KR20240099211A - Ccr2를 표적으로 하는 항체 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 항체는 CCR2-양성 세포를 고갈시키고 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1(CCL2) 유도된 하향조절을 차단한다. 또한, 이들은 유리한 생물리학적 특성을 갖는다. 항체는 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 다른 질환의 치료에 유용하다.
Description
본 개시내용은 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 항체는 CCR2-양성 세포를 고갈시키고 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1(CCL2) 유도된 하향조절을 차단한다. 또한, 이들은 유리한 생물리학적 특성을 갖는다. 항체는 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 다른 질환의 치료에 유용하다.
단핵구는 케모카인 및 사이토카인의 영향하에서 염증 부위로 이동한다. 이러한 케모카인 중 하나는 케모카인 수용체 CCR2에 결합하는 MCP-1이며, 이것은 단핵구가 골수에서 빠져나가게 한다. MCP-1은 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 기타 질환 동안 세포에 의해 분비된다.
MCP-1/CCR2 경로를 표적으로 하는 몇몇 분자는 시험되었거나 여전히 시험중이며 몇몇은 유망한 결과를 보였지만 지금까지 승인된 것은 없었다. 개발된 약물의 대부분은 작은 유기 분자이다. 예를 들어, Takeda 및 Tobira Therapeutics에 의해 개발된 소분자인 세니크리비르크(cenicrivirc)는 현재 임상 3상 시험 중이다. 그러나, 세니크리비르크는 CCR2에 특이적이지 않을 뿐만 아니라 CCR5도 억제한다.
STI-B0201은 Sorrento에 의해 생성된 항체이지만 임상 개발은 보고되지 않았다. Sorrento의 항-CCR2 항체는 제WO2013/192596호에 개시되어 있다. 본 개시내용의 항체와는 달리, 제WO2013/192596호의 항체는 마우스 CCR2와 교차 반응한다. 항-CCR2 항체의 항체는 또한 제WO2007/115713호 및 미국 제9068002호에 개시되어 있다. 그러나 이들은 마찬가지로 개발된 적이 없는 뮤린 항체이다. MLNM1202(플로잘리주맙(plozalizumab))은 또 다른 항-CCR2 항체이지만 Millennium에 의해 개발이 중단되었다. Takeda/Millennium의 항체가 제WO2016/079276호에 개시되어 있다. Amgen의 항체는 미국 제2011/0274696호에 개시되어 있다. 미국 제2011/0274696호의 항체는 시노몰구스 CCR2에 대한 반응성을 보이는 반면, 본 개시내용의 항체는 시노몰구스 CCR2와 교차 반응하지 않는다. 그러나, 본 개시내용의 항체는 마모셋 CCR2와 교차 반응한다. 레겐스부르크 대학/예다/텔 아비브 메디컬 센터의 CCR2에 대한 항체는 미국 제9,068,002호에 개시되어 있다. Pfizer의 CCR2에 대한 항체는 제WO2010021697호에 개시되어 있다. 다시 한 번, 개발은 보고되지 않았다.
따라서, 특정 항-CCR2 표적 모이어티 개발에 대한 필요성과 큰 관심이 있지만, 현재 개발이 진행중인 항-CCR2 항체는 없다. 본 발명은 CCR2에 매우 특이적이고, 성공적인 임상 개발에 이로운 높은 친화성 및 생물리학적 특성을 갖는 신규 항체를 개시한다.
본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 신규 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 항체는 임상 개발을 위한 관련 동물 모델인 마모셋 CCR2에 교차-반응성이다. 선행 기술의 항체와 비교하여, 본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 몇 가지 장점을 갖는다. 한 가지 장점은 표적 항원에 대한 높은 친화도이다. 본 발명의 항체 및 항체 단편의 친화도는 임의의 선행 기술 항체보다 적어도 1 크기 더 높다. 또한, 본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 우수한 생물리학적 특성을 갖는다. 이것은 높은 온도 안정성, 반복적인 동결 및 해동시 높은 안정성, 넓은 pH 범위에 걸친 안정성, 및 인간 혈장에서의 높은 안정성을 포함한다. 따라서, 항체의 개발 가능성이 매우 증가된다. 결합제의 안정성은 또한 항체의 연장된 혈청 수준을 유도하여, 항체를 더 낮은 용량으로 투여할 수 있게 하여 잠재적인 부작용을 줄일 수 있다.
본 개시내용은 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합하는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 인간 CCR5(서열 번호 6)에 결합하지 않는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 마모셋 CCR2와 교차-반응성인 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 항체 DOC2보다 인간 CCR2에 대해 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 항체 및 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현되는 인간 CCR2에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는 상기 항체 또는 항체 단편은 0.1 내지 1.0μg/ml의 항체 농도에서 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
본 개시내용의 바람직한 항체 및 항체 단편은 인간 lgG 부류이다. 본 개시내용의 더욱 바람직한 항체 또는 항체 단편은 lgG1 부류이다.
본 개시내용의 바람직한 항체 및 항체 단편은 단클론 항체 또는 항체 단편이다.
본 개시내용의 바람직한 항체 및 항체 단편은 인간화 항체 또는 항체 단편이다.
본 개시내용은 또한 우수한 생물리학적 특성을 갖는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다. 이것은 높은 온도 안정성, 반복적인 동결 및 해동시 높은 안정성, 넓은 pH 범위에 걸친 안정성, 및 인간 혈장에서의 높은 안정성을 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 항체 및 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 항체 및 항체 단편은 서열 번호 22의 가변 중쇄 및 서열 번호 23의 가변 경쇄를 포함한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 서열 번호 22의 가변 중쇄 및 서열 번호 23의 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 이러한 핵산 또는 핵산 조성물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 이러한 핵산, 핵산 조성물 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 의학에서 사용하기 위한 것이다. 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 다른 질환의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 항체 및 항체 단편이 바람직하다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항체 및 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 인간 CCR2에 대한 본 발명의 항체의 특이적 결합을 나타낸다. 인간 CCR5에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 항-CCR5 항체 MC-1은 인간 CCR5에 특이적이었으나 인간 CCR2에 대한 결합은 보이지 않았다.
도 2는 본 발명의 항체가 CD16-음성 단핵구에는 결합하지만(상단 패널), CD16-양성 단핵구에는 결합하지 않음(하단 패널)을 보여준다.
도 3은 항체 Y4T3가 CD16-음성 마모셋 단핵구에 결합하지만(상단) CD16-양성 마모셋 단핵구에는 결합하지 않음(하단)을 입증한다. 항체 Y1T2 및 Y2T63은 CD16-음성 및 CD16-양성 마모셋 단핵구에 결합하지 않는다.
도 4는 인간 CCR2의 ECL2 도메인이 Y4T3의 결합에 중요하다는 것을 보여준다. Y4T3은 ECL2 도메인이 레서스 CCR2b의 ECL2 도메인으로 대체된 인간 CCR2b의 변이체에 결합하지 않았다.
도 5는 37℃에서 30분 동안 MCP-1을 사용한 인간 CCR2의 하향조절이 인간 단핵구에 대한 Y4T3의 결합을 감소시킨다는 것을 입증한다.
도 6은 인간 단핵구에서 발현된 CCR2에 대한 Y3T3의 인간화 변이체의 결합을 보여준다. 모든 항체는 0.5μg/ml에서 시험되었다. H0L0은 Y4T3의 인간 IgG1 키메라 버전을 명명한다. H1L1 내지 H5L5는 Y4T3의 인간화 변이체이다.
도 7은 CCR2+ 인간 단핵구에 대한 항체 hY4T3의 결합을 입증한다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 8은 CCR2+ 마모셋 단핵구에 대한 항체 hY4T3의 결합을 입증한다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 9는 인간 CCR2로 형질감염된 CHO 세포에 대한 Y4T3의 인간 IgG1 키메라 변이체(Y4T3-chim) 및 hY4T3의 결합을 보여준다. Y4T3-chim 및 hY4T3은 인간 CCR5로 형질감염된 CHO 세포에 결합하지 않는다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 10은 다양한 백혈구 서브세트에서 hY4T3에 의한 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절의 차단을 입증한다. 세포를 먼저 37℃에서 30분 동안 표시된 바와 같은 다양한 농도(μg/ml)의 hY4T3, MCP-1 또는 배지(RPMI)와 함께 배양하였다. 그후, MCP-1, hY4T3 또는 RPMI를 첨가한 다음 37℃에서 30분 동안 또 다시 배양하였다. 1차 및 2차 배양 단계 사이에 세포를 세척하지 않았다. 표면 결합된 hY4T3을 PE-표지된 염소 항-인간 IgG 항체로 검출하였다.
도 11은 마모셋 원숭이로부터의 PBMC에 대한 hY4T3 처리의 효과를 보여준다. 마모셋을 0 시점에서 5mg/kg hY4T3로 처리하였다. 처리 전 및 처리 후의 다양한 시점에서, 백혈구 하위집단을 유세포 분석에 의해 전혈에서 정량하였다. 상대 세포 수는 PBMC의 %로 표시된다.
도 12는 표시된 온도(왼쪽 상단 = 기준; 오른쪽 상단 = 55℃; 왼쪽 하단 = 65℃; 오른쪽 하단 = 75℃)에서 3시간 동안 배양한 후 hY4T3에 대한 SEC 크로마토그램을 보여준다.
도 13은 표시된 온도에서 2시간 동안 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 14는 항체 제제의 반복적인 동결-해동 사이클 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 15는 표시된 pH에서 2시간 동안 다양한 항체 농도로 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 16은 PBS 및 인간 혈장에서 다양한 시간 간격 동안 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다. 항체를 표시된 시간 간격 동안 1mg/ml의 농도로 배양하였다. 그후, 항체의 결합을 다양한 희석도에서 시험하였다.
도 17은 인간 단핵구에서 선행 기술 항체 DOC2, 1D9 및 클론 48607에 대한 항체 Y4T4의 결합의 비교를 보여준다.
