KR820002085B1 - 불용성 활성효소의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

불용성 활성효소의 제조방법

본 발명은 고정화글루코아밀라제효소를 사용하여 포도당(dextrose)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 전분은 고분자량의 중합탄화수소이다.

이것의 단량체 즉 무수포도당 단위는 포도당으로부터 유도된 것이며 전분이 완전가수분해되어 포도당을 생성한다. 미국에서는 포도당을 옥수수전분으로부터 제조하며 유럽에서는 옥수수전분과 감자전분, 일본에서는 옥수수전분과 고구마전분으로부터 제조한다.

1960년도까지는 전분을 산가수분해하여 포도당을 제조했다. 이 제조법은 전분을 120-145℃의 온도에서 염산 또는 황산과 함께 가열하고, 가수분해혼합물을 탄산나트륨으로 중화한 다음 세척하고 포도당을 결정화시키는 것으로 구성된다. 불행하게도 포도당의 수득량은 포도당분자의 재결합에 의해 형성된 비교적 대량의 전환생성물의 생성에 의해 저하된다. 또한 가수분해 반응의 고온과 낮은 pH때문에 생성된 포도당의 일부가 하이드록시 메틸푸르푸랄, 레불린산 및 색소체로 전환된다.

이와 같은 생성물의 생성은 비가역적이며 그들이 형성됨에 따라 바람직한 포도당의 수율은 감소하게 된다.

또한 염산의 사용 또는 몇몇예에서의 황산의 사용 및 그뒤에 따른 알칼리와의 중화는 최종생성물인 포도당의 결정화를 방해하는 무기산염의 생성을 초래하게 된다. 그의 전분의 포도당으로의 가수분해는 효소에 의해 수행된다. 이런 목적으로 사용된 효소는 글루코 아밀라제이다.

이 효소는 전분분자로부터 한번에 포도당 1분자를 분해함으로써 전분을 효과적으로 가수분해 시킨다. 그러나 실제적으로 전분에 글루코아 말라제릍 작용시키기 전에 우선 전분을 희박하게 하는 것이 필요하다 이 희박하게하는 단계는 산이나 효소에 의해 수행될 수 있다. 전분을 희박하게 하여 약 10-20의 D, E로 한다음 글루코아밀라제로 처리한다. 이 두 단계방법은 산-효소법이나 효소-효소법으로서 사용된 단개의 성질에 따라 달라진다. 산-효소법에 있어 전분을 20-40%의 전분과 염산과 같을 산을 함유하는 수성현탁액내에서 액화하고 가수분해한다. 현탁액을 약 70°-160℃의 고온 및 PH 약 1-4.5에서 가열하여 액화하고 전분을 부분가수분해한다. 산-효소법은 공지되어 있다.

효소-효소법에서는 전분을 세균성 α-아밀라제 효소와 같은 액화 효소와 20-40%의 전분을 함유하는 수성현탁액중에서 약 85-105℃의 온도에서 액화하고 부분 가수분해 시킨다. 액화되고 가수분해된 전분의 포도당 당량(D, E)은 보통 약 20이하이며 10이하인 것이 바람직하다.

혼합물을 약 95℃이상의 온도, 바람직하게는 110-150℃온도로 하여 완전한 전분용액이 되게한다. 전분가수분해물을 95℃이하로 냉각한 다음 세균성 α-아밀라제로 처리히여 전분을 약 20까지의 D, E로 가수분해시킨다. 이 방법은 공지되어 있다.

