KR20240103104A - 형광 단백질 발현을 이용한 Cas9 과발현 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 고추 식물체 - Google Patents

형광 단백질 발현을 이용한 Cas9 과발현 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 고추 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광단백질과 Cas9을 동시 발현하는 고추 식물체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GFP 발현을 이용한 스크리닝 효율 향상으로 Cas9 과발현 고추(Capsicum annuum L.) 형질전환체를 제조한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 Cas9 과발현 고추 식물체는 가이드(guide) RNA를 발현하는 바이러스 벡터를 인위적으로 접종하여 유전자 기능분석 및 유전자교정체 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 형광표지된 Cas9 발현 재조합 벡터는 형질전환이 어려운 작물의 형질전환체 선발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

형광 단백질 발현을 이용한 Cas9 과발현 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 고추 식물체{Method for producing Cas9-overexpressing pepper plant using fluorescent protein expression and pepper plant simultaneously expressing fluorescent protein and Cas9 produced by the same method}
본 발명은 형광 단백질 발현을 이용한 Cas9 과발현 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 고추 식물체에 관한 것이다.
고추(Capsicum annuum L.)는 전 세계적으로 가장 중요한 채소 중 하나이며, 고추의 90% 이상이 노지에서 재배되고 있어 생육기간 동안 가뭄 등의 기후환경변화에 취약하다. 과거부터 고추의 전통적 및 분자 육종 도구를 통해 많은 품종이 개발되었으나 다양한 환경변화에 적응하는 고추 품종을 만들기 위해서는 GMO 개발 기술이나 유전자교정 기술이 필요하다. 이를 위해선 형질전환 시스템을 동반해야 하지만 고추의 형질전환 자체는 매우 어렵기 때문에 이를 해결하려는 다양한 시도가 필요한 실정이다. 고추의 형질전환 방법은 아그로박테리움을 매개한 유전적 형질전환(genetic transformation)에 의한 성공사례가 있지만 이러한 형질전환 방법으로는 형질전환된 개체를 선발하는 비율이 매우 낮아서 캘러스 단계부터 형질전환된 개체를 스크리닝하는 방법이 요구된다. 또한 유전자교정 개체를 확보하는데 Cas9 (CRISPR-associated protein 9) 유전자와 특정 gRNA (guide RNA)를 포함한 벡터로 한 종류의 형질전환체를 확보하는 것보다 Cas9 유전자가 삽입되어 발현되는 고추에 매번 서로 다른 gRNA를 바이러스 벡터를 이용하여 타겟할 경우, 훨씬 다양한 유전자교정 개체를 만들 수 있는 장점이 있다.
한편, 한국공개특허 제2021-0039306호에는 'CRISPR/Cas9과 gRNA 개별 발현 형질전환 식물체를 이용한 유전자 편집 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2004-0084876호에는 '고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '형광 단백질 발현을 이용한 Cas9 과발현 고추 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 고추 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명에서는 아그로박테리움에 의해 형질전환 되기 어려운 고추(Capsicum annuum L.)로 부터 일관된 유전자 형질전환 효율을 확보하고자 하였다. 형질전환이 안되면 유전자교정 식물체의 개발이 불가능하기 때문에, 형질전환 고추를 개발하는 시스템을 구축하고자 하였다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 형광표지(eGFP 또는 mGFP5-ER)를 포함하는 두 종류의 식물 형질전환 벡터를 구축하고, 이를 이용하여 고추의 형질전환 효율을 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명의 방법을 통하여 Cas9 단백질을 상시 발현하는 GM 고추를 개발하고자 하였으며, 상기 고추 식물체를 이용하여 가뭄내성과 관련된 표적 유전자를 교정한 고추 식물체를 개발하고자 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질 코딩 서열을 포함하는 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체에 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA)를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형광 단백질 및 Cas9 동시 발현 형질전환 고추 식물체를 이용하면 아그로박테리움 형질전환 기반 유전자교정을 통한 고추 육종 유전자원의 다양성 확보가 가능하고, 빠르고 정확한 정밀육종이 가능하여 치열한 종자산업에서 주도권을 확보할 수 있으며, 신육종재료 및 형질 특허 확보를 통한 기술이전 및 로열티를 기대할 수 있을 것이다.
