KR790001610B1 - Process for the preparation of antibiotics mm 13902 - Google Patents

Abstract

Antibiotics mm13902 (I) which had synergistic antibacterial effect with penicillin and cephalosporine and its salts were prepd. by culturing Streptomyceus olivaceus ATCC 21379, ATCC 21380, ATCC21381, ATCC 21382, ATCC 31226 on a medium contg. yeast extract, soybean meal, glucose anhydride, CoC12, and CaCO3 at 28±2≰C for 2-3 days, centrifuging and by percolating through a column of activated charcoal to recover I.

Description

항생물질 MM 13902의 제조방법Method for preparing antibiotic MM 13902

제 1 도는 MM 13902이 나트륨염의 UV 흡수 스펙트럼.1 is the UV absorption spectrum of sodium salt of MM 13902.

제 2 도는 새로 제조한 0.4% w/w 디스크 내에서의 MM 13902이 나트륨염의 IR 흡수 스펙트럼.2 is the IR absorption spectrum of MM 13902 sodium salt in freshly prepared 0.4% w / w disk.

제 3 도는 새로 제조한 D₂O용액내에서의 MM 13902이 나트륨염의 N.M.R. 스펙트럼["X"로 표시한 정점은 용제내의 불순물(HOD)로 인한 것이다.]Figure 3 shows the NMR spectrum of the sodium salt indicated by MM 13902 in the freshly prepared D ₂ O solution ["X" due to impurities in the solvent (HOD).]

본 발명은 일종의 스트렙토마이세스 올리바 세우스(Streptomyces olivaceus) 균주 및 연관 유기체의 발효에 의해 얻을 수 있는 신규 항생제의 제조방법에 관한 것으로, MM 13902라고 명명된 본 신규물질은 강한 항생작용외에 페니실린 및 세팔로스포린과 상승적(相乘的)으로 작용한다.The present invention relates to a method for preparing a novel antibiotic which can be obtained by fermentation of a strain of Streptomyces olivaceus and related organisms. The novel substance, named MM 13902, has a strong penicillin and three It works synergistically with palosporins.

지금까지는 유용한 β-락타마제 억제제가 일종의 스트렙토마이세스 올리바세우스 균주의 발효에 의하여 얻어질 수 있음이 알려져 왔다. 본 발명 이전까지는 상기 물질이 완전히 순수하다고 믿어왔다. 그러나 본 발명자는 상기 물질이 그렇지는 않고 그 물질의 극소부분이 분리되어 강한 항생작용을 가짐을 발견했다.Until now it has been known that useful β-lactamase inhibitors can be obtained by fermentation of a strain of Streptomyces olibaceus. Until the present invention it was believed that the material was completely pure. However, the inventors have found that the substance is not, and only a small part of the substance is separated and has strong antibiotic action.

이 신규물질은 MM 13902라 명명됐고, 상기 특성은 상기 상기물질에 의해 나타나는 β-락타마제 억제활성의 극히 일부분에 기인하는 것이지만 상기물질에 존재하는 일종의 항균활성의 일부분에 기인하는 것으로 알려졌다.This new material was named MM 13902 and the property is attributed to a fraction of the antibacterial activity present in the material, although it is due to only a fraction of the β-lactamase inhibitory activity exhibited by the material.

다른 β-락타마제 억제제들도 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주에 의해 생성됨이 알려졌지만 이들 물질은 MM 13902를 함유하는 항생제들과 같은 강한 항균활성을 갖고 있지 못하다.Other β-lactamase inhibitors are also known to be produced by Streptomyces strains, but these substances do not have the same strong antimicrobial activity as antibiotics containing MM 13902.

본 발명을 좀 더 상세히 기술하면, 본 발명은 여기서 MM 13902로 명명된 항균제 및 그의 염을 제공한다.In more detail the present invention, the present invention provides an antimicrobial agent and salts thereof named MM 13902 herein.

완전히 순수한 나트륨염의 형태로 되있는 고체 카복실산인 MM 13902는 다음의 특성을 갖는다.MM 13902, a solid carboxylic acid in the form of a completely pure sodium salt, has the following properties.

i) 크게 수용성이고, 메탄올에 용해되며 클로로포름, 디메틸에테르 및 탄화수소에 완전 불용성이다.i) It is largely water soluble, soluble in methanol and completely insoluble in chloroform, dimethyl ether and hydrocarbons.

ii) 수용액내에서 극대흡수치를 갖는 특성 자외선 스펙트럼을 가지며 그중 하나는 약 305nm에서이다.ii) has a characteristic ultraviolet spectrum with a maximum absorption in aqueous solution, one of which is at about 305 nm.

Ⅲ) 새로 제조한 KBr 디스크내에 0.4 w/w로 존재할 때, 약 3,450, 2,950, 1,750, 1,620, 1,510, 1,400 및 1,260cm^-1에서 극대흡수치를 갖는 특성적외선 스펙트럼을 갖는다.III) When present at 0.4 w / w in a newly prepared KBr disc, it has a characteristic infrared spectrum with a maximum absorption at about 3,450, 2,950, 1,750, 1,620, 1,510, 1,400 and 1,260 cm ⁻¹ .

iv) D₂O내에서 특성 n.m.r. 스펙트럼을 가지며 상기 스펙트럼은 (a) 약 14Hz의 커플링 상수와 함께 약 2.85τ 및 4.00τ에 위치하는 저(低) 필드(field)의 더블렛 한쌍;iv) a pair of low field doublets having characteristic nmr spectra in D ₂ O and located at about 2.85τ and 4.00τ with a coupling constant of about 14 Hz;

(b) 약 8.55τ에 위치하는 더블렛 및(b) a doublet located at about 8.55τ and

(c) 약 8.00τ에 위치하는 뾰족한 싱글렛을 가지고 있다.(c) It has a pointed singlet at about 8.00τ.

v) 여러 속(屬), 특히 스타필로코쿠스, 아우레우스, 바실루스, 섭틸루스,에스케리키아콜리, 클렙시엘라 에로게네스, 프로테우스, 미라빌리스 살모넬라 타이피, 및 슈도모나스 에루기노자의 균주에 대해 상균활성을 갖는다.v) strains of various genera, in particular Staphylococcus, Aureus, Bacillus, Subtylus, Escherichia coli, Klebsiella erogenes, Proteus, Mirabilis Salmonella typhi, and Pseudomonas eruginoza Have fungal activity against

vi) 암피실린과 혼합됐을 때 에스케리키아콜리, 클렙시엘라에로게네스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이 및 스타필로코쿠스 아우레우스 러셀을 포함하는 유기체에 대한 그의 활성을 상승(相乘)시킨다.vi) when combined with ampicillin elevates its activity against organisms including Escherichia coli, Klebsiella erogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganini and Staphylococcus aureus russell .

MM 13902의 순수한 이나트륨염은 β-락타마제 억제제이고 에스케리 키아 콜리 BII의 β-락타마제에 대하여 0.01μg/ml~0.0001μg/ml 사이의 I 50(다음에 기술)을 갖고 있다.The pure disodium salt of MM 13902 is a β-lactamase inhibitor and has an I 50 (described below) between 0.01 μg / ml and 0.0001 μg / ml for β-lactamase of Escherichia coli BII.

박층 크로마토그라피 시스템내의 셀룰로오즈상에서 수행할 때 MM 13902의 이나트륨염은 대략 다음의 Rf값을 갖는다.The disodium salt of MM 13902 has approximately the following Rf value when run on cellulose in thin layer chromatography systems.

(a) n-부탄올/이소프로판올-물-7:7:6 v/v; R_f=0.72(a) n-butanol / isopropanol-water-7: 7: 6 v / v; R _f = 0.72

(b) 이소프로판올/물-7:3 v/v; R_f=0.85(b) isopropanol / water-7: 3 v / v; R _f = 0.85

(c) n-부탄올/에탄올/물-7:7:6; R_f=0.81(c) n-butanol / ethanol / water-7: 7: 6; R _f = 0.81

(d) n-프로판올/물-4:1; R_f=0.75(d) n-propanol / water-4: 1; R _f = 0.75

또 다른 관점에서 볼 때, MM 13902는 황을 함유한 항균제로서 특징이 있으며, 그의 염은 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC 31126을 배양할 때 생성되고, 수용액상태에서의 그의 이나트륨염은 본 명세서 그림 1에 표시된 바와 같이 약 305nm 및 약 225nm에서 UV흡수 극대치를 갖는다.In another aspect, MM 13902 is characterized as an antimicrobial agent containing sulfur, its salts are produced when culturing Streptomyces olibaceus ATCC 31126, its disodium salt in aqueous solution is shown in the figure. As indicated in Figure 1, it has a UV absorption maximum at about 305 nm and about 225 nm.

바꾸어 말하면 MM 13902는 항균제로서 특징지워지며, 그의 이나트륨염 형태는 그림 2에 표시된 바와같이 새로 제조한 0.4% w/wKBr 디스크내에서 적외선 흡수 스펙트럼을 가지며 또한 그림 3에 표시된 바와 같이 새로 제조한 D₂O 용액 내에서 n.m.r스펙트럼을 가진다.In other words, MM 13902 is characterized as an antimicrobial agent, its disodium salt form has an infrared absorption spectrum in freshly prepared 0.4% w / wKBr discs as shown in Figure 2 and also freshly prepared D as shown in Figure 3. _Have nmr spectrum in 2O solution.

MM 13902물질은 염이 아닌 산형태로는 불안정한 경향이 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 면은 MM 13902의 염을 제공한다. 적당한 MM 13902의 염들은 이염기염들이다.MM 13902 material tends to be unstable in acid form, not salt. Thus, a preferred aspect of the present invention provides a salt of MM 13902. Suitable salts of MM 13902 are dibasic salts.

가장 적당한 이들 염들은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 통상적 치환 암모늄 이온 등과 같은 제약적으로 허용되는 이온들로 형성된 것들이다.Most suitable these salts are those formed with pharmaceutically acceptable ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum, conventional substituted ammonium ions and the like.

특별히 적당한 염들은 나트륨 또는 칼륨염들과 같은 알카리금속염들로서, 그 예로는 이나트륨 또는 이칼늄염들이 있다.Particularly suitable salts are alkali metal salts such as sodium or potassium salts, for example disodium or dicalium salts.

본 발명에 의해 제공되는 적당한 MM 13902 및 그의 염들은 적어도 50% 순수한 것이고, 보다 적당하게는 최소 70% 순수한 것, 바람직하게는 80% 순수(예로 90~100% 순수)한 것이다.Suitable MM 13902 and its salts provided by the present invention are at least 50% pure, more suitably at least 70% pure, preferably 80% pure (eg 90-100% pure).

본 발명의 또 다른 면은 전기한 MM 13902 또는 그의 염과 제약적으로 허용되는 담체로 구성된 제약 조성물을 제공한다.Another aspect of the invention provides a pharmaceutical composition consisting of the aforementioned MM 13902 or a salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 가장 바람직한 조성물은 MM 13902의 나트륨 또는 칼륨염(예로, MM 13902의 이나트륨 또는 이칼륨염)을 함유한다.Most preferred compositions of the present invention contain sodium or potassium salts of MM 13902 (eg, disodium or dipotassium salts of MM 13902).

상기 조성물들은 경구적, 국소적, 비경구적 용도에 적합한 형태로 있을 수 있다.The compositions may be in a form suitable for oral, topical and parenteral use.

실예로 정제, 캡슐, 크림, 시럽, 재생분말, 주사 또는 주입에 적합한 무균형태들이 사용된다.For example, aseptic forms suitable for tablets, capsules, creams, syrups, regenerated powders, injections or infusions are used.

상기 조성물들은 페니실린 및 페팔로스포린 같은 항생제 제조에 숙련된 자들에게는 잘 알려진 방법인 통상적 제약기술에 따라 희석제, 결합제, 색소, 향료, 방부제, 붕괴제 등과 같은 통상적인 제약용 물질들을 함유한다.The compositions contain conventional pharmaceutical substances such as diluents, binders, pigments, flavorings, preservatives, disintegrants and the like according to conventional pharmaceutical techniques which are well known to those skilled in the manufacture of antibiotics such as penicillin and pepalosporin.

MM 13902 또는 그의 염들은 본 발명의 조성물내에서 독단적인 치료제로 존재하거나 또는 β-락탐 항생제와 함께 존재한다. 적합한 β-락탐 항생제로는 β-락타마제에 잠수성이 있는 것으로 알려진 것 및 β-락타마제 약간의 고유저항을 갖고 있는 것들이 포함된다.MM 13902 or salts thereof are present in the compositions of the present invention as dogmatic therapeutic agents or in combination with β-lactam antibiotics. Suitable β-lactam antibiotics include those known to be submersible in β-lactamase and those with some resistivity of β-lactamase.

그러나 β-락탐 항생제로는 암피실린, 아목실린, 벤질페니실린, 페녹시메틸, 페니실린, 프로피실릴, 세팔로리딘, 세폭시틴, 세팔로틴, 세팔렉신, 카베니실린, 타카실린, 생체내에서 가수분해될 수 있는 에스테르(카베니실린 또는 타카실린의 페닐, 콜릴, 인다닐 에스테르; 암피실린, 벤질페니실린, 아목시실린, 세팔로리딘, 세팔로글리신 등의 아세톡시메틸, 피발로일옥시메틸 또는 프탈리딜 에스테르 등)들이 포함된다.However, β-lactam antibiotics include ampicillin, amocillin, benzylphenicillin, phenoxymethyl, penicillin, propicylyl, cephaloridine, cefacithin, cephalotin, cephalexin, carbenicillin, tacacillin, in vivo Degradable esters (phenyl, cholyl, indanyl esters of carbenicillin or tacacillin; acetoxymethyl, pivaloyloxymethyl or phthalidyl, such as ampicillin, benzylphenicillin, amoxicillin, cephaloridine, cephaloglycine Esters and the like).

β-락탐 항생제에 대한 MM 13902 또는 그의 염들의 비는 통상적으로 10:1~1:10 사이이고 실제로 3:1~1:3이다.The ratio of MM 13902 or salts thereof to β-lactam antibiotics is typically between 10: 1 and 1:10 and indeed 3: 1 to 1: 3.

통상의 단위 복용형태내에 존재하는 항생제의 총량은 통상적으로 50~1,500mg 사이이고 보통 100~1,000mg 사이이다.The total amount of antibiotic present in conventional unit dosage forms is typically between 50 and 1500 mg and usually between 100 and 1,000 mg.

본 발명에 의한 바람직한 단위복용 조성물은 요도, 호흡기, 연부 조직 등의 질환 치료시에 1일 1회 이상(실예로 1일 2~4회) 투여된다.Preferred unit dosage compositions according to the present invention are administered at least once a day (for example, 2 to 4 times a day) when treating diseases such as urethra, respiratory organs, and soft tissues.

따라서 조성물들은 기관지염, 임질중이염, 유선염(乳腺炎) 등과 같은 질환치료에 사용된다.Therefore, the compositions are used to treat diseases such as bronchitis, gonorrhea otitis, mastitis and the like.

본 발명의 일면은 MM 13902 또는 그의 염의 제조방법을 제공하는 바, 그 방법은 다음에 기술한 MM 4550(착화합물) 용액을 MM 13902 또는 그의염 용액만 함유하는 부분 및 다른 부분으로 크로마토그라피적으로 분리하고 그 용액으로부터 MM 13902 또는 그의 염을 단리시키는 것으로 되 있다.One aspect of the present invention provides a method for preparing MM 13902 or a salt thereof, which method chromatographically separates the MM 4550 (complex) solution described below into a portion containing only MM 13902 or a salt solution thereof and another portion thereof. To isolate MM 13902 or a salt thereof from the solution.

