KR810001824B1 - 핵산 분해효소의 고정화 법 - Google Patents

Abstract

내용 없음

Description

핵산 분해효소의 고정화 법

본 발명은 스트랩토 마이세스속에 속하는 미생물이 생성하는 헥산 분해효소인 뉴클래아제와 아데닐산디아미나제를 고정화시킴에 있어서 건조 군체를 담체로 함으로써 경제적으로 저렴한 5'-모노뉴클레오타이드를 제조함에 있다.

스트랩토마이세스속에 속하는 미생물(헥산분해효소 생성균)이 생성하는 가용성 효소를 이용하여 헥산을 분해할 경우 배양상태에 따라 분해수율에 큰 영향을 미치므로 분해과정이 안정되지 못할 뿐 아니라 배양액 중 효소의 함유가 대단히 적기 때문에 분해시 많은 배양액을 이용해야 하므로 시설규모가 커지며 또한 효소를 물에 용해된 상태로 기질에 각용시키므로 분해 후 생성물을 분리정제할 때에 효소를 산, 알칼리 및 유기용제 등에 의해 제거해야 하는 부차적인 공정이 뒤따라야 하기 때문에 공정은 복잡해질 수 밖에 없었다.

이와 같은 문제점 등을 개선하고자 본 발명자 등은 많은 연구를 한 결과 핵산분해효소인 뉴클레아제 및 아데닐산디아미나제의 효소적 성질을 변화시키지 않고 높은 활성을 계속 유지하며 안정성이 있고 내구성이 있는 고정화 효소가 상기의 문제점을 해걸할 수 있다고 생각했다.

효소를 담체에 결합시키는 고정화 방법으로는 공유결합에 의한 방법과 이온결합 또는 물리적 흡착에 의한 방법 등으로 나눌 수 있으나 효소의 특성에 따라 고정화방법을 선택해야 한다.

그러나 일반적으로 공유결합에 의해 효소를 담체에 결합시키는 경우에는 효소가 담체와 강하게 결합하기 때문에 안정한 표품을 얻을 수 있으나 비교적 격렬한 조건하에서 결합반응이 일어나기 때문에 효소의 고차구조가 변화되어 기질 특이성 드의 효소적 성질이 변화되는 경우가 많다.

또한 이온결합이나 물리적 흡착에 의해 효소를 담체에 결합시켜 고정화하는 방법은 조작이 간단하며 처리조건이 온화하며 효소의 고차구조의 변화가 적어 비교적 활성이 높은 포폼을 얻을 수 있으나 효소와 담체와의 결합력이 비교적 약하기 때문에 효소가 담체로부터 쉽게 이탈되는 결점이 있다.

본 발명자 등은 이와 같은 결점을 개선하여 공업적으로 대량의 핵산을 연속적으로 분해하는 핵산분해효소의 고정화 방법 및 담체에 대하여 연구한 결과 종래에 전혀 알려지지 않은 높은 활성을 계속 유지하고 안전성이 있으며 내구성이 큰 새로운 고정화방법을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 특징적인 점은 새로운 담체를 이용함이 아니고 스트랩토마이세스속에 속하는 미생물(핵산분해효소 생성균)을 배양하여 얻은 배양액을 균체와 조효소액으로 분리한 다음 균체는 열처리하여 건조하고 조효소액은 감압농축한 후 뉴클레아제 및 아데닐산디아미나제 이외의 효소를 최대한 실활시켜 상기의 열처리한 건조균체를 담체로 하여 고정화시킴에 있다.

본 발명을 구체적으로 설명하면 통상의 탄소원·질소원을 함유한 배지에 스트랩토마이세스속에 속하는 미생물(핵산분해효소 생성균)을 배양하고 그 배양물을 가압여고한다. 가압여과하여 균체와 조효소액을 분리한 후 균체를 100℃에서 10-20분간 열처리한 후 유기용제(예, 아세톤, 토루엔, 키실렌 등)또는 동결 건조기로 건조한다.

조효소액은 최초액량의 20-40배 정도 감압농축(농축온도 40-60℃ 진공도 600-750mmHg)한 후 상은에서 1시간에 걸쳐서 서서히 50-55℃까지 올리며 급격히 2-6분간 걸쳐 70-75℃까지 올린 후 상은까지 급냉시킨다. 병행하여 pH를 4.0-4.5까지 내린후 (5-15분)다시 pH를 7.8-8.2까지 서서히 올려 온도가 70-75℃ 되는 시간과 pH가 7.8-8.2되는 시간을 일치시킨다.

이때 각 효소의 실활율은 다음 표와 같다.