도 1은 GFP와 Cas9을 동시에 발현하는 식물 형질전환용 바이너리(binary) 벡터의 구조를 보여준다. LB: T-DNA left border, NLS: nuclear localization signal, Cas9: Plant-codon optimized spCas9, E2A: 2A self-cleaving peptide, eGFP: enhanced green fluorescent protein, CaMV 35S-P: Cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promoter, 35S-T: CaMV 35S terminator, PcUbi-P: parsley ubiquitin promoter, mGFP5: mutations green fluorescent protein 5-ER, NOS-T: Nopaline synthase terminator, RB: T-DNA right border.
도 2는 고추 원형질체 분리 후 PEG 매개로 도 1의 식물 형질전환용 바이너리(binary) 벡터를 도입하여 정상발현이 되는지, 각 벡터 내 조성된 GFP가 발현되는지 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 3은 두 종류의 식물 형질전환용 바이너리 벡터로 형질전환된 고추 캘러스의 GFP 발현 차이를 형광 해부현미경에서 보여준다. mGF5-ER은 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터를 의미하고, Cas9-2A-eGFP는 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터를 의미한다.
도 4는 아그로박테리움 매개 형질전환으로 유도된 다수의 항생제 저항성 고추 캘러스 중에서 GFP 형광 발현을 확인한 것으로, GFP 형광 유무에 의해 잠정적 형질전환 캘러스(putatively transformed callus)를 선발할 수 있었다.
도 5는 고추 T0 형질전환체에서 벡터의 T-DNA 도입을 검증하기 위해 수행한 PCR 결과이다.
도 6은 고추 T0 형질전환체에서 Cas9 단백질 발현을 검증하기 위해 수행한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 7은 고추 T0 형질전환체의 화기에서 GFP의 발현을 확인한 것이다.
도 8은 고추 T1 종자에서 GFP의 발현을 확인한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질 코딩 서열을 포함하는 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
또한, 본 발명에서 용어, "벡터(vector)"란 유전자를 운반할 수 있고, 박테리아 세포 내에서 복제가 가능하며, 진핵세포내에서 유전자 발현을 가능하게 하는 원형의 DNA 구조체이다. 특정 염기서열만 인식, 절단하는 제한효소 인식 서열(multiple cloning site)를 가지고 있어, 유전자 또는 인위적인 합성서열을 삽입할 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리아인공염색체 벡터, 효모인공염색체 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터(recombinant vector)"란 다양한 벡터에 표적 유전자를 삽입하고 원하는 숙주세포에서 표적 유전자를 발현할 수 있도록 제작된 벡터로서, 삽입된 유전자의 발현을 가능하게 하는 필수적인 조절요소를 포함하고 있는 유전자 작제물을 말한다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV (Cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터 또는 파슬리 유비퀴틴 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 제오신(블레오마이신), 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카베니실린(carbenicillin), 카나마이신(kanamycin), 파로모마이신(paromomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 (CRISPR-associated protein 9) 또는 이의 기능적 유사체일 수 있고, 바람직하게는 Cas9일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 코딩 서열은 식물 코돈에 최적화된 것일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 코돈 최적화된 Cas9 코딩 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (green fluorescent protein) 또는 이의 변형체일 수 있고, 보다 구체적으로는, eGFP 또는 mGFP5-ER (mutations green fluorescent protein 5-ER, GenBank: U87974.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 재조합 벡터는 엔도뉴클레아제와 형광 단백질의 코딩 서열을 단일 발현 카세트에 포함하거나, 별개의 발현 카세트에 각각 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "발현 카세트(expression cassette)"는 목적 단백질 또는 목적 서열 생산을 위해 목적 단백질 또는 목적 서열을 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미하는 것으로, 발현 카세트는 하기의 세 가지 주요한 요소를 포함한다: i) 프로모터; ⅱ) 상기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 해당 발현 카세트가 세포 내로 도입되는 경우 상기 프로모터에 의해 그 전사가 지시되는 것인 목적 단백질 코딩 서열 또는 발현시키고자 하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 전사의 종료를 지시하고 상기 목적 단백질 코딩 서열 또는 발현시키고자 하는 폴리뉴클레오티드의 바로 하류에 위치하는 종결자(terminator) 폴리뉴클레오티드(전사종결인자라고도 함).
