KR20240099246A - 지질 나노입자(lnp) 조성물 및 이의 사용방법 - Google Patents

지질 나노입자(lnp) 조성물 및 이의 사용방법 Download PDF

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마이클 미첼
사반 파텔
마가렛 엠. 빌링슬리
슈에시앙 한
한웬 장
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 개시는 부분적으로 콜레스테롤-대체물(즉, 콜레스테롤 유사체 및/또는 유도체)을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 및 핵산 분자 및/또는 치료제를 표적 세포로 생체내 전달하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 LNP는 항염증제이다. 특정 실시양태에서, 본 개시는 암을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 대상체의 질환 및/또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선을 위한 본원에 기재된 LNP의 용도와 관련된다.

Description

지질 나노입자(LNP) 조성물 및 이의 사용방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 12월 16일에 출원된 미국 가특허출원 제63/290,220호 및 2021년 10월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/251,255호에 대해 35 U.S.C. § 119(e)하의 우선권을 주장하고, 이 양 출원은 참조에 의해 본원에 통합되어 있다.
연방 정부의 후원에 의한 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원으로부터 TR002776에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 보유하고 있다.
지난 10년에 걸쳐, 면역요법은 다양한 질환과 병태의 치료에 중요한 도구로 되어 왔다. 이러한 요법은 암, 외래 병원체 및 기타 자극에 대한 신체의 반응을 제어하는 복잡한 생물학적 네트워크의 일부인 면역 세포(예: T 세포, B 세포, 수지상 세포)를 표적으로 한다. 면역요법은 항체-기반 억제제부터 유전자-조작 면역 세포에 이르기까지 광범위한 치료법에 미친다. 특히 치료법 중 하나인 메신저 RNA-기반 면역요법은 메신저 RNA(mRNA)의 일시적 특성과, DNA와 연관된 게놈 통합의 위험 감소로 인해 큰 관심을 불러일으켰다. 이온화 가능한 지질 나노입자(LNP)는 온파트로(Onpattro) 및 화이자/바이오엔텍(Pfizer/BioNTech) 및 모더나(Moderna) COVID-19 mRNA 백신의 임상적 성공에 의해 알 수 있는 바와 같이, RNA 치료제를 위한 가장 임상적으로 진보된 비-바이러스 전달 플랫폼이다. 이온화 가능한 지질은 생물학적 장벽을 극복함으로써 mRNA 치료제를 보호하고 표적 세포에 전달할 수 있다.
그러나, LNP/mRNA 복합체는 선천성 면역계와 상호작용하여 면역 반응을 유발할 수 있다. mRNA는 면역-침묵으로 변형될 수 있지만, LNP 자체는 면역 세포에서 강력한 염증 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. LNP는 Toll-유사 수용체(TLR)와 같은 항원 제시 세포(APC)의 패턴 인식 수용체(PRR)와 상호작용함으로써 면역계를 활성화할 수 있다. 이전 연구에서는 LNP와 PPR의 상호작용이 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)와 같은 염증유발성 사이토카인의 방출을 유발하고, 이는 선천성 면역 반응의 일반적 개시를 시사한다. 이어서, 염증 반응은 mRNA의 번역 효율을 저하시키고, 면역-관련 부작용을 유발할 수 있다. 따라서, 클리닉에서 LNP-기반 mRNA 치료제에는 항염증 약물 및 항히스타민제에 의한 사전 투약이 필요하다.
또한, 면역 세포에 대한 mRNA의 전달을 위한 대표적 기술은 전기천공이고, 이는 전기 펄스를 통해 세포막을 투과하고 세포질에 대한 mRNA의 형질도입을 가능하게 하는 방법이다. 그러나, 생체외 환경에서 세포의 전기천공은 표적 세포에 매우 독성인 경향이 있다. 추가로, 전기천공은 생체외 적용으로 한정되어 있고, 이는 mRNA 면역요법을 생체내 플랫폼에 적용하는 것을 곤란하게 한다.
따라서, 원치 않는 선천성 면역 반응을 억제하고 생체내 적용을 가능하게 하는 방식으로 면역 세포에 낮은 독성으로 mRNA 카고(cargo)를 강력하게 전달할 수 있는 LNP가 당해 기술분야에 필요하다. 본 개시는 이러한 요구를 해결한다.
일 양태에서, 본 개시는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다. 특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 이온화 가능한 지질을 포함하고, 여기서 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 45mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물의 조합은 LNP의 약 5mol% 내지 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질(PEG-conjugated lipid)을 포함하고, 여기서 PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 핵산 분자 및 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물(cholesterol-substitute)은 덱사메타손이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 7-α-하이드록시콜레스테롤, 7-β-하이드록시콜레스테롤, 19-하이드록시콜레스테롤, 20-(S)-하이드록시콜레스테롤, 24-(S)-하이드록시콜레스테롤, 25-하이드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 5,6-에폭시콜레스테롤, 3β,5α,6β-트리하이드록시콜레스테롤, 4β-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤 및 22-(R)-하이드록시콜레스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 체노데옥시콜산(CDCA), 콜산(CA), 데옥시콜산(DCA), 리토콜산(LCA), 타우로콜산, 글리코콜산, 타우로체노데옥시콜산 및 글리코체노데옥시콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 적어도 하나의 LNP 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 백신이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 핵산 분자와 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 이를 필요로 하는 대상체의 표적 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 본 개시의 적어도 하나의 LNP 및/또는 본 개시의 적어도 하나의 약제학적 조성물을 대상체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 암 또는 암과 연관된 질환 또는 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 치료, 예방 및/또는 개선한다.
도면은 한정이 아닌 예시로서 본 출원의 다양한 실시양태를 일반적으로 설명한다.
도 1A-1B는 콜레스테롤과 덱사메타손의 화학 구조, 및 부작용을 감소시키고 mRNA 형질감염을 개선하기 위한 항염증 LNP의 개략도를 도시한다. 도 1A는 콜레스테롤(좌측, MW: 386.65g/mol)과 덱사메타손(우측, MW: 392.47g/mol)의 화학 구조를 도시한다. 도 1B는 항염증 LNP가 면역 세포에서 LNP에 의해 유발된 국소 염증을 억제하여 부작용을 감소시키고 간 mRNA 감염을 증강시킨다는 것을 입증하는 예시적 데이터를 도시한다. LNP는 면역 세포(예: 마크로파지)를 자극하는 것으로 제안되어 있다. 특정 실시양태에서, 덱사메타손(즉, Dex)은 염증유발성 사이토카인(예: TNF-α)의 방출을 감소시키고, 따라서 간 형질감염을 개선하고 LNP의 부작용을 최소화할 수 있다.
도 2는 마이크로유체 혼합을 통한 Dex-도입 LNP의 제형을 나타내는 예시적 다이어그램을 도시한다. 특정 실시양태에서, mRNA는 수성 상에 용해되는 반면, PEG-접합 지질(예를 들면, C14PEG-2000), MC3, DSPC, 콜레스테롤 및 덱사메타손은 유기 상에 용해된다. 특정 실시양태에서, 2개 용액은 마이크로유체 장치에서 급속하게 혼합되어 mRNA-LNP를 형성한다.
도 3A-3B는 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된 본 개시의 비제한적 LNP의 유체역학적 크기를 도시한다. 도 3A는 C10D0 LNP의 강도-기반 크기 분포를 도시한다. 도 3B는 C9D1 LNP의 강도-기반 크기 분포를 도시한다. 각 LNP에 대한 3개 대표적 기술 반복 결과가 제시되어 있다.
도 4A-4C는 Dex를 도입한 본 개시의 예시적 mRNA LNP를 사용한 처리 후에 HepG2 세포에서 시험관내 루시퍼라제 발현 및 세포 생존율, 및 RAW246.7 세포에서의 TNF-α 수준을 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 도 4A는 처리 24시간 후에 HepG2 세포에서 시험관내 루시퍼라제 mRNA 형질감염을 도시한다. 도 4B는 처리 24시간 후에 HepG2 세포의 세포 생존율을 도시한다. 도 4C는 처리 24시간 후에 RAW246.7 세포의 TNF-α 생성을 도시한다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시된다. n.s., 유의하지 않음, ***P<0.001.
도 5A-5B는 상이한 콜레스테롤:덱사메타손(C:D) 비율로 제형화된 본 개시의 예시적 LNP를 사용한 처리 후에 HepG2 세포에서 시험관내 루시퍼라제 발현 및 세포 생존율을 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 도 5A는 처리 24시간 후에 HepG2 세포에서 시험관내 루시퍼라제 mRNA 형질감염을 도시한다. 도 5B는 처리 24시간 후에 HepG2 세포의 세포 생존율을 도시한다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시된다.
도 6A-6B는 C10D0 및 C9D1 LNP의 정맥내 투여 후에 생체내 TNF-α 수준 및 mRNA 전달을 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 도 6A는 마우스에서 C10D0 또는 C9D1 LNP를 사용한 처리 후에 혈청 TNF-α 수준을 도시한다. 혈청은 처리 20시간 후에 수집했다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시된다. *P<0.05. b). 도 6B는 생체내 루시퍼라제 발현을 도시하고; 각 마우스에 대해 4μg의 LNP-제형화된 루시퍼라제 mRNA를 정맥내 투여했다.
도 7A-7C는 하이드록시콜레스테롤-대체물을 갖는 비제한적 지질 나노입자(LNP)의 동기, 설계 및 합성을 도시한다. 도 7A는 LNP 성분, 제형 및 일반적 예상 구조를 도시하는 개략도를 제공한다. 도 7B는 T 세포로의 LNP 전달 및 단백질의 Rab 계열이 관여하는 엔도솜 수송 메커니즘을 도시하는 다이아그램을 제공한다. 특정 실시양태에서, Rab5, Rab7 및 Rab11은 각각 초기, 후기 및 재순환 엔도솜과 연관되어 있다. 도 7C는 적어도 일부의 비변형된 콜레스테롤에 의한 다양한 하이드록시콜레스테롤의 치환을 도입한 비제한적 LNP 라이브러리의 설계를 도시한다.
도 8A-8C는 콜레스테롤 유사체를 포함하는 본 개시의 비제한적 예시적 LNP 제형의 특성화 및 안정성을 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 도 8A는 콜레스테롤 분자 상의 하이드록실 변형 위치에 의해 그룹화된 6개 하이드록시콜레스테롤(예를 들면, 7α-HC, 7β-HC, 19-HC, 20(S)-HC, 24(S)-HC 및 25-HC)의 구조를 도시한다. 폴리사이클릭 코어(즉, 분자의 "본체")의 임의 위치에서 변형된 콜레스테롤을 포함하는 LNP는 "A"(즉, A1, A2, A3)로 표시되고, 콜레스테롤의 5원 환(즉, 분자의 "테일(tail)")의 알킬 쇄 치환기에 대한 콜레스테롤 변형을 함유하는 LNP는 "B"(즉, B1, B2, B3)로 표시된다. 도 8B는 LNP 안정성을 평가하기 위해 28일에 걸쳐 취득한, S2 LNP 및 100% 콜레스테롤 치환을 수반하는 LNP 제형에 대한 z-평균 직경, PDI, mRNA 농도, 및 캡슐화 효율의 측정을 도시한다. 샘플 DLS 곡선은 3일차에 LNP 제형 S2 및 A1-100의 대표적 크기 분포를 나타낸다(n = 3). 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. 도 8C는 본 개시의 예시적 LNP에 대한 pKa, 제타 전위, z-평균 직경 및 PDI 측정치를 도시한다(n = 3). 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 9A-9B는 최고 제형을 동정하기 위해 T 세포주(Jurkats)에서 루시퍼라제 mRNA 전달(도 9A) 및 생존율(도 9B)에 대한 LNP 라이브러리의 스크리닝을 도시한다. 주르캇(Jurkat) 세포를 60ng mRNA/60,000 세포에서 24시간 동안 LNP 제형으로 처리했다. 루시퍼라제 발현을 표준 LNP 제형(S2)으로 처리한 세포에 대해 정규화하고, 배경 발광을 차감했다. LNP로 처리한 세포의 퍼센트 생존율은 무처리 세포에 대해 정규화하여 결정했다. 범례는 S2 제형으로 각 하이드록시콜레스테롤-대체물의 퍼센트 치환율을 도시한다. n = 3 생물학적 복제. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. ANOVA를 사용하여, 치료 그룹 평균이 유의적으로 상이한지를 판단했다. LNP 후보와 S2 사이의 Tukey의 정직 유의성 검정에서 **: p < 0.01.
도 10A-10C는 일차 인간 T 세포에서 최고 성능의 하이드록시콜레스테롤-대체물로 제형화된 LNP의 스크리닝을 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 도 10A는 300ng mRNA/60,000 세포의 용량으로 A1, A2 또는 B1 하이드록시콜레스테롤 또는 S2를 함유한 LNP 제형으로 24시간 동안 처리한 일차 인간 T 세포에서 루시퍼라제 발현을 도시한다. n = 3 생물학적 복제. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. ANOVA를 실시하여, 치료 그룹 평균이 유의하게 상이한지를 판단했다. LNP 후보와 S2 사이의 스튜던트 t-검정에서 *: p < 0.05. 도 10B-10C는 다양한 용량에서 S2, A1-25 및 A1-50으로 처리한 일차 인간 T 세포의 루시퍼라제 발현(도 10B) 및 상대 생존율(도 10C)을 도시한다. 루시퍼라제 발현은 표준 LNP 제형(S2)으로 처리한 세포에 대해 정규화하고, 배경 발광을 차감했다. 퍼센트 생존율은 무처리 세포에 대해 정규화하여 결정했다. 범례는 S2 제형으로 각 하이드록시콜레스테롤-대체물의 퍼센트 치환율을 나타낸다. 각 환자는 상이한 마커에 의해 표시된다. n = 3개의 생물학적 복제. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. S2와 A1-25 또는 A1-50 사이의 스튜던트 t-검정에서 *: < 0.05, **: < 0.01.
도 11은 주르캇에서 엔도솜 흡수 및 엔도솜과 LNP의 공국재화를 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. 60ng mRNA/60,000 세포에서 DiO-표지 LNP로 처리하고 라이소트래커(Lysotracker)로 염색한 주르캇 세포의 공초점 현미경 이미지. 이미지를 병합하고, 배경을 제거하고, 스피어만(Spearman) 순위 상관관계를 사용하여 세포내 LNP와 산성 소기관 사이의 연관을 정량화했다. 공국재화 통계(즉, 스피어만 순위 상관관계)는 각 처리 그룹의 5개 시야(합계 적어도 90개의 세포)에서 수득되었다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. ANOVA를 실시하여, 그룹 평균이 유의하게 상이한지를 판단했다. S2와 A1-25 또는 A1-50의 공국재화 통계 사이의 본페로니 p-값 보정을 사용한 스튜던트 t-검정에서 *: p < 0.05.
도 12A-12B는 LNP 엔도솜 수송의 특성화를 입증하는 예시적 실험 데이터를 도시한다. Rab5, Rab7 또는 Rab11에 대한 항체로 염색된 주르캇의 공초점 현미경 이미지. 세포는 무처리(UT)하거나, 60ng mRNA/60,000 세포(도 12A) 또는 150ng mRNA/60,000 세포(도 12B)의 S2, A1-25 또는 A1-50으로 처리했다. Rab5, Rab7 및 Rab11 발현은 각 처리 그룹에서 적어도 50개 세포로부터의 형광 신호를 평균하여 정량화했다. Rab 단백질의 발현은 무처리 세포에 대해 정규화했다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. 각 Rab 단백질 그룹 내에서 ANOVA를 사용하여, 그룹 평균이 유의하게 상이한지를 판단했다. S2와 A1-25 또는 A1-50 사이의 본페로니 p-값 보정을 사용한 스튜던트 t-검정에서 *: p < 0.05 , **: p < 0.01.
도 13은 본 개시의 비제한적 LNP를 포함하는 조성물에서 성분으로 사용되는 예시적 콜레스테롤 유사체(예들 들면, 담즙산)의 화학 구조를 제공한다.
도 14A-14E는 Caco-2(도 14A), HeLa(도 14B), HepG2(도 14C), 주르캇(도 14D) 및 Raji(도 14E) 세포주에서 체노데옥시콜산(CDCA), 콜산(CA), 데옥시콜산(DCA) 및 리토콜산(LCA)을 포함하는 본 개시의 예시적 LNP의 투여에 따른 mRNA(예를 들면, 루시퍼라제) 전달 및/또는 발현에 관한 예시적 실험 데이터를 도시하는 막대 그래프를 제공하고; 백분율은 LNP의 콜레스테롤 성분을 구성하는 콜레스테롤 유사체의 비율을 나타낸다(예: CDCA의 경우 25%는 LNP의 전체 콜레스테롤 성분 중 25%가 CDCA로 구성되고 75%가 콜레스테롤인 것을 나타낸다).
도 15A-15B는 콜레스테롤 유사체를 포함하는 본 개시의 선택된 LNP를 복강내(i.p.) 투여한 마우스의 간, 비장, 자궁, 위, 소장 및 대장에서의 mRNA(예를 들면, 루시퍼라제) 전달 및/또는 발현과 관련된 예시적 데이터를 막대 그래프(도 15A) 및 이미지(도 15B)로 도시한다.
도 16A-16B는 콜레스테롤 유사체를 포함하는 본 개시의 선택된 LNP의 복강내(i.p.) 투여에 따른 비장 및 간에서 mRNA(예를 들면, 루시퍼라제) 전달 및/또는 발현과 관련된 예시적 데이터를 막대 그래프(도 16A) 및 이미지(도 16B)로 도시한다.
도 17A-17E는 S2(도 17B), C100(도 17C), D50(도 17D) 및 E75(도 17E)를 포함하여, 콜레스테롤 유사체를 포함하는 본 개시의 선택된 LNP를 정맥내 투여한 마우스의 심장, 폐, 신장, 자궁, 위, 소장 및 대장에서 mRNA(예를 들면, 루시퍼라제) 전달 및/또는 발현을 도시하는 막대 그래프(도 17A) 및 이미지(도 17B-17E)를 제공한다.
이제, 개시된 주제의 특정 실시양태를 상세히 참조할 것이며, 이의 예는 첨부된 도면에 부분적으로 설명되어 있다. 개시된 주제는 열거된 특허청구범위와 함께 기재될 것이지만, 예시된 주제는 특허청구범위를 개시된 주제로 한정하는 것을 의도한 것은 아니라는 것을 이해할 수 있을 것이다.
이 문서 전체에 걸쳐, 범위 형식으로 표현된 값은 범위의 한계로 명시적으로 기재된 수치뿐만 아니라, 해당 범위 내에 포함된 개별 수치 또는 하위 범위를 모두 포함하여 각 수치 및 하위 범위가 명시적으로 기재된 것과 같이 유연한 방식으로 해석되어야 한다. 예를 들면, "약 0.1% 내지 약 5%" 또는 "약 0.1% 내지 5%"의 범위는 약 0.1% 내지 약 5%뿐만 아니라 표시된 범위 내의 개별 값(예: 1%, 2%, 3% 및 4%) 및 하위 범위(예: 0.1% 내지 0.5%, 1.1% 내지 2.2%, 3.3% 내지 4.4%)를 포함하는 것으로 해석해야 한다. "약 X로부터 Y까지"라는 문장은, 달리 명시되지 않는 한, "약 X로부터 약 Y까지"와 동일한 의미를 갖는다. 마찬가지로, "약 X, Y 또는 약 Z"라는 문장은, 달리 명시되지 않는 한, "약 X, 약 Y 또는 약 Z"와 동일한 의미를 갖는다.
이 문서에서, 단수 표현 "a", "an" 또는 "the"라는 용어는, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 하나 또는 하나 이상을 포함하기 위해 사용된다. "또는"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 비배타적인 "또는"을 지칭하기 위해 사용된다. "A 및 B 중 적어도 하나" 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"라는 문장은 "A, B 또는 A와 B"와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 달리 정의되지 않고 본원에 사용된 문구 또는 용어는 설명의 목적으로만 사용되며 한정의 목적이 아님을 이해해야 한다. 섹션 제목의 사용은 본 문서의 독해를 돕기 위한 것이고 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며; 섹션 제목과 관련된 정보는 그 특정 섹션의 내부 또는 외부에 표시될 수 있다. 본 문서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 문서는 개별적으로 참조에 의해 통합된 것과 같이 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합되어 있다.
본원에 기재된 방법에서, 동작은, 시간적 또는 조작적 순서가, 명시적으로 언급된 경우를 제외하고는, 임의의 순서로 수행될 수 있다. 추가로, 명시적 클레임 언어가 개별적으로 수행되는 것을 명시하지 않는 한, 지정된 행위는 동시에 수행될 수 있다. 예를 들면, X를 수행하는 청구된 행위와 Y를 수행하는 청구된 행위는 단일 조작 내에서 동시에 수행될 수 있고, 수득되는 프로세스는 청구된 프로세스의 문자 그대로의 범위 내에 속한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 각 용어는 이 섹션에서 이와 연관된 의미를 갖는다.
관사 "a"와 "an"은 본원에서 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나 이상)을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 지속 시간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하는 경우, 본원에서 사용되는 "약"은, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문에, 지정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 더욱 바람직하게는 ±1%, 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "보조제(adjuvant)"라는 용어는 항원-특이적 적응 면역 반응을 증강시키는 임의의 분자로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은, 적어도 1개의 이중 결합이 2개의 탄소 원자 사이에 존재하는 것을 제외하고, 본원에 정의된 직쇄형 및 분지형 쇄 및 사이클릭 알킬 그룹을 지칭한다. 따라서, 알케닐 그룹은 2 내지 40개의 탄소 원자, 또는 2 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 2 내지 12개의 탄소 원자, 또는 일부 실시양태에서 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 예로서는 특히 비닐, -CH=C=CCH2, -CH=CH(CH3), -CH=C(CH3 ) 2, -C(CH3)=CH2, -C(CH3)=CH(CH3), -C(CH2CH3)=CH2, 사이클로헥세닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥사디에닐, 부타디에닐, 펜타디에닐 및 헥사디에닐 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "알콕시"라는 용어는 본원에 정의된 바와 같이 사이클로알킬 그룹을 포함한 알킬 그룹에 연결된 산소 원자를 지칭한다. 선형 알콕시 그룹의 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 분지형 알콕시의 예로는 이소프로폭시, 2급-부톡시, 3급-부톡시, 이소펜틸옥시, 이소헥실옥시 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 사이클릭 알콕시의 예로는 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 알콕시 그룹은 산소 원자에 결합된 약 1개 내지 약 12개, 약 1개 내지 약 20개 또는 약 1개 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있고, 이중 또는 삼중 결합을 추가로 포함할 수 있으며, 또한 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 알릴옥시 그룹 또는 메톡시에톡시 그룹은 구조의 2개의 인접한 원자가 치환되어 있다는 맥락에서 메틸렌디옥시 그룹과 마찬가지로 본원의 의미 내에서 알콕시 그룹이다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 1 내지 40개의 탄소 원자, 1 내지 약 20개의 탄소 원자, 1 내지 12개의 탄소 원자 또는 일부 실시양태에서 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 및 분지형 알킬 그룹 및 사이클로알킬 그룹을 지칭한다. 직쇄형 알킬 그룹의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸 그룹과 같이 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹이 포함된다. 분지형 알킬 그룹의 예로는 이소프로필, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 네오펜틸, 이소펜틸 및 2,2-디메틸프로필 그룹이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"이라는 용어는 n-알킬, 이소알킬 및 안테이소알킬 그룹뿐만 아니라 다른 분지쇄 형태의 알킬을 포함한다. 대표적 치환된 알킬 그룹은 본원에 기재된 임의의 그룹, 예를 들면, 아미노, 하이드록시, 시아노, 카복시, 니트로, 티오, 알콕시 및 할로겐 그룹으로 1회 이상 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알키닐"은, 2개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 삼중 결합이 존재하는 것을 제외하고, 직쇄 및 분지쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 따라서, 알키닐 그룹은 2 내지 40개의 탄소 원자, 2 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 2 내지 12개의 탄소 원자, 또는 일부 실시양태에서 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 예로는 특히 -C≡CH, -C≡C(CH3), -C≡C(CH2CH3), -CH2C≡CH, -CH2C≡C(CH3) 및 -CH2C≡C(CH2CH3) 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "아민"이라는 용어는, 예를 들면, 화학식 N(그룹)3을 갖는 1급, 2급 및 3급 아민을 지칭하고, 상기 화학식에서 각 그룹은 독립적으로 알킬, 아릴 등과 같이 H 또는 비-H일 수 있다. 아민은, -RNH2, 예를 들면, 알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민; R2NH(여기서, 각 R은 독립적으로 선택된다), 예컨대, 디알킬아민, 디아릴아민, 아르알킬아민, 헤테로사이클아민 등; 및 R3N(여기서, 각 R은 독립적으로 선택된다), 예컨대, 트리알킬아민, 디알킬아릴아민, 알킬디아릴아민, 트리아릴아민이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. "아민"이라는 용어는 본원에서 사용되는 암모늄 이온도 포함한다.
본원에서 사용되는 "아미노 그룹"이라는 용어는 -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 + 형태(여기서, 각 R은 독립적으로 선택된다)의 치환기, 및 양성자화될 수 없는 -NR3 +을 제외한 각각의 양성자화된 형태를 지칭한다. 따라서, 아미노 그룹으로 치환된 임의의 화합물은 아민으로 볼 수 있다. 본원의 의미에서 "아미노 그룹"은 1급, 2급, 3급 또는 4급 아미노 그룹일 수 있다. "알킬아미노" 그룹은 모노알킬아미노, 디알킬아미노 및 트리알킬아미노 그룹을 포함한다.
"음이온성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질에는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티딘산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG) 및 중성 지질에 결합된 기타 음이온 변형 그룹이 포함된다.
본원에 사용되는 "항체"라는 용어는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있고, 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수도 있다. 항체는 일반적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 일본쇄 항체 및 인간화 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다[참조: Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426].
"항체 단편"이라는 용어는 무손상 항체(intact antibody)의 일부를 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "항체 중쇄"는 천연 발생 입체구조의 모든 항체 분자에 존재하는 2개 유형의 폴리펩타이드 쇄 중 더 큰 쇄를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "항체 경쇄"는 천연 발생 입체구조의 모든 항체 분자에 존재하는 2개 유형의 폴리펩타이드 쇄 중 더 작은 쇄를 지칭한다. κ 및 λ 경쇄는 2개 주요 항체 경쇄 아이소타입을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "합성 항체"라는 용어는, 예를 들면, 박테리오파지에 의해 발현되는 것과 같이 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 코딩하는(encoding) DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 그 DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 기술분야에서 이용 가능하고 널리 공지된 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다. 이 용어는 또한 항체를 코딩하는 RNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. RNA 분자는 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하고, 여기서 RNA는 당해 기술분야에서 이용 가능하고 널리 공지된 DNA의 전사(합성 또는 클론화) 또는 기타 기술에 의해 수득된다.
본원에서 사용되는 "항원" 또는 "Ag"는 적응 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역원성-적격 세포의 활성화 또는 이들 둘 모두를 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 기능할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA 또는 RNA로부터 유래할 수 있다. 따라서, 당업자는 적응 면역 반응을 유도하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA 또는 RNA가 본원에서 사용되는 당해 용어로서 "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이들로 한정되지 않으며, 이러한 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것을 용이하게 알 수 있다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성되거나 생물학적 샘플로부터 유래할 수 있다는 것은 용이하게 알 수 있다. 이러한 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체가 포함될 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "아릴"이라는 용어는 환 내에 헤테로 원자를 함유하지 않는 사이클릭 방향족 탄화수소 그룹을 지칭한다. 따라서, 아릴 그룹은 페닐, 아줄레닐, 헵탈레닐, 비페닐, 인다세닐, 플루오레닐, 페난트레닐, 트리페닐에닐, 피레닐, 나프타세닐, 크리세닐, 비페닐에닐, 안트라세닐 및 나프틸 그룹을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 아릴 그룹은 그 그룹의 환 부분에 약 6개 내지 약 14개의 탄소를 함유한다. 아릴 그룹은 본원에 정의된 바와 같이 비치환 또는 치환될 수 있다. 대표적 치환 아릴 그룹은 일-치환될 수 있거나 2회 이상 치환될 수 있고, 예컨대, 페닐 환의 2, 3, 4, 5, 또는 6 위치 중 임의의 하나 이상에서 치환된 페닐 그룹일 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
"양이온성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH(예: 약 7.0의 pH)와 같이 선택된 pH에서 순 양전하를 갖는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다. 복수의 불포화 부위(예: 적어도 2개 또는 3개의 불포화 부위)를 갖는 알킬 쇄를 포함하는 양이온성 지질은 막 유동성이 증가된 지질 입자의 형성에 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 본 개시에서 또한 유용한 다수의 양이온성 지질 및 관련 유사체는 미국 특허공개번호 제20060083780호 및 제20060240554호, 미국 특허 제5,208,036호; 제5,264,618호; 제5,279,833호; 제5,283,185호; 제5,753,613호; 및 제5,785,992호; 및 PCT 공개공보 제WO 96/10390호에 기재되어 있고, 이러한 개시는 모든 목적을 위해 이의 전체가 참조에 의해 본원에 통합되어 있다. 양이온성 지질의 비제한적 예는 본원에 상세히 기재되어 있다. 일부 경우, 양이온성 지질은 양성자화 가능한 3급 아민(예: pH 적정 가능) 헤드 그룹, C18 알킬 쇄, 헤드 그룹과 알킬 쇄 사이의 에테르 연결, 0 내지 3개의 이중 결합을 포함한다. 이러한 지질에는, 예를 들면, DSDMA, DLinDMA, DLenDMA 및 DODMA가 포함된다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬"이라는 용어는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸 그룹과 같은 사이클릭 알킬 그룹을 지칭하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 사이클로알킬 그룹은 3개 내지 약 8~12개의 환 원을 가질 수 있지만, 다른 실시양태에서 환 탄소 원자의 수는 3개 내지 4개, 5개, 6개 또는 7개의 범위이다. 사이클로알킬 그룹은 추가로 노르보닐, 아다만틸, 보르닐, 캄페닐, 이소캄페닐 및 카레닐 그룹과 같은 폴리사이클릭 사이클로알킬 그룹 및 데칼리닐 등과 같은 융합 환을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 사이클로알킬 그룹은 또한 본원에 정의된 바와 같이 직쇄 또는 분지쇄 알킬 그룹으로 치환된 환을 포함한다. 대표적인 치환 사이클로알킬 그룹은 일치환될 수 있거나, 이들로 한정되지 않지만, 2,2-, 2,3-, 2,4-, 2,5- 또는 2,6-치환된 사이클로헥실 그룹 또는 일-, 이- 또는 삼-치환된 노르보닐 또는 사이클로헵틸 그룹과 같이 1회 이상 치환될 수 있으며, 이는, 예를 들면, 아미노, 하이드록시, 시아노, 카복시, 니트로, 티오, 알콕시 및 할로겐 그룹으로 치환될 수 있다. "사이클로알케닐"이라는 용어는 단독으로 또는 조합하여 사이클릭 알케닐 그룹을 나타낸다.
"질환"이란 동물이 항상성을 유지할 수 없는 건강 상태이고, 여기서 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있는 건강 상태이지만, 장애가 없는 경우보다 동물의 건강 상태가 양호하지 않은 상태이다. 장애를 치료하지 않고 방치한다고 해서, 반드시 동물의 건강 상태가 추가로 악화하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량", "약제학적 유효량" 및 "치료학적 유효량"이라는 용어는 독성은 없지만 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 약제의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화 또는 기타 생물학적 시스템의 원하는 변화일 수 있다. 임의의 개별 사례에서 적절한 치료량은 일상적 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특히, mRNA의 경우, mRNA와 관련된 치료용 핵산의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 원하는 효과, 예를 들면, 단백질이 발현되는 생물 내에서 바람직한 생물학적 효과를 유발하는 양의 단백질의 mRNA-유도 발현을 생성하기에 충분한 양이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 발현된 단백질은 신체 내의 세포 유형에서 정상적으로 발현되는 단백질의 활성 형태이고, 치료학적 유효량의 mRNA는 건강한 개체의 세포 유형에서 정상적으로 발현되는 단백질 양의 적어도 50%(예를 들면, 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%)인 코딩된 단백질의 양을 생성하는 양이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 발현된 단백질은 신체 내의 세포 유형에서 정상적으로 발현되는 단백질이고, 치료학적 유효량의 mRNA는 단백질의 비정상적 발현을 갖는 개체(즉, 단백질 결핍 개체)에서, 건강한 개체에서 관찰되는 것과 유사한 수준의 발현을 생성하는 양이다. mRNA 또는 단백질의 발현을 측정하는 데 적합한 검정법에는 당업자에게 공지된 표현형 검정법뿐만 아니라 도트 블롯, 노던 블롯, 제자리(in situ) 하이브리드화, ELISA, 면역침전, 효소 기능이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "코딩하는"이라는 용어는 각각 DNA 또는 RNA의 전사 또는 번역시, 핵산(즉, DNA 및/또는 RNA)에서 뉴클레오티드의 소정 서열에 의해 특정된 생성물(예를 들면, 단백질 및 RNA)을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "코딩하는"은 DNA 서열의 전사에 의해 특정된 RNA 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "코딩하는"은 mRNA의 번역에 의해 특정된 아미노산 서열(예를 들면, 폴리펩타이드 또는 단백질)을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "코딩하는"은 DNA의 mRNA로의 전사, 및 이후에 DNA 서열에 의해 코딩된 mRNA의 번역에 의해 특정된 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 생성물은 직접 전사 또는 번역 생성물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 코딩된 생성물은 당업자에 의해 이해되거나 합리적으로 예상되는 번역 후 변형을 포함할 수 있다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고, 다른 발현 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터에는 코스미드, 플라스미드(예: 네이키드 또는 리포솜에 함유된) RNA, 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입한 바이러스(예: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같이 당업자에게 공지된 모든 것들이 포함된다.
"완전 캡슐화"라는 용어는 지질 입자 내의 활성제 또는 치료제가, 유리 DNA, RNA 또는 단백질을 현저히 분해하는 혈청 또는 뉴클레아제 또는 프로테아제 검정에 노출된 후에도 현저히 분해되지 않는 것을 나타낸다. 완전 캡슐화 시스템에서, 바람직하게는, 입자 중의 활성제 또는 치료제의 약 25% 미만이 일반적으로 유리 활성제 또는 치료제의 100%를 분해하는 처리에서 분해되고, 더욱 바람직하게는 입자 중의 활성제 또는 치료제의 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만이 분해된다. 핵산 치료제의 맥락에서, 완전 캡슐화는 Oligreen® 검정에 의해 결정될 수 있다. Oligreen®은 용액 중의 올리고뉴클레오티드 및 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정량하기 위한 초고감도 형광 핵산 염색이다(Invitrogen Corporation으로부터 입수 가능; Carlsbad, Calif.). "완전 캡슐화"는 또한 지질 입자가 혈청 안정한, 즉 생체내 투여시에 이들의 성분으로 신속하게 분해되지 않는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "할로", "할로겐" 또는 "할라이드" 그룹은, 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 명시되지 않는 한, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다.
본원에서 사용되는 "할로알킬" 그룹은 모노-할로 알킬 그룹, 모든 할로 원자가 동일하거나 상이할 수 있는 폴리-할로 알킬 그룹, 모든 수소 원자가 불소와 같은 할로겐 원자로 치환되어 있는 퍼-할로 알킬 그룹을 포함한다. 할로알킬의 예로는 트리플루오로메틸, 1,1-디클로로에틸, 1,2-디클로로에틸, 1,3-디브로모-3,3-디플루오로프로필, 퍼플루오로부틸 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 "헬퍼 지질(helper lipid)"이라는 용어는 양이온성 지질-기반 입자와 같은 지질-기반 입자를 표적, 바람직하게는 세포 내로 전달하는 효과를 증가시킬 수 있는 지질을 지칭한다. 헬퍼 지질은 중성, 양으로 하전 또는 음으로 하전될 수 있다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 중성 또는 음으로 하전된다. 헬퍼 지질의 비제한적 예로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 등이 포함된다. 동물의 건강 상태에서.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"이라는 용어는 5개 이상의 환 원을 함유하는 방향족 환 화합물을 지칭하고, 그 중 하나 이상은 이들로 한정되지 않지만 N, O 및 S와 같은 헤테로 원자이고; 예를 들면, 헤테로아릴 환은 5개 내지 약 8-12개의 환 원을 가질 수 있다. 헤테로아릴 그룹은 방향족 전자 구조를 갖는 다양한 헤테로사이클릴 그룹이다. C2-헤테로아릴로서 지정된 헤테로아릴 그룹은 2개의 탄소 원자와 3개의 헤테로 원자를 갖는 5-환, 2개의 탄소 원자와 4개의 헤테로 원자를 갖는 6-환 등일 수 있다. 마찬가지로, C4-헤테로아릴은 하나의 헤테로 원자를 갖는 5-환, 2개의 헤테로 원자를 갖는 6-환 등일 수 있다. 탄소 원자 수와 헤테로 원자 수를 합하면 환 원자의 총 수와 같다. 헤테로아릴 그룹으로는 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 아자벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 이미다조피리디닐, 이속사졸로피리디닐, 티아나프탈레닐, 푸리닐, 잔티닐, 아데니닐, 구아니닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 퀴녹살리닐 및 퀴나졸리닐 그룹이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 헤테로아릴 그룹은 비치환되거나 본원에 언급된 바와 같이 치환될 수 있다. 대표적인 치환된 헤테로아릴 그룹은 본원에 열거된 것과 같은 그룹으로 1회 이상 치환될 수 있다.
아릴 및 헤테로아릴 그룹의 추가 예로는 페닐, 비페닐, 인데닐, 나프틸(1-나프틸, 2-나프틸), N-하이드록시테트라졸릴, N-하이드록시트리아졸릴, N-하이드록시이미다졸릴, 안트라세닐(1-안트라세닐, 2-안트라세닐, 3-안트라세닐), 티오페닐(2-티에닐, 3-티에닐), 푸릴(2-푸릴, 3-푸릴), 인돌릴, 옥사디아졸릴, 이속사졸릴, 퀴나졸리닐, 플루오레닐, 잔테닐, 이소인다닐, 벤즈하이드릴, 아크리디닐, 티아졸릴, 피롤릴(2-피롤릴), 피라졸릴(3-피라졸릴), 이미다졸릴(1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 5-이미다졸릴), 트리아졸릴(1,2,3-트리아졸-1-일, 1,2,3-트리아졸-2-일, 1,2,3-트리아졸-4-일, 1,2,4-트리아졸-3-일), 옥사졸릴(2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴), 티아졸릴(2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴), 피리딜(2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜), 피리미디닐(2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐), 피라지닐, 피리다지닐(3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐), 퀴놀릴(2-퀴놀릴, 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴), 이소퀴놀릴(1-이소퀴놀릴, 3-이소퀴놀릴, 4-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 6-이소퀴놀릴, 7-이소퀴놀릴, 8-이소퀴놀릴), 벤조[b]푸라닐(2-벤조[b]푸라닐, 3-벤조[b]푸라닐, 4-벤조[b]푸라닐, 5-벤조[b]푸라닐, 6-벤조-[b]푸라닐), 7-벤조[b]푸라닐), 2,3-디하이드로벤조[b]푸라닐(2-(2,3-디하이드로벤조[b]푸라닐), 3-(2,3-디하이드로벤조[b]푸라닐), 4-(2,3-디하이드로벤조[b]푸라닐), 5-(2,3-디하이드로-벤조[b]푸라닐), 6-(2,3-디하이드로-벤조[b]푸라닐), 7-(2,3-디하이드로-벤조[b]푸라닐), 벤조[b]티오페닐(2-벤조[b]티오페닐, 3-벤조[b]티오페닐, 4-벤조[b]티오페닐, 5-벤조[b]티오페닐), 6-벤조[b]티오페닐, 7-벤조[b]티오페닐), 2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐, (2-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 3-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 4-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 5-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 6-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 7-(2,3-디하이드로-벤조[b]티오페닐), 인돌릴(1-인돌릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴), 인다졸(1-인다졸릴, 3-인다졸릴, 4-인다졸릴, 5-인다졸릴, 6-인다졸릴, 7-인다졸릴), 벤즈이미다졸릴(1-벤즈이미다졸릴, 2-벤즈이미다졸릴, 4-벤즈이미다졸릴, 5-벤즈이미다졸릴, 6-벤즈이미다졸릴, 7-벤즈이미다졸릴, 8-벤즈이미다졸릴), 벤즈옥사졸릴(1-벤즈옥사졸릴, 2-벤즈옥사졸릴), 벤조티아졸릴(1-벤조티아졸릴, 2-벤조티아졸릴, 4-벤조티아졸릴, 5-벤조티아졸릴, 6-벤조티아졸릴, 7-벤조티아졸릴), 카바졸릴(1-카바졸릴, 2-카바졸릴, 3-카바졸릴, 4-카바졸릴), 5H-디벤즈[b,f]아제핀(5H-디벤즈[b,f]아제핀-1-일, 5H-디벤즈[b,f]아제핀-2-일, 5H-디벤즈[b,f]아제핀-3-일, 5H-디벤즈[b,f]아제핀-4-일, 5H-디벤즈[b,f]아제핀-5-일), 10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]아제핀(10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]아제핀-1-일, 10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]아제핀-2-일, 10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]아제핀-3-일, 10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]-아제핀-4-일, 10,11-디하이드로-5H-디벤즈[b,f]아제핀-5-일) 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "헤테로사이클로알킬"이라는 용어는 3 내지 8개 원자의 단일 환을 포함하는 지방족, 부분 불포화 또는 완전 포화, 3원 내지 14원의 환 시스템, 및 환의 탄소 원자 중 적어도 하나가 이들로 한정되지 않지만 질소, 산소, 황 또는 인과 같은 헤테로 원자로 대체되는 바이사이클릭 및 트리사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 헤테로사이클로알킬은 산소, 질소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함할 수 있고, 여기서 질소 및 황 헤테로 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로 원자는 임의로 치환될 수 있다. 대표적 헤테로사이클로알킬 그룹으로는 하기 예시적 그룹: 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐 및 테트라하이드로푸릴이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 "헤테로사이클릴"이라는 용어는 3개 이상의 환 원을 포함하는 방향족 및 비방향족 환 화합물을 지칭하고, 그 중 하나 이상은 이들로 한정되지 않지만 N, O 및 S와 같은 헤테로 원자이다. 따라서, 헤테로사이클릴은 사이클로헤테로알킬 또는 헤테로아릴이거나, 폴리사이클릭인 경우, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클릴 그룹은 3개 내지 약 20개의 환 원을 포함하는 반면, 다른 이러한 그룹은 3개 내지 약 15개의 환 원을 갖는다. C2-헤테로사이클릴로서 지정된 헤테로사이클릴 그룹은 2개의 탄소 원자와 3개의 헤테로 원자를 갖는 5-환, 2개의 탄소 원자와 4개의 헤테로 원자를 갖는 6-환 등일 수 있다. 마찬가지로, C4-헤테로사이클릴은 1개의 헤테로 원자를 갖는 5-환, 2개의 헤테로 원자를 갖는 6-환 등일 수 있다. 탄소 원자의 수와 헤테로 원자의 수는 환 원자의 총 수와 같다. 헤테로사이클릴 환은 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수도 있다. 헤테로아릴 환은 헤테로사이클릴 그룹의 일 실시양태이다. "헤테로사이클릴 그룹"이라는 문구는 융합된 방향족 및 비방향족 그룹을 포함하는 것들을 포함하는 융합된 환 종을 포함한다. 예를 들면, 디옥솔라닐 환 및 벤즈디옥솔라닐 환 시스템(메틸렌디옥시페닐 환 시스템)은 모두 본원의 의미 내에서 헤테로사이클릴 그룹이다. 이 문구는 또한 이로써 한정되지 않지만 퀴누클리딜과 같은 헤테로 원자를 함유하는 폴리사이클릭 환 시스템을 포함한다. 헤테로사이클릴 그룹은 비치환되거나 본원에 언급된 바와 같이 치환될 수 있다. 헤테로사이클릴 그룹으로는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 벤조푸라닐, 디하이드로벤조푸라닐, 인돌릴, 디하이드로인돌릴, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 아자벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 이미다조피리디닐, 이속사졸로피리디닐, 티아나프탈레닐, 푸리닐, 잔티닐, 아데니닐, 구아니닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 퀴녹살리닐 및 퀴나졸리닐 그룹이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 대표적인 치환된 헤테로사이클릴 그룹은 일치환 또는 2회 이상 치환될 수 있고, 예를 들면, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-치환되거나 본원에 열거된 것들과 같은 그룹으로 이치환되는 피페리디닐 또는 퀴놀리닐 그룹일 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 "상동성(homologous)"은 2개 폴리펩타이드 사이 또는 2개 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 비교되는 2개 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되어 있는 경우, 예를 들면, 2개 DNA 분자의 각 위치가 아데닌에 의해 점유되어 있는 경우, 해당 분자는 그 위치에서 상동성이다. 2개 서열 사이의 상동성 비율은 2개 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동 위치의 수를 비교된 위치 수 × 100으로 나눈 함수이다. 예를 들면, 2개 서열의 10개 위치 중 6개가 일치 또는 상동하는 경우, 2개 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 2개 서열을 정렬하여 최대 상동성을 제공할 때에 이루어진다.
본원에서 사용되는 "이온화 가능한 지질"이라는 용어는 적어도 하나의 양성자성 또는 탈양성자성 그룹을 갖는 지질(예: 양이온성 지질)을 지칭하고, 이러한 지질은 생리학적 pH(예: pH 7.4) 이하에서 양으로 하전되고 제2 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서 중성이다. 당업자에게는, pH의 함수로서 양성자의 부가 또는 제거는 평형 프로세스이고, 하전 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 지칭하며 모든 지질이 하전 또는 중성 형태로 존재할 것을 필요로 하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 양성자 그룹의 pKa가 약 4 내지 약 7의 범위이다.
"면역원"이란 면역 반응을 생성하기 위해 체내에 도입되는 임의의 물질을 지칭한다. 이러한 물질은 단백질과 같은 물리적 분자일 수도 있고, DNA, mRNA 또는 바이러스와 같은 벡터에 의해 코딩될 수도 있다.
본원에 사용되는 "면역 세포"는 면역 반응의 개시에 관여하는 임의의 세포를 의미한다. 이러한 세포에는 T 세포, B 세포, NK 세포, 항원-제시 세포(예: 수지상 세포 및 마크로파지), 단핵구, 호중구, 호산구, 호염기구 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
"단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리"되지 않지만, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 예를 들면, 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
"지질"이라는 용어는 지방산의 에스테르를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 유기 화합물의 그룹을 지칭하고, 물에는 불용성이지만 다수의 유기 용매에는 용해되는 것을 특징으로 한다. 이들은 통상 적어도 3개 클래스, (1) 지방과 오일, 뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질과 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도된 지질"로 분류된다.
