KR840001150B1 - Process for preparing d-(-)- -hydroxy isobutyric acid - Google Patents

Abstract

Title compd. (I) was prepd. from isobutyric acid or methacrylic acid by fermn. with any of several microorganisms. Thus, Candida rugosa IFO 0750 was cultured in a broth contg. glucoss 40, yeast ext. 5, peptone 3, meat ext. 1 and isobutyric acid 20 g/L for 24 hr with aeration. The pH was raised to 8.5, and fermn. was continued for 48 hr. The yield of I was 8.2 g/L.

Description

D(-)-β-히드록시 이소부티릭산의 제조법Preparation of D (-)-β-hydroxy Isobutyric Acid

본 발명은 D(-)-β-히드록시이소부티릭산(이하 D-HIBA로 약칭한다)의 제조법에 관하여, 특히 비(非)대칭 합성에 의해 광학적 활성의 화합물을 생산하기 위한 미생물의 특수한 능력을 활용하는의 D-HIBA의 유익한 제조법에 관한 것이다.The present invention relates to the preparation of D (-)-β-hydroxyisobutyric acid (hereinafter abbreviated as D-HIBA), in particular the ability of microorganisms to produce optically active compounds, especially by asymmetric synthesis. It is about the beneficial recipe of D-HIBA to utilize.

D-HIBA는 예컨대 1-(D-3-메르캅토-2-메틸프로판올)-L-프롤린, 항고혈압약품과 같이 비대칭의 탄소원자를 보유하는 생리학적으로 활동적인 물질의 합성에 유용한 매개체이다.D-HIBA is a useful medium for the synthesis of physiologically active substances with asymmetric carbon atoms, such as 1- (D-3-mercapto-2-methylpropanol) -L-proline, antihypertensive drugs.

β-히드록시이소부티릭산(이하 HIBA로 약칭한다)의 제조법으로서는 레포오매트스키반응(Reformatsky Reaction)에 의하여 포름알데히드와 에틸 α-브로모프로피온네이트로 부터의 화학적인 합성이 알려져 있으나(이. 이. 브라이즈와 아이. 헤르만 : Ann. Chim. et phys. 17,371,1969), 이렇게 하여 얻어진 HIBA는 광학적으로 불활성한 D(±)체이다.As a method for preparing β-hydroxyisobutyric acid (hereinafter abbreviated as HIBA), chemical synthesis from formaldehyde and ethyl α-bromopropionate is known by Reformatsky Reaction (E. E. Bryce and I. Herman: Ann. Chim. Et phys. 17,371,1969) The HIBA thus obtained is an optically inert D (±) body.

이 방법은 퀴닌과 같은 값비싼 시약이 사용되는 복잡한 화학적 분리공정이 그것을 얻는데 요구되므로 광학적 활성의 HIBA제조에 불리하다(제이. 리테이와 에프. 린넨 : 비오헤미쉐 차이트슈리프트(Biochemische Zeutscgrift), 342,256,-271,1965).This method is disadvantageous for the production of optically active HIBAs, since complex chemical separation processes in which expensive reagents such as quinine are required to obtain them (J. Litte and F. Linen: Biochemische Zeutscgrift, 342,256, -271,1965).

광학적 분리없이 화학적 합성에 의해 D-HIBA를 얻는 방법은 엠. 쉬프레허와 디. 비. 스프린슨(생화학지241,868,1966)에 의해 보고 되었으나, 이 방법에서 출발물질인 트레오-3-메틸-L-아스파라트산은 매우 비싸며, 합성공정도 극히 복잡하다.The method for obtaining D-HIBA by chemical synthesis without optical separation is described in M. Schprecher and D. ratio. Although reported by Sprinson (biochemistry 241,868,1966), the starting material, treo-3-methyl-L-aspartic acid, is very expensive and the synthesis process is extremely complex.

