° C.

상기에서 제조된 본 발명의 킬러세포는 실질적으로 정상의 임파구이며, GRA-특이성세포-대항활성을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 킬러세포중의 하나인 GRA-1-KT는 인체 말토혈액 T세포와 공통인 특성을 가지며, GRA를 함유하는 암세포에 특이적인 세포 대항활성을 나타내는데, 이것에 대해서는 하기 실시예에서 상세히 설명한다.The killer cells of the present invention prepared above are substantially normal lymphocytes and have GRA-specific cell-anti-activity. For example, GRA-1-KT, which is one of the killer cells of the present invention, has characteristics in common with human maltomal blood T cells, and exhibits specific anti-cell activity to cancer cells containing GRA. It demonstrates in detail in an example.

본 발명의 신규한 킬러세포의 전형적인 예로는 GRA-1-KT 및 GRA-M-1이 있는데, 이들의 제조방법에 대해서는 하기 실시예에서 상세히 설명한다. 본 발명의 모든 킬러세포들은 출원인으로부터 입수가능하며 ATCC에 기탁되어 있다.Typical examples of the novel killer cells of the present invention include GRA-1-KT and GRA-M-1, which are described in detail in the following Examples. All killer cells of the present invention are available from Applicants and deposited with ATCC.

본 발명의 킬러세포는 T세포 성장인자(TCGF, IL-2)를 함유하는 상기 기술된 배양배지중에서 무제한적으로 증식시킬 수 있다. 이 경우에, 킬러세포 클로닝의 선택적 배양은 통상의 한계 희석법으로 수행할 수 있다. 이들 킬러세포는 예를 들면 액체 질소중에서 오랜기간 동안 안정하게 저장할 수 있다.Killer cells of the present invention can be grown indefinitely in the culture medium described above containing T cell growth factors (TCGF, IL-2). In this case, selective culturing of killer cell cloning can be carried out by conventional limiting dilution. These killer cells can be stably stored for a long time in liquid nitrogen, for example.

활성성분으로서 GRA는 단독으로 사용될 수 있으며 또한 기타의 항균제 및 암억제제와의 배합물로서 사용될 수 있다. 활성성분으로서 본 발명의 GRA를 함유하는 암 억제제는 GRA가 유효량 함유되어 있는 한 어떠한 형태도 가능하다. 보통 이 약제는 액제, 현탁제 또는 유제로서 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여된다. 또한, 이는 사용하기전에 담체를 가함으로써 액체 상태로 될 수 있는 건조 생성물로 제공될 수도 있다. 이들 액상제는 현탁화제(예 : 메틸셀룰로오즈, 유화제(예 : 레시틴), 보존제(예 : 메틸-p-하이드록시벤조에이트), 인체나 동물의 면역기능에 대해 어떠한 해로운 영향도 미치지 않는 안정제, 완충액 등을 함유할 수 있다.As an active ingredient, GRA can be used alone or in combination with other antimicrobial and anticancer agents. Cancer inhibitors containing the GRA of the present invention as an active ingredient may be in any form as long as an effective amount of GRA is contained. Usually, the agent is administered intravenously, subcutaneously, intradermally or intramuscularly as a solution, suspension or emulsion. It may also be provided as a dry product which can be brought to liquid state by the addition of a carrier prior to use. These liquids are suspending agents (e.g. methylcellulose, emulsifying agents (e.g. lecithin), preservatives (e.g. methyl-p-hydroxybenzoate), stabilizers that do not have any detrimental effect on the immune function of humans or animals, buffers And the like.

사용될 수 있는 수성 담체로는 생리식염수가 포함되며 사용될 수 있는 비수성 담체로는 식물성유(예 : 깨유), 광유(예 : 파라핀유), 동물성유(예 : 스콸렌(Squallene)) 및 프로필렌글리콘이 포함된다. 또한, 면역기능 강화 목적으로 적당한 보조제를 첨가할 수 있다. 사용될 수 있는 보조제로는 프로인트 완전 보조제, 동물용 사포닌 및 인체용 수산화알루미늄등이 포함될 수 있다.Aqueous carriers that may be used include physiological saline, and non-aqueous carriers that may be used include vegetable oils (e.g. sesame oil), mineral oils (e.g. paraffin oil), animal oils (e.g. Squallene) and propylene glycol. Recon is included. In addition, suitable adjuvants may be added for the purpose of strengthening immune function. Adjuvants that may be used include Freund's complete adjuvant, animal saponins, and human aluminum hydroxide.

본 발명의 함암제는 암환자에게 암치료를 위해 1회 또는 장기간에 걸쳐 반복적으로 투여할 수 있거나, 또는 암에 걸리기 쉬운 사람에게 암을 예방하기 위해 투여할 수 있다.The anticancer agent of the present invention may be repeatedly administered to a cancer patient once or for a long time for cancer treatment, or may be administered to a person prone to cancer to prevent cancer.

GRA의 LD₅₀(마우스, 복강내)은 당의 양으로 계산할때 적어도 500mg/kg이므로, 본 발명의 항암제는 독성이 낮으며, 따라서 이는 광범위한 용량 범위내에서 투여할 수 있다. 본 발명의 항암제중에서의 GRA의 농도는 한정된 것이 아니며, 통상적으로 당의 양으로 계산할때 0.001 내지 100μg/ml가 바람직하다. 항암제의 용량에 관해서는 질병의 정도 및 환자의 연령과 성별에 따라 다르기는 하나 통상적으로 0.001 내지 1000μg/kg/일의 양으로, 동시에 또는 수회에 걸쳐 투여하는 것이 바람직하다.Since LD ₅₀ (mouse, intraperitoneal) of GRA is at least 500 mg / kg, calculated as the amount of sugar, the anticancer agent of the present invention is low in toxicity and therefore can be administered within a wide range of doses. The concentration of GRA in the anticancer agent of the present invention is not limited, and usually 0.001 to 100 μg / ml is preferable when calculated as the amount of sugar. Regarding the dose of the anticancer agent, administration of the anticancer agent, depending on the severity of the disease and the age and sex of the patient, is usually performed in an amount of 0.001 to 1000 μg / kg / day, simultaneously or several times.

이렇게하여 제조된, 활성성분으로서 킬러세포를 함유하는 항암제는 그러한 혈액 약품의 제조에 사용하는 담체와 병용하여 주사액제로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 담체는 한정된 것은 아니다. 혈액과 등장인 담체가 바람직하다. 특히, 생리식염수가 바람직하다. 약제의 제조에 있어서, 킬러세포를 생리식염수등으로 충분히 세척해서 상기 기술된 배양배지를 제거한 다음, 담체중에 부유시키는 것이 바람직하다.The anticancer agent prepared as described above and containing killer cells as an active ingredient is preferably used as an injection solution in combination with a carrier used for the preparation of such a blood drug. The carrier used in the present invention is not limited. Carriers that are isotonic with blood are preferred. In particular, saline is preferred. In the preparation of a medicament, it is preferable that the killer cells are sufficiently washed with physiological saline or the like to remove the culture medium described above, and then suspended in a carrier.

약제중 킬러세포의 농도는 특별히 한정된 것은 아니나 10⁵내지 10⁹/ml가 바람직하다. 킬러세포를 마우스당 10⁸의 용량으로 복강내 투여하는 경우 독성은 전혀 관찰되지 않는다. 본 발명 항암제의 용량은 질병의 정도, 환자의 연령 및 성별에 따라 다르나, 통상적으로 10⁵내지 10¹²/kg/일의 용량을 한번에 또는 분할하여 투여하는 것이 바람직하다.The concentration of killer cells in the drug is not particularly limited but is preferably 10 ⁵ to 10 ⁹ / ml. No toxicity is observed when intraperitoneally administered killer cells at a dose of 10 ⁸ per mouse. The dose of the anticancer agent of the present invention depends on the severity of the disease, the age and sex of the patient, but it is usually preferable to administer a dose of 10 ⁵ to 10 ¹² / kg / day at a time or dividedly.

다음의 실시예, 참조실시예, 실험실시예 및 비교실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위해 제공되는 것이며 이에의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The following examples, reference examples, laboratory examples and comparative examples are provided to explain the present invention in more detail, and the present invention is not limited thereto.

[참조실시예 1]Reference Example 1

GRA의 소재GRA material

(1)-A FITC-표지된 렉틴(PNA-FITC)의 제조(1) -A FITC-labeled lectin (PNA-FITC) preparation

10mg의 땅콩 렉틴(PNA, EY Co, 제품)을 2ml의 0.01M 인산염 완충액(0.85% NaCl함유 ; pH : 7.2)에 용해시킨다. 1ml의 0.5M 탄산수소염 완충염(pH=9.0) 중에 2mg의 FITC(Sigma Laboratories Inc 제품)를 용해시키고, 생성된 용액중 0.5ml를 상기 제조된 PNA 완충액에 가한다. 이어서 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음 세파덱스 G 25(10mm×300mm, Farmacia corp. 제품)상에서 분리된다. 처음 피크를 나타내는 물질을 모은다. FITC/PNA 비율 : 1.010 mg of peanut lectin (PNA, EY Co, product) is dissolved in 2 ml of 0.01 M phosphate buffer (containing 0.85% NaCl; pH: 7.2). Dissolve 2 mg of FITC (from Sigma Laboratories Inc) in 1 ml of 0.5 M hydrogen carbonate buffer (pH = 9.0) and add 0.5 ml of the resulting solution to the prepared PNA buffer. The mixture is then stirred at room temperature for 2 hours and then separated on Sephadex G 25 (10 mm × 300 mm, Farmacia corp.). Collect the material that initially shows the peak. FITC / PNA Ratio: 1.0

(1)-B FITC-표지된 렉틴(DBA-FITC)의 제조Preparation of (1) -B FITC-labeled lectin (DBA-FITC)

상기 (1) -A에서와 같은 방법으로 DBA(EY Co. 제품)를 사용하여 DBA-FITC를 수득한다. FITC/DBA 비율=0.9DBA-FITC is obtained using DBA (product of EY Co.) in the same manner as in (1) -A. FITC / DBA Ratio = 0.9

(1)-C 대두응집소 -FITC(FITC-SBA) (EY Co. 제품)FITC/SBA 비율=1.4(1) -C soybean coagulant -FITC (FITC-SBA) (product of EY Co.) FITC / SBA ratio = 1.4

(2) 각종 암세포중에서의 GRA의 조재(2) Preparation of GRA in various cancer cells

(a) 배양된 인체 암세포(1×10⁶)를 원심분리조작에 의해 0.85% NaCl를 함유하는 0.05M 트리스염산 완충액(pH=7.2)으로 3회 세척한 다음 여기에 상기 (1)에서 제조된 100μl의 PNA-FITC, DBA-FITC 또는 SBA-FITC(200μg/ml)를 가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분동안 정치시켜서 반응을 야기시킨다. 반응이 완료된 후, 반응혼합물을 0.85% NaCl을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH=7.2)으로 3회 세척한 다음 세포를 유리평판상에 놓고 형광 현미경으로 검사한다.(a) The cultured human cancer cells (1 × 10 ⁶ ) were washed three times with 0.05M tris hydrochloric acid buffer (pH = 7.2) containing 0.85% NaCl by centrifugation and then prepared in (1). Add 100 μl of PNA-FITC, DBA-FITC or SBA-FITC (200 μg / ml). The resulting mixture is allowed to stand for 30 minutes at room temperature to cause a reaction. After the reaction was completed, the reaction mixture was washed three times with 0.01 M phosphate buffer (pH = 7.2) containing 0.85% NaCl, and then the cells were placed on a glass plate and examined by fluorescence microscopy.

