KR20240099949A - A Novel Use of Macrosphelides from Pseudogymnoascus sp. SF-7351 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Pseudogymnoascus sp. SF-7351 유래 마크로스펠라이드의 신규한 용도에 관한 것으로, 본 발명의 마크로스펠라이드 화합물은 뛰어난 항-신경염증 효과 및 항-산화효과를 나타내어, 염증 및 산화 스트레스에 의한 신경 세포의 손상 및 사멸을 효과적으로 억제하고, 나아가 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to Pseudogymnoascus sp. Regarding the novel use of macrospelide derived from SF-7351, the macrospelide compound of the present invention exhibits excellent anti-neuroinflammatory and anti-oxidative effects, preventing damage and death of nerve cells due to inflammation and oxidative stress. It can be effectively suppressed and further used in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases.
Description
본 발명은 Pseudogymnoascus sp. SF-7351 유래 마크로스펠라이드의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 더욱 자세하게는 남극 진균 균주 Pseudogymnoascus sp. SF-7351에서 분리된 마크로스펠라이드의 신경보호 용도 및 이를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to Pseudogymnoascus sp. SF-7351 relates to novel uses of macrospelides, more specifically, to the Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. It relates to the neuroprotective use of macrospelide isolated from SF-7351 and to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases containing it as an active ingredient.
산화적 스트레스의 손상 및 염증 사이의 연관성은 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있다. 활성 산소(ROS)의 축적은 신경세포의 파괴를 일으키며, 알츠하이머, 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환을 악화시키는 것으로 잘 알려져 있다 (Singh et al. 2019). 염증으로 시작되는 신경퇴행성 질환의 발병기전은 산화 스트레스와 유사한 방식으로 작동한다. 충추신경계(CNS)에서 미세아교세포는 특히 병원체의 침입이나 조직의 손상에 반응하여 주변 성상교세포(astrocytes)와 뉴런에 영향을 미치는 인자들을 생성하여 면역 감시에 능동적인 역할을 수행하고(Tang et al. 2016), 활성화된 미세아교세포는 산화질소(NO), 유도성산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로 옥시게나아제(COX-2)를 포함한 전-염증 매개체(pro-inflammatory mediators)의 분비를 증가시켜 염증 관련 신경 기능 장애를 유발한다. TNF-a 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인은 활성화된 B세포의 NF-κB 경로의 활성화와 연관된다 (Jiang et al. 2021; Wu et al. 2021). 정상적인 조건에서, IκB 단백질은 세포질에 존재하는 NF-κB 이종이량체와 결합된다. 그러나, LPS(lipopolysaccharide)와 같은 다양한 자극은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 IκB 단백질의 분해를 유도한다 (Zhang et al. 2019). 결과적으로 유리된 NF-κB 이종이량체는 핵으로 전위되어 염증 매개체 및 사이토카인의 발현을 유도한다 (Wen et al. 2022). Nrf2(Nuclear factor E2-related factor 2)는 항산화 반응의 조절자로 잘 알려져 있으며, 항산화 효소의 발현을 유도하는 상류 전사 인자이다(Bellezza et al. 2018). NrF2와 결합하여 발현되는 항산화 효소중 HO-1(heme oxygenase-1)은 일산화탄소(CO), 철 및 빌리버딘/빌리루빈(biliverdin/bilirubin)의 분해를 촉매하여 강력한 항산화 및 항-신경염증 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (Ryter et al. 2018). 다양한 연구에서, Nrf2-항산화 신호의 활성화가 NF-κB 매개된 염증반응을 약화시키고, Nrf2/HO-1축의 상향 조절이 활성화된 미세아교세포에서 신경 세포의 사멸을 방지한다고 보고한 바 있다(Subedi et al. 2019; Okorji et al. 2016; Ali et al. 2020). 이러한 관점에서, NF-κB 및 Nrf2/HO-1경로의 조절은 신경염증질환의 치료를 위한 잠재적인 표적으로서 대두되고 있다.The link between oxidative stress damage and inflammation has been implicated in various neurodegenerative diseases. It is well known that accumulation of reactive oxygen species (ROS) causes destruction of nerve cells and worsens neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases (Singh et al. 2019). The pathogenesis of neurodegenerative diseases, which begin with inflammation, operates in a similar way to oxidative stress. In the paravertebral nervous system (CNS), microglia play an active role in immune surveillance by producing factors that affect surrounding astrocytes and neurons, especially in response to pathogen invasion or tissue damage (Tang et al. 2016), activated microglia secrete pro-inflammatory mediators, including nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase (COX-2). This increases inflammation-related neurological dysfunction. Proinflammatory cytokines, such as TNF-a and IL-6, are associated with the activation of the NF-κB pathway in activated B cells (Jiang et al. 2021; Wu et al. 2021). Under normal conditions, IκB proteins are associated with NF-κB heterodimers present in the cytoplasm. However, various stimuli, such as lipopolysaccharide (LPS), induce the degradation of IκB proteins through the ubiquitin-proteasome system (Zhang et al. 2019). As a result, the free NF-κB heterodimer translocates to the nucleus and induces the expression of inflammatory mediators and cytokines (Wen et al. 2022). Nrf2 (Nuclear factor E2-related factor 2) is well known as a regulator of antioxidant responses and is an upstream transcription factor that induces the expression of antioxidant enzymes (Bellezza et al. 2018). Among the antioxidant enzymes expressed in combination with NrF2, HO-1 (heme oxygenase-1) catalyzes the decomposition of carbon monoxide (CO), iron, and biliverdin/bilirubin, producing strong antioxidant and anti-neuroinflammatory effects. It is known to represent (Ryter et al. 2018). Various studies have reported that activation of Nrf2-antioxidant signaling attenuates NF-κB-mediated inflammatory responses and upregulation of the Nrf2/HO-1 axis prevents neuronal death in activated microglia (Subedi et al. 2019;Ali et al. From this perspective, regulation of NF-κB and Nrf2/HO-1 pathways has emerged as a potential target for the treatment of neuroinflammatory diseases.
한편, 극한 환경의 진균(fungi)은 새로운 의약의 개발을 위한 잠재적 원천으로 보고된 바 있다 (Deshmukh et al. 2018). 이에 다양한 진균으로부터, 아미노산, 탄수화물, 알칼로이드, 지질, 폴리케타이드, 펩타이드, 테르페노이드와 같은 수천가지 이상의 다양한 구조를 갖는 화합물이 보고되었으며, 이러한 진균 유래 화합물이 항암, 항균, 항진균, 항바이러스, 항염, 항산화, 항생제 및 세포독성 등과 같은 다양한 효과를 나타낼 수 있음이 보고된 바 있다 (Jin et al. 2016). 이와 같이 극한 환경의 진균이 합성하는 다양한 대사 산물은 그 구조에 따라 다양한 생물학적 활성 및 새로운 용도를 제공하기 때문에, 이에 관한 관심 및 연구과 높아지고 있다. 이러한 관점에서, 최근 진균 대사산물의 항신경염증 효과에 대한 연구가 활발이 진행되고 있다(Ha et al. 2020; Dong et al. 2021; Kim et al. 2021).Meanwhile, fungi in extreme environments have been reported as a potential source for the development of new medicines (Deshmukh et al. 2018). Accordingly, compounds with more than thousands of different structures such as amino acids, carbohydrates, alkaloids, lipids, polyketides, peptides, and terpenoids have been reported from various fungi, and these fungal-derived compounds have anticancer, antibacterial, antifungal, antiviral, and anticancer properties. It has been reported that it can exhibit various effects such as anti-inflammatory, antioxidant, antibiotic, and cytotoxic properties (Jin et al. 2016). As various metabolites synthesized by fungi in extreme environments provide various biological activities and new uses depending on their structures, interest and research on them are increasing. From this perspective, research on the anti-neuroinflammatory effects of fungal metabolites has recently been actively conducted (Ha et al. 2020; Dong et al. 2021; Kim et al. 2021).
천연 마크로라이드 폴리케타이드 그룹(natural macrolide polyketide group)에 속하는 마크로스펠라이드(Macrosphelides)는 1995년 신규한 항암물질로 처음 발견된 바 있다(Hayashi et al. 1995). 마크로스펠라이드는 생체 내에서 항암, 항균 및 면역 억제활성과 같은 다양한 생물학적 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Takamatsu et al. 1996; Ahmed et al. 2009; Tomprefa et al. 2009; Paek 2015). 현재까지 자연계에는 약 13종의 마크로스펠라이드가 존재하는 것으로 보고되었으나, 이들의 신경염증 및 이와 관련한 질환에 대한 보호효과 및 기전은 밝혀진 바 없다.Macrosphelides, belonging to the natural macrolide polyketide group, were first discovered as a new anticancer substance in 1995 (Hayashi et al. 1995). Macrospelides have been reported to exhibit various biological effects in vivo, such as anticancer, antibacterial, and immunosuppressive activities (Takamatsu et al. 1996; Ahmed et al. 2009; Tomprefa et al. 2009; Paek 2015). To date, it has been reported that about 13 types of macrospelids exist in nature, but their protective effects and mechanisms against neuroinflammation and related diseases have not been revealed.
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 신경보호효과를 나타내는 새로운 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 남극 진균 균주 Pseudogymnoascus sp. SF-7351로부터 분리된 신규한 마이크로스펠라이드 2종을 포함하는 5종의 마크로스펠라이드를 분리하고 구조를 규명하였으며, 이러한 5종의 마이크로스펠라이드가 LPS로 유도된 BV2 세포에서 항신경염증성 활성을 갖고 있음을 확인하였다. 나아가, HT22 헤마세포에서 글루타메이트로 유도된 산화스트레스에 대해서도 상기 Pseudogymnoascus sp. SF-7351 유래의 마이크로스펠라이드가 산화 스트레스에 의한 염증에 대해 신경보호 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이에 대한 분자적 메커니즘을 명확히 규명하고 본 발명을 완성하였다.Under this background technology, the present inventors have made diligent efforts to develop a new material that exhibits neuroprotective effects, and as a result, the Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. Five types of macrospherides, including two novel microspherides isolated from SF-7351, were isolated and their structures were identified, and these five types of microspherides exhibited anti-neuroinflammatory activity in LPS-induced BV2 cells. Confirmed that I have it. Furthermore, regarding glutamate-induced oxidative stress in HT22 hema cells, Pseudogymnoascus sp. It was confirmed that microspheride derived from SF-7351 exhibits a neuroprotective effect against inflammation caused by oxidative stress, the molecular mechanism for this was clearly identified, and the present invention was completed.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.The above information described in this background section is only intended to improve understanding of the background of the present invention, and therefore does not include information that constitutes prior art already known to those skilled in the art to which the present invention pertains. It may not be possible.
본 발명의 목적은 Pseudogymnoascus sp. SF-7351에서 분리된 마크로스펠라이드 및 이를 포함하는 신경보호 용도를 제공하는 데 있다.The object of the present invention is Pseudogymnoascus sp. The purpose is to provide macrospelides isolated from SF-7351 and neuroprotective uses containing them.
본 발명의 다른 목적은 상기 마크로스펠라이드의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a use of the macrospelide for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 화학식 I, II, 또는 III의 마크로스펠라이드 화합물 또는 이의 유도체를 제공한다.:To achieve the above object, the present invention provides macrospelide compounds or derivatives thereof of the following formulas (I), (II), or (III):
[화학식 I][Formula I]
상기 화학식 I에서 R1은 알콕시기 또는 수소이고, R2는 히드록시기임,In the formula (I), R1 is an alkoxy group or hydrogen, and R2 is a hydroxy group,
[화학식 II][Formula II]
. .
[화학식 III][Formula III]
, ,
상기 화학식 III 에서 R3는 산소 또는 히드록시기임.In Formula III, R 3 is oxygen or a hydroxy group.
본 발명은 또한, 상기 화학식 I, II, 또는 III의 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항-염증 또는 항산화용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an anti-inflammatory or antioxidant composition comprising a macrospelide compound of formula (I), II, or III, a derivative thereof, or a salt thereof as an active ingredient.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 항-염증 및/또는 항산화 용도를 제공한다.The present invention also provides an anti-inflammatory and/or antioxidant use of the macrospelide compound, a derivative thereof or a salt thereof.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 항-염증 및/또는 항산화용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.The present invention also provides the use of the macrospelide compound, its derivative or its salt for preparing an anti-inflammatory and/or antioxidant composition.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경세포보호 용도를 제공한다.The present invention also provides a use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof for protecting nerve cells.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증 및 산화스트레스에 대한 세포의 보호방법을 제공한다.The present invention also provides a method of protecting cells against inflammation and oxidative stress, comprising administering the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof to a subject.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.The present invention also provides a use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.The present invention also provides the use of the macrospelide compound, its derivative or its salt for preparing a composition for preventing or treating neurodegenerative diseases.
본 발명은 또한, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method of treating neurodegenerative diseases comprising administering the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof to a subject.
본 발명에 따른 마크로스펠라이드 화합물 또는 이의 유도체가 NO, TNF-α, IL-6의 생산 및 iNOS 단백질의 발현을 억제하여 LPS 자극 BV2 미세아교세포에서 NF-κB 경로의 활성 억제를 통해 매개됨을 확인하였으며, 나아가 산화 스트레스에 의한 ROS 생성을 억제 및 신경세포의 사멸 등을 방지할 수 있음을 글루타메이트로 산화 스트레스가 유도된 HT22 해마 신경세포에서 하고, Keap1에 결합 및 Nrf2 발현을 유도에 의한 Nrf-2/HO-1 경로를 활성화를 통해 매개됨을 확인하였다.It was confirmed that the macrospelide compound or derivative thereof according to the present invention inhibits the production of NO, TNF-α, and IL-6 and the expression of iNOS protein, which is mediated through inhibition of the activity of the NF-κB pathway in LPS-stimulated BV2 microglial cells. Furthermore, it was shown in HT22 hippocampal neurons in which oxidative stress was induced by glutamate that it can suppress ROS generation due to oxidative stress and prevent neuronal death, and Nrf-2 by binding to Keap1 and inducing Nrf2 expression. It was confirmed that it was mediated through activation of the /HO-1 pathway.