두 방법중 하나로 소화된 전분을 글루코아밀라제와 같은 또 다른 효소를 사용하여 포도당이나 포도당함유 시럽으로 전환시킨다. 글루코아밀라제 제제는 예컨데 아스페르기루스 포에니시스, 아스페르기루스니거, 아스페르기루스 아와모리와 같은 아스페르기루스 속에 속하는 특정 진균균주나 리조푸스 종및 에도마이세스종에 속하는 균주로 부터 제조한다. 글루코아밀라제는 전분을 가수분해시켜 전분분자의 비환원성 말단으르부터 알파-1.4 결합이나 알파-1.6 분지점에 있는 하나의 포도당 단위를 분리시키는 작용을 한다. 통상의 글루코아밀라제 효소제는 대부분을 차지하는 글루코아밀라제 외에 예컨대 소량의 푸루테아제, 셀루라제, α-아밀라제 및 트란스글루코시다제 같은 몇몇 효소로 구성되어 있다. 전분으로부터 포도당을 제조하는데 있어 고정화 효소를 사용하는데 많은 관심이 기울여져 왔다. 고정화는 효소안정성을 증가시키며 효소물질은 반복하여 재사용할 수 있으며 반응의 좀더 정확한 조절이 가능하게 된다. 글루코아밀라제를 고정시키는 방법에는 여러가지가 있다. 글루코아밀라제의 고정화법은 공지되어 있다.

클로이드성 실리카상에 효소를 고정시키는 법이 최근 보고되었다. 콜로이드성 실리카를 효소를 결합하는데 사용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

그러나 이 방법은 효소를 담체에 결합시키기전에 효소기질을 담체와 결합시키는 것이 필요하며 생성물을 분리시키기 위한 고가의 냉동건조 또는 분무건조를 포함한다. 또 다른 방법에서도 효소담체로서 콜로이드성 실리카가 사용되었다. 이 경우 효소를 가교결합시키고 이것을 화학적으로 실리카에 결합시키는데 글루타르알데히드가 사용되었다.

또한 폴리에틸렌 아민을 우선 실리카에 결합시킨다음, 효소를 가교결합제를 사용하여 실리카 표면상의 폴리아민에 부착시켰다. 상기 두 방법에 의해 미세하게 분할된 입자를 얻었다.

이와같은 작은 효소-함유 입자는 뱃취 반응물로부터 제거하기가 곤란하며 그들을 컬럼조작에서 사용할 경우 처치곤란한 압력드롭이 생성된다. 포도당이성화효소를 콜로이드성 실리카에 결합시키는 방법이 공지되어 있다. 글루타르알데히드를 사용함으로써 효소의 결합력이 향상되며 혼합물을 동결시키고 이것을 2회 이상 융해시키면 입자크기가 증가된다.

그 결과 이성화반응 컬럼내에서 흘러가기 충분한 크기인 20-100메쉬의 입자크기를 가진 과립 또는 박편이 생성된다. 그러나 글루코아밀라제의 결합예가 발표된 적은 없었다. 만일 pH를 약 6.5까지 상승시켜 이들을 겔화하고 동결키시고 융해시키는 경우 양이온성 콜로이드성 실리카의 작은 입자를 좀더 큰 입자로 응결시킬수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한 콜로이드성 실리카를 글루코아밀라제의 존재하에 이 방법으로 응결시킬 경우 효소가 활성형으로 고정된다는 것도 발견했다. 효소를 실리카에 결합시키는데는 가교결합제도 필요치 않으며 입자를 수용액에 현탁시키거나 또는 수용액으로 세척할 경우 효소가 침출되어 나오지 않는다. 반대로, 만일 콜로이드성 실리카를 우선 응결시킨 다음 생성된 입자를 효소와 접촉시킬 경우 효소는 실리카에 거의 결합되지 않는다.

이 효소조성물의 가장 중요한 이점은 이것이 비교적 비압착성이라는 점이다. 예컨대 2000rpm으로 원심분리기내에서 15분간 원심분리시켜도 용량은 변하지 않는다. 이 비압착성은 우수한 입자크기와 함께 고정상 반응기내에서 반응대역을 횡단하는 최소의 압력드롭을 가지고 효소적 전환을 수행하는데 매우 적합한 효소조정물을 생성케 한다.