결과를 표 1에 기재하였다. 사용되는 암세포는 모두 공지되어 있으며 니이가라대학 의학부 제1병리학 실험실(First pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University)로부터 얻었다.The results are shown in Table 1. The cancer cells used are all known and obtained from the First pathology Laboratories, Medical Department of Niigata University.

[표 1]TABLE 1

(b) 암환자의 악성조직을 스테인레스 스틸 메쉬(# 150)에 통과시켜 단일세포 현탁액을 만든다. 2mM CaCl₂, 2mM MgCl₂및 0.85% NaCl을 함유하는 0.01M 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척한 후 5×10⁵개의 세포를 100μl의 완충액에 재현탁시킨다. 100μl의 FITC-PAN 또는 FITC-DBA (200μg/ml)를 세포 현탁액에 가하고 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한다. 냉 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 형광 현미경으로 검사한다. 결과를 표 2에 기재하였다. 암환자의 악성조직은 칸사이 의과대학(Kansai Medical University)에서 입수한 것이다.(b) The malignant tissue of cancer patients is passed through a stainless steel mesh (# 150) to form a single cell suspension. 5 × 10 ⁵ cells are resuspended in 100 μl of buffer after washing twice with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing ₂ mM CaCl ₂ , 2 mM MgCl ₂ and 0.85% NaCl. 100 μl of FITC-PAN or FITC-DBA (200 μg / ml) is added to the cell suspension and the mixture is incubated for 20 minutes at room temperature. After washing three times with cold PBS, cells are examined under fluorescence microscopy. The results are shown in Table 2. The malignant tissue of cancer patients was obtained from Kansai Medical University.

[표 2]TABLE 2

: "+"는 GRA가 세포 표면상에 나타난 것을 의미한다.: "+" Means GRA appeared on the cell surface.

"-"는 GRA가 세포 표면상에 나타나지 않은 것을 의미함."-" Means that GRA does not appear on the cell surface.

[참조실시예 2]Reference Example 2

GRA의 제조Manufacture of GRA

(1)-A 고정된 렉틴(PNA-세파로오즈)의 제조(1) Preparation of -A Fixed Lectin (PNA-Sepharose)

3g의 CNBr-활성화된 세파로오즈 4B(Farmacia corp. 제품)를 1mM HCl로 충분히 세척하고 200ml의 0.1M 탄산수소나트륨(pH=8.5)에 현탁시킨다. 그후, 20mg의 PNA를 함유하는 5ml의 0.01M 인산염 완충액(pH=8.5)을 가하고 이들을 때때로 교반하면서 25℃에서 2시간 동안 반응시켜 PNA-세파로오즈를 제조한다.3 g of CNBr-activated Sepharose 4B (manufactured by Farmacia corp.) Is thoroughly washed with 1 mM HCl and suspended in 200 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate (pH = 8.5). Thereafter, 5 ml of 0.01 M phosphate buffer (pH = 8.5) containing 20 mg of PNA was added and these were reacted for 2 hours at 25 ° C with occasional stirring to prepare PNA-Sepharose.

(1)-B DBA-세파로오즈의 제조(1) Preparation of -B DBA-Sepharose

PNA 대신에 DBA를 사용하는 것 외에는 상기 (1)-A에서와 동일한 방법으로 DBA-세파로오즈를 수득한다.DBA-Sepharose is obtained in the same manner as in (1) -A, except that DBA is used instead of PNA.

(2) GRA의 제조 :(2) Preparation of GRA:

(a) BT-1(버킷트 임파종) 세포(1.3×10⁸)를 생리식염수로 3회 세척하고 여기에 2% "트리톤 X-100"(Wako Pure Chemical Judustries Ltd. 제품), 0.85% NaCl,2mM NaCl₂및 2mM MgCl₂를 함유하는 30ml의 0.01M 트리스 염산 완충액(pH=7.4)을 가한다. 혼합물 4℃에서 15분동안 교반한 다음 100,000×g의 속도로 초원심분리시킨다. 이렇게하여 수득된 상등용액 28ml중 14ml를 0.1% 트리톤 X-100, 0.85% NaCl, 2mM MgCl₂를 함유하는 트리스 염산 완충액(pH=7.4)으로 평형화시킨 PNA-아가로오즈 비이드(Maruzen Co., Ltd. 제품)로 충진시킨, 친화성 크로마토그라피용 컬럼(직경 0.5, 길이 1cm)에 통과시킨다. 상기에서 사용된 것과 동일한 완충액으로 세척한 후 이를 0.1M 락토오즈, 0.85% NaCl, 2mM NaCl₂, 2mM MgCl₂및 0.1% 트리톤 X-100를 함유하는 0.01M 트리스 염산 완충액(pH=7.4)으로 용출시킨다. 이렇게하여 용출된 부분을 0.85% NaCl, 2mM MgCl₂및 2mM NaCl₂를 함유하는 0.01M 트리스 염산 완충액으로 48시간 동안 투석하여 17ml의 GRA용액을 수득한다.(a) BT-1 (bucket lymphoma) cells (1.3 × 10 ⁸ ) were washed three times with physiological saline, followed by 2% “Triton X-100” from Wako Pure Chemical Judustries Ltd., 0.85% NaCl, 30 ml of 0.01 M Tris hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing ₂ mM NaCl ₂ and 2 mM MgCl ₂ are added. The mixture is stirred at 4 ° C. for 15 minutes and then ultracentrifuged at a rate of 100,000 × g. 14 ml in 28 ml of the supernatant thus obtained was equilibrated with Tris hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.1% Triton X-100, 0.85% NaCl, 2 mM MgCl ₂ (Maruzen Co., Ltd.) and passed through a column for affinity chromatography (diameter 0.5, length 1 cm). After washing with the same buffer as used above, it was eluted with 0.01M Tris hydrochloric acid buffer (pH = 7.4) containing 0.1M lactose, 0.85% NaCl, 2mM NaCl ₂ , 2mM MgCl ₂ and 0.1% Triton X-100 Let's do it. The eluted portion was then dialyzed with 0.01 M Tris hydrochloric acid buffer containing 0.85% NaCl, 2 mM MgCl ₂ and 2 mM NaCl ₂ for 48 hours to obtain 17 ml of GRA solution.

GRA 용액을 사용하여 단백질의 양 및 당의 양을 각각 폴린-로우리법(Folin-Lowry method) 및 페놀-황산법으로 측정하면 각각 644μg 및 120μg인 것으로 나타난다. 이것을 이후에서는 "GRA-1"으로 칭한다.The amount of protein and the amount of sugar using the GRA solution were determined to be 644 μg and 120 μg, respectively, by the Folin-Lowry method and the phenol-sulfuric acid method, respectively. This is hereinafter referred to as "GRA-1".

(b) C 3 H/He 마우스 유방암 종양(MMT) 세포(1×10₁₀)를 생리식염수로 3회 세척하고, 여기에 2% 트리톤 X-100, 0.85% NaCl, 2mM CaCl₂및 2mM MgCl₂를 함유하는 0.01M 트리수 염산완충액(pH=7.4) 30ml를 가한다. 혼합물을 4℃에서 30분동안 교반한다. 계속해서 혼합물을 100,000×g의 속도로 2시간 동안 초원심분리시키고 상등액은 0.85% NaCl, 2mM CaCl₂및 2mM MgCl₂를 함유하는 0.1M 트리스 염산완충액(pH=7.4)으로 밤새 투석시킨다. 이와 같이 투석시킨 액체를 3ml로 농축시킨 다음 그중 1ml를 0.005% 트리톤 X-100, 0.85% NaCl, 2mM CaCl₂및 2mM MgCl₂를 함유하는 트리스 염산완충액(pH=7.4)으로 평형화시킨 상기에서 사용된 것과 동일한 PNA-세파로오즈로 충전시킨, 친화성 크로마토그라피용 컬럼(직경 0.5, 길이 2cm)에 통과시킨다. 상기에서 사용된 것과 동일한 완충액으로 충분히 세척한 후, 0.1M 락토오즈, 0.85% NaCl, 2mM CaCl_2,2mM MgCl₂및 0.005% 트리톤 X-100 을 함유하는 0.01M 트리스 염산완충액(pH=7.4)로 용출시키고, 이와 같이 용출된 부분을 0.85% NaCl, 2mM CaCl₂및 2mM MgCl₂를 함유하는 0.01M 트리스 염산완충액 (pH=7.4)으로 48시간 동안 투석시켜 2ml의 GRA용액을 수득한다. 이와 같이 수득된 GRA 용액에 있어서, 단백질의 양 및 당의 양은 각각 156μg 및 94μg이다. 이것을 이후에서는 "GRA-M-1"으로 칭한다.(b) C 3 H / He mouse breast cancer tumor (MMT) cells (1 × 10 ₁₀ ) were washed three times with physiological saline, followed by 2% Triton X-100, 0.85% NaCl, 2mM CaCl ₂ and 2mM MgCl ₂ 30 ml of 0.01 M triwater hydrochloric acid buffer solution (pH = 7.4) was added. The mixture is stirred at 4 ° C. for 30 minutes. The mixture is then ultracentrifuged for 2 hours at a rate of 100,000 × g and the supernatant is dialyzed overnight with 0.1 M Tris hydrochloride buffer (pH = 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 2 mM MgCl ₂ . The dialysis liquid was concentrated to 3 ml and then 1 ml of which was equilibrated with Tris hydrochloride buffer (pH = 7.4) containing 0.005% Triton X-100, 0.85% NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 2 mM MgCl ₂ . Pass through a column for affinity chromatography (diameter 0.5, length 2 cm), packed with the same PNA-Sepharose. After sufficient washing with the same buffer as used above, with 0.01M Tris hydrochloride buffer (pH = 7.4) containing 0.1M lactose, 0.85% NaCl, 2mM CaCl _2, 2mM MgCl ₂ and 0.005% Triton X-100 Eluted and the eluted portion was dialyzed with 0.01 M Tris hydrochloric acid buffer solution (pH = 7.4) containing 0.85% NaCl, 2 mM CaCl ₂ and 2 mM MgCl ₂ for 48 hours to give 2 ml of GRA solution. In the GRA solution thus obtained, the amount of protein and the amount of sugar are 156 μg and 94 μg, respectively. This is hereinafter referred to as "GRA-M-1".

