KR860001802B1 - Stable plurilamellar vescicles - Google Patents

Abstract

Stabilized plurilamellar vesicles (SPV) contg. as many as 100 lipid bilayers make up a superior type of liposome for the delivery of drugs in the treatment of such disease as brucellosis of cattle, eye infections, and lymphocytic meningitis of viral origin. Thus, 5 ml of Et2O contg. 100 mg lecithin was placed in a roundbottomed flask, to which was added 0.3 ml of a soln. composed of 100 mg streptomycin in 5-mM HEPES medium (pH = 7.4). The mixt. was sonicated at the same time as it was being evapd. under a N-stream to a viscous paste. Upon resuspension and removal of unencapsulated streptomycin, the resulting SPV were effective against Brucella abortus infection in cattle, B. canis infections in dogs, and kerato conjunctivitis from Mycobacterium bovis infections in lab. animals.

Description

안정한 복박층 상포(複薄層 狀胞)Stable Double-Layered Flooring

제1도는 여러가지 상이한 농도의 요소(尿素)로 처리한 MLV와 SPLV간의 막(膜) 안정성의 차이를 예시한 그래프.1 is a graph illustrating the difference in film stability between MLV and SPLV treated with various different concentrations of urea.

제2도는 쥐 눈꺼풀의 액상 SPLV 및 리피드 SPLV의 잔존 지속량과 생체내에서의 SPLV로부터의 젠타마이신의 지속적인 배출량과의 관계를 예시한 그래프.FIG. 2 is a graph illustrating the relationship between the persistence of liquid SPLV and lipid SPLV in rat eyelids and the sustained release of gentamicin from SPLV in vivo.

제3도는 MLV(B)와 비교한 SPLV(A)의 전자스핀 공명흡수 스펙트럼.3 shows the electron spin resonance absorption spectrum of SPLV (A) compared to MLV (B).

제4도는 아스코르브산염의 SPLV 및 MLV중에서의 독실(doxyl) 스핀 프로우브의 환원능력의 차이를 예시한 그래프.4 is a graph illustrating the difference in reducing capacity of doxyl spin probes in SPLV and MLV of ascorbate.

제5도는 감염된 쥐의 비장으로부터 회수한 브루셀라캐니스(Brucella canis)로 된 것으로서 SPLV로 포장(胞藏)한 스트렙토마이신을 이용하여 쥐에 대한 2단계의 브루셀라캐니스 감염 치료효과를 예시한 그래프.FIG. 5 is a graph illustrating the effect of treating two stages of Brucellola canis infection in rats using streptomycin packed with SPLV as Brucella canis recovered from the spleen of infected mice.

제6도는 감염된 쥐의 기관(器管)에서 회수한 브루셀라캐니스로 된 것으로서 SPLV로 포장한 스트렙토마이신을 이용하여 쥐에 대한 2단계의 브루셀라 캐니스 감염치료효과를 예시한 그래프.FIG. 6 is a graph illustrating the effect of two-stage Brucella canis infection treatment on rats using streptomycin packaged with SPLV, which was recovered from the trachea of infected mice.

제7도는 SPLV로 포장한 스트렙토마이신을 이용하여 기니아 피그(guinea pig)에 대한 2단계의 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 치료효과를 예시한 그래프.FIG. 7 is a graph illustrating the effect of two-stage Brucella abortus treatment on guinea pigs using streptomycin packaged with SPLV.

본 발명은 리포조옴(liposome) 및 이들의 투여계통에서의 운반체로서 용도에 관한 것인데, 특히 본 발명은 큰 안정성과 큰 포장(胞藏) 효율등과 같은 특수한 장점을 나타내는 독특한 성질을 가진 새로운 형태의 리피드 포(胞)에 관한 것이다. 여기에 상술된 조성과 방법은 운반체계통과 표적 투여계통과 같은 분야에 광범위하게 적용된다. 본 발명의 실시는 브루셀라균증(症)의 치료, 눈 감염증의 치료 및 림프구성 뇌막염 비루스 감염의 치료등과 같은데서 실증이 된다.The present invention relates to the use of liposomes as carriers in their liposomes and their administration systems, in particular the present invention provides a novel form of new type with unique properties that exhibits particular advantages such as greater stability and greater packaging efficiency. It is related to a rapid four. The compositions and methods detailed herein apply broadly to such fields as delivery systems and targeted administration systems. The practice of the present invention is exemplified in the treatment of brucellosis, the treatment of eye infections and the treatment of lymphocytic meningitis virus infection.

리포조옴은 포장(胞藏)된 액상을 함유한 완전히 밀폐된 이중층막이다. 이 리포조음은 단일층포(胞)(단일막의 이중층을 가짐) 또는 다중층포(한겹의 물에 의해 서로간에 격리되어 있는 동심원모양의 막 이중층의 특징을 가진 것으로서 양파모양의 구조를 가진 것임)등 여러가지가 있다.Liposomes are fully sealed bilayer membranes containing a packaged liquid phase. These lipozomes are characterized by a monolayer cell (having a single layer of bilayers) or a multi-layer cell (characterized by concentric membrane bilayers isolated from each other by a single layer of water) and having an onion-like structure. There is.

Bangham등에 의한 최초의 리포조옴 제조방법(1965, J. Mol. Biol, 13 : 238-252)에서는 유기용매속에 인지질(phospholipid)를 현탁시킨 후 증발건조시키므로서 반응용기에 왁스모양의 인지질을 잔존시킨 다음 적당량의 액체를 첨가하여 혼합물을 만들고 이것을 팽윤시켜 만든 다중층포(MLV : multilamellar vesicle)로 된 리포조옴을 기계적인 수단을 이용하여 분산시켰다. 생성된 막 이중층의 구조는 리피드의 소수성(疎水性))무극성임)의 "말단"이 이중층의 중심을 향하고 있는 한편, 친수성(親水性)(극성임)의 "머리부분"은 액상쪽을 향하고 있다. 이 방법은 음파파쇄에 의한 조그만 단일층포(SUV : Sonicated unilamellar veaicle)제조의 기초가 된 것으로서 Papahadjapoulos와 Millor가 SUV제조에 관하여 개발한 것이다(1967, Biochim. Biophys. Acta. 135 : 624-638). 그러나 이러한 "고전적인 리포조옴"은 리피드 1몰당 포장 가능한 액상공간이 적고 다량의 기대분장를 수용할 수 있는 능력이 제한된다는 등의 여러가지 결점을 가지고 있다.In the first lipozoohm production method by Bangham et al. (1965, J. Mol. Biol, 13: 238-252), phospholipids were suspended in organic solvents and evaporated to dryness, leaving wax-like phospholipids in the reaction vessel. Then, a mixture was added by adding an appropriate amount of liquid, and the lipozoom made of multilamellar vesicles (MLV) made by swelling was dispersed by mechanical means. The structure of the resulting membrane bilayer is hydrophobic and nonpolar of lipids, with the "end" facing the center of the bilayer, while the "head" of hydrophilic (polar) faces towards the liquid phase. have. This method, the basis for the production of sonicated unilamellar veaicles (SUVs), was developed by Papahadjapoulos and Millor on the production of SUVs (1967, Biochim. Biophys. Acta. 135: 624-638). However, these "classic lipozomes" have several drawbacks such as less liquid space available for packing per mole of lipid and limited ability to accommodate large amounts of expected makeup.

포장체적을 늘리기 위한 노력으로서는 첫째로 역미셀(inverse micelle) 또는 리포조옴 선구물질을 형성시키는데, 즉 액상을 함유한 포의 주위를 단일층의 리피드분자로 둘러 싸주므로서 극성(極性)의 머리부분이 액상쪽을 향하게 하는 것이다. 리포조옴 선구물질은 유기용매중에 있는 극성의 리피드용액에다 포장이 될 용액을 첨가한 후 음파파쇄 하므로서 형성된다. 리포조옴 선구물질을 과잉량의 리피드존재하에 증발시켜 생성된 리포조옴은 리피드 이중층으로 둘러싸인 액상으로 되어 있는데 이것을 액상속에 분산시킨다(미국특허 제4,224,179호 참조).In an effort to increase the packaging volume, first, an inverse micelle or lipozoom precursor is formed, that is, a polar head part is surrounded by a single layer of lipid molecules around a cell containing a liquid phase. This is to face the liquid. Liposomes precursors are formed by adding a solution to be packaged in a polar lipid solution in an organic solvent and then sonicating it. Liposomes produced by evaporating the lipozoome precursors in the presence of excess lipids are in a liquid phase surrounded by a lipid bilayer, which is dispersed in the liquid phase (see US Pat. No. 4,224,179).

포장효율을 극대화하기 위한 다른 시도를 보면 Papahadjo-poulos(미국특허 제4,235,871호)는 "역상(逆相)증발법"을 이용하고 있는데, 이 방법에서는 역상 증발포(REV : reverse-phase evaporation vesicle)로 알려진 올리고층(oligolamellar) 리피드포를 제조하고 있다.Another attempt to maximize packaging efficiency is known as Papahadjo-poulos (US Pat. No. 4,235,871), which uses a reverse phase evaporation method, in which a reverse-phase evaporation vesicle (REV) is used. An oligoamellar lipido known as is prepared.

이 방법에 의하면 포장이 될 액상물질을 유기용매와 극성의 리피드와의 혼합물중에 첨가한 다음 균질의 W/O형(water-in-oiltype) 에멀젼을 만들고 유기용매를 증발시켜 겔(gel)을 형성시킨다. 이 겐 혼합물을 액상 매체중에 분산시켜 주므로서 겔을 현탁물로 전환시킨다. 제조된 REV는 거의가 단일층포로 되어있고 약간의 올리고 층포가 있는데 내부 액상공간이 큰 동심원 모양의 이중층으로만 되어 있다는데 특징이 있다.According to this method, a liquid substance to be packaged is added to a mixture of an organic solvent and a polar lipid, then a homogeneous water-in-oil type emulsion is formed, and the organic solvent is evaporated to form a gel. Let's do it. The gel mixture is suspended in suspension by dispersing the gen mixture in a liquid medium. The manufactured REV is mostly composed of a single layer fabric and has a slight oligo layer, which is characterized by being composed of a concentric double layer with a large internal liquid space.

REV가 투과성이 약간 있다고 보고되어 있는데 이것은 MLV와 SUV의 투과성과 유사하다(Szoka, Papabadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 75 : 4194-4198 참조).REV is reported to be slightly permeable, similar to that of MLV and SUV (see Szoka, Papabadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 75: 4194-4198).

여러가지 화합물을 포장할 수 있는 리포조옴을 제조할 수 있지만 저장도중의 리포조옴의 안전성이 항상 극한되어 있다. 이러한 안정성의 결핍으로 인하여 포장되어 있는 화합물이 리포조옴으로부터 누설되어 주위의 매체속으로 유입해 들어가게 되고, 또한 주위의 매체로부터 리포조옴자체속으로 여러가지 물질이 투과해 들어가게 되므로서 리포조옴 내용물이 오염되는 결과가 생기게 된다. 결과적으로 종래의 리포조옴의 저장기간이 극히 제한된다. 이러한 안정성을 향상시키기 위해 리포조옴막속으로 리피드 이중층의 물리적인 성질에 영향을 주는 어떤 물질(이하 "안정제"라 부르기로 함)(예 : 스태로이드류)을 첨가하고 있다. 그러나 이러한 물질중 대다수가 값이 비교적 비싸므로 이러한 리포조옴의 제조경비가 많이 소요된다.Liposomes that can package various compounds can be prepared, but the safety of lipozomes during storage is always limited. Due to this lack of stability, the packaged compound leaks from the lipozoom and enters into the surrounding medium, and the various substances penetrate into the lipozome itself from the surrounding medium, thereby contaminating the lipozome contents. The result is. As a result, the storage period of a conventional lipozoohm is extremely limited. In order to improve this stability, a substance (hereinafter referred to as "stabilizer") (for example, staids) is added to the lipozo-ohm film which affects the physical properties of the lipid bilayer. However, since many of these materials are relatively expensive, the manufacturing cost of these lipozomes is high.

종래의 리포조옴의 저장문제외에 다수의 화합물을 이 포(胞)속으로 첨가할 수 없다는 점도 있다. 리피드막의 상전이(相轉移) 온도이상의 조건하에서는 MLV를 제조할 수 없다. 이러한 문제 때문에 소요의 성질을 나타내며 길이가 길고 고도로 불포화 된 측쇄를 가진 인지질로 된 리포조옴속으로 열에 불안정한 분자를 첨가할 수 없게 된다.In addition to the storage problems of conventional lipozoohms, many compounds cannot be added into this cell. MLV cannot be manufactured under the conditions above the phase transition temperature of the lipid film. Because of this problem, it is not possible to add heat-stable molecules into lipozomes of phospholipids with long lengths and highly unsaturated side chains.

리포조옴을 치료에 사용하는 것에 관해서는 Knight의 저서(Liposomes : From Physical Structures To Therapeutic Appications, ed. Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1981)에 상술되어 있다. 이러한 막포(膜胞)를 약물의 투여계통 용으로 사용할 수 있느냐하는 가능성에 관해서는 여러가지가 나와 있으나 상당히 많은 문제점이 상존하고 있다(미국 특허 제3,993,754호 및 제4,145,410호 참조). 리포조옴에 의한 약물의 투여계통에 있어서 리포조옴형성도중 약물을 내장시킨 후 치료환자에게 투여한다. 이 약물은 수용성이거나 무극성용제에 용해되는 것이라야 한다. 이러한 내용에 관해 대표적인 것은 미극특허 제4,235,871호와 제4,224,179호에 상술되어 있다.The use of lipozomes in therapy is detailed in Knight's book (Liposomes: From Physical Structures To Therapeutic Appications, ed. Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1981). There are many possibilities for the possibility of using such membranes for the administration of drugs, but there are many problems (see US Pat. Nos. 3,993,754 and 4,145,410). In the administration system of the drug by lipozoohm, the drug is embedded in the lipozoohm and then administered to the treated patient. The drug must be water soluble or soluble in nonpolar solvents. Representatives of such contents are described in U.S. Patent Nos. 4,235,871 and 4,224,179.

약물투여계통에 관한 몇가지 필요한 특징은 작용이 지속적인 약물의 지속적인 방출에 수반하여 약물의 신속한 제거율에 대한 저항이 있어야 하는 것이다. 이렇게 되면 약물의 효능이 증가되고 투여회수를 작게할 수 있는 것이다. 생체내애서의 리포조옴 조제물을 사용할 때 제기되는 몇가지 문제점으로서는 다음과 같은 것들이 있다. (1) 리포조옴을 체액내에 잠복시킬 경우 리포조옴으로 포장된 물질이 누설되는데, 플라즈마 고밀도 지방 단백질(HDL)에의해 리포조옴 인지질이 제거되기 때문에 생기는 현상이거나 인지질에 의해 리포조옴막이 분해되므로 해서 생기는 현상이다.Some necessary features of the drug delivery system are that the action must be accompanied by a sustained release of the drug and resistance to the rapid removal rate of the drug. This increases the efficacy of the drug and can reduce the number of doses. Some of the issues raised when using lipozoom preparations in vivo include the following. (1) When liposomes are incubated in body fluids, the substance packed with lipozomes leaks, which is caused by the removal of liposomes phospholipids by plasma high density fat protein (HDL) or by the decomposition of lipozomes membranes by phospholipids. It is a phenomenon.

생체내에서 리포조옴이 분해되므로 해서 단시간내에 거의 모든 리포조옴의 내용물들이 방출되어 약제의 지속적인 방출과 제거율에 대한 저항성을 달성할 수 없게 된다. (2) 한편으로 생체내에서 극히 안정한 리포조옴(예 : 체액속에 잠복시켰을 경우 누설이 되지않는 리포조옴)을 사용할 경우 리포조옴의 내용물들이 필요한 만큼 방출되지 않는다. 결과적으로 이러한 안정한 리포조옴은 생체내에서의 치료물질의 운반체로서 효과를 나타내는데 그 이유는 필요에 따라 리포조옴 내용물을 방출할 수 있는 능력 또는 지속적인 방출이 이루어지지 않기 때문이다. 그러나 세포내감염을 치료할 경우 리포조옴이 감염된 세포에 의해 내재화(內在化)하는 정도에 도달할 때까지 생물학적인 액체내에서의 안정성을 유지할 수 있도록 하는 것이 중요하다. (3) 투여계통에 사용된 리포조옴 운반체의 가격의 효율성이 있어야 한다. 예를 들자면 라이시마니아 감염증을 리포조옴으로 포장한 항라이시마니아 약재를 이용하여 화학요법으로 치료하는 계량된 방법이 Steck와 Alving에 의한 미국 특허 제4,186,183호에 보고되어 있다. 화학요법에사용된 리포조옴에는 생체내에서의 리포조옴의 안정성을 증가시키는 정안제가 다수함유되어 있다. 그러나 앞서 상술한 바와 같이 이들 안정제는 가격이 비싸고 이러한 안정제를 함유한 리포조옴을 저렴한 가격으로 제조할 수 없다. (4) 궁극적으로 약물투여계통에서 운반체로서의 리포조옴을 사용할 때 제기되는 문제점은 질환의 치료를 효과적으로 할 수 없다는데 있다. 신속한 제거율에 대한 저항성이 없고 지속적인 방출이 되지 않는다는 것외에 질환치료의 불가능성에 대한 기타 여러가지 설명도 가능하다. 예를 들자면 표적세포 또는 식균(食菌)세포(예 : 망내계세포(網內系細胞)) 속으로 리포조옴을 내재화시키면 이들은 신속히 계로부터 제거되어 RES 이외의 기타 다른 세포의 질환에 대해 포장된 약제가 상당히 크게 약효를 나타내지 않게 된다. 식세포활동이 끝나면 리포조옴의 내용물들은 식균세포의 리소조옴(lyscsome)속에 포장된다. 극히 빈번하게 리소조옴속에 있던 분해 효소에 의해 포장된 화합물이 분해되거나 활성위치에서 화합물의 구조를 변화시키거나 화합물을 분해 시키므로서 화합물이 비활성화 된다. 더우기 리포조옴은 활성 화합물의 포장 효율이 저하되므로 해서 약물을 제대로 전달할 수 없게 된다.The breakdown of lipozomes in vivo results in the release of almost all lipozoom contents in a short time, thereby preventing the drug from achieving sustained release and removal rates. (2) On the other hand, if lipozomes that are extremely stable in vivo (eg, lipozomes that do not leak when submerged in body fluids) are used, the contents of lipozomes are not released as necessary. As a result, these stable lipozomes are effective as carriers of therapeutic substances in vivo because they do not have the ability or sustained release to release lipozome contents as needed. However, in the treatment of intracellular infection, it is important to ensure that the lipozome maintains stability in the biological liquid until the degree of internalization by the infected cells is reached. (3) There must be a cost-effectiveness of the lipozoohm carrier used in the administration system. For example, a quantified method of chemotherapy treatment using anti-lysimania medicaments packaged with lipoxiom in Liposhima is reported in US Pat. No. 4,186,183 to Steck and Alving. Liposomes used in chemotherapy contain a number of eye drops that increase the stability of lipozomes in vivo. However, as described above, these stabilizers are expensive and cannot be produced at low prices for lipozoohms containing such stabilizers. (4) Ultimately, a problem that arises when using lipozomes as carriers in the drug administration system is that they cannot effectively treat the disease. Other explanations for the impossibility of treating the disease are possible, besides being not resistant to rapid clearance and not sustained release. For example, by internalizing lipozomes into target cells or phagocytic cells (such as renal cells), they are quickly removed from the system and packaged for diseases of cells other than RES. The drug will not show a significant effect. After phagocytic activity, the lipozomes' contents are packaged in the lyscsome of phagocytic cells. Very often, compounds packaged by degrading enzymes in lysozomes are decomposed, or the compound is inactivated by changing the structure of the compound at its active site or by decomposing the compound. Moreover, lipozoom may not be able to deliver the drug properly because of poor packaging efficiency of the active compound.

리포조옴은 여러 연구자들에 의해 모형 막계통으로 사용되고 있거나 보체(補體) 매개에 의한 면역학적 검정에 "표적세포"로 활용되고 있다. 그러나 이러한 검정에 사용할 경우 혈청속에 잠복시키면 리포조옴막이 누설되지 않는데 그 이유는 이러한 검정에 의해 어떤 면역글로블린을 포함하는 면역 흑착물 형성(예 IgM 및 어떤 IgG 분자들)으로 혈청 보체 활성화의 기능으로서 리포조옴 내용물을 방출하는 것을 측정할 수 있기 때문이다.Liposomes have been used by many researchers as model membrane systems or as "target cells" for complement-mediated immunological assays. However, when used in these assays, immersion in serum does not leak the lipozoom membrane, because the assay results in the formation of an immunoglobulin containing some immunoglobulins (eg IgM and certain IgG molecules) as a function of serum complement activation. This is because it is possible to measure the release of the ohm content.

본 발명은 안정한 복박층상 포(SPLV)인 새로운 형태로 개량된 리피드포에 관한 것이다. 다중층 포(MLV)와는 구조적으로 상이한 것은 제쳐 두더라도 SPLV는 MLV와는 상이하게 제조되며 MLV에 비해 독특한 성질을 가지며 이러한 MLV에 비해 상이한 여러가지 장점을 가진다. 이러한 여러가지 상이성으로 인하여 종래의 리피드포에 의해 제기된 여러 문제점들을 SPLV에서 해결한 것이다.The present invention relates to a lipid-improved new form which is a stable double layered fabric (SPLV). Apart from the structural differences from multilayer fabrics (MLV), SPLVs are manufactured differently from MLVs, have unique properties over MLVs, and have many different advantages over these MLVs. Due to these various differences, the SPLV solves various problems raised by the conventional Lippo.

리피드포의 불균질 혼합물은 SPLV를 합성하면 얻게된다. 그 실증으로서는 SPLV속의 리피드는 신규의 초분자(超分子) 구조중에서 형성된다는 점에서 알 수 있다. 대다수의 리피드포는 고도의 이중층을 가지는데 그 수는 100겹정도로 크게 구성되어 있다. 이러한 고도의 겹이 형성되므로서 설명은 이론적일 수 있겠으나 SPLV가 놀라운 성질을 가지게 되는 것이다.A heterogeneous mixture of lipido is obtained by synthesizing the SPLV. The demonstration shows that lipids in the SPLV are formed in a novel supramolecular structure. The majority of lipidpoes have a high degree of double layer, which is largely composed of about 100 layers. With this high level of formation, the explanation may be theoretical, but the SPLV has surprising properties.

SPLV의 성질을 보면 : (1) 다른 방법론으로서는 치료가 불가능한 어떤 종류의 질환도 치료할 수 있고, (2) 완충액중에서 저장도중 SPLV는 장기간 안정성을 가지며, (3) SPLV는 가혹한 생리학적인 환경에 대해서도 큰 내성(耐性)을 가지며, (4) 여러 물질을 큰 효율로 포장할 수 있고, (5) 장기간 조직과 세포에 접착되며, (6) 포장된 물질이 체액중에 서서히 방출되며, (7) 표적세포의 시토졸(CYTOSOL)을 통해 리포조옴 내용물이 완전히 분산되고, (8) 제조경비가 염가로 되며, (9) 화합물이 생체내에서 생체활성 물질 형태로 방출이 된다는 등이다.The properties of SPLV are: (1) it can cure any kind of disease that cannot be cured by other methodologies, (2) long-term stability of SPLV during storage in buffer, and (3) SPLV is large for severe physiological environments. It is resistant, (4) able to package various substances with great efficiency, (5) adheres to tissues and cells for a long time, (6) the packaged substances are released into the body fluid slowly, and (7) target cells CYTOSOL of the lipozoom content is completely dispersed, (8) manufacturing cost is inexpensive, (9) the compound is released in the form of a bioactive material in vivo.