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는, 순차적으로 CaMV 35S 프로모터; 엔도뉴클레아제 코딩 서열; 핵 위치 신호(nuclear localization signal, NLS) 코딩 서열; 2A 펩티드 코딩 서열; 형광 단백질 코딩 서열 및 CaMV 35S 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 재조합 벡터에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9일 수 있으며, 형광 단백질은 eGFP일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 NLS 서열로 인해 본 발명의 재조합 벡터에서 발현되는 엔도뉴클레아제 단백질은 세포질에서 발현된 후 핵 안으로 이동하게 된다. 본 발명에 따른 NLS 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 2A 펩티드는 말 비염 A 바이러스(equine rhinitis A virus) 유래 E2A, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 18 유래 F2A, 돼지 테스코바이러스-1(porcine teschovirus-1) 유래 P2A, 또는 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus) 유래 T2A일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 E2A일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 재조합 벡터는 형광단백질 코딩 서열의 카복시 말단과 형광 단백질 코딩 서열 사이에 2A 펩티드 코딩 서열을 포함하고 있어, 동일한 CaMV 35S 프로모터의 조절에 의해 발현 유도되는 엔도뉴클레아제(Cas9)와 형광 단백질(eGFP)이 발현 후 서로 분리될 수 있다(도 1).
본 발명의 또 다른 예에 따른 재조합 벡터는, 순차적으로 파슬리 유비퀴틴 프로모터; 엔도뉴클레아제 코딩 서열; 핵 위치 신호(NLS) 코딩 서열; 및 CaMV 35S 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트 1, 및 순차적으로 CaMV 35S 프로모터; 형광 단백질 코딩 서열; 및 NOS 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트 2를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 발현 카세트 1은 인접한 유전자의 전사를 촉진하는 인핸서(enhancer) 기능을 가지는 애기장대 유래 ADH (alcohol dehydrogenase) 유전자의 5' UTR (untranslated region) 서열을 유비퀴틴 프로모터 서열 하류에 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 파슬리 유비퀴틴 프로모터는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, ADH 유전자의 5' UTR 서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터, 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질은 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포는 형광 단백질 발현을 통해 선별할 수 있는 것이 특징이다. 본 발명의 재조합 벡터는 형광 단백질 발현 카세트를 포함하고 있어, 재조합 벡터가 형질전환된 식물세포는 형광 단백질의 발현에 따른 형광을 나타내므로, 형광 유무를 확인하여 쉽게 형질전환된 식물세포를 선발할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 식물체 및 형질전환된 종자에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질은 전술한 것과 같다.
본 발명의 형질전환 식물체는 이에 한정하지 않으나, 바람직하게는 고추(Capsicum annuum L.)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 고추 식물체는 파슬리 유비퀴틴 프로모터 및 애기장대 유래 ADH 유전자의 5' UTR 서열에 의해 발현이 유도되는 Cas9을 발현하는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체는 가이드 RNA를 발현하는 별개의 벡터를 인위적으로 접종하여 유전자 기능분석 또는 유전자교정체 개발에 활용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 엔도뉴클레아제 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체에 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA)를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "가이드 RNA"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~20bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 유전체교정 식물체의 재조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA (guide RNA)를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 도입은 가이드 RNA를 발현하는 바이러스 벡터를 인위적으로 접종하여 도입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GFP와 Cas9를 동시 발현하는 식물 형질전환용 바이너리(binary) 벡터 제작
Cas9과 GFP를 동시에 발현하는 바이너리 벡터는 pCambia 또는 pBin 벡터를 이용하여 제작하였으며, pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 및 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST로 명명되었다(도 1).
본 발명의 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터는 pECO301 벡터(카이스트 분양)와 pBAtC 벡터(accession number: KU213970)를 변형시켜서 제작하였다. 보다 구체적으로는, HpaI과 PmeI 제한효소 자리를 가진 pCas9의 카복시 말단 부분과 eGFP 서열 사이에 E2A 코딩 서열을 가진 프라이머로 PCR을 이용해 서열 증폭 후 infusion cloning 방식으로 도입하여 35SP-pCas9+E2A+eGFP-35ST 발현 카세트를 제작하였다. 한편 pCambia 벡터의 카나마이신 유전자를 PCR로 증폭하여 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터의 NsiI 사이트에 도입하여 최종벡터의 선발 항생제를 카나마이신으로 변경하였다.
pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터제작용 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') 서열번호
Inf-GFP_F1 CCATCTAAGTACGTTAACTTTCT 6
EGFP_Cas9_R2 cggGAAGACCTGCCCGCTTCCGAATTCAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGATCAGC 7
Inf-2A_EGFP_F2 CAGTGCACCAACTACGCCCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAACCCCGGCCCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 8
V3-EGFP_MluI(R) CGCACGCGTtcaCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 9
inf-EGFP_MluI-F GACGAGCTGTACAAGtgaACGCGTGCGATTAATTAACACCCA 10
Inf-GFP_R3 AAACACTGATAGTTTAAACTGAA 11
pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터는 pECO301 벡터에서 기존 35S 프로모터를 제거하기 위해 EcoRI과 XbaI 제한효소를 사용하였고 파슬리 유비퀴틴(PcUbi) 프로모터 서열과 애기장대 ADH (alcohol dehydrogenase) 유전자 유래의 5' UTR 서열을 기반으로 결합된 DNA 주형을 합성하고 양쪽에 EcoRI과 XbaI 제한효소 서열이 부가된 프라이머로 증폭한 후 벡터에 클로닝하여 PcUbiP-pCas9-35S T 발현 카세트를 제작하였다. 이를 제한효소 HindⅢ 서열이 부가된 프라이머로 PCR 증폭한 후 완성된 pBIN19-mGFP5ER 벡터 HindⅢ 사이트에 도입하여 최종 벡터를 완성하였다.
pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터제작용 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') 서열번호
pCas9-XbaI-F TGTACAAAAAAGCAGGCTTCtctagactagcaacgattgtacaa 12
pCas9-XbaI/EcoRI-R ATAGAGTACTTCTTATCCATTCTAGAtatcaacagtgaagaacttg 13
01_inf-pBIN19-PcUbi-HindⅢ-F GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCTAGCAACGATTGTACAATT 14
03_inf-pCas9+35S-T-R CTGGGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTTGCAGGTCACTGGATTTTGG 15
실시예 2. 제작된 형질전환용 벡터의 검증
상기 실시예 1에서 구축한 2종의 바이너리 벡터를 고추 원형질체에 형질도입한 후 GFP의 발현 유무를 형광 현미경에서 확인하였다. 고추 원형질체는 C15 고추 계통(농우바이오)의 발아된 유식물체 자엽으로부터 분리하여 사용하였으며, 유 등(Nat. Protoc. (2007) 2;1565-1572)의 방법을 참고하고 일부 변형하여 고추 원형질체를 분리하고 PEG 방식으로 제작된 재조합 벡터의 원형질체 도입을 실시하였다.
보다 상세히 기술하면 고추 원형질체를 분리하기 위해, 고추 C15 계통의 종자를 70% 에탄올, 0.4% 하이포클로라이트(hypochlorite) 용액에서 15분 동안 멸균한 뒤, 증류수로 3회 세척하고, 2% 수크로스를 함유하는 1/2 MS 고형배지에서 발아시킨 후 배양하였다. 배양은 생장실에서 16시간 명(150 μmol/m2 s), 8시간 암 조건으로 25℃에서 수행하였다. 페트리 디쉬에 배양 9일째의 고추 자엽을 잘게 자르고 어두운 상태로 25℃에서 6시간 동안 15 ㎖의 효소 용액[CPW; 2% VCP (Viscozyme, Celluclast, PectinEX 2:1:1), 0.45 M 마니톨, 20 mM MES (pH 5.7)]과 함께 40 rpm으로 교반하면서 반응시켜 세포벽을 분해한 다음, 동량의 W5 용액(2 mM MES (pH 5.7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 및 5 mM KCl)으로 희석시켰다. 상기 효소 처리된 혼합물을 50 ㎛ 매쉬로 여과시키고, 원형바닥 튜브에서 100 g로 5분 동안 원심분리하여 원형질체를 회수하였다. 0.45 M CPW 용액으로 재현탁된 원형질체를 CPW 21S 용액(21%(w/v) 수크로스 함유 CPW 용액, pH 5.8)에 띄워 정제하고, 80 g로 7분 동안 원심분리하였다. 정제된 원형질체를 W5 용액으로 세척한 뒤 70 g로 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 만들었다. 마지막으로, 원형질체를 W5 용액에 재현탁하고, 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 원형질체의 수를 계수하였다.