(c) 약 120g(중량)의 KATO-Ⅲ을 waring 혼합기내에서 100ml의 PBS 증에 균질화시킨다. 100,000×g로 1시간 동안 원심분리한 후, 펠렛을 0.15M NaCl을 함유하는 0.01M 트리스 HCl 완충액(pH=7.6) 중의 100ml의 2% 트리톤 X-100에 용해시킨다. 100,000×g로 1시간 동안 원심분리하여 모든 상등액을 0.15M NaCl을 함유하는 0.01M 트리스 HCl(pH=7.6)중의 0.015% 트리톤 X-100으로 평형화시킨 PNA-세파로오즈 4B컬럼(0.8×15cm)에 적재한다. 50ml의 완충액으로 세척한 후, GRA를 0.1M 락토오즈를 함유하는 완충액으로 용출시킨다. 용출된 GRA를 0.85% NaCl(Sephadex PharmaciaCo)에 대해 투석시킨 다음 사용할때 까지 -20℃에서 저장한다.(c) Approximately 120 g (weight) of KATO-III is homogenized to 100 ml of PBS thickening in a waring mixer. After centrifugation at 100,000 × g for 1 hour, the pellet is dissolved in 100 ml of 2% Triton X-100 in 0.01 M Tris HCl buffer (pH = 7.6) containing 0.15 M NaCl. PNA-Sepharose 4B column (0.8 × 15 cm) equilibrated with 0.015% Triton X-100 in 0.01 M Tris HCl (pH = 7.6) containing 0.15 M NaCl by centrifugation at 100,000 × g for 1 hour. Load on. After washing with 50 ml of buffer, the GRA is eluted with a buffer containing 0.1 M lactose. Eluted GRA is dialyzed against 0.85% NaCl (Sephadex PharmaciaCo) and then stored at -20 ° C until use.

상기 (a)에서와 같은 방법으로 측정한 단백질 및 당의 양은 각각 2.0mg 및 0.8mg이었다. 이것을 이수에서는 "GRA-2"로 칭한다.The amounts of protein and sugar measured in the same manner as in (a) were 2.0 mg and 0.8 mg, respectively. This is called "GRA-2" in this lesson.

(d) 상기 (c)에서와 동일한 방법으로 다음의 GRA시료를 수득한다.(d) In the same manner as in (c), the following GRA sample is obtained.

[표 3]TABLE 3

(e) KATO-Ⅲ대신에 1GRA(약 29g)를 사용하고, PNA-세파로오즈 4B 대신에 상기(1)-B에서 수득된 DBA-세파로오즈를 사용하고 용출을 N-아세틸갈락토오즈아민을 사용하여 수행하는 것 외에는, 상기 (c)에서와 동일한 방법으로, 단백질 0.03mg을 함유하는 GRA제제를 수득한다. 이것을 이후에서는 "GRA -8"로 칭한다.(e) 1GRA (about 29 g) instead of KATO-III, DBA-Sepharose obtained in (1) -B instead of PNA-Sepharose 4B, and elution was performed using N-acetylgalactose A GRA preparation containing 0.03 mg of protein is obtained in the same manner as in (c), except that the amine is used. This is hereinafter referred to as "GRA-8".

(f) 상기 (d)에서 제조된 GRA-3(5ml)을 DBA-세파로오즈 컬럼에 넣고 트리스-HCL완충액(0.015%, 트리톤 X-100, 2mM MgCl₂, CaCl₂0.85% NaCl)으로 용출시켜 4ml 분획 1 내지 12를 수득한다. 분획 1 내지 3은 "GRA-3-A"이고, 분획 4 내지 12는 "GRA-3-B"라 칭한다. 컬럼을 0.1M N-아세틸갈락토오즈아민을 추가로 함유하는 도일한 완충액으로 용출시켜 분획을 수득한 다음, 이것을 "GRA-3-C"로 칭한다.(f) GRA-3 (5 ml) prepared in (d) was added to a DBA-Sepharose column and eluted with Tris-HCL buffer (0.015%, Triton X-100, 2 mM MgCl ₂ , CaCl ₂ 0.85% NaCl). To give 4 ml fractions 1 to 12. Fractions 1 to 3 are "GRA-3-A" and fractions 4 to 12 are referred to as "GRA-3-B". The column is eluted with a Dole buffer further containing 0.1M N-acetylgalactoseamine to give a fraction, which is then referred to as "GRA-3-C".

(g) SDS 겔 전기영동(g) SDS gel electrophoresis

상기 여러방법에 따라 제조된 각 GRA 제제를 문헌 [Fairbanks et al., Biochemistry Vol 10P, 2606, 1971]에 기술된 방법에 따라 전기영동 시킨다.Each GRA formulation prepared according to the various methods is electrophoresed according to the methods described in Fairbanks et al., Biochemistry Vol 10P, 2606, 1971.

수득된 결과를 제18도내지 제22도에 나타내었다. 제18도 내지 제19도에서 숫자 1 내지 5의 의미는 다음과 같다.The results obtained are shown in FIGS. 18 to 22. The meanings of the numbers 1 to 5 in FIGS. 18 to 19 are as follows.

1- - - - - - 표준물질 ; 2 - - - - - - GRA-M-3 ; 3 - - - GRA-7 ; 4 - - - - - GRA1 ; 및 5 - - - - - - GRA-2.1------standard material; 2------GRA-M-3; 3---GRA-7; 4-----GRA1; And 5------GRA-2.

제20도에서 숫자 1 내지 4의 의미는 다음과 같다.The meanings of the numbers 1 to 4 in FIG. 20 are as follows.

1 - - - - 표준물질 ; 2 - - - GRA- M-2 ; 3 - - - GRA-6 ; 4 - - - - GRA-5.1----standard material; 2---GRA- M-2; 3---GRA-6; 4----GRA-5.

제21도에서 숫자 1내지 3의 의미는 다음과 같다.The meanings of the numbers 1 to 3 in FIG. 21 are as follows.

1 - - - - GRA-m-4 ; 2 - - - GRA-M5 ; 3 - - - 표준물질.1----GRA-m-4; 2---GRA-M5; 3---Standard.

제22도에서 숫자 1 내지 4의 의미는 다음과 같다In FIG. 22, the meanings of the numbers 1 to 4 are as follows.

1 - - - GRA-3- ; 2 - - - GRA-3-A ; 3 - - - GRA-3-B ; 4 - - - GRA-3-C.1---GRA-3-; 2---GRA-3-A; 3---GRA-3-B; 4---GRA-3-C.

제18도는 C.B.B.방법[참조 : Fairbanks et al., Biochemistry Vol. 10P.2606, 1971]에 따라 단백질 염색 반응시킨 GRA의 상태를 나나낸 것이다. 제19도 내지 제21도는 PAS방법 [참조 : R.M.Zacharius et al., Anal. Biochem. Vol 30P. 148(1982)]에 따라 당 착색 반응시킨 GRA의 상태를 나타낸 것이다. 제22도는 상술한 CBB방법에 따라 염색 반응시킨 결과를 도식적으로 나타낸 것이다.18 shows the C.B.B.method [Fairbanks et al., Biochemistry Vol. 10P. 2606, 1971] shows the state of GRA protein stained. 19-21 shows the PAS method [R.M. Zacharius et al., Anal. Biochem. Vol 30P. 148 (1982)] shows the state of GRA reacted with sugar coloring. Figure 22 schematically shows the result of the dyeing reaction according to the CBB method described above.

표준물질로는 미합중국 캘리포니아 소재의 바이오래드 실험실(Biorad Lab.)에서 입수하여 사용하며 다음과 같다.The standard material is obtained from Biorad Lab. Of California, USA and used as follows.

200K 달톤 : 마이오신 66.2K 달톤 : BSA200K Dalton: Myosin 66.2K Dalton: BSA

116K 달톤 :β-갈락토시다제 45K 달톤 : 오브알부민116K Dalton: β-galactosidase 45K Dalton: Ovalbumin

92.5K 달톤 : 포스포릴라제 21.5K 달톤 : 대두 트립신 억제제92.5K Dalton: phosphorylase 21.5K Dalton: soybean trypsin inhibitor