조성물의 성질은 조성물이 보강용 반응기, 연속교반탱크 반응기 및 뱃취 반응기내에서 효소적 전환을 수행하기에 유용하게 해준다.

본 발명에 따라 하기(a)-(e)로 구성된 불용성 활성효소를 제조하는 방법이 제공된다.

(a) 효소용액을 양이온성 콜로이드성 실리카와 접촉시키고

(b) pH를 약 6.5로 올려 혼합물을 겔로 전환시키고

(c) -15℃이하에서 약 24시간 두어 겔을 동결시키고

(d) 동결교체를 약 20℃에서 방치하여 융해시키고

(e) 결과 생성된 고형 효소함유입자를 분리시킨다.

또 다른 바람직한 구체예에서 본 발명은 하기(a)-(b)로 구성된 전분 가수분해물로 부터 포도당 또는 포도당함유 시럽을 생성하는 방법을 제공한다.

(a) 전분가수분해물을 전분가수분해효소로 구성된 비가동성효소 조성물로 pH 약 4.0-4.5에서 처리하고

(b) 포도당 생성물을 회수한다.

본 발명에서 사용되는 콜로이드성 실리카는 실리카입자의 수성콜로이드성 분산액이다. 이런 생성물은 듀퐁사에서 LUDOX란 상품명으로 시판하고 있다. LUDOX제품의 대부분은 음전하입자를 가진다. 그러나 바람직한 LUDOX는 양전하 콜로이드입자를 가진 LUDOX-130M이다. 비록 시판되는 콜로이드성실리카는 7-24nm의 입자크기이나 본 발명에는 입자크기에 관계없이 어떤형의 콜로이드성실리카나 사용할 수 있다

본 발명에서 사용되는 글루코아밀라제는 기지의 진균성아밀라제 제제이며 특히 이들은 아스페르기루스속, 멘도마이세스 속 리조푸스 속에 속하는 균주로부터 유래한 것이다. 특히 바람직한 글루코아밀라제는 수성매제내에서 점토물질로 처리하여 바람직하지 않은 트란지스글루코시다 제 활성을 제거한 진균아밀라제 제제이다. 글루코아밀라제 활성단위는 하기와 같이 측정한다.

기질은 물에 녹여 용액 100ml당 건조기질 4.0g을 함유하게 끔 희석한 왁스상 옥수수전분을 10-20D, E-아밀라제로 처리한 가수분해물이다. 용액을 정확히 50ml를 100ml 용량플라스크에 넣고 이 플라스크에 1.0몰의 초산나트륨-초산완충액(pH4.3)5.0ml를 가한다.

플라스크를 60℃의 수욕에 놓고 10분후 적당량의 효소제제를 가한다. 효소제제를 가하고 정확히 120분후 용액을 0.5N수산화나트륨을 사용하여 페놀프탈레인 종말점으로 맞춘다. 용액을 실온으르 냉각한후 희석한다. 희석한 샘플에 대해 효소제제를 첨가하지 않은 것을 대조로하여 포도당으로 계선되는 환원장치를 측정한다. 글루코아밀라제 활성을 하기와 같이 계산한다.

여기서

A=효소제제ml(또는 g)당 글루코아밀라제 활성단위

S=효소전환된 샘플중의 환원당(g/100ml)

B=대조액중의 환원당(g/100ml)

E=사용된 효소제제의 양, ml(또는 g)

S는 100ml당 1.0g을 초과해서는 안된다.

출발물질로서 사용된 전분가수분해물은 전술한 바와 같은 산 액화전환이나 효소액화 전환법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 전분 가수분해물을 고정화 글루코아밀라제 제제로 단속 처리하여 포도당을 생성한다. 뱃치나 컬럼중에서 처리할 수 있다.