본원에서 사용되는 "접합된 지질"이라는 용어는 지질 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 폴리머 그룹에 접합되는 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합체로는 폴리아미드 올리고머(예: ATTA-지질 접합체), PEG-지질 접합체, 예컨대, 디알킬옥시프로필에 결합된 PEG, 디아실글리세롤에 결합된 PEG, 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 세라미드에 결합된 PEG(예: 미국 특허 제5,885,613호, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합되어 있음), 양이온성 PEG 지질 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. PEG는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. 예를 들면, 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티를 포함하여 PEG를 지질에 결합시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 비-에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "캡슐화된 지질"은 완전 캡슐화, 부분 캡슐화 또는 이들 둘 다를 수반하는 핵산(예를 들면, 단백질 카고)과 같은 활성제 또는 치료제를 제공하는 지질 입자를 지칭할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다(예를 들면, SPLP, pSPLP, SNALP 또는 기타 핵산-지질 입자를 형성하기 위해).
"지질 나노입자"라는 용어는 하나 이상의 지질 및/또는 추가 약제를 포함하는 나노미터 오더(예: 1 내지 1,000nm)의 적어도 하나의 치수를 갖는 입자를 지칭한다.
"지질 입자"라는 용어는 핵산(예를 들면, mRNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 관심 있는 표적 부위로 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 전형적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 접합 지질로부터 형성되는 본 개시의 지질 입자에서, 활성제 또는 치료제는 지질에 캡슐화되어 효소 분해로부터 약제를 보호할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 뉴클레오시드(N-글리코시드 연결을 통해 리보스 또는 데옥시리보스 당에 결합된 핵염기)에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시티딘을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 문구는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버젼에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 "조절"이라는 용어는 치료 또는 화합물의 부재하에 대상체의 반응 수준 및/또는 동일하지만 무처리 대상체의 반응 수준과 비교하여 대상체의 반응 수준에서 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 이 용어는 천연 신호 또는 반응에 교란 및/또는 영향을 미쳐 대상체(바람직하게는 인간)에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"에는 서로 축퇴 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 단백질과 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에는 인트론이 포함될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열에는 세포의 번역 기계에 의해 번역될 수 있는 변형 뉴클레오시드가 함유될 수 있다. 예를 들면, 모든 우리딘이 슈도우리딘, 1-메틸 슈도우리딘 또는 또 다른 변형 뉴클레오시드로 대체된 mRNA를 들 수 있다.
"중성 지질"이라는 용어는 선택된 pH에서 비하전된 또는 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 하나를 지칭한다. 생리적 pH에서, 이러한 지질에는, 예를 들면, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤 등이 포함된다.
"비양이온성 지질"이라는 용어는 임의의 양친매성 지질, 뿐만 아니라 기타 중성 지질 또는 음이온성 지질을 모두 지칭한다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 후자의 발현을 초래한다. 예를 들면, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 또는 RNA 서열은 연속하고, 2개 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우에는 동일한 판독 프레임 내에 있다.
"환자", "대상체", "개체" 등의 용어는 본원에서 호환적으로 사용되고, 본원에 기재된 방법에 적합한, 시험관내 또는 제자리이든, 모든 동물 또는 이의 세포를 지칭한다. 특정 비제한적 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
"폴리머 접합된 지질"이라는 용어는 지질 부분과 폴리머 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리머 접합된 지질의 예는 페길화 지질이다. "페길화 지질"이라는 용어는 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG), DSPE-PEG-DBCO, DOPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-아지드, DPPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-카복시-NHS, DOPE-PEG-카복실산, DSPE-PEG-카복실산 등을 포함한다.
본원에 사용되는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 추가로, 핵산은 뉴클레오티드의 폴리머이다. 따라서, 본원에서 사용되는 핵산과 폴리뉴클레오티드는 호환 가능하다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적 지식을 갖고 있다. 단량체 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는, 재조합 수단, 즉 통상의 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용하여 및 합성 수단에 의해 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 당해 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 경우에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 "뉴클레오시드-변형된 핵산"이고, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 핵산을 지칭한다. "변형된 뉴클레오시드"는 변형을 갖는 뉴클레오시드를 의미한다. 예를 들면, RNA에서는 100개 초과의 뉴클레오시드 변형이 확인되었다[참조: Rozenski et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197].
특정 실시양태에서, "슈도우리딘"은, 일부 실시양태에서, m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필) 슈도우리딘을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 m5D(5-메틸디하이드로우리딘)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 추가로 변형되지 않은 슈도우리딘 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 상기 슈도우리딘 중 임의의 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기타 슈도우리딘을 지칭한다. 각 가능성은 본 발명의 개별 실시양태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 호환적으로 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하고, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는, 예를 들면, 당해 기술분야에서 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 쇄, 및 일반적으로 당해 기술분야에서 단백질로 지칭되는 긴 쇄를 모두 포함하고, 이의 종류는 다양하다. "폴리펩타이드"에는, 예를 들면, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 호모이량체, 헤테로이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등이 포함된다. 폴리펩타이드에는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 이들의 조합이 포함된다.
본원에서 사용되는 "프로모터"라는 용어는, 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기계 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다. 예를 들면, 박테리오파지 RNA 폴리머라제에 의해 인식되고 시험관내 전사에 의해 mRNA의 생성에 사용되는 프로모터가 있다.
본원에서 항체와 관련하여 사용되는 "특이적으로 결합한다"는 용어는 특정 항원을 인식하지만 샘플의 다른 분자를 실질적으로 인식 또는 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들면, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 다른 종의 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 이종간 반응성 자체는 항체의 특이성 분류를 변경하는 것은 아니다. 또 다른 예로서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원의 상이한 대립유전자 형태에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성 자체는 항체의 특이성 분류를 변경하는 것은 아니다. 일부 경우에, "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종의 상호작용과 관련하여 해당 상호작용이 화학 종의 특정 구조(예: 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 의미로 사용될 수 있고; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하여 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 비표지 유리 A)를 함유하는 분자가 존재하면, 항체에 결합된 표지된 A의 양이 감소한다.
본원에서 정의된 분자 또는 유기 그룹과 관련하여 본원에서 사용되는 "치환된"이라는 용어는 그 안에 함유된 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 비수소 원자로 치환된 상태를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "작용기" 또는 "치환기"라는 용어는 분자 또는 유기 그룹 상에서 치환될 수 있거나 치환되는 그룹을 지칭한다. 치환기 또는 작용기의 예로는 할로겐(예: F, Cl, Br 및 I); 하이드록실 그룹, 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알콕시 그룹, 옥소(카보닐) 그룹, 카복실산, 카복실레이트 및 카복실레이트 에스테르를 포함하는 카복실 그룹과 같은 그룹 중의 산소 원자; 티올 그룹, 알킬 및 아릴 설파이드 그룹, 설폭사이드 그룹, 설폰 그룹, 설포닐 그룹 및 설폰아미드 그룹과 같은 그룹 중의 황 원자; 아민, 하이드록시아민, 니트릴, 니트로 그룹, N-옥사이드, 하이드라지드, 아지드 및 엔아민과 같은 그룹 중의 질소 원자; 및 다양한 기타 그룹 중의 기타 헤테로 원자가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 치환된 탄소(또는 기타) 원자에 결합할 수 있는 치환기의 비제한적 예로는 F, Cl, Br, I, OR, OC(O)N(R)2, CN, NO, NO2, ONO2, 아지도, CF3, OCF3, R, O(옥소), S(티오노), C(O), S(O), 메틸렌디옥시, 에틸렌디옥시, N(R)2, SR, SOR, SO2R, SO2N(R)2, SO3R, C(O)R, C(O)C(O)R, C(O)CH2C(O)R, C(S)R, C(O)OR, OC(O)R, C(O)N(R)2, OC(O)N(R)2, C(S)N(R)2, (CH2)0-2N(R)C(O)R, (CH2)0-2N(R)N(R)2, N(R)N(R)C(O)R, N(R)N(R)C(O)OR, N(R)N(R)CON(R)2, N(R)SO2R, N(R)SO2N(R)2, N(R)C(O)OR, N(R)C(O)R, N(R)C(S)R, N(R)C(O)N(R)2, N(R)C(S)N(R)2, N(COR)COR, N(OR)R, C(=NH)N(R)2, C(O)N(OR)R 및 C(=NOR)R이 포함되고, 여기서 R은 수소 또는 탄소-기반 모이어티일 수 있고; 예를 들면, R은 수소, (C1-C100) 하이드로카빌, 알킬, 아실, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬일 수 있거나; 또는 질소 원자 또는 인접한 질소 원자에 결합된 2개의 R 그룹은 질소 원자 또는 원자들과 함께 헤테로사이클릴을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료적"이라는 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 또는 장애 상태의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 억제, 감소, 완화 또는 근절에 의해 수득된다.
"치료학적 유효량"이라는 용어는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 수 있는 대상 화합물의 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"이라는 용어에는 투여시 치료되는 장애 또는 질환의 징후 또는 증상 중 하나 이상의 발증을 예방하거나, 또는 어느 정도 완화하기에 충분한 화합물의 양이 포함된다. 치료학적 유효량은 화합물, 질환 및 이의 중증도, 치료되는 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라진다.
이 용어가 본원에서 사용되는 경우, 질환을 "치료하다"라는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애 중 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"이라는 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 프로세스를 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 이 세포에는 일차 대상 세포 및 이의 자손이 포함된다.
본원에서 사용된 "전사 제어하에" 또는 "작동적으로 연결된"이라는 문구는 프로모터가 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 방향에 위치하여 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다수의 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 또한, 이 용어는, 예를 들면, 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같이 핵산의 세포내 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
범위: 본 개시 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태가 범위 형식으로 표시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 유연하지 않게 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 해당 범위 내의 개별 수치뿐만 아니라 가능한 모든 하위-범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6의 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위-범위, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치(예: 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 6)를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
지질 나노입자(LNP) 및 이의 조성물
일 양태에서, 본 개시는 지질 나노입자(LNP)를 제공하고, 이는 특정 실시양태에서 약제학적 조성물과 같은 조성물의 일부이지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 이온화 가능한 지질을 포함하고, 여기서 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 45mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물의 조합은 LNP의 약 5mol% 내지 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질을 포함하고, 여기서 PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 핵산 분자 및 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 및/또는 치료제는 적어도 부분적으로 캡슐화되어 있다.
특정 실시양태에서, LNP는 mRNA, siRNA, 마이크로RNA, CRISPR-Cas9, 소분자, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, LNP는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 변형된 RNA, 안타고미르, 안티센스 분자 및 표적 핵산 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, CAR은 병원성 세포 또는 종양 세포의 표면 항원에 대한 결합에 특이적이다. 특정 실시양태에서, LNP는 관심 있는 표적 세포에 대한 결합에 특이적인 표적화 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 말초 혈액 단핵세포 및 면역 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, LNP는 T 세포에 대한 결합에 특이적인 면역 세포 표적화 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표면 분자에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
A1 및 A2는 CH, N 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L1 및 L6은 CR19 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
L2 및 L5의 각 발생은 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L3 및 L4는 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17, R18 및 R19의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬), 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐), 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐), 임의로 치환된 C6-C10 아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C10 아릴), 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴), C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z'(R21)z"-에스테르, -Y(R20)z'(R21)z", -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나,
또는, R3a와 R3b, R4a와 R4b, R5a와 R5b, R6a와 R6b, R7a와 R7b, R8a와 R8b, R9a와 R9b, R10a와 R10b, R11a와 R11b, R12a와 R12b, R13a와 R13b, R14a와 R14b, 또는 R15a와 R15b로부터 선택된 2개의 저미날(geminal) 치환기는 이들이 결합되어 있는 C 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
Y의 각 발생은 C, N, O, S 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R20 및 R21의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
또는, R20 및 R21은 이들이 결합되어 있는 Y 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
z' 및 z"의 각 발생은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w 및 x의 각 발생은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
[화학식 II]
[화학식 III]
[화학식 IV]
[화학식 V]
[화학식 VI]
[화학식 VII]
상기 화학식 II 내지 VII에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고;
b1, b2, b3, b4 및 b5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
c1 및 c2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
d1 및 d2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
[화학식 VIII]
[화학식 IX]
[화학식 X]
[화학식 XI]
[화학식 XII]
[화학식 XIII]
[화학식 XIV]
[화학식 XV]
상기 화학식 VIII 내지 XV에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(2-(4-(2-((2-(2-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)에톡시)에틸)(2-하이드록시테트라데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에톡시)에틸)아잔디일)비스(테트라데칸-2-올)을 포함한다:
[화학식 C14-4]
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 덱사메타손이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 38.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 38.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 38.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:1(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:2(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:3(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:4(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:5(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:6(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:7(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:8(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:9(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 1:1(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 1:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 2:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 3:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 4:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 5:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 6:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 7:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 8:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 9:10(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 8:2(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 7:3(콜레스테롤:덱사메타손)의 중량비를 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:1(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:2(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:3(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:4(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:5(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:6(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:7(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:8(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:9(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 1:1(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 1:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 2:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 3:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 4:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 6:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 7:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 8:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 9:10(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 8:2(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 7:3(콜레스테롤:덱사메타손) 미만의 중량비를 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 10:1(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:2(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:3(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:4(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:5(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:6(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:7(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:8(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:9(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 1:1(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 1:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 2:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 3:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 4:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 6:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 7:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 8:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 9:10(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 8:2(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 7:3(콜레스테롤:덱사메타손) 초과의 중량비를 갖는다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 50mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 50mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 이온화 가능한 지질은 MC3를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 이온화 가능한 지질은 C12-200을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 C14-494를 포함한다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 약 45mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPC)이다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 약 13mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 1.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 1.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 1.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함한다.
특정 실시양태에서, LNP에서 (a):(b):(c):(d)의 몰 비율은 약 50:10:38.5:1.5이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 하이드록시 치환된 콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 에폭시 치환된 콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 케토 치환된 콜레스테롤이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 7-α-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 7-β-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 19-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 20-(S)-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 24-(S)-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 25-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 7-케토콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 5,6-에폭시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 3β,5α,6β-트리하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물이 4β-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 27-하이드록시콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 22-(R)-하이드록시콜레스테롤이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤과 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 30mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 30mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 30mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 C14-494이다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 약 45mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 약 13mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함한다.
특정 실시양태에서, LNP에서 (a):(b):(c):(d)의 몰 비율은 약 30:16:46.5:2.5이다.
특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤은 약 50:50(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤)의 몰 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7-α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤은 약 50:50(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤) 미만의 몰 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7-α-하이드록시콜레스테롤은 약 50:50(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤) 초과의 몰 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤은 약 75:25(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤)의 몰 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤은 약 75:25(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤) 미만의 몰 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, (c)는 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤은 약 75:25(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤) 초과의 몰 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 카복시 치환된 콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 담즙산이다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 약 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤-대체물은 LNP의 약 46.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 미만의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 5:95(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 10:90(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 12.5:87.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 15:85(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 20:80(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 25:75(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 30:70(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 35:65(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 40:60(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 45:55(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 50:50(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 55:45(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 60:40(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 65:35(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 70:30(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 75:25(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 80:20(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 85:15(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 87.5:12.5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 90:10(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 95:5(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물은 약 100:0(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물) 초과의 몰 백분율 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 체노데옥시콜산(CDCA)이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 콜린산(CA)이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 데옥시콜산(DCA)이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 리토콜산(LCA)이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 타우로콜산이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 글리코콜산이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 타우로체노데옥시콜산이다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤-대체물은 글리코체노데옥시콜산이다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 35mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 35mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 35mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 C14-494이다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 약 45mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 LNP의 약 16mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, 헬퍼 지질은 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 약 100mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 약 13mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol%를 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol% 미만을 구성한다. 특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 2.5mol% 초과를 구성한다.
특정 실시양태에서, PEG 또는 PEG-접합 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함한다.
특정 실시양태에서, LNP에서 (a):(b):(c):(d)의 몰 비율은 약 35:16:46.5:2.5이다.
지질
본원에서 사용되는 "양이온성 지질"이라는 용어는 양이온성이거나, 또는 pH가 지질의 이온화 가능한 그룹의 pK 이하로 낮아지면 양이온성(양성자화)이 되지만 pH 값이 높아지면 점차 중성으로 되는 지질을 지칭한다. pK보다 낮은 pH 값에서, 지질은 음으로 하전된 핵산과 회합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 pH 감소시 양전하를 띠는 쯔비터이온 지질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 갖는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 이러한 지질에는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N-2-(스페르민카복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 카복시스페르민(DOGS), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-디메틸-2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 본 발명에 사용될 수 있는 양이온성 지질의 다수의 시판 제제가 이용 가능하다. 예를 들면, 여기에는 LIPOFECTIN®(DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 시판 양이온성 리포좀, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 GIBCO/BRL), LIPOFECTAMINE®(N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 시판 양이온성 리포좀, GIBCO/BRL), 및 TRANSFECTAM®(에탄올에 디옥타데실아미도글리실 카복시스페르민(DOGS)을 포함하는 시판 양이온성 지질, 위스콘신 매디슨 소재의 Promega Corp.)이 포함된다. 하기 지질은 양이온성이고, 생리학적 pH 이하에서 양전하를 갖는다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀렌일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA).
특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 본 발명에 유용한 적절한 아미노 지질에는 이의 전체가 참조에 의해 본원에 통합되는 제WO 2012/016184호에 기재된 것들이 포함된다. 대표적 아미노 지질로는 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레오일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA) 및 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA)이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 지질은 PEG화 지질이고, DSPE-PEG-DBCO, DOPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-아지드, DPPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-카복시-NHS, DOPE-PEG-카복실산, DSPE-PEG-카복실산을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
"중성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH에서 비하전되거나 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 하나를 지칭한다. 대표적 중성 지질로는 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디하이드로 스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로사이드 등이 포함된다.
예시적 중성 지질에는, 예를 들면, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG, 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG2000, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC) 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트랜스DOPE)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다.
"스테로이드"는 하기 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
.
특정 실시양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, 양이온성 지질의 몰 비율.
"음이온성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 지칭한다. 이러한 지질에는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤(POPG) 및 중성 지질에 결합된 기타 음이온 변형 그룹이 포함된다.
"폴리머 접합 지질"이라는 용어는 지질 부분과 폴리머 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리머 접합 지질의 예는 페길화 지질이다. "페길화 지질"이라는 용어는 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 말레이미드 PEG(mPEG), DSPE-PEG-DBCO, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG), DOPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-아지드, DSPE-PEG-카복시-NHS, DOPE-PEG-카복실산, DSPE-PEG-카복실산 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화 지질)인 추가의 안정화 지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티드산, PEG-변형 세라미드(예: PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤, PEG-변형 디알킬글리세롤이 포함된다. 대표적 폴리에틸렌 글리콜-지질에는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA 및 PEG-s-DMG가 포함된다. 특정 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바밀]-1,2-디미리스틸옥실프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 특정 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG이다. 다른 실시양태에서, LNP는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 페길화된 디아실글리세롤(PEG-DAG), 페길화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEG-S-DAG), 페길화된 세라미드(PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 디알콕시프로필카바메이트이다.
특정 실시양태에서, 추가 지질은 약 1mol% 내지 약 10mol%의 양으로 LNP에 존재한다. 특정 실시양태에서, 추가 지질은 약 1mol% 내지 약 5mol%의 양으로 LNP에 존재한다. 특정 실시양태에서, 추가 지질은 약 1mol% 또는 약 2.5mol%의 양으로 LNP에 존재한다.
"지질 나노입자"라는 용어는 하나 이상의 지질(예: 화학식 I 내지 XV의 지질)을 포함하는 나노미터 오더(예: 1 내지 1,000nm)의 적어도 하나의 치수를 갖는 입자를 지칭한다.
다양한 실시양태에서, 지질 나노입자는 평균 직경이 약 30nm 내지 약 150nm, 약 40nm 내지 약 150nm, 약 50nm 내지 약 150nm, 약 60nm 내지 약 130nm, 약 70nm 내지 약 110nm, 약 70nm 내지 약 100nm, 약 80nm 내지 약 100nm, 약 90nm 내지 약 100nm, 약 70nm 내지 약 90nm, 약 80nm 내지 약 90nm, 약 70nm 내지 약 80nm, 또는 약 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 55nm, 60nm, 65nm, 70nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 105nm, 110nm, 115nm, 120nm, 125nm, 130nm, 135nm, 140nm, 145nm 또는 150nm이다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 지질 또는 LNP는 실질적으로 무독성이다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 지질 또는 LNP는 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된 LNP는 약 10mol% 내지 약 45mol%의 농도 범위에서 C14-4를 포함한다. 일부 실시양태에서, C14-4는 약 40%의 몰 비율로 존재한다.
일부 실시양태에서, 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된 LNP는 약 10mol% 내지 약 45mol%의 농도 범위의 인지질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인지질은 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)이고, DOPE는 약 25의 몰 비율 또는 약 25%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 실시양태에서, 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된 LNP는 약 5mol% 내지 약 50mol%의 농도 범위의 콜레스테롤 지질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤은 약 30의 몰 비율 또는 약 30%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 실시양태에서, 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된 LNP는 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%의 농도 범위의 총 PEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 총 PEG는 약 2.5의 몰 비율 또는 약 2.5%의 몰 백분율로 존재한다.
특정 실시양태에서, 생체내 면역 세포 표적화를 위한 안정성을 위해 제형화된 LNP는 이온화 가능한 지질 C14-4, DOPE, 콜레스테롤 및 총 PEG를 포함하고, 여기서 C14-4:DOPE:콜레스테롤:총 PEG는 약 40:25:30:2.5의 몰 비율 또는 약 40%:25%:30%:2.5%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 실시양태에서, 총 PEG는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 또는 1:15 초과, 또는 이들 사이의 임의의 몰 비율로 말레이미드 PEG(mPEG) 및 PEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, LNP는 약 2.5의 몰 비율로 총 PEG를 포함하고, 여기서 총 PEG는 1:3의 몰 비율로 mPEG 및 PEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, LNP는 약 2.5의 몰 비율로 총 PEG를 포함하고, 총 PEG는 1:5의 몰 비율로 PEG 및 mPEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, LNP는 약 2.5의 몰 비율로 총 PEG를 포함하고, 총 PEG는 1:7의 몰 비율로 PEG 및 mPEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, LNP는 약 2.5의 몰 비율로 총 PEG를 포함하고, 총 PEG는 1:10의 몰 비율로 PEG 및 mPEG를 포함한다.
소분자 치료제
다양한 실시양태에서, 약제는 치료제이다. 다양한 실시양태에서, 치료제는 소분자이다. 치료제가 소분자인 경우, 소분자는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 이러한 방법에는 화학적 유기 합성 또는 생물학적 수단이 포함된다. 생물학적 수단은 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하는 생물학적 공급원으로부터의 정제, 재조합 합성 및 시험관내 번역 시스템을 포함한다. 특정 실시양태에서, 소분자 치료제는 유기 분자, 무기 분자, 생체분자, 합성 분자 등을 포함한다.
다양한 질환 및 상태의 치료에 잠재적으로 유용한 분자적으로 다양한 화합물의 조합 라이브러리는 라이브러리의 제조 방법과 마찬가지로 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이 방법은 고상 합성, 용액 방법, 단일 화합물의 병렬 합성, 화학적 혼합물의 합성, 강성 코어 구조, 유연한 선형 서열, 디컨볼루션 전략, 태그 기술, 및 리드 발견을 위한 비편향된 분자 랜드스케이프 대 리드 개발을 위한 편향된 구조를 포함하여 당업자에게 널리 공지된 다양한 기술을 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료제는 조합 기법을 사용하여 합성 및/또는 동정된다.
작은 라이브러리 합성의 일반적 방법에서, 활성화된 코어 분자는 다수의 빌딩 블록과 응축되어, 공유 결합된 코어-빌딩 블록 앙상블의 조합 라이브러리를 초래한다. 코어의 형상과 강성에 따라, 형상 공간에서 빌딩 블록의 배향이 결정된다. 라이브러리는 특성화된 생물학적 구조("집중 라이브러리")를 표적화하기 위해 코어, 연결 또는 빌딩 블록을 변경함으로써 편향시키거나, 유연한 코어를 사용하여 적은 구조적 편향으로 합성할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료제는 작은 라이브러리 합성을 통해 합성된다.
본원에 기재된 소분자 및 소분자 화합물은 염이 도시되지 않더라도 염으로서 존재할 수 있고, 본 발명은 당업자에게 잘 이해되는 바와 같이 본원에 도시된 치료제의 모든 염 및 용매화물, 뿐만 아니라 치료제의 비-염 및 비-용매화물 형태를 포용하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료제의 염은 약제학적으로 허용되는 염이다.