[참조실시예3]Reference Example 3

TCGF의 제조Preparation of TCGF

(a) 일본산 원숭이의 비장(4kg)(Japan Plymates Co., Ltd.로부터 입수)을 절제하여 RPMI-1640배양배지(Flow Laboratory Co., Ltd.제품)로 2회 세척한다. 세포를 메쉬(Millpore Inc.제품, 150메쉬)를 사용하여 여과하고 비중 원심분리(비중, 1.076)시켜서 2×10⁹/ml의 임파구를 2l를 수득한다. 이렇게하여 수득된 임파구를 RPMI-1640배양배지로 3회 세척하고 10% FCS를 함유하는. 상기에서 사용된 것과 동일한 배지를 사용하여 임파구의 수를 5×10⁷/ml로 조정한다. 그후 이산화탄소 발효 장치중 37℃에서 1시간 동안 방치한다. 상등 임파구를 회수하여 임파구의 수를 1% FCS를 함유하는, 상기에서 사용된 것과 동일한 배양배지를 사용하여 1×10⁶/ml로 조정한다. 계소해서, 1μg/ml의 인도메타신(Sigma Laboratories Inc. 제품) 및 0.2% PHA-P(Difco Co. 제품)를 가하고, 이들을 이산화탄소 가스 발효장치중 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 10분 동안 원심분리(3000rpm)을 하고, 생성된 상등액을 회수하여 Millipore 여과기(Millipore Inc. 제품, 0.2μm)로 여과 멸균하여 2l의 TCGF를 수득한다.(a) Spleen (4 kg) (obtained from Japan Plymates Co., Ltd.) of Japanese monkeys is excised and washed twice with RPMI-1640 culture medium (manufactured by Flow Laboratory Co., Ltd.). Cells are filtered using a mesh (Millpore Inc., 150 mesh) and centrifuged (specific gravity, 1.076) to give 2 l of lymphocytes at 2 x 10 ⁹ / ml. The lymphocytes thus obtained were washed three times with RPMI-1640 culture medium and containing 10% FCS. Adjust the number of lymphocytes to 5 × 10 ⁷ / ml using the same medium as used above. It is then left to stand at 37 ° C. for 1 hour in a carbon dioxide fermentation apparatus. The upper lymphocytes are harvested and the number of lymphocytes is adjusted to 1 × 10 ⁶ / ml using the same culture medium as used above containing 1% FCS. In total, 1 μg / ml of indomethacin (manufactured by Sigma Laboratories Inc.) and 0.2% PHA-P (manufactured by Difco Co.) are added and they are incubated for 48 hours at 37 ° C. in a carbon dioxide gas fermentor. Centrifugation (3000 rpm) for 10 minutes, the resulting supernatant is recovered and filtered sterilization with a Millipore strainer (Millipore Inc., 0.2 μm) to give 2 l of TCGF.

(b) TCGF의 공급원은 건강한 10사람의 공급자에서 채취한 혼합 배양한 말초혈액 임파구의 상등액이다. CF[Conray. Ficol(Japan Immunoresearch Co.)]에서 제조한 플라스틱 표면상의 37℃에서 1시간 동안 흡착시킴으로써 분리된 임파구인 비0흡착성 임파구를 1% FCS(1.5×10⁶세포/ml)를 함유하는 RPMI 1640배지에 현탁시킨 다음, 0.2% PHA-P, 인도메타신(1μg/ml), 및 미토마이신(50μm/ml)로 전처리한 인체 B-셀 라인(BT-1)(1.5×10⁵세포/ml)과 함께 배양한다. 48시간 후, 배양된 상등액을 수거하고 TCGF 공급원으로서 사용한다. [참조 : H.Inoue et al, Scand J.Immunol.12 P.149-154(1980)](b) The source of TCGF is the supernatant of mixed cultured peripheral blood lymphocytes taken from 10 healthy suppliers. CF [Conray. Non-adsorbable lymphocytes, which are lymphocytes isolated by adsorption at 37 ° C. for 1 hour on a plastic surface manufactured by Ficol (Japan Immunoresearch Co.), were placed on RPMI 1640 medium containing 1% FCS (1.5 × 10 ⁶ cells / ml). Suspended, followed by human B-cell line (BT-1) (1.5 × 10 ⁵ cells / ml) pretreated with 0.2% PHA-P, indomethacin (1 μg / ml), and mitomycin (50 μm / ml); Incubate together. After 48 hours, the cultured supernatant is harvested and used as a TCGF source. H. Inoue et al, Scand J. Immunol. 12 P. 149-154 (1980)]

[참조실시예4]Reference Example 4

임파구의 제조Preparation of lymphocytes

(1) 인체말초혈액 임파구(1) human peripheral blood lymphocytes

헤파린 처리에 의해 건강한 성인 또는 각종 암환자로부터 채취한 혈액(50ml)을 피콜팩(Farmacia Japan Co., Ltd. 제품)을 상용하여 원심분리시켜 5×10⁷개의 말초혈액 임파구를 수득한다.Blood (50 ml) collected from a healthy adult or various cancer patients by heparin treatment was commercially centrifuged with Ficollpack (manufactured by Farmacia Japan Co., Ltd.) to obtain 5 × 10 ⁷ peripheral blood lymphocytes.

(2) 마우스 비장 임파구(2) mouse spleen lymphocyte

C 3 H/He 마우스(수컷, 생후 6주)의 비장을 절제해서 RPMI-1640 배양배지로 2회 세척한다. 그후 비장을 주사바늘로 흐트러뜨려서 스테인레스 스틸 스크린(100메쉬)에 통과시켜 커다란 조각들은 제거한다. 이와 같이 여과된 세포를 상기에서 사용된 것과 동일한 배양배지로 2회 세척하고 1200rpm으로 10분 동안 원심분리하여 4×10⁷개의 비장임파구를 수득한다.Spleens of C 3 H / He mice (male, 6 weeks old) are excised and washed twice with RPMI-1640 culture medium. The spleen is then displaced with a needle and passed through a stainless steel screen (100 mesh) to remove large pieces. The cells thus filtered are washed twice with the same culture medium as used above and centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes to obtain 4 × 10 ⁷ spleen lymphocytes.

[실시예 1]Example 1

참조실시예 2[(2)-(a)]에서 수득된 GRA-1(단백질의 양:40μg.ml ; 당의 양 : 7.5μg.ml)을 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배양배지로 원용적의 1000배로 희석하여 감작화 배양배지를 제조한다.GRA-1 (Amount of protein: 40 μg.ml; Sugar: 7.5 μg.ml) obtained in Reference Example 2 [(2)-(a)] was transferred to an RPMI-1640 culture medium containing 15% FCS. The sensitized culture medium is prepared by diluting to 1000 times the volume.

참조실시예 4(1)에서 수득된 인체말초 혈액임파구(5×10⁶/5ml)를 실험실 접시상에 놓여진, 상기에서 제조된 5ml의 감작화 배양배지에 가하고 37℃에서 2일 동안 배양한다. 이들을 참조실시예 3에서 수득된, 20% TCGF 및 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배양배지중에서 5일 동안 더 배양하여 ml당 1×10⁶개의 킬러세포를 함유하는 킬러세포용액 20ml를 수득한다. 이것을 이후에서는 "GRA-1-K-T"로 칭한다.Reference Example 4 (1) laboratory human peripheral blood lymphocytes (5 × 10 ⁶ / 5ml) obtained in placed on the plate, was added to the sensitization the culture medium of a 5ml prepared above and incubated for 2 days at 37 ℃. These were further incubated for 5 days in RPMI-1640 culture medium containing 20% TCGF and 15% FCS, obtained in Reference Example 3, to obtain 20 ml of killer cell solution containing 1 × 10 ⁶ killer cells per ml. . This is hereinafter referred to as "GRA-1-KT".

[실시예 2]Example 2

참조실시예 4((2))에서 수득된 마우스 비장 임파구의 수는 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640배양배지를 사용하여 5×10⁶/ml로 조정한다. 참조실시예 2[(2)-(B)]에서 수득된 GRA-M-1을 첨가하여 단백질 및 당의 최종양이 각각 1.5μg/ml 및 0.9μg/ml가 되게 한다. 생성된 혼합물중 5ml를 실험실용 접시(60mm×15mm)(Falcon Co. 제품)상의 37℃에서 2일간 도안 배양한다. 클로닝의 형성이 관찰된다. 클로닝 형성 부분을 TCGF(Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd제품) 20 용적%를 함유하는 15% FCS의 RPMI01640 배양배지중에서 4일 동안 더 배양하여 ml당 1×10⁶개의 킬러세포를 함유하는 킬러세포용액 50ml를 수득한다. 이것을 이후에서는 "GRA-M-1-K-T"로 칭한다.The number of mouse spleen lymphocytes obtained in Reference Example 4 ((2)) is adjusted to 5 × 10 ⁶ / ml using RPMI-1640 culture medium containing 15% FCS. GRA-M-1 obtained in Reference Example 2 [(2)-(B)] is added to bring the final amounts of protein and sugar to 1.5 μg / ml and 0.9 μg / ml, respectively. 5 ml of the resulting mixture is incubated for 2 days at 37 ° C. on a laboratory dish (60 mm × 15 mm) (Falcon Co.). The formation of cloning is observed. The cloning forming part was further cultured in RPMI01640 culture medium of 15% FCS containing 20% by volume TCGF (Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd.) for 4 days, and killer cells containing 1 × 10 ⁶ killer cells per ml. 50 ml of solution are obtained. This is hereinafter referred to as "GRA-M-1-KT".

[실시예 3]Example 3

건강한 사람의 말초 혈액임파구(5×10⁶)를 50ng/ml(단백질 함량)의 GRA-2 및 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지중, 37℃에서 배양한다. 2일째에 상술한 인체 TCGF를 농도가 20%에 달할때까지 배지에 가한 다음 3일간 동안 계속해서 배양하여 킬러세포를 수득한다. 이것을 이후에서는 "GRA-2-K-T"로 칭한다.Peripheral blood lymphocytes (5 × 10 ⁶ ) of healthy persons are incubated at 37 ° C. in RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) of GRA-2 and 15% FCS. On the second day, the above-described human TCGF is added to the medium until the concentration reaches 20%, and then continuously cultured for 3 days to obtain killer cells. This is hereinafter referred to as "GRA-2-KT".

[실시예 4]Example 4

킬러세포 제제 GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T 및 GRA-3-C-K-T를, 각각 GRA-8, GRA-3-A 및 GRA-3-C(단백질함량 : 50ng/ml) 및 참조실시예3-(b)에서 수득된 TCGF를 사용하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조한다.Killer cell preparations GRA-8-KT, GRA-3-AKT and GRA-3-CKT, respectively, GRA-8, GRA-3-A and GRA-3-C (protein content: 50 ng / ml) and Reference Examples Prepared in the same manner as in Example 1 using TCGF obtained in 3- (b).

[실시예 5]Example 5

C2H/He 마우스(암컷, 생후 8주)를 동일 균주의 X 5563 세포(10⁶로 피내 이식한 다음 7일후에 종양을 수술하여 절제한다. 다시 7일후 동일 균주가 X 5563(10⁵)를 접종하고 접종에 대해 내성을 갖는 마우스를 면역마우스라 칭한다. 면역 마우스 및 C3H/He 정상 마우스의 비장 세포를 통상의 방법에 따라 제조한다.C2H / He mice (female, 8 weeks old) are implanted intradermally with X 5563 cells (10 ⁶ ) of the same strain and then surgically excised after 7 days.The same strain is inoculated with X 5563 (10 ⁵ ) 7 days later. And mice resistant to inoculation are referred to as immuno mice Spleen cells of immune mice and C3H / He normal mice are prepared according to conventional methods.