분리된 1 × 105개의 고추 원형질체 혼합물을 200 ㎕ MMG 용액(4 mM MES (pH 5.7) containing 0.4 M mannitol and 15 mM MgCl2)에 재현탁시키고 실시예 1에서 구축한 벡터 DNA 20~30 ㎍을 첨가한 다음 220 ㎕의 새로 제조한 PEG 용액(40%(w/v) PEG 4000; Sigma No. 95904, 0.2 M 마니톨 및 0.1 M CaCl2)과 조심스럽게 혼합한 뒤, 암(dark) 조건의 25℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후, 950 ㎕의 W5 용액을 천천히 첨가하였다. 그 다음 튜브를 뒤집으면서 상기 용액을 잘 혼합하였다. 그 다음 100 g에서 3분 동안 원심분리하여 원형질체의 펠렛을 만들고, 1 ㎖의 W5 또는 WI 용액(0.5 M 마니톨, 20 mM KCl 및 4 mM MES, pH 5.7)에 조심스럽게 재현탁시켰다. 마지막으로, 상기 원형질체를 멀티-웰 플레이트로 옮기고, 암 조건의 25℃에서 24 내지 48시간 동안 반응시킨 후 형광 현미경(EVOS® FL Cell Imaging System)으로 원형질체에서 GFP의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 또는 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터가 도입된 원형질체에서 GFP 형광이 확인되었다.
실시예 3. 고추 형질전환 식물체의 제조
실시예 1에서 구축한 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 또는 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터를 이용하여 고추 형질전환 식물체를 제조하였다.
3-1. 절편체의 준비 및 전 배양
고추 C15 계통(농우바이오)을 실험에 사용하였다. 종자의 표면을 95% 에탄올로 30초 동안 소독한 후, 다시 50% 표백제로 10분 동안 소독하였다. 이후, 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균된 종자들을 1/2 MS 배지에 치상한 후 25℃의 광 조건에서 발아시켰다. 이후, 발아 8~10일차의 식물체로부터 자엽과 하배축을 절제하고 이를 절편체로 사용하였다. 절편체들을 칼로 상처낸 후, 전 배양 배지 PM-A에 치상하여 2~6일간 22~28℃의 광 조건에서 배양하였다.
3-2. 아그로박테리움과 공동 배양
pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 또는 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터를 아그로박테리움 EHA105 균주에 도입하였다, 형질전환된 아그로박테리움을 50 ㎎/ℓ 카나마이신(kanamycin), 50 ㎎/ℓ 리팜피신(rifampicin) 및 100 μM 아세토시린곤(acetosyringone)을 포함하는 YEP 배지에서 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후, MS 기본 배지로 OD600 값이 0.3~0.5가 되도록 희석하였다. 배양 현탁액을 100 μM 아세토시린곤과 100 μM DTT (Dithiothreitol)을 포함하는 MS 액체 배지(표 3의 CCM 배지)와 혼합한 후, 이를 상기 3-1.에서 전 배양한 절편체에 10~20분간 접종하였다. 이후, 상기 3-1.에서 사용한 전 배양 배지 PM-A에서 48~96시간 동안 광 조건으로 공배양하였다. 아그로박테리움과 공배양한 절편체를 3% 수크로스, 600 ㎎/ℓ 티멘틴(timentin) 및 2 ㎖/ℓ의 PPM (Plant preservation mixture; Plant Cell Technology, USA)을 포함하는 1/2 MS 액체 배지로 3회 세척하였다.
3-3. 캘러스 유도 및 신초(shoot) 형성
형질전환체를 선발하기 위하여 상기 실시예 3-2.에서 아그로박테리움과 공 배양한 절편체를 0.2 ㎎/ℓ 제아틴, 1.0 ㎎/ℓ IAA, 100 ㎎/ℓ 카나마이신, 300 ㎎/ℓ 티멘틴 및 10 μM STS (silver thiosulfate + silver nitrate)를 포함하는 MS 기본 배지(표 3의 Selection-A 배지)에서 4~6주 동안 배양하였다. 배양한 지 4-5주 째에 몇몇 절편체에서는 상처 부위 주변에 캘러스와 유사한 조직이 생기는 것을 관찰할 수가 있었다. 이후, 캘러스에서 신초를 유도하기 위하여 상기 절편체들을 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.05 ㎎/ℓ IAA, 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 300 ㎎/ℓ 티멘틴 및 10 μM STS를 포함하는 MS 기본 배지(표 3의 TSIM 배지)로 옮겨 8~12주 동안 배양하였다. 그 후, 신초 성장을 위해 상기 절편체들을 2 ㎎/ℓ 제아틴, 0.05 ㎎/ℓ IAA, 2 ㎎/ℓ GA3, 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 300 ㎎/ℓ 티멘틴 및 10 μM STS를 포함하는 MS 기본 배지(표 3의 TEM 배지)로 옮겨 2~4주 동안 배양하였다.