본원에 기재된 임의의 치료제에 대해 호변이성체 형태가 존재할 수 있는 경우, 호변이성체 형태 중 하나 또는 일부만이 명시적으로 묘사되는 경우에도 각각의 모든 호변이성체 형태가 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 2-하이드록시피리딜 모이어티가 도시되는 경우, 상응하는 2-피리돈 호변이성체도 의도된 것이다.
본 발명은 또한 기재된 치료제의 임의의 에난티오머 또는 디아스테레오머 형태를 포함하는 입체화학적 형태의 일부 또는 전부를 포함한다. 본원에서 구조 또는 명칭의 언급은 도시된 치료제의 모든 가능한 입체이성질체를 포함하는 것을 의도한다. 치료제의 결정 또는 비결정 형태와 같은 모든 형태의 치료제도 본 발명에 의해 포함된다. 본 발명의 치료제를 포함하는 조성물, 예컨대, 특정 입체화학적 형태를 포함하는 실질적으로 순수한 치료제의 조성물, 또는 라세믹 또는 비라세믹 혼합물과 같은 2개 이상의 입체화학적 형태를 포함하는 임의 비율의 본 발명의 치료제의 혼합물을 포함하는 조성물도 의도된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 치료제의 일부 또는 모든 활성 유사체 또는 유도체(예: 프로드러그(prodrug))를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 프로드러그이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 소분자는 유도체화의 후보이다. 이와 같이, 특정 실시양태에서, 조절된 효능, 선택성 및 용해도를 갖는 본원에 기재된 소분자의 유사체는 약물 발견 및 약물 개발을 위한 유용한 리드를 제공한다. 따라서, 특정 예에서, 최적화 중에, 약물 전달, 대사, 신규성 및 안전성의 문제를 고려하여 신규 유사체가 설계된다.
일부 경우, 본원에 기재된 소분자 치료제는 조합 및 의약 화학의 분야에서 널리 공지된 바와 같이 공지된 치료제의 유도체 또는 유사체이다. 이러한 유사체 또는 유도체는 다양한 위치에서 작용기를 추가 및/또는 치환함으로써 제조할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 소분자는 널리 공지된 화학적 합성 절차를 사용하여 유도체/유사체로 전환될 수 있다. 예를 들면, 모든 수소 원자 또는 치환기를 선택적으로 변형시켜 신규 유사체를 생성할 수 있다. 또한, 연결 원자 또는 그룹은 탄소 골격 또는 헤테로 원자를 갖는 더 길거나 짧은 링커로 변형시킬 수 있다. 또한, 환 그룹은 환 내에 상이한 수의 원자를 갖도록 및/또는 헤테로 원자를 포함하도록 변경할 수 있다. 더욱이, 방향족은 사이클릭 환으로 전환될 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들면, 환은 5 내지 7개 원자로 이루어질 수 있고, 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유사체(analog)", "유사체(analogue)" 또는 "유도체"라는 용어는 하나 이상의 화학 반응에 의해 모 화합물 또는 분자로부터 제조된 화합물 또는 분자를 지칭하는 것을 의미한다. 따라서, 유사체는 본원에 기재된 소분자 치료제와 유사한 구조를 갖는 구조이거나, 본원에 기재된 소분자 치료제의 스캐폴드를 기반으로 하지만 대사적으로 유사하거나 반대 작용을 가질 수 있는 특정 성분 또는 구조 구성과 관련하여 그것과 상이할 수 있다. 본 발명에 따른 소분자 억제제의 유사체 또는 유도체는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 소분자 치료제는 수소 그룹을 서로 독립적으로 다른 치환기로 변형시킴으로써 독립적으로 유도체화되거나 또는 이로부터 제조된 유사체일 수 있다. 즉, 각 분자의 각 원자는 동일한 분자의 다른 원자에 대해 독립적으로 변형시킬 수 있다. 유도체/유사체를 생성하기 위한 종래의 임의의 변형을 사용할 수 있다. 예를 들면, 원자 및 치환기는 수소, 알킬, 지방족, 직쇄 지방족, 쇄 헤테로 원자를 갖는 지방족, 분지형 지방족, 치환된 지방족, 사이클릭 지방족, 하나 이상의 헤테로 원자를 갖는 헤테로사이클릭 지방족, 방향족, 헤테로방향족, 폴리방향족, 폴리아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 이들의 조합, 할로겐, 할로-치환된 지방족 등으로 독립적으로 구성될 수 있다. 추가로, 화합물의 모든 환 그룹을 유도체화하여 환 크기를 증가 또는 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 주쇄 원자를 탄소 원자 또는 헤테로 원자로 변경할 수 있다.
핵산 치료제
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 시험관내 전사(IVT) RNA 분자를 포함한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 약제를 코딩하는 IVT RNA 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 조성물의 IVT RNA 분자는 뉴클레오시드-변형된 mRNA 분자이다. 특정 실시양태에서, 약제는 면역 세포를 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 표적화하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, IVT RNA 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩한다.
일부 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 항원에 대한 결합에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 항원은 적어도 하나의 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 인플루엔자 항원, 종양-관련 항원, 종양-특이적 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
그러나, 본 발명은 임의의 특정 약제 또는 약제의 조합으로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보조제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보조제를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보조제를 코딩하는 뉴클레오시드-변형 RNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개 약제의 조합을 코딩하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 2개 이상의 약제의 조합을 코딩하는 2개 이상의 RNA 분자의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 이 방법은 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 암 등에 대한 면역을 대상체에게 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 적어도 하나의 항원, 보조제 또는 이들의 조합을 코딩하는 하나 이상의 RNA를 포함하는 면역 세포의 생체내 표적화를 위해 제형화된 하나 이상의 LNP 분자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 면역 세포의 유전자 편집 방법을 제공한다. 예를 들면, 이 방법은 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 성분(예를 들면, CRISPR 시스템의 성분)를 대상체의 면역 세포에 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 유전자 편집을 위한 하나 이상의 뉴클레오시드-변형 RNA 분자를 포함하는 표적화 T 세포 전달을 위해 제형화된 하나 이상의 이온화 가능한 LNP 분자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 복수의 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 단일 용량의 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 단일 용량은 표적 치료제의 전달에 효과적이다.
다른 관련 양태에서, 치료제는 단리된 핵산이다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자 중 하나이다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 cDNA, mRNA, siRNA, shRNA 또는 miRNA 분자이다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 트롬보모둘린, 내피 단백질 C 수용체(EPCR), 플라스미노겐 활성화제 및 이들의 돌연변이체를 포함하는 항-혈전성 단백질, 카탈라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 철-봉쇄 단백질을 포함하는 항산화 단백질과 같은 치료용 펩타이드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 병리학적 프로세스의 악화에 관여하는 단백질을 코딩하는 것들을 포함하여 표적화 핵산을 억제하는 siRNA, miRNA, shRNA 또는 안티센스 분자이다.
특정 실시양태에서, 핵산은 핵산이 핵산의 발현을 지시할 수 있도록 프로모터/조절 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), and in Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)]에 기재되고 본원의 다른 곳에 기재된 것들과 같이 세포에서 외인성 핵산의 동시 발현을 수반하는, 외인성 핵산을 세포에 도입하기 위한 발현 벡터 및 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, siRNA는 표적화 단백질의 수준을 감소시키기 위해 사용된다. RNA 간섭(RNAi)은 다양한 생물 및 세포 유형에 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 도입이 상보적 mRNA의 분해를 유발하는 현상이다. 세포에서, 긴 dsRNA는 다이서(Dicer)로서 공지된 리보뉴클레아제에 의해 21 내지 25개의 짧은 뉴클레오티드 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다. 이어서, siRNA는 단백질 성분과 함께 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로 조립되어, 그 과정에서 풀린다. 이어서, 활성화된 RISC는 siRNA 안티센스 가닥과 mRNA 사이의 염기쌍 상호작용에 의해 상보적 전사물에 결합한다. 결합된 mRNA는 절단되고, mRNA의 서열 특이적 분해는 유전자 침묵을 초래한다. 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허 제6,506,559호; Fire et al., 1998, Nature 391(19):306-311; Timmons et al., 1998, Nature 395:854; Montgomery et al., 1998, TIG 14 (7):255-258; David R. Engelke, Ed., RNA Interference (RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology, DNA Press, Eagleville, PA (2003); and Gregory J. Hannon, Ed., RNAi A Guide to Gene Silencing, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2003). Soutschek et al. (2004, Nature 432:173-178]은 정맥내 전신 전달을 보조하는 siRNA의 화학적 변형을 기재한다. siRNA의 최적화는 전체 G/C 함량, 말단의 C/T 함량, Tm 및 3' 오버행의 뉴클레오티드 함량의 고려를 수반한다[참조: 예를 들면, Schwartz et al., 2003, Cell, 115:199-208 and Khvorova et al., 2003, Cell 115:209-216]. 따라서, 본 발명은 또한 RNAi 기술을 사용하여 PTPN22의 수준을 감소시키는 방법도 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 siRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 바람직하게는, siRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩타이드의 발현을 억제할 수 있다. 벡터에 목적하는 폴리뉴클레오티드의 도입 및 벡터의 선택은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al. (2012), and in Ausubel et al. (1997)] 및 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 벡터는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 치료제를 코딩한다. shRNA 분자는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 표적의 mRNA에 대해 지향되어 표적의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 코딩된 shRNA는 세포에 의해 발현되고, 이어서 siRNA로 처리된다. 예를 들면, 특정 경우에, 세포는 siRNA를 형성하기 위해 shRNA를 절단하는 천연 효소(예: 다이서)를 갖는다.
siRNA, shRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입되는 발현 벡터는 본 발명의 전달 비히클을 사용하여 형질감염 또는 감염시키려는 세포 모집단으로부터 발현 세포의 동정을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이들 둘 다를 포함할 수도 있다. 다른 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 별개의 DNA 파편에 담지될 수 있고, 또한 전달 비히클 내에 함유될 수 있다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열이 인접할 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 당해 기술분야에게 공지되어 있고, 예를 들면, 네오마이신 내성 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 전달 비히클은 전달되는 뉴클레오티드 서열 또는 작제물을 포함하는 벡터를 함유할 수 있다. 벡터의 선택은 후속적으로 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다. 적합한 숙주 세포는 다양한 원핵생물 세포 및 진핵생물 숙주 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터 및 포유동물 세포 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 벡터 기반 시스템은 본 발명과 함께 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 동족 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 다수의 시스템은 상업적으로 널리 이용 가능하다.
예시적으로, 핵산 서열이 도입되는 벡터는 플라스미드일 수 있고, 이는 세포에 도입될 때에 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 유전자 작제물이 삽입될 수 있는 벡터의 예시적 및 비제한적 예로는 진핵생물 세포에서의 발현을 위한 tet-on 유도성 벡터가 포함된다.
벡터는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 수득될 수 있다[참조: Sambrook et al., 2012]. 특정 실시양태에서, 벡터는 동물 세포의 형질전환에 유용한 벡터이다.
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 펩타이드 또는 펩티도모방체(peptidomimetic)를 코딩하는 핵산 분자를 함유할 수도 있다.
프로모터는 코딩 세그먼트(coding segment) 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 것과 같이 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 천연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라 지칭할 수 있다. 유사하게는, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열과 천연적으로 회합된 것일 수 있다. 또는, 코딩 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 배치함으로써 특정 이점을 수득할 수 있고, 이는 이의 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 통상 회합되지 않는 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 통상 회합되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, "천연적으로 발생하지" 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소를 함유하고 발현을 변경하는 돌연변이를 갖는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 외에도, 서열은 본원에 개시된 조성물과 관련하여 PCRTM을 포함한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산할 수 있다(미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호). 추가로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 사용될 수 있다.
당연히, 발현을 위해 선택한 세포 유형, 소기관 및 생물에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위해 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합을 사용하는 방법을 알고 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al. (2012)]. 사용되는 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 것과 같이 도입된 DNA 세그먼트의 고도의 발현을 지시하기 위해 적절한 조건하에 구성적, 조직 특이적, 유도성 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 선택 가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 적합한 선택 가능한 마커 유전자는 특정 약물, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 반딧불 루시퍼라제, 면역글로불린 또는 면역글로불린의 Fc 부분, 바람직하게는 IgG와 같은 이의 일부에 대한 내성을 부여하는, G418 및 하이그로마이신과 같은 단백질 코딩 유전자이다. 선택 가능한 마커는 관심 있는 핵산과는 별도의 벡터에 도입될 수 있다.
siRNA 폴리뉴클레오티드의 생성 후, 당업자는 siRNA 폴리뉴클레오티드가 치료 화합물로서 siRNA를 개선하기 위해 변형될 수 있는 특정 특성을 갖는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, siRNA 폴리뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 다른 연결, 메틸포스포네이트, 설폰, 설페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르 등을 포함하도록 변형시킴으로써 분해에 저항하도록 추가로 설계할 수 있다[참조: 예를 들면, Agrawal et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Stec et al., 1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody et al., 1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100; Stein, In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed., Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989)].
임의의 폴리뉴클레오티드는 생체내 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 가능한 변형에는 5' 및/또는 3' 말단에 인접 서열의 부가; 주쇄에 포스포디에스테르 연결 대신에 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 퀴오신, 및 위부토신 등과 같은 비전통적 염기 및 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 변형된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 포함이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에서, 플라스미드 벡터에 의해 발현되는 안티센스 핵산 서열은 표적 단백질의 발현을 억제하기 위한 치료제로서 사용된다. 안티센스 발현 벡터는 포유동물 세포 또는 포유동물 자체를 형질감염시키기 위해 사용되고, 이에 의해 표적 단백질의 내인성 발현의 감소를 유발한다.
안티센스 분자 및 유전자 발현을 억제하기 위한 이들의 사용은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Cohen, 1989, In: Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press]. 안티센스 핵산은 그 용어가 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같이 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 대해 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다[참조: Weintraub, 1990, Scientific American 262:40]. 세포에서, 안티센스 핵산은 상응하는 mRNA와 하이브리드화되어 이중-가닥 분자를 형성하고, 이에 의해 유전자의 번역을 억제한다.
유전자의 번역을 억제하기 위한 안티센스 방법의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Marcus-Sakura(1988, Anal. Biochem. 172:289)]에 기재되어 있다. 이러한 안티센스 분자는 이노우에(Inoue, 1993, 미국 특허 제5,190,931호)에 의해 교시된 바와 같이 안티센스 분자를 코딩하는 DNA를 사용하여 유전자 발현을 통해 세포에 제공될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 안티센스 분자는 합성적으로 제조되고, 이어서 세포에 제공될 수 있다. 약 10 내지 약 30, 더욱 바람직하게는 약 15 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머는, 이들이 용이하게 합성되어 표적 세포에 도입되기 때문에 바람직하다. 본 발명에 의해 고려되는 합성 안티센스 분자에는 비변형된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는 당해 기술분야에 공지된 올리고뉴클레오티드 유도체가 포함된다(미국 특허 제5,023,243호 참조).
본 발명의 일 실시양태에서, 리보자임은 표적 단백질의 발현을 억제하기 위한 치료제로서 사용된다. 표적 분자의 발현을 억제하는 데 유용한 리보자임은, 예를 들면, 표적 분자를 코딩하는 mRNA 서열에 상보적인 표적 서열을 기본 리보자임 구조에 도입함으로써 설계될 수 있다. 표적 분자를 표적으로 하는 리보자임은 시판되는 시약(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems, Inc.)을 사용하여 합성하거나, 이를 코딩하는 DNA로부터 유전적으로 발현될 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료제는 CRISPR-Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있고, 여기서 표적 분자를 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA) 및 CRISPR-회합(CAS) 펩티드가 복합체를 형성하여 표적 유전자 내에서 돌연변이를 유도한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 gRNA 또는 gRNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 Cas 펩타이드 또는 Cas 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 약제는 miRNA 또는 miRNA의 모방체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제는 miRNA 또는 miRNA의 모방체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
miRNA는 번역을 억제하거나 표적 mRNA를 분해하여 세포에서 특정 유전자의 전사 후 침묵을 유발할 수 있는 작은 비-코딩 RNA 분자이다. miRNA는 표적 핵산과 완전히 상보적이거나 비상보적 영역을 가질 수 있고, 결과적으로 비상보적 영역에서 "팽윤"을 초래할 수 있다. miRNA는 표적 핵산과 완전히 상보적이지 않은 경우와 같이 번역을 억제하거나, 표적 RNA 분해를 유발하여 유전자 발현을 억제할 수 있고, 이는 miRNA가 이의 표적과 완전히 상보적으로 결합하는 경우에만 발생하는 것으로 여겨진다. 본 발명은 또한 miRNA의 이중-가닥 전구체를 포함할 수 있다. miRNA 또는 프리-miRNA는 18 내지 100 뉴클레오티드 길이이거나 18 내지 80 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 성숙 miRNA의 길이는 19 내지 30 뉴클레오티드 길이 또는 21 내지 25 뉴클레오티드 길이, 특히 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. miRNA 전구체는 통상 약 70 내지 100 뉴클레오티드 길이를 갖고 헤어핀 형태를 갖는다. miRNA는 다이서(Dicer) 및 드로샤(Drosha)에 의해 생체내에서 프리-miRNA로부터 생성되고, 이는 긴 프리-miRNA를 기능성 miRNA로 특이적으로 처리한다. 본 개시에서 특성화된 헤어핀 또는 성숙 마이크로RNA 또는 프리-마이크로RNA 약제는 세포-기반 시스템에 의해 생체내에서 합성되거나 화학적 합성에 의해 시험관내에서 합성될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 약제(agent)는 질환-연관 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 프리-마이크로RNA, 성숙 또는 헤어핀 형태의 질환-연관 miRNA의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 질환-연관 miRNA, 임의의 프리-miRNA, 임의의 단편 또는 이들의 임의의 조합의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 조합이 상정된다.
miRNA는 목적하는 특성을 부여하는 변형을 포함하도록 합성할 수 있다. 예를 들면, 이러한 변형은 안정성, 표적 핵산과의 하이브리드화 열역학, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적화 또는 세포 투과성(예: 세포내이입-의존적 또는 -독립적 메커니즘)을 개선할 수 있다.
또한, 변형은 서열 특이성을 증가시키고, 결과적으로 오프-사이트 표적화를 감소시킬 수 있다. 합성 및 화학적 변형의 방법은 하기에 상세히 기재되어 있다. 필요에 따라, miRNA 분자를 변형하여 분해에 대해 miRNA를 안정화시키거나 반감기를 증가시키거나 효능을 개선할 수 있다. 바람직한 변형은, 예를 들면, 미국 특허 공개번호 제20070213292호, 제20060287260호, 제20060035254호. 제20060008822호 및 제2005028824호에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합되어 있다. 뉴클레아제 내성 및/또는 표적에 대한 결합 친화성을 증가시키기 위해, 본 개시에 특성화된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드제는 2'-O-메틸, 2'-불소, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노프로필, 2'-아미노 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 록킹된 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 예를 들면, 2'-4'-에틸렌 브릿지 핵산 및 특정 뉴클레오티드 변형의 포함도 표적에 대한 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 골격에 피라노스 당을 포함하면 엔도뉴클레오분해 절단이 감소할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 3' 양이온 그룹을 포함하거나 3'-말단에서 뉴클레오시드를 3-3' 연결로 반전시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 대안으로서, 3'-말단을 아미노알킬 그룹으로 차단할 수 있다. 다른 3' 접합체는 3'-5' 엑소뉴클레오분해 절단을 억제할 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 3'은 엑소뉴클레아제가 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 결합하는 것을 입체적으로 차단함으로써 엑소뉴클레오분해 절단을 억제할 수 있다. 작은 알킬 쇄, 아릴 그룹, 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보스, 데옥시리보스, 글루코스 등)도 3'-5' 엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
특정 실시양태에서, miRNA는 뉴클레아제 내성을 위해 일부 또는 모든 인터뉴클레오티드 연결이 포스포로티오에이트로 변형된 올리고데옥시뉴클레오티드 갭을 함유하는 2'-변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 메틸포스포네이트 변형의 존재는 이의 표적 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키고, 따라서 IC5Q를 감소시킨다. 이 변형은 또한 변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 본 개시의 방법 및 시약은 억제성 핵산 분자의 안정성 또는 효능을 증강시키기 위해 개발될 수 있는 임의의 기술과 함께 사용될 수 있음을 이해한다.
miRNA 분자는 변형된 주쇄 또는 비천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 뉴클레오티드 올리고머를 포함한다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고머에는 주쇄에 인 원자를 유지하는 것과 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 것이 포함된다. 본 개시의 목적상, 뉴클레오시드간 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드도 뉴클레오티드 올리고머로 간주된다. 예를 들면, 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄를 갖는 뉴클레오티드 올리고머에는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트 등이 포함된다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태도 포함된다.
성숙(mature) 또는 헤어핀(hairpin) 형태일 수 있는 본원에 기재된 miRNA는 네이키드 올리고뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 일부 경우에, miRNA 또는 기타 뉴클레오티드 올리고머를 세포로 전달하는 것을 보조하는 제형을 이용하는 것이 바람직할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,656,611호, 제5,753,613호, 제5,785,992호, 제6,120,798호, 제6,221,959호, 제6,346,613호 및 제6,353,055호, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 통합됨).
일부 예에서, miRNA 조성물은 적어도 부분적으로 결정질, 균일한 결정질 및/또는 무수(예: 80, 50, 30, 20, 또는 10% 미만의 물)이다. 또 다른 예에서, miRNA 조성물은 수성 상, 예를 들면, 물을 포함하는 용액에 있다. 수성 상 또는 결정질 조성물은 전달 비히클, 예를 들면, 리포좀(특히, 수성 상의 경우) 또는 입자(예를 들면, 결정질 조성물에 적합할 수 있는 마이크로입자)에 도입될 수 있다. 일반적으로, miRNA 조성물은 의도된 투여 방법에 적합한 방식으로 제형화된다. miRNA 조성물은 또 다른 약제, 예를 들면, 또 다른 치료제 또는 올리고뉴클레오티드 약제를 안정화시키는 약제, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 약제와 복합체를 형성하는 단백질과 조합하여 제형화할 수 있다. 다른 약제에는 킬레이트제, 예를 들면, EDTA(예를 들면, Mg와 같은 2가 양이온을 제거하기 위해), 염 및 RNAse 억제제(예를 들면, 광범위한 특이성 RNAse 억제제)가 포함된다. 특정 실시양태에서, miRNA 조성물은 또 다른 miRNA, 예를 들면, 제2 miRNA 조성물(예를 들면, 제1 miRNA와 상이한 마이크로RNA)을 포함한다. 또 다른 제제는 적어도 3개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 100개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 종을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 miRNA의 활성을 모방하는 올리고뉴클레오티드 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 miRNA의 핵염기 서열과 핵염기 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 miRNA의 활성을 모방하도록 설계된다. 특정 실시양태에서, miRNA 활성을 모방하는 올리고뉴클레오티드 조성물은 성숙 miRNA 헤어핀 또는 처리된 miRNA 이중쇄를 모방하는 이중-가닥 RNA 분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 내인성 miRNA 또는 miRNA 전구체 핵염기 서열과 동일성을 공유한다. 본 발명의 조성물에 포함되도록 선택된 올리고뉴클레오티드는 다수의 길이 중 하나일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 길이가 7 내지 100개의 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. 예를 들면, miRNA와 핵염기 동일성을 공유하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 7 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. miRNA 전구체와 동일성을 공유하는 올리고뉴클레오티드는 최대 100개의 연결된 뉴클레오시드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 7 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 또는 30개의 연결된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 19 내지 23개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 40 내지 최대 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 연결된 뉴클레오시드 길이이다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 또는 이의 전구체와 특정 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 본원에 기재된 성숙 miRNA의 핵염기 서열 및 이들의 대응하는 줄기-루프 서열은 miRNA 서열 및 주석의 온라인 검색 가능한 데이터베이스인 miRBase에서 발견되는 서열이다. miRBase 서열 데이터베이스의 항목은 성숙 miRNA 서열의 위치 및 서열에 대한 정보와 함께 miRNA 전사물의 예측된 헤어핀 부분(줄기-루프)을 나타낸다. 데이터베이스의 miRNA 줄기-루프 서열은 엄밀하게는 전구체 miRNA(프리-miRNA)가 아니고, 일부 경우에 프리-miRNA 및 추정된 일차 전사물로부터의 일부 인접 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 miRNA 핵염기 서열은 miRBase 서열 데이터베이스 릴리스 10.0에 기재된 서열 및 miRBase 서열 데이터베이스의 임의의 이전 릴리스에 기재된 서열을 포함하여 모든 버젼의 miRNA를 포함한다. 서열 데이터베이스 릴리스에 의해 특정 miRNA의 명칭이 변경될 수 있다. 서열 데이터베이스 릴리스는 성숙 miRNA 서열의 변경을 초래할 수 있다. 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 miRNA의 임의의 핵염기 서열 버젼에 대해 특정 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 핵염기 영역에 걸쳐 miRNA와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵염기 서열을 갖는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miRNA와 관련하여 하나 이상의 비-동일 핵염기를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 miRNA, 전구체, 모방체 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 목적하는 포유동물 세포 또는 조직에서 miRNA, 전구체, 모방체 또는 이들의 단편을 발현시키기에 적합한 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 기타 발현 벡터를 포함할 수 있다.
백신
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 활성화하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역원성 조성물"은 항원(예를 들면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 항체 또는 항체 단편(예를 들면, 항원 결합 분자), 항원 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산, 항원 또는 항원 결합 분자를 발현 또는 제시하는 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 LNP를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 임의의 펩타이드 항원 또는 항원 결합 분자 또는 이의 면역원성 기능 동등 분자의 전부 또는 일부를 포함하거나 코딩한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가 면역자극제를 코딩하는 mRNA 분자의 혼합물을 포함한다. 면역자극제는 추가 항원 또는 항원 결합 분자, 면역조절제 또는 보조제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 맥락에서, "백신"이라는 용어는 동물에 접종하면 면역을 유도하는 물질을 지칭한다.
본 발명의 백신은 핵산 성분의 조성이 상이할 수 있다. 비제한적 예에서, 항원 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산은 또한 보조제와 함께 제형화될 수 있다. 물론, 본원에 기재된 다양한 조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 백신 및 이의 다양한 성분은 본 개시에 비추어 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 제조 및/또는 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 치료용 화합물 또는 조성물은 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체 또는 질환 또는 장애를 발증할 위험이 있는(또는 발증하기 쉬운) 대상체에게 예방적으로(즉, 질환 또는 장애를 예방하기 위해) 또는 치료적으로(즉, 질환 또는 장애를 치료하기 위해) 투여될 수 있다. 이러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질환의 명백한 임상 증상이 나타나기 전에 수행되어, 질환 또는 장애를 예방하거나 이의 진행을 지연시킬 수 있다. 의학 분야의 맥락에서, "예방"이라는 용어는 질환으로 인한 사망률 또는 이환율의 부담을 감소시키는 임의의 활동을 포함한다. 예방은 1차, 2차 및 3차 예방 수준에서 수행될 수 있다. 1차 예방은 질환의 발증을 회피하는 것이지만, 2차 및 3차 예방은 질환의 진행 및 증상의 출현을 예방하고, 기능을 회복하고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 감소시키는 것을 목적으로 하는 활동을 포함한다.
핵산
특정 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 핵산 분자를 포함하거나 캡슐화하는 표적화된 생체내 T 세포 전달을 위해 제형화된 이온화 가능한 LNP 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 특정 실시양태에서, mRNA 분자는 CAR을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드로 변형된 mRNA 분자는 CAR을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보조제를 코딩하는 뉴클레오시드-변형 mRNA 분자를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수득된 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 조건하에서, 예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및/또는 결실과 같은 원래의 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 변이를 대안적으로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성이고 관심 있는 항원 또는 항원 결합 분자 또는 보조제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가로, 본 발명의 범위는 본원에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 상동성이고 원래 아미노산 서열의 면역원성 기능을 보존하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열은 이의 아미노산 서열이 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 유리하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는 경우 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열과 "실질적으로 상동성"이다. 2개 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 결정된다[참조: BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
특정 실시양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 작제물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 작제물은 복수의 항원을 코딩하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 작제물은 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 항원을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보조제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 작제물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 작제물은 CAR를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 보조제를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 복수의 작제물을 포함하고, 각 작제물은 하나 이상의 항원을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 작제물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 CAR를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 조성물; 및 보조제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 조성물을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 작제물은 번역 제어 요소에 작동적으로 결합된다. 작제물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 작동적으로 결합된 조절 서열을 도입할 수 있고, 따라서 발현 카세트를 형성한다.
벡터
본 발명의 면역 세포 표적화 LNP 분자에 캡슐화된 핵산 서열은, 예를 들면, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 동일한 유전자를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도하거나, 동일한 유전자를 함유하는 세포 및 조직으로부터 표준 기술을 사용하여 직접 단리하는 것과 같이 당해 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 또는, 관심 있는 핵산 분자는 합성적으로 생산할 수도 있다.
핵산은 다수 유형의 벡터로 클로닝할 수 있다. 예를 들면, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 코스미드 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 벡터로 클로닝할 수 있다. 특히 관심 있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터 및 시험관내 전사에 최적화된 벡터가 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 CAR를 코딩하는 시험관내 전사(IVT) RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 복수의 항원을 코딩하는 IVT RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 보조제를 코딩하는 IVT RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 보조제를 코딩하는 IVT RNA를 포함한다.
뉴클레오시드-변형된 RNA
특정 실시양태에서, 조성물은 뉴클레오시드-변형된 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 뉴클레오시드-변형된 mRNA를 포함한다. 뉴클레오시드-변형된 mRNA는 비-변형된 mRNA와 비교하여, 예를 들면, 안정성 증가, 선천성 면역원성의 저하 또는 결여, 번역 증강 등의 특별한 이점을 갖는다. 본 발명에 유용한 뉴클레오시드-변형된 mRNA는 미국 특허 제8,278,036호에 추가로 기재되어 있고, 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 통합되어 있다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형된 mRNA는 병리생리학적 경로를 활성화하지 않고, 전달 직후에 매우 효율적으로 거의 즉시 번역되고, 수일간 지속되는 생체내 연속적 단백질 생산을 위한 주형으로서 기능한다[참조: Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953]. 생리학적 효과를 발휘하는 데 필요한 mRNA의 양이 적기 때문에, 인간 치료에 적용할 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR를 코딩하는 mRNA 분자를 발현하는 것을 포함하는 면역 세포는 CAR에 의해 특이적으로 결합되는 항원을 발현하는 관심 있는 세포로 지시된다.
특정 경우에, 코딩 mRNA를 전달하여 단백질을 발현하는 것은 단백질, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 다수의 이점이 있다. mRNA 형질감염 중, 목적하는 단백질의 코딩 서열이 세포에 전달되는 유일한 물질이고, 따라서 플라스미드 주쇄, 바이러스 유전자 및 바이러스 단백질과 연관된 모든 부작용을 회피할 수 있다. 더욱 중요하게는, DNA- 및 바이러스-기반 벡터와 달리, mRNA는 게놈에 도입될 위험이 없고 mRNA 전달 후 즉시 단백질 생산이 개시된다. 예를 들면, 높은 수준의 순환 단백질은 코딩 mRNA의 생체내 주사로부터 15 내지 30분 이내에 측정되었다. 특정 실시양태에서, 단백질이 아닌 mRNA를 사용하는 것도 다수의 이점이 있다. 순환 중의 단백질의 반감기는 종종 짧기 때문에, 단백질 치료에는 빈번한 투여를 필요로 하지만, mRNA는 수일간 지속적으로 단백질을 생산하기 위한 주형을 제공한다. 단백질의 정제는 문제가 있고, 부작용을 유발하는 응집체 및 기타 불순물을 함유할 수 있다[참조: Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265].
특정 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형된 RNA는 천연에 발생하는 변형된 뉴클레오시드 슈도우리딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 슈도우리딘을 포함하는 것으로 mRNA가 더욱 안정적이고 비-면역원성이며 번역성이 높아진다[참조: Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892; Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338; Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953; Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175].
RNA에 슈도우리딘을 포함한 변형된 뉴클레오시드의 존재가 이들의 선천성 면역원성을 억제한다는 것이 입증되었다[참조: Kariko et al., 2005, Immunity 23:165-175]. 추가로, 슈도우리딘을 함유하는 단백질-코딩, 시험관내-전사된 RNA는 뉴클레오시드를 함유하지 않거나 다른 변형된 뉴클레오시드를 함유하지 않는 RNA보다 더욱 효율적으로 번역될 수 있다[참조: Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840]. 그 후, 슈도우리딘의 존재는 RNA의 안정성을 개선하고[참조: Anderson et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:9329-9338] PKR의 활성화 및 번역 억제를 모두 완화하는 것으로 밝혀졌다[참조: Anderson et al., 2010, Nucleic Acids Res 38:5884-5892]. 우수한 번역 잠재력 및 선천성 면역원성을 갖지 않는 슈도우리딘-함유 RNA를 수득하기 위해 중요한 예비 HPLC 정제 절차가 확립되었다[참조: Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Research 39:e142]. HPLC-정제된, 에리트로포이에틴을 코딩하는 슈도우리딘-함유 RNA를 마우스 및 원숭이에게 투여하면, 혈청 EPO 수준의 현저한 증가를 초래하고[참조: Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953], 슈도우리딘-함유 mRNA가 생체내 단백질 요법에 적합하다는 것을 확인했다.
본 발명은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNA, 올리고리보뉴클레오티드 및 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 항원 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하고, 여기서 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 항원, 항원 결합 분자, 보조제 또는 이들의 조합을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 여기서 핵산은 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형 RNA는 IVT RNA이다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형 RNA는 T7 파지 RNA 폴리머라제에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형 mRNA는 SP6 파지 RNA 폴리머라제에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형 RNA는 T3 파지 RNA 폴리머라제에 의해 합성된다.
특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1acp3Ψ(1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1Ψ(1-메틸슈도우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 Ψm(2'-O-메틸슈도우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m5D(5-메틸디하이드로우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m3Ψ(3-메틸슈도우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 추가로 변형되지 않은 슈도우리딘 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 상기 슈도우리딘 중 임의의 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기타 슈도우리딘-유사 뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 RNA에서 변형되는 뉴클레오시드는 우리딘(U)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 시티딘(C)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 아데노신(A)이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 구아노신(G)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 변형된 뉴클레오시드는 m5C(5-메틸시티딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m5U(5-메틸우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m6A(N6-메틸아데노신)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 s2U(2-티오우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 Ψ(슈도우리딘)이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 Um(2'-O-메틸우리딘)이다.