비장 세포 (5×10⁶/웰)를 각각 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지중의 40ng/ml(단백질함량)의 GRA-M-5로 5일 동안 감작시켜 킬러세포를 수득한다.Splenocytes (5 × 10 ⁶ / well) are sensitized for 5 days with 40ng / ml (protein content) of GRA-M-5 in RPMI-1640 medium, each containing 15% FCS, to give killer cells.

정상 비장세포로 부터 수득한 킬러세포 제제를 하기에는 "GRA-M-5-K-T-1"이라 칭하고 면역 비장세포로 부터 수득한 킬러세포 제제는 "GRA-M-5-K-T-2"로 칭한다.Killer cell preparations obtained from normal splenocytes are referred to below as "GRA-M-5-K-T-1" and killer cell preparations obtained from immune splenocytes are referred to as "GRA-M-5-K-T-2".

[실시예 6]Example 6

인체 말초 혈액 임파구(5×10⁶)를 5ng/ml(단백질 함량)의 GRA-1을 함유하는 5ml의 RPMI-1640 배지중 37℃에서 2일 동안 배양한다. 3일째에, 임파구를, 임파구 공여체로 부터 채취한 10% 혈청 및 0 내지 100ng/ml(단백질함량)의 GRA-1을 함유하는 RPMI-1640배지에 옮긴 다음 5일 동안 계속하여 배양하여 다음 표 4와 같은 킬러 세포 제제를 수득한다.Human peripheral blood lymphocytes (5 × 10 ⁶ ) are incubated for 2 days at 37 ° C. in 5 ml of RPMI-1640 medium containing 5 ng / ml (protein content) of GRA-1. On day 3, lymphocytes were transferred to RPMI-1640 medium containing 10% serum and 0-100 ng / ml (protein content) of GRA-1 from lymphocyte donors, followed by incubation for 5 days, following Table 4 Obtain a killer cell preparation such as

[표 4]TABLE 4

GRA 농도(ng/ml)GRA concentration (ng / ml)

[실시예 7]Example 7

(a) 각종 암환자로 부터 채취한 말초혈액 임파구(PBL)를 GRA-3로 감작시켜 킬러세포 제제를 수득한다. 환자들로 부터 채취한 PBL(5×10⁶)을 50ng/ml(단백질함량)의 GRA-3를 함유하는 RPMI-1640 배지중에서 2일 동안 배양한 다음 20% TCGF 및 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640배지중에서 5일 동안 더 배양하여 하기표 5와 같은 킬러세포를 수득한다.(a) Peripheral blood lymphocytes (PBL) collected from various cancer patients were sensitized with GRA-3 to obtain a killer cell preparation. PBLs (5 × 10 ⁶ ) taken from patients were incubated in RPMI-1640 medium containing 50ng / ml (protein content) of GRA-3 for 2 days and then RPMI containing 20% TCGF and 15% FCS. Further culturing for 5 days in -1640 medium to obtain killer cells as shown in Table 5.

[표 5]TABLE 5

말초혈액임파구Peripheral Blood Lymphocytes

상기표에서, P-GRA 및 D-GRA는 참조실시예 1,2-(b)에서와 동일한 방법으로 측정한 바와 같이 PBL을 채취한 암환자의 악성 조직(수술에 의해 절제함)상에 나타난 GRN의 소재를 나타낸 것이다. P-GRA 및 D-GRA는 가기각 FITC-PNA 및 FITC-DBA를 사용하여 수득한 결과이다. 조작 후의 일수는 조작 후에 PBL을 채취한 시간을 나타낸 것이다.In the table above, P-GRA and D-GRA were shown on malignant tissue (resected by surgery) of cancer patients from whom PBLs were collected as measured in the same manner as in Reference Examples 1,2- (b). It shows the material of GRN. P-GRA and D-GRA are the results obtained using cut angle FITC-PNA and FITC-DBA. The number of days after the operation indicates the time at which the PBL was collected after the operation.

(b) 조작한지 21후에 유함 환자로 부터 채취한 PBL (5×10⁶)을 50ng/ml(단백질함량)의 GRA-3, 및 동한자로 부터 채취한 10% 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지중에서 7일도안 배양하여 PBL을 감작화시켜 킬러세포 제제를 수득한다. 이것을 이후에서는 "GRA-3-K-T-7"로 칭한다.(b) RPMI-1640 medium containing 50 ng / ml (protein content) of GRA-3 at 10 ng serum from PBL (5 × 10 ⁶ ) taken from the patient and 21% serum from the same Chinese. Incubated for 7 days to sensitize PBL to obtain a killer cell preparation. This is hereinafter referred to as "GRA-3-KT-7".

[실시예 8]Example 8

실시예 1에서 수득된 GRA-1-K-T(10⁸)를 10ml의 생리식염수 용액에 용해시켜서 주사용액을 제조한다.GRA-1-KT (10 ⁸ ) obtained in Example 1 was dissolved in 10 ml of physiological saline solution to prepare an injection solution.

[실시예 9]Example 9

(i) 참조실시예 2((2)-(b))에서 수득된 GRA-M-1을 당 및 단백질의 양이 각각 1.0μg/ml 및 1.6μg/ml가 되도록 생리식염수로 희석하여 항암제 제 1 호를 제조한다.(i) GRA-M-1 obtained in Reference Example 2 ((2)-(b)) was diluted with physiological saline so that the amounts of sugar and protein were 1.0 μg / ml and 1.6 μg / ml, respectively. 1 is prepared.

(ii) C3H/He 자연발생 유방암의 종류(腫瘤)를 멸균적으로 5mm입방체 덩어리로 절제하여 상기와 동일한 종의 C3H/He 마우스(수컷, 생후 7주) 10마리 각각의 등피부에 이식한다. 이식한지 7일 후에, 종양의 고정 및 증식을 확인한다. 마우스중 5마리에 대해서는 상기(i)에서 제조된 항암제 제 1 호를 2일간격으로 1일 300ml의 용량을 피하 투여한다. 나머지 5마리의 마우스는 비처리 대조군으로 사용한다. 최초 투여 10일 수, 종양을 수술하여 절제하고 평균 체중을 측정한다. 동시에 병리조직을 검사한다.(ii) A type of C3H / He spontaneous breast cancer is sterilely excised into a 5 mm cube mass and implanted into each back skin of 10 C3H / He mice (male, 7 weeks old) of the same species. Seven days after transplantation, the fixation and proliferation of the tumors are confirmed. For five mice, the anticancer agent No. 1 prepared in (i) was administered subcutaneously at a dose of 300 ml per day for two days. The remaining five mice are used as untreated controls. Ten days after the first dose, the tumor is surgically resected and the average body weight is measured. At the same time, pathology is examined.

종양 용량 :Tumor Dose:

투여된 그룹 22.3mm³(제14도)Dosed group 22.3 mm ³ (FIG. 14)

대 조 군 162.7mm³(제15도)Control group 162.7 mm ³ (15 degrees)

이것은 종양이 86.3% 감소되었음을 의미한다.This means that tumors were reduced by 86.3%.

병리조직학적 검사 : 대조군(제16도)에서는 암의 새둥지체가 형성되며 조직의 형태는 수질성 소관암과 유사하며 종양세포의 증식이 조직 전체에 걸쳐 관찰된다. 반면, 약제가 투여된 군(제17도)에서는 암세포가 형성된 부위에서 액화 괴사를 야기시키고 석회침착 및 섬유침착이 일어나며 단지 매우 한정된 양의 암세포만이 남아 있다. 따라서 본 발명의 항암제의 항종양 활성이 관찰된다.Histopathological examination: In the control group (Fig. 16), a bird's nest is formed, and the shape of the tissue is similar to that of the medulla ductal carcinoma, and the proliferation of tumor cells is observed throughout the tissue. On the other hand, in the group to which the medicament was administered (FIG. 17), liquefied necrosis occurs at the site where cancer cells are formed, lime deposition and fiber deposition occur, and only a very limited amount of cancer cells remain. Therefore, antitumor activity of the anticancer agent of the present invention is observed.

[시험실시예 1][Test Example 1]

실시예 1에서 수득된 GRA-1-K-T(1μl)를 미소평판(Falon Corp, 제품)상에 놓고 실온에서 15분 동안 방치한다. 이어서, 4μl의 FCS(Falcon Corp, 제품)를 가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 방치한다. 뉴라미니다제- 처리된 양의 적혈구(SRBCN)의 수를 1×10⁹/ml로 조정하고 여기에 0.85% NaCl을 함유하는 0.01M인산염 완충액(pH=7.2) 5μl를 가한 다음, 평판을 6000rpm의 속도로 5분 동안 원심분리 시킨다. 이어서 평판을 회수하여 비처리 SRBCN을 제거한다. 염료 용액(Brilliant Cresyl Blue Merck&Co. 제품)을 가하여 임파구를 염색하고 로제트형성 양성을 관찰한다. 결과로서, 적어도 98%가 로제트형성 양성을 나타내는 것으로 나타났다(T-세포).GRA-1-KT (1 μl) obtained in Example 1 is placed on a microplate (Falon Corp, product) and left at room temperature for 15 minutes. 4 μl of FCS (Falcon Corp, product) is then added and the mixture is left at room temperature for 30 minutes. Adjust the number of neuraminidase-treated amounts of red blood cells (SRBCN) to 1 × 10 ⁹ / ml, add ⁵ μl of 0.01 M phosphate buffer (pH = 7.2) containing 0.85% NaCl, and then plate 6000 rpm. Centrifuge for 5 minutes at speed. The plate is then recovered to remove untreated SRBCN. Add dye solution (Brilliant Cresyl Blue Merck & Co.) to stain lymphocytes and observe positive rosette formation. As a result, at least 98% were found to be rosette positive (T-cells).

[시험실시예 2][Test Example 2]

특히암세포 파괴활성Cancer cell destruction

(a) 표 1에 기재된 세포중에서 서로 다른 GRA 양성비율을 갖는 다음의 5가지 세포를 인체표적 암세포로 사용한다.(a) The following five cells having different GRA positive ratios among the cells shown in Table 1 are used as human target cancer cells.