여기서 포도당 당량 또는 D, E치라 함은 전분가수분해물 중에 용해된 고체중의 환원당 함량을 스크룰법에 따라 퍼센트포도당으로서 표시한 것이다. (Encyclopedia of Industrial chemical Analysis, Vol, 11, pp 41 42)포도당시럽을 고압액체크로마토그라피를 사용하여 분석한다. 성분을 칼슘형 양이온 교환수지로부터 물로 용츨시켜 크로마토그라피한다. 용출된 성분을 시차굴절계로 사용하여 검출한다. 포도당 이외의 탄수화물을 전기적분계를 사용하여 정량하여 그 차로 부터 포도당의 함량을 계산한다. 사용되는 수지는 칼슘형의 아미넥스 Ql5-5이다(Bio-Rad, Laboratories, Richmond, Cali fornia)콜로이드성 실리카와 접촉되는 효소는 적당량의 물로 희석한 후 용액상태로 사용한다. 효소를 안정화 시키는 염용액으로 희석하거나 pH를 유지시켜주는 완충용액으로 희석한다. 글루코아밀라제의 경우 바람직한 농도는 5-200단위/ml이다.

콜로이드성 실리카가 사용되며 바람직하게는 물로 희석하여 10-30중량%로 희석한 것을 사용한다. 불용화된 후에도 활성이 그대로 보지되는 모든 효소를 본 방법에서 사용할 수 있다.

바람직한 효소는 글루코아밀라제, 플루라나제, 알파-아밀라제, 베타-아밀라제 및 이소아밀라제와 같은 탄수화물로분해 효소이다.

콜로이드성실리카를 효소존재하에 pH를 조절하여 겔화한다.

희산 또는 희알칼리 또는 산성, 염기성을 사용할 수 있다. 글루코아밀라제 및 양이온성 콜로이드성 실리카의 경우 희탄산나트륨용액으로 pH를 조절하는 것이 희수산화 나트륨으로 조절하는 것보다 바람직한 것으로 밝혀졌다. 겔화의 최적 pH는 사용된 효소의 안전성 및 성질에 따라 좌우된다.

겔화혼합물은 글루타르 알데히드와 같은 가교결합제 첨가에 의해 안정화 될수 있다. 놀라웁게도 글루코아밀라제와 양이온성 콜로이드성 실리카의 경우 이런 가교결합제 사용없이도 우수한 결과가 얻어졌다.

겔을 혼합물의 빙점이하의 온도, 바람직하게는 -15∼-20℃에서 얼린다. 냉각시간은 온도, 동결되는 물질의 용량 및 기타 냉각조건에 따라 달라진다. 혼합물은 혼합물이 완전히 얼도록 충분한 시간동안 빙점이하에 두어야 한다. 동결 혼합물을 15°-25℃의 실온에서 서서히 해동(解凍)시킨다. 그러나 효소의 불활성화를 야기하지 않는 어떤 온도든 사용될수 있다.

효소혼합물을 겔화시키고 동결시키고 해동시키는 반응조건은 효소활성이 유지되어 있으며 입자로 충전된 컬럼을 통해 시럽이 흐를 수 있을 정도의 충분한 크기와 구조를 가지는 뱃취반응으로 부터의 여과 또는 원심분리에 의해 입자를 쉽게 회수할 수 있는 입자를 얻을수 있도록 조정한다.

또한 효소함유입자의 구조는 효소반응이 일어나도록 기질 확산을 허용케하는 구조여야 한다. 바람직한 입자크기와 구조는 콜로이드성 실리카의 초기농도를 조절하고, 겔화한 다음 기질과 함께 또는 기질없이 염존재하에 동결시키고 동결 및 해동 속도를 조절함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 고정화 효소조성물은 효소활성의 손실을 야기하지 않고 실질적인 반응속도를 얻을 수 있는 그런 온도에서 전분 가수분해물과 접촉시킨다. 글루코아밀라제의 경우 통상온도범위는 20-70℃이며 40-50℃가 바람직하다.

본 발명을 실시하는데 있어 광범위한 가수분해물 농도를 사용할 수 있다. 이들은 5-60%의 고체를 함유하나 낮은 D. E를 가진 기질은 고체농도가 높은데 사용하기에 너무 점도하다.