"MM 13902 또는 그의 염용액만 함유하는 부분"이란 그 용액내에 존재하는 항생물질은 MM 13902 또는 그의 염임을 뜻하거나 또는 다른 항생물질이 존재한다면 그것은 MM 13902 또는 그의 염보다 소량 존재함을 뜻한다. 보다 적합한 MM 13902 또는 그의 염은 상기 부분에 존재하는 항생물질이 70%인 것이고, 가장 적합하게는 90%, 바람직하게는 90~100%인 것이다. 주로 MM 13902 또는 그의 염용액으로 되있는 부분을 결정하는 유용한 방법은 각 시료의 UV흡수 스펙트럼을 조사하는 것임을 본 출원인은 발견했다. 제 1 도에 유사한 UV흡수 스펙트럼을 나타내는 상기 부분들은 후에 기술할 MM 4550과 같은 다른 항생물질이 전혀 없는 MM 13902 또는 그의 염을 함유한다. 일반적으로 약 305nm에서 뚜렷한 UV흡수 극대치를 보여주는 그런 부분들은 원하는 순도를 갖고 있다."MM 13902 or a portion containing only its salt solution" means that the antibiotic present in the solution is MM 13902 or its salt or, if other antibiotics are present, that is present in smaller amounts than MM 13902 or its salt. A more suitable MM 13902 or salt thereof is 70% of the antibiotic present in this part, most suitably 90%, preferably 90-100%. Applicants have found that a useful method of determining the portion consisting primarily of MM 13902 or its salt solution is to examine the UV absorption spectra of each sample. The portions showing similar UV absorption spectra in FIG. 1 contain MM 13902 or salts thereof which are free of other antibiotics such as MM 4550, which will be described later. In general, those parts that show a distinct UV absorption maximum at about 305 nm have the desired purity.

보통 상기 제법은 MM 13902를 이 염기염으로 분리하는데 사용된다. 만일 MM 13902의 일염기염 또는 유리산 MM 13902가 필요하다면, 일반적으로 그들이 후에 기술할 MM 4550(착화합물)과 같은 혼합물로 부터 분리하기에 충분히 안정하지 못하므로 MM 13902의 이 염기성을 산성화하여 제조한다.Usually this preparation is used to separate MM 13902 into this base salt. If a monobasic salt of MM 13902 or free acid MM 13902 is required, this basicity of MM 13902 is prepared by acidifying as they are generally not stable enough to separate from mixtures such as MM 4550 (complex), which will be described later.

이들 일 염기염 및 유리산은 그들의 낮은 안정성 때문에 쉽게 얻을 수 없다.These monobasic salts and free acids are not easily obtained because of their low stability.

전기한 바에 따라서, MM 13902의 크로마토그라피 분리는 이나트륨염과 같은 MM 13902의 염을 사용하여 가장 잘 수행됨을 확신한다.As stated above, it is assured that chromatographic separation of MM 13902 is best performed using salts of MM 13902 such as disodium salt.

MM 13902의 염들은 크게 친유성인 용제내에서 보다 수용성용 체계 내에서 보다 안정하므로 본 발명에서 사용된 크로마토그라피 정제시에는 수용성용제제를 사용하는 것이 바람직하다.Since the salts of MM 13902 are more stable in a water-soluble system than in a highly lipophilic solvent, it is preferable to use a water-soluble solvent in the chromatographic purification used in the present invention.

본 명세서에서 대략 중성으로 완충된 전해질 수용액이 염기성 이온 교환수지와 같은 극성 지지물과 함께 사용하는데 적합함이 입증됐다. 따라서 인산염 완충액과 같은 통상적 완충액으로 약 pH7로 완충된 염화나트륨 수용액은 3급 아미노기 또는 4급 암모늄기를 함유하는 지지물질과 함께 사용된다. 본 출원인은 염기성이온교환 셀룰로오즈 및 염기성 이온 가교 텍스트란들이 적합한 지지물질들이고 QAE 세파덱스 A25(등록된 상표)는 용제계가 pH7 인산염 완충액내의 0.7m 염화나트륨으로 되어 있을때 특히 아주 적합한 지지물질이라는 것을 발견했다.It has been demonstrated herein that an aqueous solution of approximately neutral buffered electrolyte is suitable for use with polar supports such as basic ion exchange resins. Thus, aqueous sodium chloride buffered to about pH7 with conventional buffers such as phosphate buffers are used with supporting materials containing tertiary amino or quaternary ammonium groups. Applicants have found that the basic ion exchange cellulose and basic ion crosslinked text columns are suitable support materials and QAE Sephadex A25 (registered trademark) is a particularly suitable support material when the solvent system is 0.7 m sodium chloride in pH7 phosphate buffer.

바꾸어 말하면, 본 명세서에서 물 및 물과 혼화성인 유기용제(저급알칸올 같은)의 혼합물로 되있는 용제계가 실리카겔 및 셀룰로오즈 같은 불활성 지지물질과 함께 사용하는데 적합함이 입증됐다.In other words, a solvent system consisting of a mixture of water and organic solvents (such as lower alkanols) that are miscible with water has been demonstrated herein for use with inert support materials such as silica gel and cellulose.

셀룰로오즈와 함께 사용하는데 특히 적합한 용제계는 물 및 이소프로판올, 특히 7:3의 이소프로판올 물 혼합물이다.Particularly suitable solvent systems for use with cellulose are water and isopropanol, especially isopropanol water mixtures of 7: 3.

그러나 이온 교환수지를 사용한 상기 공정의 생물들은 때때로 대단히 높은 비율로 염화나트륨을 함유하는데 그것이 모여진 용액을 탈염시키는데 기여하기 때문이다.However, organisms of the process using ion exchange resins sometimes contain sodium chloride in very high proportions because it contributes to the desalination of the collected solution.

탈염은 용액을 친유성물질이 들어있는 컬럼으로 흘러내려 거기에서 MM 13902는 흡착되고 염화나트륨은 흡착되지 않으므로 수행한다. 적합한 컬럼물질로는 엠버라이트 XAD 4와 같은 폴리스티렌이 있다.Desalting is performed by flowing the solution down to a column containing lipophilic material, where MM 13902 is adsorbed and sodium chloride is not adsorbed. Suitable column materials include polystyrene, such as Amberlite XAD 4.

다른 방법으로는 세파덱스 G25와 같은 가교덱스트론 및 비오겔 P₂같은 폴리아크릴아미드겔 같은 것들을 사용하여 겔 여과한다("엠버라이트", "세파덱스", "비오겔"들은 상표). 항생제는 물, 수용성 메탄올 등을 사용하여 컬럼으로부터 용출된다.Alternatively, gel filtration using crosslinked dextrons such as Sephadex G25 and polyacrylamide gels such as Biogel P ₂ ("Amberite", "Sefadex", "Biogels" are trademarks). Antibiotics are eluted from the column using water, aqueous methanol, and the like.

원하는 용액이 상기 제법에 의해 얻어질 때, MM 13902의 염기성염은 온화한 조건으로 용제를 제거시켜 고체형태로 얻는다.When the desired solution is obtained by the above preparation, the basic salt of MM 13902 is obtained in solid form by removing the solvent under mild conditions.

위와 같은 고체물질을 얻는 유용한 방법은 MM 13902를 함유하는 모여진 용액을 감압하에 증발시키고 동결건조시키는 것임을 발견했다.A useful way of obtaining such solid material was found to evaporate and lyophilize the collected solution containing MM 13902 under reduced pressure.

필요에 따라 상기 제법은 두개 이상의 단계로 수행된다. 실예로 MM 4550(착화합물) 용액은 다른 항균제가 그의 중량만큼 오염된 MM 13902 또는 그의 염으로 되 있는 부분으로 분리되며, 그 부분은 동결 건조되어 MM 13902 또는 그의 염을 실예로 약 50~60% 함유하는 물질로 되며, 그후 이물질을 크로마토그라피하면 MM 13902 또는 그의 염을 실예로 90~100% 함유하는 물질로 된다.If necessary, the preparation is carried out in two or more steps. For example, the MM 4550 (complexed) solution is separated into portions consisting of MM 13902 or salts thereof, where other antimicrobials are contaminated by their weight, and the portions are lyophilized to contain, for example, about 50-60% of MM 13902 or salts thereof. Chromatography of the foreign substance is then performed to obtain a substance containing 90 to 100% of MM 13902 or a salt thereof.

본 명세서에서 "MM 4550(착화합물)"은 MM 4550(후에 기술)의 염, MM 13902의 염 및 기타 물질들을 여러 비율로 함유하는 불순물질을 칭한다.As used herein, "MM 4550 (complex)" refers to an impurity that contains salts of MM 4550 (described later), salts of MM 13902 and other materials in various proportions.

MM 4550(착화합물)은 MM 13902의 특수한 UV스펙트럼을 갖고 있지 않다. MM 4550(착화합물)의 I 50(후에 기술)은 보통 0.0004μg/ml 이하가 아니다.MM 4550 (complexing compound) does not have the special UV spectrum of MM 13902. I 50 (described later) of MM 4550 (complex) is usually no more than 0.0004 μg / ml.

MM 4550(착화합물)에 존재하는 MM 4550의 염과 MM 13902의 염과의 비율은 크게 변화된다고 믿어지며 사용된 유기체 균주 및/또는 사용된 정확한 분리기술 등의 요인들에 따라 변화된다고 생각되는데 보통 MM 13902 보다 MM 4550을 더 많이 함유함이 발견됐다.It is believed that the ratio of the salts of MM 4550 to the salts of MM 13902 in MM 4550 (complex) varies greatly depending on factors such as the organism strain used and / or the exact separation technique used. It was found to contain more MM 4550 than 13902.

MM 4550(착화합물)의 제법은 다음의 설명에 관계된 부분에 기술돼 있다.The preparation of MM 4550 (complex) is described in the relevant section of the following description.

본 명세서에서 "MM 4550"은 강한 β-락타마제 억제제인 완전히 순수한 화합물을 칭하며 그것은 또한 어느 정도의 항균활성을 갖는다.As used herein, "MM 4550" refers to a completely pure compound that is a strong β-lactamase inhibitor and it also has some antibacterial activity.

MM 4550의 특성은 다음의 "설명"에 관계된 부분에 기술되 있다. 또 다른 관점에서 본 발명은 MM 13902 및 그의염의 제조방법을 제공하는바 그 공정은 MM 13902를 생성하는 스트렙토마이세스 균주를 배양하고 그 후 배양액으로 부터 MM 13902 및 그의 염을 회수시키는 것으로 되어 있다.The characteristics of the MM 4550 are described in the section related to the following description. In another aspect, the present invention provides a method for preparing MM 13902 and its salt, wherein the process comprises culturing the Streptomyces strain producing MM 13902 and then recovering MM 13902 and its salt from the culture.

이 공정에서 MM 13902 생성 균주는 스트렙토마이세스 올리바세우스의 균주이고 다음에 기술한 유기체와 관계있다.The MM 13902 producing strain in this process is a strain of Streptomyces olivasus and is related to the organisms described below.

가장 적합한 사용균주는 ATCC 21379, 21380, 21381, 21382, 31126 또는 그들의 돌연변이체와 같은 스트렙토마이세스 올리바세우스의 균주이다.Most suitable strains of use are strains of Streptomyces olivasus such as ATCC 21379, 21380, 21381, 21382, 31126 or their mutants.

본 공정에서 사용하기에 특히 적합한 유기체는 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC 311126이다.Particularly suitable organisms for use in this process are Streptomyces olibaceus ATCC 311126.

본 명세서에서 사용될 때 "배양"이란 말은 탄소, 질소, 황 및 무기염의 동화원(同化源) 존재하에서 유기체를 계획적으로 유기성장(有氣成長)시킴을 뜻한다. 고체 또는 반고체 상태의 배양 매질 또는 양분이 용해 또는 현탁되있는 액체배양기내에서 상기와 같은 유기성장이 일어난다.As used herein, the term "culture" refers to the intentional organic growth of an organism in the presence of an assimilation source of carbon, nitrogen, sulfur and inorganic salts. Such organic growth takes place in a liquid incubator in which the culture medium or nutrient in a solid or semi-solid state is dissolved or suspended.

배양은 유기표면(有氣表面) 상에서 또는 심부배양(深部培養)에 의해 일어난다.Cultivation takes place on the organic surface or by deep culture.

본 명세서에서 본 출원인은 효모 추출물, 대두분(大豆粉) 등과 같은 복합양분을 함유하고 있는 배양기가 특히 적합함을 발견했다. 또한 코발트이온, 활산이온, 탄산칼륨의 첨가가 이로움도 발견했다.Applicants have found particularly suitable for incubators containing complex nutrients such as yeast extract, soybean meal and the like. It also found that the addition of cobalt ions, active ions and potassium carbonate was beneficial.

그 외에 본 출원인은 28±2℃의 온도에서 배양시킴이 유효한 항생제 수율을 나타내고, 육즙(肉汁)을 수확하는 적당한 시간은 발효를 시작한지 2~3일임도 발견했다.In addition, the Applicant also found that incubation at a temperature of 28 ± 2 ° C. yielded an effective antibiotic yield, and that the proper time to harvest the gravy was 2-3 days from the start of the fermentation.

본 명세서에서 사용될 때 "돌연변이체"란 말은 자연적으로 발생하거나 또는 작용제를 계획적으로 가하는지의 여부에 따른 외부작용제의 효과로 발생하는 돌연변이 유기체를 뜻한다.As used herein, the term “mutant” refers to a mutant organism that occurs naturally or due to the effect of an external agent, depending on whether the agent is intentionally added.

돌연변이 유기체를 생성시키는 적당한 방법은, 1973년 Vienna에서 있었던 국제원자 에너지 위원회의 심포지움 회보 241P에 기술된 "산업용 마이크로유기체를 위한 방사선 및 방사선 동위원소"에서 H.L. Adler의 마이크로 유기체 개발기술에 서술된 것들이 포함되며 이들은 다음을 포함한다.Suitable methods for generating mutant organisms are described in H.L. in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms" described in Symposium Bulletin 241P of the International Atomic Energy Commission, Vienna, 1973. Included are those described in Adler's Microorganism Development Technologies, which include:

i) 전리선(電離線)(X선 및 γ선), UV선, UV선과 광감작용제(8-메톡시 솔라렌 등), 아질산, 하이드록실아민, 피리미딘염기 유사체(5-브로모 유라실 등), 아크리딘, 아크릴화제(높개스, 에틸-메탄설포네이트), 과산화수소, 페놀, 포름알데히드, 염 및i) ionizing rays (X rays and γ rays), UV rays, UV rays and photosensitizers (such as 8-methoxy solarene), nitrous acid, hydroxylamine, pyrimidine base analogues (5-bromo uracil) Etc.), acridine, acrylate (high gas, ethyl-methanesulfonate), hydrogen peroxide, phenol, formaldehyde, salts and

ii) 자발적 돌연변이체를 위한 재결합, 변태, 인공적 항원변환, 용균소화(溶菌素化), 용원(溶原) 전환 및 선택적 기술과 같은 유전학적 기술.ii) Genetic techniques such as recombination, transformation, artificial antigen transformation, lysis, lysis, and selective techniques for spontaneous mutants.

본 출원인은 돌연변이 촉진제의 사용이 원하는 항생제를 더 많이 생성시키는 능력을 가진 유기체를 생성시킴을 발견했다. 실예로 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC 21379의 배양액을 조사(照射)시킨 다음 KAG시험에서 광역(廣域)의 활성을 나타내는 생성된 균주를 분리시키면 스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC 31126이 분리되며 이것은 본 발명에서 사용하기에 바람직한 균주이다.Applicants have found that the use of a mutation promoter produces an organism having the ability to produce more of the desired antibiotic. For example, if the culture medium of Streptomyces olibaceus ATCC 21379 was irradiated, and the resulting strain showing a wide range of activity in the KAG test was isolated, the Streptomyces olibaceus ATCC 31126 was isolated. Preferred strains for use in the invention.