도 18은 hY4T3이 인간 CCR2에 결합하지만 마우스 CCR2에 결합한다는 것을 보여준다. MC-21은 마우스 CCR2에 결합하지만 인간 CCR2에는 결합하지 않는다.
도 19는 hY4T3이 케모카인 수용체 CCR2를 효율적으로 차단한다는 것을 보여준다.
도 2는 본 발명의 항체가 CD16-음성 단핵구에는 결합하지만(상단 패널), CD16-양성 단핵구에는 결합하지 않음(하단 패널)을 보여준다.
도 3은 항체 Y4T3가 CD16-음성 마모셋 단핵구에 결합하지만(상단) CD16-양성 마모셋 단핵구에는 결합하지 않음(하단)을 입증한다. 항체 Y1T2 및 Y2T63은 CD16-음성 및 CD16-양성 마모셋 단핵구에 결합하지 않는다.
도 4는 인간 CCR2의 ECL2 도메인이 Y4T3의 결합에 중요하다는 것을 보여준다. Y4T3은 ECL2 도메인이 레서스 CCR2b의 ECL2 도메인으로 대체된 인간 CCR2b의 변이체에 결합하지 않았다.
도 5는 37℃에서 30분 동안 MCP-1을 사용한 인간 CCR2의 하향조절이 인간 단핵구에 대한 Y4T3의 결합을 감소시킨다는 것을 입증한다.
도 6은 인간 단핵구에서 발현된 CCR2에 대한 Y3T3의 인간화 변이체의 결합을 보여준다. 모든 항체는 0.5μg/ml에서 시험되었다. H0L0은 Y4T3의 인간 IgG1 키메라 버전을 명명한다. H1L1 내지 H5L5는 Y4T3의 인간화 변이체이다.
도 7은 CCR2+ 인간 단핵구에 대한 항체 hY4T3의 결합을 입증한다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 8은 CCR2+ 마모셋 단핵구에 대한 항체 hY4T3의 결합을 입증한다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 9는 인간 CCR2로 형질감염된 CHO 세포에 대한 Y4T3의 인간 IgG1 키메라 변이체(Y4T3-chim) 및 hY4T3의 결합을 보여준다. Y4T3-chim 및 hY4T3은 인간 CCR5로 형질감염된 CHO 세포에 결합하지 않는다. 사용된 항체의 농도는 x축에 표시된다.
도 10은 다양한 백혈구 서브세트에서 hY4T3에 의한 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절의 차단을 입증한다. 세포를 먼저 37℃에서 30분 동안 표시된 바와 같은 다양한 농도(μg/ml)의 hY4T3, MCP-1 또는 배지(RPMI)와 함께 배양하였다. 그후, MCP-1, hY4T3 또는 RPMI를 첨가한 다음 37℃에서 30분 동안 또 다시 배양하였다. 1차 및 2차 배양 단계 사이에 세포를 세척하지 않았다. 표면 결합된 hY4T3을 PE-표지된 염소 항-인간 IgG 항체로 검출하였다.
도 11은 마모셋 원숭이로부터의 PBMC에 대한 hY4T3 처리의 효과를 보여준다. 마모셋을 0 시점에서 5mg/kg hY4T3로 처리하였다. 처리 전 및 처리 후의 다양한 시점에서, 백혈구 하위집단을 유세포 분석에 의해 전혈에서 정량하였다. 상대 세포 수는 PBMC의 %로 표시된다.
도 12는 표시된 온도(왼쪽 상단 = 기준; 오른쪽 상단 = 55℃; 왼쪽 하단 = 65℃; 오른쪽 하단 = 75℃)에서 3시간 동안 배양한 후 hY4T3에 대한 SEC 크로마토그램을 보여준다.
도 13은 표시된 온도에서 2시간 동안 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 14는 항체 제제의 반복적인 동결-해동 사이클 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 15는 표시된 pH에서 2시간 동안 다양한 항체 농도로 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다.
도 16은 PBS 및 인간 혈장에서 다양한 시간 간격 동안 항체를 배양한 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 보여준다. 항체를 표시된 시간 간격 동안 1mg/ml의 농도로 배양하였다. 그후, 항체의 결합을 다양한 희석도에서 시험하였다.
도 17은 인간 단핵구에서 선행 기술 항체 DOC2, 1D9 및 클론 48607에 대한 항체 Y4T4의 결합의 비교를 보여준다.
도 18은 hY4T3이 인간 CCR2에 결합하지만 마우스 CCR2에 결합한다는 것을 보여준다. MC-21은 마우스 CCR2에 결합하지만 인간 CCR2에는 결합하지 않는다.
도 19는 hY4T3이 케모카인 수용체 CCR2를 효율적으로 차단한다는 것을 보여준다.
정의
본 개시내용은 CCR2에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
용어 "CCR2"는 CD192 또는 MCP-1 수용체로도 알려진 C-C 모티프 케모카인 수용체 2로 알려진 단백질을 지칭한다. 인간 CCR2는 두 가지 주요 이소형, CCR2a 및 CCR2b로 존재하며, 이는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된다. CCR2a 및 CCR2b는 세포질 C 말단 부분에서만 상이하다. 치료용 항체 및 항체 단편에 접근할 수 있는 세포외 부분은 두 이소형이 모두 동일하다.
인간 CCR2b는 다음의 아미노산 서열을 갖는다 (UniProtKB/Swiss-Prot: P41597):
MLSTSRSRFIRNTNESGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (서열 번호 1)
인간 CCR2의 세포외 도메인 2 (ECL2)은 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
TKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMR (서열 번호 2)
마모셋 원숭이 (Callithrix jacchus) CCR2b는 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
MLSTSHSRFIRNTESGEEVTTIFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKSLTDIYLLNLAVSDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAVCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWFVAVFASVPGIIFTKSQKEDSVYVCGPYFPRGWNHFHTIMRNLLGLVLPLLVMIICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWTPYNIVVLLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHIAKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (서열 번호 3)
레서스 원숭이 (Macaca mulatta) CCR2b는 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
MLSTSRSRFIRNTNGSGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKSLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYLGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQEEDSVYICGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTRQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSMFFRKYITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTAEQEVSVGL (서열 번호 4)
CCR2는 MCP-1에 대한 주요 기능적 수용체이다. MCP-1에 대한 이의 결합은 단핵구와 대식세포의 화학주성 및 이동을 매개한다.
용어 "MCP-1"은 단핵구 화학주성 단백질 1로 알려진 단백질을 지칭한다. 이것은 CCL2(C-C 모티프 케모카인 리간드 2)로도 알려져 있다. 인간 MCP-1은 다음의 아미노산 서열을 갖는다 (UniProtKB/Swiss-Prot: P13500):
MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT (서열 번호 5)
용어 "CCR5"는 C-C 모티프 케모카인 수용체 5로 알려진 단백질을 지칭한다. 이것은 CD195로도 알려져 있다. 인간 CCR5는 다음의 아미노산 서열을 갖는다 (UniProtKB/Swiss-Prot: P51681):
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL (서열 번호 6)
본 개시내용의 특정 실험에서 하기 추가의 작제물이 사용되었다.
레서스 원숭이의 ECL2 도메인을 갖는 인간 CCR2b:
MLSTSRSRFIRNTNESGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQEEDSVYICGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (서열 번호 7)
레서스 ECL2 도메인은 두 개의 아미노산 잔기에서 인간 ECL2 도메인과 상이하다.
레서스 원숭이의 ECL3 도메인을 갖는 인간 CCR2b:
MLSTSRSRFIRNTNESGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTRQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (서열 번호 8)
레서스 ECL3 도메인은 하나의 아미노산 잔기에서 인간 ECL2 도메인과 상이하다.
레서스 원숭이의 N-말단을 갖는 인간 CCR2b:
MLSTSRSRFIRNTNGSGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (서열 번호 9)
레서스 CCR2의 N-말단은 하나의 아미노산 잔기에서 인간 CCR2와 상이하다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 상호작용하는, 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 가지 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 영역 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항체"는 예를 들어, 단클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 항체는 임의의 이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, Igd, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 경쇄 및중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 항원과 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 더욱이, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다; 예를 들어, 참조; Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 "항체 단편"이라는 용어 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 당업계의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 혼입될 수 있다(예를 들어, 참조; Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1 126-1 136). 항체 단편은 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 단일체를 기재하는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항체 단편은, 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원-결합 부위를 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 단일 쇄 분자에 혼입될 수 있다(참조: Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; 및 미국 특허 제5,641,870호).
면역글로불린 가변 도메인, 예를 들어, CDR의 구조 및 위치는 잘 알려진 넘버링 체계, 예를 들어, Kabat 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, 또는 Kabat와 Chothia의 조합을 사용하여 정의될 수 있다(예를 들어, 참조; Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901 -917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; and Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Annals of the New York Academy of Sciences, 764, 47-49 (1995); Nucleic Acids Research, 25, 206-211 (1997)).
본원에서 사용되는 "인간 항체" 또는 "인간 항체 단편"은 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체 및 항체 단편이다. 인간 항체는 또한 각 시스템이 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 생성하는 한 합성 라이브러리로부터 또는 유전자이식 마우스(예를 들어 Xenomouse)로부터 단리될 수 있다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역도 이러한 서열로부터 유래된다. 인간 기원은, 예를 들어, 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 예를 들어, 문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기술된 바와 같이, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
"인간화 항체" 또는 "인간화 항체 단편"은 인간 기원의 서열로부터 유래된 불변 항체 영역을 갖는 항체 분자로서 본원에서 정의되며, 가변 항체 영역 또는 이의 일부 또는 단지 CDR은 다른 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 인간화 항체는 CDR-이식될 수 있고, 여기서 가변 도메인의 CDR은 비-인간 기원으로부터 유래되는 반면 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간 기원이고 불변 도메인(만약 있다면)은 인간 기원이다.