따라서, 본 발명의 마크로스펠라이드 화합물은 뛰어난 항-신경염증 효과 및 항-산화효과를 나타내어, 염증 및 산화 스트레스에 의한 신경 세포의 손상 및 사멸을 효과적으로 억제하고, 나아가 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the macrospelide compound of the present invention exhibits excellent anti-neuroinflammatory and anti-oxidative effects, effectively suppressing damage and death of nerve cells caused by inflammation and oxidative stress, and further helping in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases. It can be useful.
도 1은 Pseudogymnoascus sp. SF-7351에서 분리된 화합물 1 내지 5의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 화합물 1 및 2의 주요 COSY(-), HMBC(→) 상관관계를 나타낸 것이다.
도 3은 50% 확률 변위 타원체로 나타낸 화합물 1의 분자 구조에 대한 X선 ORTEP plot이다.
도 4는 BV2 세포의 염증 인자에 대한 화합물 1-5의 효과를 나타낸 것이다. 세포 생존율(A)은 세포를 다양한 농도의 화합물 1-5와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 분석을 사용하여 결정되었다. BV2 세포를 표시된 농도의 화합물로 3시간 동안 전처리하고 지질다당류(LPS; 0.5㎍/mL)로 24시간 동안 자극하였다. 그런 다음 LPS로 자극된 BV2 세포에서 아질산염(B), TNF-α(C), IL-6(D) 및 PGE2(E)에 대한 화합물의 효과가 감지되었다. LPS로 자극된 BV2 세포에서 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 단백질 발현 수준(F). 3회의 독립적인 반복 실험의 데이터이다. 밴드 강도는 β-액틴으로 정규화하였다. 막대는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 5는 BV2 세포에서 핵 인자-카파 B(NF-κB) p65 활성화에 대한 화합물 4의 효과. Western blotting은 3시간 동안 표시된 농도의 추출물로 처리하고 1시간 동안 lipopolysaccharide(LPS; 0.5μg/mL)로 자극하여 수행한 결과를 나타낸 것이다(A). 면역블롯은 ImageJ 소프트웨어(B)를 사용하여 정량화되었다. 밴드 강도는 β-액틴의 강도로 정규화되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균이다다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. NF-κB(p65) 단백질(PDIB: 1VKX)에서 화합물 2의 분자 도킹은 키메라 1.15를 사용하여 결정되었고, p65의 잔기에 대한 화합물 4의 공유 결합 포즈가 표시하였다(C). 점선(녹색)은 p65의 결합 포켓에 있는 대표적인 아미노산 잔기 간의 잠재적인 수소 결합 상호작용을 나타낸다.
도 6은 글루타메이트 유도 HT22 해마 세포에 대한 화합물 1-5의 신경 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포 생존율(A)은 HT22 세포를 다양한 농도의 화합물 1-5와 함께 24시간 동안 배양한 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 분석을 사용하여 결정되었다. 그런 다음 세포를 표시된 농도의 화합물로 3시간 동안 전처리하고 글루타메이트(5mM)의 부재 또는 존재 하에 24시간 동안 분석하였다. 세포 생존율(B) 및 ROS(C)에 대한 화합물의 효과가 검출되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균이며, *p < 0.05, ***p < 0.001.
도 7은 BV2 및 HT22 세포에서 헴 옥시게나제(HO)-1 단백질 발현에 대한 화합물 4의 효과를 나타낸 것이다.. HO-1 발현 수준(A 및 B)은 세포를 각 샘플에 대해 표시된 농도에서 코발트 프로토포르피린(CoPP)의 존재 또는 부재 하에 12시간 동안 인큐베이션한 후 웨스턴 블롯팅을 사용하여 결정하였다. 또한, 아질산염 억제(C) 및 ROS 생성(D)에 대한 HO-1 발현의 효과를 조사하였다. 세포를 추출물 단독 또는 SnPP(50μM)로 3시간 동안 전처리한 다음 LPS(1μg/mL) 및 글루타메이트(10mM)로 24시간 동안 자극하였다. 그 후, 아질산염 수준, 세포 생존율 및 ROS를 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에 대한 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대조군과 비교. LPS/글루타메이트 및 화합물 2 처리군과 비교하여 #p < 0.05, ###p < 0.001.
도 8은 BV2 및 HT22 세포에서 핵 인자 E2-관련 인자 2(Nrf2) 발현에 대한 화합물 4의 효과를 나타낸 것이다. Nrf2 발현(A, B)을 측정하기 위해 추출물을 0.5시간, 1시간, 1.5시간 동안 세포에 처리한 후 Cayman 핵 추출 키트를 사용하여 세포질과 핵을 분획하였다. 그 후, 웨스턴 블롯팅을 이용하여 단백질 발현을 결정하였다. 밴드 강도는 β-액틴 또는 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 강도로 정규화하였다(C). 화합물 4와 복합체에서 KEAP1의 가장 잘 예측된 포즈를 나타낸 것이다(D). KEAP1 및 화합물 4와 복합체에서 분자 상호작용 다이어그램 뚜껑과 Ala556 및 Phe577과 같은 화합물 4에서 유지하였다. 또한 Ser602의 백본은 화합물 4(녹색 점선)와 수소 결합하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대조군과 비교.Figure 1 shows Pseudogymnoascus sp. The chemical structures of compounds 1 to 5 isolated from SF-7351 are shown.
Figure 2 shows the main COZY ( - ) and HMBC (→) correlations of compounds 1 and 2.
Figure 3 is an X-ray ORTEP plot of the molecular structure of Compound 1 shown as a 50% probability displacement ellipsoid.
Figure 4 shows the effect of compounds 1-5 on inflammatory factors in BV2 cells. Cell viability (A) was determined by incubating cells with various concentrations of compounds 1-5 for 24 h followed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. It was decided using BV2 cells were pretreated with the indicated concentrations of compounds for 3 h and stimulated with lipopolysaccharide (LPS; 0.5 μg/mL) for 24 h. Then, the effects of the compounds on nitrite (B), TNF-α (C), IL-6 (D) and PGE2 (E) were detected in LPS-stimulated BV2 cells. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in BV2 cells stimulated with LPS (F). This is data from three independent repeated experiments. Band intensity was normalized to β-actin. Bars represent the mean ± standard deviation of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Figure 5: Effect of compound 4 on nuclear factor-kappa B (NF-κB) p65 activation in BV2 cells. Western blotting shows the results of treatment with the extract at the indicated concentration for 3 hours and stimulation with lipopolysaccharide (LPS; 0.5 μg/mL) for 1 hour (A). Immunoblots were quantified using ImageJ software (B). Band intensity was normalized to that of β-actin. Data are the average of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Molecular docking of compound 2 in the NF-κB (p65) protein (PDIB: 1VKX) was determined using Chimera 1.15, and the covalent binding pose of compound 4 to residues of p65 is indicated (C). Dashed lines (green) indicate potential hydrogen bond interactions between representative amino acid residues in the binding pocket of p65.
Figure 6 shows the neuroprotective effect of compounds 1-5 on glutamate-induced HT22 hippocampal cells. Cell viability (A) was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay after culturing HT22 cells with various concentrations of compounds 1-5 for 24 hours. was determined using . Cells were then pretreated for 3 h with the indicated concentrations of compounds and analyzed for 24 h in the absence or presence of glutamate (5 mM). The effects of compounds on cell viability (B) and ROS (C) were detected. Data are the average of three independent experiments, *p < 0.05, ***p < 0.001.
Figure 7 shows the effect of compound 4 on heme oxygenase (HO)-1 protein expression in BV2 and HT22 cells. HO-1 expression levels (A and B) were measured by incubating cells at the indicated concentrations for each sample. Incubation in the presence or absence of cobalt protoporphyrin (CoPP) for 12 hours was followed by determination using Western blotting. Additionally, the effect of HO-1 expression on nitrite inhibition (C) and ROS production (D) was investigated. Cells were pretreated with extract alone or SnPP (50 μM) for 3 h and then stimulated with LPS (1 μg/mL) and glutamate (10 mM) for 24 h. Afterwards, nitrite levels, cell viability and ROS were measured. Data are expressed as mean ± standard deviation for three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to control group. #p < 0.05, ###p < 0.001 compared to LPS/glutamate and Compound 2 treatment groups.
Figure 8 shows the effect of compound 4 on nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) expression in BV2 and HT22 cells. To measure Nrf2 expression (A, B), cells were treated with extracts for 0.5, 1, and 1.5 hours, and cytoplasm and nuclei were fractionated using the Cayman nuclear extraction kit. Afterwards, protein expression was determined using Western blotting. Band intensity was normalized to that of β-actin or proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (C). The best predicted pose of KEAP1 in complex with compound 4 is shown (D). Molecular interaction diagram lid in complex with KEAP1 and compound 4 and maintained in compound 4 as Ala556 and Phe577. Additionally, the backbone of Ser602 was hydrogen bonded with compound 4 (green dotted line). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to control group.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
마크로스펠라이드(Macrosphelide)는 1995년 신규한 항암물질로 처음 발견된 뒤 생체 내에서 항암, 항균 및 면역 억제활성과 같은 다양한 생물학적 효과를 나타내는 것으로 보고되었으며, 현재까지 자연계에는 약 13종의 마크로스펠라이드가 존재하는 것으로 보고되었으나, 이들의 신경세포의 염증 및 산화 스트레스에 의한 손상, 및 이와 관련한 질환에 대한 보호효과 및 기전은 밝혀진 바 없다.Macrosphelide was first discovered as a novel anticancer substance in 1995 and has since been reported to exhibit various biological effects such as anticancer, antibacterial, and immunosuppressive activities in vivo. To date, about 13 types of macrosphelides exist in nature. has been reported to exist, but its protective effect and mechanism against damage caused by inflammation and oxidative stress in nerve cells and diseases related thereto have not been revealed.
본 발명의 일 실시예에서, 남극 진균 균주 Pseudogymnoascus sp. SF-7351로부터 신규한 마크로스펠라이드를 포함하는 5개의 마크로스펠라이드 화합물을 분리하고, 이들의 화학구조를 밝혀 내었다. 상기 남극 진균 균주 Pseudogymnoascus sp. SF-7351로부터 분리된 5개의 마크로스펠라이드 화합물은 미세아교세포의 염증성 반응을 억제하는 뛰어난 항-염증효과가 있음을 확인하였다.In one embodiment of the invention, the Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. Five macrospelide compounds, including a novel macrospelide, were isolated from SF-7351, and their chemical structures were revealed. The Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. It was confirmed that the five macrospelide compounds isolated from SF-7351 have excellent anti-inflammatory effects that inhibit the inflammatory response of microglial cells.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 신규한 마크로스펠라이드(Macrosphelides) 화합물 또는 이의 유도체에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention relates to novel Macrosphelides compounds or derivatives thereof.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 Pseudogymnoascus sp. SF-7351 균주로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrosphelide compound is Pseudogymnoascus sp. It can be characterized as being isolated from the SF-7351 strain.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 하기 화학식 화학식 I, II, 또는 III의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as having the structure of the following formula (I, II, or III):
[화학식 I][Formula I]
[화학식 II] [Formula II]
. .
[화학식 III][Formula III]
, ,
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R1은 알콕시기 또는 수소일 수 있으며, 바람직하게는 알콕시기, 더욱 바람직하게는 메톡시(methoxy)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R1 in the formula (I) may be an alkoxy group or hydrogen, preferably an alkoxy group, and more preferably methoxy.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R2는 히드록시기 또는 수소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 히드록시기(-OH)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R2 in the formula (I) may be a hydroxy group or hydrogen, preferably a hydroxy group (-OH).
본 발명에 있어서, 상기 화학식 III의 R3는 수소, 산소 또는 히드록시기일 수 있으며, 바람직하게는 산소 또는 히드록시기, 더욱 바람직하게는 산소인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R 3 in Formula III may be hydrogen, oxygen, or a hydroxy group, preferably oxygen or a hydroxy group, and more preferably oxygen.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물의 바람직한 예는 아래 화합물 1 내지 화합물 5와 같다:In the present invention, preferred examples of the macrospelide compounds are Compounds 1 to 5 below:
[화합물 1][Compound 1]
, ,
[화합물 2][Compound 2]
. .
[화합물 3][Compound 3]
, ,
[화합물 4][Compound 4]
, 및 , and
[화합물 5][Compound 5]
. .
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 상기 화합물 1 또는 화합물 2인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrospelide compound may be Compound 1 or Compound 2.
당업계의 기술적 상식에 기반하여, 상기 마크로스펠라이드 화합물을 모 화합물로 하여 생성될 수 있는 유도체, 유사체, 이성질체(예, 구조 이성질체, 입체 이성질체, 광학 이성질체, 부분 입체 이성질체 등)가 본 발명의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다 할 것이다.Based on the technical common sense in the art, derivatives, analogs, and isomers (e.g., structural isomers, stereoisomers, optical isomers, diastereomers, etc.) that can be produced using the macrosphelide compound as a parent compound are within the scope of the present invention. It is self-evident that it can be included in .