한편, 소이도모나스 푸티데(Pseudomonas putide)를 사용하는 발효에 의한 광학적 활성의 HIBA의 제조법(샤알티. 게오드후와 제임스 알. 샤에피르 : 생물공학과 생물기술 13,203,1971)이 발표되어 있으나, 이 방법에 의하여 제조된 HIBA는 L(+)체이다.Meanwhile, a method for preparing optically active HIBA by fermentation using Pseudomonas putide (Shaalti. Geodhu and James R. Shaepir: Biotechnology and Biotechnology 13,203,1971) has been published. HIBA manufactured by this method is L (+).

그러므로 이들 어떠한 D-HIBA제조법도 공업상 유익한 것은 없었다.Therefore, none of these D-HIBA manufacturing methods are industrially beneficial.

본 발명자들은 라세미 화합물의 화학적 분리보다 광학적 활성화합물 제조에 더욱 유익하다고 증명된 미생물의 입체특이성 촉매작용 특성을 활용하는 미생물에 의한 공정을 알아냈다.The inventors have found a process by microorganisms that utilizes the stereospecific catalysis properties of microorganisms that have proven to be more beneficial for the preparation of optically active compounds than chemical separation of racemic compounds.

본 발명자들은 이소부티릭산(이하 IBA로 약칭한다) 혹은 메트아크릴릭산(이하 MA)을 D-HIBA로 전환시키는 능력을 보유하는 미생물이 있다는 것을 발견했다.The inventors have discovered that there are microorganisms that possess the ability to convert isobutyric acid (hereinafter abbreviated to IBA) or methacrylic acid (hereinafter MA) to D-HIBA.

이 발견에 기초를 두고, 본 발명자들은 IBA, MA 혹은 IBA와 MA의 혼합물로부터 D-HIBA의 제조법인 본 발명을 완성했다.Based on this finding, the present inventors have completed the present invention, which is the preparation of D-HIBA from IBA, MA or a mixture of IBA and MA.

본 발명에 있어서, IBA, MA와 그 혼합물로 구성되는 기(基)로부터 선택된 기질(基質)은 염가이고, 대량적으로 쉽게 이용할 수 있으며 기질을 D-HIBA로 전환시키는 능력을 보유한 미생물의 작용에 의거한 것이다.In the present invention, a substrate selected from the group consisting of IBA, MA, and mixtures thereof is inexpensive, readily available in large quantities, and has an effect on the action of microorganisms having the ability to convert the substrate to D-HIBA. It is based.

미생물의 촉매작용에 의한 그 기질의 D-HIBA로의 전환은 두가지 방식으로 이행된다.The conversion of the substrate to D-HIBA by the catalysis of the microorganism is accomplished in two ways.

그 한 방법으로서는 미생물의 기질을 함유하는 수성영양배지(培地)내에서 호기(好氣)적으로 배양되며, 그에 의하여 미생물의 작용에 미생물의 증식과 기질의 복종은 하나의 단계에서 동시에 시행된다.As one method, aerobic culture is carried out in an aqueous nutrient medium containing a substrate of a microorganism, whereby the growth of the microorganism and the submission of the substrate are simultaneously performed in one step.

다른 방법으로서는 먼저 수성영양배지에서 배양되며, 다음 그 기질은 제1단계에서 얻어진 세포의 현탁액에 혹은 얻어진 배양용 묽은 스우프(broth)에 가하고, 점차적으로 그 혼합물을 호기적으로 배양한다.Alternatively, the cells are first cultured in an aqueous nutrient medium, and then the substrate is added to the suspension of cells obtained in the first step or the culture broth obtained, and the mixture is gradually cultured aerobically.

본 발명에 사용된 미생물은 기질을 단지 높은 생산율로서 D(-)체의 HIBA로 전환함과 아울러, 본 발명에 의하면 D-HIBA를 저렴한 비용으로 간단한 공정으로서 제조할수 있다.The microorganism used in the present invention converts the substrate into HIBA of D (-) form only at high production rate, and according to the present invention, D-HIBA can be produced as a simple process at low cost.

본 발명에 사용된 미생물은 IBA 혹은 MA를 D-HIBA로 전환하는 능력을 보유하며, 하기의 공정에 의해 자연으로부터 이탈된 표준주(株)나 균주로부터 용이하게 선택할수 있다.The microorganism used in the present invention possesses the ability to convert IBA or MA to D-HIBA, and can be easily selected from standard strains or strains that are separated from nature by the following process.