다른 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 m1A(1-메틸아데노신); m2A(2-메틸아데노신); Am(2'-O-메틸아데노신); ms2m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신); i6A(N6-이소펜테닐아데노신); ms2i6A(2-메틸티오-N6이소펜테닐아데노신); io6A(N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신); ms2io6A(2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신); g6A(N6-글리시닐카바모일아데노신); t6A(N6-트레오닐카바모일아데노신); ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일아데노신); m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신); hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신); Ar(p)(2'-O-리보실아데노신(포스페이트)); I(이노신); m1I(1-메틸이노신); m1Im(1,2'-O-디메틸이노신); m3C(3-메틸시티딘); Cm(2'-O-메틸시티딘); s2C(2-티오시티딘); ac4C(N4-아세틸시티딘); f5C(5-포르밀시티딘); m5Cm(5,2'-O-디메틸시티딘); ac4Cm(N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘); k2C(리시딘); m1G(1-메틸구아노신); m2G(N2-메틸구아노신); m7G(7-메틸구아노신); Gm(2'-O-메틸구아노신); m2 2G(N2,N2-디메틸구아노신); m2Gm(N2,2'-O-디메틸구아노신); m2 2Gm(N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신); Gr(p)(2'-O-리보실구아노신(포스페이트)); yW(와이부토신); o2yW(퍼옥시와이부토신); OHyW(하이드록시와이부토신); OHyW*(미변형된 하이드록시와이부토신); imG(와이오신); mimG(메틸와이오신); Q(퀴오신); oQ(에폭시퀴오신); galQ(갈락토실-퀴오신); manQ(만노실-퀴오신); preQ0(7-시아노-7-데아자구아노신); preQ1(7-아미노메틸-7-데아자구아노신); G+(아케오신); D(디하이드로우리딘); m5Um(5,2'-O-디메틸우리딘); s4U(4-티오우리딘); m5s2U(5-메틸-2-티오우리딘); s2Um(2-티오-2'-O-메틸우리딘); acp3U(3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘); ho5U(5-하이드록시우리딘); mo5U(5-메톡시우리딘); cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산); mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르); chm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘)); mchm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르); mcm5U(5-메톡시카보닐메틸우리딘); mcm5Um(5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸우리딘); mcm5s2U(5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘); nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘); mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘); mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘); ncm5U(5-카바모일메틸우리딘); ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5U(5-카복시메틸아미노메틸우리딘); cmnm5Um(5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘); cmnm5s2U(5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘); m6 2A(N6,N6-디메틸아데노신); Im(2'-O-메틸이노신); m4C(N4-메틸시티딘); m4Cm(N4,2'-O-디메틸시티딘); hm5C(5-하이드록시메틸시티딘); m3U(3-메틸우리딘); cm5U(5-카복시메틸우리딘); m6Am(N6,2'-O-디메틸아데노신); m6 2Am(N6,N6,O-2'-트리메틸아데노신); m2,7G(N2,7-디메틸구아노신); m2,2,7G(N2,N2,7-트리메틸구아노신); m3Um(3,2'-O-디메틸우리딘); m5D(5-메틸디하이드로우리딘); f5Cm(5-포르밀-2'-O-메틸시티딘); m1Gm(1,2'-O-디메틸구아노신); m1Am(1,2'-O-디메틸아데노신); Tm5U(5-타우리노메틸우리딘); Tm5s2U(5-타우리노메틸-2-티오우리딘); imG-14(4-데메틸와이오신); imG2(이소와이오신) 또는 ac6A(N6-아세틸아데노신)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 RNA는 상기 변형 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형된 RNA는 상기 변형 중 3개 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형된 RNA는 상기 변형 중 3개 초과의 변형의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 잔기의 0.1% 내지 100%가 (예를 들면, 슈도우리딘 또는 변형된 뉴클레오시드 염기의 존재에 의해) 변형된다. 일부 실시양태에서, 잔기의 0.1%가 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.3%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.4%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.6%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.8%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 3%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 4%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 6%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 8%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 10%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 12%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 14%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 16%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 18%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 20%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 25%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 30%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 35%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 40%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 45%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 50%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 60%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 70%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 80%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 90%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 100%이다.
일부 실시양태에서, 분율은 5% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 3% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 4% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 6% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 8% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 12% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 15% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 20% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 30% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 40% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 50% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 60% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 70% 미만이다.
일부 실시양태에서, 소정 뉴클레오시드(즉, 우리딘, 시티딘, 구아노신 또는 아데노신)의 잔기의 0.1%가 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형되는 소정 뉴클레오티드의 분율은 0.2%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.3%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.4%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.6%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 0.8%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2.5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 3%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 4%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 5%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 6%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 8%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 10%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 12%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 14%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 16%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 18%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 20%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 25%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 30%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 35%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 40%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 45%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 50%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 60%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 70%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 80%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 90%이다. 일부 실시양태에서, 분율은 100%이다.
일부 실시양태에서, 변형되는 소정 뉴클레오티드의 분율은 8% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 5% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 3% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 1% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 2% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 4% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 6% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 12% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 15% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 20% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 30% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 40% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 50% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 60% 미만이다. 일부 실시양태에서, 분율은 70% 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 RNA는 동일한 서열을 갖는 비변형된 RNA 분자보다 세포 내에서 더욱 효율적으로 번역된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드-변형된 RNA는 표적 세포에 의해 번역되는 증강된 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 번역은 비변형된 대응물과 비교하여 2배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 3배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서는 번역은 5배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 7배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 10배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 15배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 20배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 50배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 100배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 200배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 500배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 1000배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 번역은 2000배 인자로 증강된다. 일부 실시양태에서, 인자는 10 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 10 내지 100배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 10 내지 200배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 10 내지 300배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 10 내지 500배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 20 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 30 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 50 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 100 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 인자는 200 내지 1000배이다. 일부 실시양태에서, 번역은 기타 현저한 양 또는 범위의 양에 의해 증강된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 항원-코딩 RNA는 동일한 서열을 갖는 비변형된 시험관내-합성 RNA 분자보다 현저히 더 높은 적응성 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 변형된 RNA 분자는 이의 비변형된 분자보다 2배 더 큰 적응 면역 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 3배 인자로 증가한다. 또 다른 실시양태에서, 적응 면역 반응은 5배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 7배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 10배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 15배 인자로 증가한다. 다른 실시양태에서, 적응 면역 반응은 20배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 50배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 100배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 200배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 500배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 1000배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 2000배 인자로 증가한다. 일부 실시양태에서, 적응 면역 반응은 또 다른 배수 차이로 증가한다.
일부 실시양태에서, "현저히 더 높은 적응 면역 반응을 유도한다"는 것은 적응 면역 반응의 검출 가능한 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 적응 면역 반응의 배수 증가(예를 들면, 상기 열거된 배수 증가의 1배)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 뉴클레오시드-변형된 RNA를 동일한 종의 비변형된 RNA 분자보다 더 낮은 용량 또는 빈도로 투여하면서 효과적인 적응 면역 반응을 유도할 수 있도록 하는 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 증가는 효과적인 적응 면역 반응을 유도하기 위해 단일 용량을 사용하여 뉴클레오시드-변형된 RNA를 투여할 수 있도록 하는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드-변형된 RNA는 동일한 서열을 갖는 비변형된 시험관내 합성 RNA 분자보다 현저히 낮은 선천성 면역원성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 RNA 분자는 비변형된 분자보다 2배 더 적은 선천성 면역 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 3배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 5배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 7배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 10배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 15배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 20배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 50배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 100배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 200배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 500배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 1000배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 2000배 인자로 감소한다. 일부 실시양태에서, 선천성 면역원성은 또 다른 배수 차이로 감소한다.
일부 실시양태에서, "현저히 낮은 선천성 면역원성을 나타낸다"는 것은 선천성 면역원성의 검출 가능한 감소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 선천성 면역원성의 배수 감소(예를 들면, 상기 열거된 배수 감소의 1배)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 검출 가능한 선천성 면역 반응을 유발하지 않고서 유효량의 뉴클레오시드-변형된 RNA가 투여될 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 재조합 단백질의 생산을 검출 가능하게 감소시키기에 충분한 선천성 면역 반응을 유발하지 않고서 뉴클레오시드-변형된 RNA를 반복적으로 투여할 수 있도록 하는 감소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 감소는 재조합 단백질의 검출 가능한 생산을 제거하기에 충분한 선천성 면역 반응을 유도하지 않고서 뉴클레오시드-변형된 RNA를 반복적으로 투여할 수 있도록 하는 것이다.
폴리펩타이드 치료제
다른 관련 양태에서, 치료제는 표적을 조절하는 단리된 펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 본 발명의 펩타이드는 표적에 결합하여 표적의 정상적 기능 활성을 조절함으로써 표적을 직접 억제 또는 활성화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 펩타이드는 내인성 단백질과 경쟁함으로써 표적을 조절한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 펩타이드는 우성 음성 돌연변이체로서 작용함으로써 표적의 활성을 조절한다.
폴리펩타이드 치료제의 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들면, 치환기 그룹의 부착에 의해 변형된 잔기가 있는 것, (iii) 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드의 대체 스플라이스 변이체인 것, (iv) 폴리펩타이드의 단편 및/또는 (v) 폴리펩타이드가, 리더 또는 분비 서열, 또는 정제(예를 들면, His 태그) 또는 검출(예를 들면, Sv5 에피토프 태그)에 사용되는 서열과 같은 또 다른 폴리펩타이드와 융합되는 것일 수 있다. 단편에는 원래 서열의 단백질분해 절단(복수-부위 단백질분해 포함)을 통해 생성된 폴리펩타이드가 포함된다. 변이체는 번역 후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
CAR 약제
특정 실시양태에서, 본 발명의 mRNA 분자는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 표적화 도메인이고, 여기서 표적화 도메인은 CAR를 발현하는 T 세포를 관심 있는 특정 세포 또는 조직으로 유도한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 병원성 생물 또는 종양 세포 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 펩타이드를 포함하고, 이에 의해 CAR를 발현하는 T 세포를 항원을 발현하는 세포 또는 조직으로 유도한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 약제를 포함하는 면역 세포 표적화된 LNP에 관한 것이고, 여기서 약제는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제는 CAR를 코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제는 CAR을 코딩하는 변형된 뉴클레오시드 mRNA 분자를 포함한다.
다양한 실시양태에서, CAR는 "1세대", "2세대", "3세대", "4세대" 또는 "5세대" CAR일 수 있다[참조: 예를 들면, Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Jensen et al. Rev. 257:127-133 (2014; Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8(4):337-350 (2015); Brentjens et al. 13:5426-5435 (2007); Gade et al., Cancer Res. 65:9080-9088 (2005); Maher et al., Nat. Biotechnol. 20:70-75 (2002); Kershaw et al., J. Immunol. 173:2143-2150 (2004); Sadelain et al. Opin. (2009); Hollyman et al., J. Immunother. 32:169-180 (2009)].
본 발명에 사용하기 위한 "1세대" CAR는 막관통 도메인에 융합된 항원 결합 도메인, 예를 들면, 일본쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 이는 T 세포 수용체 쇄의 세포질/세포내 도메인에 융합되어 있다. "1세대" CAR는 통상 내인성 T 세포 수용체(TCR)로부터의 신호의 주요 전달자인 CD3ζ-쇄의 세포내 도메인을 갖는다. "1세대" CAR는 HLA-매개 항원 제시와 독립적으로 단일 융합 분자의 CD3ζ 쇄 신호전달 도메인을 통해 신생 항원 인식을 제공하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 모두 활성화시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 "2세대" CAR는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포내 신호전달 도메인 및 T 세포 효능 및 지속성을 증강하도록 설계된 공-자극 도메인에 융합된 항원 결합 도메인, 예를 들면, 일본쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다[참조: Sadelain et al., Cancer Discov. 3:388-398 (2013)]. 따라서, CAR 설계는 항원 인식과 신호 형질도입, 즉 생리학적으로 2개의 개별 복합체, 즉 TCR 헤테로이량체와 CD3 복합체에 의해 담지되는 2개 기능을 조합할 수 있다. "2세대" CAR는 세포에 추가 신호를 제공하기 위해 CAR의 세포질 테일에 CD28, 4-1BB, ICOS, OX40 등과 같은 다양한 공-자극 분자로부터의 세포내 도메인을 포함한다.
"2세대" CAR는, 예를 들면, CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공-자극 및 CD3ζ 신호전달 도메인에 의한 활성화를 모두 제공한다. 전임상 연구에 따르면, "2세대" CAR는 T 세포의 항-종양 활성을 개선할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들면, 만성 림프모구 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia; CLL) 및 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia; ALL) 환자에서 CD19 분자를 표적으로 하는 임상 시험에서 "2세대" CAR 변형된 T 세포의 강력한 효능이 입증되었다[참조: Davila et al., Oncoimmunol. 1(9):1577-1583 (2012)].
"3세대" CAR는, 예를 들면, CD28과 4-1BB 도메인을 모두 포함함으로써 복수의 공-자극을 제공하고, 예를 들면, CD3ζ 활성화 도메인을 포함함으로써 활성화를 제공한다.
"4세대" CAR는, 예를 들면, CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공-자극, 및 구성적 또는 유도성 케모카인 성분 이외에 CD3ζ 신호전달 도메인에 의한 활성화를 제공한다.
"5세대" CAR는, 예를 들면, CD28 또는 4-1BB 도메인에 의한 공-자극, 및 CD3ζ 신호전달 도메인, 구성적 또는 유도성 케모카인 성분, 및 사이토카인 수용체의 세포내 도메인(예: IL-2Rβ)에 의한 활성화를 제공한다.
다양한 실시양태에서, CAR는 다가 CAR 시스템, 예를 들면, DualCAR 또는 "탠덤 CAR" 시스템에 포함될 수 있다. 다가 CAR 시스템은 복수의 CAR를 포함하는 시스템 또는 세포와, 하나 이상의 항원을 표적으로 하는 2가/이중특이적 CAR를 포함하는 시스템 또는 세포를 포함한다.
본원에 개시된 실시양태에서, CAR은 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 특정 비제한적 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 관심 있는 표적 세포(예를 들면, 병원체 또는 종양 세포)의 표면 항원에 대한 결합에 특이적인 scFv이다.
조합
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 약제의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 약제의 조합을 포함하는 조성물은 부가적 효과를 갖고, 여기서 조합의 전체 효과는 각 개별 약제의 효과의 합계와 거의 동일하다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 약제의 조합을 포함하는 조성물은 상승 효과를 갖고, 여기서 조합의 전체 효과는 각 개별 약제의 효과의 합계보다 더 크다.
약제의 조합을 포함하는 조성물은 임의의 적절한 비율로 개별 약제를 포함한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 조성물은 2개의 개별 약제를 1:1 비율로 포함한다. 그러나, 이 조합은 특정 비율로 한정되지 않는다. 오히려, 효과적인 것으로 나타나는 임의의 비율이 포함된다.
세포 표적화 도메인
본 발명의 다양한 실시양태에서, 본 발명의 LNP는 표적 세포의 수용체에 대한 결합에 특이적인 표적화 도메인에 접합된다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 줄기 세포이다. 본 발명의 조성물에 의해 표적화될 수 있는 예시적 줄기 세포에는 조혈 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포와 관련된 줄기 세포(예: 골수 줄기 세포 및 림프 줄기 세포)가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 표적 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다.
하나의 세포에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 본 발명의 조성물에 따라 표적화될 수 있는 예시적 면역 세포에는 T 세포, B 세포, NK 세포, 항원-제시 세포, 수지상 세포, 마크로파지, 단핵구, 호중구, 호산구 및 호염기구가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 표적화될 수 있는 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있고, T 헬퍼 세포(CD4+), 세포독성 T 세포(세포독성 T 림프구, CTL이라고도 지칭함; CD8-T 세포), 및 중앙 기억 T 세포(TCM), 줄기 기억 T 세포(TSCM), 줄기-세포-유사 기억 T 세포(또는 줄기-유사 기억 T 세포), 및 이펙터 기억 T 세포(예: TEM 세포 및 TEMRA(CD45RA+) 세포)를 포함한 기억 T 세포, 이펙터 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, Th22 세포, Tfh(여포 헬퍼) 세포, T 조절 세포, 천연 킬러 T 세포, 점막 연관 불변 T 세포(MAIT) 및 γδ T 세포 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 주요 T 세포 서브타입에는 TN(나이브), TSCM (줄기 세포 기억), TCM(중추 기억), TTM(이행 기억), TEM(이펙터 기억), 및 TTE(말단 이펙터), TCR-유전자도입 T 세포, 범용 사이토카인-매개 사멸을 위해 재지시된 T 세포(TRUCK), 종양 침윤 T 세포(TIL), CAR-T 세포 또는 질환 또는 장애의 치료에 사용할 수 있는 임의의 T 세포가 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 면역자극 세포, 즉 면역 반응을 매개하는 세포이다. 면역자극성인 예시적 T 세포로는 T 헬퍼 세포(CD4+), 세포독성 T 세포(세포독성 T 림프구, CTL이라고도 함; CD8+ T 세포), 및 중앙 기억 T 세포(TCM), 줄기 기억 T 세포(TSCM), 줄기-세포-유사 기억 T 세포(또는 줄기-유사 기억 T 세포) 및 이펙터 기억 T 세포를 포함한 기억 T 세포, 예를 들면, TEM 세포 및 TEMRA(CD45RA+) 세포, 이펙터 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, Th22 세포, Tfh(여포 헬퍼) 세포, 천연 킬러 T 세포, 점막 연관 불변 T 세포(MAIT) 및 γδ T 세포가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, T 세포 표적화 도메인은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 또는 CCR7에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 복수의 면역 세포를 표적으로 하기 위해 면역 세포 표적화 도메인에 접합된 전달 비히클의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조합은 2개 이상의 면역 세포 항원을 표적으로 하는 2개 이상의 면역 세포 표적화 전달 비히클을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 면역 세포 항원은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 조합은 CD4+ T 세포의 표면 항원 및 CD8+ T 세포의 표면 항원을 표적으로 하는 2개 이상의 T 세포 표적화 전달 비히클을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조합은 CD4 및 CD8을 표적으로 하는 2개 이상의 T 세포 표적화 전달 비히클을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 본 발명의 LNP에 접합된다. 접합의 예시적 방법에는 공유 결합, 정전기적 상호작용 및 소수성("반 데르 발스") 상호작용이 포함될 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 접합은 가역적 접합체이고, 따라서 특정 조건 또는 화학 물질에 노출되면 전달 비히클이 표적 영역으로부터 해리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합은 비가역적 접합이고, 따라서 정상 조건하에 전달 비히클이 표적화 도메인으로부터 해리되지 않는다.
일부 실시양태에서, 접합은 활성화된 폴리머 접합 지질과 표적화 도메인 사이의 공유 결합을 포함한다. "활성화된 폴리머 접합 지질"이라는 용어는 제1 커플링 그룹에 의한 폴리머 접합 지질의 기능화를 통해 활성화된 지질 부분과 폴리머 부분을 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 폴리머 접합 지질은 제2 커플링 그룹과 반응할 수 있는 제1 커플링 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 폴리머 접합 지질은 활성화된 페길화 지질이다. 특정 실시양태에서, 제1 커플링 그룹은 페길화 지질의 지질 부분에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제1 커플링 그룹은 페길화 지질의 폴리에틸렌 글리콜 부분에 결합된다. 특정 실시양태에서, 제2 작용기는 표적화 도메인에 공유 부착되어 있다.
제1 커플링 그룹 및 제2 커플링 그룹은, 예를 들면, 온화한 반응 조건 또는 생리학적 조건하에서 함께 공유 결합을 형성하는 것으로 당업자에게 공지된 임의의 작용기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 커플링 그룹 또는 제2 커플링 그룹은 말레이미드, N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 카보디이미드, 하이드라지드, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 포스핀, 하이드록시메틸 포스핀, 소랄렌, 이미도에스테르, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 비닐 설폰, 알파-할로아세틸, 아릴 아지드, 아실 아지드, 알킬 아지드, 디아지린, 벤조페논, 에폭사이드, 카보네이트, 무수물, 설포닐 염화물, 사이클로옥틴, 알데히드 및 설프하이드릴 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 커플링 그룹 또는 제2 커플링 그룹은 유리 아민(-NH2), 유리 설프하이드릴 그룹(-SH), 유리 하이드록사이드 그룹(-OH), 카복실레이트, 하이드라지드 및 알콕시아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 커플링 그룹은 말레이미드, 피리딜 디설파이드 또는 할로아세틸과 같은 설프하이드릴 그룹에 반응하는 작용기이다. 특정 실시양태에서, 제1 커플링 그룹은 말레이미드이다.
특정 실시양태에서, 제2 커플링 그룹은 설프하이드릴 그룹이다. 설프하이드릴 그룹은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 표적화 도메인에 설치될 수 있다. 특정 실시양태에서, 설프하이드릴 그룹은 유리 시스테인 잔기 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 설프하이드릴 그룹은 2-메르캅토에틸아민과의 반응과 같은 표적화 도메인 상의 디설파이드의 환원을 통해 나타난다. 특정 실시양태에서, 설프하이드릴 그룹은 유리 아민과 2-이미노틸란 또는 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA) 사이의 반응과 같은 화학 반응을 통해 설치된다.
일부 실시양태에서, 폴리머 접합 지질 및 표적화 도메인은 "클릭" 화학에 사용되는 그룹으로 기능화된다. 생체직교 "클릭" 화학은 아지드, 니트릴 산화물, 니트론, 이소시아나이드 및 이의 결합과 같은 1,3-쌍극자를 갖는 작용기와 알켄 또는 알킨 쌍극자와의 반응을 포함한다. 예시적 쌍극자는 사이클로옥틴, 디벤조사이클로옥틴, 모노불소화 사이클로옥틴, 이불소화 사이클로옥틴 및 비아릴아자사이클로옥티논을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 변형된 사이클로알켄 및 사이클로알킨을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 말레이미드 접합을 사용하여 LNP에 접합된다.
표적화 도메인
특정 실시양태에서, 조성물은 전달 비히클을 표적 면역 세포로 지시하는 표적화 도메인을 포함한다. 표적화 도메인은 치료제가 특히 필요한 부위로 입자를 표적화할 수 있는 핵산, 펩타이드, 항체, 소분자, 유기 분자, 무기 분자, 글리칸, 당, 호르몬 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 입자는 다가 표적화를 포함하고, 여기서 입자는 본원에 기재된 다수의 표적화 메커니즘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전달 비히클의 표적화 도메인은 전달 비히클 내에 포함된 약제를 필요로 하는 부위와 연관된 표적에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, 표적화 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 이러한 표적은 표적 부위와 연관된 단백질, 단백질 단편, 항원 또는 기타 생체분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 표적에 특이적으로 결합하는 친화성 리간드이다. 특정 실시양태에서, 표적(예를 들면, 항원)은 약제에 의한 치료가 필요한 부위와 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 전달 비히클을 포함하는 조성물과 공중합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은, 예를 들면, 표적화 도메인과 전달 비히클을 포함하는 조성물 사이의 화학 반응을 통해 전달 비히클을 포함하는 조성물에 공유 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 전달 비히클 내의 첨가제이다. 본 발명의 표적화 도메인에는 항체, 항체 단편, 단백질, 펩타이드 및 핵산이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
다양한 실시양태에서, 표적화 도메인은 관심 있는 세포의 세포 표면 분자에 결합한다. 예를 들면, 다양한 실시양태에서, 표적화 도메인은 내피 세포, 줄기 세포 또는 면역 세포의 세포 표면 분자에 결합한다.
펩타이드
특정 실시양태에서, 본 발명의 표적화 도메인은 펩타이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 표적화 도메인은 관심 있는 표적에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 펩타이드는 화학적 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드는 고상 기술[참조: Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204]에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 자동 합성은, 예를 들면, 제조업체에서 제공하는 지침에 따라 ABI 431 A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다.
펩타이드는 재조합 수단 또는 더 긴 폴리펩타이드로부터의 절단에 의해 제조될 수도 있다. 펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드의 변이체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존 아미노산 잔기(바람직하게는 보존 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형 아미노산 잔기, 예를 들면, 치환된 그룹의 부착에 의해 변형된 잔기가 존재하는 것, (iii) 펩타이드가 본 발명의 펩타이드의 대체 스플라이스 변이체인 것, (iv) 펩타이드의 단편 및/또는 (v) 펩타이드가 리더 또는 분비 서열 또는 정제(예를 들면, His 태그) 또는 검출(예를 들면, Sv5 에피토프 태그)에 사용되는 서열과 같은 또 다른 펩타이드와 융합되는 것일 수 있다. 단편에는 원래 서열의 단백질분해 절단(복수 부위 단백질분해 포함)을 통해 생성된 펩타이드가 포함된다. 변이체는 번역 후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 2개 펩타이드 사이의 "유사성"은 하나의 펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2 펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 변이체는 원래 서열과는 상이한 펩타이드 서열, 바람직하게는 관심 있는 세그먼트당 잔기의 40% 미만에서 원래 서열과는 상이한 서열, 더욱 바람직하게는 관심 있는 세그먼트당 잔기의 25% 미만에서 원래 서열과는 상이한 서열, 더욱 바람직하게는 관심 있는 세그먼트당 잔기의 10% 미만에서 원래 서열과는 상이한 서열, 가장 바람직하게는 관심 있는 세그먼트당 단지 몇 개의 잔기에서 원래 단백질 서열과는 상이한 서열 및 동시에 원래 서열의 기능을 보존하기 위해 원래 서열에 대해 충분한 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것으로 정의된다. 본 발명은 원래 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% 또는 95% 유사 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 2개 펩타이드 사이의 동일성 정도는 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 2개 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다[참조: BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol: 403-410 (1990)].
본 발명의 펩타이드는 번역 후 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 범위에 속하는 번역 후 변형에는 신호 펩타이드 절단, 글리코실화, 아세틸화, 이소프레닐화, 단백질분해, 미리스토일화, 단백질 폴딩 및 단백질분해 처리 등이 포함된다. 일부 변형 또는 처리 이벤트는 추가의 생물학적 기계의 도입을 필요로 한다. 예를 들면, 신호 펩타이드 절단 및 코어 글리코실화와 같은 처리 이벤트는 표준 번역 반응에 캐닌 마이크로솜 막 또는 제노퍼스 난 추출물(미국 특허 제6,103,489호)을 첨가하여 검사할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 번역 후 변형에 의해 형성되거나 번역 중에 비천연 아미노산을 도입하여 형성된 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
핵산
특정 실시양태에서, 본 발명의 표적화 도메인은, 예를 들면, DNA 올리고뉴클레오티드 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 표적화 도메인은 관심 있는 표적에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 핵산은 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
핵산 표적화 도메인의 뉴클레오티드 서열은, 수득된 핵산이 원래와 같이 기능하고 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 조건하에, 원래의 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 변이(예: 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및/또는 결실)을 대체할 수 있다.
본 기재에서 사용되는 의미에서, 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에 대해 이의 뉴클레오티드 서열이 적어도 60%, 유리하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는 경우에 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열과 "실질적으로 상동성"이다. 가능한 변형의 다른 예로는 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 서열의 임의의 말단에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 또는 서열의 임의의 말단 또는 내부에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실이 포함된다. 2개 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성 정도는 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 2개 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 결정된다[참조: BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol: 403-410 (1990)].
항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 표적화 도메인은 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 표적화 도메인은 관심 있는 표적에 특이적으로 결합한다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fab 및 일본쇄 Fv(scFv) 단편, 이중특이적 항체, 헤테로접합체, 인간 및 인간화 항체를 포함한다.
항체는 무손상 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 및 면역학적 활성 단편(예, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 인간화 항체, 유전자 조작 일본쇄 Fv 분자(Ladner et al., 미국 특허 제4,946,778호) 또는 키메라 항체(예: 뮤린(murine) 항체의 결합 특이성을 함유하지만 나머지 부분이 인간 유래의 것인 항체)일 수 있다. 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단편 및 키메라를 포함하는 항체는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
이러한 항체는 하이브리도마 배양, 박테리아 또는 포유동물 세포 배양물에서의 재조합 발현, 및 유전자도입 동물에서의 재조합 발현을 포함하는 다양한 방법으로 생산할 수 있다. 제조 방법론의 선택은 목적하는 항체 구조, 항체 상의 탄수화물 모이어티의 중요성, 배양 및 정제의 용이성, 및 비용을 포함한 몇몇 요인에 따라 달라진다. 전장 항체, Fab 및 Fv 단편과 같은 항체 단편, 뿐만 아니라 상이한 종의 성분을 포함하는 키메라 항체를 포함하여 표준 발현 기술을 사용하여 다수의 상이한 항체 구조를 생성할 수 있다. 이펙터 기능을 갖지 않고 약물동태 활성이 제한된 Fab 및 Fv 단편과 같은 작은 크기의 항체 단편은 박테리아 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 일본쇄 Fv 단편은 낮은 면역원성을 나타낸다.
항원
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 면역 세포 표적화 LNP를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원은 병원체 또는 종양 세포와 연관된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하여, CAR를 발현하는 생체내 변형된 면역 세포가 항원에 표적화되어 항원, 따라서 병원체 또는 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도한다.
특정 실시양태에서, 핵산 분자에 의해 코딩되는 CAR에 의해 인식되는 항원은 임의 수의 생물, 예를 들면, 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균 또는 포유동물로부터의 단백질, 펩타이드, 이의 단편 또는 이의 변이체 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원은 종양-특이적 항원 또는 종양-연관 항원을 포함하여, CAR를 발현하는 면역 세포가 항원을 발현하는 종양 세포로 지시되도록 한다.
바이러스 항원
특정 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 항원은 다음 계열 중 하나로부터 유래하는 바이러스로부터 유래한다: 아데노바이러스과(Adenoviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 헤파드바이러스과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 파보바이러스과(Parvoviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 또는 토가바이러스과(Togaviridae). 특정 실시양태에서, 바이러스 항원은 유두종 바이러스(papilloma viruses), 예를 들면, 인간 유두종 바이러스(human papillomoa virus; HPV), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 소아마비 바이러스(polio virus), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 천연두 바이러스(smallpox virus)(Variola major 및 minor), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 라이노바이러스(rhinoviruses), 뎅기열 바이러스(dengue fever virus), 말 뇌염 바이러스(equine encephalitis viruses), 풍진 바이러스(rubella virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 노르워크 바이러스(Norwalk virus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(human T-cell leukemia virus; HTLV-I), 털세포 백혈병 바이러스(hairy cell leukemia virus; HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 한타 바이러스(Hanta virus)(출혈열(hemorrhagic fever)), 광견병 바이러스(rabies virus), 에볼라 열 바이러스(Ebola fever virus), 마르부르크 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(measles virus), 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus; RSV), 단순 포진 1(herpes simplex 1)(구강 헤르페스(oral herpes)), 단순 포진 2(herpes simplex 2)(성기 헤르페스(genital herpes)), 대상 포진(herpes zoster)(수두-조스터(varicella-zoster), a.k.a., 수두(chickenpox)), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV), 예를 들면, 인간 CMV, 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 플라비바이러스(flavivirus), 수족구병 바이러스(foot and mouth disease virus), 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 라사 바이러스(lassa virus), 아레나 바이러스(arenavirus), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 또는 암 유발 바이러스(cancer causing virus).
기생충 항원
특정 실시양태에서, 항원은 기생충 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 기생충은 원생동물, 기생충 또는 외부 기생충이다. 특정 실시양태에서, 기생충(helminth)(즉, 벌레)은 편충(flatworm)(예: 플루크(flukes) 및 촌충(tapeworms)), 가시머리 벌레(thorny-headed worm) 또는 둥근 벌레(round worm)(예: 요충(pinworms))이다. 특정 실시양태에서, 외부 기생충은 이(lice), 벼룩(fleas), 진드기(ticks) 및 진드기(mites)이다.
특정 실시양태에서, 기생충은 하기 질환을 유발하는 임의의 기생충이다: 아칸타모에바 각막염(Acanthamoeba keratitis), 아메바증(Amoebiasis), 아스카리증(Ascariasis), 바베시오증(Babesiosis), 발란티디아증(Balantidiasis), 베일리사스카리아증(Baylisascariasis), 차가스병(Chagas disease), 클로노르키아증(Clonorchiasis), 섬모증(Cochliomyia), 크립토스포리디움증(Cryptosporidiosis), 디필로보트리아증(Diphyllobothriasis), 드라쿤쿨리아증(Dracunculiasis), 에키노코쿠스증(Echinococcosis), 코끼리증(Elephantiasis), 엔테로비아증(Enterobiasis), 파시올리아증(Fascioliasis), 파시오롭시아증(Fasciolopsiasis), 필라리아증(Filariasis), 지아르디아증(Giardiasis), 그나토스토미증(Gnathostomiasis), 히메놀레피아증(Hymenolepiasis), 이소포자충증(Isosporiasis), 가타야마열(Katayama fever), 리슈마니아증(Leishmaniasis), 라임병(Lyme disease), 말라리아(Malaria), 메타고니마증(Metagonimiasis), 마이아증(Myiasis), 사상충증(Onchocerciasis), 페디큐라증(Pediculosis), 옴(Scabies), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 수면병(Sleeping sickness), 스트롱길로이디아증(Strongyloidiasis), 태니아증(Taeniasis), 톡소카리증(Toxocariasis), 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis), 트리키노시스증(Trichinosis) 및 트리쿠리아증(Trichuriasis).