용어 "키메라 항체" 또는 "키메라 항체 단편"은 한 종에서 발견되는 서열로부터 유래되거나 이에 상응하는 불변 항체 영역 및 다른 종으로부터 유래되는 가변 항체 영역을 갖는 항체 분자로서 본원에서 정의된다. 바람직하게는, 불변 항체 영역은 인간에서 발견되는 서열로부터 유래되거나 이에 상응하고, 가변 항체 영역(예를 들어, VH, VL, CDR 또는 FR 영역)은 비-인간 동물, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터에서 발견되는 서열로부터 유래된다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편이 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 더욱이, 단리된 항체 또는 항체 단편은 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 항체는 단리된 항체이며, 이들은 상이한 특이성을 갖는 항체로부터 분리되었다. 단리된 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단리된 항체는 재조합 단클론 항체일 수 있다. 그러나, 표적의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어, 다른 종(예를 들어, 종 상동체)으로부터의 다른 관련 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 항체"는 자연계에 존재하지 않는 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는 모든 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 선택되고 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자, 서열의 전부 또는 일부의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식되거나 염색체 형질전환된 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마. 바람직하게는, 이러한 재조합 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자이식된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 재조합 항체는 단클론 항체일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항체 단편은 HuCAL 라이브러리로부터 단리된다(Rothe et al, J. Mol. Biol. (2008) 376, 1 182-1200).
본원에 사용된 바와 같이, 결합 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이기 때문에 이러한 항체가 이러한 항원과 하나 이상의 기준 항원(들)을 구별할 수 있다면, 항체는 인간 CCR2와 같은 항원에 "특이적으로 결합(binds specifically to)"하거나, "특이적으로 결합(specifically binds to)"하거나, 항원에 "특이적(specific to/for)"이거나, 항원을 "특이적으로 인식(specifically recognizes)"한다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석 또는 표준 유세포 분석 검정을 수행할 수 있다. 스코어링은 표준 발색(예를 들어 서양고추냉이 과산화물을 사용한 2차 항체 및 과산화수소를 사용한 테트라메틸 벤지딘) 또는 PE로 표지된 2차 항체의 결합 또는 다른 염료 또는 마커에 의해 수행될 수 있다. 특정 웰에서의 반응은 예를 들어 450nm에서의 광학 밀도(OD)에 의해 또는 유세포 분석에서의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 스코어링된다. 전형적인 배경(=음성 반응)은 0.1 OD일 수 있다; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 배경 및 양성 반응 MFI는 기기 설정에 매우 의존적이다. 양성/음성 차이는 10배 이상일 수 있다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 기준 항원이 아니라, 분유, BSA, 트랜스페린 등과 같은 약 3 내지 5개의 관련 없는 항원의 세트를 사용하여 수행된다. 유세포 분석을 위해 다양한 항원-음성 세포가 사용될 수 있다. 그러나 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 종(예를 들어, 종 상동체)으로부터의 각각의 이종상동성 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종상동성 항원에 대한 이러한 교차-반응성이 더욱 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체는 다른 종으로부터의 이종상동성 항원에 결합한다면 "교차-반응성(cross-reactivity)"을 갖거나 "교차-반응성(cross-reactive)"이다. 예를 들어, 항체는 인간 CCR2 및 마모셋 CCR2에 결합한다면 교차-반응성이다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 단일 부위에서 폴리펩티드와 이의 표적 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각 부위 내에서, 폴리펩티드의 결합 영역은 수많은 부위에서 이의 표적과 약한 비공유 힘을 통해 상호작용한다; 상호작용이 많을수록 친화도가 강해진다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 이의 항체 단편에 의해 특이적으로 인식되거나 달리 분자와 상호작용하는 임의의 단백질성 영역을 포함한다. 일반적으로, 에피토프는 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹이며, 일반적으로 특정 전하 특성 뿐만 아니라 특정 3차원 구조적 특성을 가질 수 있다. 당업계의 숙련가에 의해 인지되는 바와 같이, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 실제적인 모든 것이 에피토프가 될 수 있다.
용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 기능적 단위를 형성하고/하거나 독립적으로 3차원 구조를 형성하는 단백질의 폴리펩티드 쇄의 영역을 지칭한다. 예를 들어, CCR2의 ECL2는 단백질 도메인이다.
본 개시내용의 "조성물"은 치료적 또는 예방적 용도를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 다른 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유도하기 위해 필요한 CCR2 항체의 양을 지칭한다. 본 개시내용에 따르면, 치료적 유효량은 질환의 치료 및/또는 예방에 필요한 CCR2 항체의 양이다.
"투여된" 또는 "투여"는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 또는 피하 경로 또는 점막 경로, 예를 들어, 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸로서 또는 섭취 가능한 용액, 캡슐 또는 정제로서와 같은 주사 가능한 형태에 의한 약물의 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 투여는 주사 가능한 형태에 의해 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하다" 또는 "치료하는" 등은 치료되는 대상체에서 질환의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 질환의 발병을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
"예방하는" 또는 "예방"은 질환의 획득 또는 발병 위험의 감소(즉, 질환-유발제에 노출될 수 있거나 질환 발병 전에 질환에 걸리기 쉬운 대상체에서 질환의 임상 증상 중 적어도 하나가 발생하지 않도록 유발)를 지칭한다. "예방"은 또한 질환 또는 이의 증상의 발병을 예방하는 것을 목표로 하거나 질환 또는 이의 증상의 발병을 지연시키는 방법을 지칭한다.
이러한 문맥에서 사용되는 바와 같이 "대상체" 또는 "종"은 마우스 또는 랫트와 같은 설치류 및 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis), 마모셋 원숭이(Callithrix jacchus), 레서스 원숭이(Macaca mulatta) 또는 인간(호모 사피엔스)과 같은 영장류를 포함하는 임의의 포유류를 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 영장류이며, 가장 바람직하게는 인간이다.
용어 "이펙터 기능(effector function)"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 비제한적인 예는 C1 q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP); 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 직접 세포 활성화 또는 직접 세포 억제를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어 NK 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 항체가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이후 세포독소로 표적 세포를 사멸할 수 있도록 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcyRIII만 발현하는 반면, 단핵구/대식세포는 FcyRI, FcyRII, 및 FcyRII를 발현한다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)이 이들의 동족 항원에 결합된 본 개시내용의 (적절한 서브클래스의) 항체에 결합함으로써 개시된다.
"항체-의존성 세포 식균작용" 또는 "ADCP"는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 식세포(phagocytic cell)에 의한 내재화(internalization)에 의해 항체-코팅된 표적 세포를 제거하는 메커니즘을 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)", "갖다(have)" 및 "포함하다(include)"라는 단어 및 이들의 각각의 변형 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "갖다(has)", "갖는(having)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 명시된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 수 있지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "조작된" 또는 "변형된"은 합성 수단에 의한 (예를 들어, 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성, 펩티드의 효소적 또는 화학적 결합 또는 이들 기술의 일부 조합에 의한) 핵산 또는 폴리펩티드의 조작을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 항원 결합, 안정성, 반감기, 이펙터 기능, 면역원성, 안전성 등과 같은 하나 이상의 특성을 개선하도록 조작되거나 변형된다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어 아미노산 치환, 삽입 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드와는 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 전형적으로 기준 폴리펩티드의 특성의 대부분, 예를 들어 표적 항원에의 결합을 보유하지만, 신규하고 추가적인 특징 또는 특성을 도입하며, 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드에 비해 표적 항원에 대해 더 높은 친화성을 가지거나 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 인간화 버전이다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입, 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 최종 작제물이 목적하는 특성, 예를 들어, Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 한 치환, 결실, 삽입, 및 변형의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산 잔기의 N- 및/또는 C-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한 또는 20가지 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당업계에 잘 알려진 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정 돌연변이 유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 방법에 의해 아미노산 잔기의 측쇄 그룹을 변경하는 방법도 유용할 수 있다고 간주된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 다양한 명칭이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역의 위치 327의 글리신에서 알라닌으로의 치환은 237A, G337, G337A 또는 Gly329Ala로 나타내어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "EC50"은 기준선과 최대치 사이의 분석 중간치의 반응을 유도하는 항체 또는 항체 단편의 농도를 지칭한다. 따라서 이것은 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체 또는 리간드 농도를 나타낸다.
용어 "억제" 또는 "억제하다" 또는 "감소" 또는 "감소하다" 또는 "중화" 또는 "중화하다"는 임의의 표현형 특성(예를 들어, 결합 또는 생물학적 활성 또는 기능)의 감소 또는 중단 또는 해당 특성의 발생률, 정도 또는 가능성의 감소 또는 중단을 지칭한다. "억제", "감소" 또는 "중화"는 적절한 분석을 사용하여 검출할 수 있는 한 완전할 필요는 없다. 일부 실시양태에서, "감소하다" 또는 "억제하다" 또는 "중화하다"는 20% 이상의 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소하다" 또는 "억제하다" 또는 "중화하다"는 50% 이상의 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소하다" 또는 "억제하다" 또는 "중화하다"는 75%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 전반적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "길항" 항체는 항원과 상호작용하고 생물학적 활성 또는 기능 또는 표적 항원의 임의의 다른 표현형 특성을 부분적으로 또는 완전히 억제하거나 중화시키는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
"야생형" 단백질은 자연에서 발견되는 단백질의 버전 또는 변이체이다. 야생형 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어, 인간 lgG1 항체의 Fc 영역은 자연에서 발생하는 단백질의 아미노산 서열이다. 알로타입의 차이로 인해, 야생형 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 서열이 있을 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 인간 IGg1 중쇄 불변 영역의 몇 가지 알로타입이 있다(예를 들어, 참조; Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1).
"Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 두 개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226 또는 Pro230에서 중쇄의 C-말단까지 확장되는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이, EU 지수라고도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본 발명의 실시양태
폴리펩티드
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 Kabat에 의해 정의된 바와 같이, 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 IMGT에 의해 정의된 바와 같이, 서열 번호 16의 HCDR1 영역, 서열 번호 17의 HCDR2 영역, 서열 번호 18의 HCDR3 영역, 서열 번호 19의 LCDR1 영역, 서열 번호 20의 LCDR2 영역 및 서열 번호 21의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 Kabat에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 IMGT에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 Chothia에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 단클론 항체 또는 항체 단편이다.
본 개시내용의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편이다. 본 개시내용의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간화 항체 또는 항체 단편이다.
본 개시내용의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 재조합 항체 또는 항체 단편이다.
본 개시내용의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 IgG 이소타입이다.
본 개시내용의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 lgG1 부류이다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 마모셋 CCR2와 교차-반응한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 마모셋 CCR2와 교차-반응하지만, 레서스 CCR2와는 교차반응하지 않는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 레서스 CCR2에 결합하지 않는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 마우스 CCR2에 결합하지 않는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR5(서열 번호 6)에 결합하지 않는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 DOC2보다 인간 CCR2에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 잘 결합한다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 DOC2보다 인간 CCR2에 적어도 10배 더 잘 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 CCR2에 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 잘 결합한다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 CCR2에 적어도 10배 더 잘 결합한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 CCR2에 대해 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는 인간 CCR2에 특이적인 항체 및 항체 단편에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 항체 및 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현되는 인간 CCR2에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현되는 인간 CCR2에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
본 개시내용은 또한 항체 및 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 0.1-1.0μg/ml의 항체 농도에서 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현되는 인간 CCR2에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현되는 인간 CCR2에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 DOC2보다 인간 CCR2에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 DOC2보다 인간 CCR2에 대해 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 CCR2에 대해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 CCR2에 대해 적어도 10배 더 높은 친화도를 갖는다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 1D9보다 인간 CCR2에 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배 또는 적어도 30배 더 잘 결합한다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 1D9보다 인간 CCR2에 적어도 30배 더 잘 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 클론 48607보다 인간 CCR2에 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 더 잘 결합한다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 클론 48607보다 인간 CCR2에 적어도 30배 더 잘 결합한다. 바람직하게는, 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 클론 48607보다 인간 CCR2에 적어도 100배 더 잘 결합한다.
본원에서 "클론 48607" 또는 "항체 클론 48607"로 언급된 항체는 CD-지정 항체 클론 48607을 지칭한다. 이 항체 클론은 상업적으로 이용 가능하다(R&D Systems; 카탈로그#: MAB150).
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 갖는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역, 서열 번호 15의 LCDR3 영역, 및 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역, 서열 번호 15의 LCDR3 영역, 및 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역, 서열 번호 15의 LCDR3 영역, 및 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역, 서열 번호 15의 LCDR3 영역, 및 서열 번호 22의 VH에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
핵산
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 Kabat에 의해 정의된 바와 같이, 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 IMGT에 의해 정의된 바와 같이, 서열 번호 16의 HCDR1 영역, 서열 번호 17의 HCDR2 영역, 서열 번호 18의 HCDR3 영역, 서열 번호 19의 LCDR1 영역, 서열 번호 20의 LCDR2 영역 및 서열 번호 21의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 Kabat에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 IMGT에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 Chothia에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 상기 핵산 조성물 및/또는 상기 핵산 서열 및/또는 복수의 핵산 서열은 단리된다.
벡터
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 상기 벡터 조성물 및/또는 벡터 및/또는 복수의 벡터는 단리된다.
숙주 세포
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포를 나타낸다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 벡터 조성물 또는 핵산 조성물에 의해 암호화된 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 단리된 숙주 세포이다. 추가의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포이다. 하나의 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포이다. 하나의 실시양태에서, 상기 세포는 HEK 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 PERC.6 세포이다. 하나의 실시양태에서, 상기 세포는 HKB1 1 세포이다.
숙련가는 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열이 상이한 벡터 또는 동일한 벡터로 클로닝될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
벡터는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 원핵(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵(예를 들어, 효모 또는 포유류) 세포와 같은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다(예를 들어, 참조; "Current Protocol in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds.), Greene Publishing Assoc and John Wiley Interscience, New York, 1989 and 1992). 수많은 클로닝 벡터가 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 적절한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 유전자는 프로모터, 리보솜 결합 부위(박테리아 발현을 위한) 및 임의로, 오퍼레이터(본원에서 "조절" 요소로 통칭됨)의 제어하에 놓일 수 있어, 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 이러한 발현 작제물을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포 내의 RNA로 전사된다. 코딩 서열은 신호 펩티드 또는 리더 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 숙주 세포에서 발현시, 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편이 수득된다. 이러한 단계는 당업계의 숙련가에 의해 공지되는 바와 같이, 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 단계는 전형적으로 적합한 숙주 세포를 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 조성물 또는 벡터 조성물 또는 감염성 입자로 형질전환 또는 형질감염시키는 것을 포함한다. 또한, 이러한 단계는 전형적으로 상기 숙주 세포의 증식(증대, 성장)에 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 암호화된 항체 또는 항체 단편의 생산(발현, 합성)에 적합한 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다. 증식 또는 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포의 배양은 전형적으로 세포 성장 또는 발현 유도에 적합한 성분을 포함하는 배지의 존재하에서 달성된다. 특히, 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편의 생산 방법은, 생산된 항체 또는 항체 단편을 숙주 세포 또는 배지로부터 단리 및 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 발현 시스템이 단백질을 성장 배지로 분비하면, 배지로부터 직접 단백질을 정제할 수 있다. 단백질이 분비되지 않으면, 이를 세포 용해물로부터 단리하거나 세포막 분획으로부터 회수한다. 적절한 성장 조건 및 회수 방법의 선택은 당업계의 기술 내에 있다. 그후 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 당업계의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다수의 기술에 의해 정제될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 항체 중 어느 하나의 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 항체 또는 항체 단편의 발현에 적합한 조건하에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 포함하는 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 항체 단편을 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이 단리된 항체 또는 항체 단편은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등과 같이 당업계에 알려진 기술에 의해 정제될 수 있다. 특정 항체 또는 항체 단편을 정제하기 위해 사용되는 조건은, 부분적으로, 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인에 의존할 것이며, 이는 당업계의 숙련가에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해 항체 또는 항체 단편이 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 다양한 잘 알려진 분석 방법 중 어느 것에 의해 결정될 수 있다.
특이성
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 표 3에 개시된 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 세포외 도메인에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 세포외 도메인 2(ECL2)에 결합한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 마모셋 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 2의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 마모셋 CCR2에 교차-반응하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2 및 마모셋 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2 및 마모셋 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2 및 마모셋 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적이고 레서스 CCR2에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적이고 레서스 CCR2에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2에 특이적이고 레서스 CCR2에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 함유한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR5와 결합하지 않는 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하지 않는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 CCR2의 세포외 도메인 2(ECL2)에 결합하고 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합하고 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에 결합하며 서열 번호 6의 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드에는 결합하지 않고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 22의 가변 중쇄(VH) 및 서열 번호 23의 가변 경쇄(VL)를 갖는다.
백혈구에 대한 효과
CCR2 및 MCP-1은 단핵구가 염증 부위로 이동하는 데 중요한 역할을 한다. 본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 이러한 과정에서 핵심적인 역할을 하며, 본 개시내용의 항체 및 항체 단편의 치료적 유용성에 대한 기초를 형성한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단핵구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 단핵구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 호염기구 및 형질세포성 수지상 세포에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 호염기구 및 형질세포성 수지상 세포에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 백혈구에서 CCR2-유도된 화학주성을 억제하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 단핵구에서 CCR2-유도된 화학주성을 억제하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 호염기구 및 형질세포성 수지상 세포에서 CCR2-유도된 화학주성을 억제하는 단리된 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
이펙터 기능
면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 항체의 유리한 약동학 특성, 예를 들어 혈청 내 반감기 연장 및 세포에 발현된 Fc 수용체에 대한 결합을 통해 이펙터 기능을 유도하는 능력을 부여한다. 다른 한편으로, Fc 수용체에 대한 결합은 또한 특정 세포 표면 수용체의 바람직하지 않은 활성화를 초래하여 원치 않는 사이토카인 방출 및 전신 투여시 심각한 부작용을 야기할 수 있다.
따라서, 특정 치료 상황의 경우, 이펙터 기능을 유도하는 항체의 능력을 감소시키거나 폐지하기 위해, Fc 수용체 중 하나 이상 또는 전부에 대한 항체의 야생형 Fc 영역, 예를 들어 야생형 IgG Fc 영역의 정상적인 결합 및/또는 보체 성분, 예를 들어 C1 q에 대한 결합을 감소시키거나 폐지하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Fcy 수용체, 예를 들어 FcyRI, FcyRIla, FcyRIIb, FcyRIIIa 중 하나 이상 또는 전부에 대한 항체의 Fc 영역의 결합을 감소시키거나 폐지하는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 결합, 대식세포에 대한 결합 , 단핵구에 대한 결합, 다형핵 세포에 대한 결합, 세포사멸을 유도하는 직접 신호전달, 표적-결합된 항체의 가교결합, 수지상 세포 성숙, 또는 T 세포 프라이밍.
Fc 수용체 및/또는 C1 q에 대한 Fc 영역의 감소되거나 폐지된 결합은 전형적으로 야생형 Fc 영역, 예를 들어 lgG1 Fc 영역, 보다 특히 인간 lgG1 Fc 영역을 돌연변이시킴으로써 달성되며, 그 결과 상기 야생형 Fc 영역의 변이체 또는 조작된 Fc 영역, 예를 들어 변이체 인간 lgG1 Fc 영역이 생성된다. 결합 감소를 초래하는 치환이 유용할 수 있다. Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합 특성을 감소시키거나 폐지하기 위해, 비-보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편은 야생형 Fc 영역과 비교했을 때 Fc 수용체 및/또는 C1q에 대한 결합이 감소되거나 폐지된 변이체 Fc 영역을 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 이펙터 기능을 유도하는 항체의 능력을 감소시키거나 폐지하는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 이펙터 기능을 실질적으로 유도하지 않는다.