ATCC 31126은 또한 네덜란드에서는 CBS 155.75로 알려졌다. 일반적으로 원하는 항생제를 얻는데 사용되는 모든 분리 및 정제공정은 상승되지 않은 온도, 예로 20℃ 이하(보다 적당하게는 12℃ 이하)에서 수행되어야 한다.ATCC 31126 is also known as CBS 155.75 in the Netherlands. In general, all separation and purification processes used to obtain the desired antibiotic should be performed at an un elevated temperature, such as 20 ° C. or lower (more suitably 12 ° C. or lower).

원하는 생성물은 보통 배양물 여액으로 부터 우세하게 얻어지므로 분리공정에서 바람직한 초기 단계는 발효로 부터 고체물질을 제거하는 것이다(예로 여과해서).Since the desired product is usually obtained predominantly from the culture filtrate, the preferred initial step in the separation process is to remove solids from the fermentation (eg by filtration).

MM 13902 또는 그의 염의 불순한 제조는 정화된 배양을 여액으로 부터 이들을 활성탄소 등과 같은 활성물질상에 흡수시킨 다음 아세톤 수용액과 같은 용제를 사용하여 활성물질로 부터 원하는 물질을 용출시켜 얻는다. 보통 이 공정은 MM 13902의 이염기염으로 수행한다.Impure preparation of MM 13902 or its salts is obtained by absorbing the purified culture from the filtrate onto an active substance such as activated carbon and then eluting the desired substance from the active substance using a solvent such as an acetone aqueous solution. Usually this process is carried out with a dibasic salt of MM 13902.

다른 방법으로는 MM 13902 또는 그의 염의 불순한 제품은 잔유성 암모늄염 및 물과 섞이지 않는 용제를 사용한 추출에 의하여 배양물 여액으로 부터 얻어진다. 이것은 때때로 상기한 공정보다 더욱 효과적이다(MM 13902는 감압하에 유기용제를 증발시켜 치환된 암모늄염으로 얻는다).Alternatively, an impure product of MM 13902 or a salt thereof is obtained from the culture filtrate by extraction with a solvent containing a residual ammonium salt and a solvent incompatible with water. This is sometimes more effective than the process described above (MM 13902 is obtained as a substituted ammonium salt by evaporating the organic solvent under reduced pressure).

바람직하게는 MM 13902로 치환된 암모늄염의 최소 용액은 요오드화나트륨과 같은 요오드화 알카리금용액을 사용하여 수상(水相) 내로 다시 추출시킨다.Preferably, the minimum solution of ammonium salt substituted with MM 13902 is extracted back into the aqueous phase using an alkaline iodide solution such as sodium iodide.

이 마지막 공정은 일반적으로 MM 13902의 불순한 이 염기염 수용액을 제조하게 된다.This last process generally produces an impure aqueous base salt solution of MM 13902.

상기한 MM 13902고 또는 그의 임의 불순한 형태는 보통 다음에 기술한 크로마토그라피 공정을 거쳐 유효한 순도의 물질을 생성한다.The above described MM 13902 or any impure form thereof usually undergoes the chromatographic process described below to produce a material of effective purity.

다음의 설명은 항균화합물의 분리에 유용한 일반지식을 설명하고 다음 실시예들은 본 발명의 여러면을 예시하고 있다.The following description illustrates general knowledge useful for the isolation of antimicrobial compounds and the following examples illustrate several aspects of the invention.

[설 명 1][Comment 1]

[I 50 결정][I 50 decision]

I 50 값은 β-락타마제를 조절하는 R인지를 함유하는 유기체인 에스케리키아 콜리 BII의 β-락타마제 효소에 의해 암피실린의 가수분해를 50% 억제하는데 필요한 물질의 양이다. 이 β-락타마제는 Richmond and Sykes[Adv. in Microbiol. physiol. 9 31(1973)]에 의해 Ⅲa효소 형태로 분류된다.The I 50 value is the amount of substance required to inhibit 50% hydrolysis of ampicillin by the β-lactamase enzyme of Escherichia coli BII, an organism containing R cognition that regulates β-lactamase. This β-lactamase is described in Richmond and Sykes [Adv. in Microbiol. physiol. 9 31 (1973)].

암피실린이 그의 페니실로산으로 β-락타마제 가수분해되는 속도는 전분-요드 시험에 의해 측정할 수 있는데 이때 우리는 페니실로산의 생성속도를 전분-요드 착화합물의 탈색에 의해 계산한다. 이 방법 및 β-락타마제의 제조는 Cole M., Elson S. 및 Fullbrook P.D.에 의한 논문(Biochemical Journal 1972, 127, 195~308)에 기술되 있다.The rate at which β-lactamase hydrolyzes to ampicillin with its penicillic acid can be determined by starch-iod testing, where we calculate the rate of penicillic acid production by decolorization of the starch-iod complex. This method and the preparation of β-lactamase are described in Cole M., Elson S. and Fullbrook P.D. (Biochemical Journal 1972, 127, 195-308).

상기 방법을 약간 변형시켜 암피실린 지질에 가하기전 37℃에서 15분동안 효소와 함께 미리 배양시킨 억제제시료에 사용한다. 그 과정은 다음과 같다.The method is slightly modified and used in inhibitor samples pre-incubated with enzymes at 37 ° C. for 15 minutes prior to addition to ampicillin lipids. The process is as follows.

[시 료][sample]

완충액 : 0.05M pH7 인산칼륨 완충액.Buffer: 0.05 M pH7 potassium phosphate buffer.

전분/요드용액 : Novick에 의해 Biochemical J.(1962) 83, 236에 기술된 대로 제조.Starch / iodine solution: Prepared by Novick as described in Biochemical J. (1962) 83, 236.

지 질 : 암피실린 40㎍/ml 완충액.Lipid: Ampicillin 40 μg / ml buffer.

β-락타마제효소 : Cole 등에 의해 Biochem. J.(1972) 127, 295에 기술된 대로 E. Coli Bll로부터 제조. 완충액내에서의 효소 희석제조는 방해되지 않은 반응시에 약 0.3 광학밀도단위/100 secs가 되게한다.β-lactamase enzyme: by Biochem. Prepared from E. Coli Bll as described in J. (1972) 127, 295. Enzyme dilution in the buffer is about 0.3 optical density units / 100 secs for undisturbed reactions.

E. Coli의 다른 β-락타마제 생정균주는 특히 R인자를 갖고 있는 것들에 사용된다(실예로 R TEM에서).Other β-lactamase live strains of E. Coli are used particularly for those with the R factor (eg in R TEM).

[조 건][Condition]

반응은 SP 800 파이 유니켐 스펙트로포토메타로 37℃에서 1cm 큐벳트(cuvette)로 실시한다.The reaction is carried out in 1 cm cuvette at 37 ° C. with SP 800 PI Unichem Spectrophotometer.

첫번째 큐벳트는 기준 반응에 사용되며 억제제를 함유하지 않는다. 두번째, 세번째 및 네번째 큐벳트는 억제제를 여러가지 농도로 희석시켜 사용한다.The first cuvette is used for the reference reaction and contains no inhibitor. The second, third and fourth cuvettes are used by diluting the inhibitor to various concentrations.

반응은 590nm에서 광학밀도 변화를 기록하고 3~6분의 시간동안 100초당의 광학밀도변화로서 반응속도를 측정하면서 수행한다.The reaction is carried out by recording the optical density change at 590 nm and measuring the reaction rate as the optical density change per 100 seconds for 3-6 minutes.

반응속도가 억제제가 없는 기준치의 50%가 될 때까지 억제제 시료를 희석시킨다.Dilute the inhibitor sample until the reaction rate is 50% of the baseline without the inhibitor.

[설 명 2][Comment 2]

[KAG 시험][KAG Exam]

KAG 시험은 발효육즙(肉汁) 내에 있는 또는 분리단계에 있는 β-락타마제 억제제 존재를 결정하는 방법이다. 45℃ 하의 용융된 영양아가를 클렙시엘라 에로게네스의 적당한 β-락타마제 생성 균주로 잡종시킨 다음 무균의 페니실린 G용액 충분량과 혼합하면 아가내의 페니실린 G농도는 6㎍/ml가 된다. 그 후 아가를 페트리(petri) 접시에 붓고 고화시킨 다음 무균의 금속 절단기를 사용하여 아가층의 등(等) 간격의 원통형 웰로 자른다. 시험할 용액을 웰(well)에 주입한 다음 접시를 27~37℃ 사이의 일정온도로 배양시킨다.The KAG test is a method of determining the presence of β-lactamase inhibitors in fermented broth or at a stage of separation. Melted nutrients at 45 ° C. were hybridized with a suitable β-lactamase producing strain of Klebsiella erogenes, and then mixed with a sufficient amount of sterile penicillin G solution to give 6 μg / ml of penicillin G in the agar. The agar is then poured into a petri dish and solidified and then cut into cylindrical wells of equal spacing of the agar layer using a sterile metal cutter. Inject the solution to be tested into a well and then incubate the dish at a constant temperature between 27 and 37 ° C.

배양기간중에 시험용액 내의 억제제는 웰로 부터 아가내로 확산되어 클렙시엘라 세포에 의해 생성된 β-락타마제 활성을 억제한다. 그러므로 페니실린 G는 β-락타마제에 의한 파괴로 부터 보호되고 충분농도로 존재하므로 클렙시엘라의 성장을 막는다. 억제제가 충분 농도로 확산되지 않은 아가부분에서는 페니실린 G가 β-락타마제에 의해 파괴되어 클렙시엘라의 큰 성장이 일어난다.During the incubation period, the inhibitor in the test solution diffuses from the well into the agar to inhibit β-lactamase activity produced by Klebsiella cells. Therefore, penicillin G is protected from destruction by β-lactamase and is present in sufficient concentration, preventing the growth of Klebsiella. In the agar portion where the inhibitor did not diffuse to sufficient concentration, penicillin G was destroyed by β-lactamase resulting in large growth of Klebsiella.

클렙시엘라 성장이 억제된 명확한 원형지역이 억제제를 함유하고 있는 웰주위에 형성되고 각 지역은 시험할 용액내의 억제제 농도에 따른다. 시험용액의 효능(임의의 단위/ml) 영역 직경에 대한 억제제 농도의 표준 대수라인을 참조하여 얻는다.A clear circular area where Klebsiella growth was inhibited was formed around the well containing the inhibitor and each area was dependent on the inhibitor concentration in the solution to be tested. Obtained by reference to standard algebraic lines of inhibitor concentration relative to efficacy (arbitrary units / ml) area diameter of test solution.

이 시험 시스템은 또한 바이오오로그라피에도 사용된다.This test system is also used in biographography.

[설 명 3][Comment 3]

[MM 4550(착화합물)의 제조]Preparation of MM 4550 (Compound Compound)

스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC 21379를 Roux병내의 교체 아가사면(斜面) 상에서 28℃하에 7일간 성시킨다. 이 아가 배양기는 다음 조성을 갖고 있다.Streptomyces Olivaseus ATCC 21379 was cultivated at 28 ° C. for 7 days on a replacement apoptosis in Roux disease. This agar incubator has the following composition.

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

효모 추출물 10.0Yeast Extract 10.0

글루코오즈 단수화물 10.0Glucose Monohydrate 10.0

한 천 15.0One thousand 15.0

수도물 1ℓ로 되게 한다.1 liter of tap water.

["효모추출물은 영국 버톤온트렌트시 웰링톤가 P.O. Box18 보브릴 후드 인그리디엔트에서 공급하는 이덱스"이고, 한천은 영국 S.E.I 런던시 사우스워크 브리지가 옥스포드 주식회사에서 공급하는 것이다.]["The yeast extract is an edex supplied by P.O. Box18 Bobbril Hood Ingridient, Wellington, UK", and the agar is supplied by Oxford Corporation, S.E.I London City Southwark Bridge.]

배양기는 소독하기전에 pH 6.8로 맞춘다.The incubator is adjusted to pH 6.8 before sterilization.

그 후 0.02% Tween 80[등록상표; Tween 80은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레이트]을 함유하는 무균의 탈이온수 50ml를 Roux병의 배양액에 가하고 포자(胞子)는 흔들어서 현탁시킨다. 이 포자 현탁액을 접종물로서 100ℓ 용량의 스테인레스철 발효기내에 들어 있는 무균의 잡종 배양기 75ℓ에 가한다.Then 0.02% Tween 80 [registered trademark; Tween 80 adds 50 ml of sterile deionized water containing polyoxyethylene sorbitan mono-oleate to the culture solution of Roux bottle, and spores are suspended by shaking. This spore suspension is added as an inoculum to 75 liters of a sterile hybrid incubator in a 100 liter stainless steel fermenter.

잡종 배양기의 조성은 다음과 같다 :The composition of the hybrid incubator is as follows:

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

대두분(大豆粉) 10.0Soybean meal 10.0

글루코오스 단수화물 20.0Glucose Monohydrate 20.0

수도물 1ℓ로 되게 한다.1 liter of tap water.

["대두분"은 멘체스타시 올드트라포드에 있는 브리티쉬 아카디주식회사, 에서 공급하는 아카디 50이다]["Soybean flour" is the Arcadi 50 supplied by British Arcadian Corporation, Old Trafford, Menchester City]

포말을 조절하기 위해서는 대두유(大豆油) 내의 10% v/v Pluronic L 81(등록된 상표) 50ml를 살균하기 전에 발효 배양기에 가한다. Pluronic L81은 영국 W.3. 런던시 베일 231번지 자콤센반덴베르그주식회사에서 공급하는 것이고 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌옥사이드의 블록(block) 중합체이다.]To control the foam, 50 ml of 10% v / v Pluronic L 81 (registered trademark) in soybean oil is added to the fermentation incubator before sterilization. Pluronic L81 is the UK W.3. It is a block polymer of ethylene oxide and propylene oxide, supplied by Zacomsen-Bandenberg Corporation, 231, Vale, London.]

배양기(培養基)는 발효기내에서 120℃로 20분동안 증기 살균한다. 잡종 배양액은 8.5인치 직경의 날개 모양판의 교반기를 사용하여 340r.p.m으로 교반한 다음 개구 스파거(sparger)로 150ℓ/분의 무균공기를 공급한다. 배양용기는 조절판으로 고정시킨다. 온도를 28℃로 조정하고 이 온도로 45시간동안 배양시킨 다음 이 잡종 배양액 7.5ℓ를 접종물로서 300ℓ용량의 스테인레스철 발효기 내에 들어있는 150ℓ의 무균발효 배양기에 가한다.The incubator is steam sterilized at 120 ° C. for 20 minutes in the fermenter. Hybrid cultures are stirred at 340 r.p.m using an 8.5-inch diametric stirrer and then fed 150 liters / minute of sterile air to an open sparger. The culture vessel is fixed with a control panel. The temperature is adjusted to 28 ° C. and incubated for 45 hours at this temperature, and then 7.5 l of this hybrid culture is added to the 150 l aseptic fermentation incubator contained in a 300 l stainless steel fermenter as inoculum.

발효 배양기는 다음의 조성을 갖고 있다.The fermentation incubator has the following composition.

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

대두분(Arkasoy 50) 10.0Soy flour (Arkasoy 50) 10.0

글루코오즈 단수화물 20.0Glucose Monohydrate 20.0

백악(百堊)(침전된 탄산칼슘) 0.2Chalk (precipitated calcium carbonate) 0.2

염화코발트(CoCl₂, 6H₂O) 0.001Cobalt Chloride (CoCl ₂ , 6H ₂ O) 0.001

수도물 1ℓ로 되게 한다.1 liter of tap water.

포말을 방지하기 위해서 대두유내의 10% Pluronic L81 300ml를 가한다.To prevent foaming, 300 ml of 10% Pluronic L81 in soybean oil is added.