SPLV가 독특한 성질을 가지므로 해서 생체내에서 투여계통의 운반체로서 SPLV가 특히 유용하게 이용되는데 그 이유는 SPLV가 제거율에 대한 저항성이 있고 지속성이 있기 때문이다. 생체내에서의 생체 활성 화합물 전달용으로서의 SPLV의 이용방법과 전염병 치료같은 병리학적인 치료에 대해 상술한다.Because SPLVs have unique properties, SPLVs are particularly useful as carriers of administration systems in vivo because SPLVs are resistant and persistent to removal rates. The use of SPLVs for the delivery of bioactive compounds in vivo and pathological therapies such as the treatment of infectious diseases are described in detail.

SPLV제조SPLV Manufacturing

앞서 기술된 바 있는 기타 리포조옴과는 특이하게 다른 것을 제조할 수 있는 방법에 따라 SPLV를 제조한다.The SPLV is prepared according to a method that can produce something uniquely different from the other lipozomes described above.

SPLV는 몇겹 내지 100겹이상의 리피드 이중층으로 된 리피드 포이다. 이중층의 중심쪽을 향해 안쪽으로 무극성의 소수성(疎水性) 탄화수소(말단 점이 있으며 액상쪽을 향해 친수성(親水性)의 "머리부분"이 있는 양극성(兩極性) 리피드로 된 2분자막으로 막 이중층이 구성되어 있다. 이중충으로 폐쇄된 것은 액실(液室)인데, 이중 일부는 포의 강(腔 : Lumen)을 형성하고 있으며 일부는 인접한 막사이에 위치하고 있다. 리피드 이중층과 결합되어 있는 것은 여러가지 단백질, 당단백질, 당지질, 무토 다당류(mucopolysaccharide) 기타 소수성 및 양극성 물질이다.SPLV is a rapid fabric of several layers to 100 layers of repeat bilayers. Membrane bilayer with a bipolar membrane of bipolar lipids with a nonpolar hydrophobic hydrocarbon (end point and hydrophilic "head" towards the liquid phase towards the center of the bilayer) Closed by double worms are liquid chambers, some of which form the pores of the Lumen, and some of which are located between adjacent membranes. Proteins, glycoproteins, glycolipids, mucopolysaccharides and other hydrophobic and bipolar substances.

SPLV의 제조방법은 다음과 같다.The manufacturing method of SPLV is as follows.

양극성 리피드 또는 리피드 혼합물을 유기용매에 용해시킨다. 여기에 사용되는 유기용매는 여러가지가 적합하지만 디에틸에테르, 플루오로화 탄화수소 및 플루오로화 탄화수소와 에테르와의 혼합물이 좋다. 이 용액에다 포장될 활성 첨가물과 액상을 첨가한다. 이 이중상(相) 혼합물을 용매속에서 예멀전화하여 용매를 증발시키므로서 SPLV로 전환시킨다. 음파 파쇄처리도중이나 처리후에 증발됨, 즉 비활성가스를 혼합물위로 통과시켜 가열 또는 진공처리하여 증발시키는 방법에 의해 증발처리를 한다.The bipolar lipid or lipid mixture is dissolved in the organic solvent. Various organic solvents used herein are suitable, but diethyl ether, fluorinated hydrocarbons and mixtures of fluorinated hydrocarbons and ethers are preferred. To this solution is added the active additive to be packaged and the liquid. This dual phase mixture is converted to SPLV by emulsifying in solvent to evaporate the solvent. During or after the sonic crushing treatment, the evaporation is carried out by evaporation by heating or vacuuming the inert gas through the mixture.

용매의 사용량을 액상물질이 혼합물중에서 완전히 에멀전화될 수 있을 정도의 충분한 량으로 한다. 실제로 용매와 액상의 체적비를 약 3 : 1 정도가 되게 사용하는데 용매와 액상의 체적비율을 100이상 : 1로 할 수 있다. 리피드량은 에멀전 방율을 코오팅하는데 필요한 량을 초과할 정도의 충분한 량으로 한다(액상 1ml당 리피드 약 40mg). 제조경비효율면을 고려하여 상한선을 제한하지만 액상 1ml당 리피드 15gm으로 SPLV를 제조할 수 있다.The amount of the solvent used is sufficient to allow the liquid substance to be fully emulsified in the mixture. In fact, the volume ratio of the solvent to the liquid phase is about 3: 1, but the volume ratio of the solvent and the liquid phase can be 100 or more: 1. The amount of lipid is sufficient to exceed the amount necessary to coat the emulsion rate (about 40 mg of lipid per ml of liquid phase). Although the upper limit is limited in consideration of manufacturing cost efficiency, SPLV can be produced with 15 gm of lipid per 1 ml of liquid.

이 방법에 의해 종래의 리포조옴과는 상이한 초분자 구조를 가진 리피드포를 제조한다. 본 발명에 의한 전체 제조공정을 리피드의 상전이 온도와는 관계없이 4°-60℃의 온도범위에서 실시한다. 이것에 대한 정잠은 용이하게 변성되는 단백질 같은 소요의 성질을 가진 열에 대해 불안정한 생성물을 디스테아로일 포스파디딜콜린 같은 인지질로부터 제조한 SPLV에 첨가하여 사용할 수 있으나 이들의 상전이 온도이상의 온도에서만이 종래의 리포조옴으로 변화시킬 수 있다는 점이다. 이 방법을 사용하면 보통 수용성 물질 20%이상을 포장시킬 수 있고, 리피드 가용성 물질 40% 이상을 포장시킬 수 있다. MLV를 사용하면 액상의 포장이 보통 10%를 초과하지 못한다. 대개의 양극성 리피드는 SPLV의 구성성분이다. 적당한 친수성기(親水性基)로서는 포스파토기, 카르복실기, 술파토기 및 아미노기가 있다. 적당한 소수성기로서는 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기와 최소한 한개의 방향족기 또는 시클로 지방족기로 치환된 지방족 탄화수소기가 있다. 적합한 양극성 화합물로는 인지질 및 이에 근사한 화학 구조를 가진 것들이 있다. 이것들의 예로서는 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소파리딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시올, 스핀고미엘틴, 카르디올티핀, 포스파티드산 및 세레브로시드가 있다. SPLV 제조에 사용하기에 적합한 리피드의 특수한 예로서는 천연 레시틴(예 : 란(egg) 레시틴 또는 대두 레시틴)과 합성 레시틴을 포함하는 인지질이 있는데 합성 레시틴으로서는 포화 합성 레시틴(예 : 디미리스토일포스파티딜콜린 또는 디팔미토일-포스파티딜콜린 또는 디스테아로일-포스파티딜콜린)과 불포화 합성 레시틴(예 : 디올티오일-포스파티딜콜린 또는 디리놀오일-포스파티딜콜린)이 있다. SPLV 이중층에는 콜레스테롤, 코프로스탄올, 콜레스탄올, 콜레스탄등과 같은 스테로이드 성분을 함유할 수 있다. 이를 화합물을 산성의 친수성기(포스파토기, 술파토기 등)과 사용할 경우 생성된 SPLV는 음이온성이 되고 아미노기와 같은 염기성기와 사용할 경우에는 양이온성의 리포조음이 얻어지며, 폴리에틸렌옥시기 또는 글리콜기와 사용할 경우에는 중성의 리포조음이 얻어진다. SPLV의 크기는 광범위하게 달라지는데 그 범위는 약 500nm-약 10,000nm(10마이크론)이며 보통 약 1,000nm-약 4,000nm이다.By this method, lipid lipids having a supramolecular structure different from those of conventional lipozomes are prepared. The entire manufacturing process according to the invention is carried out in a temperature range of 4 ° -60 ° C regardless of the phase transition temperature of the lipid. This can be used by adding heat-stable products with the necessary properties, such as easily denatured proteins, to SPLVs prepared from phospholipids such as distearoyl phosphadidylcholine, but only at temperatures above their phase transition temperature. Can be changed to This method usually packs 20% or more of the water soluble material and 40% or more of the lipid soluble material. With MLV, liquid packaging usually does not exceed 10%. Most bipolar lipids are components of the SPLV. Suitable hydrophilic groups include phosphato groups, carboxyl groups, sulfato groups and amino groups. Suitable hydrophobic groups include saturated and unsaturated aliphatic hydrocarbon groups and aliphatic hydrocarbon groups substituted with at least one aromatic or cycloaliphatic group. Suitable bipolar compounds include those having phospholipids and chemical structures close to them. Examples of these are lecithin, phosphatidylethanolamine, lyso lecithin, lysoparylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinosinols, spinomieltin, cardioolthipine, phosphatidic acid and cerebroside. Specific examples of lipids suitable for use in the manufacture of SPLVs include phospholipids, including natural lecithin (eg egg lecithin or soy lecithin) and synthetic lecithin. Synthetic lecithin is saturated synthetic lecithin (eg dimyristoylphosphatidylcholine or di-). Palmitoyl-phosphatidylcholine or distearoyl-phosphatidylcholine) and unsaturated synthetic lecithins, such as diolthioyl-phosphatidylcholine or dirinoyl-phosphatidylcholine. The SPLV bilayer may contain steroid components such as cholesterol, coprostanol, cholestanol, cholestan and the like. When the compound is used with an acidic hydrophilic group (phosphato group, sulfato group, etc.), the resulting SPLV is anionic and when used with a basic group such as an amino group, a cationic lipozoic sound is obtained, and when used with a polyethyleneoxy group or a glycol group. A neutral lipozoic sound is obtained. The size of the SPLV varies widely, ranging from about 500 nm to about 10,000 nm (10 microns), usually about 1,000 nm to about 4,000 nm.

실제로 SPLV속에 생체 활성화합물을 포장시킬 수 있다(포장이란 것은 액실 또는 막이중층속에 가두어 두는 것을 뜻함). 이러한 화합물로서는 헥산(mucleic acid), 폴리뉴클레오티드, 항세균화합물, 항비루스화합물, 항진균화합물, 구충(驅蟲)화합물, 종양화합물, 단백질, 독소, 효소, 호르몬, 신경전달물질, 당단백질, 면역글로볼린, 염료, 방사성표지물질, 방사성불투과물질, 형광물질, 다당류, 분자결합성 세포수용체, 소염제, 항녹내장제, 산동제(散瞳劑), 국부마취제 등이 있다.Indeed, it is possible to package a bioactive compound in an SPLV (packaging means to be confined in a liquid chamber or a membrane double layer). These compounds include hexane (mucleic acid), polynucleotides, antibacterial compounds, antiviral compounds, antifungal compounds, antiparasitic compounds, tumor compounds, proteins, toxins, enzymes, hormones, neurotransmitters, glycoproteins, immunoglobulins. Lobulin, dyes, radiolabels, radiopaque materials, fluorescent materials, polysaccharides, molecularly binding cell receptors, anti-inflammatory agents, anti-glaucoma agents, acidic agents, and local anesthetics.

다음에 나오는 것은 SPLV 합성시에 사용되는 첨가 비율이 예이다. 즉 BHT(부틸화 히드록시톨루엔) 5㎍을 함유한 디에틸에테르 5ml에다 인지질 50마이크로몰을 첨가한 다음 포장될 활성물질을 함유한 액상물질 0.3ml을 첨가하여 SPLV를 만든다. 생성된 용액은 포장될 물질과 포장용 리피드로 되어 있는데, 이것을 음파파쇄하면서 혼합물위로 비활성가스를 통과시키므로서 대부분의 용매를 제거한다. 이 예에 의하여 BHT가 포의 속으로 결합되기 때문에 특히 안정한 SPLV를 만들 수 있게 된다. 등의 방법(1982, Eur. j. Biochem 121 : 475-482)에서는 클로로포름과 에테르의 혼합물에 액상을 첨가한 혼합물중에서 콜레스테롤과 포스파티딜콜린의 용액을 음파파쇄 및 증발처리하여 리포조옴으로 포장된 항체를 제조하는 방법을 상술하고 있는데 리피드와 액상의 상대적인 비율에 대해 제시가 되어있지 않다.The following is an example of the addition rate used in the SPLV synthesis. That is, SPLV is prepared by adding 50 micromoles of phospholipid to 5 ml of diethyl ether containing 5 µg of BHT (butylated hydroxytoluene) and then adding 0.3 ml of a liquid substance containing the active substance to be packaged. The resulting solution consists of the material to be packaged and the packing lipid, which is sonicated to remove most of the solvent by passing an inert gas over the mixture. In this example, the BHT is incorporated into the artillery, making it possible to produce particularly stable SPLVs. (1982, Eur. J. Biochem 121: 475-482) in the mixture of chloroform and ether in liquid phase, sonicated and evaporated a solution of cholesterol and phosphatidylcholine to prepare an antibody packaged with lipozoohm. This method is described in detail, but the relative ratio between lipid and liquid is not suggested.

SPLV는 단일겹 또는 몇겹으로 되어 있는 리포조옴(예 : SUV, REV)과는 그 성질에 있어서 명확히 구분이 된다. 동결열극(凍結裂隙)을 전자 현미경으로 관찰한 결과에 의하면 SPLV조제물은 SUV와 REV가 거의 없는 것으로서 포중의 20% 이하가 단일층으로 되어 있었다. 그러나 이것들은 물성이 대다수 상이하였으나 전지현미경법으로 관찰한 결과는 MLV와는 구별이 되지 않았다. 따라서 다음에 나오는 상세한 비교는 SPLV와 MLV간의 명확한 구별에 초점을 둔 것이다.SPLVs are clearly distinguished in their properties from single- or multi-layer lipozomes (eg SUV, REV). Electron microscopy of the frozen thermode revealed that the SPLV preparation had almost no SUV and REV, with less than 20% of the envelope in a single layer. However, these properties were largely different, but the results of observation by cell microscopy were indistinguishable from MLV. The following detailed comparison therefore focuses on a clear distinction between SPLV and MLV.

리피드포의 안정성은 포가 장기간에 걸쳐 외부 환경으로부터 밀폐된 공간이 격리될 수 있는 능력을 뜻한다. 리피드 포를 사용하자면 저장 및 취급도중 안정성이 영구하여야 한다. 어떤 곳에 적용하자면 포가 그 내용물을 서서히 배출해야 한다. 기타 다른데 적용하자면 포는 투여후에 그대로 보존된 상태에서 소요의 작용위치에 도달해야 한다. 여기서 알 수 있는 것은 SPLV는 이러한 소요의 특성을 발휘하지만 MLV는 그렇지 않다. 포가 배출할 수 있도록 하는 인자가 두가지 있다. 그 하나는 리피드의 자동산화에 의해 탄화수소 사슬이 과산화물을 형성하여 이중층을 불안정하게 하는 것이다. 이 산화작용은 부틸화 히드록시 톨루엔(BHT)같은 항산화재를 포조제물에 첨가하므로서 격심하게 지체된다. 외부 환경에 있는 첨가물들이 리피드가 그대로 보존될 정도로 리피드의 이중층 구조를 파괴시키나 막에 기공이 생성되므로 해서 포의 누설작용이 생기게 된다.Lipidpo stability refers to the ability of the fabric to isolate enclosed spaces from the external environment over a long period of time. The use of a lipid cloth should be stable during storage and handling. In some applications, the gun should slowly drain its contents. For all other applications, the fabric should reach the site of action as required after administration. It can be seen that the SPLV exhibits this requirement but the MLV does not. There are two factors that allow the gun to discharge. One is that the automatic oxidation of the lipids causes hydrocarbon chains to form peroxides which destabilize the bilayer. This oxidation is severely delayed by adding antioxidants such as butylated hydroxy toluene (BHT) to the preparation. The additives in the external environment destroy the double layer structure of the lipids to the extent that the lipids are preserved intact, but the pores are generated in the membrane, thereby causing the leakage of the cells.

제조된 리피드포는 처음 제조되었을 때는 색상이 백색이나 자동산화가 되고나면 갈색으로 변색된다. 동일한 리피드와 액상성분으로된 SPLV와 MLV를 비교해 보면 MLV는 1-2주내에 변색하지만 SPLV는 최소환 2계월간 백색상태로 있게 된다. 이 사실은 리피드의 박막 크로마토그래피 결과에서도 나타났는데, 즉 MLV의 리피드는 분해되었으나 SPLV의 리피드는 분해되지 않았다. 이러한 포를 기타 첨가성분 및 BHT를 첨가하여 제조할 경우 MLV는 1개월내에 다소 변색된 것 같았으나 SPLV는 백색 그대로 있었고 최소한 6개월이상 안정한 상태로 있었다.The manufactured Lippo is initially white in color, but discolored brown after automatic oxidation. Comparing SPLVs and MLVs with the same lipids and liquid components, the MLVs discolor in 1-2 weeks, but the SPLVs remain white for at least two months. This fact is also shown in the results of the thin layer chromatography of lipids, that is, the lipids of MLV are degraded but the lipids of SPLV are not. When the fabric was prepared with other additives and BHT, the MLV appeared to be discolored within 1 month, but the SPLV remained white and stable for at least 6 months.

등장성(等張性) 염용액을 함유한 중성 pH의 완충용액중에 두었을 때 항생물질을 함유한 SPLV는 표 I에 있는 바와 같이 4개월이상 동안 안정한 상태로 있었다. 표에 나온 데이터를 보면 SPLV중에 최초부터 포장된 항생물질중 어느 것이나 실험기간동안 배출되지 않았음을 알 수 있다.When placed in neutral pH buffer solution containing isotonic salt solution, the antibiotic-containing SPLV remained stable for at least 4 months as shown in Table I. The data in the table shows that none of the antibiotics initially packaged in the SPLV were released during the experiment.

[표 I]TABLE I

란(EGG) 포스파티딜콜린 SPLV의 4℃에서

개월동안 밀폐용기 중에서의 저장후의 안정성At 4 ° C. of lan (EGG) phosphatidylcholine SPLV

Stability after storage in airtight containers for months

* 란(egg) 포스파티딜콜린(EPC) 127μM과 약물 25μM을 사용하여 SPLV제조, 4℃에서

개월 저장한 후 SPLV를 원심분리에 의해 저장 완충액에서 분리, SPLV 내용물과 상청액의 연속 회석물을 배지에 적용하여 표준 항생물질 희석물에 대한 생체활성도를 측정했음.* SPLV prepared using 127 μM of phosphatidylcholine (EPC) and 25 μM of drug at 4 ° C

After months of storage, SPLVs were separated from the storage buffer by centrifugation, and serial activities of SPLV contents and supernatant were applied to the medium to determine bioactivity against standard antibiotic dilutions.

** 0은 측정 가능범위 이하의 수치임.** 0 is below the measurable range.

기타 예를 보면 SPLV는 칼슘이온만큼 작은 분자로부터 포장된 첨가물들을 6개월이상동안 격리시킬 수 있음을 알 수 있다. 아르센아조 III은 미량의 2가 양이온 존재하에 색상이 적색으로부터 청색으로 변화되는 염료이다. SPLV중에 염료를 포장시켜 저장완충액에다 염화칼슘을 첨가하여 색갈변화를 관찰하므로서 포의 안정성을 측정할 수 있다. 색갈은 최소한 6.5개월동안 최초의 색갈과 검출 불가능할 정도로 있었는데, 이것은 염료가 밖으로 누설되지도 않았고 이온이 침투해 들어가지도 않았음을 뜻한다.Other examples show that SPLV can segregate packaged additives from molecules as small as calcium ions for more than six months. Arsenazo III is a dye whose color changes from red to blue in the presence of trace divalent cations. The stability of the fabric can be measured by packaging the dye in SPLV and adding calcium chloride to the storage buffer to observe the color change. The color was undetectable with the original color for at least 6.5 months, which means that the dye did not leak out and the ions did not penetrate.

이러한 시험결과로부터 SPLV는 저장 및 취급상의 문제도 극복할 수 있을 정도로 충분한 안정성을 가졌음을 알 수 있다. 이러한 안정성을 가진 MLV를 제조할 수 있겠으나 DSPC 같은 합성 리피드로 제조해야만 하기 때문에 제조경비가 비싸지게 된다. 막 교란제가 있는 매체중에 리피드포를 두면 상이한 분자구조를 탐지할 수 있는 방법이 된다. 막을 어떻게 구성하느냐에 따라서 상이한 포가 이러한 막 교란제에 대해 상이하게 응답하게 된다.These test results indicate that the SPLV has sufficient stability to overcome storage and handling problems. Although MLVs having such stability can be manufactured, manufacturing costs are expensive because they must be manufactured with synthetic lipids such as DSPC. Placing lipido in a medium with membrane disturbances provides a way to detect different molecular structures. Depending on how the membrane is constructed, different fabrics will respond differently to these membrane disturbances.

다음에 나오는 실험에 있어서, 폐쇄된 액실속에 방사성 추적자분자(³H 이눌린)을 함유시킨 포를 제조했다. 다당류인 이눌린은 액상속으로 분배해 들어가서 방사능 물질로 표지가 되었을 때 리피드포의 액상 내용물을 추적하는데 이용된다. 첨가제에 대해 적당한 시간동안 노출시킨 후 원신분리에 의해 포를 매체로부터 분리하고 포로부터 매체속으로 이동해간 방사능의 상대적인 량을 측정했다. 이러한 결과는 표 II에 나와 있는데 여기에 나온 값들은 누설율(%)로 나타낸 것으로 포에 포장된 출발물질의 량에 대한 주위에 있는 매체중의 방사성물질의 비율을 뜻하는 것이다.In the following experiment, a fabric was prepared in which a radiotracer molecule ( ³ H inulin) was contained in a closed liquid chamber. The polysaccharide, inulin, is distributed to the liquid phase and used to track the liquid content of Lipidpo when labeled with radioactive material. After exposure to the additive for a suitable time, the relative separation of radioactivity from the media and transfer from the fabric into the media was determined by centrifugation. These results are shown in Table II, where the values are expressed in terms of leak rate (%), which represents the ratio of radioactive material in the surrounding medium to the amount of starting material packed in the fabric.

SPLV는 염산중에서 MLV보다 훨씬 안정성이 있다. 표 II를 보면 란(egg) 레시틴으로 제조했을 경우 MLV와 SPLV는 모두 0.125N 염산중에 1시간 노출되면 안정성이 없어짐을 알 수 있다. 그러나 SPLV는 MLV보다 산의 공격을 상당히 받지 않는 다는데 주목할 필요가 있다. 이러한 상이한 반응정도는 리피드가 주위환경과 작용하는 방법에 고유한 상위점이 있음을 뜻하는 것이다.SPLV is much more stable than MLV in hydrochloric acid. Table II shows that when prepared with egg lecithin, both MLV and SPLV lose stability when exposed to 0.125N hydrochloric acid for 1 hour. It is important to note, however, that SPLVs are not much more attacked by mountains than MLVs. These different degrees of response mean that there are inherent differences in how lipids interact with the environment.