특정 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC, ADCC 및 ADCP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 하나의 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 하나의 실시양태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP를 실질적으로 유도하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 시험관내에서 ADCC 또는 ADCP를 유도하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교할 때 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 C1q에 대한 변이체 Fc 영역의 결합을 감소시키거나 폐지하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교할 때 이펙터 기능을 유도하는 항체의 능력을 감소시키거나 폐지하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 Fc 영역과 비교할 때 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 C1q에 대한 변이체 Fc 영역의 결합 친화도를 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배 또는 심지어 적어도 50배까지 감소시킬 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 Fc 영역과 비교할 때 이펙터 기능을 유도하는 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 능력을 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배 또는 심지어 적어도 50배까지 감소시킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 변이체 Fc 영역은 하나 이상의 Fc 수용체 및/또는 C1q에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 변이체 Fc 영역은 이펙터 기능을 유도하는 상기 항체의 능력을 실질적으로 폐지한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 이펙터 기능을 실질적으로 유도하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 상기 이펙터 기능은 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 CDC이다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 이펙터 기능을 실질적으로 유도하지 않으며, 이는 유도된 이펙터 기능의 수준이 상기 항체의 부재하에서 측정된 바와 같이 배경보다 유의하게 높지 않음을 의미한다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 Fey 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 FcyRIIIa, FcyRI, FcyRIla 및/또는 FcyRIlb이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 변이체 인간 lgG1 Fc 영역을 포함하며, 이는 야생형 인간 lgG1 Fc 영역에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 Fc 영역과 비교할 때 Fc 수용체 및/또는 C1 q에 대한 변이체 Fc 영역의 결합을 감소시키거나 폐지하고/하거나 이펙터 기능을 유도하는 상기 항체의 능력을 감소시킨다.
본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 다른 아미노산 잔기, 폴리펩티드 또는 모이어티에 융합될 수도 있고 융합되지 않을 수도 있다. 이러한 융합 단백질은 유전학적 또는 화학적 접근을 포함한 임의의 적절한 방식으로 제조될 수 있다. 상기 연결된 모이어티는 분비 또는 리더 서열, 검출, 발현, 분리 또는 정제를 돕는 서열, 또는 예를 들어 재조합 생산 동안 단백질 안정성을 증가시키는 서열을 포함할 수 있다. 잠재적 모이어티의 비제한적인 예는 베타-갈락토시다제, 글루타티온-S-전이효소, 루시퍼라제, T7 중합효소 단편, 분비 신호 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 독소, 리포터 효소, 폴리-히스티딘 태그와 같은 금속 이온과 결합할 수 있는 모이어티, 검출 및/또는 정제에 적합한 태그, 동종- 또는 이종-결합 도메인, 단백질의 용해도를 증가시키는 모이어티, 또는 효소적 절단 부위를 포함하는 모이어티를 포함한다.
따라서, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 다른 표적 또는 관심 표적 단백질에 결합하기 위한 하나 이상의 모이어티를 임의로 함유할 수 있다. 이러한 추가 모이어티는 항체에 추가의 기능성을 제공할 수도 있고 제공하지 않을 수도 있으며 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 특성을 변형시킬 수도 있고 변형시키지 않을 수도 있음이 명백하다.
치료 방법
본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 다른 질환의 치료에 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 질환은 인간 CCR2에서 CCR2의 바람직하지 않은 존재와 연관되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 질환은 CCR2 양성 세포, 특히 인간 CCR2 양성 세포의 바람직하지 않은 존재와 연관되어 있다. 인간 CCR2 양성 세포는 CD16-음성 단핵구, 호염기구 및 형질세포성 수지상 세포를 포함한다. 또한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 약 20%가 CCR2를 발현한다.
하나의 실시양태에서, 치료하고자 하는 질환은 자가면역 또는 염증성 질환이다. 자가면역 또는 염증성 질환의 비제한적인 예는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염(lupus nephritis), 제1형 당뇨병(type I diabetes), 그레이브스병(Grave's disease), 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD), 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre's Syndrome), 가족성 지중해열(Familial Mediterranean Fever, FMF)과 같은 자가염증성 질환, 크리오피린-관련 주기적 증후군(Cryopyrin-associated periodic syndrome. CAPS), IL-1-수용체 길항제의 결핍(Deficiency of IL-1-Receptor Antagonist, DlIRA), 과잉 IgD 증후군(Hyper IgD Syndrome, HIDS), 자가면역성 심근염(autoimmune myocarditis), 가와사키병(Kawasaki disease), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 간질성 폐질환(interstitial lung disease), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 경피증(scleroderma), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 골관절염(osteoarthritis), 아토피성 피부염(atoptic dermatitis), 백반증(vitiligo), 이식편대숙주병(graft vs. host disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 자가면역 신염(autoimmune nephritis), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), ANCA-관련 혈관염(ANCA-associated vasculitis), 포도막염(uveitis), 경피증(scleroderma), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴 무도병(Huntington's Chorea), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 통풍(gout), 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration), 알레르기(allergy), 천식(asthma), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome, APS), 죽상경화증(atherosclerosis), C3 사구체병증(C3 glomerulopathy) 및 IgA 신병증(IgA nephropathy), 허혈/재관류 손상(ischemia/reperfusion injury), 복막염(peritonitis), 패혈증(sepsis) 및 급성 또는 만성 염증의 결과인 기타 자가면역 질환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 치료하고자 하는 질환은 증식성 질환이다. 특정 실시양태에서, 질환은 암이다. 암의 비제한적인 예는 만성 골수단핵구 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia, CMML), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 비만세포증(mastocytosis)과 같은 혈액학적 악성 종양 및 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 육종, 피부암, 편평 상피세포 암, 골암, 흑색종, 신장세포암, 및 신장암과 같은 비혈액학적 악성 종양을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 질환의 치료 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 질환의 예방 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 예방 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 질환의 치료를 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 질환의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 약제의 제조를 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 약제로서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 의학에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 추가 치료제의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 전형적으로 포유류, 보다 특히 인간이다. 치료 방법에 사용하기 위해, 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편은 양호한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화, 복용 및 투여될 것이다.
약제학적 조성물
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 적어도 하나의 다른 약제학적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 CCR2, 특히 인간 CCR2의 바람직하지 않은 존재와 관련된 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 CCR2 양성 세포, 특히 CCR2 양성 인간 세포의 바람직하지 않은 존재와 관련된 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 개시내용은 포유류, 보다 특히 인간에서의 예방적, 치료적 및/또는 진단적 용도에 적합한 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일반적으로, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 화합물을 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 경구, 비경구, 국소 투여 또는 흡입에 의한 투여에 적합할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 비경구, 예를 들어 정맥내, 또는 근육내 또는 피하 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예를 들어 경구 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 정맥내 또는 피하 투여된다.
특히, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편은 관심의 표적 항원이 수반되는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되거나 사용될 수 있는 하나 이상의 약제학적 활성 화합물과 조합하여 사용될 수 있으며, 그 결과 상승 효과가 수득될 수 있거나 수득되지 않을 수 있다. 이러한 화합물의 예 뿐만 아니라 이들을 투여하기 위한 경로, 방법 및 약제학적 제형 또는 조성물은 임상의에게 명확할 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 CCR2, 특히 인간 CCR2의 바람직하지 않은 존재와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 CCR2 양성 세포, 특히 CCR2 양성 인간 세포의 바람직하지 않은 존재와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 약제로서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환 및/또는 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 이를 필요로 하는 대상체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환 및/또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편을 생체내 투여에 적합한 형태로 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 본 개시내용에 따른 방법에 의해 항체 또는 항체 단편을 수득하는 단계, 및 (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화하는 단계를 포함하며, 이에 의해 항체 또는 항체 단편의 제제가 생체내 투여를 위해 제형화된다. 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 용해된 본 개시내용에 따른 하나 이상의 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효량을 포함한다.
진단적 사용
하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 질환의 진단을 위한 본 개시내용에 따른 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 CCR2, 특히 인간 CCR2 및/또는 마모셋 CCR2의 검출을 위한 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 대상체 또는 샘플을 본 개시내용의 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하여, 대상체 또는 샘플에서 CCR2를 검출하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 대상체 또는 샘플을 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하여 대상체에서 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 항체는 또한 환자로부터의 세포에서 CCR2 발현 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다. CCR2 발현 수준은 예를 들어 환자 층화(stratification)를 위한 치료용 바이오마커로서 작용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 하이브리도마 기술을 사용한 항-CCR2 항체의 생성
항-CCR2 항체는 고전적 하이브리도마 기술을 사용하여 생성하였다. 간단히 말해서, BALB/c 마우스를 인간 CCR2b로 안정적으로 형질감염된 1,000만 개의 CHO 세포로 4주 간격으로 6회 면역화하였다. 비장세포를 X63Ag8 골수종 세포에 융합시키고 하이브리도마를 CCR2-형질감염된 CHO 세포에 대한 특이 결합 및 CCR5-형질감염된 CHO 세포에 대한 결합의 부재에 대해 스크리닝하였다. 하이브리도마를 제한 희석 기술에 의해 클로닝 및 재클로닝하였다.
항체 Y4T3, Y2T63 및 Y1T2를 포함한 여러 항-CCR2 항체가 확인되고 특성화되었다.