발효는 48시간 후에 수확하고 원심분리하여 정화한다.Fermentations are harvested after 48 hours and clarified by centrifugation.

정화된 양조물은 1/100,000로 희석할 때 효소시험시 50% 억제치를 나타낸다. 정화된 양조물 100ℓ를 식초산염 형태로 있는 화트만 DE32(등록된 상표) 12Kg(습윤중량)과 함께 교반시킨다[화트만 DE32는 영국 E.C.4 런던시 뉴브리지가 14번지 H. 리브엔젤 엔드 컴페니에서 공급하며, 이 물질은 디에틸아미노 에틸기로 치환된 마이크로 결정형의 셀룰로오즈이다.]Purified brews show 50% inhibition in enzyme testing when diluted to 1 / 100,000. 100 liters of clarified brew is stirred with 12 Kg (wet weight) of Whitman DE32 (registered trademark) in the form of vinegar [Hatman DE32 is a H. ribangel end company, 14 Newbridge, London, UK, EC4. Which is microcrystalline cellulose substituted with diethylamino ethyl groups.]

슬러리를 여과하고 MM 4550(착화합물)는 0.5M 황산칼륨 12ℓ를 사용하여 셀룰로오즈로 부터 용출시킨다. 추출물은 진공 및 30℃ 하의 상승피막 증발기내에서 6ℓ로 농축시킨다. 12ℓ의 아세톤을 가하면 황산칼륨 상당량이 침전된다.The slurry was filtered and MM 4550 (complex) eluted from cellulose using 12 L of 0.5 M potassium sulfate. The extract is concentrated to 6 l in vacuum and in a raised film evaporator at 30 ° C. Adding 12 liters of acetone precipitates a significant amount of potassium sulfate.

용액을 여과하고 30℃의 진공하에서 증발시켜 200ml로 농축시킨다. 농축물을 엠버라이트 XAD-4 수지(등록된 상표)[미국 필라델피아롬 앤드 하스 컴퍼니에서 제조하며 이 물질은 이온성의 폴리스리렌 수지이다]가 들어 있는 76mm×2m 컬럼에 채우고 탈이온수로 용출시킨 다음 용출물을 140ml씩 모은다.The solution is filtered and concentrated to 200 ml by evaporation under vacuum at 30 ° C. The concentrate was filled into a 76 mm x 2 m column containing Amberlite XAD-4 resin (registered trademark) (manufactured by Philadelphia Rome & Haas Company, USA, which is an ionic polystyrene resin), eluted with deionized water and then eluted. Collect 140 ml of water.

KAG 시험으로 검사한 활성 부분들을 모으고(1.2ℓ) 60p.s.i의 질소압력하에 아미콘 UM-05 반투막(150mm 직경)(등록된 상표)[하이위콤퀸스가 57번지 아미콘 주식회사]을 사용하여 한외(限外) 여과시켜 275ml로 농축시킨다.The active parts examined by the KAG test were collected (1.2 L) and ultrafiltration using Amicon UM-05 semipermeable membrane (150 mm diameter) (registered trademark) (Amicon Co., Ltd., 57 Hi-Comquin Queens) under nitrogen pressure of 60 p.si. Filter and concentrate to 275ml.

농축물을 냉각건조시키면 갈색분말 2.2g이 생성된다(I 50 0.004㎍/ml).Cooling of the concentrate gave 2.2 g of brown powder (I 50 0.004 μg / ml).

분말 1g을 0.2 황산나트륨 1ℓ에 용해시키고 디클로로메탄에 용해되 있는 2% w/v 테트라-n-부틸 암모늄하이드리진 설페이트(스웨덴 스더탈제 AB 아스트라제품) 1ℓ와 혼합시킨다. 디클로로메탄상을 중력하에 분리하고, -70℃로 냉각시킨 다음 얼음을 여과하고 증발시켜 20ml로 농축시킨다. 40~60℃의 석유물질 400ml를 농축물에 가하고 침전을 원심분리하여 모은다. 침전을 디클로로메탄(10ml)에 다시 용해시키고 요오드화바륨(80mg) 및 탄산바륨(70mg)을 함유하고 있는 물(10ml)로 추출한다. 상(相)들을 분리하고 수상을 여과하여 pH 6.5로 맞춘다. 용액을 냉각건조시키면 황색 분말이 된다.1 g of powder is dissolved in 1 l of 0.2 sodium sulfate and mixed with 1 l of 2% w / v tetra-n-butyl ammonium hydrazine sulfate (product of Swedish Asteral AB). The dichloromethane phase is separated under gravity, cooled to -70 ° C and the ice is filtered and evaporated to concentration to 20 ml. 400 ml of petroleum material at 40 ~ 60 ℃ is added to the concentrate, and the precipitate is collected by centrifugation. The precipitate is again dissolved in dichloromethane (10 ml) and extracted with water (10 ml) containing barium iodide (80 mg) and barium carbonate (70 mg). The phases are separated and the aqueous phase is filtered to reach pH 6.5. Cooling and drying the solution gives a yellow powder.

고체를 아세톤으로 씻어 과량의 요오드화바륨을 용해시키고 연황색 고체를 원심분리하여 회수한 다음 진공하에 건조시킨다. 수율은 13mg이다(I 50 0.0004㎍/ml).The solid is washed with acetone to dissolve excess barium iodide and the pale yellow solid is recovered by centrifugation and dried under vacuum. The yield is 13 mg (I 50 0.0004 μg / ml).

[설 명 4][Comment 4]

[배양액의 탄소흡수예시][Example of Carbon Absorption of Culture Liquid]

설명 3에서 얻은 배양물 여액은 클렙시엘라 에로게네스에 대한 홀-인-플레이트(hole-in-plate) 아가 확산항균시험에서 17mm의 영역직경을 나타내며 KAG 시험에서는 영역직경이 38mm이고 희석시 I 50은 1/100,000이다.The culture filtrate obtained in Description 3 had an area diameter of 17 mm in the hole-in-plate agar diffusion antimicrobial test for Klebsiella erogenes, and the area diameter was 38 mm in the KAG test and I 50 at dilution. Is 1 / 100,000.

5℃하의 정화된 배양물 여액(170ℓ)을 활성탄(Farnell BO, Dearbon Chemicals Ltd., Dilton, Widnes, Lancs에서 공급되며, 규정염산으로 미리 세척되고 인산염으로 pH6으로 완충된 60~80메쉬 크기의 것)이 16인치 높이로 차있는 9인치 직경 컬럼을 통하여 800~1,000ml/분의 유속으로 상승시켜 삼투시킨다. 양조물을 탈이온된 물(10ℓ)을 사용하여 탄소로 부터 세척해 내고 컬럼을 20℃에서 20% 아세톤으로 용출시킨다.Purified culture filtrate at 5 ° C. (170 L) was supplied from activated carbon (Farnell BO, Dearbon Chemicals Ltd., Dilton, Widnes, Lancs), 60-80 mesh size pre-washed with hydrochloric acid and buffered to pH 6 with phosphate Osmosis is carried out at a flow rate of 800-1,000 ml / min through a 9-inch diameter column that is 16 inches high. The brew is washed out of carbon with deionized water (10 L) and the column is eluted with 20% acetone at 20 ° C.

10ℓ에 달한 활성부분들을 30℃이하의 진공에서 6ℓ로 증발 농축시키고 냉각건조시키면 조제 MM 4550(착화합물) 282g이 제조되며 이는 I 50이 0.05㎍/ml이다. 효소억제제 활성의 복구는 22%이다.Evaporating and condensing 10 l of the active part to 6 l in a vacuum below 30 ° C. and cooling to dry yields 282 g of crude MM 4550 (complex), which is 0.05 μg / ml. Recovery of enzyme inhibitor activity is 22%.

유사한 결과를 주는 다른 활성탄은 다코그라뉼라 탄소(호니윌아트라스 주식회사 밀레인, 카샬론, 서레이에서 공급)이다.Another activated carbon that gives similar results is Daco Granular Carbon (available from Honeywill Atlas Co., Ltd. Milane, Casalon, Surrey).

[설 명 5][Comment 5]

[배양물 여액의 이온교환수지 크로마토그라피예시][Example of Ion Exchange Resin Chromatography of Culture Filtrate]

1cm 내직경을 가진 컬럼을 도웩스 21K 이온교환수지(20~25U.S.메쉬, 염화물 형태)(도웩스 21K는 B.D.H Chemicals LTd., Poole, Dorset, U.K.에서 공급되며 염기를 함유하는 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지이다)를 사용하여 6cm 높이(층 부피 4.7ml)로 채운다.A column with a diameter of 1 cm was subjected to Dow's 21K ion exchange resin (20-25 U.S. mesh, chloride form) (Dows 21K is supplied from BDH Chemicals LTd., Poole, Dorset, UK and contains polystyrene-D containing base. Using a vinylbenzene resin) to 6 cm high (layer volume 4.7 ml).

그 후 수지층을 5% 메탄올 수용액 약 4×4.7ml로 세척하고 증류수 1×4.7ml로 세척한다.Thereafter, the resin layer was washed with about 4 × 4.7 ml of 5% aqueous methanol solution and washed with 1 × 4.7 ml of distilled water.

배양물 여액 2ℓ를 설명 3에 기술한 방법대로 얻고 컬럼에 가한다. 그 후 수지를 50% 메탄올 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한다. MM 4550(착화물)은 50% 메탄올수용액내의 5% NaCl을 사용하여 수지로부터 용출시킨다.2 L of culture filtrate is obtained according to the method described in description 3 and added to the column. The resin is then washed with 50% aqueous methanol solution to remove impurities. MM 4550 (complex) is eluted from the resin using 5% NaCl in 50% aqueous methanol solution.

다음의 표 1은 활성단위로 나타낸 결과를 나타내고 있다. 배양물 여액의 MM 4550(착화합물) 함량은 8단위/ml의 임의 값이다.Table 1 below shows the results expressed in active units. The MM 4550 (complex) content of the culture filtrate is an arbitrary value of 8 units / ml.

컬럼에서 용출된 부분은 클렙시엘라 에로게네스에 항균확산방법을 사용하여 시험하고, 활성단위는 배양물 여액을 여러가지로 희석시킨 단위/ml에 대해서 영역 직경을 점찍어 만든 표준선을 참조하여 계산한다(즉, 배양물 여액이 표준으로 사용된다).The eluted portion of the column is tested using the Klebsiella erogenes using antimicrobial diffusion method, and the active unit is calculated by referring to the standard line created by dividing the area diameter with respect to the unit / ml of various dilutions of the culture filtrate ( Ie, culture filtrate is used as standard).

이 실험으로 부터 컬럼은 MM 4550(착화합물)을 농축시키는 효과적인 방법임을 알 수 있다.From this experiment it can be seen that the column is an effective way to concentrate the MM 4550 (complex).

2~5부분들은 총부피 37ml 내에서 활성이 60%이다. 이들 부분들의 총건조중량은 약 210mg이며 이때 고체 35g를 컬럼에 가했었다.The 2-5 parts are 60% active in 37 ml total volume. The total dry weight of these parts was about 210 mg at which time 35 g of solid were added to the column.

[표 1] DOWEX 21 K 상의 크로마토그라피 결과TABLE 1 Chromatography results on DOWEX 21 K

[설 명 6][Explanation 6]

[배양물 여액의 이온상 추출예시][Example of Ion Phase Extraction of Culture Filtrate]

황산나트륨(248g)을 설명 3에 따라 제조한 정화된 배양물 여액(3ℓ)에 가하고, 디클로로메탄(10ℓ)에 용해되어 있는 2% 테트라 n-부틸암모늄 하이드리진 설페이트와 함께 30분간 교반시켜 상기 용액을 추출한다. 상(相)들을 분리하고 디클로로메탄상을 2℃로 냉각시킨다.Sodium sulfate (248 g) was added to the clarified culture filtrate (3 L) prepared according to Description 3 and stirred for 30 minutes with 2% tetra n-butylammonium hydride sulfate dissolved in dichloromethane (10 L) to give the solution. Extract. The phases are separated and the dichloromethane phase is cooled to 2 ° C.

분산되 있는 물 소량은 Whatman No. 1PS페이퍼로 여과하여 제거한다. 디클로로메탄 용액은 30℃하의 진공에서 증발시켜 20ml로 농축시킨다.Small amount of water dispersed is Whatman No. Remove by filtration with 1PS paper. The dichloromethane solution is concentrated to 20 ml by evaporation in vacuo at 30 ° C.

석유 에테르(40~60°) 400ml를 가하면 껌이 침전되며 이는 MM 4550(착화합물)을 함유한다.400 ml of petroleum ether (40-60 °) is added to precipitate the gum, which contains MM 4550 (complex).

껌을 원심분리하여 모으고 디클로로메탄 50ml에 다시 용해시킨 후, 요오드화 바륨 1g 및 탄산바륨 1g을 함유하는 있는 물 50ml로 2시간동안 교반시켜 추출한다. 생성된 고체를 여과하여 버리고 두상을 분리한다. 바륨염의 MM 4550(착화합물)을 함유하는 있는 수용액층을 pH6.5로 맞춘 후 동결 건조시키면 I 50이 0.001㎍/ml인 MM 4550(착화합물)의 조제품 317mg이 생성된다.Gum is collected by centrifugation, dissolved in 50 ml of dichloromethane, and extracted by stirring with 50 ml of water containing 1 g of barium iodide and 1 g of barium carbonate for 2 hours. The resulting solid is filtered off and the two phases are separated. The aqueous layer containing MM 4550 (complex compound) of barium salt was adjusted to pH 6.5 and lyophilized to yield 317 mg of a preparation of MM 4550 (complex compound) having an I 50 of 0.001 µg / ml.

[설명 7][Description 7]

테트라 n-부틸암모늄하이드리진설페이트를 사용하여 MM 4550 및 MM 13902를 함유하고 있는 부분 정제된 항균착화합물의 제조Preparation of Partially Purified Antimicrobial Complexes Containing MM 4550 and MM 13902 Using Tetra n-Butylammonium Hydrazine Sulfate

설명 4에서 제조한 MM 4550(착화합물) 조제품을 물에 다시 용해시키고(125ml 내에 12.5g) 디클로로메탄에 용해되 있는 10% w/v 테트라 w/v=부틸암모늄하이드리진 설페이트 125ml로 추출한다. 두상을 분리하고, 디클로로메탄을 요오드화나트륨 190mg을 함유하고 있는 2℃의 물 100ml와 천천히 교반시켜 다시 추출한 다음, 수용상을 2% NaHCO₃를 사용하여 pH 6.4로 맞춘다. 용액을 동결건조시키고 건조된 고체를 아세톤으로 세척하면 에스케리키아 콜리 β-락타마제에 대한 I 50이 0.0002㎍인 MM 4550 및 MM 13902의 혼합 이나트륨염 88mg이 얻어진다. 항생제회수는 70%이다.The preparation of MM 4550 (complex) prepared in Description 4 is again dissolved in water (12.5 g in 125 ml) and extracted with 125 ml of 10% w / v tetra w / v = butylammonium hydrazine sulfate dissolved in dichloromethane. The two phases are separated, dichloromethane is extracted again by slowly stirring with 100 ml of 2 ° C. water containing 190 mg of sodium iodide, and the aqueous phase is adjusted to pH 6.4 using 2% NaHCO ₃ . The solution was lyophilized and the dried solid was washed with acetone to give 88 mg of mixed disodium salt of MM 4550 and MM 13902 with an I 50 of 0.0002 μg against Escherichia coli β-lactamase. Antibiotic recovery is 70%.

암피실린과 설명 7에서 제조한 물질의 혼합물의 항균활성은 영양아기내에서의 연속희석방법으로 결정된다. 얻어진 희소억제농도가 표 3에 나타나 있다.The antimicrobial activity of the mixture of ampicillin and the substance prepared in Description 7 is determined by the continuous dilution method in nutrient babies. The obtained rare inhibitory concentration is shown in Table 3.