시험 균주가 그 안에서 자랄 수 있는 영양배지내에서 미생물 균주를 배양함에 따라서 얻어지는 배양용 묽은 스우프에 IBA 혹은 MA를 약 2%w/v의 농도에 달하는 양으로 첨가한다.IBA or MA is added in an amount up to a concentration of about 2% w / v to the dilute scoop for culture obtained as the microorganism strain is grown in a nutrient medium in which the test strain can grow.

그 결과, 배양용 묽은 스우프는 pH6-9로 조절되어 25°-35℃에서 1-3일간 호기적으로 배양된다.As a result, the dilute scoop for culture is adjusted to pH 6-9 and incubated for one to three days at 25 ° -35 ° C.

이렇게 배양한 다음, 배양용 묽은 스우프에 황산 암모늄과 황산나트륨과 같은 고수용성염을 첨가하여서 배양용 스우프로부터 D-HIBA의 추출을 원활히하기 위하여 pH가 2이하로 떨어지게 한다.After this incubation, a high water-soluble salt such as ammonium sulfate and sodium sulfate is added to the dilute slough for the culture so that the pH is dropped to 2 or less to facilitate the extraction of D-HIBA from the culture snoop.

배양용 묽은 스우프는 초산에틸과 같은 비수용성 용제로서 추출된다. 용제층은 무수황산 나트륨위에서 증류 및 건조되며, 다음 메탄올 용액에서 추출물의 광학적 회전을 측정한다.Cultured thin swabs are extracted as a water-insoluble solvent such as ethyl acetate. The solvent layer is distilled and dried over anhydrous sodium sulfate, and the optical rotation of the extract is then measured in methanol solution.

좌선(左旋)을 나타내는 추출물 샘플은 선별되어 실리카겔의 엷은 층판위로 가해진다.An extract sample showing zwitterosis is screened and applied onto a thin layer plate of silica gel.

만일 그 추출물샘플이 HIBA와 같은 이동도를 나타내면, 샘플을 제조하기 위하여 사용된 미생물은 거의 항상 IBA나 MA를 D-HIBA로 전환시킬수 있는 것이다.If the extract sample exhibits the same mobility as HIBA, the microorganism used to prepare the sample can almost always convert IBA or MA to D-HIBA.

D-HIBA의 제조를 확실하게 하기 위해서 추출물 샘플은 실리카겔 위에서 컬럼크로마토 그래프에 의합 정제되며, 정제된 제조품의 구조는 NMR, RI등과 같은 기계적인 분석에 의해서 결정된다.In order to confirm the preparation of D-HIBA, the extract sample is purified by column chromatography on silica gel, and the structure of the purified product is determined by mechanical analysis such as NMR, RI, and the like.

D-HIBA 제조용 미생물의 이 선별에서 얻어진 결과에서 볼때, 용제추출물이 좌선을 나타내는 대부분의 배양용 묽은 스우프는 D-HIBA를 포함하고 있다.From the results obtained in this screening of D-HIBA-prepared microorganisms, most of the cultured dilute scoops in which solvent extracts are left tinged contain D-HIBA.

또한 이 선별방법은 간단하며, IBA나 MA로부터 D-HIBA를 제조할수 있는 미생물을 발견하기에 매우 용이하다.In addition, this screening method is simple and very easy to find microorganisms capable of producing D-HIBA from IBA or MA.

전기한 선별 방법에 의하여 선별된 모든 D-HIBA제조용 미생물은 본 발명에 사용되는데, 예를들면 칸디다(Candida), 토룰로프시스(Torulopsis), 트리고노프시스(Trygonopsis), 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 드베리오미세스(Debaryomyces), 원지아(Wingea), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 아스페르기루스(Aspergillus), 코우엔포라(Choanephora) 및 차이거린커스(Zygorhynchus)와 같은 균속을 보유하는 미생물이 사용된다.All microorganisms for producing D-HIBA selected by the above-mentioned selection method are used in the present invention, for example, Candida, Torulopsis, Trigonopsis, Saccharomyces, Such as Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choanephora and Zygorhynchus Microorganisms carrying the fungus are used.