특정 실시양태에서, 기생충은 아칸타모에바(Acanthamoeba), 아니사키스(Anisakis), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 봇플라이(Botfly), 발란티디움 콜리(Balantidium coli), 빈대(Bedbug), 세스토다(Cestoda)(촌충(tapeworm)), 치거(Chiggers), 코클리미아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax), 엔타모에바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 구충(Hookworm), 레이쉬마니아(Leishmania), 링가툴라 세라타(Linguatula serrata), 간 흡충(Liver fluke), 로아 로아(Loa loa), 파라고니무스(Paragonimus) - 폐 흡충(lung fluke), 요충(Pinworm), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 주혈흡충(Schistosoma), 스트롱일로이드 스테코랄리스(Strongyloides stercoralis), 진드기(Mite), 촌충(Tapeworm), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리파노소종(Trypanosoma), 편충(Whipworm) 또는 우케레리아 방크로프트티(Wuchereria bancrofti)이다.
박테리아 항원
특정 실시양태에서, 항원은 박테리아 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 하기 문(phyla) 중 어느 하나로부터 유래한다: 산성 박테리아(Acidobacteria), 방선균(Actinobacteria), 남조류(Aquificae), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 칼디세리카(Caldiserica), 클라미디아(Chlamydiae), 클로로비(Chlorobi), 클로로플렉스(Chloroflexi), 크리시오게네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코커스-써머스(Deinococcus-Thermus), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 엘루시마이크로비아(Elusimicrobia), 파이브로박테리아(Fibrobacteres), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 젬마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 렌티스파에래(Lentisphaerae), 니트로스피라(Nitrospira), 플랜크토마이세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카테스(Spirochaetes), 시너지스테테스(Synergistetes), 테네리쿠테스(Tenericutes), 열설포박테리아(Thermodesulfobacteria), 써모토게(Thermotogae), 및 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia)이다.
특정 실시양태에서, 박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 독립영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 중성균, 호중구균, 호염성균, 호산성균, 알칼리성균, 호열성균, 호염성균, 반호염성균 또는 삼투성균이다.
특정 실시양태에서, 박테리아는 탄저균(anthrax bacterium), 항생제 내성 박테리아(antibiotic resistant bacterium), 질환 유발 박테리아, 식중독 박테리아, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리아(Salmonella bacterium), 포도상구균 박테리아(Staphylococcus bacterium), 스트렙토코커스 박테리아(Streptococcus bacterium), 또는 파상풍 박테리아(tetanus bacterium)이다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 마이코박테리아(mycobacteria), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 메티실린-내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) 또는 클로스트리디움 디피실리균(Clostridium difficile)이다.
진균 항원
특정 실시양태에서, 항원은 진균 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 진균은 아스페르길루스 종(Aspergillus species), 블래스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 효모(Candida yeasts)(예: 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 코시디오이드(Coccidioides), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gattii), 더마토피테(dermatophyte), 푸사리움 종(Fusarium species), 히스토플라즈마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 뮤코로마이코티나(Mucoromycotina), 뉴모시스티스 지로베키(Pneumocystis jirovecii), 스포로트릭스 켄키(Sporothrix schenckii), 엑스로힐룸(Exserohilum) 또는 클라도스포리움(Cladosporium)이다.
종양 항원
특정 실시양태에서, 항원은, 예를 들면, 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원을 포함하는 종양 항원을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연관된 항원"은 특정 과증식성 장애에 공통하는 항원을 지칭한다. 특정 양태에서, 본 발명의 과증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종(melanoma), 중피종(mesothelioma), 흉선종(thymoma), 림프종(lymphoma), 육종(sarcoma), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkins lymphoma), 백혈병(leukemias), 자궁암(uterine cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(kidney cancer), 및 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer) 등과 같은 선암을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 암으로부터 유래한다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 종양 항원은 포유동물의 암 종양으로부터 유래된 종양 침윤 림프구(TIL)에 의해 면역원적으로 인식되는 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 항원의 선택은 본 발명의 조성물을 통해 치료 또는 예방되는 암의 특정 유형에 따라 달라질 수 있다.
종양 항원은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 신경교종 연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모 성선 자극 호르몬, 알파페토프로테인(AFP), 렉틴-반응 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선암 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린이 포함된다.
특정 실시양태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격의 표적 항원으로 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이러한 분자에는 흑색종의 MART-1, 티로시나제 및 GP 100과 같은 조직-특이적 항원, 및 전립선암에서 전립선 산성 포스파타제(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환-관련 분자의 그룹에 속한다. 또 다른 표적 항원의 그룹은 암배아성 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 고유한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종에서 표적 항원의 다른 후보이다. 이러한 항원 중 일부(CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)는 모노클로날 항체를 사용한 수동 면역요법의 표적으로 사용되었으나, 제한적 성공을 거두었다.
본 발명에서 언급된 종양 항원의 유형은 또한 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-연관 항원(TAA)일 수도 있다. TSA는 종양 세포에 고유하고, 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA-연관 항원은 종양 세포에 고유하지 않고, 대신에 항원에 대한 면역학적 내성의 상태를 유도하지 못하는 조건하에 정상 세포에서도 발현된다. 종양 상에서 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건하에서 발생할 수 있다. TAA는 정상 세포에서는 일반적으로 매우 낮은 수준으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 예는 다음이 포함된다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 분화 항원, 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양-특이적 다계통 항원; CEA와 같은 과발현 배아 항원; 과발현 종양 유전자 및 돌연변이 종양-억제 유전자(예: p53, Ras, HER-2/neu); 염색체 전좌로부터 발생하는 고유 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 엡스타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7과 같은 바이러스 항원. 기타 거대 단백질-기반 항원으로는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-페토단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS.
보조제
특정 실시양태에서, 조성물은 보조제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 보조제를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 보조제-코딩 핵산 분자는 IVT RNA이다. 특정 실시양태에서, 보조제-코딩 핵산 분자는 뉴클레오시드-변형 mRNA이다.
예시적 보조제에는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인(TECK), 점막-연관 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86(신호 서열이 결실되고 임의로 IgE로부터의 신호 펩타이드가 포함된 IL-15를 포함)가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 유용한 보조제일 수 있는 다른 유전자로는 하기를 코딩하는 것들이 포함된다: MCP-I, MIP-Ia, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-I, VLA-I, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-I, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-I, Ap-I, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP 1, TAP2, 항-CTLA4-sc, 항-LAG3-Ig, 항-TIM3-Ig 및 이의 기능성 단편.
약제학적 조성물
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학의 분야에서 공지되거나 이후 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법에는 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키고, 이어서 필요하거나 바람직한 경우에 생성물을 목적하는 단일 또는 복수 용량 단위로 성형 또는 포장하는 단계가 포함된다.
본원에 제공된 약제학적 조성물의 기재는 주로 인간에게 윤리적으로 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기에 적합하다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 다양한 동물에게 투여하기에 적합한 조성물로 되게 하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 널리 공지되어 있고, 통상의 숙련된 수의약학자는 이러한 변형을 단지 통상적인 실험을 통해 설계 및 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체에는 인간 및 기타 영장류, 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개와 같은 상업적으로 관련된 포유동물을 포함한 포유동물이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 안과, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 협측, 정맥, 뇌실내, 피내, 근육내 또는 또 다른 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 기타 고려되는 제형으로는 투영된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재봉입 적혈구, 면역원-기반 제형 등이 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 단위 용량 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 벌크로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단위 용량"은 소정 양의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 개별적 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여되는 활성 성분의 투여량 또는, 예를 들면, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 이러한 투여량의 편리한 분획과 동일하다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의의 추가 성분의 상대적 양은 치료 대상체의 속성, 크기 및 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 활성 성분 외에도, 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제어 방출 또는 서방형 제형은 종래의 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약제학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직에 대한 물리적 파괴 및 조직 내 파괴를 통한 약제학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서, 비경구 투여에는 조성물의 주사에 의한 약제학적 조성물의 투여, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-관통 비외과적 창상을 통한 조성물의 적용 등이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 안구내, 유리체강내, 피하, 복강내, 근육내, 피내, 강내 주사, 종양내, 정맥내, 뇌실내 및 신장 투석 주입 기술이 포함되지만 이들로 한정되지 않는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장 생리식염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 앰플 또는 방부제가 함유된 복수회 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형에는 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 서방형 또는 생분해성 제형이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 일 실시양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적절한 비히클(예: 멸균 피로겐-비함유 물)과 재구성하기 위해 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 이외에 본원에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사용 제형은, 예를 들면, 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성 비경구 허용되는 희석제 또는 용매를 사용하여 제조할 수 있다. 기타 허용되는 희석제 및 용매로는 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 합성 모노- 또는 디글리세라이드와 같은 고정 오일이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 유용한 다른 비경구-투여 가능한 제형에는 활성 성분을 미결정 형태, 리포좀 제제 또는 생분해성 폴리머 시스템의 성분으로서 포함하는 것들이 포함된다. 서방형 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 폴리머 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용되는 폴리머 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하고 직경이 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위인 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 분말을 분산시키기 위해 추진제의 스트림이 유도될 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하거나, 밀봉된 용기 내에 저비점 추진제에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자가-추진 용매/분말-분배 용기를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태가 편리하다. 바람직하게는, 이러한 분말은 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 나노미터 초과의 직경을 갖고, 수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 나노미터 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 나노미터 초과의 직경을 갖고, 수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 바람직하게는 설탕과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함하고, 단위 용량 형태로 편리하게 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 비점이 65℉ 미만인 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(바람직하게는, 활성 성분을 구성하는 입자와 동일한 정도의 입자 크기를 갖는 것)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장성 생리식염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사용 제형은 앰플 또는 방부제가 포함된 복수회 투여 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형에는 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 서방형 또는 생분해성 제형이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 일 실시양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 전에 적절한 비히클(예: 멸균 피로겐-비함유 물)과 재구성하기 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
약제학적 조성물은 멸균된 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 이외에 본원에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사용 제형은, 예를 들면, 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성 비경구-허용되는 희석제 또는 용매를 사용하여 제조할 수 있다. 기타 허용되는 희석제 및 용매로는 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 디글리세라이드와 같은 고정 오일이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 유용한 다른 비경구 투여 가능한 제형에는 활성 성분을 미결정 형태, 리포좀 제제 또는 생분해성 폴리머 시스템의 성분으로서 포함하는 것들이 포함된다. 서방형 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 폴리머 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용되는 폴리머 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "추가 성분"에는 하기의 하나 이상이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화 및 분해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 착향제; 착색제; 방부제; 젤라틴과 같은 생리학적으로 분해 가능한 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 점활제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 약제학적으로 허용되는 폴리머 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 참조에 의해 본원에 통합되어 있는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)]에 기재되어 있다.
방법
일 양태에서, 본 개시는 핵산 분자와 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 표적 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 약제학적 조성물(이들로 한정되지 않음)과 같은 조성물로서 임의로 제형화되는 적어도 하나의 지질 나노입자(LNP)를 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 이온화 가능한 지질을 포함하고, 여기서 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 50mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함하고, 여기서 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 45mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고, 여기서 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물의 조합은 LNP의 약 5mol% 내지 약 50mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질을 포함하고, 여기서 PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%를 구성한다.
특정 실시양태에서, LNP는 표적 세포의 표면 분자에 대한 결합에 특이적인 세포 표적화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 표적화 도메인은 LNP의 적어도 하나의 성분에 공유 접합된다.
특정 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 I의 이온화 가능한 지질 또는 이의 염 또는 용매화물이다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
A1 및 A2는 CH, N 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L1 및 L6은 CR19 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
L2 및 L5의 각 발생은 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L3 및 L4는 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17, R18 및 R19의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬), 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐), 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐), 임의로 치환된 C6-C10 아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C10 아릴), 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴), C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z'(R21)z"-에스테르, -Y(R20)z'(R21)z", -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나,
또는, R3a와 R3b, R4a와 R4b, R5a와 R5b, R6a와 R6b, R7a와 R7b, R8a와 R8b, R9a와 R9b, R10a와 R10b, R11a와 R11b, R12a와 R12b, R13a와 R13b, R14a와 R14b, 또는 R15a와 R15b로부터 선택된 2개의 저미날(geminal) 치환기는 이들이 결합되어 있는 C 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
Y의 각 발생은 C, N, O, S 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R20 및 R21의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
또는, R20 및 R21은 이들이 결합되어 있는 Y 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
z' 및 z"의 각 발생은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w 및 x의 각 발생은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 II의 화합물이다:
[화학식 II]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 III의 화합물이다:
[화학식 III]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 IV의 화합물이다:
[화학식 IV]
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특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 V의 화합물이다:
[화학식 V]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 VI의 화합물이다:
[화학식 VI]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 VII의 화합물이다:
[화학식 VII]
.
특정 실시양태에서, 화학식 II, III, IV, V, VI 및 VII의 화합물에서, 하기 정의는 독립적으로 적용된다:
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고;
b1, b2, b3, b4 및 b5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
c1 및 c2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
d1 및 d2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, 메틸, 에틸, 이소-프로필, n-프로필, n-부틸, t-부틸, 이소-부틸 및 sec-부틸로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 VIII의 화합물이다:
[화학식 VIII]
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특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 IX의 화합물이다:
[화학식 IX]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 X의 화합물이다:
[화학식 X]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 XI의 화합물이다:
[화학식 XI]
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특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 XII의 화합물이다:
[화학식 XII]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 XIII의 화합물이다:
[화학식 XIII]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 XIV의 화합물이다:
[화학식 XIV]
.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 XV의 화합물이다:
[화학식 XV]
.
특정 실시양태에서, 화학식 VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV 및 XV의 화합물에서, 하기 정의가 독립적으로 적용된다:
R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.
특정 실시양태에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 메틸, 에틸, 이소-프로필, n-프로필, n-부틸, t-부틸, 이소-부틸 및 sec-부틸로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질은 1,1'-((2-(2-(4-(2-((2-(2-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)에톡시)에틸)(2-하이드록시테트라데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에톡시)에틸)아잔디일)비스(테트라데칸-2-올)을 포함한다:
[화학식 C14-4]
.
본 발명은 표적 대상체의 면역 세포에 약제를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약제는 질환 또는 장애와 연관된 적어도 하나의 마커를 검출하기 위한 진단제이다. 일부 실시양태에서, 약제는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 치료제이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 진단제 또는 치료제, 하나 이상의 보조제 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 진단, 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 유전자 편집 또는 유전자 조작용 조성물을 대상체의 표적 면역 세포에 전달하는 것을 제공한다. 예시적 질환 또는 장애는 병원성 질환 및 장애 및 암을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 표적 대상체에서 감염, 또는 감염원과 연관된 질환 또는 장애에 면역을 제공한다. 따라서, 본 발명은 감염, 또는 감염원과 연관된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 이 방법은 투여된 조성물의 항원의 유형에 따라 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 예시적 항원 및 연관 감염, 질환 및 종양은 본원의 다른 부분에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 부분적으로 이를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 이와 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 암, 또는 이와 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위해 종양 항원에 대한 결합에 특이적인 CAR를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 면역 세포 표적화 LNP를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 예시적 암에는 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 충수암(appendix cancer), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌 및 척수 종양(brain and spinal cord tumors), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 뇌종양(brain tumor), 유방암(breast cancer), 기관지 종양(bronchial tumors), 버킷 림프종(burkitt lymphoma), 카르시노이드 종양(carcinoid tumor), 중추신경계 비정형 테라토이드/흉선 종양(central nervous system atypical teratoid/rhabdoid tumor), 중추신경계 배아 종양(central nervous system embryonal tumors), 중추신경계 림프종(central nervous system lymphoma), 소뇌 성상세포종(cerebellar astrocytoma), 뇌 성상세포종/악성 신경교종(cerebral astrocytoma/malignant glioma), 뇌 성상세포종/악성 신경교종(cerebral astrocytotna/malignant glioma), 자궁경부암(cervical cancer), 소아 시각 경로 종양(childhood visual pathway tumor), 척수종(chordoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 만성 골수 증식성 장애(chronic myeloproliferative disorders), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 두개인두종(craniopharyngioma), 피부암(cutaneous cancer), 피부 T-세포 림프종(cutaneous t-cell lymphoma), 자궁내막암(endometrial cancer), 상피 모세포종(ependymoblastoma), 상피종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 유잉 종양군(ewing family of tumors), 두개외암(extracranial cancer), 생식선외 생식세포 종양(extragonadal germ cell tumor), 간외 담관암(extrahepatic bile duct cancer), 간외암(extrahepatic cancer), 안암(eye cancer), 진균종(fungoides), 담낭암(gallbladder cancer), 위(위장)암(gastric(stomach) cancer)), 위장관암(gastrointestinal cancer), 위장관 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor)(기스트(gist)), 생식세포 종양(germ cell tumor), 임신성 암(gestational cancer), 임신성 영양막 종양(gestational trophoblastic tumor), 교모세포종(glioblastoma), 신경교종(glioma), 모세포 백혈병(hairy cell leukemia), 두경부암(head and neck cancer), 간세포(간) 암(hepatocellular (liver) cancer), 조직구증(histiocytosis), 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 시상하부 및 시각 경로 신경교종(hypothalamic and visual pathway glioma), 시상하부 종양(hypothalamic tumor), 안구(눈) 암(intraocular (eye) cancer), 안구 흑색종(intraocular melanoma), 섬세포 종양(islet cell tumors), 카포시 육종(kaposi sarcoma), 신장(신장 세포) 암(kidney (renal cell) cancer), 랑게르한스 세포 암(langerhans cell cancer), 랑게르한스 세포 조직구증(langerhans cell histiocytosis), 후두암(laryngeal cancer), 백혈병(leukemia), 입술 및 구강암(leukemia), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 마크로글로불린혈증(macroglobulinemia), 골육종 및 골육종의 악성 섬유조직종(malignant fibrous histiocvtoma of bone and osteosarcoma), 수모세포종(medulloblastoma), 수질상피종(medulloepithelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포 암종(merkel cell carcinoma), 중피종(mesothelioma), 원발 불명의 전이성 편평 경부암(metastatic squamous neck cancer with occult primary), 구강암(mouth cancer), 다발성 내분비 신생물 증후군(multiple endocrine neoplasia syndrome), 다발성 골수종(multiple myeloma), 진균증(mycosis), 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수형성이상/골수증식성 질환(myelodysplastic/myeloproliferative diseases), 골수성 백혈병(myelogenous leukemia), 골수성 백혈병(myeloid leukemia), 골수종(myeloma), 골수증식성 장애(myeloproliferative disorders), 비강 및 부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 비호지킨 림프종(non-hodgkin lymphoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 구강암(oral cancer), 구강암(oral cavity cancer), 구인두암(oropharyngeal cancer), 골육종 및 악성 섬유조직세포종(osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma), 골육종 및 뼈의 악성 섬유조직세포종(osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma of bone), 난소(ovarian), 난소암(ovarian cancer), 난소 상피암(ovarian epithelial cancer), 난소 생식세포 종양(ovarian germ cell tumor), 난소 저악성 잠재 종양(ovarian low malignant potential tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 유두종증(papillomatosis), 부신경절종(paraganglioma), 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 갈색세포종(pheochromocytoma), 중간 분화의 송과체 실질 종양(pineal parenchymal tumors), 송과모세포종(pineoblastoma) 및 뇌실질상 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 형질 세포 신생물(plasma cell neoplasm), 형질 세포 신생물/다발성 골수종(plasma cell neoplasm/multiple myeloma), 흉막 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 원발성 중추 신경계 암(primary central nervous system cancer), 원발성 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma), 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신세포(신장)암(renal cell (kidney) cancer), 신장 골반 및 요관암(renal pelvis and ureter cancer), 15번 염색체의 너트 유전자와 관련된 호흡기 암종(respiratory tract carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암(salivary gland cancer), 육종(sarcoma), 세자리 증후군(sezary syndrome), 피부암(흑색종)(skin cancer (melanoma)), 피부암(비흑색종)(skin cancer (nonmelanoma)), 피부암(skin carcinoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 소장암(small intestine cancer), 연조직암(soft tissue cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 편평세포암(squamous cell carcinoma), 편평 목암(squamous neck cancer), 위장(위)암(stomach (gastric) cancer), 상부 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 상부 원시 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumors) 및 송과모세포종(pineoblastoma), T-세포 림프종(T-cell lymphoma), 고환암(testicular cancer), 인후암(throat cancer), 흉선종 및 흉선암(thymoma and thymic carcinoma), 갑상선암(thyroid cancer), 전이세포암(transitional cell cancer), 신장 골반 및 요관의 전이 세포암(transitional cell cancer), 영양막 종양(trophoblastic tumor), 요도암(urethral cancer), 자궁암(uterine cancer), 자궁 육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 시각 경로 및 시상하부 신경교종(visual pathway and hypothalamic glioma), 외음부암(vulvar cancer), 월든스트롬 거대혈소판혈증(waldenstrom macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(wilms tumor)이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 조성물은 감염, 질환 또는 암을 갖는 표적 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 감염, 질환 또는 암을 발증할 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들면, 조성물은 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 등과 접촉할 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 면역 세포 표적화 LNP를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 분자는 질환 또는 장애의 치료를 위한 치료제를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 분자는 병원체 또는 암 세포에 의해 발현되는 항원에 대한 T 세포를 표적으로 하는 약제(예를 들면, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 mRNA 분자)를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 추가의 치료제, 보조제 또는 이들의 조합과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 본 방법은 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 약제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 LNP 및 하나 이상의 보조제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 LNP를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 약제를 코딩하는 핵산 분자 및 하나 이상의 보조제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단일 LNP를 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 복수의 약제, 보조제 또는 이들의 조합을 코딩하는 복수의 뉴클레오시드-변형된 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 약제 또는 보조제의 지속적 발현을 투여 후 적어도 수일 동안 가능하게 한다. 그러나, 특정 실시양태에서, 본 방법은 또한 특정 실시양태에서 핵산이 대상체 게놈에 통합되지 않는 것과 같이 일시적 발현을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 약제 또는 본원에 기재된 보조제의 안정한 발현을 제공하는 뉴클레오시드-변형 RNA를 투여하는 것을 포함한다.
치료 방법에서 본 발명의 조성물의 투여는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 다수의 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들면, 장내 또는 비경구 투여를 포함하여 대상체에 대한 전신 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 피내 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 정맥내 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 근육내 전달을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 피하 전달을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 흡입을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 조성물의 비강내 전달을 포함한다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 또 다른 약제와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 본 발명의 방법을 실행하기 위해 본원에 기재된 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 약제, 보조제 또는 이들의 조합을 코딩하는 약제학적 조성물의 사용을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 약제학적 조성물은 ng/kg/일 및 100mg/kg/일의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에서 본 발명의 화합물의 농도가 10nM 내지 10mM로 되는 용량을 투여하는 것을 상정한다.
전형적으로, 본 발명의 방법에서 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있는 용량은 포유동물의 체중 킬로그램당 0.01μg 내지 약 50mg의 범위이고, 투여되는 정확한 용량은 포유동물의 종류 및 치료되는 질환 상태의 종류, 포유동물의 연령 및 투여 경로를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의 수의 요인에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 화합물의 용량은 포유동물의 체중 킬로그램당 약 0.1μg로부터 약 10mg까지 달라질 것이다. 더욱 바람직하게는, 투여량은 포유동물의 체중 킬로그램당 약 1μg로부터 약 1mg까지 달라진다.
본 조성물은 포유동물에게 1일 수회와 같이 빈번히 투여될 수도 있고, 1일에 1회, 1주일에 1회, 2주에 1회, 1개월에 1회와 같이 덜 빈번히 투여될 수도 있고, 수개월에 1회 또는 1년에 1회 이하와 같이 훨씬 덜 빈번히 투여될 수도 있다. 투여 빈도는 당업자가 용이하게 명백할 수 있고, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 포유동물의 유형 및 연령 등(이들로 한정되지 않음)과 같은 임의 수의 요인에 따라 달라질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나, 또는 복수회 투여에 의해 부스팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 하나 이상의 약제 또는 본원에 기재된 보조제를 코딩하는 하나 이상의 조성물을 투여하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 부가적 효과를 갖고, 여기서 조합을 투여하는 전체 효과는 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 각 약제 또는 보조제를 투여하는 효과의 합계와 거의 동등하다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 시너지 효과를 갖고, 조합 투여의 전체 효과는 관심 있는 병원체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포를 표적화하기 위한 각 약제 또는 보조제를 투여하는 효과의 합계보다 더 크다.
실시예
본 출원의 다양한 실시양태는 예시적으로 제공되는 하기 실시예를 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 본 출원의 범위는 본원에 제공된 실시예로 한정되지 않는다.
재료 및 방법
재료
DLin-MC3-DMA(MC3)는 MedChemExpress로부터 구입했다. 덱사메타손은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)로부터 수득했다. 기타 헬퍼 지질은 아반티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)로부터 구입했다.
루시퍼라제 mRNA 생산
코돈 최적화된(codon optimzed) 반딧불이 루시퍼라제를 mRNA 생산 플라스미드(최적화된 3' 및 5' UTR, 101 polyA 테일 포함)에 클로닝하고, N1-메틸슈도우리딘 변형된 뉴클레오시드(N1mΨ)의 존재하에 시험관내에서 전사하고, CleanCapTM 기술(TriLink)을 사용하여 공-전사적으로 캡핑하고, 셀룰로오스 정제하여 dsRNA를 제거했다. 정제된 mRNA를 에탄올 침전하고, 세척하고, 뉴클레아제-비함유 물에 재현탁시키고, 품질 관리(예: 전기영동, 도트 블롯, 인간 수지상 세포로의 형질감염)에 제공했다. mRNA는 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다.
지질 나노입자(LNP) 제형 및 특성화
특정 실시양태에서, 모든 지질을 함유하는 에탄올 상 및 mRNA를 포함하는 수성 상은 마이크로유체 장치를 사용하여 혼합되어 LNP를 합성했다. 에탄올 상은 이온화 가능한 지질(MC3), 1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](C14PEG-2000), 콜레스테롤 및 덱사메타손을 포함했다. MC3, DSPC 및 C14PEG-2000을 각각 50%, 10% 및 1.5%의 몰 비율로 혼합했다. 콜레스테롤과 덱사메타손의 몰 비율은 제형에 따라 상이하고, 합계 몰 비율은 38.5%이다. 수성 상은 10mM 시트레이트 완충액에 용해된 루시퍼라제 mRNA를 포함했다. 에탄올 및 수성 상은 각각 1.8ml/min 및 0.6mL/min(3:1)의 유속으로 Pump33DS 시린지 펌프(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 사용하여 혼합했다. LNP를 미세투석 카세트(20,000 MWCO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 투석용 1×PBS에 2시간 동안 넣고, 이어서 0.22μm 필터를 통해 여과했다. 제타사이저 나노(Zetasizer Nano)(Malvern Instruments, Malvern, U.K.)를 사용하여 다분산 지수(PDI) 및 Z-평균 직경을 측정했다. 각 LNP 제형에서 mRNA 농도 및 캡슐화 효율은 개량된 Quant-iT RiboGreen(ThermoFisher) 검정에 의해 측정했다.
지질 나노입자(LNP)는 마이크로유체 장치에서 에탄올 상과 시트르산 상을 1:3 용적 비율로 펌프33DS 시린지 펌프(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 사용하여 혼돈 혼합을 통해 교대로 합성했다. 에탄올 상은 C14-4 이온화 가능한 지질, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG)(Avanti Polar Lipids), 콜레스테롤(Avanti Polar Lipids) 및 X-하이드록시콜레스테롤을 함유했다. 시트르산 상에는 10mM 시트르산 및 루시퍼라제 mRNA를 1mg/mL로 함유했다. 합성 후, 입자를 1× PBS에서 2시간 동안 투석하고, 0.22μm 필터를 통해 멸균 여과했다.
라이브러리 설계
특정 실시양태에서, 라이브러리 스크리닝에는 6개의 하이드록시콜레스테롤(즉, 콜레스테롤의 다양한 위치에 부가된 하이드록실 그룹을 갖는 콜레스테롤)의 평가가 포함되었다: 7α-하이드록시콜레스테롤(Abcam, Cambridge, MA), 7β-하이드록시콜레스테롤(Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 19-하이드록시콜레스테롤(Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), 20(S)-하이드록시콜레스테롤(Abcam, Cambridge, MA), 24(S)-하이드록시콜레스테롤(Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), 25-하이드록시콜레스테롤(Abcam, Cambridge, MA). 라이브러리의 기본 제형 부형제 몰 비율은 C14-494 35%, DOPE 16%, 콜레스테롤 46.5%, 및 PEG 2.5%이다. 6개의 하이드록시콜레스테롤 후보는 다양한 몰 치환율(12.5%, 25%, 50%, 100%)로 콜레스테롤을 하이드록시콜레스테롤로 대체하여 이러한 제형에 도입되었다. 이러한 후보 제형에 대한 부형제의 몰 비율은 C14-494 35%, DOPE 16%, 합계 콜레스테롤 46.5% 및 PEG 2.5%로 유지되었고, 여기서 합계 콜레스테롤은 콜레스테롤 및 하이드록시콜레스테롤-대체물을 구성했다.
LNP 특성화