[표 2] 암피실린과 설명 7의 물질 사이의 상승작용TABLE 2 Synergy between Ampicillin and Substance 7

* 이들 농도에서의 MM 4550(착화합물) 단독에 의한 부분억제.Partial inhibition by MM 4550 (complex compound) alone at these concentrations.

유사한 상승효과가 아목시실린과 MM 4550(착화합물)의 혼합물에 대해서도 관찰된다.Similar synergistic effects are observed for mixtures of amoxicillin and MM 4550 (complex).

[설 명 8][Comment 8]

세틸디메틸벤질암모늄클로라이드를 사용하여 MM 4550과 MM 13902를 함유하고 있는 부분 정제된 항균 착화합물의 제조Preparation of Partially Purified Antimicrobial Complexes Containing MM 4550 and MM 13902 Using Cetyldimethylbenzylammonium Chloride

설명 4에 따라 아세톤/물로 용출시킨 파-넬 탄소컬럼으로부터 얻은 동결건조된 생성물(I₅₀=0.02㎍/ml)을 13mg/ml 농도로 증류수에 용해시킨다. 용액을 pH6.5로 맞춘다.The lyophilized product (I ₅₀ = 0.02 μg / ml) obtained from the Par-nel carbon column eluted with acetone / water according to description 4 is dissolved in distilled water at a concentration of 13 mg / ml. Adjust the solution to pH6.5.

용액 100ml를 클로로메탄에 용해되 있는 0.1% 세틸디메틸벤질 암모늄클로라이드 동부피로 추출한다. 상들을 원심분리하고 유기상은 0.5% 요오드화 나트륨용액 100ml로 다시 추출한다. 상들을 분리하고 수용상내의 디클로로메탄은 용액을 감압으로 10분동안 유지시켜 제거한다.100 ml of the solution is extracted with 0.1% cetyldimethylbenzyl ammonium chloride eastern blood dissolved in chloromethane. The phases are centrifuged and the organic phase is extracted again with 100 ml of 0.5% sodium iodide solution. The phases are separated and dichloromethane in the aqueous phase is removed by keeping the solution at reduced pressure for 10 minutes.

아세톤으로 세척한 생성물은 진공데시케이터내에서 건조시키면 연갈색분말이 생성된다(4.3mg; I₅₀=0.002㎍/ml).The product washed with acetone was dried in a vacuum desiccator to give a light brown powder (4.3 mg; I ₅₀ = 0.002 μg / ml).

[설 명 9][Comment 9]

겔여과를 사용하여 MM 4550 및 MM 13902를 함유하고 있는 부분정제된 항균착화합물의 제조Preparation of Partially Purified Antimicrobial Compound Containing MM 4550 and MM 13902 Using Gel Filtration

설명 4의 방법으로 제조된 조제 MM 4550(착화합물)(I₅₀=0.2㎍/ml) 1g을 용출제로 아세톤/물, 4:6v/v를 사용하여 세파덱스 G25(양호한 품질)로 크로마토그라피한다. 컬럼크기는 2.5cm×32cm이고 용출은 1.5ml/분 속도로 수행한다.1 g of the prepared MM 4550 (complex) (I ₅₀ = 0.2 μg / ml) prepared by the method of Description 4 is chromatographed with Sephadex G25 (good quality) using acetone / water, 4: 6v / v as eluent. The column size is 2.5 cm x 32 cm and elution is carried out at a rate of 1.5 ml / min.

활성 부분들을 모아 30℃ 이하의 진공에서 농축하고 동결건조시키면 I₅₀이 0.005㎍/ml인 무정형의 누르스름한 유색고체 22g이 얻어진다.The active portions were collected, concentrated in vacuo below 30 ° C. and lyophilized to yield 22 g of an amorphous yellowish colored solid with an I ₅₀ of 0.005 μg / ml.

회수율은 88%이고 40배 정제한다.Recovery is 88% and 40-fold purification.

[설 명 10][Comment 10]

셀룰로오즈크로마토그라피를 사용하여 MM 4550 및 MM 13902를 함유하고 있는 부분 정제된 항균착화합물의 제조Preparation of Partially Purified Antimicrobial Compounds Containing MM 4550 and MM 13902 Using Cellulose Chromatography

공정 7에 따라 제조한 MM 4550(착화합물) 610mg을 2.5cm×32cm의 셀룰로오즈(whatman cc 37) 컬럼에서 크로마토그라피하고 이소프로판올/물, 7/3(v/v)의 혼합물로 1.5ml/분의 속도로 용출시킨다.610 mg of MM 4550 (complex) prepared according to step 7 was chromatographed on a 2.5 cm × 32 cm cellulose (whatman cc 37) column and subjected to a rate of 1.5 ml / min with a mixture of isopropanol / water and 7/3 (v / v). Elute.

항균적으로 활성인 부분들을 모으고 30℃ 이하의 진공에서 농축시켜 동결건조하면 I₅₀이 0.00007㎍/ml인 항균착화합물의 갈색무정형 고체제품 40mg이 얻어진다.The antimicrobial active moieties were collected, concentrated in vacuo below 30 ° C. and lyophilized to yield 40 mg of brown amorphous solid product of an antimicrobial complex having an I ₅₀ of 0.00007 μg / ml.

I₅₀이 대단히 작은 값을 가짐은 활성물질의 순도가 증가됐음을 가리킨다.Very low values of I ₅₀ indicate an increase in the purity of the active substance.

다른 경우에 있어서 상기 공정은 I₅₀이 0.001㎍/ml인 물질을 생성하기도 한다.In other cases, the process may produce substances with an I ₅₀ of 0.001 μg / ml.

이 물질은 약한 접종물(하룻밤 묵힌 육즙의 1%)을 사용하여 Oxoid 감응 육즙의 표준 마이크로적정으로 결정할 때 표 3에 기록된 항균활성을 갖고 있다.This material has the antimicrobial activity listed in Table 3 when determined as a standard microtiter of Oxoid-sensitive juice using a weak inoculum (1% of overnight broth).

[표 3] I₅₀이 0.01㎍/ml인 MM 4550과 MM 13902 혼합물의 항균활성Table 3 Antimicrobial activity of MM 4550 and MM 13902 mixtures with I ₅₀ of 0.01 ㎍ / ml

[설 명 11][Comment 11]

[MM 4550][MM 4550]

MM 4550은 다음과 같은 그의 특성에 의하여 알 수 있게 될 것이다. 나트륨형태로 되있는 산성 고체인 MM 4550은 다음 특성을 갖고 있다.The MM 4550 will be known by its characteristics as follows. MM 4550, an acidic solid in sodium form, has the following properties:

i) 물에 대단히 잘 용해되고 메탄올에 용해되어 클로로포름, 디에틸에테르 및 탄화수소에 전혀 불용이다.i) Very well soluble in water and in methanol, insoluble in chloroform, diethyl ether and hydrocarbons.

ii) 수용액상태에서는 약 238nm에서 흡수 극대치를 갖는 특성 UV 스펙트럼을 갖는다.ii) in aqueous solution, has a characteristic UV spectrum with an absorption maximum at about 238 nm.

Ⅲ) 새로 제조한 KBr 디스크내에 0.4% w/v로 존재할 때 약 3,450, 2,950, 1,765, 1,695, 1,510, 1,390 및 1,260cm^-1에서 흡수극대치를 갖는 특성 IR스팩트럼을 갖는다. KBr을 제조한지 약 1주일이 경과한 후 스팩트럼을 취하면 상당한 변화가 있게 되며, 실예로 전에 약 1,765cm^-1에서 있었던 큰 피크가 상당히 크기가 감소되거나 없어진다.III) It has a characteristic IR spectrum with absorption maxima at about 3,450, 2,950, 1,765, 1,695, 1,510, 1,390 and 1,260 cm ^-1 when present at 0.4% w / v in newly prepared KBr discs. After about one week of preparation of the KBr, taking the spectrum takes a significant change, for example, the large peak that previously occurred at about 1,765 cm ⁻¹ is significantly reduced or eliminated in size.

iv) D₂O내에서 특성 n.m.r스팩트럼을 가지며 그 스팩트럼은 (a) 약 2.45τ 및 3.65τ에 위치하는 저(低) 필드(field)의 더블렛 한쌍; (b) 약 8.55τ에 위치하는 더블렛 및 (c) 약 7.95τ에 있는 뾰족한 싱글렛을 가지고 있다.iv) a pair of low field doublets having characteristic nmr spectra in D ₂ O, the spectra being located at about 2.45τ and 3.65τ; (b) a doublet at about 8.55τ and (c) a sharp singlet at about 7.95τ.

v) 박층 크로마토그라피내의 셀룰로오즈상에서 수행할 때 다음과 대단히 유사한 R_f값을 갖는다 :v) When run on cellulose in thin layer chromatography, it has an R _f value very similar to the following:

(a) 부탄올/이소프로판올/물-7:7:6v/v; Rf=0.6(a) butanol / isopropanol / water-7: 7: 6v / v; Rf = 0.6

(b) 이소프로판올/물-7:3v/v; Rf=0.7(b) isopropanol / water-7: 3v / v; Rf = 0.7

(c) n-부탄올/에탄올/물-7:7:6v/v; R_f=0.7(c) n-butanol / ethanol / water-7: 7: 6v / v; R _f = 0.7

(d) n-프로판올/물-4:1v/v; R_f=0.6(d) n-propanol / water-4: 1 v / v; R _f = 0.6

다음의 여러 속(屬), 그중에서도 스타필로코쿠스 아우레우스, 바실루스 섭틸리스, 에스케리키아콜리, 클렙시엘라 에로게네스, 프로테우스 미라빌리스, 아시네토박터 아니트라투스, 세르티아마르세슨스, 및 시겔라손네이에 대하여 항균 활성을 갖는다.The following genera, including Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella erogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Sertia marcesons, And antimicrobial activity against Shigella sonnai.

vii) 여러속(屬), 그중에서도 에스케리키아콜리, 클렙시엘라 에로게네스 및 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해 제조되는 β-락타마제에 대하여 효소억제활성을 갖는다.vii) has enzymatic inhibitory activity against β-lactamase produced by various genera, inter alia Escherichia coli, Klebsiella erogenes and Staphylococcus aureus.

또한 에스케리키아콜리 BII의 β-락타마제에 대하여 0.0001㎍/ml 이하의 I₅₀을 갖는다.Also it has a I ₅₀ of 0.0001㎍ / ml or less against the β- lactamase of Escherichia coli BII.

vⅢ) 암피실린과 혼합됐을 때 에스케리키아콜리, 클렙시엘라 에로 게네스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이 및 스타필로코쿠스 아우레우스 러셀의 균주를 포함하는 유기체에 대한 그의 활성이 상승(相乘)된다.vIII) When mixed with ampicillin, its activity against organisms, including strains of Escherichia coli, Klebsiella erogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganini and Staphylococcus aureus russell, is elevated. Viii)

ix) 아미노산분석을 하면 그 물질은 폴리펩타이드나 프로테인이 아님을 나타낸다.ix) Amino acid analysis indicates that the substance is not a polypeptide or protein.

산가수분해 후에도 α-아미노아디프산이 발견되지 않는다.Α-aminoadipic acid is not found even after acid hydrolysis.

x) 에르리히 시약(4-디메틸아미노벤즈알데히드 300mg을 n-부탄올 54ml, 에탄올 9ml, 농염산 9ml의 혼합물에 용해시킨 것)과 반응하여 페이퍼 크로마토그램 및 박층크로마토그라피시이트상에 푸른색을 나타낸다.x) Reaction with Erlich reagent (300 mg of 4-dimethylaminobenzaldehyde dissolved in a mixture of 54 ml of n-butanol, 9 ml of ethanol and 9 ml of concentrated hydrochloric acid) to give a blue color on paper chromatogram and thin layer chromatography.

xi) 그것은 일반적인 효소 해독제가 아니고 에스케리키아 콜리의 β-락타마제를 억제하는데 필요한 양보다 과량의 농도에서도 다음의 효소를 억제하지는 않는다. 모노아민 옥시다제, 카보닉안하이드라제, 도파디카복실라제, 트립신, 키모트립신 또는 우레아제.xi) It is not a general enzyme detoxifier and does not inhibit the following enzymes in excess of concentrations necessary to inhibit β-lactamase of Escherichia coli. Monoamine oxidase, carbonic anhydrase, dopadicarboxylase, trypsin, chymotrypsin or urease.

[실시예 1]Example 1

MM4550(착화합물)의 제조 및 MM4550 및 MM13902로의 분리Preparation of MM4550 (Compound Compound) and Separation into MM4550 and MM13902

설명 부분에서 상술한 분리공정은 여러가지의 단계로 이용할 수 있다. 특히 적당한 단계는 탄소흡착, 이온쌍추출 및 하기한 바와 같은 셀룰로오즈 크로마토그라피이다 :The separation process described in the description can be used in various steps. Particularly suitable steps are carbon adsorption, ion pair extraction and cellulose chromatography as described below:

배양물여액(340ℓ)(설명 3에서와 같이 얻어진 것)을 파넬 80탄소로 채워진 칼럼(9" 직경×21" 높이)을 통해 800~1,200ml/min으로 상향유동시켜 삼투시켰다. MM4550(착화합물)을 흡착시키기 위해 전에 탄소를 사용했으며 이것은 다음과 같은 시약들로 세척함으로서 재생되었다.The culture filtrate (340 L) (obtained as described in description 3) was osmotically upflowed to 800-1,200 ml / min through a panel of 80 carbon filled (9 "diameter x 21" high). Carbon was previously used to adsorb MM4550 (complex) and was regenerated by washing with the following reagents.

0.5N, NaOH:0.2N NaOH/아세톤(3:2); 물; N HCl; 물; 포스페이트 완충액 pH6; 물0.5N, NaOH: 0.2N NaOH / acetone (3: 2); water; N HCl; water; Phosphate buffer pH6; water

칼럼을 물(20ℓ)로 세척하여 배양여과액을 제거하고 아세톤/물(2:8) v/v을 200~250ml/min으로 하향유동시켜 용출시켰다.The column was washed with water (20 L) to remove the culture filtrate and eluted with acetone / water (2: 8) v / v flowing down to 200-250 ml / min.

1ℓ 부분씩 모았다. 클펩시엘라 에로게네스를 사용한 항균성 확산 분석에 의해 결정한 MM4550(착화합물)을 포함하는 부분들을 합쳐 (11ℓ) 30℃ 이하의 진공에서 증발시켜 5.5ℓ로 농축시켰다. 이 과정에서 MM4550(착화합물)의 회수율은 20%이었다. 농축물을 2℃까지 냉각시키고, 디클로로메탄내의 2% w/v n 부틸암모늄 하이드로진 설페이트 5.5ℓ를 -5℃에서 가한 다음 두층을 2분동안 함께 혼합했다.1 L portions were collected. The portions containing MM4550 (complex), determined by antimicrobial diffusion analysis using Kepsiella erogenes, were combined (11 L) and concentrated to 5.5 L by evaporation under vacuum up to 30 ° C. In this process, the recovery rate of MM4550 (complex compound) was 20%. The concentrate was cooled to 2 ° C., 5.5 L of 2% w / v n butylammonium hydrosulfate in dichloromethane was added at −5 ° C. and the two layers were mixed together for 2 minutes.

디클로로메탄층을 분리하여 0℃에서 1ℓ의 요드화나트륨 용액(0.6%)에 가했다. 두층을 부드럽게 교반한 다음 수성층을 2% NaHCO₃수용액을 사용하여 pH6.5~7.0으로 서서히 조절했다.The dichloromethane layer was separated and added to 1 L of sodium iodide solution (0.6%) at 0 ° C. The two layers were stirred gently and the aqueous layer was slowly adjusted to pH 6.5-7.0 using 2% aqueous NaHCO ₃ solution.