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 항염증 효과 및/또는 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as having an anti-inflammatory effect and/or an antioxidant effect.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 항염증 및/또는 항산화에 의한 신경보호 효과를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 신경보호 효과는 신경 세포의 아질산염 생성 억제, 염증성 사이토카인(예, TNF -α 및 IL-6 등)의 발현 및/또는 분비 억제, IκB-α의 인산화 억제, p65의 핵 전위 억제, NF-κB 활성화 억제, 산화스트레스에 의한 ROS 생성 억제, HO-1 발현 유도, Nrf2 활성화 및 핵 전위 증가, KEAP1 결합에 의한 NRF2 억제 활성 저해 등의 다양한 메커니즘에 의해 신경 보호 효과를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as having anti-inflammatory and/or anti-oxidant neuroprotective effects. For example, the neuroprotective effect may include inhibition of nitrite production in neurons, inhibition of expression and/or secretion of inflammatory cytokines (e.g., TNF-α and IL-6, etc.), inhibition of phosphorylation of IκB-α, and nuclear translocation of p65. It is characterized as having a neuroprotective effect through various mechanisms such as inhibition of NF-κB activation, inhibition of ROS generation by oxidative stress, induction of HO-1 expression, increase of Nrf2 activation and nuclear translocation, and inhibition of NRF2 inhibitory activity by KEAP1 binding. You can do this.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 남극 진균 균주 Pseudogymnoascus sp. SF-7351로부터 추출 및 분리되었다. In the present invention, the macrosphelide compound is an Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. Extracted and isolated from SF-7351.
따라서, 본 발명은 진균 Aspergillus sp. SF-7351을 배양하여 대사물질을 추출하는 단계; 및 대사물질 중 마크로스펠라이드(Macrosphelides) 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.Therefore, the present invention relates to the fungus Aspergillus sp. Culturing SF-7351 to extract metabolites; And it relates to a method of producing the compound of claim 1, comprising the step of separating macrosphelides compounds from metabolites.
본 발명의 화합물은 기재된 화학식 구조에 기반하여 상기 진균 Aspergillus sp. SF-7351을 사용한 제조 방법 이외의 통상적인 화합물의 화학적 합성 또는 반합성, 생물학적 합성 방법을 제한 없이 사용하여 제조할 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.The compound of the present invention is based on the described chemical structure and is prepared by the fungus Aspergillus sp. It will be obvious to those skilled in the art that the compound can be manufactured using conventional chemical synthesis, semi-synthesis, or biological synthesis methods other than the manufacturing method using SF-7351 without limitation.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 포함하는 항-염증 및/또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.Accordingly, from another aspect, the present invention relates to an anti-inflammatory and/or antioxidant composition comprising a macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 하기 화학식 화학식 I, II, 또는 III의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as having the structure of the following formula (I, II, or III):
[화학식 I][Formula I]
[화학식 II] [Formula II]
. .
[화학식 III][Formula III]
, ,
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R1은 알콕시기 또는 수소일 수 있으며, 바람직하게는 알콕시기, 더욱 바람직하게는 메톡시(methoxy)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R1 in the formula (I) may be an alkoxy group or hydrogen, preferably an alkoxy group, and more preferably methoxy.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R2는 히드록시기 또는 수소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 히드록시기(-OH)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R2 in the formula (I) may be a hydroxy group or hydrogen, preferably a hydroxy group (-OH).
본 발명에 있어서, 상기 화학식 III의 R3는 수소, 산소 또는 히드록시기일 수 있으며, 바람직하게는 산소 또는 히드록시기, 더욱 바람직하게는 산소인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 R3가 산소인 경우, 탄소와 이중결합으로 공유결합된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R 3 in Formula III may be hydrogen, oxygen, or a hydroxy group, preferably oxygen or a hydroxy group, and more preferably oxygen. In the present invention, when R 3 is oxygen, it may be covalently bonded to carbon through a double bond.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물의 바람직한 예는 아래 화합물 1 내지 화합물 5와 같다:In the present invention, preferred examples of the macrospelide compounds are Compounds 1 to 5 below:
[화합물 1][Compound 1]
, ,
[화합물 2][Compound 2]
. .
[화합물 3][Compound 3]
, ,
[화합물 4][Compound 4]
, 및 , and
[화합물 5][Compound 5]
. .
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 마크로스펠라이드 화합물은 상기 화합물 4인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrospelide compound may be preferably Compound 4.
본 발명의 용어 “유도체”는 이의 구조가 모체가 되는 화합물(parent compound)들과 충분히 유사하고 이의 유사성을 기준으로 모체의 화합물과 동일하거나 유사한 활성 및 용도를 나타내는 화합물 또는 이의 전구체를 의미한다. 본 발명에서는 항생 활성 및 항생제 내성 회피능을 갖는 것으로 예상되는 모 화합물(예: 본원에 기재된 화합물, 아미노글리코시드계 항생제)의 구조로부터 유래된 구조를 갖는 화합물을 나타낸다. 예시된 유도체는 모 화합물의 염, 이성질체, 에스테르, 아미드, 에스테르 또는 아미드의 염, N-산화물을 포함한다.The term “derivative” in the present invention refers to a compound or precursor thereof whose structure is sufficiently similar to that of the parent compound and which exhibits the same or similar activity and use as the parent compound based on its similarity. In the present invention, it refers to a compound having a structure derived from the structure of a parent compound (e.g., a compound described herein, an aminoglycoside antibiotic) that is expected to have antibiotic activity and the ability to avoid antibiotic resistance. Illustrative derivatives include salts, isomers, esters, amides, salts of esters or amides, and N-oxides of the parent compounds.
본 발명에 있어서, 상기 “유도체”는 본 발명의 마크로스펠라이드 화합물의 생물학적 및/또는 화학적 변형을 통해 제조될 수 있다. 본 발명의 용어, “화학적 변형(chemical modification)”은 화합물, 효소 등의 관능기 또는 잔기 등에 화학 반응을 통하여, 본래의 화합물, 또는 효소가 갖는 성질을 개변하거나 새로운 특성을 부여하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 화학적 변형은 화학 잔기의 치환, 가수 분해, 다른 화합물의 공유 또는 비공유 결합, 이성질체 형성 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 마크로스펠라이드 화합물의 변형은 본 발명에 화합물 4와 KEAP1의 결합 형태를 기반으로 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 화합물 4의 C-11 및 C-14 위치의 케톤 및 12의 E-geometry가 신경 보호 활성을 발휘하는 주요한 구조적 특징임을 확인하였는 바, 이를 제외한 다른 부위의 잔기 치환 등을 통해 동등 또는 개량된 활성을 갖는 마크로스펠라이드 화합물 유도체를 쉽게 도출할 수 있다.In the present invention, the “derivative” can be produced through biological and/or chemical modification of the macrospelide compound of the present invention. The term “chemical modification” of the present invention refers to modifying the properties of an original compound or enzyme or imparting new properties through a chemical reaction to a functional group or residue of a compound, enzyme, etc. For example, the chemical modification includes, but is not limited to, substitution of chemical residues, hydrolysis, covalent or non-covalent bonding to other compounds, and isomer formation. For example, modification of the macrospelide compound of the present invention can be performed based on the combined form of compound 4 and KEAP1. In an example of the present invention, it was confirmed that the ketone at positions C-11 and C-14 of compound 4 and the E -geometry at position 12 are the main structural features that exert neuroprotective activity, and residue substitutions at other sites other than these were confirmed. Through this, macrospelide compound derivatives with equivalent or improved activity can be easily derived.
본 발명의 용어 “염”은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속염의 부가염을 말하며, 약학 조성물에 사용되는 경우 “약학적으로 허용되는 염”일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다.The term “salt” in the present invention refers to an addition salt of an inorganic acid salt, organic acid salt, or metal salt of a compound, and when used in a pharmaceutical composition, it may be a “pharmaceutically acceptable salt.” The pharmaceutically acceptable salt may be a salt that does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and physical properties of the compound.
본 발명에 있어서, 항-염증 및/또는 항산화용 조성물은 염증 및/또는 산화 스트레스로부터 세포를 보호하기 위해 투여되는 것, 즉 세포보호용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the anti-inflammatory and/or antioxidant composition may be administered to protect cells from inflammation and/or oxidative stress, that is, it may be characterized as a cell protection composition.
본원에서 "염증"이란, 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조식의 증식등이 보여진다.As used herein, “inflammation” is one of the defense responses of biological tissue to certain stimuli, and is a biological defense mechanism that removes damage caused by various harmful stimuli and restores the body to its original state. Stimuli of inflammation include infection, chemical or physical stimulation, and the inflammatory process can be divided into two types: acute and chronic inflammation. Acute inflammation is a short-term reaction lasting within a few days, and plasma components and blood cells are involved in the removal of foreign substances through the microcirculation system. Chronic inflammation lasts for a long time, and proliferation of breakfast is seen.
본 발명에 있어서, 상기 항-염증 및/또는 항산화용 조성물은 염증 또는 산화스트레스로부터 세포의 손상 및/또는 사멸을 예방 또는 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the anti-inflammatory and/or antioxidant composition may be characterized in that it prevents or inhibits cell damage and/or death from inflammation or oxidative stress.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 신경세포는 미세아교세포 또는 해마 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다.In the present invention, the cells may be characterized as nerve cells. For example, the nerve cells may be characterized as microglial cells or hippocampal cells, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the composition may be a pharmaceutical composition or a food composition.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 바람직하게 건강기능성 식품일 수 있으며, 식품 첨가제일 수 있다. 상기 건강기능성 식품 또는 식품 첨가제는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.In the present invention, the food composition may preferably be a health functional food or a food additive. The health functional food or food additive is preferably powder, granule, tablet, capsule or beverage, but is not limited thereto. Examples of the above foods include meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, etc. This includes all foods in the conventional sense.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 항-염증 및/또는 항산화용도에 관한 것이다. From another aspect, the present invention relates to the anti-inflammatory and/or antioxidant use of the macrospelide compound, its derivative or its salt.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 항-염증 및/또는 항산화용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to the use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof for the preparation of an anti-inflammatory and/or antioxidant composition.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경세포보호 용도에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to the use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof to protect nerve cells.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증 및 산화스트레스에 대한 세포(바람직하게는 신경 세포)의 보호방법에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to a method of protecting cells (preferably nerve cells) against inflammation and oxidative stress, comprising administering the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof to a subject.
본 발명의 항-염증 및/또는 항산화용 조성물은 다양한 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 염증 및/또는 산화스트레스에 의해 유발될 수 있는 질환일 수 있다. 보다 바람직한 예를 들어, 상기 질환은 염증성 질환, 예를 들어 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The anti-inflammatory and/or antioxidant composition of the present invention can be used to improve, prevent, or treat various diseases. For example, the disease may be a disease that may be caused by inflammation and/or oxidative stress. More preferably, the disease is an inflammatory disease, such as arthritis, rhinitis, hepatitis, keratitis, gastritis, enteritis, nephritis, bronchitis, pleurisy, peritonitis, spondylitis, pancreatitis, inflammatory pain, urethritis, cystitis, burn inflammation, dermatitis. , may be characterized as being selected from the group consisting of periodontitis, gingivitis, and degenerative neuroinflammation, but is not limited thereto.
산화 스트레스 및 신경염증은 퇴행성 신경 질환의 발명에 중요한 요소이다. 산화 질소(NO)는 LPS 및 다양한 사이토카인에 의해 유도될 수 있는 염증 과정에서의 주요한 매개체이다 (Chianese et al. 2021). NO는 미세 아교세포를 포함한 많은 세포 유형에서 발현된다. 구체적으로, 허혈성(ischemic) 외상성(traumatic), 신경독성(neurotoxic), 또는 염증성(inflammatory) 조건에서, NF-κB가 활성화되며, iNOS를 생성하고 많은 양의 NO를 방출한다. 결과적으로 높은 NO의 농도는 세포막의 구조적 손상을 주고, DNA 전사 및 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있으며, 뉴런에 직접적인 손상을 줄 수 있다(Liu et al. 2020). Oxidative stress and neuroinflammation are important factors in the development of neurodegenerative diseases. Nitric oxide (NO) is a key mediator in inflammatory processes that can be induced by LPS and various cytokines (Chianese et al. 2021). NO is expressed in many cell types, including microglia. Specifically, under ischemic, traumatic, neurotoxic, or inflammatory conditions, NF-κB is activated, produces iNOS, and releases large amounts of NO. As a result, high concentrations of NO can cause structural damage to cell membranes, affect DNA transcription and protein synthesis, and directly damage neurons (Liu et al. 2020).
미세아교세포 (microglia)는 중추 신경계 (CNS: central nervous system)의 면역 방어와 조직 복구에 중요한 역할을 한다. 미세아교세포의 활성화와 이에 의한 신경 염증은 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 역할을 한다.Microglia play an important role in immune defense and tissue repair in the central nervous system (CNS). Activation of microglia and resulting neuroinflammation play an important role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.
글루타메이트 등에 의해 유도될 수 있는 산화 스트레스는 신경 병리학 적 조건에서 신경 세포 사멸의 원인 인자이다. 고농도의 글루타메이트는 산화 스트레스를 유발하여 신경퇴행성 질환에서 신경 세포 사멸에 기여한다(Iovino et al. 2020).Oxidative stress, which can be induced by glutamate and others, is a causative factor in neuronal cell death in neuropathological conditions. High concentrations of glutamate cause oxidative stress and contribute to neuronal cell death in neurodegenerative diseases (Iovino et al. 2020).
이러한 관점에서 최근 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위해 염증 완화 및 산화 스트레스에 대한 사멸 억제 전략이 점점 더 주목을 받고 있다.From this perspective, strategies to alleviate inflammation and suppress apoptosis against oxidative stress have recently received increasing attention for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
본 발명의 마크로스펠라이드 화합물은 미세아교세포의 활성화 및 이에 의한 염증 반응에 대한 뛰어난 억제효과를 나타내며, 나아가 산화 스트레스로 인한 신경세포의 손상 및/사멸 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.It was confirmed that the macrospelide compound of the present invention exhibits an excellent inhibitory effect on the activation of microglial cells and the resulting inflammatory response, and further exhibits an inhibitory effect on damage and/or death of nerve cells due to oxidative stress.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.Accordingly, from another aspect, the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising a macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof.