표적 암세포Target cancer cells

No. 1 BT-1 (버킷트 임파종)No. 1 BT-1 (Bucket Lymphoma)

No. 2 Daudi (버킷트 임파종)No. 2 Daudi (bucket lymphoma)

No. 3 KATO-III (위암)No. 3 KATO-III (Stomach Cancer)

No. 4 MKN-45 (위암)No. 4 MKN-45 (Stomach Cancer)

No. 5 MOLT (T세포성백혈병)No. 5 MOLT (T Cell Leukemia)

미소평판(Falcon Corp. 제품)상에서 800rpm의 속도로 5분 동안 원심분리하여 웰당 표적 암세포 5×10⁴개를 적충시킨다. 이어서 웰당, 실시예 1에서 수득된 GRA-1-K-T 4×10³개를 완화하게 가하고 1시간 동안 배양한다.Centrifuge for 5 min at 800 rpm on a microplate (Falcon Corp.) to load 5 x 10 ⁴ target cancer cells per well. Then, per well, 4 × 10 ³ GRA-1-KT obtained in Example 1 are added gently and incubated for 1 hour.

파괴활성은 플라크 형성도에 따라 결정되며 다음과 같이 평가된다 :Fracture activity is determined by the degree of plaque formation and is evaluated as follows:

+ + 파괴활성이 상당히 관찰됨.+ + Destructive activity is significantly observed.

+ 파괴활성이 관찰됨.+ Destructive activity is observed.

± 파괴활성이 다소 관찰됨.± Destructive activity is somewhat observed.

- 파괴활성이 관찰되지 않음.No destructive activity was observed.

대조군에서 GRA가 사용되지 않은 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조된 감작되지 않은 인체 말초혈액 임파구를 사용한다. 결과를 표 6에서 기재하였다.Unsensitized human peripheral blood lymphocytes prepared in the same manner as in Example 1 were used except that GRA was not used in the control group. The results are shown in Table 6.

본 발명의 방법에 의해 제조된 킬러T세포는 강력한 특히 세포독성작용을 갖는다.Killer T cells produced by the method of the present invention have a particularly potent cytotoxic action.

[표 6]TABLE 6

(b) 상기(a)에서 사용된 것과 동일한 표적 암세포(3.2×10⁶)를 8×10⁵개의 GRA-1-K-T와 혼합(세포비율 : 5/1)하고 생성된 세포혼합물(총수 : 4×10⁶)을 15% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지중에서 배양한다. 1시간 후 남아있는 세포의 수를 계수하고 다음 방정식으로 세포적성율을 계산한다.(b) The same target cancer cells (3.2 × 10 ⁶ ) as used in (a) above were mixed with 8 × 10 ⁵ GRA-1-KT (cell ratio: 5/1) and the resulting cell mixture (total number: 4 10 ⁶ ) are incubated in RPMI-1640 medium containing 15% FCS. After 1 hour, the number of remaining cells is counted and the cell suitability is calculated by the following equation.

결과를 표7에 기재하였다.The results are shown in Table 7.

[표 7]TABLE 7

세포수Cell count

(c) 표적 암세포에 대한 GRA-1-K-T의 혼합비율을 5/3으로 변화시키는 것을 제외하고는 상기(b)의 방법을 반복한다. 결과를 표 8에 기재하였다.(c) The method of (b) is repeated except that the mixing ratio of GRA-1-K-T to target cancer cells is changed to 5/3. The results are shown in Table 8.

[표 8]TABLE 8

세 포 수Three catchers

상기 시험에서, GRA-1-K-T는 Daudi, KATO-III 및 BT-1에 대해서는 높은 결합 활성을 나타내지만, MKN-45 및 MOLT에 대해서는 낮은 결합 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.In this test, GRA-1-K-T shows high binding activity for Daudi, KATO-III and BT-1, but low binding activity for MKN-45 and MOLT.

[시험 실시예 3][Test Example 3]

C3H/He 자연발생 유방암에 걸린 마우스에게 실시예 2에서 수득된 GRA-M-1-K-T를 격일로 주당 3회 3×10⁶/0.3ml/마우스의 용량으로 피하투여한다. 10일 후 병소를 떼어내어 검사한다.Mice suffering from C3H / He spontaneous breast cancer are subcutaneously administered with GRA-M-1-KT obtained in Example 2 at a dose of 3 × 10 ⁶ /0.3 ml / mouse three times per week. After 10 days, remove the lesion and examine it.

제12도에서 알수 있는 바와 같이 임파구가 암세포속으로 침투하는 현상이 발생하며 종양 부위의 파괴가 관찰된다. 또한 제13도로 부터, 종양부위의 석회침착이 발생함이 관찰되었으며, 따라서 이로부터 본 발명이 킬러세포가 항종양활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.As can be seen in FIG. 12, lymphocytes penetrate into cancer cells and destruction of tumor sites is observed. In addition, from Fig. 13, it was observed that lime deposition of the tumor site occurs, and thus it can be seen from the present invention that the killer cells have antitumor activity.

[비교실시예 1]Comparative Example 1

이 실시예에서는 암세포 그자체를 본 발명의 과정에서 GRA 대신에 특히 항원으로 사용한다.In this example, the cancer cells themselves are used, in particular, as antigens instead of GRA in the course of the present invention.

암세포로 감작된 임파구를, GRA 대신에, BT-1, Daudi, KATO-III 또는 MKN-45를 실험용 접시낭 1×10⁵개의 수준으로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 수득한다.Lymphocytes sensitized with cancer cells were obtained in the same manner as in Example 1 except that, instead of GRA, BT-1, Daudi, KATO-III or MKN-45 was used at 1 × 10 ⁵ levels of experimental dish sacs. do.

이들 임파구를 사용하여 시험실시예 2((a))에서와 동일한 방법으로 세포독성 활성을 검사한다. 결과를 표 9에 기재하였다.These lymphocytes are used to test for cytotoxic activity in the same manner as in Test Example 2 ((a)). The results are shown in Table 9.

표 9로 부터 상기에서 제조된 임파구는 세포독성활성을 전혀 갖지 않음을 알 수 있다.From Table 9 it can be seen that the prepared lymphocytes do not have any cytotoxic activity.

[표 9]TABLE 9

임파구 감작에 사용된 세포Cells used for lymphocyte sensitization

[시험실시예 4][Test Example 4]

시험실시예 2-(b)와 동일한 방법으로, 실시예 4에서 수득된 GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T 및 GRA-3-C-K-T의 암세포 파괴활성을 측정한다. 결과를 표 10에 기재하였다.In the same manner as in Test Example 2- (b), the cancer cell disrupting activity of GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T and GRA-3-C-K-T obtained in Example 4 was measured. The results are shown in Table 10.

[표 10]TABLE 10

세 포 독 성 율 (%)Cell Poisoning Rate (%)

[시험실시예 5][Test Example 5]

a) 실시예 6에서 수득된 킬러세포 제제들이 세포독성은⁵¹Cr 방출시험[참조 : J. Immunol. 122, 2527-2533(1979)]으로 측정할 수 있다. 이는 다음과 같이 수행한다 ; 50μci의 방사성⁵¹Cr(Japan Isotope Association)을 KATO-III(2×10⁷)에 가하고 세포를 RPMI-1640 배지중 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 원심분리로 충분히 세척하여⁵¹Cr로 표지된 표적세포를 수득한다. 킬러세포(작동세포)(2×10⁶)를 표적세포(1×10⁵)에 가하고 (따라서 E/T=20/1), 혼합물을 RPMI-1640 배지중 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 상등액을 원심분리하여 모으고 이의 방사능을 액체 섬광(Scintillation)계수기로 측정한다.a) Cytotoxicity of the killer cell preparations obtained in Example 6 was determined by ⁵¹ Cr release test [J. Immunol. 122, 2527-2533 (1979). This is done as follows; 50 μci of radioactive ⁵¹ Cr (Japan Isotope Association) was added to KATO-III (2 × 10 ⁷ ), and the cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. in RPMI-1640 medium, and then washed sufficiently by centrifugation to target ⁵¹ Cr labeled targets. Obtain the cells. Killer cells (worker cells) (2 × 10 ⁶ ) are added to target cells (1 × 10 ⁵ ) (thus E / T = 20/1) and the mixture is incubated for 4 hours at 37 ° C. in RPMI-1640 medium. The supernatant is collected by centrifugation and its radioactivity is measured by a liquid scintillation counter.

작동 세포의 세포분해 활성에 상응하는 특히⁵¹Cr 방출율(%)은 다음식에 따라 계산한다.Particularly ⁵¹ Cr release rate (%) corresponding to the cytolytic activity of the effector cells is calculated according to the following equation.

특히⁵¹Cr방출율(%)=

×100Especially ⁵¹ Cr release rate (%) =

× 100

(최대방출은 모든 세포가 분해됐을때의 방사능을 나타낸다)(Maximum release represents radioactivity when all cells are broken down)

결과를 표 11에 기재하였다.The results are shown in Table 11.

[표 11]TABLE 11

상기 표 11의 결과로 부터. TCGF 및 FCS는 킬러 세포의 유도와는 관계가 없음을 알 수 있다.From the results in Table 11 above. It can be seen that TCGF and FCS are not related to the induction of killer cells.

b) 실시예 3에서 수득된 GRA-2-K-T의 세포독성은 상기(a)와 동일한 방법으로⁵Cr-표지된 KATO-III의 특히⁵¹Cr 방출율은 14.3%로 나타났다.b) The cytotoxicity of GRA-2-KT obtained in Example 3 was found to be 14.3%, especially ⁵¹ Cr release rate of ⁵ Cr-labeled KATO-III in the same manner as in (a) above.

[시험실시예 6][Test Example 6]

a) 표적세포로서 KATO-III(E/T=20/1)을 사용하여 실시예 7-(a)에서 수득된 킬러세포의 세포독성을 시험실시예 2-(b)와 동일한 방법으로 측정한다. 결과를 표12에 기재하였더.a) Cytotoxicity of the killer cells obtained in Example 7- (a) using KATO-III (E / T = 20/1) as target cells was measured in the same manner as in Test Example 2- (b) . The results are shown in Table 12.

[표 12]TABLE 12

b) 실시예 7-(b)에서 수득된 GRA-3-K-T-7의 세포독성은 표적세포로서⁵¹Cr-KATO-III(E/T=20/1)을 사용하여 시험실시예 5와 동일한 방법으로 측정한다. 킬러 세포의 특히⁵¹Cr 방출율은 25.5%이었다.b) The cytotoxicity of GRA-3-KT-7 obtained in Example 7- (b) was the same as that of Test Example 5 using ⁵¹ Cr-KATO-III (E / T = 20/1) as target cells. Measure by method. The killer cell especially ⁵¹ Cr release rate was 25.5%.