수성층을 분리하여 동결건조시켰다.The aqueous layer was separated and lyophilized.

건조된 고체를 무수 아세톤으로 추출하여 과량의 요드화나트륨을 용해시키고 진공에서 불용성 잔류물로부터 아세톤을 제거한 결과, 누런색의 분말(1.1g)이 얻어졌다. 이 과정에서의 MM4550(착화합물)의 전체 회수율은 10%이었다.The dried solid was extracted with anhydrous acetone to dissolve excess sodium iodide and to remove acetone from insoluble residue in vacuo, resulting in a yellow powder (1.1 g). The overall recovery of MM4550 (complexed compound) in this process was 10%.

배양물 여액에 용해된 전체 고체에 대해 계산한 정제도는 125배이었다.The purity calculated for the total solids dissolved in the culture filtrate was 125 fold.

2.5cm 직경의 칼럼을 이소프로파놀/물(7:3v/v)내의 셀룰로오즈 분말(Whatman CC31)로 32cm 높이까지 채웠다. 누런색 분말 500mg을 이소프로파놀/물(7:3v/v) 2ml에 용해시킨 다음, 동일한 용매를 사용하여 1.5ml/min의 유동속도를 크로마토그라피시켰다. 칼럼으로 부터 3ml씩의 부분들을 모아 약 285nm에서 UV최대흡수치를 나타내는 것을 합쳐 농축시키고 동결건조시킨 결과 MM4550(착화합물)이 생성되었다. 상기 실험에서 약 285nm에서 흡수를 나타내는 부분들은 효소억제 및 항균활성 물질을 포함한다는 것이 증명되었다.A 2.5 cm diameter column was filled with cellulose powder (Whatman CC31) in isopropanol / water (7: 3 v / v) up to 32 cm high. 500 mg of yellow powder was dissolved in 2 ml of isopropanol / water (7: 3v / v), and the flow rate of 1.5 ml / min was chromatographed using the same solvent. 3 ml portions of the column were collected, concentrated and lyophilized to show UV maximum absorption at about 285 nm, resulting in MM4550 (complex). The experiment demonstrated that the parts showing absorption at about 285 nm include enzyme inhibitory and antimicrobial actives.

동결건조된 MM4550(착화합물)의 수율은 35mg이었다. 이것은 갈색 무정형 외양을 나타내며 I₅₀은 0.0001㎍/ml이었다. 이 과정에서의 활성물질의 회수율은 총 3%이었으며, 정제도는 총 600배이었다.The yield of lyophilized MM4550 (complex) was 35 mg. This shows a brown amorphous appearance with an I ₅₀ of 0.0001 μg / ml. The recovery rate of active substance in this process was 3% and the degree of purification was 600 times.

이 제제의 항균 활성은 경 접종물을 사용한 Oxoid민감성 시험액내에서 표준 Microtitre 방법에 의해 측정했다. 생성된 최소억제 농도는 앞의 표 3에서 표시한 것과 유사했다.The antimicrobial activity of this formulation was determined by standard Microtitre method in Oxoid sensitive test solution with light inoculum. The resulting minimum inhibitory concentrations were similar to those shown in Table 3 above.

이 제제를 셀룰로오즈(이스트만 코닥 "Chromagram"종이)상에서 n-부타놀; 이소프로파놀; 물(7:7:6)로 전개시켜 박층 크로마토그라피시킨 결과, 약 0.58의 R_f를 갖는 MM4550을 나타내는 것과 약 0.72의 R_f를 갖는 NN13902를 나타내는 것의 2개의 활성물질로 분리되었다.This formulation was prepared on cellulose (Eastman Kodak "Chromagram" paper) n-butanol; Isopropanol; Water (7: 7: 6) was developed with separated into two active substances of what represents a thin layer chromatography in which the results, as NN13902 having about 0.72 of the R _f represents a MM4550 with R _f of about 0.58.

이 2개의 물질은 B. 섭틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스(옥스포드), 스타필로코쿠스 아우레우스(항페니실린 균), 에스케리키아콜리(페니실린 감수성균 및 항페니실린균), 살모넬라 타이피무리움, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이 및 클렙시엘라 에로게네스을 포함하는 여러가지 조직상의 페어터 크로마토그라피에 의해 검사하였다. 얻어진 결과가 표 4에 주어져 있다.These two substances include B. subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (antipenicillin), Escherichia coli (penicillin susceptible and antipenicillin), Salmonella Examination was by various tissue pairer chromatography, including Typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganini and Klebsiella erogenes. The results obtained are given in Table 4.

또 다른 실험에서는, 셀룰로오즈 박층상에서 이소프로파놀; 물(8:2)로 전개하고 셀룰로오즈로 부터 포스페이트 완충액으로 추출함으로서 2개의 물질을 분리했다. 각 물질을 β-락타마제 억제에 대해 분석했으며, 두물질 모두 에스케리키아콜리 β-락타마제의 억제제임이 나타났다.In another experiment, isopropanol on a thin layer of cellulose; The two materials were separated by running with water (8: 2) and extracting from cellulose into phosphate buffer. Each material was analyzed for β-lactamase inhibition and both were shown to be inhibitors of Escherichia coli β-lactamase.

또한 두물질 모두 클펩시엘라 에로게네스에 대해 벤질페니실린과 상승작용을 한다는 것이 나타났다.It has also been shown that both substances are synergistic with benzylphenicillin against the Cepsiella erogenes.

[표 4] 페아퍼 크로마토그라피(셀룰로오즈와 부타놀/이소프로필알콜/물 7:7:6v/v를 사용한 TLC)에 의해 측정된 MM4550과 MM13902의 항균활성TABLE 4 Antimicrobial Activity of MM4550 and MM13902 as Measured by Peper Chromatography (TLC Using Cellulose and Butanol / Isopropyl Alcohol / Water 7: 7: 6v / v)

[실시예 2]Example 2

MM4550(착화합물)의 제조와 MM4550 및 MM13902로의 분리Preparation of MM4550 (Compound Compound) and Separation into MM4550 and MM13902

스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC31126을 pH6.5와 5℃에서 발효시킨 배양물 여액(1,100ℓ)을 Darco입자상 탄소를 채운 칼럼(0.3cm×1m)을 통해 3.2ℓ/min으로 여과시켰다.The culture filtrate (1,100 L) fermented with Streptomyces olivasus ATCC31126 at pH 6.5 and 5 ° C. was filtered through a column filled with Darco particulate carbon (0.3 cm × 1 m) at 3.2 L / min.

[탄소는 MM4550(착화합물)을 흡착하는데 이미 사용되었으며 사용하기 전에 다음과 같은 시약들로 세척함으로서 재생되었다.[Carbon has already been used to adsorb MM4550 (complex) and was regenerated by washing with the following reagents before use.

0.5N NaOH; 0.2N NaOH/아세톤(3:2); 물; N HCl; 물; 포스페이트 완충액, pH6; 물]0.5N NaOH; 0.2N NaOH / acetone (3: 2); water; N HCl; water; Phosphate buffer, pH6; water]

칼럼을 물(60ℓ)로 세척하여 배양물 여액을 제거한 다음, 아세톤/물(2:8v/v)으로 30℃에서 1.1ℓ/min으로 용출시켰다. 60ℓ를 모은 다음 5×10부분들을 모았다.The column was washed with water (60 L) to remove the culture filtrate and then eluted with acetone / water (2: 8 v / v) at 1.1 C / min at 30 ° C. 60 l were collected and then 5 × 10 parts were collected.

클렙시엘라 에로게네스를 사용한 항균성 확산분석에 의해 측정한 결과 MM4550(착화합물)을 포함하는 이 부분들을 합쳐(40ℓ) 30℃ 이하의 진공에서 32ℓ가 되도록 농축시켰다. 이 과정에서의 MM4550(착화합물)의 회수율은 15%이었다.As measured by antimicrobial diffusion analysis using Klebsiella erogenes, these portions containing MM4550 (complex) were combined (40 L) and concentrated to 32 L in a vacuum below 30 ° C. The recovery rate of MM4550 (complex compound) in this process was 15%.

농축물을 5℃까지 냉각시키고, 디클로로메탄내의 0.2% 세틸디메틸벤질암모늄 클로라이드 16ℓ를 가한 다음 2개의 층을 5분간 혼합했다.The concentrate was cooled to 5 ° C., 16 L of 0.2% cetyldimethylbenzylammonium chloride in dichloromethane was added and the two layers were mixed for 5 minutes.

디클로로메탄층을 분리한 다음, 5℃에서 요드화나트륨 용액(0.4%) 3.75ℓ에 가했다.The dichloromethane layer was separated and then added to 3.75 L of sodium iodide solution (0.4%) at 5 ° C.

2개의 층을 5분간 혼합한 다음 수성층을 분리하여 동결건조시켰다. 건조한 고체를 무수 아세톤으로 추출하여 과량의 요드화나트륨을 용해시킨 다음, 잔류고체를 진공에서 건조시킨 결과 누런색 분말(2.87g)이 생성되었다. 이 과정에서의 MM4550(착화합물)의 전체회수율은 6%이었다.The two layers were mixed for 5 minutes and then the aqueous layer was separated and lyophilized. The dry solid was extracted with anhydrous acetone to dissolve excess sodium iodide, and the residual solid was dried in vacuo resulting in a yellow powder (2.87 g). In this process, the total recovery of MM4550 (complex compound) was 6%.

배양물 여액내에 용해된 전체 고체에 대해 계산한 정제도는 160배이었다.The purity calculated for the total solids dissolved in the culture filtrate was 160 fold.

63mm 직경의 칼럼을 이소프로파놀-물(7:3V/V) 내의 셀룰로오즈 분말(Whatman CC31)로 300mm의 높이까지 채웠다. 누런색분말 2.0g을 이소프로파높/물(7:3v/v) 내에 용해시킨 다음 동일한 용매내에서 3ml/min으로 크로마토그라피시켰다. 클렙시엘라 에로게내스에 대한 분석에 의해 측정한 결과 MM4550(착화합물)을 포함하는 부분들을 합쳐 30℃ 이하의 진공에서 증발시켜 농축시킨 다음 동결건조시킨 결과 갈색고체(207mg)이 생성되었다. 이 과정에서의 MM 4550(착화합물)의 회수율은 51%이었으며 정제도는 5배이었다.A 63 mm diameter column was filled with cellulose powder (Whatman CC31) in isopropanol-water (7: 3 V / V) to a height of 300 mm. 2.0 g of yellow powder was dissolved in isopropano / water (7: 3v / v) and chromatographed at 3 ml / min in the same solvent. As a result of analysis by Klebsiella erogenase, the portions containing MM4550 (complex) were combined, concentrated by evaporation under vacuum below 30 ° C, and then lyophilized to give a brown solid (207 mg). The recovery rate of MM 4550 (complexed compound) was 51% and the purity was 5 times.

16mm 직경의 칼럼을 n-프로파놀/물(4:1v/v) 내의 셀룰로오즈 분말(Whatman CC31)로 300mm의 높이까지 채웠다. 갈색고체 198mg을 물/n-프로파놀(1:1)에 용해시킨 다음, n-프로파놀/물(4:1v/v) 내에서 0.5ml/min의 유출속도로 크로마토그라피시켰다. 부분들(6ml)을 모아 클렙시엘라 에로게내스에 대해 생물검사하고, 각 부분의 UV스팩트럼을 측정했다. 약 305nm에서 UV최대치를 갖는 23~28부분들은 MM 13902의 디소디움염을 포함했다. 이 부분들은 합쳐 진공하에서 농축시키고 동결건조시킨 결과 고체 30mg이 얻어졌다. 이 제제는 이스트만 코닥 셀룰로오즈판을 사용하여 n-프로파놀/물(4:1v/v)로 박층 크로마토그라피시킨 결과 R_f0.77에서 단지 한개 영역의 항생활성을 나타냈다. 영역은 바실루스 섭틸리스 상의 페이퍼 크로마토그라피에 의해 검사했다(약 285nm에서 UV 최대 흡수치를 갖는 부분 29~40은 MM4550을 포함했다. 이들을 합쳐 진공하에서 농축시키고 동결건조시킨 결과 53mg의 고체가 얻어졌으며, 이것은 소량의 MM13902의 염으로 오염된 MM4550의 염을 포함했다).A 16 mm diameter column was filled with cellulose powder (Whatman CC31) in n-propanol / water (4: 1 v / v) to a height of 300 mm. 198 mg of a brown solid was dissolved in water / n-propanol (1: 1) and then chromatographed at a flow rate of 0.5 ml / min in n-propanol / water (4: 1 v / v). The portions (6 ml) were collected and biopsied for Klebsiella erogenes, and the UV spectrum of each portion was measured. The 23-28 moieties with UV maximums at about 305 nm included the disodium salt of MM 13902. These portions were combined, concentrated in vacuo and lyophilized to give 30 mg of solid. This formulation showed only one region of anti-bioactivity at R _f 0.77 using Eastman Kodak cellulose plate with thin layer chromatography with n-propanol / water (4: 1 v / v). Areas were examined by paper chromatography on Bacillus subtilis (parts 29-40 with UV maximum absorption at about 285 nm contained MM4550. Combined, concentrated in vacuo and lyophilized to give 53 mg of solid, This included the salt of MM4550 contaminated with a small amount of salt of MM13902).

[설 명 12][Comment 12]

[조 직][group]

생성된 MM4550(착화합물)의 성질은 각각 스페인, 뉴질랜드, 남아프리카 및 이스라엘로부터 채취한 토양샘플로부터 분리된 배양물 ATCC21379, ATCC21380, ATCC21381 및 ATCC21382 내에서 처음으로 발견되었다. 시험실에서, 이 배양물들은 동일했으며, 국립산업 박테리아 수집소(NCIB), 스코트란드 에버딘시 토리리서치시스테이션에서의 방선균 전문가인 버스필드 박사에 의해 널리 인정된 휘틀러의 1967분류[시스티메틸데어 스트렙토마이세테스 카르거 바슬 382pp]를 사용하여 모두 스트렙토마이세스 올리바세우스로서 확인되었다. 따라서 MM4550은 표 4에 나타난 바와 같이 다른 스트렙토마이세스 종내에서 발견되었다.The properties of the resulting MM4550 (complex) were first found in cultures ATCC21379, ATCC21380, ATCC21381 and ATCC21382 isolated from soil samples taken from Spain, New Zealand, South Africa and Israel, respectively. In the laboratory, these cultures were identical and were recognized by Whitler's 1967 classification [Cystimethyldeer] by Dr. Busfield, an expert in actinomycetics at the National Institute of Industrial Bacteria (NCIB), Torrisearch, Scotland, Scotland. All were identified as Streptomyces olivaseus using Streptomyces Carger Basel 382 pp]. Thus MM4550 was found in other Streptomyces species as shown in Table 4.

S.올리바세우스는 1919년에 바크만에 의해 처음으로 기술되었다[악티노마이세스종의 배양연구, Soil, Sci, 8, 71-215].S. olivaseus was first described by Bakman in 1919 [Cultural Studies of Actinomyces, Soil, Sci, 8, 71-215].

다음에 1960년에 일단의 러시아학자들이 매우 유사한 특성을 갖는 종들을 기술했으며 이들은 악티노바이세스(스트렙토마이세스 폴보비리디스로 명명되었다[Kuchaeva et al, Trud, Inst, Mikrobiol., Akad Nauk. SSSR., 8, 226-253(1960)].Then in 1960, a group of Russian scholars described species with very similar characteristics, which were named Actinobises (Streptomyces polvovidis [Kuchaeva et al, Trud, Inst, Mikrobiol., Akad Nauk.SSSR] , 8, 226-253 (1960).