위에서 예시한 균속을 소유하는 미생물에 따라서, 예컨대 하기의 균주가 본발명에 사용된다.According to the microorganisms possessing the above-mentioned fungi, for example, the following strains are used in the present invention.

즉, 칸디다 루고사(rugosa) IFO 0750, 칸디다루고사 IFO 0591, 칸디다 파라프실로시스(parapsilosis) IFO 0708, 칸디다 유틸리스(utilis) IFO 0396, 토룰로프시스 칸디다 IFO 0380, 트리고노프시스 배리아비리스(variabilis) IFO 0671, 사카로미세스 세레비지에(cerevisiae) IAM 4274, 사카로미세스 럭시(rouxii) IFO 0493, 피키아 멤브라에파신스(membranaefaciens) IAM 4904, 드베리오미세스 한세니(hansenii) IFO 0026, 윈지아 로버트지(robertsii) IFO 1277, 로도스포리디움 토룰로이드스(toruloides) IFO 0559, 아스페르기루스 나이저(niger) IAM 2532, 코오엔포라 썰씨네너스(circinanus) HUT 1324 및 차이거린커스 묄러리(moelleri) HUT 1305.That is, Candida rugosa IFO 0750, Candidarugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulofsis Candida IFO 0380, Trigonofsis Barrier biris (variabilis) IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces lux IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Deberiomises hanseni IFO 0026, Winzia Robertsii IFO 1277, Rhodosporium toluroids IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Coenfora Circinanus HUT 1324 and Chagerin Moelleri HUT 1305.

주 :Note:

IFO : 오오사카발효학회IFO: Osaka Fermentation Society

일본 오오사가시 요도가와구 히가시 니시노마찌 주소Nishi-no-machi, Higashi-shi, Yodogawa-ku, Osaga-shi, Japan

IAM : 도오꾜오 대학교 응용 미생물학회IAM: The Applied Microbiological Society of Tokuo University

일본 도오꾜오도 분꾜구 야요이 1쪼메1, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan

HUT : 히로시마 대학공학부HUT: Faculty of Engineering, Hiroshima University

일본 히로시마시 센다마찌 3쪼메3 chome, Sendamachi, Hiroshima City, Japan

기질에 미생물의 작용을 주기 위해서는 두 가지 방법이 유용하다.Two methods are useful for giving the substrate a microbial action.

그 하나는 배양시초로부터 기질을 포함하고 있는 수성배지에서 미생물을 호기적으로 배양하고, 그에 의하여 미생물의 증식과 동시에 배지내에서 D-HIBA가 축적된다.One is aerobic cultivation of microorganisms in an aqueous medium containing a substrate from the beginning of the culture, whereby D-HIBA accumulates in the medium at the same time as the microorganisms grow.

다른 하나의 공정은 미생물의 배양과 기질에 미생물을 작용시키는 두 단계로 구성된다.The other process consists of two steps of culturing the microorganisms and applying the microorganisms to the substrate.

두단계 공정의 제1단계는 수성배지내에서 미생물을 배양함에 의해 이행된다.The first step of the two step process is carried out by culturing the microorganisms in an aqueous medium.

두단계 공정의 제2단계는 제1단계에서 얻어진 배양용 묽은 스우프에 혹은 얻어진 혼합물을 호기적으로 배양함에 의한 제1단계에서 얻어진 세포의 현탁액에 기질을 가함으로서 이루어진다.The second stage of the two-step process is accomplished by applying the substrate to the dilute swabs for culture obtained in the first stage or to the suspension of cells obtained in the first stage by aerobic culturing the mixture obtained.

세포의 현탁액은 원심분리법에 의하여 미생물의 배양용 묽은 스우프로 부터 세포를 분리하므로서 조제되며 수성 인산염 버퍼용액과 같은 적당한 수성 배지내에서 세포를 현탁시킴에 의하여 수반된다.The suspension of cells is prepared by separating the cells from the dilute scoop for culturing the microorganisms by centrifugation and is accompanied by suspending the cells in a suitable aqueous medium such as aqueous phosphate buffer solution.

