KR20240095463A - 변형된 IgG1 Fc 도메인 및 그와의 항-CD40 도메인 항체 융합체 - Google Patents

변형된 IgG1 Fc 도메인 및 그와의 항-CD40 도메인 항체 융합체 Download PDF

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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

Fc-감마-수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 변형된 IgG1 Fc 도메인이 제공된다. 변형된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 항체 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 항체 폴리펩티드는 단일 VH 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 도메인 항체 (dAb)의 융합체이다. 항체 폴리펩티드는 CD40 효능제 활성을 나타내지 않고, 미성숙 수지상 세포를 실질적으로 활성화시키지 않고, 개선된 생물물리학적 특성을 갖는다.

Description

변형된 IgG1 Fc 도메인 및 그와의 항-CD40 도메인 항체 융합체{MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH}
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 5월 23일에 생성된 상기 ASCII 카피는 200896_0014_00_WO_ST25.txt로 명명되고, 크기가 245,881 바이트이다.
기술 분야
Fc-감마-수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 변형된 IgG1 Fc 도메인이 제공된다. 항-CD40 단일 가변 도메인 및 변형된 Fc 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드가 제공된다. 항체 폴리펩티드는 CD40에 결합하고, CD40 효능제 활성을 나타내지 않고, 미성숙 수지상 세포를 활성화시키지 않고, 치료제로서의 개발에 적합한 개선된 생물물리학적 특성을 갖는다. 그를 포함하는 조성물, CD40 활성을 수반하는 질환의 치료를 위한 사용 방법, 및 CD40 활성을 수반하는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도가 제공된다.
CD40은 수지상 세포, B 세포 및 대식세포를 포함한 항원 제시 세포 (APC) 상에 존재하는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 공동-자극 분자이다. CD40이 TH 세포 상의 그의 리간드인 CD154 (CD40L)에 결합하는 경우에 APC가 활성화된다. CD40-매개 APC 활성화는 시토카인 생산, 공동-자극 분자 (예컨대 CD86)의 상향-조절, 및 증진된 항원 제시 및 B 세포 증식을 포함한 다양한 면역 반응에 수반된다. CD40은 또한 내피 세포, 평활근 세포, 섬유모세포 및 상피 세포에 의해 발현될 수 있다.
CD40 활성화는 또한 예를 들어 자가면역, 이식 거부 또는 알레르기 반응에 관련된 다양한 바람직하지 않은 T 세포 반응에 수반된다. 바람직하지 않은 T 세포 반응을 제어하기 위한 하나의 전략은 CD40을 길항작용 항체로 표적화하는 것이다. 예를 들어, 이전에 카이론(Chiron) 1212로 공지된 모노클로날 항체 HCD122 (루카투무맙)가 현재 특정 CD40-매개 염증성 질환의 치료를 위해 임상 시험 중이다. 인터넷 상 hypertext transfer protocol: clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209 (최종 업데이트: 2011년 1월 11일)에서의 ["Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma," Clinical Trials Feeds]을 참조한다. 그러나, 모노클로날 항체는 효능제 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 항-CD40 항체 Chi220의 유용성은 그의 약한 자극 잠재력에 의해 제한된다. 문헌 [Adams, et al., 2005, "Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival," J. Immunol. 174: 542-50]을 참조한다.
면역 질환의 치료 및/또는 예방에서 CD40 활성화를 조정하는 치료제에 대한 진행 중인 필요가 존재한다.
FC-감마-수용체에 대한 결합을 감소시키는 카바트 위치 238에서의 돌연변이이며, 여기서 프롤린 238 (P238)은 리신, 세린, 알라닌, 아르기닌 및 트립토판으로부터 선택되는 잔기 중 1개로 돌연변이된 것인 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드가 제공된다. IgG1 Fc는 서열식별번호(SEQ ID NO): 65의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
카바트 위치 238에서 치환된 리신을 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드가 제공된다. 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure pat00001
(A) 이종 폴리펩티드; 및 (B) 상기 기재된 바와 같은 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다.