실시예 2: 인간 CCR2에 대한 특이성 및 CCR5와의 교차-반응성의 부재
하이브리도마 항체를 형질감염된 CHO 세포에서 발현되는 인간 CCR2에 대한 결합에 대해 시험하였다. 대조군으로서, CHO 세포를 또한 인간 CCR5로 형질감염시켰다. 또 다른 대조군으로서, 형질감염된 CHO 세포에 대한 항-CCR5 항체 MC-1(Mol Biol Cell. 2002 Feb; 13(2):723 737, 자체 생산)의 결합을 또한 시험하였다. 항체를 10μg/ml 및 1μg/ml의 농도에서 시험하였으며 빙상에서 45분 동안 세포와 함께 배양하였다. 냉각 PBS로 3회 세척 단계 후, 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-표지된 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체(Agilent Dako로부터의 R0439, PBS에서 1:200으로 희석)로 검출하였다. PBS로 두 번의 세척 단계 후, 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도를 결정하고 표시하였다.
예시적인 항체 Y4T3에 대한 결과가 도 1에 나타내어져 있다. 항-CCR2 항체 Y4T3는 인간 CCR2에 특이적이었으나, 인간 CCR5에 대한 결합은 보이지 않았다. 항-CCR5 항체 MC-1은 인간 CCR5에 특이적이었으나, 인간 CCR2에 대한 결합은 보이지 않았다.
실시예 3: 인간 단핵구에 대한 결합
이들의 기능적 효과를 발휘하기 위해, 본 발명의 항체는 인간 단핵구에서 발현되는 CCR2에 결합할 필요가 있다. CD16-양성 및 CD16-음성 단핵구에 대한 결합을 측정하였다. 60μl의 리튬-헤파린 항응고된 인간 전혈을 PBS 중의 표시된 농도의 표시된 항체와 함께 빙상에서 45분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-표지된 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체(Agilent Dako로부터의 R0439, PBS에서 1:200으로 희석)로 검출하였다. PBS로 3회의 세척 단계 후 10% 마우스 혈청을 첨가하고 빙상에서 10분 동안 배양하였다. CD3, CD8, CD4, CD123, CD304, CD116 및 CD16에 대해 직접 표지된 항체를 추가로 세척하지 않고 빙상에서 30분 동안 첨가하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(Lysing Solution)(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 CD16-양성 및 CD16-음성 단핵구를 식별하였다. PE에 대한 평균 형광 강도를 이러한 세포 집단에 대해 결정하여 도시하였다. CCR2는 CD16-음성 단핵구에서만 발현되고 CD-16 양성 단핵구에서는 발현되지 않는다. 두 개의 추가 항-CCR2 항체를 또한 시험하였다: 이전에 Millennium(BDBioscience)에서 개발 중이던 MLN1202의 모체 항체인 1D9 및 상업적으로 이용 가능한 항-CCR2 항체인 클론 48607(R&D Systems; 카탈로그#: MAB150).
결과는 도 2에 나타내어져 있다. 예시적인 항체 Y4T3는 CD16-음성 단핵구에는 반응하였으나, CD16-양성 단핵구에는 결합하지 않았다. 또한 대조 항체인 1D9 및 클론 48607은 CD16-음성 단핵구에 대한 결합을 보였지만 CD16-양성 단핵구에 대한 결합은 보이지 않았다. 그러나 Y4T3의 결합은 1D9 및 클론 48607의 결합보다 분명히 더 강했다.
실시예 4: 마모셋 단핵구에 대한 결합
마모셋 원숭이는 확립된 동물 모델이다. 따라서 마모셋 CCR2에 결합하는 것이 매우 바람직하다.
CD16-양성 및 CD16-음성 마모셋 단핵구에 대한 결합을 측정하였다. 마모셋 CCR2에 대한 반응성이 알려진 항-CCR2 항체인 DOC-3(WO2007/115713)을 대조군으로 사용하였다. 마모셋 비장세포를 PBS 중의 표시된 농도의 표시된 항체와 함께 빙상에서 30분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-표지된 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체(Agilent Dako로부터의 R0439, PBS에서 1:200으로 희석)로 검출하였다. PBS로 3회의 세척 단계 후 10% 마우스 혈청을 첨가하고 빙상에서 10분 동안 배양하였다. CD14, CD11b, CD16 및 CD20에 대해 직접 표지된 항체를 추가로 세척하지 않고 빙상에서 20분 동안 첨가하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 CD16-양성 및 CD16-음성 단핵구를 식별하였다. PE에 대한 평균 형광 강도를 이러한 세포 집단에 대해 결정하여 도시하였다.
결과는 도 3에 나타내어져 있다. 예시적인 항체 DOC-3 및 Y4T3는 CD16-음성 마모셋 단핵구에 대한 결합을 입증하였지만, CD16-양성 마모셋 단핵구에 대한 결합은 입증하지 못했다. 항체 Y1T2 및 Y2T63은 CD16-음성 마모셋 단핵구에도 CD16-양성 마모셋 단핵구에도 결합하지 않았다.
항체 Y4T3는 시노몰구스 원숭이의 CCR2에 결합하지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 시노몰구스 원숭이, 레서스 원숭이 및 자나버(Janaver)의 CCR2는 세포외 영역에 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
실시예 5: 인간 CCR2의 ECL2 도메인에 대한 Y4T3의 결합
본 발명의 항체의 특이성을 추가로 조사하기 위해, 다양한 CCR2 작제물에 대한 Y4T3의 결합을 시험하였다. 또한 항체 1D9 및 클론 48607(상기 참조)을 시험하였다. CHO 세포를 표 1에 나타낸 CCR2 작제물로 안정적으로 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(empty)를 또한 분석하였다. 항체를 10μg/ml의 농도에서 시험하였으며 빙상에서 30분 동안 세포와 함께 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-표지된 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체(Agilent Dako로부터의 R0439, PBS에서 1:200으로 희석)로 검출하였다. PBS로 2회의 세척 단계 후, 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도를 세포에서 결정하여 도시하였다.
하기 작제물이 시험되었다:
표 1:
결과는 도 4에 나타내어져 있다. 항체 Y4T3은 인간 CCR2b 및 마모셋 CCR2b에 결합하지만 레서스 CCR2b에는 결합하지 않았다. 항체 Y4T3은 또한 ECL3 도메인이 레서스 CCR2b의 ECL3 도메인으로 대체된 인간 CCR2b 변이체 및 CCR2b의 N-말단이 레서스 CCR2b의 N-말단으로 대체된 인간 CCR2b 변이체에 결합하였다. 항체 Y4T3는 ECL2 도메인이 레서스 CCR2b의 ECL2 도메인으로 대체된 인간 CCR2b 변이체에는 더 이상 결합하지 않았다. 따라서 ECL2 도메인은 Y4T3의 결합에 중요한 아미노산 잔기를 함유한다. 대조적으로, 항체 1D9 및 클론 48607은 모두 레서스 CCR2b와의 반응성을 입증하였다.
실시예 6: 인간 단핵구의 표면으로부터 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절은 인간 단핵구에 대한 Y4T3의 감소된 결합을 초래한다
CCR2가 MCP-1로 세포 표면에서 하향조절될 때 인간 단핵구에 대한 Y4T3의 결합이 감소하는지 여부를 조사하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 인간 PBMC를 37℃에서 30분 동안 다양한 농도의 인간 MCP-1(Peprotec)과 함께 사전배양하였다. 그후, 세포를 4℃로 냉각시키고, Y4T3를 빙상에서 30분 동안 10μg/ml로 첨가하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-표지된 다클론 토끼 항-마우스 면역글로불린 항체(Agilent Dako로부터의 R0439, PBS에서 1:200으로 희석)로 검출하였다. PBS로 2회의 세척 단계 후, 세포를 유세포 분석으로 분석하고 단핵구를 광 산란 특성에 의해 식별하였다. PE에 대한 평균 형광 강도를 단핵구에서 결정하여 도시하였다.
결과는 도 5에 나타내어져 있다. 2μg/ml MCP-1 농도에서 Y4T3으로 얻은 표면 CCR2 신호의 70% 이상이 손실되었다. 더 낮은 농도의 MCP-1이 사용되었을 때 표면 CCR2 신호가 돌아왔다.
이 실험은 Y4T3가 MCP-1로 하향조절될 수 있는 표면 분자에 결합한다는 것을 입증한다.
실시예 7: 인간화를 위한 후보 항체의 선택
지금까지 수득된 실험 데이터에 기반하여 인간화를 위한 후보 항체를 선택하였다. 선도 항체의 특성에 대한 개요는 하기 표에 나타내어져 있다.
표 2:
이용 가능한 실험 데이터에 기반하여 항체 Y4T3가 인간화를 위해 선택되었다. 기준에는 인간 PBMC에서 CCR2에 대한 결합제의 높은 친화도 뿐만 아니라 마모셋 CCR2에 대한 결합제의 탁월한 교차-반응성이 포함되었다.
실시예 8: Y4T3의 인간화
Y4T3을 CDR-이식에 의해 인간화하여 hY4T3을 생성하였다. BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 뮤린 VH 도메인 및 VL 도메인과 비교하기 위해 인간 IgG 서열 및 인간 생식계열 서열의 데이터베이스를 검색하고, 상위 200개의 BLAST 결과로부터 후보 인간 가변 도메인을 선택하였다. 이들을 주요 프레임워크 잔기 및 표준 루프 구조를 유지하면서 프레임워크 상동성의 조합에 기반하여 VH에 대한 5개의 후보(HC1-HC5 또는 H1-H5) 및 VL에 대한 5개의 후보(LC1-LC5 또는 L1-L5)로 축소하였다. 총 25개의 Y4T3의 인간화 변이체가 생성되었다. 인간화 Y4T3 변이체를 유세포 분석에 의해 인간 전혈에서 인간 CCR2+ 단핵구에 대한 결합에 대해 시험하였다. .60μl의 리튬-헤파린 항응고된 인간 전혈을 PBS에서 0.5μg/ml의 표시된 항체와 함께 빙상에서 45분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후 결합된 항체를 CD8, CD4, CD123 및 CD116에 대해 직접 표지된 항체와 함께 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-116-098)로 검출하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 단핵구를 포함한 다양한 세포 유형에서 CCR2 발현을 식별하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 이러한 세포 집단에 대해 결정하여 도시하였다.