[표 II]TABLE II

기타 환경중에서의 SPLV의 안정성Stability of SPLV in Other Environments

* 보존시간은 HCl에서 1시간인 것외에는 모두 2-4시간임.* Preservation time is 2-4 hours except 1 hour in HCl.

SPLV도 요소에 노출되면 MLV보다 상이하게 반응한다(제1도 및 표 II). 요소는 분자 혼란효과(물의 구조를 파괴함)와 강력한 쌍극자능률을 가진 분자이다. 관찰된 결과를 보면 SPLV는 동일농도에서 염화나트륨과 같은 삼투압제에 대한 것보다 요소에 대해 공격을 훨씬 더 많이 받는다(제1도). MLV는 염화나트륨중에서 보다 요소중에 훨씬 누설되지 않는다. 이러한 상이한 거동에 대한 설명은 이론적인 것이 되겠으나 반응정도는 요소와 유사한 분자인 구아니딘이 SPLV를 불안정하게 하지 못하기 때문에 분자 혼란 특성보다 오히려 쌍극 효과에 기인하는 것으로 생각할 수 있다(표 II). 구아니딘도 강력한 혼란효과를 가지고 있으나 강력한 쌍극자 능률은 없다.SPLVs also react differently to MLVs when exposed to urea (FIG. 1 and Table II). Elements are molecules with molecular chaotic effects (destroying water structure) and strong dipole efficiencies. The observed results show that SPLVs are much more attacked on urea than at the same concentration than on osmotic agents such as sodium chloride (Figure 1). MLVs do not leak much more in urea than in sodium chloride. The explanation for this different behavior may be theoretical, but the degree of reaction can be thought to be due to the bipolar effect rather than the molecular chaotic properties because guanidine, a urea-like molecule, does not destabilize SPLV (Table II). Guanidine has a powerful chaotic effect, but no powerful dipole efficiency.

SPLV는 아세트산 암모늄에 대하여 약하지만 MLV는 그렇지 않다(표 II). 그러나(염화 암모늄중의) 암모늄 이온이나(아세트산 나트륨중)의 아세테이트중 어느 것이나 SPLV를 불안정하게 하는데 특히 효과가 있는 것은 아니다. 따라서 누설을 유발하는 것은 이온 그 자체가 아니라 아세트산 암모늄의 극성인 것이다.SPLV is weak against ammonium acetate but not MLV (Table II). However, neither ammonium ions (in ammonium chloride) nor acetate (in sodium acetate) are particularly effective at destabilizing the SPLV. It is therefore the polarity of the ammonium acetate, not the ion itself that causes leakage.

이러한 결과는 놀라운 것인데 그 이유는 SPLV가 혈청이나 피같은 체액중에 잠복될 경우 MLV보다 훨씬 안정성이 있기 때문이다. 그러나 이 결과에 대한 이론적인 설명을 제안할 수 있다(물론 기타 설명도 가능함). SPLV의 안정성이 리피드막의 극성기가 배향된 물분자 또는 수화각(hydration shell)에 의해 수화될 정도로 이중막의 독특한 구조에 기인하는 것이라면 이러한 수화각을 파괴하거나 간섭을 하는 여하한 첨가물이 구조적인 막의 일체성의 변화를 촉진하므로서 누설이 잘 진행된다는 것은 가능하다.This is surprising because the SPLV is much more stable than the MLV when it is immersed in body fluids such as serum or blood. However, a theoretical explanation for this result can be proposed (other explanations are possible of course). If the stability of the SPLV is due to the unique structure of the double membrane such that the polar group of the lipid membrane is hydrated by the oriented water molecules or the hydration shell, any additives that destroy or interfere with such hydration angles may be responsible for the integrity of the structural membrane. It is possible that leakage will proceed well by promoting change.

요소중에서의 SPLV의 불안정화에 대한 이론적인 설명에는 관계가 없음이 정확하겠으나 결과는 MLV와 SPLV의 구조상의 특징적인 차이를 증명하는 것이 된다. 이러한 차이는 응용면에 있어서 극히 유용한 목적으로 작용한다. 다음에 상술하는 바와같이 SPLV를 눈에 적용했을 경우 서서히 누설이 된다. 이러한 내용물의 느린 방출은 바람직한 것으로서 눈물에 노출이 될 경우의 SPLV의 유사한 불안정화에 기인된 것이다.Although the theoretical explanation for the destabilization of SPLV in the elements is irrelevant, the results demonstrate the structural differences between the MLV and the SPLV. This difference serves an extremely useful purpose in application. Next, as described above, when SPLV is applied to the eyes, leakage occurs gradually. Slow release of this content is desirable and is due to similar destabilization of the SPLV when exposed to tears.

SPLV는 MLV보다 혈청중에서 훨씬 안정성이 있다. 리피드포의 여러가지 응용면으로서는 브루셀라균증 치료의 경우처럼 복강내 투어가 포함된다. 효과적으로 되자면 소요의 목적에 도달할 수 있는 충분한 시간동안 포가 잔존해 있어야 하는 것이다. 란(egg) 레시틴으로 제조한 SPLV와 MLV는 모두 활성 보체(補體)를 함유한 태수(胎水)중의 소 혈청에 노출시켰다(표 II). 37℃에서 48시간 노출시킨 후 SPLV도 MLV보다 훨씬 안정성이 있었다.SPLVs are much more stable in serum than MLVs. Various application areas of Lipidpo include intraperitoneal tours as in the case of Brucellosis. To be effective, the guns need to remain for enough time to reach the purpose of the requirements. Both SPLVs and MLVs made from egg lecithin were exposed to bovine serum in mesentery containing active complement (Table II). After 48 hours of exposure at 37 ° C., the SPLV was much more stable than the MLV.

SPLV는 생체내에서 투여계통의 운반체로서 특히 적합한 여러가지 특징을 가지고 있다.SPLVs have several characteristics that make them particularly suitable as carriers of administration systems in vivo.

(A) SPLV는 제거에 대한 저항성이 있다. SPLV를 기관에 투여하면 리피드 성분과 포장된 활성성분은 모두 조직내에서 잔류되고 투여되는 대상의 세포에 의해 잔류된다.(A) SPLVs are resistant to removal. When the SPLV is administered to an organ, both the lipid component and the packaged active ingredient remain in the tissue and are retained by the cells of the subject to be administered.

(B) SPLV를 지효성이 있도록할 수 있다. SPLV의 안정성은 저장도중 SPLV가 극히 안정하며 체액존재시에도 안전하고 생체내에 투여했을 때 활성성분이 서서히 배출되므로 해서 활성 성분의 지속적인 효력을 나타내도록 할 수 있다는 점에서 "조절 가능한" 것이다.(B) The SPLV can be made effective. The stability of the SPLV is "controllable" in that the SPLV is extremely stable during storage, is safe even in the presence of body fluids, and the active ingredient is slowly released when administered in vivo, thereby enabling the active ingredient to have a sustained effect.

(C) 투여했을 때의 포장물과 안정성이 고도로 발휘되기 때문에 활성 성분의 유효용량이 배출된다.(C) The effective dose of the active ingredient is released because the package and the stability at the time of administration are highly exerted.

(D) SPLV의 제조는 이중층속에 고가의 안정제를 첨가하지 않고서도 포의 안정성을 얻을 수 있다는 점에서 경비면에서 극히 효과적이다.(D) The production of SPLV is extremely cost effective in that the stability of the fabric can be obtained without adding an expensive stabilizer in the double layer.

다음에 나오는 실험은 시험용 동물의 눈에 국소 투여했을 때 SPLV의 특성중 몇가지를 실증한 것이다. 이 실험에 사용된 SPLV는 리피드 이중층과 활성성분을 각각 방사성물질로 표지를 하여 일정시간에 걸쳐 눈조직내에서 이들 성분을 추적하도록 한점외에는 앞서 상술된 바와 같이하여 제조했다.The following experiment demonstrates some of the properties of SPLV when administered topically to the eye of a test animal. The SPLVs used in this experiment were prepared as described above, with one point being that the lipid bilayer and the active ingredients were labeled with radioactive materials respectively to track these components in eye tissue over time.

란(egg) 포스파티딜콜린(EPC) 100mg과 황산 젠타마이신 100mg을 이용하여 SPLV를 제조했다. 125_I-프스파티딜 에탄올아민(125_I-PE) 추적량을 이중층속에 첨가하여 리피드성분을 방사성으로 표지하는 한편 액상중의 활성성분을 125_I-황상젠타마이신(125_I-GS)의 첨가로 방사성으로 표시하였다.SPLV was prepared using 100 mg of egg phosphatidylcholine (EPC) and 100 mg of gentamicin sulfate. 125 _I - by the addition of hwangsang gentamicin (125 _I-GS) - peuseu party dill ethanolamine (125 _I-PE) was added a trace amount in a double layer with the active ingredient of the cover of the lipid component in the radiation while liquid 125 _I Marked radioactive.

SPLV를 완충액으로 반복하여 세척하여 미결합 되었거나 미포장된 물질을 효과적으로 제거하였다.SPLV was washed repeatedly with buffer to effectively remove unbound or unpacked material.

SPLV 조제물을 분취(分取)한 것을 제거하고 추출하여 액상으로부터 유기상(有機相)을 분리했다. 각 상(相)의 방사능을 측정하여 SPLV속에 결합된 125_I-PE: 125_I-GS의 초기 비율을 cpm(counts per minute) 단위(리피드의 cpm : 액상중의 cpm)로 측정했다.An aliquot of the SPLV preparation was removed and extracted to separate the organic phase from the liquid phase. The radioactivity of each phase was measured and the initial ratio of 125 _I-PE : 125 _I-GS bound to the SPLV was measured in units per minute (cpm of lipids: cpm in liquid phase).

추출과정을 다음과 같이 했다.The extraction process was as follows.

0.4M NaCl 수용액 0.8ml, 클로로포름 1ml 및 메탄올 2ml를 혼합하여 균일상을 만든 다음 방사능으로 표지된 SPLV4를 첨가하고 혼합했다. SPLV성분이 액상과 유기상중으로 용해함에 따라 처음에는 혼탁하였던 혼합물이 투명하게 되었다. 0.4M NaCl 수용액 1ml와 클로로포름 1ml를 첨가 혼합하여 둔후 2800×g에서 5분간 원심분리하므로서 각 상(相)을 분리했다. 각 상중의 1ml 분취액에 대해 방사능측정(cpm)단위로) 측정했다(초기의 125_I-PE: 125_I-GS비율은 1.55 : 1이었다).0.8 ml of 0.4 M aqueous NaCl solution, 1 ml of chloroform and 2 ml of methanol were mixed to form a homogeneous phase, and then radioactively labeled SPLV4 was added and mixed. As the SPLV component dissolved into the liquid and organic phases, the initially cloudy mixture became transparent. Each phase was separated by adding and mixing 1 ml of 0.4 M aqueous NaCl solution and 1 ml of chloroform, followed by centrifugation at 2800 × g for 5 minutes. 1 ml aliquots of each phase were measured in radiometric measurements (cpm) (the initial 125 _I-PE : 125 _I-GS ratio was 1.55: 1).

성장한 수컷쥐(Swiss Webster mice) 15마리를 마취시켜 속박시켰다(이 쥐들이 눈을 닦아내지 못하도록 하기 위한 것임).Fifteen grown Webster mice were anesthetized and restrained (to prevent these mice from wiping their eyes).

현탁액중에 방사능 물질로 표지된 SPLV 동일량(2㎕)을 취하여 쥐의 눈에 국부적으로 가했다. 세마리씩 무리를 지어 각 무리를 1, 2, 3, 18 및 24시간의 시점에서 처리했다. 9마리의 주 (Swiss Webster mice)(대조준)에 대해서는 방사능으로 표지된 황산젠타마이신 수용액 동일량(2㎕)을 눈에 국부적으로 가하여 동일하게 처리했다. 3마리의 대조용 동물로 된 무리를 1, 4 및 8시간째 되는 시각에서 처치했다.An equal amount (2 μl) of SPLV labeled radioactive material was taken in the suspension and added locally to the rat eye. Three herds were treated in groups at 1, 2, 3, 18 and 24 hour time points. For nine strains (Swiss Webster mice) (control), the same amount (2 μl) of radiolabeled aqueous solution of gentamicin sulfate was applied locally to the eyes and treated the same. Flocks of three control animals were treated at 1, 4 and 8 hours of time.

처치한 즉시 동물의 눈꺼풀을 제거하고 다진 후(앞서 상술된 방법을 이용하여) 추출하므로서 리피드성분으로부터 액상성분을 분리하였다. 이 상(相)의 방사능을 측정함과 아울러 방사능 총계수를 측정했다. 리피드상에서 측정한 방사능은 눈조직에서 나타내는 SPLV 리피드의 보유량인 반면액상에서 측정한 방사능은 눈조직에서 나타내는 젠타마이신의 보유량이다. 제2도는 눈꺼풀조직에서의 각 성분의 보유량을 나타낸 것이다(눈에 가한 최초의 총 cpm에 대한 백분율로 나타낸 것임).Immediately after treatment, the animal's eyelids were removed, chopped (using the method described above), and the liquid components were separated from the lipid components by extraction. The radioactivity of this phase was measured and the radioactivity total coefficient was measured. The radioactivity measured on the lipid phase is the retention of SPLV lipids in the eye tissue, while the radioactivity measured on the liquid phase is the retention of gentamicin in the eye tissue. Figure 2 shows the retention of each component in the eyelid tissue (expressed as a percentage of the first total cpm added to the eye).

제2도는 24시간 경과후의 눈꺼풀조직에 있는 SPLV 리피드성분의 보유량과 24시간 경과후의 SPLV로부터 나온 젠타마이신의 지속적인 배출량을 나타낸 것이다(이 시간동안 눈꺼풀 조직내에 잔존하는 젠타마이신의 백분율로 나타낸 것임). 제2도는 또한 미포장된 젠타마이신(국부적으로 투여된 액상의 젠타마이신)이 눈꺼풀 조직으로부터 신속히 제거되었음을 예시한 것이다. 예를 들자면 용액중의 젠타마이신(대조용)은 4시간이내에 눈꺼풀조직에서 제거되었다(눈꺼풀 조직내에 잔존한 젠타마이신의 5%이하). 한편으로 SPLV로 포장된 젠타마이신의 50% 이상은 이와 같은 4시간에 있어서는 눈꺼풀조직에 의해 보유되고 있었다. 사실상 24시간이 종료된 시점에서 SPLV로 포장된 젠타마이신의 15% 이상이 눈꺼풀조직에 의해 보유되었다. 이것은 SPLV로 포장된 젠타마이신의 약 85%가 24시간 경과후에 배출된 한편 미포장된 황산젠타마이신의 95%는 4시간이내에 제거되었음을 가리키는 것이다.Figure 2 shows the retention of SPLV lipid components in the eyelid tissue after 24 hours and the sustained release of gentamicin from SPLV after 24 hours (expressed as the percentage of gentamicin remaining in the eyelid tissue during this time). FIG. 2 also illustrates that unpackaged gentamicin (a locally administered liquid gentamicin) was rapidly removed from eyelid tissue. For example, gentamycin (control) in solution was removed from eyelid tissue within 4 hours (less than 5% of gentamycin remaining in eyelid tissue). On the other hand, more than 50% of SPN-packed gentamicin was retained by the eyelid tissue at these 4 hours. In fact, at the end of 24 hours more than 15% of the gentamicin packaged with SPLV was retained by the eyelid tissue. This indicates that about 85% of SPN-packed gentamicin was released after 24 hours, while 95% of unpackaged gentamycin was removed within 4 hours.

표 III은 각 시점에서 눈꺼풀조직에 잔류하는 SPLV 리피드상 : 액상의 비율을 비교한 것인데 이 비율이 증가한 것은 SPLV로부터 젠타마이신이 방출되었음을 나타내는 것이다.Table III compares the ratio of SPLV lipid phase: liquid remaining in the eyelid tissue at each time point, indicating an increase in the release of gentamicin from SPLV.

눈꺼풀조직에 의해 잔존하는 SPLV로 포장된 황산 젠타마이신의 생체활성을 평가해 보았다. SPLV로 포장된 황산 젠타마이신을 눈에 적용한 지 3시간뒤에 제조한 눈꺼풀추출물의 액상으로부터 분취량을 제거하므로서 눈꺼풀조직으로부터 황산 젠타마이신을 회수하였다. 액상을 계열희석하여 2㎕ 분취량을 평면 한천위의 포도상구균(Staphylococcus aureus) 베지에 두어 24시간 배양한 후 억제범위를 측정하였다. SPLV로 포장된 황산 젠타마이신으로 처리된 동물의 눈꺼풀 조직추출물로부터 회수한 황산젠타마이신은 완전히 그 생체활성을 유지하고 있었다.The bioactivity of gentamycin sulfate packed with SPLV remaining by the eyelid tissue was evaluated. Gentamicin sulfate was recovered from the eyelid tissue by removing an aliquot from the liquid phase of the eyelid extract prepared 3 hours after application of SPLV-packed gentamicin to the eye. After diluting the liquid phase, 2 μl aliquots were placed on a flat agar on Staphylococcus aureus, and incubated for 24 hours, and the inhibition range was measured. Gentamicin sulfate recovered from eyelid tissue extracts of animals treated with SPLV-packed gentamycin remained fully bioactive.

[표 III]TABLE III

쥐의 눈에 국부처리후의 SPLV로 포장된 젠타마이신의 지속적인 배출Continuous release of gentamycin packaged with SPLV after topical treatment in rat eyes

전자 현미경으로 보면 SPLV와 MLV가 동인한 것으로 보이지만 전자 스핀공명(ESR : electron spin resonance)에 의하면 초분자구조에 차이가 있다. SPLV는 분자배열과 분자운동이 크고 아스코르브산염에 대한 투과성이 훨씬 크기 때문에 분자 구성에 있어서 MLV와는 구별이 된다. 이러한 분자구성의 차이로 인하여 상이한 생물학적인 효과가 나타나게 된다.On the electron microscope, SPLV and MLV appear to be the driver, but there is a difference in supramolecular structure according to electron spin resonance (ESR). SPLV is distinguished from MLV in molecular composition because of its large molecular arrangement and molecular motion and its greater permeability to ascorbate. These molecular differences result in different biological effects.

전자스핀 공명 분광학에서는 5-독설 스테아레이트(5-doxyl stearate : 5DS) 같은 스핀 프로우브(spin probe)를 리피드 이중층속에 결합시킨다. 독실기의 짝 안지은 전자는 시료가 자장(磁場)속에 삽입될 때 마이크로파 에너지를 흡수한다.In electron spin resonance spectroscopy, spin probes such as 5-doxyl stearate (5DS) are bound to the lipid bilayer. The unpaired electrons of the toxin group absorb microwave energy when the sample is inserted into the magnetic field.

이 흡수 스펙트럼으로부터 세가지 실험변수, 즉 차수매개변수(S), 초미세 결합상수(A₀) 및 회전 상관시간(Tau)를 결정할 수 있다. 제3도에는 대표적인 스펙트럼이 나와 있는데 여기서 A는 SPLV신호이고 B는 MLV신호인데 이들 두가지는 모두 5-독실 스테아레이트로 표지가 되어있다. 이 스펙트럼은 실온에서 얻은 것으로서 스캔(scan) 범위는 100가우스(Gauss)이었다.From these absorption spectra, three experimental variables can be determined: the order parameter (S), the ultrafine coupling constant (A ₀ ), and the rotation correlation time (Tau). Figure 3 shows a representative spectrum, where A is the SPLV signal and B is the MLV signal, both of which are labeled with 5-doxy stearate. This spectrum was obtained at room temperature and the scan range was 100 Gauss.

차수매개변수(S)는 2T₁과 2T₁₁의 두가지에 의존하는 것으로서 관측된 ESR신호가 프로우브의 완전히 균일한 배향의 경우로부터 벗어나는 정도를 측정한다. 균일히 배향된 시료의 경우 S=100이고 무질서한 시료의 경우 S=0이다. 초미세 결합상수 (A₀)는 2T₁과 2 T₁₁으로 부터 계산할 수 있는데 국부적인 편극을 나타내는 것으로서 막내에서의 스핀프로우브의 위치를 가리킨다. 회전 상관 시간(이것은 W₀, h₀, h-1에 의존함)은 분자가 이전의 공간 배향의 상태를 잊어버리는데 소요되는 시간으로 생각할 수 있다. 대표적인 스핀 프로우브로서 5-DS를 가지는 MLV와 SPLV간의 차이의 대표적인 ESR측정결과는 표 IV에 나와 있다.The order parameter (S) depends on two things, 2T ₁ and 2T ₁₁ , and measures the degree to which the observed ESR signal deviates from the case of a perfectly uniform orientation of the probe. S = 100 for uniformly oriented samples and S = 0 for disordered samples. The ultrafine coupling constant (A ₀ ) can be calculated from 2T ₁ and 2 T ₁₁ , indicating local polarization and indicating the position of the spin probe in the membrane. The rotation correlation time (which depends on W ₀ , h ₀ , h −1) can be thought of as the time it takes for the molecule to forget the state of the previous spatial orientation. Representative ESR measurements of the difference between MLV and SPLV with 5-DS as the representative spin probe are shown in Table IV.

[표 IV]TABLE IV

SPLV와 MLV의 ESR특성ESR Characteristics of SPLV and MLV

두가지 경우에 있어서 미중층의 동일한 길이로부터 스핀 프로우브가 나타나고 있을지라도 SPLV는 MLV보다 훨씬 큰 분자배열과 분자운동을 가지고 있다.In both cases, SPLVs have much larger molecular alignments and molecular motions than MLVs, even though spin probes appear from the same length of the middle layer.

SPLV와 MLV간의 차이의 다른 예를보면 아스코르브산염이 독설스핀 프로우브를 환원시키는 능력을 가지고 있다. 아스코르브산염은 독실성분을 그들의 히드록실아민 유사체로 환원시키는 데 이들 유사체는 자장내에서 마이크로파 에너지를 흡수하지 않는 다는 것은 공지로 되어있다. 수용액중에서의 환원은 ESR신호를 상실함과 동시에 신속하게 일어난다. 스핀 프로우브가 리피드 이중층 같은 보호된 환경속에 있다면 친수성 아스코르브산 염에 의해 보다 서서히 환원되거나 전혀 환원되지 않는다. 따라서 니트록시드(nitroxide)환원속도를 이용하여 아스크로브산염의 리피드 이중층속으로의 침투속도를 연구할 수 있다. 제3도는 아스코르브산염 용액중에 현탁된 SPLV와 MLV의 시간과 잔존하는 스핀 백분율과의 관계를 나타낸 것이다. 90분에 있어서 아스코르브산염은 MLV에 매몰된 프로우브의 25%를 환원시켰으나 SPLV에 매몰된 프로우브의 60%를 환원시켰다. SPLV는 정도가 심하게 MLV보다 아스코르브산염의 투과성을 크게 한다.Another example of the difference between SPLV and MLV is that ascorbate has the ability to reduce doxylspin probes. It is known that ascorbates reduce toxic components to their hydroxylamine analogues, which analogues do not absorb microwave energy in the magnetic field. Reduction in aqueous solution occurs rapidly with loss of ESR signal. If the spin probe is in a protected environment, such as a lipid bilayer, it is reduced more slowly or not at all by the hydrophilic ascorbic acid salt. Therefore, the rate of penetration of ascorbate into the lipid bilayer can be studied using the nitroxide reduction rate. 3 shows the relationship between the time of SPLV and MLV suspended in ascorbate solution and the percentage of spin remaining. At 90 minutes ascorbate reduced 25% of the probes buried in the MLV but reduced 60% of the probes buried in the SPLV. SPLV's degree of permeability is greater than that of MLV.