3-4. 뿌리 유도 및 토양 순화
신장된 신초를 1 ㎎/ℓ IBA (Indole-3-butyric acid) 및 150 ㎎/ℓ 티멘틴을 포함하는 MS 기본 배지(표 3의 TRIM 배지)에 치상하여 2~4주 동안 발근을 유도하며 배양하였다. 이렇게 발근된 재분화 식물체를 원예용 상토가 든 화분(seedling pot & soil)으로 옮겨 25℃, 16시간의 광 조건 하에서 3~6주 동안 순화하며 배양하였다.
실시예 4. GFP 및 Cas9 동시 발현 고추 형질전환 식물체의 선별
본 발명자는 상기 실시예 3-3.의 과정을 진행하며 형질전환된 고추 캘러스에서 GFP의 발현 여부를 분석하여 잠정적 형질전환 캘러스(putatively transformed callus)를 선발하였다. 간단하게, 배양한 지 4-5주 사이에 확인된 항생제(카나마이신) 저항성 캘러스를 형광 해부현미경으로 관찰하여 GFP 발현 유무를 분석하였다. 그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 항생제 저항성 캘러스 중 GFP 형광을 나타내는 캘러스들이 확인되었고, GFP의 효율(GFP 발현 캘러스/전체 캘러스)은 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터에서 54.45%(153/281), pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터에서 24.92%(78/313)로 나타났다. 이와같은 GFP 발현 캘러스를 선발하는 스크리닝 방법을 통해 형질전환된 캘러스 수를 많이 확보함으로서 재분화 확보 효율을 개선할 수 있었다. 또한, 두 종류의 벡터 중에서 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터의 eGFP보다 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터의 mGFP5-ER이 더 강한 형광을 보여 주고 있어 형질전환 캘러스 구별에 장점이 있음을 알 수 있었다(도 3 및 도 4).
고추 C15 계통을 이용한 형질전환체 효율
Vector 절편체 수 캘러스가
유도된 수		 GFP 발현
캘러스 수		 GFP 발현 캘러스로부터 유도된 신초의 수 생장된
신초의 수		 PCR 양성
plantlet 수
pCAM-35SP 2,666 281/2,666
(10.56%)		 153/281
(54.45%)		 3/153
(1.9%)		 43 38
pBin-35SP 1,545 313/1,545
(20.26%)		 78/313
(24.92%)		 1/78
(1.2%)		 9 9
Total 4,211 594/4,211
(14.11%)		 231/594
(38.89%)		 4/307
(1.30%)		 52 47
pCAM-35SP : pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST
pBin-35SP : pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST
상기 표 4를 통해 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 및 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터를 이용하여 C15 계통을 형질전환하였을 때, 전체 절편체 중에서 GFP가 발현된 캘러스는 각각 5.7%(153/2,666) 및 5.1%(78/1,545)임을 알 수 있다.
실시예 5. 고추 T0 식물체에서 형질전환 검증
본 발명자는 선발된, 화분 정식한 고추 T0 식물체를 대상으로 Cas9 및 GFP를 확인하기 위해 PCR 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. 분석을 위한 시료는 T0 식물체의 잎을 사용하였으며, PCR은 Cas9, GFP 및 벡터 특이적 프라이머 세트를 사용하였고, 웨스턴 블랏은 항-Cas9 항체(Guide-it™ Cas9 Polyclonal Antibody; Clontech Cat. # 632607)를 사용하였으며, PCR 및 웨스턴 블랏 과정은 통상적인 방법을 이용하여 수행하였다.