기질의 pH는 3.5-7.0으로서 사용되는 효소에 따라 최적 pH가 달라진다. 글루코아밀라제의 경우 바람직한 범위는 4.2-4.5이다. 고정화 글루코아밀라제 조성물을 사용하는 본 발명의 방법은 탄수화물의 높은 퍼센트가 포도당인 시럽을 제조하는데 사용될 수 있다.

생성물중의 포도당의 퍼센트는 가수분해물과 효소와의 접촉시간, 온도, 사용되는 가수분해물의 농도, 사용되는 가수분해물의 조성을 달리함으로써 조정할 수 있다. 따라서 다량의 포도당을 함유하는 시럽은 물론, 조절된 양의 포도당을 함유하는 시럽을 생성하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법은 말토스를 함유하는 시럽을 생성하는데도 사용할 수 있다. 이것은 고정화 글루코아밀라제 조성물 대신 고정화 β-아밀라제는 사용함으로써 이루어진다.

본 발명은 하기실시예에서 상세히 설명되며 따로 지적하지 않는한 모든 부와 퍼센트는 중량기준이다.

[실시예 1]

양이온성 콜로이드성 실리카(LUDOX 130M) 30%분산액 5ml에 몰 4ml 및 글루코아밀라제 112단위를 물 2ml에 녹인 용액을 첨가했다.

생성된 pH4.4의 현탁액을 실온에서 15분간 진탕했다.

글루타르알데히드 25%용액 0.045ml를 가한다음 0.1N수산화나트륨 용액을 가하여 pH를 6.5로 맞추었다. 혼합물로서 형성된 겔을 실온에서 20분간 진탕했다. 겔을-120℃에서 24시간 동안 동결한 후 동결물을 실온으로하여 교반하지 않고 3시간 동안 방치하고 이어 고체상과 액체상을 분리하였다. 고체를 흡인 여과하여 모으고 물 135ml로 세척했다. 혼합여액과 세액을 분석한 결과 활성효소는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 고체의 수성현탁액을 현미경에 검사했다.

투명한 입자의 직경은 1-380μ로서 입자의 대부분은 100-150μ사이였다.

[실시예 2]

모든 물질을 3배량을 사용하여 실시예 1의 과정을 반복했다. 글루코아밀라제 활성은 14단위/g이다.

[실시예 3]

글루타르알데히드를 첨가하지 않는 것외에는 실시예 2의 방법을 반복했다. 건조고체 g당, 17단위의 글루코아밀라제가 활성형으로 결합되어 있다. 이것은 가교결합제로서 글루타르 알데히드를 사용하지 않을 경우 좀더 많은 글루코아밀라제가 활성형으로 양이온성콜로이드성 실리카와 결합함을 나타내준다.

[실시예 4]

1%탄산나트륨용액을 0.1N 수산화나트륨용액 대신 사용하여 pH를 6.5로 맞추는 것을 제외하고는 실시예 3의 과정을 반복했다.

글루코아밀라제의 결합활성은 건조고체 g당 24단위이다.

[실시예 5]

본 실시예는 겔화 및 동결에 의해 생성된 양이온성 콜로이드성 실리카 입자를 극소량의 글루코아밀라제와 결합시키는 과정을 나타낸다.

30%양이온성 콜로이드성 실리카(LUDOX 130M) 15ml와 물 10ml의 혼합물에 천천히 교반하면서 1%탄산 나트륨용액 10ml를 가한다. 그 결과 혼합물의 pH가 6.5로 올라간다. 백색 겔을-20℃에서 24시간동안 동결시키고 실온에서 2시간 방치한후 고체를 흡인여과하여 모으고 물로 세척한다. 고체 샘플 2g을 pH 4.3-4.5의 0.05물 초산나트륨 완충액 50ml와 함께 1시간 동안 진탕한다.