종래의 MLV에 비해 SPLV가 우수하다는 다른 극단적인 예로서 SPLV는 다량의 활성물질을 포장하므로서 물질을 보유할 수 있다는데 있다(표 V).Another extreme example of the superiority of SPLVs over conventional MLVs is that SPLVs can retain materials by packaging large amounts of active material (Table V).

[표 V]TABLE V

MLV와 SPLV의 비교Comparison of MLVs and SPLVs

SPLV의 또 다른 장점으로서는 포(胞)의 내부에 포장된 물질의 비교적 대부분을 식균 세포성 포(胞)에 국한되어 있는 것보다는 오히려 세포의 세포질을 통해 분산되는 정도로 세포와 SPLV가 상호 작용하는 것이다. SPLV를 세포와 혼합하면 두가지는 응집한다. 응집이 일어나면 MLV와는 달리 SPLV는 생체내에서 세포와 작용하여 모든 세포중에는 SPLV중에 최초에 포장되었던 물질중 최소한 약간을 함유하게 된다. 이 물질은 각 세포를 통해 분배되며 식균 세포성 포에만 제한되는 것은 아니다. 이것은 액상의 SPLV 조제물중에 페리틴(ferritin)을 첨가시켜 주므로서 증명이 된다. 배지속에서 세포와 응집이 되고나면 초구조적인 분석결과로부터 시토졸(cytosol) 전체에 페리틴이 분산되어 있고 이 페리틴은 세포내 막에 의해 결속이 되지 않음을 알수 있다. 이러한 현상은 MLV에 있어서 일어나며 상당량의 물질이 SPLV에 의해 전달되는 것이다.Another advantage of SPLV is that the cells interact with SPLV to the extent that relatively large amounts of material packaged inside the cells are dispersed through the cytoplasm of the cell rather than being confined to phagocytic cells. . When the SPLV is mixed with the cells, the two aggregate. When aggregation occurs, unlike MLVs, SPLVs interact with cells in vivo, so that all cells contain at least some of the material originally packaged in SPLVs. This substance is distributed through each cell and is not limited to phagocytic cells. This is demonstrated by the addition of ferritin in liquid SPLV preparations. After aggregation with the cells in the medium, hyperstructural analysis shows that ferritin is dispersed throughout the cytosol and the ferritin is not bound by the intracellular membrane. This phenomenon occurs in MLVs and a significant amount of material is delivered by the SPLVs.

더욱이 SPLV는 MLV보다 낮은 부력 밀도를 가지는데 이것은 피콜 기울기(ficol gradient)에서 띠를 매어 측정한다(표 VI).Moreover, the SPLV has a lower buoyancy density than the MLV, which is measured by banding at the ficol gradient (Table VI).

[표 VI]Table VI

부력 밀도Buoyancy density

또한 1000-100,000×g범위에서 원심분리하여 펠릿(pellet)상태로 수집할 경우 SPLV는 MLV보다 상당히 큰 펠릿을 형성하며 동일한 인지질 농도를 나타낸다. 16,000×g의 조건에서는 SPLV는 MLV보다 1/3정도 큰 펠릿을 형성한다.In addition, when collected in a pellet state by centrifugation in the range of 1000-100,000 × g, SPLV forms pellets considerably larger than MLV and shows the same phospholipid concentration. At 16,000 x g, the SPLV forms pellets one third larger than the MLV.

인지질 이중층은 물에 대한 투과성이 있기 때문에 MLV를 고장성(高張性) 환경중에 두면 삼투압으로 인해 수분을 흡수한다. SPLV는 MLV보다 많이 수축한다. 또한 내부염 농도보다 20배나 큰 농도의 완충액중에서 16시간 수축하고나면 SPLV는 MLV와 동일한 최종체적으로 수축하지 않는다(SPLV 펠릿은 MLV 펠릿보다 1/3정도나 크게 잔존함). 이것은 펠릿의 크기 차이는 액상의 밀폐된 체적의 차이에 기인하는 것이 아님을 가리키는 것이다.Since the phospholipid bilayer is permeable to water, placing MLVs in a highly troublesome environment absorbs moisture due to osmotic pressure. SPLVs contract more than MLVs. In addition, after 16 hours of shrinkage in a buffer 20 times greater than the internal salt concentration, the SPLV does not shrink to the same final volume as the MLV (SPLV pellets remain about one third larger than the MLV pellets). This indicates that the difference in size of the pellets is not due to the difference in the closed volume of the liquid phase.

SPLV는 체액과의 접촉 및 저장중의 안정성, 비교적 큰 정도의 포장능력, 가격의 효율성 및 포장된 화합물의 생물학적으로 활성인 형태로의 배출등 여러 인자가 중요시되는 계에서 특히 사용된다. 더욱이 생체내에서의 투여방식에 따라 SPLV는 신속한 제거 정화작용에 대해 저항성이 있도록 할 수 있거나(예 : 지속적인 배출이 중요할 경우 ) 또는 RES의 세포쪽으로 배출이 되게 할 수 있다.SPLVs are especially used in systems where several factors are important, such as stability during contact with body fluids and storage, relatively high levels of packaging capacity, cost effectiveness and release of packaged compounds into biologically active forms. Moreover, depending on the mode of administration in vivo, SPLVs can be resistant to rapid clearance and purification (eg when sustained release is important) or to be released into cells of the RES.

결과적으로 본 발명에 의한 SPLV는 여러가지 계에 사용할 수 있다. 이 SPLV를 이용하여 치료효과를 향상시키며, 전염병을 치료할 수 있고, 효소 교대와 경구 약물투여, 국부 약물 투여효율을 향상시켜 생체내외에서 세포속으로 유전정보를 도입하고 백신(vaccine)제조와 재결합 데옥시리보핵산 세그먼트(segment)의 세포내 도입 또는 포장된 분자의 방출에 따른 임상 시험용 진단시약 등으로서 사용할 수 있다. SPLV를 이용하여 식물등의 성장에 영향을 주는 지효성 화합물, 살충제, 향장품등을 포장할 수 있다.As a result, the SPLV according to the present invention can be used in various systems. The SPLV can be used to improve therapeutic effects, treat infectious diseases, improve enzyme replacement, oral drug administration, and local drug administration efficiency to introduce genetic information into cells inside and outside the body and to produce vaccines and recombine. It can be used as a diagnostic reagent for clinical trials following introduction of oxyribonucleic acid segments into cells or release of packaged molecules. SPLV can be used to package slow-acting compounds, insecticides, and cosmetics that affect the growth of plants.

SPLV의 용도에 관련하여 상술된 바에 따라 SPLV의 용도 또는 SPLV와 유사한 가능적인 특징을 가진 리피드 포 또는 기타 리포조음을 고려한다.Consider the use of a SPLV or a Lippo or other lipozoic sound with possible features similar to the SPLV as described above with regard to the use of the SPLV.

생체의의 세포(예 : 동물세포, 식물세포, 원생생물 등)에 화합물을 투여하자면 일반적으로 화합물을 함유한 SPLV를 배양중의 세포에 첨가해야 한다. 그러나 SPLV를 이용하여 동물(인간포함), 식물 및 원생동물의 생체내 화합물투여가 가능하다. 투여 목적에 따라 여러가지 경로를 통해 SPLV를 투여한다. 인간과 동물에 있어서 투여방식을 주사(예 : 정맥, 복강내, 근육내, 피하, 심방내, 유방내, 요도내 등), 국부작용(예 : 감염부위), 및 상피조직 또는 점액피부조직을 통한 흡수(예 : 눈의 상피조직, 구강점막, 직장 및 질(膣) 산피조직, 호흡기관조직, 비인(鼻咽) 점막, 장점막 등)등의 방법이 있고, 식물과 원형생물에 있어서 투여방식은 기관에 직접투여, 기관의 생육지에 분산, 주위환경이나 주위의 물에 대한 첨가등의 방법이 있다.In order to administer a compound to cells of a living body (eg, animal cells, plant cells, protozoa, etc.), the SPLV containing the compound should generally be added to the cells in culture. However, SPLV can be used for in vivo compound administration of animals (including humans), plants and protozoa. Depending on the purpose of administration, the SPLV is administered through several routes. In humans and animals, injections are administered (e.g., intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intraatrial, intramammary, urethra, etc.), localized (e.g. infected areas), and epithelial or mucous skin tissues. Absorption through the eye (e.g., epithelial tissue of the eye, oral mucosa, rectal and vaginal dermal tissue, respiratory tract tissue, nasal mucosa, gut membrane, etc.). These can be administered directly to the trachea, dispersed in the trachea, or added to the environment or surrounding water.

사용방법에 따라 화합물이 투여되는 유기체의 세포와 위치를 결정한다. 예로서 특수한 감염위치에 대한 투여는 국부투여로 (감염부위가 외부적일 때) 가장 용이하게 할 수 있다. 순환계 및 망내계 세포(網內系 細胞)]에 대한 투여는 정맥, 복강내, 근육내 또는 피하 등의 주사에 의해 가장 용이하게 할 수 있다.The method of use determines the cell and location of the organism to which the compound is administered. For example, administration to specific sites of infection can be most easily by topical administration (when the site of infection is external). Administration to the circulatory and intraretinal cells can be facilitated by injections intravenously, intraperitoneally, intramuscularly or subcutaneously.

SPLV는 화합물의 지속적인 효력을 발휘할 수 있도록 하기 때문에 유기체에 독성을 주지않는 용량을 유기체에 대해 1회이상 투여하도록 한다.SPLV allows the compound to have a lasting effect, so that at least one dose is administered to the organism that is not toxic to the organism.

인간, 동물 및 식물에서 발생하는 병리학적인 여러가지 조건을 SPLV속에 적당한 화합물을 포장시켜 효과적으로 치료할 수 있다. 이러한 병리학적인 조건으로서는 감염(세포내 및 세포외), 낭종(cyst), 종양 및 종양세포, 알레르기 등이 있다.Various pathological conditions occurring in humans, animals and plants can be effectively treated by packaging appropriate compounds in SPLV. Such pathological conditions include infection (intracellular and extracellular), cysts, tumors and tumor cells, allergies, and the like.

병리학적인 치료에 SPLV를 사용하기 위한 여러가지 대책이 가능하다. 생체내에 투여했을 때 SPLV가 대식세포에 의해 내재화된다는 사실을 장점으로 들수 있다.Various measures are possible for the use of SPLVs in pathological treatment. The advantage is that SPLV is internalized by macrophages when administered in vivo.

한가지 방안으로서는 SPLV를 사용하여 세포내 감염부위에 치료제를 투여하는 것이다. 어떤 종류의 질환에는 망내계세포계의 세포감염 즉 브루셀라균증을 포함하고 있다. 이러한 세포내감염은 여러가지 이유로해서 치료가 어렵다. 즉 (1) 감염된 유기체가 망내계세포계의 세포속에 위치하므로해서 치료적으로 충분한 농도를 가지고 세포막을 통과할 수 없으며 치료에 대해 극히 저항성이 있는 순환치료제와 격리되고, (2) 치료제를 독성을 주는 량으로 자주 투여하여 이러한 감염증을 치료해야 할 때가 있고, (3) 치료후에 잔존하는 감염증이 숙주 유기체를 해치거나 기타 숙주에게로 전염되기 때문에 치료는 완전히 효과적이어야 한다.One approach is to use SPLV to administer the therapeutic agent to intracellular infections. Some types of disease include intracellular intracellular infections, or brucellosis. Such intracellular infections are difficult to treat for a variety of reasons. In other words, because (1) infected organisms are located in cells of the intracellular network, they are isolated from circulating therapeutic agents that are therapeutically sufficient and cannot pass through the cell membrane and are extremely resistant to treatment, and (2) toxic to therapeutic agents. It is sometimes necessary to treat these infections in frequent doses, and (3) the treatment must be completely effective since the remaining infectious disease after treatment will harm the host organism or spread to other hosts.

본 발명의 한가지 방법에 의하면 적당히 생물학적인 활성이 있는 화합물을 함유한 SPLV를 숙주 유기체 또는 잠재적인 숙주 유기체에서 복강내 또는 정맥에 투여한다(예 : 가축용 잡초에 있어서 감염 및 비감염 가축의 치료). 식균세포는 SPLV를 내재화하기 때문에 감염성 유기체에 대해 생물학적으로 활성이 있는 SPLV로 포장된 물질을 투여하므로서 생체 활성 물질을 곧 바로 감염부위로 가게한다. 따라서 본 발명에 의한 방법을 이용하여 미생물, 박테리아, 기생체, 진균, 마이코플라즈마, 비루스 외에 브루셀라 미코박테리움, 살모넬라, 리스테리아, 프란시셀라, 히스토플라즈마, 코리네박테리움, 코시디오이데스 등의 균종 및 림프구성 맥락수막염 비루스 등에 의해 야기되는 전염을 제거할 수 있다.According to one method of the present invention, SPLV containing a moderately biologically active compound is administered intraperitoneally or intravenously in a host organism or potential host organism (eg, treatment of infected and uninfected livestock in livestock weeds). Phagocytic cells internalize SPLVs, so that biologically active substances are sent directly to the site of infection by administering a biologically active SPLV package to an infectious organism. Therefore, in addition to microorganisms, bacteria, parasites, fungi, mycoplasma and viruses, Brucella Mycobacterium, Salmonella, Listeria, Francisella, Histoplasma, Corynebacterium, Cosidioides, etc. It is possible to eliminate the infection caused by the species and lymphocytic choroiditis virus.

선정된 치료제는 감염을 유발하는 유기체에 따라 달라진다. 예를 들자면 세균감염은 항생제를 캡슐에 넣어 투여하므로서 제기할 수 있다. 항생제를 액상 SPLV내에 함유시키거나 포 이중층속에 삽입한다. 적당한 항생제로는 페니실린, 암피실린, 헤타실린, 카르벤실린, 테트라사이클린, 염산테트라사이클린, 염산옥시테트라사이클린, 염산클로르테트라사이클린, 7-클로로-6-디메틸테트라사이클린, 독시사이클린 1수화물, 염산메타사이클린, 염산모노사이클린, 롤리테트라사이클린, 디히드로스트렙토마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네리트로마이신, 카르보마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 폴리믹신 B콜리스틴, 세팔로틴소디움, 세팔로리딘, 세팔로글리신 2수화물 및 세팔렉신 1수화물 등이 있다. 브루셀라균증 치료효과에 대해 실험을 한 바 있다(다음에 나오는 실시예 참조). 본 발명의 방법에 따라 약효의 지속시간이 연장되었다. 놀라운 사실로서는 이러한 투여방식은 MLV에 포장시킨 항생제 같은 공지의 치료제에 대해 반응을 하지 않는 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다는 점이다. 소량으로 잔류하는 감염이 환산되어 감염주기가 다시 시작되기 때문에 성공적인 치료를 기대하기는 어렵다. 따라서 본 발명인들은 림프구성 맥낙 뇌막염 비루스 감염치료에 성공을 보았다.The therapeutic agent chosen depends on the organism causing the infection. For example, bacterial infections can be brought about by taking antibiotics in capsules. Antibiotics can be contained in a liquid SPLV or inserted into a cell bilayer. Suitable antibiotics include penicillin, ampicillin, hetacillin, carbencillin, tetracycline, tetracycline hydrochloride, oxytetracycline hydrochloride, chlortetracycline hydrochloride, 7-chloro-6-dimethyltetracycline, doxycycline monohydrate, methacycline hydrochloride, Monocycline hydrochloride, lolitetracycline, dihydrostreptomycin, streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin, nerthromycin, carbomycin, oleandomycin, troleandomycin, polymyxin B colistin, cephalotin Sodium, cephaloridine, cephaloclysin dihydrate and cephalexin monohydrate. Experiments have been made on the effect of Brucella fungal treatment (see Examples below). According to the method of the present invention, the duration of the drug is extended. Surprisingly, this mode of administration can effectively treat infections that do not respond to known therapies such as antibiotics packaged in MLVs. It is difficult to expect a successful treatment because a small amount of remaining infection is converted and the infection cycle begins again. Therefore, the present inventors have been successful in treating lymphocytic banax meningitis virus infection.

물론 본 발명은 세포내 감염치료에 국한된 것은 아니다. SPLV를 세포내 또는 세포의 감염부위에 투여할 수 있다. 예를들자면 본 발명의 다른 예에서 대식세포를 이용하여 활성성분을 세포의 감염부위에 운반시킨다. 이러한 방법에 따라 SPLV를 이용하여 생체내에 SPLV를 투여(복강내투여 또는 정맥투여)하므로서 미감염 대식세포에 치료물질을 전달한다.Of course, the present invention is not limited to intracellular infection treatment. SPLVs can be administered intracellularly or at infected sites of cells. For example, in another embodiment of the present invention, macrophages are used to deliver the active ingredient to the infected site of the cell. According to this method, SPLV is administered in vivo (intraperitoneally or intravenously) using SPLV to deliver a therapeutic substance to uninfected macrophages.

대식세포는 SPLV와 응집하여 치료물질을 함유하게 된다. 일반적으로 대식세포는 약 3-5일간 치료물질을 유지하게 된다. 일단 치료물질을 함유한 대식세포가 감염부위에 도달하면 병원체는 대식세포에 의해 내재화하게 되므로서 병원체는 대식세포내에 함유된 치료물질과 접하게 되고 파괴된다. 본 발명의 이러한 예는 인간과 가축에서 포도상구균(Staphylococcus aurous)에 의한 유방염 치료에 특히 유용하다.Macrophages aggregate with SPLV to contain therapeutic substances. In general, macrophages will retain the therapeutic material for about 3-5 days. Once the macrophage containing the therapeutic agent reaches the site of infection, the pathogen is internalized by the macrophage, so that the pathogen comes into contact with and destroys the therapeutic agent contained in the macrophage. This example of the invention is particularly useful for the treatment of mastitis by Staphylococcus aurous in humans and livestock.

감염부위가 외부에 있거나 접근 가능한 곳이라면 SPLV로 포장된 치료제를 국부적으로 투여할 수 있다. 특히 유용한 투여 방법에는 안질치료도 포함된다. 안질의 경우에 있어서 한가지 이상의 적당한 활성 첨가물을 함유한 SPLV를 질환이 있는 눈에 국부적으로 투여한다. 다수의 생물은 동물과 인간에게 눈병을 유발시킨다. 이러한 생물로서는 모락셀라, 클로스트리듐, 코리네박테리움, 디플로코커스, 프랄토박테리움, 헤모필러스, 클레브시엘라, 렙토스피라, 마이코박테리움, 나이세리아, 프로피오니박테리움, 프로테우스, 폐수도모나스, 세라티아, 에쉐리치아, 스타필토코커스, 스트렙토코커스 등의 균종과 마이코플라즈마와 리케치아균종을 포함한 박테리아류의 생물 등이 있다. 이러한 감염은 치료후에 잔존하는 감염이 눈물분비를 통해 재차 감염될 수 있기 때문에 종래의 방법으로는 제거하기가 어렵다. 본 발명인들은 SPLV를 사용하여 모락셀라 보비스에 의해 일어나 눈 감염증을 치료한 바 있다)실시예 참조).If the site of infection is external or accessible, the therapeutics packaged with SPLV may be administered locally. Particularly useful methods of administration also include eye treatment. In ophthalmic cases, SPLVs containing one or more suitable active additives are administered locally to the diseased eye. Many creatures cause eye disease in animals and humans. Such organisms include Moraxella, Clostridium, Corynebacterium, Diplococcus, Pratobacterium, Hemophilus, Klebsiella, Leptospira, Mycobacterium, Neisseria, Propionibacterium, Proteus, Species such as wastewater domonas, serratia, shericia, staphylococcus and streptococcus, and bacteria such as mycoplasma and rickettsia species. Such infections are difficult to remove by conventional methods because the remaining infections can be reinfected through tear secretion after treatment. The inventors have used SPLV to treat eye infections caused by Moraxella vorbis (see Examples).

SPLV는 정화 제거에 대한 저항이 있고 그 내용물을 지속적으로 방출할 수 있기 때문에 활성의 치료물질과 장시간 접촉을 시켜야 할 필요가 있는 감염증치료에도 SPLV를 사용할 수 있다. 예를 들자면 녹내장은 눈속의 압력이 점차로 상승하므로 해서 말초시력을 점차 상실하게되는 장애현상인데 치료가 되지 않으면 중추시력을 상실하게 되어 결국은 눈이 멀게된다. 이러한 녹내장 치료에 사용되는 약물을 안약처럼 국부적으로 투여할 수 있다. 그러나 어떤 경우에는 눈구멍으로 부터 약물이 신속하게 제거되므로 해서 15분 간격으로 안약을 투여해야 한다. 녹내장 같은 질환을 이 방법으로 치료하고자 하면 필로카르핀, 클로로프릴, 피조스티그민, 카르콜린, 아세타졸아미드, 에토졸아미드, 디클로르페나미드, 카르비콜, 데메카륨브로마이드, 디이소프로필포스포플루오리데이트, 에코티오플레이트 아이오다이드 또는 네오스티민 등과 같은 치료물질을 SPLV에 포장시킨 후 감염된 눈에 투여한다. SPLV속에 포장시킬 수 있고 국부적으로 투여할 수 있는 기타 치료제로서는 산동약(散瞳藥)(예 : 에피네프린, 페닐에피네프린, 히드록시암페타민, 에페드린, 아트로핀, 호마트로핀, 스코폴라민, 시클로펜톨레이트, 트로피카미드, 엔카트로핀 등), 국부마취제, 항세균제(예 : 이득수리딘, 아데닌아라비노시드 등), 항진균제(예 : 암포테라신 B, 나타마이신, 피마리신, 플루시토신, 니제탄틴, 디메로살, 술파메라진, 티오벤다졸, 톨나프테이트, 그리시오풀빈 등), 구충제(예 : 술폰아미드, 피리메타민, 클린다마이신 등) 및 소염제(예 : ACTH 같은 코르티코스테로이드류, 히드로코오리존, 프레드니존 메드리존, 베타메타존, 덱사메타존, 플루오로메탈론, 트리암시날론 등)이 있다.Because SPLVs are resistant to decontamination and can release their contents continuously, SPLVs can also be used to treat infections that require long contact with active therapeutic agents. For example, glaucoma is a disorder in which peripheral vision is gradually lost because the pressure in the eye is gradually increased. If it is not treated, the central vision is lost and eventually becomes blind. Drugs used to treat such glaucoma may be administered locally, like eye drops. However, in some cases, eye drops should be administered every 15 minutes because the drug is quickly removed from the eye holes. Treatment of diseases such as glaucoma with this method includes pilocarpine, chloropril, pizostigmine, carcholine, acetazolamide, etosolamide, dichlorphenamide, carbicol, demecarium bromide, diisopropylphospho Therapeutic agents such as fluoride, ecothioplate iodide or neothymine are packaged in SPLV and administered to the infected eye. Other therapeutic agents that can be packaged and administered locally in SPLV include Shandong drugs (e.g., epinephrine, phenylepinephrine, hydroxyamphetamine, ephedrine, atropine, homatropin, scopolamine, cyclopentolate, Trocarmids, encartropins, etc.), local anesthetics, antibacterial agents (e.g., gainuridine, adenine arabinoside, etc.), antifungal agents (e.g., amphotericin B, natamycin, pimaricin, flucitocin, nizetan Tin, dimerosal, sulfamerazin, thiopendazole, tolnaftate, grisiofulvin, etc., insect repellents (e.g. sulfonamides, pyrimethamine, clindamycin, etc.) and anti-inflammatory agents (e.g., corticosteroids such as ACTH, hydro Coriozone, prednisone meridzone, beta metazone, dexamethasone, fluorometallon, triamcinolone, etc.).