미생물의 효소가 본 발명의 공정의 반응에 포함되어 있으므로, 분리된 세포는 효소반응을 촉진하기 위하여 배지내에서 현탁되기 이전에 건조나 균질화 등과같은 다양한 처리를 받게 된다.Since the enzyme of the microorganism is included in the reaction of the process of the present invention, the isolated cells are subjected to various treatments such as drying or homogenization before being suspended in the medium to promote the enzymatic reaction.

또한 다양한 방식으로서 처리된 세포를 사용하는 것은 본발명의 범위내에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.It will also be construed that use of cells treated in various ways is within the scope of the present invention.

미생물을 배양하기 위해서는 사용되는 미생물이 그안에서 성장할수 있는 것이면 어떠한 배지라도 사용할 수 있다.To culture the microorganism, any embryo can be used as long as the microorganism used can grow therein.

배지는 통상 탄소원, 질소원 및 필요하다면 미네랄원을 함유한다. 배지내에 있는 탄소원의 예로서는 포도당, 수크로오스, 녹말, 가수분해물 및 당밀등과 같은 탄수화물, 초산, 푸마르산 및 락트산과 같은 유기산, 메탄올, 에탄올 및 프로판올과 같은 알코올 및 n-파라핀과 올레핀, 오일과 지방, 글리세롤등과 같이 사용되는 미생물과 동화될수 있는 액체탄화수소를 포함한다.The medium usually contains a carbon source, a nitrogen source and, if necessary, a mineral source. Examples of carbon sources in the medium include carbohydrates such as glucose, sucrose, starch, hydrolysates and molasses, organic acids such as acetic acid, fumaric acid and lactic acid, alcohols such as methanol, ethanol and propanol and n-paraffins and olefins, oils and fats, glycerol Liquid hydrocarbons that can be assimilated with the microorganisms used.

배지내의 질소원으로서는 황산암모늄, 염산암모늄, 인산암모늄, 암모니아수, 우레아, 아미노산, 펩톤 및 콩단백질의 가수분해물과 같은 무기 혹은 유기화합물이 사용된다.As the nitrogen source in the medium, inorganic or organic compounds such as ammonium sulfate, ammonium hydrochloride, ammonium phosphate, ammonia water, urea, amino acids, peptone and hydrolysates of soy protein are used.

배지내의 미네랄원으로서는 포타슘, 마그네슘, 아연, 철, 망간, 구리 혹은 칼슘의 무기산염을 사용할수 있다.As a mineral source in the culture medium, inorganic salts of potassium, magnesium, zinc, iron, manganese, copper or calcium can be used.

만일 필요하다면 효모추출물, 육류추출물, 옥수수 담금액제, 비타민 혹은 아데닌 및 구아닌과 같은 핵산 관련물질을 배지에 첨가할수 있다.If necessary, yeast extracts, meat extracts, corn dipping agents, vitamins or nucleic acid-related substances such as adenine and guanine can be added to the medium.

전기한 두 방법들은 배양상태에 특별한 차이는 없다.The two methods do not differ significantly in culture.

미생물의 태양은 미생물이 성장할수 있는 임의 상태에서면 실시 가능하며, 바람직하게로는 pH4.0-9.5와 20-40℃에서 배양하는 것이 좋다.The aspect of the microorganism can be carried out in any state in which the microorganism can grow, preferably, it is preferable to incubate at pH 4.0-9.5 and 20-40 ° C.

전기한 2단계 공정에 있어서는, 제1단계에서 배지에 적은양의 기질을 부가하므로서 미생물의 효소가 기질을 D-HIBA로 전환되도록 촉매작용을 하여 제2단계에서의 반응을 촉진시키는 효과가 있다.In the above two-step process, by adding a small amount of substrate to the medium in the first step, there is an effect of promoting the reaction in the second step by catalyzing the enzyme of the microorganism to convert the substrate into D-HIBA.

전기한 2단계 공정에서 제2단계의 배양은 pH 약 6.0-약 9.5, 약 20-40℃의 온도하에서 실시하는 것이 바람직하다.In the two-step process described above, the second step of culture is preferably performed at a temperature of about 6.0 to about 9.5 and a temperature of about 20-40 ° C.