PCR 프라이머 세트
For pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST
표적 프라이머명 염기서열 (5'→3') 서열번호
pCas9 pCas9 PCR primer C-term-F GAT TGG GAC CCT AAG AAA TAC GG 16
pCas9 PCR primer C-term-R GTA GCA TCG AGC ACT TCT TTG GT 17
eGFP eGFP_check-F TCC TAA GAA GAA GAG GAA GGT TGA 18
eGFP_check-R ATG ATA TAG ACG TTG TGG CTG TTG 19
Vector pC2300_F AGA ATG AAC GCC AAG AGG AA 20
pC2300_R GAC TCA AGA ATG GGC AGC TC 21
For pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST
표적 프라이머명 염기서열 (5'→3') 서열번호
pCas9 pBIN-Cas9#2-F TTC GAT AAG AAC CTT CCA AA 22
pBIN-Cas9#2-R TTG AGC CTT TCT TCA ATC AT 23
mGFP5-ER mgfp5er-#2-F CAA TGC TTT TCA AGA TAC CC 24
mgfp5er-#2-R TGA TAA TGA TCA GCG AGT TG 25
Vector pBIN#2-vector-F GCT GAA ATA GTC GAA CAT CC 26
pBIN#2-vector-R GTC AAC AAG GAC GTG AAG AT 27
PCR 분석 결과, 야생형 대조구와 달리 형질전환 T0 고추 식물체에서는 모두 예상된 크기의 Cas9 및 GFP 산물이 관찰되어, pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 및 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터의 T-DNA가 도입된 형질전환 고추 식물체임이 확인되었다(도 5). 또한, 웨스턴 블랏 결과에서는 5개의 형질전환 T0 고추 식물체 시료 모두에서 Cas9 단백질 발현을 확인할 수 있었다(도 6). pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터로 형질전환된 식물체에서는 약 160 KDa의 Cas9 단백질이 발현되고 있었으며, pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터로 형질전환된 식물체에서는 약 160 KDa의 Cas9 단백질과 일부 분리되지 않은 187 KDa 크기의 Cas9-GFP 단백질이 동시에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, Cas9을 발현하는 고추 T0 식물체의 화기에서도 GFP가 발현되고 있음을 확인할 수 있었고(도 7), pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 벡터보다 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터로 형질전환된 고추 식물체의 화기에서 GFP 발현이 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는 동일한 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되지만, mGFP5 유전자가 소포체(endoplasmic reticulum)로 이동되고 다량 축적되어 식물 조직에서 더 강하게 발현되는 것으로 유추되었다.
실시예 6. 고추 T1 종자에서 형광 단백질의 발현 확인
본 발명자는 T0 식물체를 자가수분하여 T1 종자를 생산하였다. 그 후, 해당 종자에서 형광 단백질의 발현이 확인되지는 현미경으로 분석하였다. 그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 pCAM-35SP-pCas9-2A-eGFP-35ST 또는 pBin-35SP-mGFP5ER-NosT + PcUbiP-pCas9-35ST 벡터로 형질전환된 고추 T1 종자에서 GFP의 발현을 확인할 수 있었다. 비록, 캘러스 또는 T0 식물체의 화기보다 GFP 발현이 다소 약하게 나타났으나, 형광현미경 하에서 mGFP5 발현 종자가 야생형(WT) 종자와 뚜렷하게 구별이 가능하기 때문에 후대 종자에서 T-DNA free 개체를 선별할 수 있음을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질 코딩 서열을 포함하는 식물 형질전환용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 (CRISPR-associated protein 9) 또는 이의 기능적 유사체인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (green fluorescent protein) 또는 이의 변형체인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 엔도뉴클레아제와 형광 단백질의 코딩 서열을 단일 발현 카세트에 포함하거나, 별개의 발현 카세트에 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는, 순차적으로 CaMV 35S 프로모터; 엔도뉴클레아제 코딩 서열; 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 코딩 서열; 2A 펩티드 코딩 서열; 형광 단백질 코딩 서열 및 CaMV 35S 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는, 순차적으로 파슬리 유비퀴틴 프로모터; 엔도뉴클레아제 코딩 서열; 핵 위치 신호 코딩 서열; 및 CaMV 35S 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트 1, 및 순차적으로 CaMV 35S 프로모터; 형광 단백질 코딩 서열; 및 NOS 터미네이터;가 작동가능하게 연결된 발현 카세트 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 발현 카세트 1은 애기장대 유래 ADH (alcohol dehydrogenase) 유전자의 5' UTR (untranslated region) 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 코딩 서열은 식물 코돈에 최적화된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포는 형광 단백질 발현을 통해 선별하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제9항의 방법에 의해 제조된 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 형광 단백질을 동시에 발현하는 형질전환 식물체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물체는 고추(Capsicum annuum L.)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 고추 식물체는 파슬리 유비퀴틴 프로모터 및 애기장대 유래 ADH 유전자의 5' UTR 서열에 의해 발현이 유도되는 Cas9을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  14. 제11항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  15. 제11항에 따른 형질전환 식물체에 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA)를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 유전체 교정 식물체의 제조방법.
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