본 발명을 실시예에 따라 상술하기로 한다.The present invention will be described in detail according to the embodiment.

[실시예 1]Example 1

SPLV 제조SPLV Manufacturing

앞서 상술한 바와 같이 SPLV의 기본 제조방법은 리피드 또는 여러 리피드의 혼합물을 유기용매에 용해시키고 포장(胞藏)이 될 물질과 액상을 첨가한 후 혼합물을 음파파쇄하는 것이다. 적절한 예를 볼것 같으면 음파 파쇄처리도중 용매를 제거하는 것인데 유기용매를 음파파쇄도중이나 음파파쇄후에 증발법으로 제거한다. 모든 실시예에 사용되는 SPLV는 다음과 같은 방법에 따라 제조된 것이다.As described above, the basic manufacturing method of SPLV is to dissolve a lipid or a mixture of several lipids in an organic solvent, add a substance to be packaged and a liquid, and then sonicate the mixture. A suitable example is to remove the solvent during the sonication process. The organic solvent is removed by evaporation during or after sonication. The SPLV used in all the examples was manufactured according to the following method.

가. 항생물질을 함유한 SPLV제조end. Manufacture of SPLVs containing antibiotics

테시린 100mg으로 된 디에틸 에테르용액 5ml를 제조한 후 혼합물을 둥근 바닥의 플라스크속에 넣었다. 황산 스트렙토마이신 100mg을 HEPES (4-[2-히드록시에틸]피페라지노 2-에탄술폰산)/0.725MNaCl/0.725 M HCl에 가하여서 된 pH 7.4의 용액을 리피드의 디에틸에테르 용액을 함유한 유기 용기속으로 피페트로 옮겼다. 이 혼합물을 음파파쇄기(Laboratory Supplies Co., Inc. type 10536)중에 넣어 수분간 처리(주파수 80 KHZ, 출력 80와트)하는 동안 질소가스를 통과시켜 주므로서 점성의 호상(糊狀)물질이 되게 건조시켰다.After preparing 5 ml of diethyl ether solution of 100 mg of tesirin, the mixture was placed in a round bottom flask. 100 mg of streptomycin sulfate was added to HEPES (4- [2-hydroxyethyl] piperazino 2-ethanesulfonic acid) /0.725 MNaCl / 0.725 M HCl to obtain a solution of pH 7.4 containing a diethyl ether solution of lipid. Transfer to pipette into container. The mixture is placed in a sonicator (Laboratory Supplies Co., Inc. type 10536) and dried to become a viscous staple while passing through nitrogen gas for several minutes of treatment (frequency 80 KHZ, output 80 watts). I was.

잔존한 점세의 호상물질에다 5mM HEPES 10ml을 첨가했다. 스트렙토마이신을 함유한 SPLV 조제물을 완충 용액중에 현탁시켜 소용돌이식 혼합기에서 수분간 진탕시킨 후 20℃에서 12,000×g의 속도로 10분간 원심분리하여 미포장된 스트렙토 마이신을 유리시켰다. 생성된 케이크를 5mM HEPES 0.5ml속에 현탁시켰다.10 ml of 5 mM HEPES was added to the remaining viscous staple. The unpackaged streptomycin was liberated by suspending the SPLV preparation containing streptomycin in a buffer solution, shaking for a few minutes in a vortex mixer and then centrifuging for 10 minutes at 12,000 × g at 20 ° C. The resulting cake was suspended in 0.5 ml of 5 mM HEPES.

위에 상술한 방법을 실시함에 있어서 디히드로스트렙토마이신, 황산젠타마이신, 암피실린, 염산 테트라사이클린 및 카나마이신의 각 물질을 스트렙토마이신 대신에 사용하여 제조했다.In carrying out the above-mentioned method, each substance of dihydrostreptomycin, gentamicin sulfate, ampicillin, tetracycline hydrochloride and kanamycin was prepared using instead of streptomycin.

나. 기타 막 성분을 함유한 SPLV제조I. Manufacture SPLV Containing Other Membranes

가에서 상술한 방법을 실시함에 있어서 다음에 나오는 물질중 한가지를 란(egg)레시틴과 함께 첨가하여 제조했다.In the method described above, one of the following substances was added together with egg lecithin.

(1) 프스파티드산을 첨가하여 몰비가 8 : 2(레시틴 : 디세틸포스페이트)되게 함.(1) Add the spatidic acid so that the molar ratio is 8: 2 (lecithin: dicetylphosphate).

(2) 스테아릴아민을 첨가하여 몰비가 8 : 2(레시틴 : 스테아릴아민)되게 하고, 콜레스테롤과 스테아릴아민을 첨가하여 몰비가 7 : 2 : 1(레시틴 : 콜레스테롤 : 스테아릴아민)되게 함.(2) Stearylamine is added so that the molar ratio is 8: 2 (lecithin: stearylamine) and cholesterol and stearylamine are added so that the molar ratio is 7: 2: 1 (lecithin: cholesterol: stearylamine). .

(3) 포스파티드산과 콜레스테롤을 첨가하여 몰비가 7 : 2 : 1(레시틴 : 포스파티드산 : 콜레스테롤)되게 함.(3) Add phosphatidic acid and cholesterol so that the molar ratio is 7: 2: 1 (lecithin: phosphatidic acid: cholesterol).

다. 필로카르핀을 함유한 SPLV제조All. Manufacture of SPLV containing pilocarpine

스트렙토마이신 항생제 대신에 필로카르핀을 사용하여 가의 방법을 따라 제조했다.It was prepared according to the household method using pilocarpine instead of streptomycin antibiotics.

라. 첨가 또는 무첨가에 의한 SPLV제조la. SPLV production by addition or no addition

미증류된 에테르에 저장의 목적으로 항산화제인 부틸히드록 시톨루엔 (BHT)1㎍/ml을 첨가했다. 한편으로 용매로서 미증류된 에테르를 사용하여 BHT를 SPLV조제물에 첨가하므로서 가의 방법에 따라 SPLV를 제조했다. BUT가 첨가되지 않는 SPLV를 제조하기 위해서 증류된 에테르를 용매로 사용하여 가의 방법에 따라 SPLV를 제조했다.To the undistilled ether was added 1 μg / ml of the antioxidant butylhydroxycytoluene (BHT) for storage purposes. On the other hand, SPLV was prepared according to a conventional method by adding BHT to the SPLV preparation using undistilled ether as a solvent. SPLV was prepared according to an additive method using distilled ether as a solvent to prepare SPLV to which BUT was not added.

[실시예 2]Example 2

SPLV에 의한 생체의 투여Administration of living bodies by SPLV

다음의 예에서는 배양중의 대식세포에 대한 항생 물질의 SPLV에 의한 투여실험을 했다. 복막(腹膜)의 대식세포는 성장한 C₅₇BLK수컷쥐의 복막 세척물을 열 불활성화시킨 태아(胎兒)중인 새끼 송아지 혈청(10%)을 함유한 pH 7.2의 최소 필수 배지(M.E.M.) 중에 현탁시켜 얻었다. 조직 배양 접시중에서 1ml당 1×10⁶세포 농도로 세포를 현탁시켰다. 착색성(着生性)의 복막 대식세포를 가진 배지에다 브루셀라 캐니스를 1ml당 1×10⁶CFU(군체형성단위(群體形成單位) : Colony forming unit)의 농도로 첨가했다. 12시간 경과후 복막 대식세포가 빨아들이지 못한 박테리아를 M.E.M.으로 반복 세척하여 제거했다. 복막대식세포배지를 세척한 후 이들을 5무리(群)으로 나누어 각 무리에 12개의 반복 배지를 함유토록 했다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않는 것이고, 제2군은 1mg/ml의 농도의 황산 스트렙토마이신 액을 첨가한 것이며, 제3군은 완충액을 충전시킨 SPLV를 첨가한 것이고, 제4군은 황산 스트렙토 마이신액(1mg/ml)과 완충액을 충전시킨 SPLV를 첨가한 것이고, 제5군은 황산 스트렙토마이신(1mg/ml)을 가한 SPLV를 첨가한 것이다. 24시간 경과후 반복 세척으로 상청액을 제거하고 반복 동결(凍結)과 해동(解凍) 처리에 의해 복막 대식 세포를 파괴시켰다. 파괴된 대식 세포의 계열(系列) 희석물을 브루셀라 한천위에 평탄 처리하여 4일이 경과한 후 생존해 있는 브루셀라 캐니스를 한계 희석법으로 측정했다. 얻어진 결과(표 III)로부터 생체외에서의 세포내브루셀라 캐니스 감염균을 죽여 제거하는 데는 SPLV로 포장된 스트렙토 마이신이 완전히 효과적이었음을 알수 있다. 성장한 암컷 백생종의 기니아 피그로부터 복막세척에 의해 복막 대식 세포를 얻어 위에 상술한 바에 따라 브루셀라 아보르투스로 반복 실험한 결과도 표 VII에 나와 있다.In the following example, administration of antibiotics by SPLV to macrophages in culture was performed. Peritoneal macrophages are suspended in minimal essential medium (MEM) at pH 7.2 containing fetal calf serum (10%) in fetal calcined heat-inactivated peritoneal lavage of grown C ₅₇ BLK male mice. Got it. The cells were suspended at a concentration of 1 × 10 ⁶ cells per ml in tissue culture dishes. Brucellella canis was added to a medium containing colored peritoneal macrophages at a concentration of 1 × 10 ⁶ CFU (Colony forming unit) per ml. After 12 hours, the bacteria which the peritoneal macrophages did not absorb were removed by repeated washing with MEM. After peritoneal macrophages were washed, they were divided into 5 groups to contain 12 repeat media in each group. The first group is the base group, which is not treated at all, the second group is the addition of streptomycin sulfate solution at a concentration of 1 mg / ml, the third group is the addition of SPLV filled with buffer solution, and the fourth group The group added SPLV filled with streptomycin sulfate (1 mg / ml) and a buffer, and the fifth group added SPLV added with streptomycin sulfate (1 mg / ml). After 24 hours, supernatant was removed by repeated washing, and peritoneal macrophages were destroyed by repeated freezing and thawing treatment. A serial dilution of the destroyed macrophages was flattened on the Brusella agar and the surviving Brucella canis was measured by limiting dilution after 4 days. The obtained result (Table III) shows that SPLV-packed streptomycin was completely effective in killing and removing the intracellular Brussela canis infectious bacteria in vitro. Peritoneal macrophages were obtained by peritoneal washing from guinea pigs of the grown female leukoma and the results of repeated experiments with Brucella Abortus as described above are also shown in Table VII.

[표 VII]TABLE VII

감염된 대식세포를 스트립토마이신을 함유한 SPLV로 처리한 후 분리한 세포내 브루셀라균의 군체형성단위Colony-forming units of intracellular Brucella bacteria isolated after treatment of infected macrophages with SPLV containing streptomycin

* 이전에 감염시킨 동일한 수의 쥐(C₅₇BLK)의 복막 대식 세포에서 분리한 브루셀라 캐니스의 군체형성 단위(CFU)(12개 반복 배지의 평균±SD)* Colonization units (CFU) of Brucella canis isolated from peritoneal macrophages from the same number of mice (C ₅₇ BLK) previously infected (mean ± SD of 12 repeat media)

** 이전에 감염시킨 동일한 수의 기니아피그 복막 대식 세포에서 분리한 브루셀라 아보르투스의 군체형성 단위(CFU)(12개 반복 배지의 평균±SD)** Brucellar Abortus colony units (CFU) isolated from the same number of guinea pig peritoneal macrophages previously infected (mean ± SD of 12 repeat media)

*** 스트렙토마이신 1mg/ml의 농도.*** Concentration of streptomycin 1 mg / ml.

[실시예 3]Example 3

세포내 감염 치료Intracellular Infection Treatment

다음의 실시예는 세포내 감염치료에 SPLV의 사용법을 실험한 것이다. 제시된 데이터를 보면, (1) 질환치료에서 SPLV에 포장된 항생물질의 약효와 (2) SPLV조제물의 주사액 투여에서 나타나는 보다 큰 약효능을 알 수 있다. 사용된 부형제로서의 MLV와 SPLV의 비교도 했다.The following example experiments with the use of SPLV in the treatment of intracellular infections. The data presented suggest that (1) the efficacy of antibiotics packaged in SPLVs in disease treatment and (2) the greater efficacy of injections of SPLV preparations in injections. A comparison of MLV and SPLV as excipients used was also made.

브루셀라균중은 세계적으로 경제적으로나 보건위생상의 문제를 야기시키고 있다. 브루셀라균증은 브루셀라균종에 의해 일어나고 있다. 인간, 가축 및 여러가지 야생동물을 포함한 다수의 포유동물에 이 브루셀라균증이 일어난다. 여섯가지의 브루셀라균종은 동물에 있어서 브루셀라균증을 유발하는데 이들 균증은 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 캐니스, 브루셀라 델리텐시스, 브루셀라 네오토마에, 브루셀라 오비스 및 브루셀라 수이스 등이다. 가축 및 야생동물은 모두가 기타 동물과 인간에게 브루셀라균증을 전염시킬 수 있는 잠재적인 전파 매체이다.Brucella bacteria are causing economic and health problems worldwide. Brucella bacteria are caused by Brucella species. This brucellosis occurs in many mammals, including humans, livestock and various wild animals. Six Brucella species cause brucellosis in animals, which include Brucella Avortus, Brucella Canis, Brucella Delitensis, Brucella Neotomae, Brucella Orbis and Brucella Suisse. Both livestock and wildlife are potential dissemination media capable of transmitting Brucella bacteria to other animals and humans.

이러한 감염증은 항생물질로 제거되는 것이 아닌데, 그 이유는 감염성 생물체가 망내개 세포개의 세포속에 잔존하여 항생물질의 살균력에 대해 내성이 크기 때문이다. 필요로 하는 항생물질의 량과 치료기간에 따라 동물에 대해 독성을 나타내거나 동물의 조직내에 항생 물질이 불필요하게 많은 농도로 축적되게 된다.These infections are not eliminated by antibiotics, because infectious organisms remain in the cells of the crypt cells and are highly resistant to the bactericidal properties of the antibiotics. Depending on the amount of antibiotics required and the duration of treatment, they may be toxic to the animal or accumulate in unnecessarily high concentrations of antibiotics in animal tissues.

이러한 질환을 치료하는데 있어서의 난점이란 잔존하는 감염증이 전파되어 그 감염주기가 재발하기 때문에 완치가 되기 어렵다는데 있다. 이러한 질환치료에 있어서 경제적인 문제로서는 매년 우발적인 유산으로 인해 귀중한 수백만불어치의 가축을 잃게 된다는데 있다. 이러한 감염증 발생을 퇴치할 수 있는 유일한 방법은 동물을 검역(檢疫)한 후 도살해 버리는 것이다.The difficulty in treating such a disease is that it is difficult to be cured because the remaining infection spreads and the infection cycle recurs. An economic problem in treating these diseases is the loss of millions of dollars of valuable livestock every year due to accidental miscarriage. The only way to combat this development is to quarantine and kill animals.

다음에 나오는 실시예들은 항생물질을 SPLV속으로 첨가한 후 감염된 동물을 복강내로 접종시키므로서 동물에게 포장된 활성물질을 투여하는 것으로 되어있다.The following examples consist of administering a packaged active substance to an animal by adding antibiotics into the SPLV and then inoculating the infected animal intraperitoneally.

가. SPLV로 포장된 항생물질을 이용한 브루셀라 캐니스 감염증의 일회치료 효과end. Single-Treatment Effect of Brucella Canis Infectious Disease Using SPLV-Packed Antibiotics

브루셀라 캐니스 ATCC 23365를 이용하여 80마리의 성장한 수컷 쥐(Swiss mice)를 복강내(I.P.)로 감염(1×10⁷CFU)시킨 후 10마리를 1군으로 하여 8군으로 나누었다. 브루셀라 캐니스로 접종시킨 7인후의 무리를 다음과 같이 처리했다.80 grown male mice were infected (1 × 10 ⁷ CFU) with intraperitoneal (IP) using Brucella Canis ATCC 23365, and 10 were divided into 8 groups. A group of seven throats inoculated with Brucella canis were treated as follows.

제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않는 것이고, 제2군은 완충액을 충전시킨 SPLV(0.2ml I.P.)로 처리한 것이고, 제3군은 황산 스트렙토마이신액으로 처리한 것(체중 1kg당 1ml투여, 전체 투여량은 0.2ml I.P.)이미, 제4군은 황산스트립토마이신액으로 처리(체중 1kg당 5mg)한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이고, 제5군은 황산 스트렙토마이신액으로 처리(체중 1kg당 10mg)한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이고, 제6군은 황산 스트렙토마이신(체중 1kg당 1mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이고, 제7군은 황산 스트렙토마이신(체중 1kg당 5mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이며, 제8군은 황상 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체 투여량은 0.2ml I.P.인 것이다. 브루셀라 캐니스로 접종한지 14일 되는날 전부를 죽여 비장을 무균상태로 분리해 내었다.The first group is the basic group, which is not treated at all, the second group is treated with SPLV (0.2 ml IP) filled with buffer solution, and the third group is treated with streptomycin sulfate (per kg of body weight). 1ml administration, the total dose was 0.2ml IP), the fourth group was treated with striptomycin sulfate (5mg per kg of body weight), the total dose was 0.2ml IP, and the fifth group was streptomycin sulfate Treated (10 mg / kg body weight), total dose was 0.2 ml IP, group 6 was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (1 mg / kg body weight), total dose was 0.2 ml IP, The group was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (5 mg / kg body weight), the total dose was 0.2 ml IP, and the eighth group was treated with SPLV containing yellow streptomycin (10 mg / kg body weight). Dosage is 0.2 ml IP. Fourteen days after the inoculation with Brucella canis, the whole spleen was killed and the spleen was isolated aseptically.

비장을 균질화하고 브루셀라 한천위에 계열 희석시켜 처리후의 비장내에 생존하는 브루셀라 캐니스의 수를 측정했다. 배양한지 4일후의 결과는 표 VIII에 나와 있다.The spleen was homogenized and serially diluted on Brucella agar to determine the number of Brucella canis surviving in the spleen after treatment. The results after 4 days of incubation are shown in Table VIII.

[표 VIII]TABLE VIII

스트렙토마이신 단독 또는 SPLV에 포장시킨 스트렙토 마이신의 각종 농도에 따른 브루셀라 캐니스로 감염된 쥐의 일회 치료 효과^* Streptomycin Brucella cache one time treatment of mice infected with the varnish according to the various levels of which streptomycin packed in single or SPLV ^*

* 복강내 주사(I.P.)량 : 총 0.2ml(무균염용액)* Intraperitoneal injection (I.P.) amount: total 0.2ml (sterile salt solution)

** 각 비장에 대해 분리한 군체 형성 단위수를 측정하여 각실험에 대해 10마리의 평균 ±S.D.로 나타내어 생존 브루셀라 캐니스를 측정한 것임(각 동물당 3회 측정)** The number of isolated colony forming units for each spleen was measured and expressed as the mean ± S.D. of 10 animals for each experiment to measure survival Brucella canis (3 measurements per animal).

나. SPLV로 포장된 항생물질을 이용한 브루셀라 캐니스 감염증의 다중 치료효과I. Multiple Therapeutic Effect of Brucella Canis Infection Using SPLV-Packed Antibiotics

브루셀라 캐니스 ATCC 23365를 성장한 80마리의 수컷 쥐(Swiss mice)에 감염(1×10⁷CFU, I.P.)시켜 10마리를 1군으로하여 8군으로 나누었다. 브루셀라 캐니스를 접종시킨 7일후와 10일후의 무리를 다음과같이 처리했다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고, 제2군은 완충액을 충전시킨 SPLV(0.2ml, I.P.)로 처리한 것이고, 제3군은 황산스트렙토마이신액으로 처리(체중 1kg당 1mlg) 전체투여량은 0.2ml, I.P.)한 것이며, 제4군은 황산 스트렙토마이신약으로 처리(체중 1kg당 5mg)한 것으로서 전체 투여량은 0.2ml, I.P.이고 제5군은 황산 스트렙토마이신액으로 처리(체중 1kg당 10mg)한 것으로서 전체투여량은 0.2ml, I.P.이며, 제6군은 황산스트렙토마이신(체중 1kg당 1mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml, I.P.이고, 제7군은 황산스트렙토마이신(체중 1kg당 5mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml, I.P. 이고, 제8군은 황산스트렙토마이신(체중 1kg당 10ml)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이다. 브루셀라 케니스로 접종한지 14일 되는 날 전부를 죽여비장을 무균상태로 분리해 내었다. 비장을 균질화하고 브루셀라 한천위에 계열희석시켜 처리후의 비장내에 생존하는 브루셀라 캐니스 수를 측정했다. 비양한지 4일후의 결과는 제5도에 예시되어있다.80 male rats (1 × 10 ⁷ CFU, IP), which grew Brucella canis ATCC 23365, were infected (1 × 10 ⁷ CFU, IP) and divided into eight groups. Flocks 7 and 10 days after the inoculation of Brucella canis were treated as follows. The first group is the base group, which is not treated at all, the second group is treated with SPLV (0.2 ml, IP) filled with buffer solution, and the third group is treated with streptomycin sulfate (1 mlg per kg of body weight). ) The total dose was 0.2ml, IP), and the fourth group was treated with streptomycin sulfate (5mg / kg body weight), and the total dose was 0.2ml, IP and the fifth group was treated with streptomycin sulfate. (10 mg / kg body weight), the total dose was 0.2 ml, IP, and the sixth group was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (1 mg / kg body weight), and the total dose was 0.2 ml, IP, Group 7 was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (5mg / kg body weight), total dose was 0.2ml, IP, and Group 8 was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (10ml / kg body weight). The total dose is 0.2 ml IP. The spleens were isolated aseptically by killing all 14 days after inoculation with Brucella kenis. The spleen was homogenized and serially diluted on Brucella agar to determine the number of Brucella canis surviving in the spleen after treatment. The results four days after the preparation are illustrated in FIG.