특정 실시양태에서, LNP 샘플 mRNA 농도는 Infinite M Plex 플레이트 판독기(Tecan, Morissville, NC)에서 A260 흡광도를 사용하여 측정했다. Z-평균 직경(입자 크기) 및 다분산 지수(PDI)는 제타사이저 나노(Zetasizer Nano)(Malvern Instruments, Malvern, UK)에서 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 측정했다. pKa는 6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌설폰산(TNS) 검정에 의해 계산했다. 150mM 염화나트륨, 20mM 인산나트륨, 25mM 암모늄 시트레이트, 20mM 암모늄 아세테이트의 완충 용액을 2로부터 12까지 0.5 증분하여 pH 값에 도달하도록 조정했다. LNP를 96-웰 플레이트의 각 pH 조정 용액에 첨가하고, 이어서 각 웰에 TNS를 첨가하여 최종 TNS 농도가 6μM가 되도록 했다. 수득된 형광은 Infinite M Plex 플레이트 판독기에서 판독했다. 수득된 데이터는 시그모이드 회귀를 사용하여 적합시켰고, 형광 강도가 최대 값의 50%에 도달하는 pH로서 pKa를 계산했다. 캡슐화 효율은 제조업체 지침에 따라 Quant-iTTM RiboGreenTM RNA 검정 키트(Thermo Fisher Scientific)에 의해 측정했다.
세포 배양
인간 간암 세포주 HepG2 세포 및 뮤린 마크로파지 세포주 RAW264.7 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, VA)로부터 수득되었다. 이들은 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 항생제(페니실린 100단위/ml 및 스트렙토마이신 100μg/ml)를 보충한 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 5% CO2로 가습 분위기에서 37℃에서 배양했다.
불멸화 T 세포인 Jurkats(ATCC 번호 TIB-152)를 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 보충한 L-글루타민(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)과 함께 RPMI-1640에서 배양했다. 일차 인간 T 세포(CD3+)는 건강한 지원 기증자로부터 수집하고, 펜 메디슨의 인간 면역학 코어로부터 조달했다. 이후, 일차 인간 T 세포를 RPMI-1640 배지에서 L-글루타민, 10% FBS, 1% P/S와 함께 CD4+와 CD8+ T 세포의 1:1 비율로 조합했다. 이어서, 1차 인간 T 세포를 인간 T 활성화제 CD3/CD28 다이나비드(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 1:1 비드 대 세포 비율로 활성화했다. 모든 스크리닝을 위해, 세포를 96-웰 플레이트에 60μL의 배지에 웰당 60,000개의 세포로 플레이팅했다. 이어서, LNP를 목적하는 mRNA 용량 농도(예: 60,000세포당 60ng)로 웰에 첨가했다. 세포를 24시간 동안 인큐베이팅한 후 기능 판독 검정을 수행했다.
시험관내 형질감염 및 세포독성
HepG2 세포를 96 웰 플레이트에 1×104 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 24시간 동안 성장시켰다. 상이한 콜레스테롤:덱사메타손(C:D) 비율(10:0, 9:1, 7:3, 5:5, 3:7, 0:10)의 LNP를 사용하여 50ng mRNA/웰의 용량으로 24시간 동안 세포를 처리했다. 그 후, 루시퍼라제 발현 및 세포 생존율은 각각 루시퍼라제 검정 키트(E4550, Promega) 및 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 검정 키트(G7572, Promega)를 사용하여 시험했다.
RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트에 2×105 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 24시간 동안 성장시켰다. LNP를 사용하여 세포를 500ng mRNA/웰의 용량으로 24시간 동안 처리했다. TNF-α 분석을 위해 상청액을 수집했다.
동물 실험
9마리의 8 내지 12주령의 C57BL/6 암컷 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, ~20g)를 랜덤으로 3개 그룹(n=3)으로 나누고, PBS, 원래 MC3 LNP(C10D0) 또는 Dex-도입 LNP(C9D1)를 정맥 주사했다. LNP 처리 그룹의 각 마우스에 4μg의 루시퍼라제 mRNA를 주사했다. 20시간 후, 혈액은 후안와 출혈을 통해 각 마우스로부터 채취하고, TNF-α 분석을 위해 혈청을 제조했다. 생체발광 이미징은 주사 20시간 후에 IVIS Spectrum Imaging 시스템(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)으로 수행했다. 150mg/kg 용량으로 D-루시페린(PerkinElmer, Waltham, MA)을 복강내 주사(IP)에 의해 마우스에 주사하고, 이어서 마취 및 이미징을 실시했다. 합계 광자 플럭스의 양을 측정했다.
사이토카인 수준 측정
RAW264.7 배양물 및 마우스 혈청 중의 TNF-α 농도는 시판의 ELISA 검정 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정했다.
통계 분석
결과는 대응하지 않는 스튜던트 t-검정에 의해 분석했고, Prism 5 소프트웨어 패키지(Graphpad, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 평균값 +/- SD 또는 배율 증가에 의해 표시했다. 통계적 유의성은 0.05 이하의 p-값으로 표시했다.
루시퍼라제 및 독성 검정
루시퍼라제 발현 판독을 위해, 96-웰 플레이트를 300×g에서 7분간 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 세포를 50μL 1× 용해 완충액(Promega, Madison, WI) 및 100μL 루시퍼라제 검정 기질(Promega)에 재현탁시켰다. 10분간 인큐베이팅 후, 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰에서 발광 신호를 판독했다. 발광은 각 플레이트 내에서 S2로 정규화했다. 독성 검정을 위해, 60μL의 CellTiter-GloTM(Promega)를 각 웰에 첨가했다. 10분간 인큐베이팅한 후, 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰에서 발광 신호를 판독했다. 발광은 각 플레이트 내에서 무처리 세포에 대해 정규화했다.
산성 소기관과 지질 나노입자의 공-국재화(co-localization)
LNP를 1×PBS에서 10ng 루시퍼라제 mRNA/μL로 희석했다. VybrantTM DiO 세포 표지 솔루션(Thermo Fisher Scientific)을 1:75의 용적 비율로 LNP 용액에 첨가했다. 주르캇 세포를 60μL 배지에서 60ng 루시퍼라제 mRNA/60,000 세포로 3시간 동안 처리했다. 세포를 수집하고, 300×g에서 5분간 원심분리하고, LysoTrackerTM Deep Red(Thermo Fisher Scientific)(1:3000)를 함유하는 RPMI 배지에 재현탁시키고, 추가로 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세포를 수집하고, 300×g에서 5분간 원심분리한 후, 1×PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 세포 함유 PBS 용액을 챔버형 현미경 슬라이드, 탈착식 웰을 갖는 NuncTM Lab-TekTM II 4-웰 챔버 슬라이드(Thermo Fisher Scientific)에 15분 동안 침전시켰다. PBS를 흡인 제거하고, 슬라이드를 4% 포름알데히드에 10분간 인큐베이팅하여 세포를 고정시켰다. 이어서, 슬라이드를 1×PBS로 각각 5분 동안 온화하게 흔들면서 2회 세척했다. 마지막으로, 챔버 벽을 제거하고, 슬라이드 위에 커버 슬립을 배치하여 공초점 현미경 이미징을 위해 샘플을 준비했다. 이미지는 Zeiss LSM 710 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 촬영했다.
엔도솜 수송 검정(Endosomal Trafficking Assay)
주르캇을 150ng 루시퍼라제 mRNA/60,000 세포 중 60개에서 4시간 동안 처리했다. 각 처리 그룹에는 적어도 750,000개 세포가 사용되었다. 세포를 수집하고, 300×g에서 5분간 원심분리하고, 1×PBS에 재현탁했다. 이어서, 세포-함유 PBS 용액을 챔버형 현미경 슬라이드, 탈착식 웰을 갖는 NuncTM Lab-TekTM II 4-웰 챔버 슬라이드(Thermo Fisher Scientific)에 15분 동안 침전시켰다. PBS를 흡인 제거하고, 슬라이드를 4% 포름알데히드에 10분간 인큐베이팅하여 세포를 고정했다. 이후, 모든 세척 및 인큐베이션은 슬라이드를 온화하게 흔들면서 수행했다. 이어서, 슬라이드를 1×PBS로 5분간 세척하고, 1×PBS 중의 0.3% Tween-20와 함께 15분간 인큐베이팅했다. 이어서, 슬라이드를 1×PBS로 세척하고, 1×PBS 중의 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분 동안 인큐베이팅/차단했다. 차단 단계 후, 슬라이드를 Rab5A #46449, Rab7 #9367 또는 Rab11 #5589 XP® Rabbit mAb(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 1:100으로 1시간 동안 인큐베이팅했다. 1×PBS로 각각 5분간 2회 세척한 후, 세포를 덮고, 1:1000에서 항-래빗 IgG(H+L), F(ab')2 단편(Alexa Fluor 647® 접합체) #4144(Cell Signaling Technology)와 함께 1시간 동안 인큐베이팅했다. 2회의 추가 1×PBS 세척 후, 슬라이드는 커버 슬립 및 ProLongTM Gold Antifade 봉입제(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조했다. 이미지는 Zeiss LSM 710 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 촬영했다.
이미징 소프트웨어(Imaging Software)
공국재화 계산을 위해, 채널을 서로 오버레이하고, Fiji의 빌트-인 공국재화 패키지인 coloc2와 오버레이했다. 스피어만의 순위 상관관계는 합계 5개의 이미지 뷰(합계 적어도 75의 세포)에 대해 기록했다.
엔도솜 수송 검정에서 Rab5, Rab7, 및 Rab11 발현의 합계 정량화를 위해, Fiji를 사용하여 세포 주변에서 관심 있는 영역을 선택했다. 이어서, 각 세포의 통합 밀도를 기록했다(각 처리 그룹에서 합계 적어도 50개 세포). 이어서, 세포당 Rab 발현을 평균하여 보고했다.
실시예 1: mRNA 전달을 위한 예시적 항-염증성 지질 나노입자의 합리적 설계
코르티코스테로이드는 항염증 효과를 갖고, 이전 연구에 따르면, 유전자 및 광역 항염증 스테로이드의 공-전달이 염증유발성 유전자의 전사를 억제하여 염증을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 덱사메타손(Dex)은 일반적으로 사용되는 항염증 코르티코스테로이드이다. 지질화된 Dex는 염증유발성 사이토카인을 감소시키고, LNP-유발된 면역 활성화를 억제하며, LNP의 인용성을 개선하고, 도입유전자의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근, RNA 치료제 및 항염증 스테로이드(예: 로플레포니드 및 부데소니드)를 동시 전달하는 DLin-MC3-DMA(MC3) LNP가 염증 반응을 억제하고 단백질 발현을 원래 제형과 비교하여 1.2 내지 1.9배 증가시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, Dex는 LNP 구조의 안정화에 관여하는 LNP 성분 중 하나인 콜레스테롤과 구조적 유사성을 공유한다(도 1A).
본원에 기재된 실험은 Dex 및 mRNA를 동시 전달하는 항염증 LNP 제형의 개발을 입증한다. 이전 연구에 따르면, MC3는 서서히 분해되고 면역 반응을 유발하기 쉽다는 것이 밝혀졌기 때문에, siRNA 전달을 위해 FDA에 의해 승인된 MC3 제형을 이 연구에서 추가로 최적화하기 위해 검토했다[참조: Davies et al., 2021, Mol Ther Nucleic Acids, 24:369-384; Hou et al., 2021, Nat Rev Mater, 1-17; Hassett et al., 2019, Mol Ther Nucleic Acids, 15:1-11; Sabnis et al., 2018, Mol Ther, 26:1509-1519]. Dex를 LNP 구조에 직접 도입함으로써, LNP가 염증 반응을 유발할 수 있는 동일한 세포로 약물을 전달할 수 있고, 따라서 LNP에 의해 유발된 국소 염증을 억제할 수 있을 것으로 기대된다(도 1B). 번역 관점에서, 원래 형태의 Dex를 LNP에 포함시키는 것은 LNP에 접합된 Dex 프로드러그보다 규제 장애물 및 스케일업 문제가 적어 신규 LNP 제형의 광범위한 적용 가능성을 유도할 수 있다. 본원에 제시된 데이터는 Dex-도입된 LNP가 시험관내 및 생체내에서 염증유발성 사이토카인의 생성을 효과적으로 감소시키고 간 mRNA 발현을 1.5배 증가시켰음을 입증한다.
실시예 2: 예시적 항염증 LNP의 특성화
LNP는 mRNA를 포함하는 수성 상과, MC3, 1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPC), PEG-접합 지질(C14PEG-2000), 콜레스테롤 및 덱사메타손을 포함하는 유기 상을 마이크로유체 장치에서 혼합함으로써 제형화했다(도 2). 이 마이크로유체 장치는 균일한 크기의 LNP의 형성을 가능하게 하도록 설계되었다. mRNA에 의한 면역 활성화를 회피하기 위해, 정제된 1-메틸슈도우리딘-함유 mRNA를 본원에 기재된 실험 전체에 사용했다.
Dex의 부재하에 MC3 LNP(C10D0) 및 Dex 도입된 LNP(C9D1)를 제조했다. 명명 규칙은 상대 콜레스테롤:덱사메타손(C:D) 비율을 따른다. 즉, "C10D0"으로 기재된 제형은 상대적 C:D 몰 비율이 10:0이고, C10D0 LNP의 C:D 몰 퍼센트가 38.5%:0%임을 나타낸다. C9D1 LNP의 C:D 몰 비율은 9:1이고, C:D 몰 퍼센트는 34.65%:3.8%이다(표 1). 양쪽 LNP 모두는 >90%의 캡슐화 효율을 나타냈고, ±10mV31의 중성 범위 내에 있었다. 더욱이, 유체역학적 크기 및 다분산성은 양쪽 LNP 모두에서 유사했다(도 3A-3B). 이러한 결과는 10% 콜레스테롤을 Dex로 대체해도 LNP의 크기와 다분산성에 미치는 영향이 최소이고, 후속 연구를 위해 높은 mRNA 캡슐화 효율을 갖는 Dex-도입 LNP가 개발되었음을 시사한다.
[표 1]
예시적 항염증 LNP의 특성화
C:D 비율은 콜레스테롤 및 덱사메타손의 중량비를 나타내고, ±는 SD를 나타낸다.
실시예 3: C9D1 LNP의 시험관내 형질감염, 세포독성 및 항염증 잠재력
루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP를 Dex의 존재 또는 부재하에 HepG2 세포의 처리에 사용하여 형질감염 효율 및 세포독성을 평가했다. C9D1 LNP는 C10D0 LNP와 비교하여 형질감염 효율의 감소를 나타내지 않았다(도 4A). 더욱이, C9D1 LNP는 세포독성의 증가를 나타내지 않았다(도 4B). 이어서, LNP에 추가 Dex를 도입할 수 있는 가능성을 검토했다(표 2). LNP는 여전히 제형화할 수 있었지만, Dex의 비율이 증가함에 따라 형질감염 효율이 현저히 저하되었다(도 5A-5B). 이러한 결과는 콜레스테롤의 일부를 Dex로 대체하는 것이 높은 LNP 형질감염 효율을 유지하는 데 중요하다는 것을 시사한다.
[표 2]
예시적 항염증 LNP의 특성화
C:D 비율은 콜레스테롤 및 덱사메타손의 중량비를 나타내고, ±는 SD를 나타낸다.
Dex의 도입이 LNP에 의해 유발된 면역 반응을 억제할 수 있는지를 검증하기 위해, 뮤린 마크로파지(RAW246.7)에 대한 C9D1 LNP의 항염증 효과를 평가했다(도 4C). 세포를 24시간 동안 LNP로 자극한 후, 상청액 중의 TNF-α의 농도를 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA)에 의해 측정했다. C10D0 LNP 처리는 RAW246.7 세포에서 TNF-α의 생성을 약 2.6배 유의적으로 자극한 반면, C9D1 LNP 처리는 TNF-α 수준을 1.2배로 약간만 증가시켰다. 이러한 결과는 C9D1 LNP가 본 개시의 LNP에 의해 유발된 시험관내 면역 반응을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 생체내 C9D1 LNP mRNA 전달, 형질감염 및 항염증 효과
C57BL/6 마우스를 사용하여 본 개시의 LNP의 염증 반응 및 mRNA 전달을 조사했다. 루시퍼라제를 코딩하는 4μg의 mRNA를 포함하는 LNP를 각 마우스에 정맥내(i.v.) 주사했다. C9D1 LNP 처리 그룹의 경우, Dex의 용량은 마우스당 0.62μg였다. 무처리, C10D0 LNP, C및 9D1 LNP 그룹의 혈청을 채취하여 ELISA에 의한 TNF-α 정량화를 수행했다. 그 결과는, C10D0 LNP-처리 마우스가 무처리 대조군과 비교하여 유의하게 높은 TNF-α 수치를 나타냈기 때문에, 유일한 콜레스테롤 화합물로서 비변형된 콜레스테롤을 포함하는 LNP(즉, 변형된 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 유사체를 함유하지 않음)가 염증 반응을 유도하는 것을 나타낸다. 대조적으로, C9D1 LNP 처리된 마우스의 혈청 TNF-α 농도는 C10D0 LNP-처리 마우스와 비교하여 유의적으로 감소했다(도 6A). 이러한 결과는 C9D1 LNP가 생체내에서 LNP에 의해 유발된 염증 반응을 성공적으로 감소시킬 수 있음을 시사한다.
이전 연구에서는 더 높은 용량의 유리 Dex 또는 Dex 프로드러그를 사용하여 LNP에 의해 유도된 염증 반응을 억제했다. 그러나, 본원에 기재된 실험에서, 이론에 얽매이지 않고서, LNP가 염증 반응을 유발하는 동일한 세포에 대해 C9D1 LNP 내의 저용량의 원래 Dex의 전달을 사용하여 염증의 성공적 억제를 설명할 수 있다. 즉, 국소 면역 반응을 억제하는 항염증 LNP는 고용량의 유리 코르티코스테로이드로 전신 면역 반응을 억제하는 것과 비교하여 우수한 선택일 수 있다.
이어서, 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA를 캡슐화한 C9D1 LNP의 생체내 형질감염을 조사했다. MC3 LNP는 간 형질감염을 위해 임상적으로 검증된 비-바이러스 벡터이다. 간에서 강력한 루시퍼라제 발현은 C9D1 LNP-처리 마우스 및 C10D0 LNP-처리 마우스 모두에서 관찰되었다(도 6B). 흥미롭게도, 발광 신호의 정량화는 C9D1 LNP-처리 마우스에서 C10D0 LNP-처리 마우스와 비교하여 1.5배 증가한 것으로 나타났다. 이 결과는 LNP에 의해 유발된 면역 반응의 억제가 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 이전 보고와 일치한다. 도입유전자 발현은 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 존재하에 억제될 수 있기 때문에, C9D1 LNP는 염증성 사이토카인의 생성을 억제함으로써 mRNA 형질감염을 증강시킬 수 있다. 종합하면, 이 결과는 C9D1 LNP가 염증을 감소시키고 동시에 mRNA/LNP 치료제의 단백질 발현을 증강시킬 수 있는 유망한 제형인 것을 나타낸다.
Dex-도입된 LNP(C9D1)가 성공적으로 제조되어 강력한 항염증 효과를 입증했다. C9D1 LNP는 시험관내에서 염증유발성 사이토카인 TNF-α를 기저 수준에 근접하게 억제하고, 생체내에서 천연 C10D0 LNP와 비교하여 TNF-α 수준을 유의적으로 하향-조절하는 것으로 밝혀졌다. 염증 반응의 감소로 인해, C9D1 LNP-처리 마우스에서 전체적 mRNA 형질감염이 1.5배 개선되었다. 따라서, Dex를 포함하는 LNP는 염증-관련 부작용을 감소시키면서 mRNA 치료제의 단백질 발현을 증강시킬 수 있는 유망한 전략을 나타낸다.
실시예 5: T 세포에 대한 mRNA 전달을 위한 이온화 가능한 지질 나노입자에서 하이드록시콜레스테롤 치환
본 개시는 부분적으로 콜레스테롤 유사체(즉, 하이드록시콜레스테롤)의 클래스를 포함하는 LNP에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 개시는 T 세포에 대한 LNP-매개 mRNA 전달에 대한 콜레스테롤 유사체의 평가 및/또는 영향을 기재한다. 하이드록시콜레스테롤은 NPC1 및 다양한 콜레스테롤 유사체에 대해 수행된 이전의 효소-리간드 결합 연구를 고려하여 관심 있는 부형제로서 선택되었다. 콜레스테롤 분자를 따라 다양한 위치(예: 폴리사이클릭 코어 및/또는 폴리사이클릭 코어의 5원 환의 알킬 쇄 치환기)에 하이드록실의 부가는 변형된 콜레스테롤 및 NPC1 사이의 결합 동태를 변화시킬 수 있다. 이러한 변화의 목표는 최종적으로 LNP의 엔도솜 수송 중에 콜레스테롤에 대한 NPC1의 인식을 감소시키는 것이다. 그러나, 막 단백질에 의한 콜레스테롤 인식은 여전히 LNP 흡수를 위한 중요한 단계이다. 따라서, 본 개시는 이러한 치환이 T 세포에 대한 mRNA의 전달을 개선하는지 여부를 결정하기 위해 4개의 상이한 치환 퍼센트로 6개의 하이드록시콜레스테롤 후보의 치환을 평가하는 것을 기재한다.
실시예 6: 치환 콜레스테롤을 포함하는 예시적 LNP의 라이브러리 설계
본 개시는, 부분적으로, 본 개시의 예시적 LNP를 이용한 T 세포에 대한 mRNA 전달의 설계, 합성 및 평가에 대해 기재한다. 라이브러리의 기본 제형(즉, S2)은 하기와 같은 부형제 및 몰 비율 퍼센트로 사전에 최적화된 제형이었다: 35% C14-4 이온화 가능 지질, 46.5% 콜레스테롤, 16% DOPE, 및 2.5% 지질-고정 PEG. 특히, 콜레스테롤은 LNP 제형에서 상당한 몰 퍼센트를 차지한다.
LNP는 엔도솜 재순환을 통해 표적 세포로부터 세포외 유출될 수 있다. 이러한 경로, 특히 니만 픽(Niemann Pick) 타입 C1(NPC1) 매개 재순환은 핵산 카고의 기능적 전달의 감소에 대한 핵심 원인으로 확인되었다. NPC1과 같은 엔도솜 수송 효소는 지질, 특히 콜레스테롤을 인식하고, 이러한 지질 성분을 세포 막으로 재순환한다. 효소-리간드 결합 연구에 따르면, 콜레스테롤 분자에 대한 하이드록실 그룹의 부가는 NPC1과 변형된 콜레스테롤 사이의 결합 동태를 변화시키는 것이 입증되었다. 엔도솜의 상이한 단계를 통한 LNP의 처리를 특성화하기 위해 엔도솜 수송을 조사했다. 세포를 통한 엔도솜의 수송은 Ras-연관 결합(Rab) 단백질 계열에 의해 추적할 수 있다. 구체적으로, Rab5, Rab7, 및 Rab11은 각각 초기, 후기, 및 재순환 엔도솜과 연관되어 있다(도 7B). 일반적으로, LNP가 후기 엔도솜 동안 세포질로 mRNA 카고를 방출한다는 것을 고려하면, 이후 재순환되지 않고서 후기 엔도솜에 도달할 수 있는 LNP가 기능 전달에 최대의 경향을 갖는다는 것이 명백하다.
본원에 기재된 LNP 라이브러리 설계는 다양한 치환율로 S2 제형으로 콜레스테롤 유사체(즉, 하이드록시콜레스테롤) 클래스의 치환을 수반했다(도 7C). S2로 하이드록시콜레스테롤 치환의 동기는 콜레스테롤 분자의 이러한 변형이 NPC1과 콜레스테롤 분자 사이의 결합을 파괴하고, 이에 의해 세포 외부로의 LNP 재순환을 감소시킬 수 있다.
6개의 하이드록시콜레스테롤 유사체(즉, 7α-하이드록시콜레스테롤, 7β-하이드록시콜레스테롤, 19-하이드록시콜레스테롤, 20(S)-하이드록시콜레스테롤, 24(S)-하이드록시콜레스테롤, 25-하이드록시콜레스테롤)를 평가했다. 이러한 콜레스테롤 대체물은 효소-리간드 결합 연구, 하이드록실 그룹 부가 위치, 및 상업적 이용 가능성 등을 기준으로 선택되었다. 이러한 콜레스테롤 유사체 대부분은 체내에서 천연적으로 발견되고, 활성 산소 종 및/또는 효소에 의한 콜레스테롤의 처리로부터 발생한다. 예를 들면, 7α-하이드록시콜레스테롤은 담즙산 전구체이고, 20(S)-하이드록시콜레스테롤은 스무딩(Smoothened) 온코프로틴 신호전달 경로에 관여한다.
각 하이드록시콜레스테롤 대체물은 각각 A1, A2, A3, B1, B2 및 B3로 약칭한다. "A" 대체물(즉, A1, A2 및 A3)은 콜레스테롤 분자의 환 구조(즉, 폴리사이클릭 코어) 또는 본체에 하이드록실 그룹 부가를 갖는 유사체를 지칭한다. "B" 대체물(즉, B1, B2 및 B3)은 콜레스테롤 분자의 소수성 극 또는 테일에 하이드록실 그룹 부가를 갖는 유사체를 지칭한다(도 8A). 각 대체물은 12.5%, 25%, 50% 또는 100%의 치환율로 S2 제형에 도입되었다. 이 설계 방식은 하이드록시콜레스테롤-대체물 및 치환율로 명명된 합계 24개 LNP를 생성했다. 예를 들면, A2-50 제형은 A2를 S2 제형에 50% 치환한 것이다.
LNP 제형에 신규 부형제를 도입할 때에 중요한 고려사항은 이러한 첨가가 시간 경과에 따라 입자 안정성에 미치는 영향이다. 이는 지질 성분 사이의 화학적 상호작용이 에너지적으로 안정적인 막의 형성을 가능하게 하기 때문이다. 특히, 지질 막 중에 콜레스테롤의 존재는 질서 효과를 생성함으로써 막 안정성 및 지질 이중층의 고유 곡률에 영향을 미친다. 콜레스테롤 분자의 헤드에서 하이드록실 그룹은 친수성 극으로 작용하고 콜레스테롤을 양친매성(amphipathic)으로 되게 한다. 이를 통해, 콜레스테롤은 지질 막의 법선을 따라 자체 배향하고 인접한 지질을 정렬시킬 수 있다. 추가로, 콜레스테롤 분자의 통합은 콜레스테롤과 지질 사이의 비극성 상호작용으로 인해 에너지적으로 유리하다.
콜레스테롤 분자에 대한 추가 하이드록실 그룹의 도입은 NPC1 결합을 방해하는 것을 목적으로 하지만, 이러한 변형은 콜레스테롤이 다른 LNP 부형제와 갖는 비극성 및 정전기적 상호작용을 변화시킨다. 특히, 비변형된 콜레스테롤이 막 형성 및 안정성에 미치는 질서 효과를 고려하면, 콜레스테롤 분자의 본체 또는 테일에 이러한 친수성 그룹을 부가는 막 불안정성을 초래할 수 있다. 추가로, 하이드록실 그룹의 부가는 콜레스테롤과 인접 지질의 배열을 입체적으로 방해할 수도 있다. 따라서, 하이드록시콜레스테롤을 LNP 제형에 도입하면, 입자의 안정성이 저하될 수 있다.
실시예 7: 표준 LNP 제형으로 하이드록시콜레스테롤 후보 물질의 100% 치환의 안정성
28일에 걸쳐 평가된 특성화 파라미터는 z-평균 직경, PDI, mRNA 농도 및 캡슐화 효율을 포함한다(표 3). 경향은 LNP 제형 중의 콜레스테롤을 특정 X-하이드록시콜레스테롤로 100% 치환해도 안정성에 부정적 영향을 미치지 않는 것으로 나타난다. 입자 직경 및 PDI와 관련하여, 대부분의 100% 치환 LNP는 28일에 걸쳐 60 내지 100nm 사이의 크기와 0.25 미만의 PDI를 유지했다. 시간 경과에 따른 mRNA 농도 및 캡슐화 효율의 시간적 경향도 모든 LNP 후보 및 S2 사이에 유사했다(도 8B).
[표 3]
선택된 예시적 콜레스테롤-치환된 LNP에 대한 LNP 라이브러리 특성화 데이터
그러나, 주목할 것으로, B2-100 및 B3-100은 일부 불안정한 특성을 나타냈다. B2-100 및 B3-100은 모두 평균 직경이 100nm를 초과했고 샘플 mRNA 농도가 낮은 경향을 나타냈다. 추가로, B3-100은 28일간에 걸쳐 PDI에 현저한 변동이 있었다. B2-100 및 B3-100은 콜레스테롤에 대해 각각 24(S)-하이드록시콜레스테롤 및 25-하이드록시콜레스테롤의 100% 치환을 나타내고, 이는 콜레스테롤 분자의 테일 변형이다. 콜레스테롤 분자의 테일 말단에 하이드록실 그룹(즉, 콜레스테롤의 폴리사이클릭 코어의 5원 환의 알킬 치환기)의 부가는 이의 양친매성 특성을 변화시키고, 지질 막 내에서의 정렬을 방해하여 이러한 관찰된 불안정성을 초래할 수 있는 것으로 제안되어 왔다. 대조적으로, 나머지 4개의 하이드록시콜레스테롤 후보(즉, A1, A2, A3 및 B1)은 모든 일자의 모든 파라미터에서 S2와 동등했다.
100% 치환 제형이 시간 경과에 따라 안정성이 변화한다는 것을 고려하여, 콜레스테롤에 대한 각 X-하이드록시콜레스테롤 후보의 12.5%, 25% 및 50% 치환을 갖는 제형은 적어도 pKa, 제타 전위, z-평균 직경 및 PDI에 대해 특성화했다(도 8C). LNP pKa는 입자가 세포질로 카고를 방출하는 세포내 pH를 나타내는 데이터를 제공한다. 경향은 체내-변형 하이드록시콜레스테롤의 치환을 포함하는 LNP의 경우, 치환율의 증가가 pKa 증가와 연관되어 있고, 이는 이러한 치환이 엔도솜 회피에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 제타 전위 측정값은 특정 방향의 경향을 나타내지 않았다. A1, A2, A3(즉, 신체 변형), B1은 직경 및 PDI가 예상 범위 내에 유지되는 반면, B2 및 B3은 입자 직경이 증가했고 다분산성이 더 높았다. 이는 콜레스테롤 분자의 24 또는 25 말단에서 테일 변형이 콜레스테롤의 주문 효과를 감소시킴으로써 정상적 합성 및 LNP 형성을 방해한다는 이전의 발견을 추가로 뒷받침한다.
실시예 8: 본 개시의 예시적 LNP의 시험관내 스크리닝
입자 안정성은 LNP 설계 및 평가에서 중요한 고려사항이지만, 기능 전달도 중요한 지표이다. 콜레스테롤은 막 융합에 매우 중요하고, 따라서 LNP 제형으로부터 콜레스테롤을 완전히 제거하는 것은 엔도솜 흡수의 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 4개 치환 퍼센트에서 6개 하이드록시콜레스테롤-대체물을 포함하는 24개의 LNP 라이브러리를 불멸화 T 세포인 주르캇(Jurkats)에서 루시퍼라제 발현 및 세포 생존율을 1차 판독값으로 사용하여 평가했다.
이 스크리닝에 의해, 각 하이드록시콜레스테롤-대체물 범주 내에서, S2와 비교한 상대적 루시퍼라제 발현이 낮은 및 높은 치환율(즉, 12.5% 및 100%)을 갖는 중간 성능의 LNP 및 중간 치환율(즉, 25% 및 50%)을 갖는 고성능 LNP로 단봉형의 경향이 있는 것으로 나타났다(도 9A-9B). 추가로, 이 스크리닝에 의해, A1-25, A1-50, 및 B1-50은 각각 214%, 186%, 172%로 S2와 비교하여 주르캇에 대한 mRNA 전달에서 통계적으로 유의한 개선을 생성한 것으로 나타났다. 추가로, 라이브러리 중의 어떤 LNP 제형도 세포 생존율에 유의한 변화를 생성하지 않았고, 이는 하이드록시콜레스테롤-대체물을 LNP에 도입해도 세포 사멸의 증가를 유도하지 않음을 시사한다. 최종적으로, A1-25, A1-50 및 B1-50은 시험관내에서 입자 독성에 큰 변화 없이 mRNA 카고의 전달의 증가를 입증했다.
실시예 9: 일차 인간 T 세포에서 하이드록시콜레스테롤 후보를 포함하는 LNP의 생체외 스크리닝
이러한 변형 지질 나노입자의 생체외 적용에 대한 번역 가능성을 추가로 조사하기 위해, 일차 인간 T 세포에서 A1, A2 및 B1 대체물을 포함하는 LNP를 사용하여 12개 LN의 2차 스크린을 실시했다. A1과 B1이 선택되었고, 이는 A1-25, A1-50 및 B1-50이 시험관내 평가에서 S2보다 우수한 성능을 나타냈기 때문이다. A2 후보 중 어느 것도 시험관내에서 mRNA 전달을 현저히 개선하지 못했지만, A1과 A2의 입체 이성질체로서의 유사성 때문에 A2 함유 LNP도 이 생체외 평가에 포함되었다. mRNA를 일차 T 세포에 전달하기 위해, T 세포는 CD3/CD28 의존 경로로 활성화되어야 한다. 따라서, 이러한 확장 트리거는 세포의 막 항상성을 변화시킬 수 있다. 따라서, 이 생체외 검정에서 선택된 3개 하이드록시콜레스테롤-대체물(즉, A1, A2 및 B2)의 모든 치환율을 평가하여 생체내 적용을 위한 치환율을 다시 최적화했다.
환자마다 차이가 있음에도 불구하고, A1-25 및 A1-50은 S2와 비교하여 일차 T 세포에 대한 mRNA 전달을 각각 83% 및 99% 현저히 개선시키는 것으로 밝혀졌다(도 10A-10C). 흥미롭게도, A1-25는 시험관내에서 A1-50를 상회했지만, 생체외에서 A1-50은 A1-25를 상회했다. 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 이 결과는 활성화된 일차 T 세포 및 불멸화 T 세포에 의해 나타나는 세포내 활성의 고유한 차이에 기인한 것일 수 있다.
이러한 발견을 추가로 검증하기 위해, 일차 인간 T 세포에서 용량 반응 검정을 수행하고, A1-25 및 A1-50은 60,000 세포당 60 내지 400나노그램 범위의 mRNA 용량에서, 세포 생존율을 거의 또는 전혀 증가시키지 않으면서, T 세포로의 mRNA 전달을 지속적으로 개선하는 것으로 밝혀졌다. 이는 A1-25 및 A1-50이 CAR T 세포 요법과 같은 생체외 적용에서 표적 세포에 대한 독성을 증가시키지 않고서 mRNA 전달 효율을 증가시키기 위해 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 10: 주르캇에서 최고 LNP 제형과 엔도솜과의 공국재화
이러한 하이드록시콜레스테롤 치환이 엔도솜 흡수 및 유지에 미치는 영향을 더욱 양호하게 이해하기 위해, 공국재화 검정법을 활용하여 주르캇 세포에서 산성 소기관 내의 LNP의 축적을 평가했다. 라이소트래커(Lysotracker)는 대부분 엔도솜과 리소좀인 구형의 산성 소기관을 표시하기 위해 사용되었고, LNP는 친유성 염료인 DiO로 표지했다. A1-25는 이러한 산성 소기관과의 공국재화의 증가를 입증했고, 이는 A1-25 입자가 더 빠른 속도로 세포에 침입하거나 엔도솜에 더 장기간 잔류하는 것을 시사한다(도 11). LNP가 카고를 방출하고 mRNA 전사를 가능하게 하기 위해, LNP가 후기 엔도솜에 도달하여 잔류해야 한다는 사실이 이전에 관찰되었다. 따라서, 입자 흡수의 증가 또는 후기 엔도솜에 도달하여 잔류하는 LNP 빈도의 증가는 A1-25와 세포내 산성 소기관 사이의 이러한 연관성의 증가를 설명할 수 있다.
실시예 11: 주르캇에서 최고 LNP 제형의 엔도솜 수송
이후, 엔도솜 수송 거동에 대한 S2, A1-25 및 A1-50의 영향을 조사했다. 특히, 엔도솜의 다양한 단계와 연관된 3개 단백질을 평가했다: Rab5, Rab7, Rab11. Rab5는 초기 엔도솜과 결합하는 경향이 있고, 이는 LNP의 세포 흡수에 대한 통찰을 제공한다. Rab7은 후기 엔도솜과 연관되어 있고, 엔도솜 탈출 및 기능 전달의 직접적 전구 단계인 것으로 이전에 밝혀졌다. Rab11은 재순환 엔도솜과 연관되어 있고, 여기에는 세포내 유입된 LNP의 세포외 유출이 포함된다.
저용량 및 고용량 모두에서, 3개 LNP 제형 모두는 무처리 세포와 비교하여 Rab5 발현이 감소했다(도 12A-12B). 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 이 현상은 외인성 물질(즉, LNP)의 도입을 통해 후기 엔도솜으로 초기 엔도솜의 이행에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 고용량에서, A1-25 및 A1-50 모두에서 Rab5 발현은 현저히 증가하고, 무처리 세포에서 관찰되는 수준으로 향하는 경향이 있다. A1-25 및 A1-50 모두가 본원에 기재된 초기 스크리닝에서 주르캇에 대한 mRNA의 기능적 전달의 증가를 나타냈음을 고려하면, 이러한 초기 엔도솜 생성의 증가는 후기 엔도솜으로의 초기 엔도솜 진행의 감소보다는 LNP의 세포 흡수 증가의 결과라고 제안되어 왔다. 이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, LNP 제형에 하이드록시콜레스테롤 분자의 도입은 세포 흡수에 영향을 미치는 LNP의 형태학적 변화를 유발할 수 있다.
3개 제형 모두는 고용량에서 무처리 세포와 비교하여 Rab7 발현 프로파일의 증가를 나타냈다. 저용량에서, A1-25는 S2와 비교하여 Rab7 발현이 현저히 개선되었다. 이는 후기 엔도솜이 엔도솜 탈출과 가장 밀접한 연관이 있고 A1-25가 이전 스크리닝에서 S2와 비교하여 주르캇에서 mRNA 전달을 현저히 증강시킨다는 것을 고려할 때 예상되는 결과이다. 그러나, 고용량에서, 3개 제형 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
Rab11 연관 재순환 경로와 관련하여, A1-25 및 A1-50은 저용량에서 유의하게 낮은 Rab11 발현을 생성했다. 기능적 전달 결과와 함께, 이러한 발현 감소는 A1-25 및 A1-50이 세포 외부로 재순환되기보다는 후기 엔도솜에 잔류하여 탈출하는 경향이 있음을 시사한다. 고용량에서, A1-25는 이러한 경향을 유지하지만, A1-50은 더 이상 Rab11 발현을 현저히 감소시키지 않는다.
종합하면, 이러한 다양한 엔도솜 마커의 발현은 비변형된 콜레스테롤을 하이드록시콜레스테롤로 25% 및 50% 치환하는 것이 세포 흡수 개선, 후기 엔도솜 생성 증가, 엔도솜 재순환 감소 등의 조합을 통해 T 세포로의 mRNA의 기능 전달을 현저히 개선시키는 것을 시사한다.
실시예 12: 콜레스테롤 유사체(예 : 담즙산)를 포함하는 LNP의 시험관내 평가
본 개시는 또한 체노데옥시콜산(CDCA), 콜산(CA), 데옥시콜산(DCA), 리토콜산(LCA), 타우로콜산, 글리코콜산, 타우로체노데옥시콜산, 글리코체노데옥시콜산 (도 13)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 선택된 담즙산을 포함하는 LNP 제형의 시험관내 분석과 관련된 예시적 데이터를 제공하고, 여기서 LNP의 콜레스테롤 성분의 일부가 담즙산으로 치환된다. 담즙산-콜레스테롤-대체물을 포함하는 LNP 제형은 본원에 기재된 다른 LNP와 유사한 방식으로 제조되었다(표 4).
[표 4]
선택된 예시적 담즙산-치환 LNP 제형
a LNP 타이틀에 표시된 담즙산 동일성(예: CDCA-25는 담즙산 CDCA를 포함함).
루시퍼라제 mRNA가 캡슐화된 본원에 기재된 담즙산-치환 LNP는 Caco-2, HeLa, HepG2, 주르캇 및 Raji 세포주에서 루시퍼라제의 전달 및 발현에 대해 시험관내에서 평가되었다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 담즙산-치환 LNP는 상피 세포 및 HeLa 세포에서 우수한 결과를 입증했다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 LNP는 림프구에서 우수한 결과를 입증했다.
실시예 13: 콜레스테롤 유사체(예 : 담즙산)를 포함하는 LNP의 생체내 평가
본 개시는 선택된 담즙산을 포함하는 LNP 제형의 생체내 분석과 관련된 예시적 데이터를 추가로 제공하고, 여기서 선택된 LNP는 추가 평가를 위해 본원의 다른 곳에서 기재된 시험관내 평가에서 동정되었다(즉, LNP CA-100, DCA-50 및 LCA-75).
특정 실시양태에서, 마우스에게 본 개시의 LNP를 복강내 투여하고, 여기서 루시퍼라제 mRNA를 캡슐화하여, 표적 기관에서 mRNA의 전달 및/또는 발현을 평가했다(도 15A-15B 및 도 17A-17E). 특정 실시양태에서, Ca-100은 비장으로의 전달을 현저히 개선한다. 특정 실시양태에서, LCA-75는 소장으로의 전달을 현저히 개선한다. 특정 실시양태에서, 담즙산-콜레스테롤-대체물을 포함하는 LNP는 소장 및 폐로의 전달을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 마우스에게 본 개시의 LNP를 정맥내 투여하고, 여기서 루시퍼라제 mRNA를 캡슐화하여, 표적 기관에서 mRNA 전달 및/또는 발현을 평가했다(도 16A-16B).
특정 실시양태에서, CA-100, DCA-50 및 LCA-75는 간외 장기(예: 폐 및 소장)로의 전신 전달을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, CA-100은 복강내 및/또는 정맥내 투여시 비장 전달을 증가시킨다.
열거된 실시양태
하기의 예시적 실시양태가 제공되고, 이의 번호는 중요도 수준을 지정하는 것으로 해석되어서는 안 된다:
실시양태 1은 지질 나노입자(LNP)로서,
(a) 적어도 하나의 이온화 가능한 지질로서, 상기 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 50mol%를 구성하는, 이온화 가능한 지질;
(b) 적어도 하나의 헬퍼 지질로서, 상기 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 45mol%를 구성하는, 헬퍼 지질;
(c) 콜레스테롤 및 콜레스테롤 대체물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나로서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤 대체물의 조합은 LNP의 약 5mol% 내지 약 50mol%를 구성하는, 적어도 하나; 및
(d) 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질로서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%를 구성하는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질
을 포함하는, 지질 나노입자(LNP)를 제공한다.
실시양태 2는 실시양태 1에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물인, LNP를 제공한다:
[화학식 I]
상기 화학식 I에서,
A1 및 A2는 CH, N 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L1 및 L6은 CR19 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
L2 및 L5의 각 발생은 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L3 및 L4는 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17, R18 및 R19의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬), 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐), 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐), 임의로 치환된 C6-C10 아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C10 아릴), 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴), C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z'(R21)z"-에스테르, -Y(R20)z'(R21)z", -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나,
또는, R3a와 R3b, R4a와 R4b, R5a와 R5b, R6a와 R6b, R7a와 R7b, R8a와 R8b, R9a와 R9b, R10a와 R10b, R11a와 R11b, R12a와 R12b, R13a와 R13b, R14a와 R14b, 또는 R15a와 R15b로부터 선택된 2개의 저미날(geminal) 치환기는 이들이 결합되어 있는 C 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
Y의 각 발생은 C, N, O, S 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R20 및 R21의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
또는, R20 및 R21은 이들이 결합되어 있는 Y 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
z' 및 z"의 각 발생은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w 및 x의 각 발생은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
실시양태 3은 실시양태 2에 있어서, 상기 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다:
[화학식 II]
[화학식 III]
[화학식 IV]
[화학식 V]
[화학식 VI]
[화학식 VII]
상기 화학식 II 내지 VII에서,
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고;
b1, b2, b3, b4 및 b5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
c1 및 c2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
d1 및 d2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
실시양태 4는 실시양태 2에 있어서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다:
[화학식 VIII]
[화학식 IX]
[화학식 X]
[화학식 XI]
[화학식 XII]
[화학식 XIII]
[화학식 XIV]
[화학식 XV]
상기 화학식 VIII 내지 XV에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.
실시양태 5는 실시양태 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 1,1'-((2-(2-(4-(2-((2-(2-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)에톡시)에틸)(2-하이드록시테트라데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에톡시)에틸)아잔디일)비스(테트라데칸-2-올):
[화학식 C14-4]
을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 6은 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 덱사메타손인, LNP를 제공한다.
실시양태 7은 실시양태 6에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤 대체물이 9:1, 8:2, 7:3 및 5:5(콜레스테롤:덱사메타손)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중량 비율을 갖는, LNP를 제공한다.
실시양태 8은 실시양태 6 또는 7에 있어서, 상기 LNP가 MC3 및 C12-200으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 지질을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 9는 실시양태 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPC)인, LNP를 제공한다.
실시양태 10은 실시양태 6 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 11은 실시양태 6 내지 10 중 어느 하나에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 50:10:38.5:1.5인, LNP를 제공한다.
실시양태 12는 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 하이드록시 치환 콜레스테롤, 에폭시 치환 콜레스테롤 및 케토 치환 콜레스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다.
실시양태 13은 실시양태 1 내지 5 및 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 7-α-하이드록시콜레스테롤, 7-β-하이드록시콜레스테롤, 19-하이드록시콜레스테롤, 20-(S)-하이드록시콜레스테롤, 24-(S)-하이드록시콜레스테롤, 25-하이드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 5,6-에폭시콜레스테롤, 3β,5α,6β-트리하이드록시콜레스테롤, 4β-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤 및 22-(R)-하이드록시콜레스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다.
실시양태 14는 실시양태 1 내지 5, 12 및 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물이 약 50:50, 75:25, 87.5:12.5 및 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 백분율 비율을 갖는, LNP를 제공한다.
실시양태 15는 실시양태 1 내지 5 및 12 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)인, LNP를 제공한다.
실시양태 16은 실시양태 1 내지 5 및 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 17은 실시양태 1 내지 5 및 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 30:16:46.5:2.5인, LNP를 제공한다.
실시양태 18은 실시양태 17에 있어서, (c)가 콜레스테롤 및 7-α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 상기 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤이 50:50 및 75:25(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 비율을 갖는, LNP를 제공한다.
실시양태 19는 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 카복시-치환 콜레스테롤인, LNP를 제공한다.
실시양태 20은 실시양태 1 내지 5 및 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 담즙산인, LNP를 제공한다.
실시양태 21은 실시양태 1 내지 5, 19 및 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 대체물이 체노데옥시콜산(CDCA), 콜산(CA), 데옥시콜산(DCA), 리토콜산(LCA), 타우로콜산, 글리코콜산, 타우로체노데옥시콜산 및 글리코체노데옥시콜산으로 이루어진 그룹에서 선택되는, LNP를 제공한다.
실시양태 22는 실시양태 1 내지 5 및 19 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물이 25:100, 50:50, 75:25 및 100:0(콜레스테롤-대체물:콜레스테롤)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 비율을 갖는, LNP를 제공한다.
실시양태 23은 실시양태 1 내지 5 및 19 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 24는 실시양태 1 내지 5 및 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 25는 실시양태 1 내지 5 및 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 35:16:46.5:2.5인, LNP를 제공한다.
실시양태 26은 실시양태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 핵산 분자와 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 27은 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 mRNA, siRNA, 마이크로RNA, CRISPR-Cas9, 소분자, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제를 추가로 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 28은 실시양태 26에 있어서, 상기 LNP가 핵산 분자를 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 29는 실시양태 28에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 또는 RNA 분자인, LNP를 제공한다.
실시양태 30은 실시양태 28 또는 29에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 변형 RNA, 안타고미르, 안티센스 분자 및 표적 핵산 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다.
실시양태 31은 실시양태 28에 있어서, 상기 핵산 분자가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, LNP를 제공한다.
실시양태 32는 실시양태 31에 있어서, 상기 CAR가 병원성 세포 또는 종양 세포의 표면 항원에 대한 결합에 특이적인, LNP를 제공한다.
실시양태 33은 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 관심 있는 표적 세포에 대한 결합에 특이적인 표적 도메인을 추가로 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 34는 실시양태 33에 있어서, 상기 표적 세포가 말초 혈액 단핵 세포 및 면역 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP를 제공한다.
실시양태 35는 실시양태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 T 세포에 대한 결합에 특이적인 면역 세포 표적화 도메인을 포함하는, LNP를 제공한다.
실시양태 36은 실시양태 35에 있어서, 상기 표적 도메인이 CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 분자에 특이적으로 결합하는, LNP를 제공한다.
실시양태 37은 실시양태 1 내지 36 중 어느 하나의 LNP 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 38은 실시양태 37에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 보조제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 39는 실시양태 37 또는 38에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신인, 약제학적 조성물을 제공한다.
실시양태 40은 핵산 분자 및 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 이를 필요로 하는 대상체의 표적 세포에 전달하는 방법으로서,
상기 방법은 실시양태 1 내지 36 중 어느 하나의 적어도 하나의 LNP 및/또는 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
실시양태 41은 실시양태 40에 있어서, 상기 치료제가 mRNA, siRNA, 마이크로RNA, CRISPR-Cas9, 소분자, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법을 제공한다.
실시양태 42는 실시양태 40에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 및 RNA 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법을 제공한다.
실시양태 43은 실시양태 40에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 안타고미르, 안티센스 분자 및 표적 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법을 제공한다.
실시양태 44는 실시양태 40에 있어서, 상기 핵산 분자가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 방법을 제공한다.
실시양태 45는 실시양태 44에 있어서, 상기 CAR이 병원성 세포 또는 종양 세포의 표면 항원에 대한 결합에 특이적인, 방법을 제공한다.
실시양태 46은 실시양태 40 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 세포가 줄기 세포, 말초 혈액 단핵 세포 및 면역 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법을 제공한다.
실시양태 47은 실시양태 45 또는 46에 있어서, 상기 CAR이 T 세포에 대한 결합에 특이적인 세포 표적화 도메인을 포함하는, 방법을 제공한다.
실시양태 48은 실시양태 47에 있어서, 상기 세포 표적화 도메인이 CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 대한 결합에 특이적인, 방법을 제공한다.
실시양태 49는 실시양태 40 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP 또는 이의 약제학적 조성물이 보조제를 추가로 포함하는, 방법을 제공한다.
실시양태 50은 실시양태 40 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자 및/또는 치료제가 LNP 내에 적어도 부분적으로 캡슐화되는, 방법을 제공한다.
실시양태 51은 실시양태 40 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 암 또는 암과 연관된 질환 또는 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 치료, 예방 및/또는 개선하는, 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시 및 기재된 특징의 임의의 균등물 또는 이의 일부를 배제하려는 의도는 없으나, 본 출원의 실시양태의 범위 내에서 다양한 수정이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 본 출원은 특정 실시양태 및 임의의 특징을 기재하지만, 본원에 개시된 조성물, 방법 및 개념의 수정 및 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 이러한 수정 및 변형은 본 출원의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.