결과는 도 6에 나타내어져 있다. 대부분의 결합제는 인간 단핵구에서 발현되는 CCR2에 결합할 수 있었다.
선택된 결합제인 H3L1은 CCR2-양성 단핵구 뿐만 아니라 호염기구, pDC 및 T 세포와 같은 다른 CCR2-양성 세포에도 우수한 결합을 보였다. 선택된 결합제를 hY4T3이라고 한다.
실시예 9: Y4T3 및 hY4T3의 서열 결정.
Y4T3 및 hY4T3의 서열을 표준 시퀀싱 기술에 의해 결정하였다.
Kabat 및 IMGT 명명법에 따른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 뿐만 아니라 CDR 영역은 아래 표에 나타내어져 있다.
표 3:
hY4T3의 가변 중쇄에 가장 가까운 생식계열 유전자는 IGHV1-3*01이다. hY4T3의 가변 경쇄에 가장 가까운 생식계열 유전자는 IGKV2-30*01이다. 표 4 참조.
표 4:
가장 가까운 생식계열 서열과 비교하여, hY4T3의 가변 중쇄는 하나의 아미노산이 상이하다. 프레임워크 영역 2에서, 메티오닌 잔기가 이소류신 잔기로 대체되어 산화를 감소시킨다. 유사하게, 가변 경쇄의 프레임워크 영역 3에서, 세린 잔기는 트레오닌 잔기로 대체된다.
실시예 10: hY4T3는 CCR2+ 인간 단핵구에 결합한다.
CCR2+ 인간 단핵구에 대한 hY4T3의 결합을 유세포 분석에 의해 인간 PBMC로 시험하였다. 인간 PBMC를 PBS 중의 다양한 농도의 hY4T3과 함께 빙상에서 30분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 결합된 항체를 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-116-098)로 검출하였다. PBS로 3회의 세척 단계 후 5% 마우스 및 5% 랫트 혈청을 빙상에서 10분 동안 첨가하였다. CD20, CD14, CD11b, CD16에 대해 직접 표지된 항체를 세척하지 않고 첨가하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 단핵구에서 CCR2 발현을 확인하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 결정하여 도시하였다. hY4T3는 인간 단핵구에 대한 결합 특성을 유지하였다. 결과는 도 7에 나타내어져 있다.
실시예 11: hY4T3는 CCR2+ 마모셋 단핵구에 결합한다
CCR2+ 마모셋 단핵구에 대한 hY4T3의 결합을 실시예 10에 기재된 바와 같이 마모셋 비장세포를 사용하여 시험하였다. hY4T3는 마모셋 단핵구에 대한 결합 특성을 유지하였다. 결과는 도 8에 나타내어져 있다.
실시예 12: hY4T3는 형질감염된 CHO 세포에서 발현된 CCR5에 결합하지 않는다
Y4T3와 마찬가지로, Y4T3의 인간 IgG1 키메라 변이체(Y4T3-chim) 및 hY4T3도 인간 CCR5로 형질감염된 CHO 세포에 결합하지 않는다. Y4T3-chim 및 hY4T3는 인간 CCR2로 형질감염된 CHO 세포에 결합한다. 항체를 10μg/ml 및 1μg/ml의 농도로 시험하였으며 빙상에서 45분 동안 세포와 함께 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 결합된 항체를 빙상에서 30분 동안 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-116-098)로 검출하였다. PBS로 2회의 세척 단계 후, 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 결정하여 도시하였다. 결과는 도 9에 나타내어져 있다.
실시예 13: hY4T3은 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향 조절을 차단한다
hY4T3의 기능적 활성을 조사하기 위해, CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 다양한 백혈구 서브세트에서 측정하였다. 호염기구, 형질세포성 수지상 세포 및 CD16 저 단핵구를 시험하였다.
세포를 먼저 37℃에서 30분 동안 다양한 농도의 hY4T3, MCP-1 또는 배지(RPMI)와 함께 배양하였다. 그후, MCP-1, hY4T3 또는 RPMI를 첨가한 다음 37℃에서 30분 동안 또 다른 배양을 수행하였다. 1차 및 2차 배양 단계 사이에 세포를 세척하지 않았다. 세포는 2차 배양 후 PBS로 3회 세척하였다. 표면 결합된 항체를 CD3, CD8, CD4, CD123, CD304, CD116 및 CD16에 대해 직접 표지된 항체와 함께 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-116-098)로 검출하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 호염기구, 형질세포성 수지상 세포 및 CD16low 단핵구를 포함한 다양한 세포 유형에서 CCR2 발현을 확인하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 이러한 세포 집단에 대해 결정하여 도시하였다.
결과는 도 10에 나타내어져 있다. MCP-1과의 사전-배양은 용량-의존적 방식으로 CCR2에 대한 hY4T3의 결합을 감소시켰다. 세포를 hY4T3과 먼저 배양한 경우, 결합 강도는 MCP-1과의 후속 배양에 의해 거의 영향을 받지 않았다.
이것은 hY4T3이 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단한다는 것을 보여주며, 이는 hY4T3이 MCP-1에 의한 CCCR2의 활성화를 차단함을 나타낸다.
실시예 14: hY4T3으로 처리된 마모셋에서의 세포의 고갈
마모셋 원숭이를 느린 정맥 주사에 의해 0 시점에 5mg/kg hY4T3로 처리하였다. 처리 전 및 후의 다양한 시점에서 전혈을 유세포 분석에 의해 분석하였다. EDTA로 항응고된 전혈을 PBS에서 3μg/ml의 hY4T3과 함께 빙상에서 30분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후 결합된 항체를 CD3, CD20, CD14, CD11b 및 CD16에 대해 직접 표지된 항체와 함께 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, 109-116-098)로 검출하였다. 0.9% NaCl로 2회의 세척 단계 후 적혈구를 암흑에서 10분 동안 용해액(BDBioscience)으로 용해시켰다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고 유세포 분석으로 분석하여 다양한 세포 집단을 식별하였다. 실험은 세 마리의 원숭이를 대상으로 수행하였다.
한 마리의 원숭이에 대한 대표적인 결과가 도 11에 나타내어져 있다. CD3-양성 세포, CD3-양성/CCR2-양성 세포, CD16-양성 NK 세포 및 형질세포성 수지상 세포(pDC)의 비율은 유의하게 변하지 않았다. B 세포의 비율은 hY4T3으로 처리시 증가하였지만 23일째에 원래 수준(즉, 전처리 수준)으로 다시 떨어졌다. 호염기구의 수는 hY4T3으로 처리시 크게 감소하였지만 처리 후 약 1-2주에 원래 수준으로 돌아왔다. CD16-음성 단핵구에 대해서도 동일한 패턴이 관찰되었으며, 이는 hY4T3으로 처리시 크게 감소하였다. 수치는 처리 후 약 2주에 원래 수준으로 돌아왔다.
이것은 본 개시내용의 항체 및 항체 단편이 염증성 질환, 자가면역 질환, 혈액학적 악성 종양 및 잠재적으로 CCR2의 발현과 관련된 다른 질환의 치료에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 15: 개발 가능성 - hY4T3은 유리한 온도 안정성을 갖는다
hY4T3이 성공적인 임상 개발을 나타내는 융점을 갖는지 여부를 시험하기 위해 Microcal VP-DSC(Malvern)를 사용하여 시차 주사 열량법에 의해 융점을 측정하였다. PBS + 100mM L-아르기닌 중의 hY4T3의 8.44mg/ml 용액의 온도를 분당 1℃의 속도로 25 - 130℃로 증가시켰다.
CH2 도메인의 융점은 70.9℃로 결정되었다(Tm1). Fab 도메인 및 CH3 도메인은 75.1℃의 융점을 갖는다(Tm2). 분자의 완전한 용융은 82.5℃에서 발생하였다(Tm3).
hY4T3의 안정성을 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 추가로 조사하였다. PBS + 100mM L-아르기닌 중의 hY4T3의 8.44mg/ml 용액을 각각 55, 65 또는 75℃에서 3시간 동안 배양한 다음 Superdex 200 Increase를 사용하여 분석적 SEC를 수행하고 280nm에서 단백질의 광도 검출을 수행하였다. 결과는 도 12에 나타내어져 있다. 55℃에서 3시간 동안 배양한 hY4T3의 SEC 패턴은 기준, 즉 4℃에서 유지된 항체와 구별할 수 없었다. 65℃에서 3시간 동안 배양 후 불용성 변성 단백질의 생성으로 인해 신호의 50% 이상이 손실되었다. 75℃에서 3시간 동안 hY4T3의 배양시 불용성 변성 단백질의 생성으로 인해 대부분의 항체가 손실되었다. 분해 생성물 또는 가용성 응집물이 거의 없었다.
CHO 세포에서 CCR2에 대한 hY4T3의 결합도 마찬가지로 조사하였다. PBS + 100mM L-아르기닌 중의 hY4T3의 8.44mg/ml 용액을 각각 55, 65 및 75℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그후 항체 제제를 상기한 바와 같이 CHO 세포에서 CCR2에 대한 결합에 대해 시험하였다. 결과는 도 13에 나타내어져 있다. 55℃에서 2시간 동안 배양한 hY4T3는 기준, 즉 4℃에서 유지된 항체와 동일한 정도의 CHO 세포에 대한 결합을 보였다. 65℃에서 2시간 동안 배양 후 약간의 결합 손실이 관찰되었다. hY4T3를 75℃에서 2시간 동안 배양하면 결합이 손실되었다.
hY4T3은 또한 PBS 및 혈청(데이터는 표시되지 않음)에서 다양한 항체 농도(0.015625, 0.0625, 0.25 및 1μg/ml)에서 적어도 14일(시험된 가장 긴 시점) 동안 37℃에서 안정하였다. 이러한 데이터는 hY4T3의 융점이 매우 유리하다는 것을 나타내며, 이는 성공적인 임상 개발을 뒷받침한다. 항체는 55℃에서 적어도 2시간 동안 안정하다.