생체내에서의 브루셀라 캐니스 감염에 대한 2단계 처리결과는 제5도에 나와 있는데, 이것을 보면, 황산스트렙토마이신액을 접종한지 7일 및 10일후가 되는 무리에서는 비장내에 생존하는 브루셀라 캐니스의 수가 극히 작게 감소했음을 알 수 있다. 황산스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg의 농도로 하여 SPLV에 포장시켜 처리한 7일 및 10일후의 무리에서만이 감염된 동물의 비장에서부터 모든 생균(生菌)이 제거되었다.The results of a two-step treatment of Brucella canis infection in vivo are shown in FIG. 5, which shows that the number of Brucella canis surviving in the spleen in groups 7 and 10 days after streptomycin sulfate inoculation. It can be seen that the decrease is extremely small. All live bacteria were removed from the spleens of infected animals only 7 and 10 days after the treatment with Streptomycin Sulfate at a concentration of 10 mg / kg body weight in SPLV.

위에 나온 실험에 추가하여 SPLV로 포장된 스트립토마이신으로 2회 처리한 후의 브루셀라 캐니스가 감염된 쥐의 여러 조직을 다음과 같이 샘플링하였다.In addition to the experiments above, several tissues of mice infected with Brucella canis after two treatments with SPLV-packed striptomycin were sampled as follows.

브루셀라 캐니스 ATCC 23365로 30마리의 성장한 수컷 쥐(Swiss mice)를 접종(1×10⁷CFU, I.P.)시키고 7일 경과후 10마리를 무리로 하여 모두 3군으로 나누었다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고, 제2군은 접종후 7일 및 10일 되는 날 황산 스트렙토마이신액으로 처리(체중 1kg당 10mg)한 것으로서 전체투여량은 0.2ml I.P.이며, 제3군은 접종후 7일 및 10일 되는 날에 황산스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 전체투여량은 0.2ml, I.P.이다. 브루셀라캐니스 접종후 14-75일 되는날 모두를 죽여 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 정소(***)등의 기관(器管)을 무균상태로 분리해내고 균질화한 다음 브루셀라 한천위에 계열 희석하여 브류셀라 캐니스를 분리했다. 배양한지 4일 경과후 각 기관당 생존하는 브루셀라 캐니스의 수를 측정한 결과는 제6도에 나와 있다.Thirty grown male mice (Swiss mice) were inoculated (1 × 10 ⁷ CFU, IP) with Brucella canis ATCC 23365, and after seven days, ten were divided into three groups. The first group was the base group, which was not treated at all, and the second group was treated with streptomycin sulfate (10 mg / kg body weight) 7 days and 10 days after inoculation, and the total dose was 0.2 ml IP. The third group was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (10 mg / kg body weight) at 7 and 10 days after inoculation, with a total dose of 0.2 ml and IP. Kill all 14-75 days after the inoculation of Brucella canis to separate the organs such as heart, lung, spleen, liver, kidney, testis, aseptically, homogenize, and dilute them on Brucella agar. The Brussela canis was separated. The number of surviving Brucella canis per organ after 4 days of culture is shown in FIG.

제6도에 예시된 것은 스트립토마이신으로 2회 처리한 후의 브루셀라 캐니스가 감염된 쥐의 각종 조직을 샘플링하여 실험한 결과인데, 여기서 알 수 있는 것은 SPLV로 포장된 스트렙토마이신으로 처리한 동물에 있어서 브루셀라 캐니스로 접종한지 14-75일 되는 동물에서 채취한 모든 조직은 생존하는 브루셀라 캐니스가 완전히 없는 것들이었음을 알 수 있다. SPLV로 포장된 스트렙토마이신으로 처리한 동물들과 동일한 농도와 투여량으로서 황산 스트렙토마이신액으로 처리한 것과 처리하지 않은 동물에 있어서 브루셀라 캐니스를 접종한지 14-75일 되는 동물에서 채취한 모든 조직에서 생존하는 브루셀라 캐니스를 분리할 수 있었다.Illustrated in FIG. 6 are the results of experiments by sampling various tissues of mice infected with Brucella canis after two treatments with streptomycin. Here, it can be seen that Brucella in animals treated with streptomycin packed with SPLV It can be seen that all tissues harvested from animals inoculated with canis 14-75 days were completely devoid of surviving Brucella canis. All tissues collected from animals treated with streptomycin sulfate at the same concentration and dose as those treated with SPLV-treated streptomycin solution and from animals treated with Brucella canis 14 to 75 days after inoculation The surviving Brucella Canis could be separated.

다. MLV와 SPLV의 치료효과 비교All. Comparison of therapeutic effects between MLV and SPLV

15마리의 성장한 수컷 쥐에게 브루셀라 캐니스 ATCC 23365를 접종(1×10⁷CFU, I.P.)한지 7일 경과후 1군당 5마리로하여 3군으로 나누었다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고, 제2군은 접종후 7일 및 10일 되는 날 황산스트렙토마이신을 함유한 MLV를 이용하여 처리(체중 1kg당 10mg, I.P.)한 것이다. MLV는 란(egg) 포스파티딜콜린(EPC) 100mg과 황산스트렙토마이신(100mg/ml)을 함유한 무균 HSPES 2ml을 이용하여 종래의 방법으로 만든 것이다. MLV현탁액 2ml에서 리피드와 황산스트렙토마이신의 비율을 EPC 100mg : 황산스트렙토마이신 28mg으로 하였다.Fifteen grown male rats were divided into 3 groups of 5 mice per group 7 days after inoculation (1 × 10 ⁷ CFU, IP) of Brucella canis ATCC 23365. The first group was the base group without any treatment, and the second group was treated with MLV containing streptomycin sulfate (10 mg / kg body weight, IP) 7 days and 10 days after inoculation. MLV was prepared by conventional methods using 2 ml of sterile HSPES containing 100 mg of phosphatidylcholine (EPC) and streptomycin sulfate (100 mg / ml). The ratio of lipid and streptomycin sulfate in 2 ml of MLV suspension was EPC 100 mg: streptomycin sulfate 28 mg.

제3군은 접종후 7일 및 10일 되는 날 항생물질을 함유한 SPLV제조방법에 따라 황산스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg, I.P.)을 함유한 SPLV로 처리한 것인데, 제조방법은 다음과 같이 약간 달리하였다. 즉 EPC 100mg을 사용했고 황산 스트렙토마이신 100mg을 함유한 HEPES 0.3ml을 사용한 점만이 다르다. SPLV중에서의 리피드와 황산스트렙토마이신의 비율은 최종 현탁액 2ml중에서 EPC 100mg : 황산 스트렙토마이신 28mg가 되게 했다. 브루셀라 캐니스를 접종한지 14일 되는날 모두 죽여 무균상태로 비장을 분리해내어 균질화하고 브루셀라 한천위에서 계열희석시킨 다음 브루셀라 캐니스를 분리했다. 배양한지 4일 경과후의 각 기관당 생존하는 브루셀라 캐니스의 수를 측정한 결과는 표 IX에 나와 있다.The third group was treated with SPLV containing streptomycin sulfate (10 mg / kg body weight, IP) according to the SPLV production method containing antibiotics on the 7th and 10th day of inoculation. Different. The only difference was that 100 mg of EPC was used and 0.3 ml of HEPES containing 100 mg of streptomycin sulfate. The ratio of lipid to streptomycin sulfate in SPLV was EPC 100 mg: streptomycin sulfate 28 mg in 2 ml of the final suspension. After 14 days of inoculation of Brucella canis, the spleens were killed, homogenized, homogenized, serially diluted on Brucella agar, and then Brucella canis was isolated. The number of surviving Brucella canis per organ after 4 days of culture is shown in Table IX.

[표 IX]TABLE IX

2회처리후^*의 생체내의 브루셀라 캐니스의 멸균작용에 대한 황산스트렙토마이신을 함유한 MLV 및 SPLV의 비교2 Comparison of the MLV and SPLV containing streptomycin sulfate to the sterilization action of Brucella canis in vivo after the time treatment ^*

* 3일 간격으로 체중 1kg당 10mg을 복강내주사 기본군은 하동의 처리를 하지 않은 것임.* Intraperitoneal injection base group at 10mg / kg body weight every 3 days is not treated with Hadong.

** 각 비장의 CFU수를 측정하여 각 무리당 5마리에 대해 평균±S.D.로 나타낸 것임(각 동물당 2회 측정)** Measured CFU count of each spleen and expressed as mean ± S.D. for 5 birds per herd (measured twice per animal)

*** 란 포스파티딜콜린 : 황산스트렙토마이신=리피드 100mg : 황산 스트렙토마이신 28mg*** Lan phosphatidylcholine: streptomycin sulfate = lipid 100 mg: streptomycin sulfate 28 mg

라. 각종 SPLV에 포장된 항생물질의 주사치료에 미치는 영향la. Effect on the Injection Treatment of Antibiotic in Various SPLVs

브루셀라 캐니스 ATCC 23365를 이용하여 50마리의 성장한 수컷 쥐에 접종(1×10⁷CFU, I.P.)한지 7일후 1군당 5마리로 하여 10군으로 나누었다. 제 군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고, 제2군은 접종후 7일 및 10일 되는 날 완충액을 충전시킨 SPLV로 처리(0.2ml, I.P.)한 것이고, 제3군, 제4군, 제5군 및 제6군은 접종후 7일 및 10일 되는 알 디히드로스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신 또는 스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg을 주사액으로 하여 주사(0.2ml, I.P.)한 것이며(이들 항생제는 브루셀라 캐니스를 생체외에서 멸균시킴), 제7군, 제8군, 제9군 및 제10군은 접종후 7일 및 10일 되는 날 디히드로스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신 또는 스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg 함유시킨 SPLV로 처리한 것이다. 브루셀라 캐니스를 접종한 지 14일 되는 날 모두를 죽여 무균상태로 비장을 분리해내어 균질화하고 브루셀라 한천위에서 계열 희석시킨 다음 브루셀라 캐니스를 분리했다. 배양한지 40일 경과후 각 기관에 생존하는 브루셀라 캐니스의 측정결과는 표 X에 나와 있다.Seventy days after inoculation (1 × 10 ⁷ CFU, IP) to 50 grown male mice using Brucella Canis ATCC 23365, the animals were divided into 10 groups. The first group was the base group, which was not treated at all, and the second group was treated with SPLV (0.2 ml, IP) filled with buffer solution on the 7th and 10th days after inoculation, and the 3rd and 4th groups. , Groups 5 and 6 were injected (0.2 ml, IP) with 10 mg / kg body weight of Al dihydrostreptomycin, gentamicin, kanamycin or streptomycin at 7 and 10 days after inoculation (these Antibiotics sterilize Brucella canis ex vivo), Groups 7, 8, 9 and 10 were treated with dihydrostreptomycin, gentamicin, kanamycin or streptomycin 7 and 10 days after inoculation. It was treated with SPLV containing 10 mg / kg body weight. After 14 days of vaccination of Brucella canis, all spleens were killed, the spleens were isolated aseptically, homogenized, serially diluted on Brucella agar, and the Brucella canis was isolated. The measurement results of Brucella canis surviving in each organ after 40 days of culture are shown in Table X.

[표 X]TABLE X

2회 처리후^*생체내에서의 브루셀라 캐니스 멸균작용에 대한 각종 항생물질의 비교2 Comparison of various antibiotics on Brucella canis sterilizing action in ^* vivo after treatment times

* 3일 간격으로 체중 1kg당 10gm을 복강내 주사 기본군은 하등의 처리를 하지 않은 것임.* Intraperitoneal injection of 10 gm / kg body weight every 3 days is not treated at all.

** 각 비장의 CFU수를 측정하여 각 무리당 5마리에 대해 평균 ±S.D.로 나타낸 것임(각 동물당 2회 측정)** Measured CFU count of each spleen and expressed as mean ± S.D. for 5 per herd (2 measurements per animal)

*** 현탁 배양액중에서 항생물질은 브루셀라 캐니스를 살균함*** Antibiotics in suspension culture sterilize Brucella canis

표 X에 나온 바와 같이 브루셀라 캐니스로 감염된 쥐에 대한 각종 항생물질의 시험결과로부터 생체외(현탁 배양액중)에서 브루셀라 캐니스의 살균작용이 있는 항생물질은 또한 SPLV내에 포장시켰을 경우 생체내에서도 브루셀라 캐니스의 살균작용이 있음을 알 수 있다. 항생물질용액이나 완충액을 충전시킨 SPLV로 처리한 동물이나 하등의 처리를 하지않은 동물은 어느 경우에서나 분리해낸 비장 조직중에 생존해 있는 브루셀라 캐니스가 잔존해 있었다.As shown in Table X, antibiotics with bactericidal action of Brucella canis in vitro (in suspension culture) were also tested in vivo in suspension of mice infected with Brucella canis. It can be seen that there is a bactericidal action. In either case, animals treated with SPLV filled with antibiotic solutions or buffers, or those without any treatment, remained viable in the isolated spleen tissues.

마. 브루셀라 캐니스를 감염시킨 계의 치료hemp. Treatment of the system that infected Brucella canis

브루셀라 캐니스 ATCC 23365를 성장한 암컷의 작은 사냥개에 대해 경구(經口) 및 질(膣)을 통해 접종시킨 7일 후 3군으로 나누었다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고, 제2군은 접종한지 7일 및 10일 되는 날 체중 1kg당 10mg의 량의 황산 스트렙토마이신액을 투여(각 투여량은 5.0ml, I.P.)하 것이며 제3군은 접종한 지 7일 및 10일 되는 날 체중 1kg당 10mg의 량의 황산스트렙토마이신을 가한 SPLV로 처리한 것이다. 계의질(膣)을 세척하여 헤파린화한 혈액샘플을 실험전, 실험도중 및 실험종료시에 일정간격을 두고 채취했다. 이들을 브루셀라한 천위에 배양하여 브루셀라 캐니스를 분리했다. 그 결과는 표 XI에 있다. 혈청 샘플을 실험전, 실험도중 및 실험 종료시에 수집하여 브루셀라 캐니스에 대한 혈청 항체를 측정했다. 이 결과도 표 XI에 있다. 브루셀라 캐니스를 접종한지 21일 되는 날 모든 계를 안락시키고 헤라핀화한 혈청, 질 분비물, 패, 비장, 관절낭액, 자궁, 난소, 림프절, 침샘, 편도성, 종경막 림프절, 장간막 림프절, 골수, 표면 경부(頸部) 림프절 및 보조 림프절 등의 조직을 무균상태로 분리해 내고 균질화한 후 브루셀라 한천위에 계열 희석시켜 브루셀라 캐니스를 분리했다. 배양한지 4일후의 각 조직의 생존하는 브루셀라 캐니스의 수를 측정한 결과는 표 XII에 나와 있다.Brucella canis ATCC 23365 was divided into three groups 7 days after oral and vaginal inoculation of small hounds of grown females. The first group is the base group, which is not treated at all, and the second group receives 10 mg of streptomycin sulfate per 1 kg of body weight on the 7th and 10th day of inoculation (each dose is 5.0ml, IP The third group was treated with SPLV with 10 mg of streptomycin per kilogram of body weight 7 days and 10 days after inoculation. Heparinized blood samples were collected at intervals before and during the experiment and at the end of the experiment. These were incubated on a Brucella cloth to isolate Brucella canis. The results are in Table XI. Serum samples were collected before, during, and at the end of the experiment to determine serum antibodies against Brucella canis. This result is also in Table XI. On day 21 of the inoculation of Brucella canis, all systems were relaxed and herinized serum, vaginal discharge, plaque, spleen, articular sac, uterus, ovary, lymph nodes, salivary glands, amygdala, mediastinal lymph nodes, mesenteric lymph nodes, bone marrow, Tissues such as superficial cervical and secondary lymph nodes were isolated aseptically, homogenized, and serially diluted on Brucella agar to separate Brucella canis. The results of measuring the number of surviving Brucella canis of each tissue 4 days after culture are shown in Table XII.

[표 XI]TABLE XI

2회 항생물질처리를 한 브루셀라 캐니스로 감염된 개에 대한 배양 및 혈청 시험 결과^* Culture and serum test results for dogs infected with Brucella canis treated with 2 antibiotics ^*

* R(신속 슬라이드 응집 반응검사) : 브루셀라 캐니스 항원에 대한 혈청 역가의 역수(×10²) ; 0=무검출 역가 M(2-메르캅토에탄올 관응집 반응검사) : 브루셀라 캐니스 항원에 대한 혈청 역가의 역수(×10²); 0=무검출 역가, B(혈액 배양) 및 V(질 배양)은 브루셀라 한천에 대한 것임 : +=1CFU이상 또는 이와 동일함. 0=군체검출 없음. 기본군은 하등의 처리를 하지 않은 것임.* R (Rapid Slide Aggregation Assay): Inverse of serum titer against Brucella canis antigen (× 10 ² ); 0 = no detectable titer M (2-mercaptoethanol coagulation assay): inverse of serum titer against Brucella canis antigen (× 10 ² ); 0 = no detectable titers, B (blood culture) and V (vaginal culture) are for Brucella agar: + = 1 CFU or greater or equal. 0 = no colony detection. The base is not treated at all.

** 황산 스트렙토마이신액 체중 1kg당 10mg, 복강내(I.P.)투여.** 10 mg per kg body weight of streptomycin sulfate, intraperitoneally administered (I.P.).

*** 체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg을 함유한 SPLV 복강내(I.P.)투여*** SPLV intraperitoneal (I.P.) administration containing 10 mg of streptomycin sulfate per kg body weight

[표 XII]TABLE XII

2회 항생물질처리를 한 브루셀라 캐니스로 감염된 개의 조직 샘플에 대한 배양 시험 결과 (가)Results of culture test on tissue samples of dogs infected with Brucella canis treated with 2 antibiotics

(가) 접종후 7일 및 10일 되는 날 처리한 것임.(A) It was processed 7 days and 10 days after vaccination.

(나) 시체 해부시 채취한 샘플을 브루셀라 한천에서 계열희석했음. +=ICFU이상 또는 이와 동일함. 0=군체없음(B) Dilution of the samples taken at the time of dissection of the body in Brucella agar. + = ICFU or higher 0 = no colon

(다) 황산스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg함유시킨 SPLV 복강내(I.P.)투여(C) Intraperitoneal (I.P.) administration of SPLV containing 10 mg of streptomycin sulfate per kg body weight

(라) 황산스트렙토마이신액을 체중 1kg당 10mg투여. 복강내(I.P.)투여(D) 10 mg / kg body weight of streptomycin sulfate solution is administered. Intraperitoneal (I.P.) Administration

(마) 기본군은 하등의 처리를 하지 않은 것임.(E) The base is not treated at all.

2단계의 항생물질 투여전, 투여 도중 및 투여종료시에 브루셀라캐니스로 감염된 개에 대한 배양 및 혈청 시험 결과(표 XI)로부터 모든 개가 브루셀 캐니스에 노출되기 이전에는 혈청학적으로 역가가 음성으로 나타났으며 혈액 배양 및 질 세척물의 배양에서 음성이었음을 알 수 있다. 모든 개는 접종후 7일 및 10일 되는 날 약을 투여하기전에 혈액과 질배양에 대해서는 양성으로 나타났다. 스트렙토마이신액으로 처리한 개 또는 하등의 처리를 하지 않은 개는 접종후 21일 되는 날 투여 종료이전에는 처리후의 기간동안 혈액과 질 배양에서 양성으로 그대로 남아 있었다. 제3군은 스트렙토마이신을 함유한 SPLV로 처리한 것으로서 1차 투여후 1일째 되는 날 배양은 음성으로 되었고 전체 약물투여 기간은 음성으로 있었다. 하등의 처리를 하지 않은 개나 스트렙토마이신을 투여한 개는 접종후 21일 되는 날까지 브루셀라캐니스 항원에 대해 검출할 수 있을 정도로 혈청 역가를 나타낸 한편 항생물질을 함유한 SPLV로 처리한 개들은 접종후 7일 및 10일 되는 날 브루셀라 캐니스 항원에 대해 어떠한 검출 가능한 항체를 나타내지 않았다. 2단계 항생물질 투여를 한 감염된 개에서 브루셀라 캐니스를 분리한 결과(표 XII)로부터 스트렙토마이신을 함유한 SPLV를 투여한 개에 있어서만이 모든 기관에서 채취한 모든 조직중에 생존해 있는 브루셀라 캐니스를 효과적으로 제거할 수 있었음을 알 수 있다.From culture and serum test results (Table XI) for dogs infected with Brucella canis prior to, during, and after the administration of the second phase of antibiotics (Table XI), serologically negative titers before all dogs were exposed to Brussels canis And negative in blood cultures and vaginal washes. All dogs were positive for blood and vaginal cultures before the drug was given 7 and 10 days post vaccination. Dogs treated with streptomycin or untreated dogs remained positive in blood and vaginal cultures during the post-treatment period, up to 21 days after inoculation. The third group was treated with SPLV containing streptomycin, and the culture was negative on the first day after the first administration, and the entire period of drug administration was negative. Untreated dogs or dogs treated with streptomycin showed serum titers that were detectable against Brucella canis antigen up to 21 days post-inoculation, while those treated with SPLV containing antibiotics There were no detectable antibodies to the Brucella canis antigen on days 7 and 10. Brucella canis survived in all tissues collected from all organs only in dogs receiving SPLV containing streptomycin from the results of isolation of Brucella canis from infected dogs with two-stage antibiotics (Table XII). It can be seen that it could be effectively removed.

바. 기니아 피그에 대한 브루셀라 아보르투스의 치료bar. Brucella Abortus Treatment for Guinea Pigs

브루셀라 아보르투스 ATCC23451을 15마리의 성장한 암컷기니아 피그에 접종(1×10⁷CFU, I.P.)한 지 7일 후 5마리를 1군으로 하여 3군으로 나누었다. 제1군은 기본군으로서 하등의 처리를 하지 않은 것이고 제2군은 브루셀라 아보르투스를 접종한지 7일 및 10일 후에 황산스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg을 복강내(I.P.)투여(0.2ml)한 것이고 제3군은 브루셀라 아로르투스를 접종한 지 7일 및 10일후에 황산스트렙토마이신을 체중 1kg당 10mg의 량으로 함유시킨 SPLV를 복강내(I.P.) 투여(0.2ml)한 것이다. 브루셀라아보르투스를 접종한 후 14일 되는 날 모두를 죽여 무균상태로 비장을 분리해 내고 균질화하여 브루셀라 한천위에서 계열희석한 후 브루셀라 아보르투스를 분리했다. 4일간 배양한 후 각 비장에서 생존해 있는 브루셀라 아보르투스의 수를 측정한 결과는 제7도에 나와 있다. 스트렙토마이신을 함유한 SPLV만이 기니아 피그의 비장내에 잔존하는 브루셀라 아보르투스의 살균에 효과가 있었고 스트렙토마이신액을 투여한 것이나 하등의 투여를 하지 않는 것에 있어서는 브루셀라 아보르투스가 생존해 있는 것이 확인되었다.Seven days after inoculation (1 × 10 ⁷ CFU, IP) of 15 cellus female guinea pigs inoculated with Brucella Avortus ATCC23451, 5 animals were divided into 3 groups. The first group was the primary group, which was not treated at all, and the second group received 10 mg / kg of intraperitoneal (IP) dose of streptomycin sulfate 7 and 10 days after the inoculation of Brucella Abortus (0.2 ml). Group 3 was intraperitoneal (IP) administration (0.2 ml) of SPLV containing 10 mg / kg body weight of streptomycin sulfate 7 and 10 days after inoculation of Brucella aortus. On the 14th day after the inoculation of Brucella abortus, all spleens were killed, the spleen was isolated aseptically, homogenized, and serially diluted on Brucella agar, and then Brucella abortus was isolated. The results of the measurement of the number of Brucella Abortus surviving in each spleen after 4 days of incubation are shown in FIG. Only SPLV containing streptomycin was effective in the sterilization of Brucella abortus remaining in the spleen of guinea pigs, and it was confirmed that Brucella abortus survived the administration of streptomycin solution or no administration. .