본 발명에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물은 약학 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the composition for preventing or treating neurodegenerative diseases may be characterized as a pharmaceutical composition.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 하기 화학식 화학식 I, II, 또는 III의 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as having the structure of the following formula (I, II, or III):
[화학식 I][Formula I]
[화학식 II] [Formula II]
. .
[화학식 III][Formula III]
, ,
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R1은 알콕시기 또는 수소일 수 있으며, 바람직하게는 알콕시기, 더욱 바람직하게는 메톡시(methoxy)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R1 in the formula (I) may be an alkoxy group or hydrogen, preferably an alkoxy group, and more preferably methoxy.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 R2는 히드록시기 또는 수소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 히드록시기(-OH)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R2 in the formula (I) may be a hydroxy group or hydrogen, preferably a hydroxy group (-OH).
본 발명에 있어서, 상기 화학식 III의 R3는 수소, 산소 또는 히드록시기일 수 있으며, 바람직하게는 산소 또는 히드록시기, 더욱 바람직하게는 산소인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 R3가 산소인 경우, 탄소와 이중결합으로 공유결합된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, R 3 in Formula III may be hydrogen, oxygen, or a hydroxy group, preferably oxygen or a hydroxy group, and more preferably oxygen. In the present invention, when R 3 is oxygen, it may be covalently bonded to carbon through a double bond.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물의 바람직한 예는 아래 화합물 1 내지 화합물 5와 같다:In the present invention, preferred examples of the macrospelide compounds are Compounds 1 to 5 below:
[화합물 1][Compound 1]
, ,
[화합물 2][Compound 2]
. .
[화합물 3][Compound 3]
, ,
[화합물 4][Compound 4]
, 및 , and
[화합물 5][Compound 5]
. .
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 마크로스펠라이드 화합물은 상기 화합물 4인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrospelide compound may be preferably Compound 4.
일산화질소는 3개의 일산화질소 합성효소(NOS) 아이소폼에 의해 아르기닌으로부터 효소적으로 형성된다. NOS 패밀리의 이소형인 유도성 NOS(iNOS)는 LPS 및 다양한 사이토카인에 의해 유도될 수 있다. iNOS는 미세아교세포를 포함한 많은 세포 유형에서 발현된다. 건강한 뇌에서, 미세아교세포는 iNOS를 발현하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 허혈성, 외상성, 신경독성, 또는 염증성 손상 하에서, 이들은 활성화되어 iNOS를 생성하고, 대량의 NO를 방출한다. 그 후, 세포막 구조는 손상될 수 있고 DNA 전사와 단백질 합성에 영향을 미치며 뉴런에 직접 손상을 준다. NO는 세포 내의 Fe2+ 농도를 변화시킴으로써 신경퇴행을 일으킨다. 따라서, 미세아교세포에서 iNOS의 넉다운은 NO의 생산을 억제하여 CNS 변성을 감소시킨다.Nitric oxide is formed enzymatically from arginine by three nitric oxide synthase (NOS) isoforms. Inducible NOS (iNOS), an isoform of the NOS family, can be induced by LPS and various cytokines. iNOS is expressed in many cell types, including microglia. In a healthy brain, microglia do not express iNOS. Nevertheless, under ischemic, traumatic, neurotoxic, or inflammatory injury, they are activated to produce iNOS and release large amounts of NO. Afterwards, cell membrane structures can be damaged, affecting DNA transcription and protein synthesis, and directly damaging neurons. NO causes neurodegeneration by changing intracellular Fe2+ concentration. Therefore, knockdown of iNOS in microglia reduces CNS degeneration by suppressing NO production.
본 발명의 마크로스펠라이드 화합물은 iNOS의 유도를 현저이 헉제하는 것을 확인하였으며(도 4F), NO의 생산 또한 현저히 억제하였다.It was confirmed that the macrospelide compound of the present invention significantly inhibited the induction of iNOS (Figure 4F), and also significantly inhibited the production of NO.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 TNF-α 및 IL-6와 같이 NF-κB 활성화에 의존하는 전염증성 사이토카인의 발현을 현저히 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the macrosphelide compound can be characterized as significantly inhibiting the expression of pro-inflammatory cytokines dependent on NF-κB activation, such as TNF-α and IL-6.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 NF-κB 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 구체적인 예를 들어 IκB-α의 인산화 및 핵 p65의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the macrosphelide compound may be characterized by inhibiting the NF-κB pathway, and more specifically, may be characterized by inhibiting the phosphorylation of IκB-α and the expression of nuclear p65.
본 발명에 있어서, 상기 마크로스펠라이드 화합물은 산화 스트레스에 의한 세포의 사멸을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 화합물 4의 마크로스펠라이드 화합물은 HT22 세포에서 글루타메이트 유도 세포 손상을 현저히 억제할 수 있음을 확인하였다(도 6). In the present invention, the macrospelide compound may be characterized as inhibiting cell death caused by oxidative stress. In particular, it was confirmed that the macrospelide compound of compound 4 can significantly inhibit glutamate-induced cell damage in HT22 cells (FIG. 6).
또한, Nrf-2/HO-1 경로의 활성화는 신경보호 전략의 중요한 치료 표적이다(Li et al. 2021). HO-1은 산화 스트레스를 포함한 다양한 세포 및 종 의존적 스트레스 요인에 의해 유도되며, HO-1 유전자의 프로모터 영역에서 다중 스트레스 및 항산화 반응 조절 요소를 통해 유전자 전사 수준에서 조절된다. HO-1의 세포 보호 효과는 뉴런에서 입증되었습니다(Zhang et al. 2021). 본 발명의 실시예에서는 상기 마크로스펠라이드 화합물 중 화합물 4가 BV2 및 HT22 세포 모두에서 HO-1 발현을 유도하고(도 7A 및 7B), 본 발명의 화합물 4는 KEAP1 kelch domain에 결합하여 Nrf2 발현을 유도할 수 있으며, Nrf2의 핵 전위를 유의하게 활성화했음을 확인하였다.Additionally, activation of the Nrf-2/HO-1 pathway is an important therapeutic target for neuroprotective strategies (Li et al. 2021). HO-1 is induced by a variety of cell- and species-dependent stressors, including oxidative stress, and is regulated at the gene transcription level through multiple stress and antioxidant response regulatory elements in the promoter region of the HO-1 gene. The cytoprotective effect of HO-1 has been demonstrated in neurons (Zhang et al. 2021). In an example of the present invention, among the macrospellide compounds, compound 4 induces HO-1 expression in both BV2 and HT22 cells (FIGS. 7A and 7B), and compound 4 of the present invention binds to the KEAP1 kelch domain to induce Nrf2 expression. It was confirmed that it could be induced and that the nuclear translocation of Nrf2 was significantly activated.
상기 신경퇴행성 질환은 예를 들어, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 (AD), 뇌졸중, 치매, 근위축증 (MD), 다발성 경화증 (MS), 근위축성측색경화증 (ALS), 낭성 섬유증, 앙겔만(Angelman) 증후군, 리들(Liddle) 증후군, 픽 질환, 파젯 질환, HIV 관련 치매(HAD), 헌팅턴 병, 루게릭 병, 크로이츠펠트 야콥 병, 암 또는 외상 뇌 손상 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The neurodegenerative diseases include, for example, Parkinson's disease, Alzheimer's disease (AD), stroke, dementia, muscular dystrophy (MD), multiple sclerosis (MS), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), cystic fibrosis, and Angelman syndrome. , Liddle syndrome, Pick disease, Paget disease, HIV-related dementia (HAD), Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, cancer, or traumatic brain injury, but are not limited thereto.
본 발명의 조성물에는 투여를 위하여 상기 기재된 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용되는 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균 수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. The composition of the present invention may be prepared to include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration. The pharmaceutically acceptable carrier must be compatible with the active ingredient of the present invention, and may include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or two or more of these ingredients. It can be used by mixing, and other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added as needed.
또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁 액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc. In particular, it is preferable to formulate and provide it in a lyophilized form. To prepare a freeze-dried formulation, methods commonly known in the art to which the present invention pertains may be used, and a stabilizer for freeze-drying may be added. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method disclosed by Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing company, Easton PA).
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따 라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered parenterally, and the dosage varies depending on the patient's weight, age, gender, health status, diet, administration time, method, excretion rate, or severity of the disease. An expert in the technical field can easily determine this.
본 발명에 따른 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. It relates to a method for preventing or treating neurodegenerative diseases, including administration to animals according to the present invention.
상기 동물은 인간, 원숭이 등의 영장류 개， 돼지， 소， 양， 염소, 마우스，래트일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동물은 예를 들어 인간일 수 있다. The animal may be a human, a primate such as a monkey, a dog, a pig, a cow, a sheep, a goat, a mouse, or a rat, but is not limited thereto. The animal may be a human, for example.
상기 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. The method of administering the composition can be determined by an expert in the art based on the patient's symptoms and the severity of the disease.
본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명의 약학 조성물은 CNS (central nervous system)에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 수막공간내 주사 (intrathecal injection)에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered parenterally. The route of administration of the composition according to the present invention is not limited to these, but includes, for example, oral cavity, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual. Alternatively, topical administration is possible. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to the central nervous system (CNS). The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by intrathecal injection.
본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.The dosage of the composition according to the present invention varies depending on the patient's weight, age, gender, health condition, diet, administration time, method, excretion rate, or severity of the disease, and is easily understood by an expert in the art. You can decide. Additionally, the composition of the present invention can be formulated into a suitable dosage form for clinical administration using known techniques.
"용량"은 단일 투여에서, 또는 명시된 기간 동안에 제공된 약제학적 제제의 명시된 양을 의미한다. 용량은 하나, 둘 또는 그 이상의 볼러스 (boluses), 정제, 또는 주사제로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여를 원하는 특정 구현예에서, 원하는 용량은 단일 주사에 의해서 쉽게 수용되지 않는 용적을 필요로 하며, 두 개 또는 그 이상의 주사제를 사용하여 원하는 용량을 달성할 수 있다. 약제는 장시간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 용량은 시간, 일, 주, 또는 개월 당 약제학적 제제의 양으로 언급될 수 있다.“Dose” means a specified amount of pharmaceutical agent given in a single administration or over a specified period of time. Doses may be administered as one, two or more boluses, tablets, or injections. For example, in certain embodiments where subcutaneous administration is desired, the desired dose requires a volume that is not readily accommodated by a single injection, and two or more injections may be used to achieve the desired dose. Medications are administered by infusion over a long period of time or continuously. Dosage may be stated as the amount of pharmaceutical agent per hour, day, week, or month.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to the use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to the use of the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof for preparing a composition for preventing or treating neurodegenerative diseases.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 마크로스펠라이드 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료방법에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to a method of treating neurodegenerative disease comprising administering the macrospelide compound, a derivative thereof, or a salt thereof to a subject.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention should not be construed as limited by these examples.
실시예Example
실시예에서 사용된 재료 및 방법Materials and Methods Used in Examples
1. 일반적 실험방법1. General experimental method
광학적 로테이션 값(optical rotation values)은 Jasco P-2000 디지털 편광계를 사용하여 얻었다. NMR(1D 및 2D)은 JEOL JNM ECP-400 분광계를 사용하여, CDCl3에서 수행되었다(1H의 경우 400MHz, 13C의 경우 100MHz). 화학적 이동은 각각의 잔류 용매 신호에 의해 참조되었다(CDCl3: δH 7.26/δC 77.0). HR-ESI-MS 데이터는 ESI quadrupole time of flight MS/MS system (AB SCIEX Pte., Ltd.)을 사용하여 얻었다. HPLC 분리를 위해 preparative YMC ODS C18 컬럼(21.2 × 150 mm; 5 μm)을 사용한 YOUNGLIN-YL9100 (Young Lin Instrument Co., Ltd.)을 이용하였다. UV 검출은 210nm 및 250nm에서 수행하였다. TLC(Thin layer chromatography) 분석은 Kieselgel 60 F254 and RP-18 F254s상에서 수행되었다. 플래시 컬럼 크로마토그래피는 YMC octadecyl-기능화된 실리카겔(C18, 75 μm)을 사용하여 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 모든 용매는 분석 등급(analytical grade)으로 추가 정제 없이 사용되었다.Optical rotation values were obtained using a Jasco P-2000 digital polarimeter. NMR (1D and 2D) was performed in CDCl 3 using a JEOL JNM ECP-400 spectrometer (400 MHz for 1 H, 100 MHz for 13C). Chemical shifts were referenced by the respective residual solvent signals (CDCl 3 : δH 7.26/δC 77.0). HR-ESI-MS data were obtained using an ESI quadrupole time of flight MS/MS system (AB SCIEX Pte., Ltd.). For HPLC separation, YOUNGLIN-YL9100 (Young Lin Instrument Co., Ltd.) using a preparative YMC ODS C18 column (21.2 × 150 mm; 5 μm) was used. UV detection was performed at 210 nm and 250 nm. Thin layer chromatography (TLC) analysis was performed on Kieselgel 60 F254 and RP-18 F254s. Flash column chromatography was performed using YMC octadecyl-functionalized silica gel (C18, 75 μm). All solvents used in this example were of analytical grade and used without further purification.