[시험실시예 7][Test Example 7]

실시예 5에서 수득된 킬러세포의 세포독성은 시험실시예 5와 동일한 방법으로⁵¹Cr 방출 시험으로 측정한다. 표적세포로는⁵¹Cr-표지된 X 5563세포를 사용한다. 대조용으로는, 비장세포를 GRA-M-5 대신에, 1×10⁵/웰의 미토마이신 C-처리된 X 5563세포(5×10⁶/ml의 X 5563 세포를 50μg/ml의 미토마이신 C로 60분 동안 처리한 것)로 감작시킨 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법에 의해 수득된 임파구를 사용한다. 결과를 표 13에 기재하였다.Cytotoxicity of the killer cells obtained in Example 5 was measured by the ⁵¹ Cr release test in the same manner as in Test Example 5. As target cells, ⁵¹ Cr-labeled X 5563 cells were used. For control, the splenocytes were replaced with GRA-M-5, with 1 × 10 ⁵ / well mitomycin C-treated X 5563 cells (5 × 10 ⁶ / ml X 5563 cells with 50 μg / ml mitomycin Lymphocytes obtained by the same method as Example 5 were used except that they were sensitized with C for 60 minutes). The results are shown in Table 13.

[표 13]TABLE 13

특히⁵¹Cr 방출율(%)Especially ⁵¹ Cr emission rate (%)

[시험실시예 8 (H-2검정)][Test Example 8 (H-2 Test)]

참조실시예 2에서 수득된 GRA-M-1, GRA-M-3 및 GRA-M-4를 PBS(0.85% NaCl)로 연속적으로 희석하여 시료를 만든다.Samples are prepared by serial dilution of GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 obtained in Reference Example 2 with PBS (0.85% NaCl).

MIGR(National INstitute of Genetic Research)로 부터의 항-H-2 혈청과 상기 시료를 혼합하고 4℃에서 2시간 동안 배양한 후, 여기에 항-H-2혈청에 상응하는 표적세포를 가한다. 통상적인 방법에 의해 BIO(H-2^b)와 BIO·BR(H-2^k)로 부터 수득된 비장세포 또는 임파절 세포를 표적세포로서 사용한다. 세포를 PBS로 세척한 후, 보체(토끼)를 세포에 가하고 세포를 37℃에서 1시간 도안 배양한 후 0.2% 트리판 블루-PBS로 염색하여 세포독성율(%)을 측정한다. 항-H-2 혈청은 GRA부재하에 적어도 95%의 세포독성을 나타내도록 최대로 희석하여 사용한다. 시스템에 대해 GRA에 의한 차단 효과를 측정하여 표 14에기재하였다.The sample is mixed with anti-H-2 serum from the National Institute of Genetic Research (MIGR) and incubated at 4 ° C. for 2 hours, to which target cells corresponding to anti-H-2 serum are added. Splenocytes or lymph node cells obtained from BIO (H- ^2b ) and BIO.BR (H- ^2k ) by conventional methods are used as target cells. After washing the cells with PBS, complement (rabbit) is added to the cells and the cells are incubated for 1 hour at 37 ℃ and then stained with 0.2% trypan blue-PBS to measure the cytotoxicity (%). Anti-H-2 serum should be used at maximum dilution to show at least 95% cytotoxicity in the absence of GRA. The blocking effect by GRA on the system was measured and listed in Table 14.

[표 14]TABLE 14

결과를 표 15에 기재하였다The results are shown in Table 15.

[표 15]TABLE 15

세포독성율(%)Cytotoxicity rate (%)

주 : GRA I : GRA-m-1Note: GRA I: GRA-m-1

GRA II : GRA-M-3GRA II: GRA-M-3

GRA III : GRA-M-4GRA III: GRA-M-4

"*"은 보체만을 사용했을 경우의 세포독성율(%)을 나타낸다."*" Shows the cytotoxicity rate (%) when only complement is used.

상기 표 15에 나타난 결과로 부터, GRA-M-1, GRA-M-3 및 GRA-M-4는 H-2가 결핍되어 있음을 알 수 있다.From the results shown in Table 15, it can be seen that GRA-M-1, GRA-M-3 and GRA-M-4 are deficient in H-2.

[시험실시예 9][Test Example 9]

C 57 Br/6 마우스에게 동일한 균주로 부터 수득한 LLC(2×10⁶)를 피하 이식하고, 6일 후에, 참조실시예 2(d)에서 수득된 1ng(단백질)의 GRA-M-3을 피하 투여한다. 이어서 4일 동안 하루에 한번씩 동일용량으로 반복 투여한다. 최종으로 투여한 다음날 종양 세포를 절제하여 무게를 단다. 대조군으로는 생리식염수를 투여한 동물을 사용한다. 각 시험군은 5마리의 동물로 구성한다.C 57 Br / 6 mice were implanted subcutaneously with LLC (2 × 10 ⁶ ) obtained from the same strain, and after 6 days, 1 ng (protein) of GRA-M-3 obtained in Reference Example 2 (d) Administered subcutaneously. Subsequently, the same dose is repeated once a day for 4 days. The tumor cells are excised and weighed the day after the last dose. As a control group, animals administered with saline are used. Each test group consists of 5 animals.

결과로서, 대조군 평균 종앵 무게는 약 500mg이었으며, GRA-M-3투여군에서는, 3마리는 종양이 나타나지 않았고 두마리는 평균 종양무게가 약 100mg이었다.As a result, the mean median weight of the control group was about 500 mg. In the GRA-M-3 administration group, 3 dogs showed no tumor and two dogs had an average tumor weight of about 100 mg.

[시험실시예 10][Test Example 10]

C 57 Br/6마우스에게 참조 실시예 2(d)에서 수득된 1ng(단백질)의 GRA-M-3를 하루에 한번씩 3일 동안 피하 투여하여 면역성을 주고, 5일째에 비장세포를 동물로 부터 수집하여 작동세포를 얻는다. 표적세포로서 작동 세포와 루이스 폐 암종(LLC)의 혼합물 E/T=50 : 1의 비율로 만들고 이의 부분(1×10⁵)을 동일균주의 마우스에게 이식하고 윈(Winn)검정을 수행한다. [참조 : J.Immunol, 86, P 228-239(1961)].결과를 표 16에 기재하였다.Immunity was given to C 57 Br / 6 mice by subcutaneously administering 1 ng (protein) of GRA-M-3 obtained in Reference Example 2 (d) for 3 days, once a day, and splenocytes were removed from the animals on day 5 Collect working cells. As a target cell, a mixture of effector cells and Lewis lung carcinoma (LLC) was made at a ratio of E / T = 50: 1, and a portion thereof (1 × 10 ⁵ ) was transplanted into mice of the same strain and a Winn test was performed. [J. Immunol, 86, P 228-239 (1961)]. The results are shown in Table 16.

[표 16]TABLE 16

주 : 그룹 A는 GRA-M-3면역 마우스로 부터의 비장세포를 나타낸다. 그룹 B는 정상 마우스로 부터의 비장세포를 나타낸다. 그룹 C는 LLC(1×10⁶)를 인식한 10일 후에 마우스로 부터 수득한 비장세포를 나타낸다.Note: Group A shows splenocytes from GRA-M-3 immunized mice. Group B shows splenocytes from normal mice. Group C represents splenocytes obtained from mice 10 days after the recognition of LLC (1 × 10 ⁶ ).

종양 성장율(%)은 다음 식에 따라 계산한다.Tumor growth rate (%) is calculated according to the following equation.

상기식에서 T_A는 종양을 이식한 쪽의 발바닥 두께를 나타내고 T_N은 정상 발바닥 두께를 나타낸다.In the above formula, T _A represents the thickness of the planting of the tumor-grafted side and T _N represents the normal plantar thickness.

[시험실시예 11][Test Example 11]

C3H/He 마우스의 선미골근 부위에 참조실시예 2(d)에서 수득된 GRA-M-4 4.5μm(단백질) 및 0.1ml의 프로인트 완전 보조제를 투여하여 면역성을 부여한다. 2주일 후 임파절 세포를 통상의 방법으로 수집하여 GRA-M-4에 의한 증식반응을 측정하기 위해 반응세포로서 사용한다.Immunity is conferred by administering 4.5 μm (protein) of GRA-M-4 obtained in Reference Example 2 (d) and 0.1 ml of Freund's complete adjuvant to the sternocyst site of C3H / He mice. Two weeks later lymph node cells are collected by conventional methods and used as response cells to measure proliferative responses by GRA-M-4.

상기 목적을 위해, 감응세포(4×10⁵)를 GRA-M-4 존재하에 15%FCS를 함유하는 RPMI-1640 배지중에서 5일 동안 배양한다. 배양기간중 마지막의 18시간 동안에, 1μci의 3H-티미딘(3H-TdR)을 배지에 가하고 이의 세포내의 혼입을 계수한다.For this purpose, sensitized cells (4 × 10 ⁵ ) are incubated for 5 days in RPMI-1640 medium containing 15% FCS in the presence of GRA-M-4. During the last 18 hours of incubation, 1 μci of 3H-thymidine (3H-TdR) is added to the medium and its incorporation counted.

결과를 표17에서 기재하였다.The results are shown in Table 17.

[표 17]TABLE 17

주 : "S.I."는 실험군/비교균에서의 자극지수를 나타낸다.Note: "S.I." indicates the stimulus index in the experimental group / comparative bacteria.

[시험실시예 12][Test Example 12]

실시예 5와 동일한 방법으로 수득된 MH134면역 마우스, C3H/He 정상 마우스 및 ×5563면역 마우스, 및 시험실시예 11과 동일한 방법으로 수득된 GRA-M-4마우스 및 GRA-M-5면역 마우스의 지연형 과민성(delayed hypersensitivity ; DTH) 반응을 발바닥 반응(FPR ; food pad reaction)으로 측정한다. 이는 다음과 같이 수행한다. GRA 또는 MMC-처리된 종양세포를 동물의 뒷다리 발바닥 피부에 접종하여 공격시킨지 24시간 후에 발바닥의 팽윤정도를 측정한다. DTH반응정도는 접종후에 팽윤정도에서 접종전의 팽윤정도를 뺀 것으로 계산한다(10^-2mm).MH134 immunized mice obtained in the same manner as in Example 5, C3H / He normal mice and × 5563 immunized mice, and GRA-M-4 mice and GRA-M-5 immunized mice obtained in the same manner as in Test Example 11 Delayed hypersensitivity (DTH) responses are measured by the food pad reaction (FPR). This is done as follows. GRA or MMC-treated tumor cells are inoculated into the plantar skin of the hind limb of the animal and measured swelling of the plantar 24 hours after attack. The degree of DTH response is calculated by subtracting the degree of swelling before inoculation (10 ^-2 mm).