이와 같이 처리된 조효소 농축액을 상기 열처리한 건조된 균체에 서서히 가하여 군체에 대하여 1.5-2.0배 정도 첨가시킨 후 페리트(Pellet)를 만든다.

이와 같이 만든 페리트를 실온에서 16-20시가 자연건조시켜 2-5%의 글루탈알데하이드 용액에 3-5시간 서서히 교반시키며 침지시킨 후 꺼내어 수도수에 2-4회 수세한 다음 건조하여 5℃이하에서 보관한다. 이상과 같이 조제된 고정화효소역가의 반감기는 100-115일이었으며 활성측정은 리퀴드크로마토그라피에 의해 5'-모노뉴클래오타이드를 정량했다.

[실시예 1]

전분 3%, 대두박 1.5%, 제1 인산카리 0.1%, 황산마그네늄 0.05%, 뇨소 0.3% 조성의 배지에 스트랩토마이세스아래우스를 접종하여 pH 7.5, 온도 30℃로 36시간 배양한 1ℓ의 배양종료액을 룻째로 여과하여 균체 120ℓ(수분 81.2%)을 얻었다.

상기 균체는 100℃에서 10분 열처리한 후 균체 120g에 아세톤 200ml씩 2회에 걸쳐서 수세한 후 실온에서 건조하였다.

상기 건조된 균체 20g(건분 93.2%)을 취하여 분쇄하여 분말을 만들었다. 조효소액을 45℃에서 진공감압농축(진공도 720mmHg)하여 365ml농축 조효소액을 얻은 후 1시간에 걸쳐 온도를 서서히 50℃까지 올리며 3분간에 걸쳐 70℃까지 올린 후 상온으로 냉각한다. 병행해서 pH는 4.0까지 10분간에 걸쳐 떨어뜨린 후 서서히 pH를 8.0까지 올린다.

이때 온도가 70℃까지 되는 시간과 pH 8.0까지 되는 시간이 일치되도록 한다.

상기 처리된 효소 농축액을 상기 열처리 건조균체에 첨가시켜 페리트를 만든다. 이상과 같이 만들어진 페리트를 18시간 실온에서 건조시킨다. 건조된 페리트를 5%글루탈알데히드 용액에 3시간 동안 서시히 교반하여 침전시킨 후 꺼내어 3회 수도수로 수세한다. 수세한 페리트를 실온에서 18시간 건조한 후 5℃이하에 보관한다.

이와 같이 만든 고정화효소를 칼람에 충진한 후 3% 핵산 수용액을 온도 52℃, pH7.5로 유지하면서 지질용액을 체장시간이 6.5시간이 되도록 조절하여 반응시켜 본 결과 반감기가 115일로 나타났으며 반감기까지의 5'-GMP, 5'-IMP의 평균분해율은 21%, 23%를 나타냈다.

[실시예 2]

실시예 1과 같이 만든 고정화효소에 1% 핵산수용액 1ℓ를 온도 52℃ pH 7.5 체장시간 4.5시간이 되도록 한 후 나온액을 공지의 이온교환수지로 분획·정제한 결과 5'-GMP 2.56g 5'-IMP 2.38g 5'-UMP 2.45g 5'-CMP 2.25g을 얻었다. 효소 활성의 반감기는 110일이였다.

[실시예 3]

고구마전분 3%, 대두박 1.5%, 제2인산카리 0.1%, 유산마그네슘 0.05%로 조성한 배지를 115℃에서 15분간 멸군한 후 스트랩토마이세스알보그리세오루스를 접종한 후 pH 7.4, 온도 31℃에서 40시간 배양하여 배양완료액을 얻어 실시예 1과 같은 방법으로 하여 고정화효소를 얻었다.

상기 고정화효소를 자켓이 부착된 칼람에 50g을 충전한 후 2% 핵산 수용액 2ℓ를 온도 52℃, pH 7.5로 유지하여 SV=1.0로 조절 후 반응시켜 공지의 방법인 이온교환수지법으로 분획정제해 본 결과 5'-GMP 10.36g 5'-IMP 9.76g 5'-UMP 9.64g 5'-CMP 9.04g을 얻었으며 효소활성 반감기 105일까지 5'-GMP 24.5g 5'-IMP 22.8g 의 평균분해율을 얻었다.

Claims (1)

1. 스트랩토마이세스속에 속하는 핵산분해효소 생성균을 배양하여 얻은 배양액을 균체와 조효소액으로 분리한 다음 균체를 열처리 건조하고 조효소액은 감압 농축한 후 뉴클레아제 및 아데닐산디아미나제 이외의 효소를 실활시켜 상기의 열처리한 건조균체를 담체로 하여 효소를 고정화 시키는 방법.