2. 진균의 분리 및 발효2. Isolation and fermentation of fungi
Pseudogymnoascus sp. SF-7351은 2017년 1월 25일 남극의 King George Island(62°14′16.26′′S, 58°43′15.32′′ W)에서 수집된 지의류에서 분리되었다. 시료 1g을 멸균해수(10mL)와 혼합하고, 시료의 일부(0.1ml)를 멸균해수를 포함하는 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 스프레드 플레이트 방법으로 처리하고, 플레이트를 25℃에서 14일간 배양하였다. 분리된 균주는 최종 순수 배양물을 얻기 위해 여러번 배양되었으며, 선택된 배양물은 -70℃에서 보관하였다. 진균 균주 SF-7351은 리보솜 RNA(rRNA)유전자 서열을 분석하여 동정하였으며, SF-7351 (MZ267532)의 영역에 대한 GenBank 검색은 Pseudogymnoascus verrucosus (NR111197), P. destructans (NR111838), P. roseus (NR165894), 및 P. appendiculatus (NR137875)에 각각 99.80%, 99.38%, 99.38% 및 97.54% 동일하여 가장 가까운 것으로 나타났다. 따라서, SF-7351 진균 균주는 Pseudogymnoascus sp.로 분류되었다. Pseudogymnoascus sp. SF-7351 was isolated from a lichen collected on King George Island, Antarctica (62°14′16.26′′S, 58°43′15.32′′W) on January 25, 2017. 1 g of the sample was mixed with sterilized seawater (10 mL), a portion of the sample (0.1 ml) was treated by the spread plate method on PDA (potato dextrose agar) medium containing sterilized sea water, and the plate was cultured at 25°C for 14 days. The isolated strain was cultured several times to obtain a final pure culture, and the selected culture was stored at -70°C. Fungal strain SF-7351 was identified by analyzing the ribosomal RNA (rRNA) gene sequence, and a GenBank search for the region of SF-7351 (MZ267532) yielded Pseudogymnoascus verrucosus (NR111197), P. destructans (NR111838), and P. roseus (NR165899). ), and P. appendiculatus (NR137875) were found to be the closest, being 99.80%, 99.38%, 99.38%, and 97.54% identical, respectively. Therefore, the fungal strain SF-7351 was classified as Pseudogymnoascus sp.
3. 화합물 추출 및 분리3. Compound extraction and separation
진균 균주 SF-7351은 20개의 FernBach 플라스크에서 배양하였다. 각 플라스크에는 3% NaCl(w/v)를 포함하는 PDA 배지 300mL가 투입되었다. 플라스크에 진균 균주의 종자 배양액 2mL을 개별 접종하고 25℃에서 14일간 배양하였다. 발효된 배양 배지를 합한 뒤, EtOAc(3L)로 3회 추출하였다. 이 후, 혼합한 EtOAc 추출물을 여과지를 통해 여과하고 증발 건조시켜 SF-7351의 조추출물(crude extract) 6.8g을 수득하였다. 조출물을 RP C18 플래시 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase (RP) C18 flash column chromatography, 4.5 × 30cm)를 사용하여 분획화하고, 20%, 40%, 60%, 80% 및 100% (v/v)의 수(H2O) 중 MeOH의 단계적 구배로 용리하여 SF7351-1 내지 SF7351-5의 5개의 하위분획을 수득하였다.Fungal strain SF-7351 was cultured in 20 FernBach flasks. 300 mL of PDA medium containing 3% NaCl (w/v) was added to each flask. 2 mL of seed culture of the fungal strain was individually inoculated into the flask and cultured at 25°C for 14 days. The fermented culture media were combined and extracted three times with EtOAc (3L). Afterwards, the mixed EtOAc extract was filtered through filter paper and evaporated to dryness to obtain 6.8 g of crude extract of SF-7351. The crude product was fractionated using reversed-phase (RP) C18 flash column chromatography (4.5 × 30 cm) and 20%, 40%, 60%, 80% and 100% (v/v). ), five subfractions of SF7351-1 to SF7351-5 were obtained by eluting with a stepwise gradient of MeOH in water (H 2 O).
분획 SF7351-3(3.9g)를 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(3 x 35cm)로 화합물 3 및 10개의 하위 분획(SF7351-3-1 내지 SF7351-3-10)을 수득하였다. 하위분획 SF7351-3-1(828.0mg)을 RP C18 컬럼(1.2 x 30cm)을 사용하여 크로마토그래피를 수행한 뒤, 수(H2O) 중 MeOH(1/1; 2/1; 1/3 (v/v))를 사용하여 더 작은 하위분획 5개(SF7351-3-1-1 내지 SF7351-3-1-5) 및 화합물 4(300/5mg)를 수득하였다. 하위분획 SF7351-3-1-4(28.0mg)은 C18 prep HPLC [30%-70% CH3CN in H2O (0.1% HCOOH), over 40 min]를 사용하여 추가로 분리하여 화합물 2를 수득하였다(2.1mg, tR = 15 min). 최종적으로 화합물 1(10.2 mg, tR = 23.0 min) 및 5(12.2 mg, tR = 23.2 min)를 RP C18 분취용 HPLC [(30%-70% MeOH in H2O (0.1% HCOOH, over 60 min]를 사용하여 SF7351-3-1-5 (350 mg)로부터 분리하였다. Fraction SF7351-3 (3.9 g) was subjected to column chromatography (3 x 35 cm) using silica gel to obtain compound 3 and 10 subfractions (SF7351-3-1 to SF7351-3-10). Subfraction SF7351-3-1 (828.0 mg) was chromatographed using an RP C18 column ( 1.2 (v/v)) was used to obtain five smaller subfractions (SF7351-3-1-1 to SF7351-3-1-5) and compound 4 (300/5 mg). Subfraction SF7351-3-1-4 (28.0 mg) was further separated using C18 prep HPLC [30%-70% CH3CN in H2O (0.1% HCOOH), over 40 min] to obtain compound 2 (2.1 mg, tR = 15 min). Finally, compounds 1 (10.2 mg, tR = 23.0 min) and 5 (12.2 mg, tR = 23.2 min) were analyzed using RP C18 preparative HPLC [(30%-70% MeOH in H2O (0.1% HCOOH, over 60 min)]. It was isolated from SF7351-3-1-5 (350 mg).
화합물 1 내지 5의 화학식은 도 1과 같다.The chemical formulas of compounds 1 to 5 are shown in Figure 1.
EpiEpi -Macrosphelide J (화합물 1):-Macrosphelide J (Compound 1):
Macrosphelide N (화합물 2): Macrosphelide N (Compound 2) :
Macrosphelide A (화합물 3): Macrosphelide A (Compound 3) :
Macrosphelide B (화합물 4): Macrosphelide B (Compound 4) :
Macrosphelide J (화합물 5): Macrosphelide J (Compound 5) :
4. NMR 화학 이동 계산4. NMR chemical shift calculations
DFT 셋팅(B3-LYP functional/M3 grid size), 기하 최적화 셋팅(energy 10-6 hartree, gradient norm |dE/dxyz| = 10-3 hartree/bohr) 및 모든 원자에 대한 기본 세트 def-SV(P)를 갖는 Tmolex 4.2를 사용하여 형태학적 검색을 수행하였다(Lee et al. 2020). NMR 차폐 상수(NMR shielding constant) 계산은 이론의 DFT B3LYP/def-SV(P) 레벨에서 최적화된 바닥-상태 형상(optimized ground-state geometries)에 대해 수행하였다. 화학적 이동값은 아래 방정식을 사용하여 계산하였다(Smith et al. 2010). DFT settings (B3-LYP functional/M3 grid size), geometric optimization settings (energy 10 -6 hartree, gradient norm |d E /d xyz | = 10 -3 hartree/bohr) and basis set def-SV for all atoms. Morphological search was performed using Tmolex 4.2 with (P) (Lee et al. 2020). NMR shielding constant calculations were performed for optimized ground-state geometries at the DFT B3LYP/def-SV(P) level of theory. Chemical shift values were calculated using the equation below (Smith et al. 2010).
여기서, 는 핵 χ에 대한 계산된 NMR 화학적 이동이며, here, is the calculated NMR chemical shift for the nucleus χ,
는 DFT B3LYP/def-SV(P) 기본 세트를 사용하여 계산된 TMS의 양성자(proton) 및 탄소에 대한 차폐 텐서(shielding tensor)임. is the shielding tensor for the proton and carbon of TMS calculated using the DFT B3LYP/def-SV(P) basis set.
최적화된 구조의 계산된 NMR 특성은 각각의 볼트만 모집단(Boltzmann populations)에 기초하여 평균화하였으며, DP4+ 확률 분석의 계산은 Grimblat et al. 2015에서 제공된 Excel 시트(DP4+)를 사용하여 수행하였다.The calculated NMR properties of the optimized structures were averaged based on each Boltzmann population, and the calculation of DP4+ probability analysis was performed according to Grimblat et al. This was performed using the Excel sheet (DP4+) provided in 2015.
5. 결정 구조 분석5. Crystal structure analysis
상온(RT)의 MeOH에서 화합물 1의 무색 결정을 얻었다. IμS micro-focus sealed tube Cu Kα (λ = 1.54178 ) 방사선 소스가 장착된 Bruker D8 Venture 회절계를 사용하여 X-선 결정학 분석에 적합한 결정을 선택하였다. APEX3 소프트웨어와 PHOTON III M14 검출기를 사용하여 253K에서 데이터를 수집하였다. Bruker SADABS를 사용하여 등가 반사에 기반한 반-실험적 흡수 보정(Semi-empirical absorption corrections)을 적용하였다. 결정 구조는 직접 방법(direct method)을 사용하여 해석하였으며, SHELXL-2014 컴퓨터 프로그램을 사용하여 풀 매트릭스 최소 자승법(full-matrix least-squares refinement)으로 정제(refine)되었다. 모든 비수소원자의 위치는 이방성 변위 계수(anisotropic displacement factors)를 사용하여 정제(refine) 되었다. 모든 수소원자는 라이딩 모델(riding model)을 사용하여 배치되었으며, SHELXL-2014에서 적절한 명령을 사용하여 이들의 모원자에 대해 위치를 제한(constrained)하였다. Hooft 매개변수 y는 0.07(8)이었으며, PLATON을 사용하여 계산하였다. 분자 그래픽은 ORTEP-3을 사용하여 컴퓨팅하였다. 화합물 1의 결정학적 데이터는 Cambridge Crystallographic Data Center(기탁 번호: CCDC 2093914)에 기탁하였다. 데이터 사본은 CCDC, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK [fax: + 44(0)-1233-336033 or e-mail: [email protected]]에 신청하여 무료로 제공받을 수 있다.Colorless crystals of Compound 1 were obtained in MeOH at room temperature (RT). IμS micro-focus sealed tube Cu Kα (λ = 1.54178 ) Crystals suitable for X-ray crystallographic analysis were selected using a Bruker D8 Venture diffractometer equipped with a radiation source. Data were collected at 253K using APEX3 software and a PHOTON III M14 detector. Semi-empirical absorption corrections based on equivalent reflection were applied using Bruker SADABS. The crystal structure was analyzed using the direct method and refined by full-matrix least-squares refinement using the SHELXL-2014 computer program. The positions of all non-hydrogen atoms were refined using anisotropic displacement factors. All hydrogen atoms were placed using a riding model and their positions were constrained to their parent atoms using appropriate commands in SHELXL-2014. The Hooft parameter y was 0.07(8) and was calculated using PLATON. Molecular graphics were computed using ORTEP-3. The crystallographic data of compound 1 were deposited at the Cambridge Crystallographic Data Center (accession number: CCDC 2093914). Copies of the data can be obtained free of charge by contacting CCDC, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK [fax: + 44(0)-1233-336033 or e-mail: [email protected]] .
화합물 1의 결정학적 데이터:Crystallographic data of compound 1:
C17H24O9, M = 372.36, 0.351 Х 0.317 Х 0.115 mm3, orthorhombic, space group was P212121, a = 10.9453(9) , b = 11.1868(9) , c = 15.4777(13) , α = = γ = 90°, V = 1895.1(3) 3, Z = 4, T = 253(2) K, D calcd = 1.305 Mg/m3, μ(Cu Kα) = 0.903 mm-1, 및 F(000) = 792.0. 4.878° < 2θ < 77.307°범위에서 총 20577개의 반사가 수집되었으며, 3861개의 독립반사(R int = 0.0872)가 포함됨. 최종 R 1 값은 0.0574 (I > 2σ(I))임. 최종 wR(F 2) 값은 0.1485 (I > 2σ(I))임. 최종 R 1 값은 0.0612 임(모든 데이터). 최종 wR(F 2) 값은 0.1502 임 (모든 데이터 포인트). F 2 -에 대한 적합도(goodness-of-fit)는 1.242임. Flack parameter = 0.02(11)를 사용하여 절대 배치가 결정됨.C 17 H 24 O 9 , M = 372.36, 0.351 Х 0.317 Х 0.115 mm 3 , orthorhombic, space group was P 2 1 2 1 2 1 , a = 10.9453(9) , b = 11.1868(9) , c = 15.4777(13) , α = = γ = 90°, V = 1895.1(3) 3 , Z = 4, T = 253(2) K, D calcd = 1.305 Mg/m 3 , μ (Cu Kα) = 0.903 mm -1 , and F (000) = 792.0. A total of 20577 reflections were collected in the range 4.878° < 2θ < 77.307°, including 3861 independent reflections ( R int = 0.0872). The final R 1 value is 0.0574 ( I > 2σ( I )). The final wR ( F 2 ) value is 0.1485 ( I > 2σ( I )). Final R 1 value is 0.0612 (all data). Final wR ( F2 ) value is 0.1502 (all data points). The goodness-of-fit for F 2 - is 1.242. Absolute placement was determined using Flack parameter = 0.02 (11).