Claims (51)

  1. 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP)로서,
    (a) 적어도 하나의 이온화 가능한 지질로서, 상기 이온화 가능한 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 50mol%를 구성하는, 이온화 가능한 지질;
    (b) 적어도 하나의 헬퍼 지질(helper lipid)로서, 상기 헬퍼 지질은 LNP의 약 10mol% 내지 약 45mol%를 구성하는, 헬퍼 지질;
    (c) 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물(cholesterol-substitute)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나로서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물의 조합은 LNP의 약 5mol% 내지 약 50mol%를 구성하는, 적어도 하나; 및
    (d) 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질로서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질은 LNP의 약 0.5mol% 내지 약 12.5mol%를 구성하는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG-접합 지질(PEG-conjugated lipid)
    을 포함하는, 지질 나노입자(LNP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질이 화학식 I의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물인, LNP:
    [화학식 I]

    상기 화학식 I에서,
    A1 및 A2는 CH, N 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L1 및 L6은 CR19 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    L2 및 L5의 각 발생은 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L3 및 L4는 -CH2-, -CHR19-, -O-, -NH- 및 -NR19-로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17, R18 및 R19의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬), 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐), 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐), 임의로 치환된 C6-C10 아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C6-C10 아릴), 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, -Y(R20)z'(R21)z"-(임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴), C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z'(R21)z"-에스테르, -Y(R20)z'(R21)z", -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되거나,
    또는, R3a와 R3b, R4a와 R4b, R5a와 R5b, R6a와 R6b, R7a와 R7b, R8a와 R8b, R9a와 R9b, R10a와 R10b, R11a와 R11b, R12a와 R12b, R13a와 R13b, R14a와 R14b, 또는 R15a와 R15b로부터 선택된 2개의 저미날(geminal) 치환기는 이들이 결합되어 있는 C 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
    Y의 각 발생은 C, N, O, S 및 P로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R20 및 R21의 각 발생은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트, 에스테르, -NO2, -CN 및 설폭시로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    또는, R20 및 R21은 이들이 결합되어 있는 Y 원자와 조합하여 C=O를 형성할 수 있고;
    z' 및 z"의 각 발생은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w 및 x의 각 발생은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP:
    [화학식 II]