실시예 16: 개발 가능성 - hY4T3은 유리한 동결-해동 안정성을 갖는다
반복적인 동결 및 해동에 대한 hY4T3의 거동을 시험하기 위해, hY4T3(PBS + 100mM L-아르기닌 중의 8,44mg/ml)를 반복적인 동결-해동 사이클에 적용하였다. 10회 사이클의 동결 및 해동 후, 샘플을 SEC에 적용하였으며 기준과 비교하여 차이를 관찰할 수 없었다(데이터는 표시되지 않음).
hY4T3의 샘플(PBS + 100mM L-아르기닌 중의 8,44mg/ml)을 또한 다양한 동결-해동-사이클 후 CHO 세포에서 CCR2에 대한 결합에 대해 시험하였다. 결과는 도 14에 나타내어져 있다. 최대 10회 사이클의 동결 및 해동에서, 제제는 CHO 세포에서 발현되는 CCR2에 대한 결합의 손실을 보이지 않았다.
이러한 데이터는 hY4T3가 안정하다는 것을 추가로 나타내며, 이는 성공적인 임상 개발을 뒷받침한다.
실시예 17: 개발 가능성 - hY4T3는 넓은 pH 범위에 걸쳐 안정하다
다양한 pH 범위에서 hY4T3의 거동을 시험하기 위해 hY4T3를 다양한 pH의 완충액에서 2시간 동안 다양한 항체 농도에서 배양하였다.
이를 위해, PBS + 100mM L-아르기닌 중의 hY4T3의 8.44mg/ml 용액을 물로 1:5로 용해시키고 pH를 HCl/NaOH를 사용하여 원하는 값으로 조정하였다. 그후 샘플을 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 HCl/NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 재조정하였다.
CHO 세포에서 발현된 CCR2에 대한 샘플의 결합은 다양한 농도의 pH 노출된 항체를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 15에 나타내어져 있다.
기준 샘플(pH 6,82)과 비교하여, 2만큼 낮은 pH로의 배양은 CHO 세포에서 발현되는 CCR2에 대한 결합에 영향을 미치지 않았다. pH 9에서의 배양은 약간의 결합 손실을 보였다.
다시 말하지만, 이러한 데이터는 hY4T3가 매우 낮은 pH에서도 매우 안정하다는 것을 나타내며, 이는 성공적인 임상 개발을 다시 한 번 강력하게 뒷받침한다. 항체는 pH3.0 및 22℃에서 적어도 2시간 동안 안정하다.
실시예 18: 개발 가능성 - hY4T3는 혈장에서 안정하다
혈장에서 hY4T3의 거동을 시험하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. hY4T3을 PBS 및 인간 혈장에서 48시간, 7일 및 14일 동안 다양한 농도로 배양하였다.
이를 위해, 23.7μl hY4T3(100mM L-아르기닌을 갖는 PBS 중의 8.44mg/ml)를 176.3μl PBS 또는 인간 리튬-헤파린 혈장(1mg/ml)과 혼합하고 37℃에서 0시간, 48시간 또는 14일 동안 배양하였다. 그후, CHO 세포에 발현된 CCR2에 대한 샘플의 결합을 다양한 농도의 노출된 항체를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 16에 나타내어져 있다.
CHO 세포에서 발현된 CCR2에 대한 결합은 배양 시간 간격에 의존하지 않았다. PBS에서의 배양과 인간 혈장에서의 배양 사이에는 차이가 없었다.
이 실험은 hY4T3의 유리한 생화학적 특성을 추가로 확인시켜 준다.
실시예 19: 선행 기술 항체와의 비교
항체 Y4T3을 선행 기술 항체 DOC2, 1D9 (BDBioscience) 및 클론 48607 (R&D Systems; 카탈로그#: MAB150)과 비교하였다. DOC-2 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
VH:
(서열 번호 28)
VL:
(서열 번호 29)
인간 헤파린화 전혈을 표시된 항체와 함께 빙상에서 45분 동안 배양하고, 냉각 PBS로 3회 세척한 다음 2차 PE-표지된 토끼-항-마우스 Ig(R0439, DakoCytomation 1:200)로 빙상에서 30분 동안 염색하고, 냉각 PBS로 3회 세척하였다. 10% 마우스 혈청을 10분 동안 첨가하고 그 후 CD3-APCCy7, CD8-PE-Cy7, CD4-V500, CD123-PerCP, CD304-APC, CD116-FITC, CD16-PB에 대해 직접 표지된 항체를 첨가하였다. BD 용해액으로 적혈구를 세척하고 용해한 후 FACSCanto-II에서 세포를 획득하고 FACS-DIVA 소프트웨어로 분석하였다. 고전적 단핵구를 광 산란 특성, CD116의 발현 및 CD16 및 CD123의 부재에 의해 식별하였다. PE에 대한 중간 형광 강도는 고전적 단핵구에 대해 도시되어 있다.
결과는 도 17에 나타내어져 있다. Y3T3의 친화도는 시험된 선행 기술 항체의 친화도보다 5배 이상 높았다.
실시예 20: hY4T3은 마우스 CCR2와 교차-반응하지 않는다
마우스 CCR2 CHO 세포 및 인간 CCR2 CHO 세포를 PBS 또는 다양한 농도의 MC-21(마우스 CCR2에 대한 랫트 단클론 항체; 레겐스부르크 대학교)과 함께 빙상에서 45분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 세포를 빙상에서 30분 동안 비오틴-항-랫트 IgG2b 항체(5μg/ml; BD Clone RG7/11.1, Cat No. 553898)로 염색하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 세포를 빙상에서 30분 동안 스트렙타비딘-PE(1:100)로 염색하였다. 냉각 PBS로 3회 세척 단계 후 세포를 FACS로 분석하여 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였다.
마우스 CCR2 CHO 세포 및 인간 CCR2 CHO 세포를 PBS 또는 다양한 농도의 hY4T3과 함께 빙상에서 45분 동안 배양하였다. 냉각 PBS로 3회의 세척 단계 후, 세포를 빙상에서 30분 동안 PE-F(ab)2 염소 항 인간 IgG(1:300; Jackson, Cat.No.109-116-098)로 염색하였다. 냉각 PBS로 3회 세척 단계 후 세포를 FACS로 분석하여 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였다.
결과는 도 18에 나타내어져 있다. hY4T3은 마우스 CCR2에 결합하지 않는다. MC-21은 인간 CCR2에 결합하지 않는다.
실시예 21: 케모카인 수용체 CCR2를 효율적으로 차단하는, hY4T3의 길항 효과
PathHunter® eXpress CCR2 CHO-K1 β-Arrestin GPCR 분석(DiscoverX; Cat# 93-0192E2CP0M)을 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 hY4T3의 길항 활성을 평가하였다. 키트로부터의 CCR2 CHO K1 β-Arrestin GPCR 세포를 해동하고, 시딩하고, 37℃ 및 5% C02에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, CCL2(MCP-1), hY4T3, 고정된 농도의 CCL2(EC20, EC50 및 EC80)와 함께 30분 동안 사전-배양된 hY4T3 또는 항 IgG 항체(Biorad; #MCA5748G)와 함께 30분 동안 사전-배양된 hY4T3를 제조하여 세포에 첨가하였다. 37℃ 및 5% C02에서 90분 배양 후, 검출 시약을 플레이트에 첨가하고 60분 후 Envision 플레이트 판독기에서 발광을 측정하였다.
결과는 도 19에 나타내어져 있다. 이 실험은 hY4T3가 시험된 조건 중 어느 것에서도 작용 활성이 없는 강력한 CCR2 길항제임을 입증한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (15)
- 인간 CCR2에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 10의 HCDR1 영역, 서열 번호 11의 HCDR2 영역, 서열 번호 12의 HCDR3 영역, 서열 번호 13의 LCDR1 영역, 서열 번호 14의 LCDR2 영역 및 서열 번호 15의 LCDR3 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 22의 VH 및 서열 번호 23의 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 인간 lgG1 부류의 항체인 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 결합하는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 마모셋 CCR2와 교차-반응하지만, 레서스 CCR2와는 교차-반응하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 CCR5(서열 번호 6)에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에 발현된 인간 CCR2에 대해 더 높은 친화도를 갖고, 바람직하게는 적어도 5배 더 높은 결합 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 백혈구에서 CCR2의 MCP-1 유도된 하향조절을 차단하는 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항체 또는 항체 단편이 단클론 항체 또는 항체 단편 및/또는 인간화 항체 또는 항체 단편인 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 의학에서 사용을 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편으로서, 바람직하게는 상기 치료가 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 혈액학적 악성 종양의 치료인 단리된 항체 또는 항체 단편.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 복수의 핵산 서열을 포함하는 핵산 조성물.
- 제11항의 핵산 조성물을 포함하는 벡터.
- 제12항의 벡터 또는 제11항의 핵산 조성물을 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 인간 CCR2의 ECL-2 도메인(서열 번호 2)에 특이적인 단리된 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 22의 VH 및 서열 번호 23의 VL을 포함하고, 상기 항체 또는 항체 단편이 마모셋 CCR2와 교차-반응하지만, 레서스 CCR2와는 교차-반응하지 않으며, 상기 항체 또는 항체 단편이 0.1-1.0μg/ml의 항체 농도에서 서열 번호 28의 가변 중쇄 및 서열 번호 29의 가변 중쇄를 포함하는 항체보다 인간 단핵구에서 발현되는 인간 CCR2에 대해 더 높은 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 항체 단편.
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