D-HIBA배양용 묽은 스우프나 반응혼합물에서 분리하기 위해서는, 솔벤트 추출 및 이온변환과 같은 유기산의 추출 및 정체의 통상방법이 사용된다.In order to separate from dilute swabs or reaction mixtures for D-HIBA culture, conventional methods of extraction and stabilization of organic acids such as solvent extraction and ion conversion are used.

솔벤트 추출에 의한 효과적인 회수방법의 한 예는 다음과 같다.An example of an effective recovery method by solvent extraction is as follows.

즉, 배양용 묽은 스우프나 반응혼합물을 황산 및 염산과 같은 미네랄산, 묽은 스우프나 혼합물의 이온 강도를 증가시킬 필요가 있으면 첨가되는 황산나트륨과 황산암모늄과 같은 무기산염으로서 산성화시키고, 부탄올, 메틸-이소부틸케톤 및 초산 에틸과 같은 비수용성 용제로서 추출한다.That is, the cultured dilute duff or reaction mixture is acidified as mineral acid such as sulfuric acid and hydrochloric acid, and the inorganic acid salt such as sodium sulfate and ammonium sulfate added if it is necessary to increase the ionic strength of dilute duff or mixture, butanol, methyl Extract as a non-aqueous solvent such as isobutyl ketone and ethyl acetate.

이 용제층을 증류 건조하여서 생(生) D-HIBA를 얻는다. 이렇게 하여 얻어진 D-HIBA조제물을 실리카겔을 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의하여 다시 정제되어서 고순도의 D-HIBA를 구한다.The solvent layer is distilled off to obtain raw D-HIBA. The D-HIBA preparation thus obtained is purified again by column chromatography using silica gel to obtain high purity D-HIBA.

본 발명을 다음 실시예로서 더욱 상세히 설명한다.The present invention is explained in more detail by the following examples.

[실시예 1]Example 1

칸디다 루고사 IFO 0750, 칸디다 루고사 IFO 0591, 칸디다 파라프실로시스 IFO 0708, 칸디다 유틸리스 IFO 0396, 토룰로프시스 칸디다 IFO 0380, 트리고노프시스 배리아비리스 IFO 0671, 사카로 미세스 세레비지에 IAM 4274, 사카로미세스 럭시 IFO 0493, 피키아 멤브라에파신스 IAM 4904, 드베리오미세스 한세니 IFO 0026, 윈지아 로버트지 IFO 1277, 로도스포리디움 토룰로프시스 IFO 0559, 아스페르 기루스 나이저 IFO 2532, 코우엔포라 썰씨네너스 IAM 1324 및 차이거린커스 묄러리 HUT 1305를 포도당 40g, 효모추출물 5g, 펩톤 3g, 육류추출물 1g및 IBA 20g이나 혹은 IBA와 MA의 동일한 양(중량)의 혼합물 20g으로서 구성된 영양배지내에 접종한다.Candida Lugosa IFO 0750, Candida Lugosa IFO 0591, Candida Parafylosis IFO 0708, Candida Utilis IFO 0396, Torulofsis Candida IFO 0380, Trigonofsis Bariaviris IFO 0671, Saccharomyces Cerevisie IAM 4274 , Saccharomyces Lux IFO 0493, Pichia Membra Efacins IAM 4904, Dveriomisses Hanseni IFO 0026, Winzia Roberts IFO 1277, Rhodosporium Torulofsis IFO 0559, Aspergillus Niger IFO 2532, Cooenfora Low Cinener's IAM 1324 and Chai Grincus M. HUT 1305 consisted of 40 g of glucose, 5 g of yeast extract, 3 g of peptone, 1 g of meat extract and 20 g of IBA or a mixture of 20 g of IBA and MA in the same amount Inoculate in nutritional medium.

미생물을 30℃, pH 7.5, 교반회전수 500rmp 및 통기 1vv로 24시간동안 3-L 자(jar)발효기내에서 각각 배양한다. 다음에 pH를 8.5로 상승시켜서 48시간 동안 배양하였다.Microorganisms are incubated in a 3-L jar fermenter for 24 hours at 30 ° C., pH 7.5, agitation speed 500 rmp and aeration 1vv. The pH was then raised to 8.5 and incubated for 48 hours.