6. 세포 배양 및 세포 생존율6. Cell culture and cell viability
BV2 세포를 1% 항생제(페니실린-스트렙토마이신) 및 10% 열-불활성화 fetal bovine serum을 함유한 RPMI1640에서 37℃, 가습된 5% CO2 및 95% 공기(air)에서 배양하였다. HT22 세포는 BV2 세포와 동일한 성분으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 유지하였다. MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 방법을 사용하여 세포 생존율에 대한 화합물 1 내지 화합물 5의 효과를 측정하였다.BV2 cells were cultured in RPMI1640 containing 1% antibiotic (penicillin-streptomycin) and 10% heat-inactivated fetal bovine serum at 37°C in humidified 5% CO 2 and 95% air. HT22 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with the same components as BV2 cells. The effect of Compounds 1 to 5 on cell viability was measured using the MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) method.
MTT 방법: MTT (5 mg/mL) 를 각 세포 현탁액 MTT(5 mg/mL)를 각 세포 현탁액 (1 Х 105 cells/mL) 에 첨가하여, 4시간동안 포르마잔을 형성하였다. 형성된 포르마잔을 디메틸 설폭사이드에 용해시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다.MTT method: MTT (5 mg/mL) was added to each cell suspension MTT (5 mg/mL) was added to each cell suspension (1 Х 10 5 cells/mL) to form formazan for 4 hours. The formed formazan was dissolved in dimethyl sulfoxide and the absorbance was measured at 540 nm.
7. 아질산염(NO) 수준 측정7. Measuring nitrite (NO) levels
아질산염 수준은 BV2 세포에서 NO 분비의 지표로 평가하였다. 세포 배양액과 Griess 시약을 같은 부피로 혼합하여 반응시킨 후 570 nm에서 아질산염 수준을 측정하였다(Lee et al. 2022).Nitrite levels were assessed as an indicator of NO secretion in BV2 cells. After mixing equal volumes of cell culture medium and Griess reagent and reacting, the nitrite level was measured at 570 nm (Lee et al. 2022).
8. PGE2 수준의 측정8. Measurement of PGE2 levels
PGE2 수준은 당업계에 공지된 통상적 방법에 따라 특정 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다(Lee et al. 2022).PGE2 levels were measured using a specific ELISA kit according to routine methods known in the art (Lee et al. 2022).
9. IL-6 및 TNF-α 수준의 측정9. Measurement of IL-6 and TNF-α levels
IL-6 및 TNF-α의 수준은 제조업체의 지침에 따라 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 배지에서 수집된 상등액에서 측정하였다(Lee et al. 2022).The levels of IL-6 and TNF-α were measured in supernatants collected from the medium using a cytokine ELISA kit according to the manufacturer's instructions (Lee et al. 2022).
10. 웨스턴 블롯 분석10. Western blot analysis
총 30μg의 세포 용해물 단백질을 10-12% SDS-PAGE 젤에 로딩하고 분해된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 막을 5% 탈지유(TBST에서 제조)에서 2.5시간 동안 인큐베이션하고 표적 단백질에 대한 1차 항체(1:1000)와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 막을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)에 접합된 2차 항체(1:5000)를 사용하여 1차 항체를 결합시켰다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 강도를 정량화하였다.A total of 30 μg of cell lysate protein was loaded on a 10-12% SDS-PAGE gel, and the resolved proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. Membranes were incubated in 5% skim milk (from TBST) for 2.5 h and further incubated with primary antibodies against target proteins (1:1000). The membrane was washed to remove unbound antibodies, and the primary antibody was bound using a secondary antibody (1:5000) conjugated to horseradish peroxidase. Optical intensity was quantified using ImageJ software.
11. 핵 및 세포질 분획의 추출11. Extraction of nuclear and cytoplasmic fractions
핵 추출 키트(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 세포질 및 핵 분획을 분리하였다. 각 추출 분획은 프로토콜에 따라 용해시켰다.Cytoplasmic and nuclear fractions were separated using a nuclear extraction kit (Cayman, Ann Arbor, MI, USA). Each extracted fraction was dissolved according to the protocol.
12. HT22 세포에서 ROS 수준의 결정12. Determination of ROS levels in HT22 cells
HT22 세포를 6-웰 플레이트(1 x 105 cells/mL)에서 배양하고 다양한 농도의 마크로스펠라이드 화합물(화합물 4)로 3시간 동안 전처리하였다. 세포를 글루타메이트(5mM)로 8시간 동안 처리하고, 배지를 제거하고, 세포에 인산염 완충 식염수(PBS) 중 10μM DCFH-DA를 로딩하였다. 그 후, 플레이트를 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후 형광현미경(Nikon Ti-S Eclipse; Melville, NY, USA)을 이용하여 영상을 획득하였다.HT22 cells were cultured in 6-well plates (1 x 105 cells/mL) and pretreated with various concentrations of macrospelide compound (compound 4) for 3 hours. Cells were treated with glutamate (5mM) for 8 h, medium was removed, and cells were loaded with 10 μM DCFH-DA in phosphate-buffered saline (PBS). The plate was then incubated at 37°C for 20 minutes. After washing with PBS, images were acquired using a fluorescence microscope (Nikon Ti-S Eclipse; Melville, NY, USA).
13. 통계 분석13. Statistical analysis
데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 표현된다. 중앙 집중식 분산 분석과 이어지는 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 세 그룹을 비교했다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 5.01(GraphPad Software Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 수행하였다.Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. The three groups were compared using centralized analysis of variance followed by Tukey's multiple comparison test. Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism software version 5.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
14. p65 및 Keap1 단백질의 분자 도킹14. Molecular docking of p65 and Keap1 proteins
KEAP1 단백질에 대한 화합물 4의 가능한 결합 포즈를 예측하기 위해 Autodock Vina를 사용하여 도킹 시뮬레이션을 수행하였다(Trott et al. 2010). 화합물 4는 에너지 최적화를 통해 구축되었다. 작은 화합물 K67(PDB ID:4ZY3)(Adelusi et al. 2021)과 복합체를 이루는 KEAP1 단백질의 결정 구조는 RCSB 데이터베이스에서 얻어 표적 단백질로 사용하였다. Keap1 단백질은 화학적 정확성을 확보하고 도킹을 위한 단백질 구조를 최적화하기 위해 단백질 준비 마법사(protein preparation wizard)를 사용하여 처리하였다. 도킹 시뮬레이션을 설정하기 위해 Keap1 단백질의 리간드 결합 부위 주변에 표적 단백질에 대한 검색 그리드를 생성하였으며, K67의 결합 부위는 Tyr334, Ser363, Arg415, Arg483, Tyr525, Ser555, Tyr572 및 Phe577로 정의되었다. 모델링 연구는 Chimera 1.15 소프트웨어를 사용하여 수행되하였다(Nouadi et al. 2021). 잠재적인 수소 결합과 반데르발스 상호작용은 LIGPLOT을 사용하여 분석하였다(Laskowski et al. 2011).Docking simulations were performed using Autodock Vina to predict the possible binding pose of compound 4 to the KEAP1 protein (Trott et al. 2010). Compound 4 was constructed through energy optimization. The crystal structure of KEAP1 protein in complex with the small compound K67 (PDB ID: 4ZY3) (Adelusi et al. 2021) was obtained from the RCSB database and used as the target protein. The Keap1 protein was processed using the protein preparation wizard to ensure chemical accuracy and optimize the protein structure for docking. To set up docking simulations, a search grid for target proteins was generated around the ligand binding site of Keap1 protein, and the binding site of K67 was defined as Tyr334, Ser363, Arg415, Arg483, Tyr525, Ser555, Tyr572 and Phe577. The modeling study was performed using Chimera 1.15 software (Nouadi et al. 2021). Potential hydrogen bonds and van der Waals interactions were analyzed using LIGPLOT (Laskowski et al. 2011).
실시예 1: 화합물 1-5의 분리 및 구조 규명Example 1: Isolation and structure elucidation of compounds 1-5
화합물 1-5의 마크로스펠라이드는 2017년 1월 25일 남극의 King George Island(62°14′16.26′′S, 58°43′15.32′′ W)에서 수집된 지의류에서 분리된 Pseudogymnoascus sp. SF-7351에서 상기 재료 및 방법에 기재된 방법으로 분리되었다.The macrosphelides of compounds 1-5 were Pseudogymnoascus sp. It was isolated from SF-7351 by the method described in Materials and Methods above.
분리된 화합물 1-5 중, 화합물 1 및 2는 신규한 마크로스펠라이드 화합물이며, 화합물 3, 4 및5는 각각 공지된 마크로스펠라이드 중 마크로스펠라이드 A (Takamatsu et al. 1996), 마크로스펠라이드 B (Takamatsu et al. 1996), 및 마크로스펠라이드 J (Fukami et al. 1999)로 분광 데이터 비교를 통해 확인되었다(도 1).Among the isolated compounds 1-5, compounds 1 and 2 are novel macrospelide compounds, and compounds 3, 4, and 5 are macrospelide A (Takamatsu et al. 1996) and macrospelide, respectively, among known macrospelides. B (Takamatsu et al. 1996), and Macrosphelide J (Fukami et al. 1999) were confirmed through comparison of spectroscopic data (Figure 1).
화합물 1은 1 = -10.6 (c 0.06, MeOH)의 백색의 무정형물질로 수득되었다. 화합물 1의 분자식 C17H24O9 는 m/z 373.1482 [M + H]+ (calcd for C17H25O9, 373.1499)에서의 양성자화된 분자피크, 및 m/z 395.1302 [M + Na]+ (calculated for C17H24NaO9, 395.1318)에서의 나트륨 부가 이온 피크를 갖는 HR-ESI-MS를 사용하여 확인되었다. 화합물 1의 1H-NMR 데이터는 δ H 6.03 (1H, dd, J = 1.5, 15.8 Hz, H-6) 및 6.88 (1H, dd, J = 5.7, 15.8 Hz, H-7)에서 2개의 올레핀 양성자(olefinic protons), [δ H 3.34 (3H, s)]에서 메톡시기(methoxy group), 및 δ H 1.34 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-16), 1.37 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-18), 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-17)]에서 3개의 메틸기의 존재를 나타낸다. 화합물 1의 13C NMR 및 DEPT 스펙트럼은 3개의 메틸기(δ C 15.8, 17.8, 및 20.1), 1개의 카르보닐기 (δ C 204.4), 3개의 에스터-유사 카르보닐기 (δ C 164.4, 170.9, 및 172.0), 2개의 올레핀 탄소(olefinic carbons, δ C 123.2, 및 145.7), 2개의 메틸렌기 (δ C 40.1, 및 40.9), 및 1개의 메톡시 탄소(methoxy carbon, δ C 58.8)로 구성되는 17개의 탄소 신호를 나타냈다. 다른 신호는 5개의 옥시메틴기(oxymethine groups, δ C 68.6, 74.3, 74.8, 76.2, 및 76.3)에서 기인한다. COSY 및 HMBC를 포함한 2D NMR 실험을 사용하여 화합물 1의 구조를 추가로 확인하였다. COSY 스펙트럼을 상세히 분석한 결과 교차-피크 H-2/H-3, H-6/H-7/H-8/H-9, 및 H-12/H-13이 연결되었다(도 2). 화합물 1의 평면 구조는 COSY 및 HMBC 스펙트럼의 추가 상관관계에 의해 확인되었다(도 2). 화합물 1의 NMR 데이터는 C12에서의 구성의 차이를 나타내는 C-13 및 C14의 화학적 이동의 변화(variations)을 제외하고는 마크로스펠라이드 J (화합물 5) 및 마크로스펠라이드 K [Fukami et al. 1999]와 유사하였다. 8R, 9S, 및 15S의 구성(configurations)은 자연에서 마크로스펠라이드의 생합성을 기반으로 유지되는 것으로 예상되었다[Fukami et al. 1999]. 3R or 3S의 배열(assignment)에 대한 추가 증거를 얻기 위해, 1a (3R) 및 1b (3S) 의 컨포머를 고려하여, B3LYP/6-31* 수준에서 화합물 1의 NMR 화학적 이동의 양자역학적 계산을 수행하였다[Lee et al. 2020]. 결과적으로, 1a (3R) 및 1b (3S)의 컴퓨터 계산된 1H 및 13C NMR 화학적 이동을 DP4+ 컴퓨터 분석을 사용하여 화합물 1의 실험 데이터와 비교하였으며, 이는 93.97% 확률로 화합물 1 및 1b(3S) 사이의 구조적 동등성을 나타낸다.Compound 1 is 1 = -10.6 (c 0.06, MeOH) was obtained as a white amorphous material. The molecular formula C 17 H 24 O 9 of compound 1 is a protonated molecular peak at m/z 373.1482 [M + H] + (calcd for C 17 H 25 O 9 , 373.1499), and m/z 395.1302 [M + Na ]+ (calculated for C17H24NaO9, 395.1318) was confirmed using HR-ESI-MS with a sodium adduct ion peak. 1H -NMR data of compound 1 show two olefins at δH 6.03 (1H, dd, J = 1.5, 15.8 Hz, H-6) and 6.88 (1H, dd, J = 5.7, 15.8 Hz, H-7) Protons (olefinic protons), [ δ H 3.34 (3H, s)] to methoxy groups, and δ H 1.34 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-16), 1.37 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-18), 1.49 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-17)], indicating the presence of three methyl groups. The 13 C NMR and DEPT spectra of compound 1 show three methyl groups ( δ C 15.8, 17.8, and 20.1), one carbonyl group ( δ C 204.4), three ester-like carbonyl groups ( δ C 164.4, 170.9, and 172.0), 17-carbon signal consisting of two olefinic carbons ( δ C 123.2, and 145.7), two methylene groups ( δ C 40.1, and 40.9), and one methoxy carbon ( δ C 58.8) indicated. Other signals originate from five oxymethine groups ( δ C 68.6, 74.3, 74.8, 76.2, and 76.3). The structure of compound 1 was further confirmed using 2D NMR experiments including COZY and HMBC. Detailed analysis of the COZY spectrum showed that the cross-peaks H-2/H-3, H-6/H-7/H-8/H-9, and H-12/H-13 were connected (Figure 2). The planar structure of compound 1 was confirmed by further correlation of COZY and HMBC spectra (Figure 2). The NMR data of compound 1 were similar to those of macrosphelide J (compound 5 ) and macrosphelide K [Fukami et al. 1999]. The configurations of 8 R , 9 S , and 15 S were expected to be maintained based on the biosynthesis of macrosphelides in nature [Fukami et al. 1999]. To obtain further evidence for the assignment of 3 R or 3 S , NMR chemical shifts of compound 1 at the B3LYP/6-31* level, considering conformers of 1a (3 R ) and 1b (3 S ). Quantum mechanical calculations were performed [Lee et al. 2020]. As a result, the computer-calculated 1H and 13C NMR chemical shifts of 1a ( 3R ) and 1b ( 3S ) were compared with the experimental data of compound 1 using DP4+ computer analysis, which showed that with 93.97% probability, compounds 1 and Shows structural equivalence between 1b(3 S ).