    [화학식 III]

    [화학식 IV]

    [화학식 V]

    [화학식 VI]

    [화학식 VII]

    상기 화학식 II 내지 VII에서,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이고;
    b1, b2, b3, b4 및 b5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    c1 및 c2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    d1 및 d2는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
  4. 제2항에 있어서, 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 하기 화학식의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP:
    [화학식 VIII]

    [화학식 IX]

    [화학식 X]

    [화학식 XI]

    [화학식 XII]

    [화학식 XIII]

    [화학식 XIV]

    [화학식 XV]

    상기 화학식 VIII 내지 XV에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, 할로겐, 임의로 치환된 C1-C28 알킬, 임의로 치환된 C3-C12 사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로사이클로알킬, 임의로 치환된 C2-C28 알케닐, 임의로 치환된 C5-C12 사이클로알케닐, 임의로 치환된 C2-C28 알키닐, 임의로 치환된 C6-C12 사이클로알키닐, 임의로 치환된 C6-C10 아릴, 임의로 치환된 C2-C12 헤테로아릴, C1-C28 알콕시카보닐, 선형 C1-C28 알콕시카보닐, 분지형 C1-C28 알콕시카보닐, C(=O)NH2, NH2, C1-C28 아미노알킬, C2-C28 아미노알케닐, C2-C28 아미노알키닐, C6-C10 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, OH, C1-C28 하이드록시알킬, C2-C28 하이드록시알케닐, C2-C28 하이드록시알키닐, C6-C10 하이드록시아릴, C1-C28 알콕시, 카복실, 카복실레이트 및 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    a1, a2, a3, a4 및 a5는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이다.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 I의 이온화 가능한 지질이 1,1'-((2-(2-(4-(2-((2-(2-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)에톡시)에틸)(2-하이드록시테트라데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에톡시)에틸)아잔디일)비스(테트라데칸-2-올):
    [화학식 C14-4]

    을 포함하는, LNP.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 덱사메타손인, LNP.
  7. 제6항에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물이 9:1, 8:2, 7:3 및 5:5(콜레스테롤:덱사메타손)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중량비를 갖는, LNP.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 LNP가 MC3 및 C12-200으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 지질을 포함하는, LNP.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPC)인, LNP.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 50:10:38.5:1.5인, LNP.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 하이드록시 치환 콜레스테롤, 에폭시 치환 콜레스테롤 및 케토 치환 콜레스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP.
  13. 제1항 내지 제5항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 7-α-하이드록시콜레스테롤, 7-β-하이드록시콜레스테롤, 19-하이드록시콜레스테롤, 20-(S)-하이드록시콜레스테롤, 24-(S)-하이드록시콜레스테롤, 25-하이드록시콜레스테롤, 7-케토콜레스테롤, 5,6-에폭시콜레스테롤, 3β,5α,6β-트리하이드록시콜레스테롤, 4β-하이드록시콜레스테롤, 27-하이드록시콜레스테롤 및 22-(R)-하이드록시콜레스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP.
  14. 제1항 내지 제5항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물이 약 50:50, 75:25, 87.5:12.5 및 약 0:100(콜레스테롤:콜레스테롤-대체물)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 퍼센트 비율을 갖는, LNP.
  15. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)인, LNP.
  16. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP.
  17. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 30:16:46.5:2.5인, LNP.
  18. 제17항에 있어서, (c)가 콜레스테롤 및 7-α-하이드록시콜레스테롤을 포함하고, 상기 콜레스테롤 및 7α-하이드록시콜레스테롤이 50:50 및 75:25(콜레스테롤:7-α-하이드록시콜레스테롤)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 비율을 갖는, LNP.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 카복시-치환 콜레스테롤인, LNP.
  20. 제1항 내지 제5항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 담즙산인, LNP.
  21. 제1항 내지 제5항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤-대체물이 체노데옥시콜산(CDCA), 콜산(CA), 데옥시콜산(DCA), 리토콜산(LCA), 타우로콜산, 글리코콜산, 타우로체노데옥시콜산 및 글리코체노데옥시콜산으로 이루어진 그룹에서 선택되는, LNP.
  22. 제1항 내지 제5항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤 및 콜레스테롤-대체물이 25:100, 50:50, 75:25 및 100:0(콜레스테롤-대체물:콜레스테롤)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 몰 비율을 갖는, LNP.
  23. 제1항 내지 제5항 및 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 포함하는, LNP.
  24. 제1항 내지 제5항 및 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 또는 PEG-접합 지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)(C14PEG-2000)을 포함하는, LNP.
  25. 제1항 내지 제5항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, (a):(b):(c):(d)의 몰 비율이 약 35:16:46.5:2.5인, LNP.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 핵산 분자와 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는, LNP.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 mRNA, siRNA, 마이크로RNA, CRISPR-Cas9, 소분자, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 약제(agent)를 추가로 포함하는, LNP.
  28. 제26항에 있어서, 상기 LNP가 핵산 분자를 포함하는, LNP.
  29. 제28항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 또는 RNA 분자인, LNP.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 변형 RNA, 안타고미르, 안티센스 분자 및 표적(target) 핵산 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP.
  31. 제28항에 있어서, 상기 핵산 분자가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는(encoding), LNP.
  32. 제31항에 있어서, 상기 CAR가 병원성 세포 또는 종양 세포의 표면 항원에 대한 결합에 특이적인, LNP.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 관심 있는 표적 세포에 대한 결합에 특이적인 표적화 도메인을 추가로 포함하는, LNP.
  34. 제33항에 있어서, 상기 표적 세포가 말초 혈액 단핵 세포 및 면역 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, LNP.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 T 세포에 대한 결합에 특이적인 면역 세포 표적화 도메인을 포함하는, LNP.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적화 도메인이 CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 표적 분자에 특이적으로 결합하는, LNP.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 LNP 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신인, 약제학적 조성물.
  40. 핵산 분자 및 치료제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 이를 필요로 하는 대상체(subject)의 표적 세포에 전달하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 LNP 및/또는 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 치료제가 mRNA, siRNA, 마이크로RNA, CRISPR-Cas9, 소분자, 단백질 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 및 RNA 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 핵산 분자가 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 안타고미르(antagomir), 안티센스 분자 및 표적 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 핵산 분자가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 CAR이 병원성 세포 또는 종양 세포의 표면 항원에 대한 결합에 특이적인, 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 줄기 세포, 말초 혈액 단핵 세포 및 면역 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 CAR이 T 세포에 대한 결합에 특이적인 세포 표적화 도메인을 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포 표적화 도메인이 CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD16, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD40L, CD44, CD45, CD62L, CD69, CD73, CD80, CD83, CD86, CD95, CD103, CD119, CD126, CD150, CD153, CD154, CD161, CD183, CD223, CD254, CD275, CD45RA, CXCR3, CXCR5, FasL, IL18R1, CTLA-4, OX40, GITR, LAG3, ICOS, PD-1, leu-12, TCR, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, NKG2D, CCR, CCR1, CCR2, CCR4, CCR6 및 CCR7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나에 대한 결합에 특이적인, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 이의 약제학적 조성물이 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자 및/또는 치료제가 LNP 내에 적어도 부분적으로 캡슐화(encapsulating)되는, 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 암 또는 암과 연관된 질환 또는 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 치료, 예방 및/또는 개선하는, 방법.
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