이렇게 하여 얻어진 배양용 묽은 스우프를 pH 2.0으로 부여되는 황산으로서 산성화하여 황산암모늄으로 포화시키고 배양용 묽은 스우프와 같은 부피의 초산에틸로서 추출시켰다.The cultured diluted sluff thus obtained was acidified as sulfuric acid imparted to pH 2.0, saturated with ammonium sulfate, and extracted as the same volume of ethyl acetate as the cultured diluted sluff.

무수황산소오다에서 건조된 추출물을 감소된 압력하에서 농축시켰다. 적은 양의 벤젠에 용해된 농축유질의 물질을 실리카겔로 포장된 컬럼에 작용시켰다.The extract dried over anhydrous sodium sulfate was concentrated under reduced pressure. The oily substance dissolved in a small amount of benzene was applied to a column packed with silica gel.

전환되지 않은 IBA 혹은 MA를 제거하기 위하여 먼저 벤젠-아세톤(체적비 9:1)으로서 용리가 이행되고, 다음에 D-HIBA를 용리하기 위하여 벤젠-아세톤(체적비 3:1)으로서 이행되었다.Elution was first carried out as benzene-acetone (volume ratio 9: 1) to remove unconverted IBA or MA and then as benzene-acetone (volume ratio 3: 1) to elute D-HIBA.

점성액체를 주기위하여 감소된 압력하에서 D-HIBA의 증류를 혼합 및 농축시켰다.Distillation of D-HIBA was mixed and concentrated under reduced pressure to give viscous liquid.

이렇게 하여 얻어진 액체는 개스 크로마토그래피, 실리카겔 TLC(Thin-layer chromatography), NMR 스펙트럼 등에 의하여 HIBA로 판명되었다.The liquid thus obtained was found to be HIBA by gas chromatography, silica gel thin-layer chromatography (TLC), NMR spectrum and the like.

각 생산물의 광학적 회전은 [α]_D ²⁵13-18°(C=3, 메탄올)의 결과를 부여함이 측정되었으며, 이는 각 미생물에 의하여 제조된 HIBA가 D(-)-체임이 판명되었다.It was determined that the optical rotation of each product gave a result of [α] _D ²⁵ 13-18 ° (C = 3, methanol), which proved that the HIBA produced by each microorganism was D (-)-chain.

상기한 방법으로서 조제된 D-HIBA의 수량(收量)을 표1에 표시한다.Table 1 shows the amount of D-HIBA prepared as described above.

[표 1]TABLE 1

[실시예 2]Example 2

실시예 1에서 사용한 것과 같은 균주를 포도당 20g, 효모추출물 5g, IBA 1g이나 MA 1g 혹은 IBA과 MA의 동일한 양(중량)으로서 구성된 혼합물 1g을 함유하는 영양배지의 1L내에 각각 접종시켰다.The same strain as used in Example 1 was inoculated in 1 L of nutrient medium containing 20 g of glucose, 5 g of yeast extract, 1 g of IBA or 1 g of MA or 1 g of a mixture composed of the same amount (weight) of IBA and MA.

이들 미생물을 30℃, pH 6.0, 교반회전수 500rpm 및 통기 1vvm으로 20시간동안 3-L자 발효기내에서 각각 배양시켰다.These microorganisms were incubated in a 3-L fermentor for 20 hours at 30 DEG C, pH 6.0, agitation speed 500 rpm and aeration of 1 vmv for 20 hours.

다음 IBA나 MA의 30g 혹은 IBA와 MA의 동일한 양(중량)으로서 구성된 혼합물 30g을 그 결과의 배양용 묽은 스우프에 가했다.Then 30 g of IBA or MA or 30 g of a mixture consisting of the same amount (weight) of IBA and MA were added to the resulting cultured dilute swab.

이 배양용 묽은 스우프를 pH 8.5로 조정한 다음 72시간동안 배양하였다.This cultured thin scoop was adjusted to pH 8.5 and incubated for 72 hours.