사. 브루셀라 아보르투스로 감염된 소의 치료four. Treatment of cattle infected with Brucella Abortus

아홉마리의 심하게 감염된 소를 본 실험에 이용했다. 우유와 질 세척률에서 브루셀라 아보르투스 박테리아를 분리하여 스트렙토마이신을 함유한 SPLV를 투여한후 6주동안은 음성으로 있었다. 이들 동물에서 감염이 재발했을 때 투여전에 양성이었던 유방의 1/4부분에서만 박테리아 분리가 확인되었다.Nine heavily infected cows were used in this experiment. Brucella abortus bacteria were isolated from milk and vaginal lavage and negative for 6 weeks after administration of SPLV containing streptomycin. In these animals, bacterial isolation was observed only in the first quarter of the breast, which was positive before administration when the infection relapsed.

22개월된 임신하지 않은 잡종(헤리포오드-저이지-브란구스종) 9마리에 대해서는 브루셀라 아보르투스 배양이 양성이었던 것을 사용했다. 실험 시작 최소한 4개월전에 이 소들을 실험적으로 임신중기(中期)에 결막(結膜)에 브루셀라 아보르투스를 1×10⁷CFU접종시킨 결과 유산 되었거나 젖 또는 자궁분비물 또는 태아조직은 브루셀 아보르투스 양성으로 나타났다. 소들은 각각의 축사에 3군으로 나누어 넣었다. 3일 간격으로 2회 투여방법으로 실험했는데, 즉 (1) 3마리에 대해서는 생리 식염수를 복강내 주사했고, (2) 3마리에 대해서는 항생 물질(체중 1kg당 스트렙토마이신 10mg)액과 미리 성형한 완충액을 충전한 SPLV를 복강내로 주사했으며, (3) 3마리에 대해서는 SPLV에 포장된 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)을 복강내에 주사했다. 주사를 할 때마다 전체량은 동물 1마리당 100ml였다.For nine 22-month-old non-pregnant hybrids (Heripood-Jersey-Brangus species), the one in which the Brucella Abortus culture was positive was used. At least 4 months before the start of the experiment, the cows were experimentally aborted and 1 × 10 ⁷ CFU of Brucella Abortus in the conjunctiva during pregnancy. It was positive. The cows were divided into three groups in each barn. Two experiments were performed at three-day intervals, i.e. (1) three animals were injected intraperitoneally with saline, and (2) three animals were antibiotics (10 mg of streptomycin per kg of body weight) and preformed. Buffer-filled SPLV was injected intraperitoneally, and (3) three mice were injected intraperitoneally with streptomycin (10 mg / kg body weight) packaged in SPLV. The total amount was 100 ml per animal per injection.

최초 2개월 동안은 젖 및 자궁 분리물의 세균배양을 매주 2회실시하므로서 분비물을 얻었다. 그 다음 모든 소들을 나트륨 펜타바르비를 과잉량으로 안락사시킨 후 세균배양을 하기 위해 다음과 같은 기관들을 수집했다(림프절 :좌우제익, 좌우 상인두, 좌우 아래턱뼈, 좌우 귀밑샘, 좌우 프레스카풀라, 좌우 프레페모랄, 좌우포프리틸, 좌우장골, 좌우상유방, 좌우신장, 기관지, 종경막, 부림프절 장간막, 간장, (2) 샘(

) : 젖샘, 좌우 부신(副腎), 가슴샘, (3) 기관 및 기타조직 : 비장, 간, 좌우자궁, 나팔관, 질, 신장, 편도선 시체해부후에 모든 조직을 동결시켜 운반도중 -70℃에서 유지했다. 조직을 해동(解凍)시켜 알코올 불꽃에 살균하여 무균상태에서 잘라낸 후 중량을 달았다. 중량을 기록(0.2-1.0g)하고 난뒤 조직을 1ml의 무균염용액에서 균질화하고 무균염용액로 초기균질 현탁액의 1 : 10^-10이 되게 계열 희석했다. 계열 현탁액에서 각 희석물을 분취(20μl)한 것을 브루셀라 한천위에 두어 37℃에서 배양했다. 각 조직에 대해 2회 측정을 하였다.During the first two months, secretions were obtained by performing twice weekly bacterial cultures of milk and uterine isolates. All cows were then euthanized in excess of sodium pentabarbi, and the following organs were collected for bacterial culture: Femoral, left and right poprytil, left and right iliac bone, left and right breast, left and right kidney, bronchus, media dura, mesenteric mesentery, liver, (2) gland (

): Mammary gland, right and left adrenal gland, thorax gland, (3) organs and other tissues: spleen, liver, left and right uterus, fallopian tubes, vagina, kidney, tonsil After tissue dissection, all tissues were frozen and maintained at -70 ℃ . Tissues were thawed (sterilized), sterilized by alcohol flame, cut out in sterile state and weighed. After the weight was recorded (0.2-1.0 g), the tissue was homogenized in 1 ml of sterile saline solution and serially diluted to 1: 10 ^-10 of the initial homogeneous suspension with sterile saline solution. Aliquots (20 μl) of each dilution from the series suspension were placed on Brucella agar and incubated at 37 ° C. Two measurements were taken for each tissue.

세균성장에 대해 매있 기록을 했다. 3일전에 나타나는 모든 군체를 분리하여 개대 배양하고 그램염색을 하여 확인하였다. 배양도중 5일, 6일 및 7일 되는 날 브루셀라 아보르투스와 일치하는 형태, 성장 및 그램 염색특성을 가진 군체를 계산하여 조직 1g당 CFU를 결정했다. 대표적인 군체를 다시 개대 배양하여 브루셀라 아보르투스의 세균확인에 이용했다.There was a good record of bacterial growth. All colonies appearing 3 days ago were isolated, larvae cultured and confirmed by gram staining. CFU per gram of tissue was determined by counting colonies with morphology, growth and gram staining characteristics consistent with Brucella Abortus on days 5, 6 and 7 of the culture. Representative colonies were again cultivated and used to identify bacteria in Brucella Abortus.

모든 조직 샘플에 대해 세균학적인 분리를 하여 조직 1g당 세균의 정량계산을 하였다. 4마리동물-한마리는 위약(爲藥)을 사용한 기본군이고 나머지 3마리는 SPLV로 포장된 스트렙토마이신을 투여한 것-에 대한 결과는 표 XIII에 나와있다.All tissue samples were bacteriologically isolated and quantified for bacteria per gram of tissue. The results for four animals, one with the base group with placebo and the other three with streptomycin packaged with SPLV, are shown in Table XIII.

[실시예 4]Example 4

안질환 치료Eye disease treatment

세균 등에 의한 안(眼)전염 및 기타 여러가지 안질환으로 인해 세계적으로 경제적 및 공중보건위생상의 문제가 되고 있는데 폐혈병으로 인해 사망하거나 시력을 상실하고 있다. 동물과 인간에게 있어서, 눈의 세균감염은 클로스트리듐, 코리네박테리움, 테프로스피라, 모락셀라, 마이코박테리움, 네이세리아, 프로피오니 박테리움, 프로레우스, 슈우도모나스, 세라티아, 이콜리, 스타필로코커스, 스트렙토코커스등과 마이코플라즈마와 리케치아를 포함하는 세균같은 생물체등 여러가지 세균에 의해 야기되고 있다고 보고되어 있다. 인간이나 동물은 이러한 전염성 세균확산에 대한 잠재적인 매체로 되어 있다.Bacterial infections and other eye diseases are causing global economic and public health problems, including death from pneumonia and loss of vision. In animals and humans, bacterial infections of the eyes include Clostridium, Corynebacterium, Teprospira, Moraxella, Mycobacterium, Neisseria, Propioni bacterium, Proreus, Schudomonas, and Serratia. , E. coli, Staphylococcus, Streptococcus, and other organisms such as bacteria, including mycoplasma and rickettsia, are reported to be caused by various bacteria. Humans and animals are potential media for the spread of these infectious bacteria.

[표 XIII]TABLE XIII

브루셀라 아보르투스로 감염된 소의 조직 배양 결과Tissue Culture Results of Cows Infected with Brucella Abortus

0 0.3-1gm의 조직 배양에서는 세균검출이 되지 않았음.0 No bacterial detection was detected in 0.3-1 gm of tissue culture.

+ 200군체/조직 gm이하+ 200 colony / tissue gm or less

++ 300군체/gm이상++ over 300 colonies / gm

+++ 1,000군체/gm이상+++ over 1,000 colonies / gm

++++ 100,000군체/gm이상++++ over 100,000 colonies / gm

이러한 세균 감염은 인간에게 있어서는 20분마다 신속히 자주 치료하던지 조직내에 고농도로 항생제를 투여하므로서 제기되는 장시간의 귀찮을 치료 스케줄에 의하지 않고서는 항생물질로만으로 치료가 불가능하다. 현재의 치료법은 여러가지 이유로 해서 어렵다. 어떤 경우에 있어서 눈의 표피조직에 있는 감염성생물체가 항생물질의 살균작용에 극히 내성이 있으며, 항생제를 국부적으로 투여하므로서 눈구멍으로부터 약물이 신속히 빠져나가게 되서 약물의 접촉시간이 달라지게 된다. 일반적으로 눈 전염병 치료를 완전히 해야만 하는데 그 이유는 잔류하는 전염이 있으면 눈문 분비를 통해 달순히 재발하게 되기 때문이다. 더우기 여러 경우에 있어서, 전염병을 제거하기 위한 약물의 농도에 의해 시력을 해치게 되고 어떤 경우에 있어서는 완전히 눈이 멀게된다. 가축에 있어서의 이러한 안질환의 경제적인 손실은 치료 가능한 유일한 방법이 검역을 통해 지속적인 치료를 해야 하기 때문에 매년 수백만 달러어치의 손해를 보고 있는 것이다.Such bacterial infections cannot be treated with antibiotics only in humans without the long and cumbersome treatment schedules raised by the rapid administration of antibiotics every 20 minutes or by high concentrations of antibiotics in tissues. Current therapies are difficult for a variety of reasons. In some cases, infectious organisms in the epidermal tissue of the eye are extremely resistant to the bactericidal action of antibiotics, and the localized administration of antibiotics quickly releases the drug from the eye cavity, resulting in a different contact time of the drug. In general, the treatment of eye infectious diseases should be completely completed, because if there is any remaining infection, the recurrence of the eye will be recurred. Moreover, in many cases, the concentration of drugs to eliminate infectious diseases can damage vision and in some cases become completely blind. The economic loss of these eye diseases in livestock is costing millions of dollars each year because the only curable way to do that is through quarantine.

다음의 실험은 M. 보비스에 의한 안질환에 SPLV속에 포장된 항생물질에 비교하여 글리세린속에 항생물질을 넣은 것을 이용한 치료 효능을 평가한 것이다.The following experiments evaluated the efficacy of treatment with antibiotics in glycerin compared to antibiotics packaged in SPLV for eye diseases caused by M. bovis.

M. 보비스는 소의 각 결막염(핑크색 눈병)을 유발한다. 이것은 유루(流淚), 결막염 및 여러가지의 각막 혼막과 궤양형성 등의 특징이 있다. 다 자란 소는 미열이 나고 다소간의 식욕이 떨어지며 우유생산이 감소된다. M. 보비스에 대해서 여러가지 항생물질이 효과가 있으나 조기에 투여하여 국부치료 또는 부결막 주사로 자주 반복 투여해야 한다.M. bovis causes bovine keratoconjunctivitis (pink eye disease). It is characterized by oily fistula, conjunctivitis and various corneal conjunctival ulcers. Mature cattle tend to have a mild fever, less appetite, and reduced milk production. Several antibiotics are effective against M. bovis, but should be administered early and frequently repeated, either locally or by subconjunctival injection.

위에 나온 예에서 치료물질의 약효 지속기간이 길어진다. 놀라운 것은 감염은 단순히 일반적인 항생제에 의한 치료에 반응을 하기 때문에 1회 이상 투여를 해야 효과가 있다는 것이다. 보통 치료방법으로는 잔류하는 감염중이 있기 때문에 눈에 질환을 재발시켜 감염주기가 다시 시작되므로 여러가지 치료를 반복하여 완치시켜야 한다.In the example above, the duration of the drug is longer. Surprisingly, the infection simply responds to treatment with common antibiotics, so one or more doses may be effective. In general, there is a residual infection, so the disease recurs in the eye and the infection cycle starts again, so various treatments must be repeated repeatedly.

가. 쥐의 결막염 치료end. Conjunctivitis Treatment in Rats

C 57 흑색쥐 160마리를 8군으로 나누어 각 군의 절반을 눈에 자외선 조사하여 각막 병변을 일으킨 다음 모든 쥐를 오른쪽눈에 1×10⁶의 농도로 M. 보비스를 접종시켰다. 24시간 경과후 각막 혼탁정도를 기록했다. 8군을 다음과 같이 눈에 대해 국부치료를 했다. 제1군과 제2군은 SPLV에 포장시킨 스트렙토마이신(30mg/ml) 10μl을 투여한 것이고, 제3군과 제4군은 스트렙토마이신(100mg/ml)을 10μl투여한 것이며, 제5군과 제6군은 스트렙토마이신(100mg/ml)속에 현탁시킨 완충액을 충전한 SPLV 10㎕를 투여한 것이다.160 C 57 black rats were divided into eight groups, and half of each group was irradiated with UV light to cause corneal lesions. Then, all mice were inoculated with M. bovis at a concentration of 1 × 10 ^{6 in} the right eye. After 24 hours, corneal haze was recorded. Group 8 was topically treated for eyes as follows. Groups 1 and 2 were treated with 10 μl of streptomycin (30 mg / ml) packaged in SPLV. Groups 3 and 4 were treated with 10 μl of streptomycin (100 mg / ml). In group 6, 10 μl of SPLV filled with buffer suspended in streptomycin (100 mg / ml) was administered.

제7군과 제8군은 멸균 식염수 10㎕을 투여한 것이다(감염시키지 않는 왼쪽 눈을 동일한 국부 치료액으로 투여하여 SPLV가 눈을 자극하는 지의 여부를 조사한 결과 하등의 자극 현상이 없었다). 매일 각막 병변의 발전 내지 퇴화정도를 기록하였으며 투여후 3일, 5일 및 7일 되는 날에 대표적인 동물에 대해 오른쪽 눈을 세척하여 M. 보비스를 분리했다. M. 보비스필리(pili)에 대한 형광물질로 표지한 항체에 대한 군체형태와 반응정도에 따라 M. 보비스군체를 측정했다. 표 XIV에 나온 결과로부터 SPLV에 포장된 스트렙토마이신만이 안질치료에 효능이 있었음을 알 수 있다.Groups 7 and 8 were treated with 10 μl of sterile saline solution (no irritation occurred when the left eye, which was not infected, was administered with the same topical treatment to see whether SPLV irritated the eye). The daily development and degeneration of corneal lesions were recorded and M. bovis was isolated by washing the right eye for representative animals on days 3, 5 and 7 days after dosing. M. bovis colonies were measured according to the colony form and the degree of response to the antibody labeled with a fluorescent substance against M. bovispili (pili). The results in Table XIV indicate that only streptomycin packaged in SPLV was effective in treating ocular diseases.

나. SPLV로 포장한 항생물질에 의한 토끼의 결막치료I. Conjunctival treatment of rabbits with antibiotics packaged with SPLV

보비스(ATCC균주 10900)를 멸균 염용액중에 1ml당 1×10⁷개의 세포농도로 묽게하고 세균 현탁액 분취량(0.1ml)을 성장한 10마리의 암컷 토끼 눈속에 국부적으로 접종시켰다. 결막을 세척하여 매일 배양 샘플을 채취하여 혈액한천판위에 두어 M. 보비스를 분리했다. 접종한지 3일 후에 토끼를 3군으로 나누었다. 두마리(기본군)는 하등의 처리를 하지 않았고 4마리는 멸균염용액중에 스트렙토마이신을 투여(체중 1kg당 10mg)한 것으로 처리하였고 4마리는 멸균염용액중에 SPLV로 포장한 스트렙토마이신을 투여(체중 1kg당 스트렙토마이신 100mg)한 것으로 처리하였다. 모든 용액을 각 눈에 국부적으로 투여했다. 24시간 경과후 결막 세척물을 수거하여 7일간 매일 계속했다. 혈액한천판위에서 M. 보비스를 분리한 결과를 표XV에 나와 있다.Vorbis (ATCC strain 10900) was diluted in sterile saline solution to 1 × 10 ⁷ cell concentration per ml and locally inoculated into 10 female rabbit eyes grown with an aliquot of bacterial suspension (0.1 ml). The conjunctiva was washed and cultured samples were taken daily and placed on a blood agar plate to isolate M. bovis. Three days after inoculation, rabbits were divided into three groups. Two (base group) were not treated at all, four were treated with streptomycin (10 mg / kg body weight) in sterile salt solution and four were treated with SPLV-packed streptomycin in sterile salt solution (body weight). 100 mg of streptomycin per kg). All solutions were administered locally to each eye. After 24 hours, conjunctival lavage was collected and continued daily for 7 days. The results of separating M. bovis on the blood agar plate are shown in Table XV.

다. 피하 주사에서 나타나는 각결막염 치료All. Treatment of keratoconjunctivitis with subcutaneous injection

보비스(ATCC균주 10900)를 멸균염용액중에서 1ml당 1×10⁷개의 세포농도로 묽게 하였다. 세균 현탁액 분취량(0.1ml)을 앞서와 같이 미리 전염시켜 둔 성장한 토끼 눈속에 접종시켰다. 아홉마리토끼의 오른쪽 눈을 결막 조직속으로 M. 보비스 0.1ml을 피하 접종시켰고 왼쪽눈을 M. 보비스 0.1ml롤 국부 접종시켰다. 토끼의 양쪽 눈의 결막에서 매일 배양물을 취하여 혈액 한천판위에 두어 M. 보비스를 분리했다. 접종한지 3일후 토끼를 3군으로 나누었다. 두마리는 하등의 처리를 하지 않았고 세마리는 표준 안과용 글리세린 현탁액중에 스트렙토마이신을 가한 것(체중 1kg당 스트렙토마이신 10mg)으로 투여했고 네마리는 SPLV로 포장한 스트렙토마이산(체중 1kg당 스트렙토마이신 10mg)의 염 현탁액을 투여한 것이다. 현탁액 또는 용액을 각눈에 국부적으로 투여(0.1ml)했다. 24시간 경과후 5일째 되는 날에 결막 세척술을 취하여 혈액한천판위에서 M. 보비스분리를 한 결과는 표 XVI에 나와있다. 실험이 끝났을 때 모든 동물을 시체해부하여 결막을 분리해내었다. 관다발화에 대한 결과를 기록하고 잘게 썰어 균질화하여 혈액한천 판위에 두어 M. 보비스의 분리를 했다. 그 결과는 표 XVII에 나와 있다.Vorbis (ATCC strain 10900) was diluted in sterile salt solution to 1 × 10 ⁷ cell concentration per ml. Aliquots of bacteria suspensions (0.1 ml) were inoculated into previously grown rabbit eyes previously infected. Nine rabbits' right eyes were subcutaneously inoculated with 0.1 ml of M. bovis into the conjunctival tissue and the left eye was topically inoculated with 0.1 ml of M. bovis. Daily cultures were taken from the conjunctiva of both eyes of rabbits and placed on agar plate of blood to isolate M. bovis. Three days after inoculation, rabbits were divided into three groups. Two were not treated at all, and three were administered with streptomycin (10 mg streptomycin per kg body weight) in a standard ophthalmic glycerin suspension and four were streptomycin (10 mg streptomycin per kg body weight) packaged with SPLV. The salt suspension of was administered. Suspensions or solutions were administered locally (0.1 ml) at each eye. The results of M. bovis separation on blood agar plate by conjunctival lavage on day 5 after 24 hours are shown in Table XVI. At the end of the experiment, all animals were dissected to separate the conjunctiva. The results of vascular bundles were recorded, chopped, homogenized and placed on blood agar plates for M. bovis separation. The results are shown in Table XVII.

라. 눈질환 치료에 있어서의 리포조옴 조제물에 대한 효과 평가la. Evaluation of effects on lipozoom preparations in the treatment of eye diseases

M. 보비스(ATCC균주 10900)를 멸균 염용액중에서 1ml당 1×10⁷개의 세포농도로 묽게 하였다. 세균현탁액 분취량(0.1ml)을 성장한 토끼의 양쪽 눈의 결막조직속으로 피하 접종시켰다.M. bovis (ATCC strain 10900) was diluted in sterile saline solution to 1 × 10 ⁷ cell concentration per ml. An aliquot of the bacterial suspension (0.1 ml) was inoculated subcutaneously into the conjunctival tissue of both eyes of the grown rabbit.

[표 XIV]TABLE XIV

M. 보비스를 쥐의 눈에 전염시켜 나타나는 각결막염 치료결과Results of treatment of keratoconjunctivitis caused by the transmission of M. bovis to the rat eye

* 형광성 항체염색으로 측정한 결과 M. 보비스 존재에 대해 눈의 배양은 양성임.* Eye culture is positive for the presence of M. bovis as measured by fluorescent antibody staining.

** 정상적인 각막의 등급 : 1=정상적인 광체상실, 2=약간의 병적인 혼탁, 3=각막의 부분적인 혼탁, 4=각막의 완적 혼탁.** Grade of normal cornea: 1 = normal loss of minerals, 2 = slight pathological clouding, 3 = partial clouding of cornea, 4 = complete clouding of cornea.