스트렙토마이세스 속의 미생물은 그들이 배양되는 조건에 따라 형태학적 및 물리학적 특성이 매우 변화한다. 이러한 변화성의 존재가 안정되기전에 많은 종에 대한 설명이 발표되었다. 휘틀러(1967)는 25종의 S.플보비리디스를 포함하는 S.올리바세우스와 동일하다고 열거했다.The microorganisms of Streptomyces genus vary greatly in morphological and physical properties depending on the conditions under which they are cultured. Explanations of many species have been published before the existence of this change has stabilized. Whitler (1967) enumerates the same as S. olivaseus, which includes 25 species of S. plovividis.

명명법과 분류에서의 혼합을 해결하기 위해 쉬를링 등에 의해 국제 스트렙토마이세스 연구가 1962년에 시작되었으며 Int. J. Syst. Bacteriol, 18, 69-189(1968)에 기재되어 있다.In order to resolve the mix in nomenclature and classification, the study of international Streptomyces began in 1962 by Schering et al. J. Syst. Bacteriol, 18, 69-189 (1968).

이 연구의 공저자들은 표준 조건하에서 스트렙토마이세스종의 정확한 설명을 목적으로 한 일련의 연구를 행했다, 이 계획에서 표준설명은 스트렙토마이세스 올리바세우스와 스트렙토마이세스 플보비리디스를 포함하는 400개의 명명된 종의 형태품종을 나타냈다.The co-authors of the study conducted a series of studies aimed at the precise description of Streptomyces sp. Under standard conditions. The standard description in this scheme includes 400 named species, including Streptomyces olibaceus and Streptomyces flavoviridis. Species type of species are shown.

S.올리바세우스와 S.플보비리디스의 I.S.P 설명은 단지 2가지 특성이 다르다.The I.S.P descriptions of S. Olivaseus and S. Plovividis differ only in two characteristics.

(i) 포자체의 형태와 (ii) 유일한 탄소원으로서 이노시톨의 이용능력.(i) the form of spores and (ii) the ability to use inositol as the only carbon source.

S.올리바세우스는 다음과 같이 설명된다 :S. olivaseus is described as follows:

포자사슬의 형태학 : 파형(波形) 부분을 나타내는 굴곡성 포자 사슬을 통해 점차 변화하는 개방된 나선을 갖는 나선형, 부분, 성숙한 포자 사슬은 일반적으로 길며, 때로는 1사슬상 50개 이상의 포자를 갖는다.Morphology of spore chains: Spiral, partial, mature spore chains with open spirals gradually changing through flexible spore chains representing wavy portions are generally long, sometimes with more than 50 spores in a chain.

탄소이용 : D-글루코우즈, L-아라비노오즈, D-크실로오즈, i-이노시톨, D-만니톨, D-푸락토오즈 및 람노오즈가 성장에 사용된다. 슈크로오즈와 라피노오즈의 경우에는 전혀 성장하지 않거나 약간 성장한다.Carbon use: D-glucose, L-arabinose, D-xylose, i-inositol, D-mannitol, D-furactose and rhamnose are used for growth. Sucrose and raffinose do not grow at all or grow slightly.

S.플보비리디스는 다음과 같이 설명된다.S. Fulbividis is described as follows.

포자 사슬의 형태학 : 파형 부분, 성숙한 포자사슬은 보통 짧으며 1사슬당 10-50개의 포자를 갖는다.Morphology of spore chains: wavy part, mature spore chains are usually short and have 10-50 spores per chain.

탄소이용 : D-글루코오즈, L-아라비노오즈, D-크실로오즈, D-만니톨, D-푸락토오즈 및 람노오즈가 성장에 이용된다. 슈크로오즈는 잘 이용되지 않는다.Carbon use: D-glucose, L-arabinose, D-xylose, D-mannitol, D-furactose and rhamnose are used for growth. Sucrose is not well used.

i-이노시톨 또는 라피노오즈의 경우에는 전혀 성장하지 않거나 약간 성장한다.i-inositol or raffinose do not grow at all or grow slightly.

S.올리바세우스 또는 S.플보비리디스 및 다른 연관된 종으로 명명되거나 또는 이와 동일한 다수의 배양물의 특성을 표준방법과 매질를 사용하여 측정했다(International Streptomyces Proiect(ISP)에서 추천된 Shirling 등에 의한 Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340(1966)).The characterization of a number of cultures named or identical to S. olivaseus or S. flaboviridis and other related species was measured using standard methods and media (Int. By Shirling et al., Recommended by International Streptomyces Proiect (ISP)). J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340 (1966)).

배양물은 서로 다른 공급원으로 부터 유래되었다. ATCC21379, 21380, 21381, 21382를 생성되는 MM4550(착화합물)을 기준으로 하여 토양으로 부터 분리했다.Cultures were from different sources. ATCC21379, 21380, 21381, 21382 were isolated from soil on the basis of the resulting MM4550 (complex).

비교할 목적으로 여러가지의 배양 수집물로 부터 다른 균주들을 얻었다.Different strains were obtained from various culture collections for comparison purposes.

MM4550(착화합물)의 제조시험의 결과, 호기성 균사체의 색갈, 포자체의 형태, 기질균사체의 색갈, 용해성 안료제조, 멜라닌제조 및 탄소원의 이용이 표 4-8에 주어져 있다. 전자현미경 검사법에 의해 검사한 결과 모든 균주에서 포자의 표면은 매끄럽다.As a result of preparation test of MM4550 (complex compound), the color of aerobic mycelium, the form of spores, the color of substrate mycelium, the production of soluble pigment, the production of melanin and the use of carbon source are given in Table 4-8. As a result of electron microscopy, the surface of the spores was smooth in all strains.

ISP설명으로 부터 S.올리바세우스에서 포자체의 나선형 성장은 가변적 특성이라는 것이 명백하다. S.올리바세우스의 형태종, 즉 ATCC3335에서 가변적빈도를 갖는 진짜 나선형이 관찰되었다. 포자체의 대부분은 길다.It is clear from the ISP statement that the helical growth of spores in S. olivaseus is a variable characteristic. In the morphological species of S. olivaseus, ATCC3335, a true spiral with variable frequency was observed. Most of the spores are long.

포자체는 길며 파형형태의 배경중에서 나선형으로 되려는 경향을 나타내지만 배양물 ATCC 21379, 21380, 21381 또는 21382로 부터는 진짜 나선형이 관찰되지 않았다. 그러나, 2개의 S.올리바세우스 균주, 즉 NCIB 8238과 NCIB8509에서는 포자체의 대부분이 파형형태이었다. NCIB8238에서 이들은 중간 정도의 길이였고, NCIB8509에서는 길었다.The spores were long and tended to spiral in the corrugated background, but no real spirals were observed from the culture ATCC 21379, 21380, 21381 or 21382. However, in the two S. olivaseus strains, NCIB 8238 and NCIB8509, most of the spores were corrugated. In NCIB8238 they were of medium length and in NCIB8509.

S.플보비리디스의 형태종인 ATCC15863으로부터 관찰된 포자체는 분리물 ATCC21379, 21380, 21381, 21382 및 31126로 부터 관찰된 것보다 짧았고 단지 파형 형태이었다. 따라서 이 특성에 관해서는 분리물 ATCC21379, 21380, 21381, 21382 및 31126이 S.올리바세우스 설명과 꽤 일치하지만 정확히 일치하지는 않는다.Spores observed from ATCC15863, a morphotype of S. flavoridis, were shorter than those observed from isolates ATCC21379, 21380, 21381, 21382 and 31126 and were only in the form of waveforms. Thus, regarding this property, the isolates ATCC21379, 21380, 21381, 21382 and 31126 are quite consistent with the S. olivaseus description, but not exactly.

분리물 ATCC21379, 21380, 21381, 21382 및 31126은 I.S.P.형태종 설명에 의해 S.올리바세우스 종과 S.플보비리디스종 사이의 다른 구별되는 특성인 이노시톨 이용에 관해 가변성을 나타낸다(표 8).Isolates ATCC21379, 21380, 21381, 21382 and 31126 show variability with regard to inositol use, which is another distinguishing characteristic between S. olivaseus and S. flibolidis species by the I.S.P. morphological species description (Table 8).

ATCC31126과 ATCC21380은 이노시톨을 이용하지만(이노시톨 이용은 S.올리바세우스의 특징이다.) 다른 균주는 약간 이용하거나 또는 이용하지 않는다. 그러나, 일반적으로 한가지 탄수화물을 이용하는 능력을 기준으로 하여 종을 분리하는 것은 만족스럽지 못하다고 생각된다. 이와 같은 차이는 단일 유전자 돌연변이에 의해 발생되며 때로는 단지 균주의 의미로 생각된다.ATCC31126 and ATCC21380 use inositol (inositol use is characteristic of S. olivaseus), but other strains are used slightly or not. However, it is generally considered unsatisfactory to isolate species based on their ability to use one carbohydrate. Such differences are caused by single gene mutations and are sometimes thought of only as strains.

S.올리바세우스 균주 NCIB8138, NCIB8509, ATCC21549, ATCC12019 및 ATCC3335에 의한 설탕 이용의 차이는 많은 권위자가 이들을 종의 의미로 생각하지 않도록 하는 것이다. 따라서 ATCC21379, 21380, 21381, 21382 및 31126는 적당히 표시된 S.올리바세우스이다.The difference in sugar utilization by the S. olivaseus strains NCIB8138, NCIB8509, ATCC21549, ATCC12019 and ATCC3335 is such that many authorities do not regard them as species. Thus ATCC21379, 21380, 21381, 21382 and 31126 are the appropriately indicated S. olivaseus.

앞으로의 연구에 의해 현재 S.올리바세우스와 S.플보비리디스로 명명된 배양물 사이에 더 중요한 차이점이 발견되지 않는다면 이들은 결국 단일 종으로서 국제적으로 인정될 것이다. 이 경우에는 정확한 명칭은 우선 법칙에 의해 S.올리바세우스가 될 것이며, 이것은 또한 휘틀러에 의해 S.올리바세우스와 동일하다고 열거된 배양물도 포함될 것이다.If further research does not find any more important differences between the cultures currently named S. olivaseus and S. plovivides, they will eventually be recognized internationally as a single species. In this case the correct name would first be S. olivaseus by law, which would also include cultures listed by Whitler as S. olivaseus.

S.올리바세우스 균주의 배양여액과 MM4550(착화합물)을 제조하는 연관된 종들에 대한 검사를 다음과 같이 수행했다 :Tests of the culture filtrate of S. olivaseus strains and the associated species making MM4550 (complex) were performed as follows:

열거된 균주들의 배양여액을 Whatman No. 1 종이조각 위에 20μl로 점찍고, n-부타놀/이소프로파놀/물(7:7:6)내에서 하루밤동안 차거운 곳에서 크로마토그라피시켰다. 다른 세트의 조각에 대해 n-부타놀/빙초산/물(12:3:5)내에서 역시 하루밤동안 차거운 곳에서 크로마토그라피시켰다.The culture filtrate of the listed strains was Whatman No. One piece of paper was spotted at 20 μl and chromatographed overnight in cold n-butanol / isopropanol / water (7: 7: 6). Another set of pieces was chromatographed in a cold place for one night in n-butanol / glacial acetic acid / water (12: 3: 5).

부분적으로 정제된 MM4550(착화합물)의 샘플을 또한 동시에 두개의 시스템에서 크로마토그라피시켰다.Samples of partially purified MM4550 (complex) were also chromatographed in two systems simultaneously.

또는 정제된 양조물 25ml를 디클로로메탄내의 0.2% 세틸벤질 암모늄 클로라이드 12.5ml로 추출하고 상을 분리한 다음, 유기층에 요드화나토륨 용액(0.5%) 2.5ml를 가하고 진탕시킨 후, 다시 상을 분리하여 수성층을 박층 크로마토그라피 조각 위에 5μ씩 점찍어 n-부타놀/이소프로파놀/물(7:7:6)으로 전개시킴으로서 크로마토그라피시켰다.Alternatively, 25 ml of purified brew was extracted with 12.5 ml of 0.2% cetylbenzyl ammonium chloride in dichloromethane, and the phases were separated. 2.5 ml of sodium iodide solution (0.5%) was added to the organic layer, followed by shaking. The aqueous layer was chromatographed by spreading 5 μl on thin chromatography pieces with n-butanol / isopropanol / water (7: 7: 6).

스트렙토마이세스 올리바세우스 및 연관유기체는 다음과 같은 주요 특성을 갖고 있다.Streptomyces olivasus and related organisms have the following main characteristics:

(a) 그들은 갈색 또는 황색계염의 포자를 형성하는 호기성 균사체를 갖고 있다.(a) They have aerobic mycelium that forms spores of brown or yellow salts.

(b) 그들은 랙스트(rexti) 탄성 또는 나선형의 포자형태이다.(b) They are in the form of rexti elastic or helical spores.

(c) 그들은 매끄러운 표면을 가진 포자를 갖고 있다.(c) They have spores with smooth surfaces.

(d) 그들은 멜라닌을 생성치 않는다.(d) They do not produce melanin.

전기한 특성을 갖고 있는 속(屬)들은 표 5-9에 있는 것들을 포함한다.Genus having the above characteristics include those in Table 5-9.

[표 5] 배양물 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 폴보비리디스 및 이와 연관된 종의 MM4550(착화합물)을 생성하는 능력TABLE 5 Ability to produce MM4550 (complex) of cultures Streptomyces olibaceus, Streptomyces polboviridis and related species

(스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC21549, ATCC12019 및 ATCC3335는 MM4550(착화합물)을 생성하지 않았고, ATCC15863은 또한 RIA660으로 표시되었다.(Streptomyces Olivaseus ATCC21549, ATCC12019 and ATCC3335 did not produce MM4550 (complex) and ATCC15863 was also designated RIA660.

[표 6] 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 플보비리디스 및 이와 연관된 종-ISP 매질상에서 14일간 성장 시킨 후 성숙한 포자형성의 호기성 균사체의 색갈 및 형태TABLE 6 Color and morphology of aerobic mycelium of mature sporulation after 14 days of growth on Streptomyces olibaceus, Streptomyces plovividis and related species-ISP media

SS=무기염-전분아가(ISP 매질 4)SS = Inorganic Salt-Starch (ISP Medium 4)

YM=효모추출물-맥아추출아가(ISP 매질 2)YM = yeast extract-malt extract agar (ISP medium 2)

GA=글리세롤-아스파라긴 아가(ISP 매질 5)GA = glycerol-asparagine agar (ISP medium 5)

OM=오트밀 아가(ISP 매질 3)OM = Oatmeal Baby (ISP Medium 3)

RF=파형상(波形狀)RF = wave form

RA=RetinaculiapertiRA = Retinaculiaperti

S=Spirales(나선상)S = Spirales

[표 7] 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 플보비리디스 및 이와 연관된 종-반대쪽에서 본 기질본사체의 색갈TABLE 7 Streptomyces Olivaseus, Streptomyces Plboviridis and Associated Species-Opposite Seed Colors

[표 8] 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 플보비리디스 및 이와 연관된 총-배양매질 내에서의 색소의 생성TABLE 8 Generation of pigments in Streptomyces olibaceus, Streptomyces flavoridis and related total-culture media

+=색소가 생성됨.+ = Color is generated.

-=색소가 생성되지 않음.-= No pigment is generated.

* 펩톤-효모-철 아가(ISP 6), 타이로신 아가(ISP 17) 및 트립톤-효모액(ISP 1) 상에서 시험함.* Tested on peptone-yeast-iron agar (ISP 6), tyrosine agar (ISP 17) and tryptone-yeast liquor (ISP 1).

[표 9] 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 플보비리디스 및 이와 연관된 종-탄소이용 시험Table 9 Streptomyces olibaceus, Streptomyces flavoridis and related species-carbon utilization tests

+는 화합물이 이용된 것을 표시하고,+ Indicates that the compound was used,

-는 화합물이 이용되지 않은 것을 표시하며,-Indicates that no compound is used,

+는 이용이 확실치 않거나 또는 매우 불량한 것을 표시한다.The + indicates that the use is unclear or very poor.