배양한 후에, 반응혼합물을 실시예 1에서 기재한바와같은 방법으로서 D-HIBA를 부여하도록 처리하였다.After incubation, the reaction mixture was treated to give D-HIBA in the same manner as described in Example 1.

이렇게 하여 얻은 D-HIBA의 광학적 회전 범위는 실시예 1의 것과 동일했으며, D-HIBA의 수량은 표 2에 표시하였다.The optical rotation range of D-HIBA thus obtained was the same as that of Example 1, and the amount of D-HIBA is shown in Table 2.

[표 2]TABLE 2

[실시예 3]Example 3

실시예 1에서 사용한 바와같은 균주를 포도당 20g, 효모 5g, 펩톤 3g, 육류추출물 3g, IBA 1g이나 MA 1g 혹은 IBA와 MA의 동일한 양(중량)으로서 구성된 혼합물 1g을 함유하는 영양배지의 1L 내에 각각 접종시켰다.The strain as used in Example 1 was each contained in 1 L of nutrient medium containing 20 g of glucose, 5 g of yeast, 3 g of peptone, 3 g of meat extract, 1 g of IBA or MA, or 1 g of a mixture composed of the same amount (weight) of IBA and MA. Inoculated.

이 미생물을 30℃, pH 6.0, 교반회전수 500rpm 및 통기 1vvm으로 24시간동안 3-L자 배지내에서 각각 배양하였다.The microorganisms were incubated in 3-L medium for 24 hours at 30 DEG C, pH 6.0, agitation speed 500 rpm and aeration of 1 vmv for 24 hours.

이렇게 하여 얻어진 배양용 묽은 스우프로부터 원심분리법에 의해 세포를 수확했으며, 이 세포를 0.9%살린 용액으로 2회 세척하고 1/15 M 포스페이트버퍼(phosphate buffer (pH 8.5))로 현탁시켰다.The cells were harvested by centrifugation from the cultured diluted sluff thus obtained, and the cells were washed twice with 0.9% saline solution and suspended in 1/15 M phosphate buffer (pH 8.5).

이 세포현탁액에 IBA나 MA의 30g 혹은 IBA와 MA의 혼합물(IBA:MA=1:1(중량)) 30g 및 포도당 30g을 가하였다. 그 결과의 혼합물을 pH 8.5로 48시간동안 배양하고 다음에 반응 혼합물을 D-HIBA를 부여하도록 실시예 1에 기재한 바와 동일한 방법으로 처리했다.30 g of IBA or MA or 30 g of a mixture of IBA and MA (IBA: MA = 1: 1 (weight)) and 30 g of glucose were added to the cell suspension. The resulting mixture was incubated for 48 hours at pH 8.5 and the reaction mixture was then treated in the same manner as described in Example 1 to give D-HIBA.

이렇게 하여 얻어진 D-HIBA의 광학적 회전범위는 실시예 1에서의 것과 같았으며, D-HIBA의 수량은 표3에 표시하였다.The optical rotation range of D-HIBA thus obtained was the same as in Example 1, and the amount of D-HIBA is shown in Table 3.

[표 3]TABLE 3

Claims (1)

이소부티릭산, 메타크릴릭산 및 이소부티릭산과 메타크릴릭산의 혼합물로 구성되는 기로부터 선택된 기질을 수성 영양배지내에서 D(-)-β-히드록시이소부티릭산으로 전환시키는 능력을 보유하는 미생물의 반응을 그 기질에 부여하고, 영양배지로 부터 D(-)-β-히드록시이소부티릭산을 회수하는 것을 특징으로 하는 D(-)-β-히드록시이소부티릭산의 제조법.Microorganisms possessing the ability to convert substrates selected from groups consisting of isobutyric acid, methacrylic acid and mixtures of isobutyric acid and methacrylic acid to D (-)-β-hydroxyisobutyric acid in aqueous nutrient media A method for producing D (-)-β-hydroxyisobutyric acid, wherein the reaction is given to the substrate and the D (-)-β-hydroxyisobutyric acid is recovered from the nutrient medium.