*** 전체 투여량 : 10㎕(한쪽 눈에 대해 스트렙토마이신 1.0mg*** Total dose: 10 μl (1.0 mg streptomycin per eye)

[표 XV]TABLE XV

M. 보비스로 국부적으로 전염시킨 후 액상 또는 SPLV로 포장된 스트렙토마이신을 투여한 후의 토끼 결막 분리물에 대한 시험결과Test results for rabbit conjunctival isolates after topical transmission with M. bovis and administration of streptomycin packaged in liquid or SPLV

* 37℃에서 24시간 경과후 혈액한천판위의 M. 보비스 군체 존재에 대한 기록임. (+)는 분리물에 대한 M. 보비스 1CFU이상 또는 이와 동일함. 0은 군체 검출없음* Record of the presence of M. bovis colony on blood agar plate after 24 hours at 37 ° C. (+) Is greater than or equal to 1 CFU of M. bovis on the isolate. 0 means no colony detection

** 한쪽눈에 M. 보비스를 1×10⁶CFU로 국부적으로 접종한 동물** Animal locally inoculated with M. Vorbis at 1 × 10 ⁶ CFU in one eye

*** 한쪽눈에 국부적으로 0.1ml용액을 투여한 동물*** Animals with 0.1 ml solution locally on one eye

**** 멸균염용액중의 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg))**** Streptomycin in sterile salt solution (10 mg / kg body weight)

***** 멸균염용액중에 SPLV로 포장된 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)***** Streptomycin packaged with SPLV in sterile salt solution (10 mg / kg body weight)

[표 XVI]TABLE XVI

M. 보비스를 결막속에 접종시켜 안과용 글리세린 용액중에 가한 스트렙토마이신 또는 SPLV로 포장된 스트렙토마이신의 염용액을 투여한 쥐의 결막의 분리물에 대한 실험결과Experimental results of rat conjunctival isolates inoculated with M. bovis in the conjunctiva and administered with saline solution of streptomycin or SPLV packaged streptomycin in ophthalmic glycerin

(가) 37℃에서 24시간 경과후 혈액한천파위의 M. 보비스 군체의 존재에 대한 기록임. (+)는 분리물에 대한 M. 보비스 1CFU이상 또는 이와 동일함. 0은 군체 검출없음(A) Records of the presence of M. bovis colony on blood agar after 24 hours at 37 ° C. (+) Is greater than or equal to 1 CFU of M. bovis on the isolate. 0 means no colony detection

(나) 양쪽눈에 M. 보비스를 국부적으로 1×10⁶CFU접종시킨 것임. 오른쪽눈에는 결막속으로 M. 보비스를 1×10⁶CFU 주사했으며 왼쪽눈에는 M. 보비스를 1×10⁶CFU국부적으로 투여했음.(B) Locally 1 × 10 ⁶ CFU inoculated with M. bovis on both eyes. The right eye received 1 × 10 ⁶ CFU of M. bovis into the conjunctiva and the left eye received 1 × 10 ⁶ CFU locally.

(다) 각 눈에 0.1ml용액을 국부적으로 투여한 것임.(C) 0.1 ml solution is administered locally to each eye.

(라) 각 눈에 안과용 글리세린베이스에 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)을 국부적으로 투여한 것임.(D) Locally administered streptomycin (10 mg / kg body weight) to an ophthalmic glycerin base in each eye.

(마) 각 눈에 SPLV로 포장된 스트렙토마이신(체중 1kg당 10mg)을 멸균 염용액에 가한 것을 국부적으로 투여한 것임.(E) Local administration of streptomycin (10 mg / kg body weight) packaged with SPLV in each eye to sterile saline solution.

[표 XVII]TABLE XVII

M. 보비스를 결막 조직속에 접종시켜 안과용 글리세린용액중에 스트렙토마이신을 가한 것 또는 멸균염용액중에 SPLV포장된 스트렙토마이신을 가한 것으로 치료했을 때 토끼의 조직 및 눈구멍 해부결과^* When treating a M. Bovis were added to the SPLV packed streptomycin to the solution inside and streptomycin was added to the rapamycin or salt in a sterile glycerine solution for inoculation into the conjunctival tissue of the eye socket and rabbit anatomical results ^*

* 표XII와 동일하며 감염후 5일째 되는 날의 결과임.* Same as Table XII, results on day 5 after infection.

** 다음과 같이 점검한 것임 : 0=혈관정상 1=어떤 혈관은 명확히 이완되었고 소혈관의 침투가 있었음. 2=쉽사리 분간할 수 없을 정도로 각 혈관이 붉게 확산되어있음. 3=투박하게 붉게 확산되어 있었고 관다발 수축 및 혈액이 결막속으로 삼출(渗出)되어 있음.** Checked as follows: 0 = vascular normal 1 = some vessels were clearly relaxed and there was a small vessel invasion. 2 = The blood vessels are reddish enough to be indistinguishable. 3 = coarse red diffuse, vascular bundle contraction and blood exuded into the conjunctiva.

모든 토끼의 양쪽 눈의 결막에서 매일 세척물을 취하여 혈액한천판위에 두어 M. 보비스를 분리했다. 접종한지 5일후 토끼를 6군으로 나누었다. 두마리는 하등의 처리를 하지 않았고(기본군), 세마리는 1 : 100으로 묽게했을 경우 O.D.480(480nm에서의 흡광도) 즉 0.928인 SPLV로 포장된 스트렙토마이신 현탁액(체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg)으로 처리한 것이고, 세마리는 1 : 100으로 묽게했을 경우 O.D. 480측 0.928인 SPLV로 포장된 스트렙토마이신 현탁액(체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg)으로 처리한 것이고, 세마리는 1 : 100으로 묽게 했을 경우 O. D. 480 즉 0.242인 SPLV로 포장된 스트렙토마이신 현탁액(체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg)으로 처리한 것이고, 세마리는 1 : 100으로 묽게 했을 경우 O. D. 480 즉 0.119인 SPLV로 포장된 스트렙토마이신의 현탁액(체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg)으로 처리한 것이며, 두마리는 1 : 100으로 묽게했을 경우 O. D. 480 즉 0.940인 스트렙토마이신을 함유한(체중 1kg당 황산 스트렙토마이신 10mg)다중층 포(MLV)의 현탁액으로 처리한 것이다. MLV는 Fountain등의 방법[Curr.Micro. 6 : 373(1981)]에 따라 건조한 리피드 필름에 황산 스트렙토마이신을 첨가한후 혼합하여 2시간 팽윤시킨 다음 포장되지 않은 스트렙토마이신을 반복 원심분리 처리하여 제거하므로서 제조한 것이다.M. bovis was isolated from the conjunctiva of both eyes of all rabbits by taking washes daily and placing them on agar plate. Five days after inoculation, rabbits were divided into six groups. Two were not treated at all (base group) and three were diluted 1: 100 and streptomycin suspension packed with SPLV of OD480 (absorbance at 480 nm), or 0.928 (10 mg of streptomycin sulfate per kg of body weight). Three, OD 1: diluted to 100 OD Treated with a streptomycin suspension (10 mg of streptomycin sulfate per kg of body weight) of 480-sided 0.928 SPLV, the three were streptomycin suspension (SP1 packed with SPLV of OD 480 or 0.242 when diluted 1: 100). Sugar was treated with 10 mg of streptomycin sulfate, and three were treated with a suspension of streptomycin (10 mg of streptomycin sulfate per kg of body weight) packed in SPLV of OD 480, or 0.119, when diluted 1: 100. When diluted 1: 100, it was treated with a suspension of multi-layered cells (MLV) containing OD 480, or 0.940 streptomycin (10 mg of streptomycin sulfate per kg of body weight). MLV is described by Fountain et al. [Curr. Micro. 6: 373 (1981)] was added to the dried lipid film was added by the addition of streptomycin sulfate, followed by swelling for 2 hours and then unpacked streptomycin by repeated centrifugation to remove.

각 눈에 현탁액을 국부 투여하고 24시간 경과후 9일 동안 매일 세척물을 수거하여 혈액 한편위에 두어 M. 보비스를 분리했다. 그 결과는 표 XVIII에 있다. 모든 동물에 대해 시체해부를 하여 눈물 분비물에 대한 결과를 기록하였고 결막을 무균상태로 떼어내었다. 관다발형성에 대한 결과를 기록하고 잘게 썰어 균질화하고 혈액한천위에 투여 M. 보비스 분리를 하였다. 그 결과는 표 XVIIII에 있다.M. bovis was isolated by topically administering the suspension to each eye and collecting the wash every day for 9 days after 24 hours. The results are in Table XVIII. Carcass dissection was performed on all animals to record tear secretions and the conjunctiva was removed aseptically. The results for vascular bundle formation were recorded, finely chopped, homogenized and administered on blood agar for M. bovis separation. The results are in Table XVIIII.

[실시예 5]Example 5

비루스 감염치료Virus Infection Treatment

아레나비루스군의 일종인 림프구성 맥락수막염 비루스(LCMV)는 인간에게 있어서 질환을 유발하면 LCMV감염은 이 비루스에 의해 뇌속에 감염된 주는 치명적이 된다. 비루스로 감염된 세포에 대항하는 면역세포에 의해 쥐가 죽게된다. 이 비루스는 증식하는 세포를 죽이지 못하기 때문에 쥐에 사용된 치료제는 비루스 증식을 억제하여 면역 세포의 활성화를 막든지 면역세포의 활성화를 억제해야 한다.Lymphocytic choroidal meningitis virus (LCMV), a type of arenavirus group, causes disease in humans, and LCMV infection becomes lethal in the brain by the virus. Mice are killed by immune cells against cells infected with the virus. Because these viruses do not kill proliferating cells, the therapeutic agents used in mice should inhibit the growth of viruses and prevent the activation of immune cells or inhibit the activation of immune cells.

다음의 실시예는 SPLV로 포장된 항비루스 화합물을 투여하므로서 비루스성 감염을 효과적으로 치료한 예이다.The following example is an example of effectively treating a viral infection by administering an antiviral compound packaged with SPLV.

가. 쥐의 치명적인 림프구성 맥락수막염 비루스치료end. Treatment of lethal lymphocytic choroiditis virus in rats

2개월된 스위스 쥐들을 림프구성 맥락수막염 비루스(LCM)치사량으로, 즉 쥐 1마리당 접종균 0.05ml속에 100플라크 형성단위(plaque forming unit : PFU)의 량으로 늬속에 접종시킨 후 7마리를 1군으로 하여 4군으로 나누고 다음과 같이 쥐 1마리당 0.ml/용량으로 하여 2일, 3일 및 4일후 되는 날 복강내 주사하였다. (1) "SPLV-R군"은 리바바린 3mg/ml을 함유한 란 포스파티딜콜린 SPLV 현탁액을 투여했다. SPLV는 PBS완충액에 약제 100mg/ml을 가한 0.3ml과 리피드 100mg으로 만든 것이다. 약제의 함량은 10%였다.Two month-old Swiss rats were inoculated with lymphocytic choroidal meningitis (LCM) lethal dose, ie, 100 plaque forming units (PFU) in 0.05 ml of inoculated bacteria per mouse, and then 7 mice in group 1 The group was divided into 4 groups and injected intraperitoneally on day 2, 3 and 4 days at 0.ml/dose per mouse as follows. (1) "SPLV-R group" was administered a lan phosphatidylcholine SPLV suspension containing 3 mg / ml of ribavarin. SPLV is made from 0.3 ml of 100 mg / ml of PBS buffer and 100 mg of lipid. The drug content was 10%.

(2) "R-군"는 PBS에 리바바린 3mg/ml을 가한 용액으로 투여했다. (3) "SPLV군"은 완충액을 충전한 SPLV(리바바린을 쓰지 않고 위의 방법에 따라 제조한 것)로 투여했다.(2) "R-group" was administered by the solution which added 3 mg / ml of ribivarin to PBS. (3) "SPLV group" was administered by the SPLV filled with the buffer solution (made by the above-mentioned method without ribovarin).

(4) "기본군"은 PBS를 투여했다. 감염후 5일 되는 날 각 군에서 두마리를 죽여 비장을 끄내 균질화하고(각 군당 비장 2개를 완충액 1에 대해 1/20의 비율에서 PBS중에서 균질화), 1ml당 플라크 형성단위(PFU)를 각 현탁액에 대해 측정했다. 각 군에서 나머지 5마리에 대해 30일동안 매일 2회씩 치사율을 관찰했다. 그 결과는 표 XX에 있다.(4) "Basic group" administered PBS. Five days after infection, two groups were killed in each group to remove the spleen and homogenized (homogenized two spleens in each group in PBS at a ratio of 1/20 to buffer 1), and a plaque forming unit (PFU) per ml was added to each suspension. Measured against. In each group, mortality was observed twice daily for 30 days for the remaining 5 animals. The results are in Table XX.

표 XX에서는 치사율을 감소하고 감염된 동물에서 재생하는 비루스량이 감소함을 알 수 있다. SPLV에서 방출되는 리바바린의 항비루스작용으로 인하여 이러한 결과가 나왔는지 또는 SPLV로부터 리바바린이 지속적으로 방출되는 도중 쥐의 숙주의 면역변화에 기인한 것인지에 관해서는 아직 연구한 바 없다.It can be seen from Table XX that the mortality is reduced and the amount of virus regenerated in infected animals is reduced. We have not yet studied whether this result is due to the antiviral action of ribovarin released from SPLV or whether it is due to immune changes in the host of mice during the continuous release of ribovarin from SPLV.

[표 XVIII]TABLE XVIII

염용액중에 SPLV로 포장된 스트렙토마이신을 희석시킨 것 또는 염용액중에 SPLV로 포장된 스트렙토마이신을 희석시킨 것으로 감염된 쥐 결막을 치료하여 얻은 M. 보비스의 분리결과Isolation of M. bovis obtained by treating infected rat conjunctiva with diluting SPLV-packed streptomycin in saline solution or diluting SPLV-packed streptomycin in saline solution

* 양쪽 눈의 결막속으로 M. 보비스 1×10⁶CFU를 주사하여 접종.* Inoculate with 1 × 10 ⁶ CFU of M. bovis into the conjunctiva of both eyes.

혈액한천위에 결막 세척물을 평판으로 두고 37℃에서 24시간 경과후 혈액한천판위 M. 보비스 군체의 존재에 대해 기록했음.The conjunctival lavage was plated on blood agar and recorded for the presence of M. bovis colonies on blood agar plate after 24 hours at 37 ° C.

+=1CFU이상 또는 이와 동일함.+ = 1 CFU or greater

0=배양물에서 검출되지 않았음.0 = not detected in culture.

[표 XIX]Table XIX

M. 보비스를 결막조직속에 접종시켜 SPLV로 포장된 스트렙토마이신, SPLV로 포장된 스트렙토마이신 또는 SPLV로 포장된 스트렙토마이신의 희석물로 치료했을 때 토끼의 조직 및 눈구멍 해부결과^* When the treatment with M. Bovis dilutions of the streptomycin as streptomycin packing or packing in a SPLV streptomycin, SPLV packed with SPLV was inoculated in the conjunctival tissue of the eye socket and rabbit anatomical results ^*

* 표 XIV와 동일하며 감염후 14일째 되는 날 실시한 것임.* Same as Table XIV, conducted on day 14 after infection.

** 다음과 같이 점검한 것임 : 0=혈관정상; 1=어떤 혈관은 이완되었고 소혈관의 침투가 있었음; 2=쉽사리 분간할 수 없을 정도로 각 혈관이 붉게 확산되어 있음; 3=투박하게 붉게 확산되어 있었고 관다발 누출 및 혈액이 결막속으로 삼출(渗出)되어 있음.** Checked as follows: 0 = vascular normal; 1 = some blood vessels were relaxed and there was infiltration of small vessels; 2 = the blood vessels are reddish red enough to be indistinguishable; 3 = coarse reddish, vascular bundle leakage and blood exuded into the conjunctiva.

*** 다음과 같이 점검한 것임 : 0=분비없음; 1=눈꺼풀 및 눈꺼풀에 인접한 눈섭이 젖을 정도의 분비; 2=눈꺼풀, 눈섭 및 눈에 인접한 부분까지 젖을 정도의 분비.*** Checked as follows: 0 = no secretion; 1 = secretion of the eyelids and the eyelids adjacent to the eyelids wetted; 2 = wet secretion to the eyelids, brows and adjacent areas.

[표 XX]TABLE XX

쥐의 LCM비루스 감염에 대한 치료^* LCM biruseu treatment for infection of mice ^*

* 접종균 0.05ml중에 LOM비루스 100PFU를 가한 치사량으로 2개월된 쥐를 뇌속에 접종시켰음.* Two months old rats were inoculated into the brain with a lethal dose of LOM virus 100 PFU in 0.05 ml of inoculating bacteria.

** 치사작용은 사망수/군의 수로 나타낸 것임.** Lethal action is the number of deaths / group.

*** 접종후 5일째 되는 날 각 군에서 쥐 두마리씩을 죽여 비장을 끄내어 1gm비장/20ml균질물의 농도로 비장을 균질화했음.*** On the 5th day after inoculation, two mice were killed in each group to remove the spleen and homogenize the spleen at a concentration of 1 gm spleen / 20 ml homogenate.

Claims (24)

(a) 최소한 한가지의 양극성 리피드를 유기용매속에 가한 분산물을 만들고 (b) 액상이 완전히 에멀젼화될 수 있는 2상 혼합물을 형성할 수 있을 정도의 충분한 량의 액상과 분산물을 혼합한 후 (c) 액상을 에멀젼화하여 2쌍 혼합물중의 유기용매를 증발시키므로서 일정한 복박층 상포의 제조방법.(a) create a dispersion in which at least one bipolar lipid is added to the organic solvent, and (b) mix a sufficient amount of liquid and dispersion to form a biphasic mixture in which the liquid phase can be fully emulsified. c) A method for producing a uniform double layer blanket by emulsifying the liquid phase to evaporate the organic solvent in the two-pair mixture. 제1항에 있어서, 용매와 액상과의 체적비를 약 3 : 1-약 100 : 1로 하는 제조방법.The process of claim 1 wherein the volume ratio of solvent to liquid phase is about 3: 1 to about 100: 1. 제1항에 있어서, 제조시의 온도범위를 약 4℃ 내지 약 60℃로 하는 제조방법.The process according to claim 1, wherein the temperature range during manufacture is about 4 ° C to about 60 ° C. 제1항에 있어서, 제조시의 온도를 리피드의 상전이온도이하가 되게 하는 제조방법.The method according to claim 1, wherein the temperature at the time of manufacture is equal to or less than the phase transition temperature of the lipid. 제1항에 있어서, 용매로서는 플루오로카본 또는 디에틸에테르 또는 이들의 혼합물을 사용하는 제조방법.The process according to claim 1, wherein fluorocarbon or diethyl ether or a mixture thereof is used as the solvent. 제5항에 있어서, 용매중에 항산화제를 첨가하는 제조방법.6. A process according to claim 5 wherein an antioxidant is added to the solvent. 제6항에 있어서, 항산화제로서는 부틸화 히드록시 톨루엔을 사용하는 제조방법.The production method according to claim 6, wherein butylated hydroxy toluene is used as the antioxidant. 제1항에 있어서, 에멀젼화시킨 후 증발 처리하는 제조방법.A process according to claim 1 which is emulsified and then evaporated. 제1항에 있어서, 에멀젼화와 증발처리를 동시에 실시하는 제조방법.The production method according to claim 1, wherein the emulsification and the evaporation treatment are performed simultaneously. 제1항에 있어서, 포에 포장될 물질을 액상과 함께 첨가하는 제조방법.The method of claim 1, wherein the material to be packaged in the fabric is added together with the liquid phase. 제10항에 있어서, 이 물질중 최소한 20%정도가 포속에 포장되게 하는 제조방법.The method of claim 10 wherein at least about 20% of this material is packaged in a package. 제10항에 있어서, 단백질을 원료로 사용한 제조방법.The manufacturing method of Claim 10 which used protein as a raw material. 제1항에 있어서, MLV, SUV 및 REV가 거의 함유되지 않은 안정한 복박층상포의 제조방법.The method of producing a stable double layered cloth according to claim 1, wherein the MLV, SUV, and REV are hardly contained. 제1항에 있어서, 동일 성분으로 만든 것으로서 MLV보다 작은 부력밀도와 1/3정도의 큰체적을 가진 안정한 복박층상포의 제조방법.The method of manufacturing a stable double layer fabric according to claim 1, which is made of the same component and has a buoyancy density smaller than that of MLV and a volume of about 1/3. 제1항에 있어서, 포의 주요 리피드 성분으로서 포스타 티딜콜린을 이용한 안정한 복박층상포의 제조방법.The method for producing a stable bilayer lamella according to claim 1, wherein phosphatidylcholine is used as the main lipid component of the fabric. 제1항에 있어서, 포의 성분으로서 항-산화제를 이용하고 항산화제로서 부틸화히드록시 톨루엔을 이용한 안정한 복박층상포의 제조방법.The method for producing a stable double layered fabric according to claim 1, wherein an anti-oxidant is used as a component of cloth and butylated hydroxy toluene is used as an antioxidant. 제1항에 있어서, 포의속에 단백질을 포장시키는 안정한 복박층상포의 제조방법.The method for producing a stable double layered wrapper according to claim 1, wherein the protein is packaged in a cloth. 제1항에 있어서, 항세균성 화합물 항진균성 화합물, 구충제 및 항비루성 화합물을 포의속에 포장시키는 안정한 복박층상포의 제조방법.The method according to claim 1, wherein the antibacterial compound, the antifungal compound, the antiparasitic agent, and the antiviral compound are packaged in a fabric. 제1항에 있어서, 종양성 화합물 독소, 분자결합성 세포수용체 및 면역글로블린을 포의 속에 포장시키는 안정한 복박층상포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the tumorous compound toxin, the molecular binding cell receptor, and the immunoglobulin are packaged in a cell. 제1항에 있어서, 효소, 호르몬, 신경전달물질, 면역조절제, 뉴클레오티드 및 고리형 일인산아데 노신을 포의속에 포장시키는 안정한 복박층상포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the enzyme, hormone, neurotransmitter, immunomodulator, nucleotide, and cyclic mono adenosine phosphate are packaged in a package. 제1항에 있어서, 염료, 형광화합물, 방사능화합물 및 방사선 불투과성화합물을 포의 속에 포장시키는 안정한 복박층상포의 제조방법.The method for producing a stable double layered cloth according to claim 1, wherein the dye, fluorescent compound, radioactive compound and radiopaque compound are packaged in a cloth. 제1항에 있어서, ACTH히드로코오 티존, 프레드니존, 메드리존, 베타메타존, 덱사메타존, 플루오로메탈론 및 트리암시날론을 포함하는 그룹에서 선택된 소염제를 포의속에 포장시키는 안정한 복박층 상실의 제조방법.The stable bilayer loss of claim 1 wherein the anti-inflammatory agent selected from the group comprising ACTH hydrocotizone, predniso, medridone, beta metazone, dexamethasone, fluorometallon and triamcinolone is packed into the envelope. Manufacturing method. 제1항에 있어서, 필로카르핀, 플로로프릴, 피조스티그민, 카르콜린, 아세타졸아미드, 에토졸아미드, 디클로르페나미드, 카르바콜, 데메카륨브로마이드, 디이소프로필포스포플루오리데이트, 에코티오플레이트 아이오다이드 및 네오스티민을 포함하는 그룹에서 선택한 항속내장 화합물을 포의속에 포장시키는 안정한 복박층 상포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the filocarpine, phlofroril, pizostigmine, carcholine, acetazolamide, etozolamide, dichlorphenamide, carbacol, demecarium bromide, diisopropylphosphofluoride A method for producing a stable lamellae wrapper, wherein the anti-embedding compound selected from the group consisting of ecothioplate iodide and neothymine is packaged in a fabric. 제1항에 있어서, 에피네프린, 페닐에피네프린, 히드록시암페타민, 에페드린, 아트로핀, 호마트로핀, 소코폴라민, 시크롤펜톨레이트, 트로피카미드 및 엔카트로핀을 포함하는 그룹에서 선택한 산동약 화합물을 포의 속에 포장시키는 안정한 복박층상 포의 제조방법.The acidic drug compound according to claim 1, comprising an acidic drug compound selected from the group consisting of epinephrine, phenylepinephrine, hydroxyamphetamine, ephedrine, atropine, homatropin, socopolamine, cyclopentolate, trocaramide and encartropin. Method for producing a stable double layer fabric wrapped in the stomach.

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