결과를 표 18 내지 22에 기재하였다.The results are shown in Tables 18-22.

[표 18]TABLE 18

평균 발바닥 증분(10^-2mm)Average plantar increments (10 ^-2 mm)

주 : 그룹 1 : 동유정형 정상 비장 1×10⁶/20μl 배지(한크스 용액)Note 1: Group 1: Copper well normal spleen 1 × 10 ⁶ / 20μl medium (Hans solution)

그룹 2 : MH 134세포 1×10⁶/20μl 배지Group 2: MH 134 cells 1 × 10 ⁶ / 20μl medium

그룹 3 : 배지 20μlGroup 3: 20 μl of medium

그룹 4 : GRA-M-4, 0.8μg(단백질)/20μl 배지Group 4: GRA-M-4, 0.8 μg (protein) / 20 μl medium

그룹 5 : GRA-M-4, 0.4μg(단백질)/20μl 배지Group 5: GRA-M-4, 0.4 μg (protein) / 20 μl medium

[표 19]TABLE 19

주 : 그룹 1 : 배지(한크스 용액) 20μlNote 1: Group 1: 20 μl of medium (Hanx solution)

그룹 2 : GRA-M-4, 4μg(단백질)/20μl 배지Group 2: GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium

그룹 3 : GRA-M-5, 4μg(단백질)/20μl 배지Group 3: GRA-M-5, 4 μg (protein) / 20 μl medium

[표 20]TABLE 20

주 : 그룹 1 : 배지(한크스 용액) 20μlNote 1: Group 1: 20 μl of medium (Hanx solution)

그룹 2 : GRA-M-4, 4μg(단백질)/20μl 배지Group 2: GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium

[표 21]TABLE 21

주 : 그룹 1 : 배지(한크스 용액) 20μlNote 1: Group 1: 20 μl of medium (Hanx solution)

그룹 2 : GRA-M-4, 4μg(단백질)/20μl 배지Group 2: GRA-M-4, 4 μg (protein) / 20 μl medium

그룹 3 : GRA-M-4와 동시에 PNA-컬럼을 통과한 분획의 배지 20μl 당 4μg(단백질) (이후에서는 "C.P."라 칭함)Group 3: 4 μg (protein) per 20 μl of the medium that passed through the PNA-column simultaneously with GRA-M-4 (protein) (hereinafter referred to as “C.P.”)

[표 22]Table 22

주 : 그룹 1 : 배지(한크스 용액) 20μlNote 1: Group 1: 20 μl of medium (Hanx solution)

그룹 2 : GRA-M-4, 3.8μg(단백질)/20μl 배지Group 2: GRA-M-4, 3.8 μg (protein) / 20 μl medium

그룹 3 : 3.8μg(단백질)/20μl 상기의 "C.P."배지Group 3: 3.8 μg (protein) / 20 μl "C.P." medium above

그룹 4 : 3.4μg(단백질)의 GRA-M-4 및 3.8μg의 (단백질)/20μl 상기의 "C.P."배지Group 4: 3.4 μg (protein) of GRA-M-4 and 3.8 μg of (protein) / 20 μl "C.P." medium

[참조시험][Reference test]

×5563면역 마우스를 실시예 5와 동일한 방법으로 얻는다. 이 면역 마우스로부터 얻은 비장세포를 작동세포로 사용하고, 작동 세포(10⁷) 및 표적세포(×5563, 10⁵)를 함께 동일균주의 마우스에 이식한다.Immunity mice were obtained in the same manner as in Example 5. Splenocytes obtained from this immune mouse are used as effector cells, and effector cells (10 ⁷ ) and target cells (× 5563, 10 ⁵ ) are transplanted together into mice of the same strain.

시험실시예 10과 동일한 방법으로 윈(Winn) 검정을 수행한다.The Win assay is performed in the same manner as in Test Example 10.

결과를 제23도에 나타내었는데, 여기서는 가로 좌표는 일수(days)를 나타내고 세로좌표는 평균 종양크기(cm²)±표준오차를 나타내며 여러가지 표지는 다음과 같은 뜻을 나타낸다.The results are shown in FIG. 23, where the abscissa represents days, the ordinate represents the mean tumor size (cm ² ) ± standard error, and the various markers have the following meanings.

- : 작동 세포를 첨가하지 않은 그룹.-: Group without addition of working cells.

-

: 비처리 작동세포를 첨가한 그룹.

-

: Group to which untreated effector cells were added.

-

: 토끼 보체(rabbit complement)로 처리된 작동세포를 첨가한 그룹.

-

: Group with effector cells treated with rabbit complement.

-

: 안티-Thy 1(미합중국 소재의 New England Nuclear Co.)과 토끼보체로 처리된 작동세포를 첨가한 그룹.

-

: Addition of effector cells treated with anti-Thy 1 (New England Nuclear Co., United States) and rabbit complement.

-

: 안티-Lyt 1(미합중국 소재의 New England Nuclear Co.)와 토끼보체로 처리된 작동세포를 첨가한 그룹

-

: Addition of effector cells treated with anti-Lyt 1 (New England Nuclear Co., United States) and rabbit complement

-

: 안티-Lyt 2(미합중국 소재의 New England Nuclear Co.)와 토끼보체로 처리된 작동세포를 첨가한 그룹.

-

: Addition of effector cells treated with anti-Lyt 2 (New England Nuclear Co., United States) and rabbit complement.

제 23도에 나타난 결과로부터, Lty 1형 T-세포는 종양 면역성에 있어 생체내 작동 세포의 기전(mechanism)에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.From the results shown in FIG. 23, it can be seen that Lty type 1 T-cells play an important role in the mechanism of effector cells in vivo in tumor immunity.

또한, DTH 반응은 Lyt -1 T-세포에 의해 조정됨을 알 수 있다[참조 : J.Exp.Med.143 P1534-39(1976)].It can also be seen that the DTH response is mediated by Lyt-1 T-cells (J. Exp. Med. 143 P1534-39 (1976)).

본 발명을 특정 실시 양태를 참조로 하여 상세히 설명하였으나, 본 분야의 전문가는 본 발명의 개념 및 범주를 벗어나지 않고서도 여러가지의 변화 및 변형을 수행할 수 있다는 것을 알 것이다.While the invention has been described in detail with reference to specific embodiments, those skilled in the art will recognize that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention.

Claims (10)

임파구를 암세포-유도된 당-관련 항원으로 감작시킴을 특징으로 하여 암세포-세포독성 임파구를 제조하는 방법.A method for producing cancer cell-cytotoxic lymphocytes characterized by sensitizing lymphocytes with cancer cell-derived sugar-related antigens. 제1항에 있어서, 당-관련 항원이 말단 갈락토오즈와 특이적으로 결합하는 렉틴과 결합하는 암세포 막 성분인 방법.The method of claim 1, wherein the sugar-related antigen is a cancer cell membrane component that binds to a lectin that specifically binds to terminal galactose. 제1항에서 있어서, 당-관련 항원이 말단 갈락토오즈와 특이적으로 결합하는 렉틴과 결합하는 암세포 막 성분인 방법.The method of claim 1, wherein the sugar-related antigen is a cancer cell membrane component that binds to a lectin that specifically binds to terminal galactose. 제1항에 있어서, 당-관련 항원이 말단 N-아세틸 갈락토오즈아민과 특이적으로 결합하는 렉틴과 결합하는 암세포 막 성분인 방법.The method of claim 1, wherein the sugar-related antigen is a cancer cell membrane component that binds to a lectin that specifically binds to terminal N-acetyl galactoseamine. 말단 갈락토오즈 또는 말단 N-아세틸갈락토오즈아민과 특이적으로 결합할 수 있는 렉틴과 결합할 수 있는 당-관련 항원을 분리시킴을 특징으로 하여 당-관련 항원을 제조하는 방법.A method for producing a sugar-associated antigen, characterized by separating a sugar-related antigen capable of binding to a lectin that can specifically bind to terminal galactose or terminal N-acetylgalactoseamine. 제5항에 있어서, 말단 갈락토오즈 또는 말단 N-아세틸갈락토오즈 아민과 특이적으로 결합하는 렉틴을 사용하여 인체 암 세포막 성분으로부터 당-관련 항원을 분리시키는 방법.6. The method of claim 5, wherein the lectin is used to isolate sugar-related antigens from human cancer cell membrane components using lectins that specifically bind to terminal galactose or terminal N-acetylgalactose amines. 제6항에 있어서, 렉틴이 말단 갈락토오즈와 특이적으로 결합하는 렉틴인 방법.7. The method of claim 6, wherein the lectin is a lectin that specifically binds to terminal galactose. 제6항에 있어서, 렉틴이 말단 N-아세틸갈락토오즈아민과 특이적으로 결합하는 렉틴인 방법.7. The method of claim 6, wherein the lectin is a lectin that specifically binds with terminal N-acetylgalactoseamine. 먼저 말단 갈락토오즈와 특이적으로 결합하는 제1의 렉틴을 사용하고, 이어서 말단 N-아세틸갈락토오즈아민과 특이적으로 결합하는 제2의 렉틴을 사용하여, 인체 암세포막 성분으로부터 당-관련 항원을 분리시킴을 특징으로 하여 당-관련 항원을 제조하는 방법.Sugar-related from human cancer cell membrane components, first using a first lectin that specifically binds to terminal galactose, followed by a second lectin that specifically binds to terminal N-acetylgalactoseamine A method for producing a sugar-associated antigen, characterized by isolating antigen. 제9항에 있어서, 제1의 렉틴이 땅콩 렉틴이고 제2의 렉틴이 돌리코스(Dolichos)콩 응집소인 방법.10. The method of claim 9, wherein the first lectin is a peanut lectin and the second lectin is a Dolichos soybean flocculator.

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