고체를 여과하여 제거하고 pH4.3의 초산나트륨 완충액으로 한번 더 세척한다. 고체를 글루코아밀라제 150단위를 0.04몰 초산나트륨 완충액 15ml에 녹인 용액에 가하고 초산을 가하여 pH4.3으로 조절한다.

혼합물을 실온에서 하룻밤 진탕하고 고체를 모은후 물 200ml로 세척한다. 분석결과 139단위의 글루코아밀라제가 비결합형으로 남아있는 것으로 나타났다.

결합활성은 g당 2단위이다.

[실시예 6]

30중량%의 양이온성콜로이드성 실리카(LUDOX 130M) 180ml와 증류수 120ml의 혼합물에 진탕하면서 글루코아밀라제 3990단위를 함유하는 용액 60ml를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 15분간 진탕한 다음 탄산나트륨 1%용액 140ml를 2시간에 걸쳐 진탕하면서 적가했다.

두꺼운 백색겔을 -20℃의 냉동기에 24시간 동안 둔다.

이 물질을 실온에서 5시간 방치하여 해동시킨다.

고체를 모아 증류수 100ml로 세척한다.

이것을 비이커에 옮기고 경사법으로 물로 4회 세척하여 미세한 입자를 제거한다. 건조담체 g당 16단위의 글루코아밀라제가 활성형으로 결합되어 있다.

[실시예 7]

유리컬럼(내경 30mm, 길이 190mm)에 실시예 6에서와 같이 제조된 글루코아밀라제를 함유하는 LUDOX 130M 100ml를 가한다. 29D. E α-아밀라제 처리 가수분해물의 25%수용액을 0.5(BVH Bed Volumes per hour)의 속도로 컬럼을 통과시킨다. 가수분해물의 pH를 4.3으로 맞추고 0.025%의 프로필 파라셉트를 가하여 미생물 생장을 저지시킨다. 컬럼의 온도를 물쟈켓을 사용하여 45℃로 유지시킨다.

컬럼으로부터 흐르는 시럽의 탄소화물조성물을 고압액체 크로마토그라피법으로 측정한다.

평균조성은 다음과 같다 :

용출액의 당조성은 조작 8시간 동안 거의 일정하게 남아있다.

용출액중에 활성 글루코아밀라제는 검출되지 않았다.

[실시예 8]

29D. E전분가수분해물을 가용성 글루코아밀라제로 소화시켜 제조한 71D. E전분가수분해물을 실시예 5에서 사용된 29D. E전분가수분해물 대신 출발물질로 사용했다. 컬럼을 45℃, pH4.3에서 3시간 동안 유출시켰다. 탄수화물 생성물을 고압액체 크로마토그라피법으로 분석한 결과 하기와 같은 평균치를 나타냈다.

컬럼을 14일간 연속해서 사용한 후, 불용성효소 복합물 샘플을 컬럼으로 부터 취한 결과 g당 11단위의 글루코아밀라제 활성을 함유하는 것으로 나타났다.

이 결과는 본 발명의 방법에 의한 고정화 글루코아밀라제는 전분가수분해물을 포도당시럽으로 전환시킬 수 있으며 이런 목적으로 연속컬럼조작에서 장기간 사용할수 있음을 나타낸다.

본 발명을 그의 특수한 구체예와 함께 설명하였으나 본 분야에 숙련된 자에게 명백한 또 다른 변법이 가능하다는 것을 알아야 한다.

Claims (1)

1. 글루코아밀라제 용액을 양이온성 콜로이드성 실리카와 접촉시키고, 혼합물을 pH를 약 6.5로 올려 겔로 전환시키고, 약 -15℃이하에서 약 24시간 두어 겔을 동결시키고, 동결고체를 약 20℃에서 방치하여 해동시키고, 생성된 고형효소 함유입자를 분리시킴으로써 불용성 활성효소를 제조하는 방법.