최종적으로, MeOH에서 느린 결정화를 통해 화합물 1의 단결정(single crystal)을 수득하였다. IμS micro-focus sealed tube Cu Kα (λ = 1.54178 ) 및 PHOTON II M14 detector가 장착된 Bruker D8 Venture diffractometer에서의 X-선 결정학 분석을 위한 적합한 결정이 선택되었다. Flack 매개변수 0.02(11)는 화합물 1의 절대 배치가 3S, 8R, 9S, 12R, 및 15S 임을 입증하였다 (도 3). 따라서, 화합물 1은 epi-macrosphelide J의 신규합 화합물로, NMR 할당의 첫번째 리포트와 화합물 1의 절대 배치가 명확하게 식별된다.Finally, a single crystal of Compound 1 was obtained through slow crystallization in MeOH. I μ S micro-focus sealed tube Cu Kα (λ = 1.54178 ) and suitable crystals were selected for X-ray crystallographic analysis on a Bruker D8 Venture diffractometer equipped with a PHOTON II M14 detector. The Flack parameter 0.02 (11) demonstrated that the absolute configurations of compound 1 were 3 S , 8 R , 9 S , 12 R , and 15 S (Figure 3). Therefore, compound 1 is a novel compound of epi -macrosphelide J, and the first report of NMR assignment and absolute configuration of compound 1 are clearly identified.
Macrosphelide N (화합물 2)는 = -6.24 (in MeOH, c 0.05)의 흰색 비정질 가루로 분리되었다. 화합물 2의 분자식 C16H20O8 는 m/z 341.1217 [M + H]+ (calcd. for C16H21O8, 341.1236) 에서의 양성자화된 분자 피크, 및 m/z 363.1041 [M + Na]+ (calcd. for C16H20NaO8, 363.1056)에서의 나트륨 부가 이온 피크를 갖는 HR-ESI-MS를 사용하여 확인되었다. CDCl3 에서 1H-NMR 스펙트럼은 (d H 1.34, 1.43, 및 1.45, 각각 3H)에서의 3개의 단일항 메틸 신호(singlet methyl signals); 및 d H 6.01 (dd, J = 1.8, 15.5 Hz, H-6), d H 6.80 (dd, J = 4.2, 15.8 Hz, H-7), d H (6.10 d, J = 12.0 Hz, H-12), 및 d H (6.54 d, J = 12.0 Hz, H-13)에서의 4개의 올레핀 양성자 신호를 뚜렷하게 나타내었다. DEPT 및 HMQC 데이터와 함께 화합물 2의 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 면밀히 확인한 결과는 3개의 2차 메틸기(secondary methyl groups, C-17, C-18, 및 C-19), 1개의 sp 3-혼성화된 메틸렌 (C-2), 4개의 산소 함유 sp 3-메틴(oxygen-bearing sp 3-methines, C-3, C-8, C-9, 및 C-15), 2개의 1,2-이중치환된 이중결합(1,2-disubstituted double bonds, C-6, C-7, C-12, 및 C-13), 및 4개의 에스테르/락톤 카르보닐기(ester/lactone carbonyl groups, C-1, C-5, C-11, 및 C-14)의 존재를 나타내었다. 화합물 2의 COSY 분석은 도2에서 굵은석으로 표시된 것과 같이, HMBC 상관 관계에 의해 뒷받침되는 3개의 부분 구조 단위를 나타낸다. 화합물 2의 NMR 데이터는 12의 Z-geometry를 제외하고 동일한 NMR 용매에서의 마크로스펠라이드 B의 데이터와 유사하엿다. 실제로, 12의 Z-geometry는 결합상수(coupling constant; J H12-H13 = 12.0 Hz)에 의해 추론된 반면, 마크로스펠라이드의 12의 E-geometry는 J H12-H13 = 15.8 Hz 이다.Macrosphelide N (Compound 2) is = -6.24 (in MeOH, c 0.05) was isolated as a white amorphous powder. The molecular formula of compound 2, C 16 H 20 O 8 , is m/z 341.1217 [M + H] + (calcd. for C 16 H 21 O 8 , 341.1236) was identified using HR-ESI-MS with the protonated molecule peak at and the sodium adduct ion peak at m/z 363.1041 [M + Na] + (calcd. for C 16 H 20 NaO 8 , 363.1056) . The 1 H-NMR spectrum in CDCl 3 shows three singlet methyl signals at ( d H 1.34, 1.43, and 1.45, respectively, 3H); and d H 6.01 (dd, J = 1.8, 15.5 Hz, H-6), d H 6.80 (dd, J = 4.2, 15.8 Hz, H-7), d H (6.10 d, J = 12.0 Hz, H- 12), and the four olefin proton signals at d H (6.54 d, J = 12.0 Hz, H-13) were clearly displayed. Close examination of the 1 H and 13 C NMR spectra of compound 2 along with DEPT and HMQC data showed that it contains three secondary methyl groups (C-17, C-18, and C-19), one sp 3 - Hybridized methylene (C-2), four oxygen-bearing sp 3 -methines (C-3, C-8, C-9 , and C-15), two 1,2- 1,2-disubstituted double bonds, C-6, C-7, C-12, and C-13, and four ester/lactone carbonyl groups, C-1, C-5, C-11, and C-14). COZY analysis of compound 2 reveals three partial structural units supported by HMBC correlation, as indicated in bold in Figure 2. The NMR data of compound 2 were similar to those of macrosphelide B in the same NMR solvent except for the Z -geometry of 12 . In fact, the Z -geometry of 12 was deduced by the coupling constant ( J H12-H13 = 12.0 Hz), while the E -geometry of 12 in the macrospelade is J H12-H13 = 15.8 Hz.
이러한 3개의 부분 구조 단위와 나머지 에스테르 모이어티의 연결은 도 2에 요약된 주요 HMBC 상관 관계를 기반으로 결정되었으며, 화합물 2의 평면 구조가 명확하게 해명되었다. 화합물 1의 경우와 유사하게 2의 절대 배치는 자연계의 모든 마크로스펠라이드의 생합성 배열에 근거하여 8R, 9S 및 15S로 잠정적으로 부여하였다(Paek et al. 2009). 절대 배치를 확인하기 위해 GIAO NMR 계산을 사용하여 DP4+ 분석을 수행하였다. 2a(3R) 및 2b(3S)의 컴퓨터 계산된 1H 및 13C NMR 화학적 이동을 DP4+ 컴퓨터 분석을 사용하여 화합물 2의 실험 데이터와 비교하였으며, 이는 100%의 확률로 화합물 2에서 2b(3S)의 구조적 동등성을 나타낸다. 화합물 2는 새로운 화합물로 지정되었으며, 마크로스펠라이드 N으로 명명되었다. The linkage of these three partial structural units with the remaining ester moiety was determined based on the main HMBC correlations summarized in Figure 2, and the planar structure of compound 2 was clearly elucidated. Similar to the case of compound 1, the absolute configuration of 2 was tentatively assigned to 8R, 9S, and 15S based on the biosynthetic sequences of all macrosphelides in nature (Paek et al. 2009). DP4+ analysis was performed using GIAO NMR calculations to confirm the absolute configuration. The computer-calculated 1 H and 13 C NMR chemical shifts of 2a(3R) and 2b(3S) were compared with experimental data for compound 2 using DP4+ computer analysis, which shows that 2b(3S) in compound 2 has a 100% probability. indicates structural equivalence. Compound 2 was designated as a new compound and named macrospelide N.
실시예 2: 마크로스펠라이드(화합물 1-5)의 LPS로 염증 유도된 BV2 세포에 대한 효과 확인Example 2: Confirmation of the effect of macrospelide (Compound 1-5) on BV2 cells induced by inflammation with LPS
BV2 세포와 같은 미세아교세포에 대한 LPS에 의한 자극은 아질산염(NO) 및 염증성 사이토카인의 생산을 증가시키며, 염증을 유발할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 이에 기초하여, LPS에 의해 염증이 유도된 BV2 세포에서 실시예 1에서 확인한 마크로스펠라이드(화합물 1-5)의 항-염증 효과를 확인하였다.It is well known that stimulation of microglial cells such as BV2 cells by LPS increases the production of nitrite (NO) and inflammatory cytokines, which can induce inflammation. Based on this, the anti-inflammatory effect of macrospelide (Compound 1-5) confirmed in Example 1 was confirmed in BV2 cells in which inflammation was induced by LPS.
먼저, LPS로 유도된 BV2 세포에 대한 최대 처리농도를 결정하기 위해, 화합물 1-5의 마크로스펠라이드를 20~80μM 농도 범위로 처리하여, 독성 평가를 수행하였다. 도 4A에 도시된 것과 같이, 화합물 4는 40μM에서 독성을 나타내었으며, 다른 마크로스펠라이드(화합물 1, 2, 3 및 5)는 시험된 농도범위에서 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 화합물 4의 최대 처리 농도를 20 μM로 설정하여 아질산염(Nitrite)의 생성에 대한 억제 효과를 평가하였다. BV2 세포에서 LPS로 유도된 NO 생성에 대한 화합물의 효과를 확인하기 위해, 양성 대조군으로 항-염증효과가 있는 것으로 잘 알려진 Sulfuretin(Lee et al. 2010) 20 μM를 사용하였다. 각 화합물이 처리된 세포 배양 배지를 수확한 후, Griess 반응을 통해 아질산염 농도를 측정하였다. 그 결과 도 4에 도시된 것과 같이, 화합물 1 ~ 5는 모두 최대 처리 농도 이내에서 NO의 생성을 효과적으로 억제하였다(도 4B). First, in order to determine the maximum treatment concentration for LPS-induced BV2 cells, the macrosphelide of compounds 1-5 were treated in a concentration range of 20 to 80 μM, and toxicity evaluation was performed. As shown in Figure 4A, compound 4 was toxic at 40 μM, and the other macrospherides (compounds 1, 2, 3, and 5) were not toxic in the concentration range tested. Therefore, the maximum treatment concentration of Compound 4 was set to 20 μM to evaluate the inhibitory effect on the production of nitrite. To confirm the effect of the compound on LPS-induced NO production in BV2 cells, 20 μM of Sulfuretin (Lee et al. 2010), which is well known to have anti-inflammatory effects, was used as a positive control. After harvesting the cell culture medium treated with each compound, nitrite concentration was measured through the Griess reaction. As a result, as shown in Figure 4, compounds 1 to 5 all effectively inhibited the production of NO within the maximum treatment concentration (Figure 4B).
추가적으로 LPS로 자극된 BV2 세포에서, 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, 및 PGE2에 대한 화합물 1-5의 효과를 ELISA를 통해 평가하였다. 도 4C 및 4D에 도시된 것과 같이, 화합물 2, 4 및 5는 TNF-α 및 IL-6 발현에 대한 실질적인 억제 효과를 나타내었고, 특히 화합물 4는 저농도(20μM)에서도 가장 강력한 발현 억제효과를 나타내었다. Additionally, in LPS-stimulated BV2 cells, the effects of compounds 1-5 on the proinflammatory cytokines TNF-α, IL-6, and PGE2 were evaluated by ELISA. As shown in Figures 4C and 4D, compounds 2, 4, and 5 showed substantial inhibitory effects on TNF-α and IL-6 expression, and in particular, compound 4 showed the strongest expression inhibitory effect even at low concentration (20 μM). It was.
반면, 화합물 1-5는 LPS로 자극된 BV2 세포에서 PGE2의 생성을 폐지하지 않았으며(도 4E), COX-2 발현에 대해서도 유의미한 억제효과를 나타내지 않았다(도 4F). 이는 화합물 1-5의 항-염증 활성이 LPS 자극된 미세아교세포에서 COX-2 경로와 관련이 없음을 의미한다.On the other hand, compounds 1-5 did not abolish the production of PGE2 in LPS-stimulated BV2 cells (Figure 4E) and did not show a significant inhibitory effect on COX-2 expression (Figure 4F). This means that the anti-inflammatory activity of compounds 1-5 is not related to the COX-2 pathway in LPS-stimulated microglia.
이에, 보다 구체적인 염증 관련 신호 전달경로에 대해 가장 뛰어난 효과를 나타내는 화합물 4의 효과 및 메커니즘을 규명하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. Accordingly, additional experiments were conducted to identify the effects and mechanisms of Compound 4, which has the greatest effect on specific inflammation-related signal transduction pathways.