[실시예 3]Example 3

MM13902를 제조하는 바람직한 분리 공정Preferred Separation Process to Prepare MM13902

S.올리바세우스 ATCC31126의 포자원액을 20℃ 온도에서 데시컨트가 있는 밀폐된 용기내에 있는 건조토양의 튜브내에 저장함으로서 보존했다.The stock solution of S. olivaseus ATCC31126 was preserved by storing it in a tube of dry soil in a closed container with desiccant at a temperature of 20 ° C.

소량의 토양(약 20mg)을 다음의 매질 100ml를 포함하는 500ml 용량의 엘렌마이어 플라스크에 방부적으로 옮겼다.A small amount of soil (about 20 mg) was preservatively transferred to a 500 ml Elenmeyer flask containing 100 ml of the following medium.

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

글루코오즈 모노하이드레이트 20.0Glucose Monohydrate 20.0

콩가루 10.0Soy flour 10.0

탈이온수 1ℓ까지Up to 1ℓ of deionized water

pH는 살균하기 전에 6.5로 조절했다.pH was adjusted to 6.5 before sterilization.

콩가루는 영국 멘체스터시 올드 스트라포드, 브리티시 아카디주식회사에 의해 공급되는 Arkasoy 50이었다.Soy flour was Arkasoy 50, supplied by British Old City of Stratford, Manchester City.

플라스크를 회전진탕기(240r.p.m) 상에서 28℃에서 약 30시간동안 방치시켰다.The flask was left on a rotary shaker (240r.p.m) at 28 ° C. for about 30 hours.

다음에 생성된 성장물 2ml를 룩스병내의 고체 아가사면을 접종시키는데 사용했다.Next, 2 ml of the resulting growth was used to inoculate solid agar slope in Lux disease.

아가매질은 다음과 같은 조성을 가졌다.The agar medium had the following composition.

성 분 양Amount

V-8 식물쥬스 20.0mlV-8 Plant Juice 20.0ml

아 가 20.0gBaby with 20.0 g

탈이온수 1ℓ까지Up to 1ℓ of deionized water

살균하기 전에 pH를 6.0으로 조절했다.The pH was adjusted to 6.0 before sterilization.

(V-8쥬스는 영국 노포크 킹스린캠프 벨스 수프 주식회사로 부터 얻을 수 있다.)(V-8 juice can be obtained from Norfolk King's Lynn Camp Bell's Soup Co., Ltd.)

병을 흔들어서 접종물질을 아가상에 분산시킨 다음 30℃에서 수직으로 배양시켰다.The bottle was shaken to disperse the inoculum on agar and incubated vertically at 30 ° C.

2일 후 병내의 과잉액체를 피펫으로 제거하고 4일간 더 배양시켰다.After 2 days, the excess liquid in the bottle was removed by pipette and incubated for 4 more days.

룩스병 배양물의 이 제법이 채택되는 경우에는 사면 배양에서 방선균 파지의 성장이 능가한다는 것이 이미 발견되었다.It has already been found that the growth of actinomycetes phages in slope cultures is superior when this method of Lux disease culture is adopted.

0.02% Tween 80을 포함하는 살균된 탈이온스 50ml를 룩스병 배양물에 가하고 진탕시켜 포자를 현탁시켰다. 다음에 포자현탁액을 100ℓ 용량의 스테인레스강철 발효기 내의 살균된 종자매질 75ℓ에 접종물로서 가했다. 종자 매질의 조성은 다음과 같았다.50 ml of sterile deione containing 0.02% Tween 80 was added to Lux bottle culture and shaken to suspend spores. The spore suspension was then added as an inoculum to 75 liters of sterile seed medium in a 100 liter stainless steel fermenter. The composition of the seed medium was as follows.

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

콩가루(Arkasoy 50) 10.0Soy flour (Arkasoy 50) 10.0

글로코오즈 모노하이드레이트 20.0Glocose Monohydrate 20.0

수도물 1ℓ까지Tap water up to 1ℓ

기포를 억제하기위해 살균하기 전에 콩기름 내의 10% v/v 'pluronic 81' 50ml를 발효매질에 가했다.50 ml of 10% v / v 'pluronic 81' in soybean oil was added to the fermentation medium prior to sterilization to suppress bubbles.

매질을 발효기내에서 120℃에서 20분간 증기로 살균했다. 종자 배양물을 7.5인치 직경의 날개 달린 원판 교반기로 140rpm으로 교반하고 끝이 열린 스파거를 통해 75ℓ/min 살균공기를 공급했다.The medium was sterilized with steam at 120 ° C. for 20 minutes in the fermentor. The seed culture was stirred at 140 rpm with a 7.5 inch diameter winged disc stirrer and fed 75 L / min sterilization air through an open sparger.

온도를 28℃로 조절하고 이 조건하에서 48시간동안 배양시킨 후 용기의 내용물을 2,000ℓ 용량의 스테인레스강철제 발효기내의 살균 발효매질 1,500ℓ에 접종물로서 가했다.After the temperature was adjusted to 28 ° C. and incubated for 48 hours under these conditions, the contents of the vessel were added as inoculum to 1,500 l of the sterile fermentation medium in a 2,000 L stainless steel fermentor.

발효매질은 다음과 같은 조성을 가졌다.The fermentation medium had the following composition.

성 분 양(g/ℓ)Component amount (g / ℓ)

콩가루(Arkasoy 50) 10.0Soy flour (Arkasoy 50) 10.0

글루코오즈 모노하이드레이트 20.0Glucose Monohydrate 20.0

백악(침전된 탄산칼슘) 0.2Chalk (precipitated calcium carbonate) 0.2

염화 코발트(COCl₂·6H₂O) 0.001Cobalt Chloride (COCl ₂ · 6H ₂ O) 0.001

황산나토륨(무수) 1.0Natorium Sulfate (anhydrous) 1.0

수도물 1,500까지Tap water up to 1,500

살균하기전에 수산화나트륨으로 pH를 6.0으로 조절했다. 기포를 방지하기 위해 살균하기 전에 콩기름내의 10% 'pluronic L81' 3ℓ를 가했다.The pH was adjusted to 6.0 with sodium hydroxide before sterilization. To prevent bubbles, 3 l of 10% 'pluronic L81' in soybean oil was added before sterilization.

살균한 후 살균 수산화나토륨용액으로 pH를 다시 7.0으로 조절했다. 발효액을 106r.p.m으로 교반하고, 교반기축을 2개의 19인치 직경의 원판 날개바퀴에 끼웠다. 온도를 30℃로 조절하고 1,200ℓ/min으로 공기 유입시켰다. 60시간 후 발효액을 원심분리에 의해 정제했다.After sterilization, the pH was adjusted to 7.0 again with sterile sodium hydroxide solution. The fermentation broth was stirred at 106 r.p.m and the stirrer shaft was fitted to two 19 inch diameter disc vanes. The temperature was adjusted to 30 ° C. and air was introduced at 1,200 L / min. After 60 hours the fermentation broth was purified by centrifugation.

상기한 바와 같이 제조된 물질은 340단위/ml의 활성을 나타냈다. 분석은 설명 2에서 기술한 바와 같이 수행했다.The material prepared as described above showed an activity of 340 units / ml. The analysis was performed as described in Description 2.

10℃와 pH8에서 배양여액(1,050ℓ; 340단위/ml)을 두개의 액체를 혼합기를 통해 예정된 유입속으로 덤핑함으로서 세틸디메틸벤질 암모늄클로라이드(1,200g)을 포함하는 디클로로메탄(310ℓ)으로 추출했다.The culture filtrate (1,050 L; 340 units / ml) was extracted with dichloromethane (310 L) containing cetyldimethylbenzyl ammonium chloride (1,200 g) at 10 ° C. and pH 8 by dumping two liquids through the mixer at a predetermined flow rate. .

약 2분간 혼합된 샤플스 연속원심분리기내에서 층을 분리했다. 디클로로메탄층(300ℓ)을 수성 요드화나토륨으로 다시 추출했다. 재추출은 요드화나토륨 210g을 포함하는 물 7ℓ를 사용하여 4배취로 수행했다. 층은 중력에 의해 분리되었다. 수성층을 염산으로 pH 7.7-7.0으로 조절한 후 여과했다. 요드화나토륨 추출액(7ℓ)은 21,900단위/ml를 포함했다.The layers were separated in a mixed Chapels centrifuge for about 2 minutes. The dichloromethane layer (300 L) was extracted again with aqueous sodium iodide. Reextraction was carried out in four batches using 7 L of water containing 210 g of sodium iodide. The layers were separated by gravity. The aqueous layer was adjusted to pH 7.7-7.0 with hydrochloric acid and then filtered. Nathium iodide extract (7 L) contained 21,900 units / ml.

염화나토륨(0.3M)을 포함하는 pH7의 포스페이트 완충액(0.05M) 내의 QAE 세파덱스 A25(파마시아사제품로부터 얻음)를 10cm 직경의 유리칼럼에 40cm 높이까지 채워 이온교환 칼럼을 제조했다. 5℃에서 요드화나토륨 추출액(7ℓ)을 QAE 세파덱스를 통해 50ml/min으로 여과했다.An ion exchange column was prepared by filling a 10 cm diameter glass column up to 40 cm high with QAE Sephadex A25 (obtained from Pharmacia) in a phosphate buffer (0.05 M) at pH 7 containing sodium chloride (0.3 M). Nathium iodide extract (7 L) was filtered through QAE Sephadex at 50 ml / min at 5 ° C.

칼럼을 0.05M포스페이트 완충액(pH7) 내의 0.7M NaCl로 5℃에서 25ml/min의 유동속도로 용출시켰다. 2ℓ의 용출액을 버리고 90부분들(100ml)을 모았다. 부분들을 U.V.분광광도계에서 주사시키고, 약 305mm에서 최대흡수치를 나타내는 부분들을 합쳐 pH7로 조절했다(50-62부분, 합친 부피 1,440ml, 7,100단위/ml).The column was eluted with 0.7 M NaCl in 0.05 M phosphate buffer (pH 7) at 5 ° C. at a flow rate of 25 ml / min. 2 liters of eluate was discarded and 90 portions (100 ml) were collected. Portions were injected on a U.V. spectrophotometer and the pH adjusted to pH 7 combined portions showing maximum absorption at about 305 mm (50-62 portions, combined volume 1,440 ml, 7,100 units / ml).

이 영역에서 최대치를 갖는 부분들은 MM13902를 포함한다는 것이 이미 알려졌다.It is already known that the parts with the maximums in this area include MM13902.

염화나토륨(5g/100ml)을 합친 부분들에 가한 다음, 엠버라이트 XAD 4수지(롬 엔드 하스 주식회사에 의해 공급됨)로 30cm 높이까지 채워진 6.3cm 직경의 칼럼을 통해 5℃에서 20ml/min의 유동속도로 여과했다. 이 조건하에서 MM13902는 수지에 흡수되었으나 무기불순물은 흡수되지 않았다.Nathium chloride (5 g / 100 ml) was added to the combined portions and then 20 ml / min at 5 ° C. through a 6.3 cm diameter column filled up to 30 cm with Amberlite XAD 4 resin (supplied by Rohm End Haas Co.). Filtration at flow rate. Under these conditions, MM13902 was absorbed into the resin but not inorganic impurities.

항생제를 실온에서 증류수(200ml)와 50% 수성메타놀로 용출시켰다. 용출액을 감압하에 30℃이하에서 70ml가 되도록 증발시킨 다음 pH7까지 조절하고 동결시킨 결과 갈색고체(1.62g)가 얻어졌으며, 이것은 3,700단위/mg의 활성도를 갖는 MM13902의 부분적으로 정제된 염이었다.Antibiotics were eluted with distilled water (200 ml) and 50% aqueous methanol at room temperature. The eluate was evaporated to 70 ml at below 30 ° C. under reduced pressure, then adjusted to pH 7 and frozen to yield a brown solid (1.62 g), which was a partially purified salt of MM13902 with an activity of 3,700 units / mg.

부분적으로 정제된 MM13902 디소디움염(1.0g, 3,700단위/mg)을 셀룰로오즈(3.8cm×30cm, 화트만 CC31 셀룰로오즈) 상에서 n-프로파놀/물(4:1v/v)로 2.5ml/min의 유동속도로 용출시켰다.Partially purified MM13902 disodium salt (1.0 g, 3,700 units / mg) was added 2.5 ml / min of n-propanol / water (4: 1 v / v) on cellulose (3.8 cm × 30 cm, Whiteman CC31 cellulose). Eluted at flow rate.

170ml의 용출액을 버리고 100×15ml부분들을 모았다. UV흡수에 의해 결정된 MM13902 디소디움염(NOS.37-43)을 포함하는 부분들을 합쳐(89ml), 감압하에 30℃ 이하에서 증발시켜 n-프로파놀을 제거하고 동결건조시킨 결과, 7,300단위/mg의 활성도를 갖는 노랑색 분말(219mg)이 생성되었다.170 ml of eluate was discarded and 100 × 15 ml portions were collected. The portions containing MM13902 disodium salt (NOS.37-43) determined by UV absorption (89 ml) were combined and evaporated to below 30 ° C. under reduced pressure to remove n-propanol and lyophilized, 7,300 units / mg. A yellow powder (219 mg) having an activity of was produced.

상기 물질은 약 3.08nm에서 UV 최대흡수치를 나타냈으며

는 약 343이었다.The material exhibited a UV maximum absorption at about 3.08 nm.

Was about 343.

이 물질은 각각 그림 1과 2에서 나타낸 i.r. 및 n.m.r.스펙트럼을 가졌다. 이 물질의 항균활성은 표 10에 나타나 있다. 이 물질의 원소분석은 이것이 질소, 유황 및 나토륨을 대략 2:2:2의 비율로 포함한다는것을 나타냈다. 디소디움 MM13902에 대한 원형 2색성커브의 양성 및 음성 최대치는 Cary-61기록 분광 편광개에서 0.37mg/ml의 농도에서 1cm의 경로길이에서 측정되었으며 결과는 다음과 같다.These substances are shown in i.r. And the n.m.r. spectrum. The antimicrobial activity of this material is shown in Table 10. Elemental analysis of this material indicated that it contained nitrogen, sulfur and nathium in a ratio of approximately 2: 2: 2. The positive and negative maximum of the circular dichroic curve for the disodium MM13902 was measured at a path length of 1 cm at a concentration of 0.37 mg / ml in the Cary-61 recording spectropolarizer and the results are as follows.

λ(nm) △E/mλ (nm) ΔE / m

186 +67.24×10^-4 186 + 67.24 × 10 ^-4

221 -67.24×10^-4 221 -67.24 × 10^-4

286 -3.3×10^-4 286 -3.3 × 10^-4

323 -8.2×10^-4 323 -8.2 × 10 ^-4

[표 4] MM13902의 디소디움염의 항균활성(미세적성방법-중 접종물, 1/100 하루밤동안의 발효액)Table 4 Antimicrobial activity of disodium salts of MM13902 (microinoculation method-inoculum, 1/100 overnight fermentation broth)

Claims (1)

본문에 상술한 바와 같이, MM13902를 생성하는 스트렙토마이세스(Streptomyces olivaceus ATCC21379, 21380, 21381, 21382, 31126등) 균주를 배양한 다음 배양액으로 부터 MM13902 또는 그의 염을 회수함을 특징으로 하는 항생물질 MM13902 및 그의 염의 제조방법.As described above, the antibiotic MM13902 characterized by culturing a strain of Streptomyces olivaceus ATCC21379, 21380, 21381, 21382, 31126, which produces MM13902, and recovering MM13902 or its salts from the culture. And methods for preparing the salts thereof.

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