실시예 3: 마크로스펠라이드(화합물 4)의 항-염증 효과 메커니즘 규명Example 3: Identification of the anti-inflammatory effect mechanism of macrospelide (Compound 4)
특히 NF-κB는 숙주 면역에서 중요한 역할을 하며 LPS 및 사이토카인을 포함한 자극에 대한 미세아교세포 반응의 중심 조절자로 알려져 있다(Zhan et al. 2018). 미세아교세포에서 NF-
이와 같이, 활성화된 미세아교세포에서 NO, TNF-α 및 IL-6의 비정상적인 상향 조절은 NF-
실시예 4: 마크로스펠라이드(화합물 1-5)의 HT22 해마 세포에서 글루타메이트 유도된 산화스트레스에 대한 효과 확인Example 4: Confirmation of the effect of macrospelide (Compound 1-5) on glutamate-induced oxidative stress in HT22 hippocampal cells
글루타메이트는 중추신경계의 중요한 신경전달 물질이나, 여러가지 원인에 의한 글루타메이트의 과분비는 산화스트레스를 유발하여 신경세포의 손상 및 사멸로 이어지는 것으로 보고된다. 따라서, 당업계에서 통상적으로 고농도의 글루타메이트를 처리한 HT22 해마 세포는 산화스트레스에 의한 신경세포 사멸 모델로 사용된다.Glutamate is an important neurotransmitter in the central nervous system, but hypersecretion of glutamate due to various causes is reported to cause oxidative stress, leading to damage and death of nerve cells. Therefore, in the art, HT22 hippocampal cells treated with high concentrations of glutamate are commonly used as a model for neuronal death due to oxidative stress.
본 발명의 마크로스펠라이드(화합물 1-5)의 글루타메이트 유도된 산화스트레스 유발 세포 독성에 대한 신경 보호 효과를 확인하였다. 먼저, 최대 처리농도를 결정하기 위해 화합물 1-5의 마크로스펠라이드를 20~80μM 농도 범위로 처리하여, 독성 평가를 수행하였다(도 6A). 화합물 4는 40μM에서 독성을 나타내었으며, 다른 마크로스펠라이드(화합물 1, 2, 3 및 5)는 시험된 농도범위에서 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 화합물 4의 최대 처리 농도를 20 μM로 설정하고, 나머지 화합물의 최대 처리 농도를 80 μM로 설정하여 산화스트레스에 대한 신경보호 효과를 확인하였다. The neuroprotective effect of the macrospelide (Compound 1-5) of the present invention against glutamate-induced oxidative stress-induced cytotoxicity was confirmed. First, in order to determine the maximum treatment concentration, macrosphelides of compounds 1-5 were treated in a concentration range of 20 to 80 μM, and toxicity evaluation was performed (Figure 6A). Compound 4 was toxic at 40 μM, and other macrospelides (compounds 1, 2, 3, and 5) did not show toxicity in the concentration range tested. Therefore, the maximum treatment concentration of compound 4 was set to 20 μM, and the maximum treatment concentration of the remaining compounds was set to 80 μM to confirm the neuroprotective effect against oxidative stress.
그 결과, 도 6B에 도시된 것과 같이 5종의 화합물 중 화합물 4만이 글루타메이트 처리된 HT22 해마 세포에서 현저한 신경보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다. ROS의 생성 또한 농도 의존적 방식으로 화합물 4에 의해 억제되었다(도 6C). 이러한 결과는 화합물 4가 LPS에 의해 유도된 항-염증 효과 이외에도 산화 스트레스를 억제할 수 있음을 의미한다.As a result, as shown in Figure 6B, it was confirmed that among the five compounds, only compound 4 showed a significant neuroprotective effect in glutamate-treated HT22 hippocampal cells. The production of ROS was also inhibited by compound 4 in a concentration-dependent manner (Figure 6C). These results mean that compound 4 can inhibit oxidative stress in addition to the anti-inflammatory effect induced by LPS.
실시예 5: 마크로스펠라이드(화합물 4)의 HO-1 발현 및 Nrf2 핵 전위에 대한 효과 메커니즘 확인Example 5: Confirmation of the effect mechanism of macrospelide (compound 4) on HO-1 expression and Nrf2 nuclear translocation
화합물 4의 신경보호 효과가 HO-1의 상향 조절과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해 화합물 4를 BV2 미세아교세포 및 HT22 해마세포에 12시간동안 처리하였다. 정상 HO-1 발현을 위한 양성 대조군으로 HO-1 유도제인 CoPP(cobalt protoporphyrin)으로 처리하여 분석하였다. 그 결과, 도 7A 및 7B에 도시된 것과 같이 화합물 4는 BV2 및 HT22 세포에서 HO-1의 발현을 현저하게 유도하는 것으로 나타났다.To determine whether the neuroprotective effect of compound 4 is related to the upregulation of HO-1, BV2 microglia and HT22 hippocampal cells were treated with compound 4 for 12 hours. As a positive control for normal HO-1 expression, the samples were treated with CoPP (cobalt protoporphyrin), an HO-1 inducer, and analyzed. As a result, as shown in Figures 7A and 7B, compound 4 was found to significantly induce the expression of HO-1 in BV2 and HT22 cells.
또한, 화합물 4의 신경보호 효과가 HO-1 발현과 관련이 있는지를 확인하기 위해 선택적 HO-1 억제제인 SnPP(tin protoporphyrin-IX)를 사용하여 실험을 진행하였다. 50 μM SnPP의 존재 또는 부존재하에, 추출물로 전처리된 BV2 및 HT22 세포를 LPS (1 μg/mL) 및 글루타메이트 (10 mM)로 24시간동안 처리하였다. 화합물 4와 SnPP가 동시 처리된 경우보다, 화합물 4만 처리한 LPS 유도 BV2 세포에서 아질산염의 생성을 현저히 감소시켰다(도 7C). 또한, 글루타메이트 유도 HT22 세포에서도 화합물 4와 SnPP가 동시 처리된 경우보다, 화합물 4만 처리한 경우에 더욱 뛰어난 신경보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 7D). 이러한 결과는 화합물 4의 항-염증 및 신경보호효과에 HO-1 발현 유도 메커니즘이 관여하는 것을 의미한다. Additionally, to confirm whether the neuroprotective effect of compound 4 was related to HO-1 expression, an experiment was conducted using SnPP (tin protoporphyrin-IX), a selective HO-1 inhibitor. BV2 and HT22 cells pretreated with extract were treated with LPS (1 μg/mL) and glutamate (10 mM) for 24 h in the presence or absence of 50 μM SnPP. The production of nitrite was significantly reduced in LPS-induced BV2 cells treated with compound 4 alone, compared to when compound 4 and SnPP were co-treated (Figure 7C). In addition, it was confirmed that glutamate-induced HT22 cells exhibited a more excellent neuroprotective effect when treated with Compound 4 alone than when Compound 4 and SnPP were simultaneously treated (Figure 7D). These results imply that the HO-1 expression induction mechanism is involved in the anti-inflammatory and neuroprotective effects of compound 4.
본 기술분야에서 HO-1는 주요 전사인자인 Nrf2의 활성화에 의해 조절되는 주요한 항염증, 항산화 및 세포 보호 인자로 잘알려져 있다 (Ge et al. 2017). 이러한 사실에 기반하여, 화합물 4의 Nrf2의 핵 전위(nuclear translocation)에 대한 효과도 추가로 조사하였다. Nrf2 발현은 BV2 및 HT22 세포를 20μM의 화합물 4로 처리한 후 매 0.5시간마다 측정되었다. 세포질 Nrf2의 발현은 화합물 4 처리 후 핵 Nrf2 수준이 증가할 때 감소했으며, 세포질 Nrf2는 BV2 및 HT22 세포 모두에서 핵으로 전위되었음을 확인하였다(도 8A 및 8B). In the art, HO-1 is well known as a major anti-inflammatory, antioxidant and cytoprotective factor regulated by the activation of Nrf2, a key transcription factor (Ge et al. 2017). Based on these facts, the effect of compound 4 on nuclear translocation of Nrf2 was further investigated. Nrf2 expression was measured every 0.5 hours after treatment of BV2 and HT22 cells with 20 μM compound 4. Expression of cytoplasmic Nrf2 decreased when nuclear Nrf2 levels increased after compound 4 treatment, and cytoplasmic Nrf2 was translocated to the nucleus in both BV2 and HT22 cells (Figures 8A and 8B).
KEAP1은 NRF2의 억제제로 알려져 있으며, KEAP1 켈치 도메인의 결합이 KEAP1-NRF2 상호작용을 억제하여 NRF2를 활성화 할 수 있음은 잘 알려진 경로이다 (Zhang et al. 2020). 화합물 4와 KEAP1 사이의 상호작용을 조사하기 위해 분자 도킹 시뮬레이션을 수행하고 KEAP1의 활성 부위에서 화합물 4의 가능한 결합 포즈를 예측하였다. 도 8C 및 8D에 도시된 것과 같이 화합물 4는 KEAP1 서브유닛의 소수성 영역(Arg415, Ala556 및 Phe577)에 위치하였으며, 화합물 4는 Ser602와 수소 결합을 형성하였다. 따라서, 화합물 4가 Keap1의 소수성 영역과 상호작용하여 Nrf2 활성을 유도할 수 있음을 예측할 수 있다.KEAP1 is known to be an inhibitor of NRF2, and it is a well-known pathway that binding of the KEAP1 Kelch domain can activate NRF2 by inhibiting KEAP1-NRF2 interaction (Zhang et al. 2020). To investigate the interaction between compound 4 and KEAP1, we performed molecular docking simulations and predicted the possible binding pose of compound 4 in the active site of KEAP1. As shown in Figures 8C and 8D, compound 4 was located in the hydrophobic region (Arg415, Ala556, and Phe577) of the KEAP1 subunit, and compound 4 formed a hydrogen bond with Ser602. Therefore, it can be predicted that compound 4 can induce Nrf2 activity by interacting with the hydrophobic region of Keap1.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. will be. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (18)
[화학식 I]
상기 화학식 I에서 R1은 알콕시기 또는 수소이고, R2는 히드록시기임,
[화학식 II]
.
[화학식 III]
,
상기 화학식 III 에서 R3는 산소 또는 히드록시기임.
A macrospelide compound of formula (I), (II), or (III) or a derivative thereof:
[Formula I]
In the formula (I), R1 is an alkoxy group or hydrogen, and R2 is a hydroxy group,
[Formula II]
.
[Formula III]
,
In Formula III, R 3 is oxygen or a hydroxy group.
[화합물 1]
,
[화합물 2]
.
The compound or derivative thereof according to claim 1, wherein the macrospelide compound is Compound 1 or Compound 2 below:
[Compound 1]
,
[Compound 2]
.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서 R1은 알콕시기 또는 수소이고, R2는 히드록시기임,
[화학식 II]
.
[화학식 III]
,
상기 화학식 III 에서 R3는 산소 또는 히드록시기임.
An anti-inflammatory or antioxidant composition comprising the macrospelide compound of the following formula (I, II, or III), a derivative thereof, or a salt thereof as an active ingredient:
[Formula I]
In the formula (I), R1 is an alkoxy group or hydrogen, and R2 is a hydroxy group,
[Formula II]
.
[Formula III]
,
In Formula III, R 3 is oxygen or a hydroxy group.
The composition according to claim 3, wherein R 1 in Formula I is methoxy.
The composition of claim 3, wherein R 3 in Formula III is oxygen (O).
[화합물 1]
,
[화합물 2]
.
[화합물 3]
,
[화합물 4]
, 및
[화합물 5]
.
The composition according to claim 3, wherein the macrospelide is one or more compounds selected from the group consisting of:
[Compound 1]
,
[Compound 2]
.
[Compound 3]
,
[Compound 4]
, and
[Compound 5]
.
The composition according to claim 6, wherein the macrospelide compound is Compound 4.
The method of claim 3, wherein the macrosphelide compound is an Antarctic fungus Aspergillus sp. A composition characterized in that it is derived from SF-7351.
The composition according to claim 3, wherein the composition is used for anti-inflammatory or antioxidant effects on nerve cells.
The composition according to claim 8, wherein the nerve cells are microglial cells or hippocampal cells.
[화학식 I]
상기 화학식 I에서 R1은 알콕시기 또는 수소이고, R2는 히드록시기임,
[화학식 II]
.
[화학식 III]
,
상기 화학식 III 에서 R3는 산소 또는 히드록시기임.
A composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising the following macrospelide compound of formula (I, II, or III), a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
[Formula I]
In the formula (I), R1 is an alkoxy group or hydrogen, and R2 is a hydroxy group,
[Formula II]
.
[Formula III]
,
In Formula III, R 3 is oxygen or a hydroxy group.
The composition according to claim 11, wherein R 1 in Formula I is methoxy.
The composition of claim 11, wherein R 3 in Formula III is oxygen (O).
[화합물 1]
,
[화합물 2]
.
[화합물 3]
,
[화합물 4]
, 및
[화합물 5]
.
The composition according to claim 11, wherein the macrospelide is one or more compounds selected from the group consisting of:
[Compound 1]
,
[Compound 2]
.
[Compound 3]
,
[Compound 4]
, and
[Compound 5]
.
The composition according to claim 14, wherein the macrospelide compound is Compound 4.
The method of claim 11, wherein the macrosphelide compound is an Antarctic fungus Aspergillus sp. A composition characterized in that it is derived from SF-7351.
The method of claim 11, wherein the neurodegenerative disease is Parkinson's disease, Alzheimer's disease (AD), stroke, dementia, muscular dystrophy (MD), multiple sclerosis (MS), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), cystic fibrosis, and Angelman's disease. ) syndrome, Liddle syndrome, Pick's disease, Paget's disease or traumatic brain injury.
대사물질 중 마크로스펠라이드(Macrosphelides) 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 화합물을 제조하는 방법.The fungus Aspergillus sp. Culturing SF-7351 to extract metabolites; and
A method for producing the compound of claim 1, comprising the step of separating macrosphelides compounds from metabolites.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240099949A true KR20240099949A (en) | 2024-07-01 |
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