(1) 단일 가변 도메인이며, 상기 단일 가변 도메인이 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 1의 CDR1 영역과 최대 2개의 아미노산만큼 상이한 CDR1 영역, (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 2의 CDR2 영역과 최대 3개의 아미노산만큼 상이한 CDR2 영역, 및 (c) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 3의 CDR3 영역과 최대 6개의 아미노산만큼 상이한 CDR3 영역을 포함하고, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 CD40에 결합하는 것인 단일 가변 도메인; 및 (2) FC-감마-수용체에 대한 결합을 감소시키는 카바트 위치 238에서의 돌연변이이며, 여기서 프롤린 238 (P238)은 리신, 세린, 알라닌, 아르기닌 및 트립토판으로부터 선택되는 잔기 중 1개로 돌연변이된 것인 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드인 Fc 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 본원에 기재된 항체 폴리펩티드의 단일 가변 도메인은 CD40의 적어도 하나의 활성에 길항한다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드는, 동일한 단일 가변 도메인 서열을 갖고 야생형 IgG1 Fc 도메인에 융합된 참조 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는다. (1) 상기 기재된 바와 같은 단일 가변 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 인간 IgG1 Fc 도메인은 카바트 위치 238에서 치환된 리신을 갖는다. 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure pat00002
(a) CDR1 영역이 서열 X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (서열식별번호: 4)로 이루어지며, 여기서 X1은 Asp 또는 Gly이고, Y1은 Met 또는 Leu이고; (b) CDR2 영역이 서열 Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (서열식별번호: 5)로 이루어지며, 여기서 X2는 Gln, Tyr, His, Trp, 또는 Ala이고, Y2는 Thr, Asn, Gly, Ser, 또는 Gln이고, Z2는 Arg, Leu, Tyr, His, 또는 Phe이고, A2는 Lys 또는 Met이고; (c) CDR3 영역이 서열 X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3 (서열식별번호: 6)으로 이루어지며, 여기서 X3은 Leu, Pro, 또는 Glu이고, Y3은 Phe, Gln, Thr, Met, 또는 Tyr이고, Z3은 Arg, Tyr, Pro, Leu, Thr, Ile, Phe, Met, 또는 Ser이고, A3은 Phe 또는 Tyr이고, B3은 Ser, Gln, His, Asp, Lys, Glu, 또는 Gly이고, C3은 Asp, Tyr, Glu, 또는 Ser인 상기 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
(a) CDR1 영역이 서열식별번호: 1 (3h-56-269의 CDR1)의 아미노산 서열로 이루어지고, (b) CDR2 영역이 서열식별번호: 2 (3h-56-269의 CDR2)의 아미노산 서열로 이루어지고, (c) CDR3 영역이 서열식별번호: 3 (3h-56-269의 CDR3)의 아미노산 서열로 이루어진 것인 상기 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드가 추가로 제공된다. 단일 가변 도메인의 아미노산 서열이 서열식별번호: 41 (= 3h-56-269 서열)에 제시된 것인 상기 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 항체 폴리펩티드가 제공된다.
Figure pat00003
하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 항체 폴리펩티드가 제공된다.
Figure pat00004
본 개시내용의 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 또는 항체 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산이 추가로 제공된다. 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 또한 제공된다. 발현 벡터로 형질전환된 세포가 제공된다.
상기 기재된 항체 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
대상체에게 상기 기재된 항체 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 면역 질환은 애디슨병, 알레르기, 아나필락시스, 강직성 척추염, 천식, 아테롬성동맥경화증, 아토피성 알레르기, 귀의 자가면역 질환, 눈의 자가면역 질환, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 기관지 천식, 관상동맥 심장 질환, 크론병, 당뇨병, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 염증성 장 질환, 재조합 약물 제품 (예를 들어, 혈우병환자에서의 인자 VII)에 대한 면역 반응, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 천포창, 건선, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상선염, 이식 거부, 혈관염, 및 궤양성 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
도 1A 및 1B를 포함하는 도 1은 본 개시내용의 유용한 대표적인 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다. 도 1A는 단일 가변 도메인 항체 BMS3h-56-269 (서열식별번호: 41) 및 Fc 도메인 (IgG1a-P238K; 서열식별번호: 66)의 항체 폴리펩티드 융합체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 70)을 도시한다. Fc 도메인 (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열은 이탤릭체표시되고; 밑줄표시된 이탤릭체 잔기 23 (카바트 위치 238에 상응함)은 프롤린에서 리신으로의 돌연변이이다. 도 1B는 단일 가변 도메인 항체 BMS3h-56-269 (서열식별번호: 41) 및 또 다른 Fc 도메인 (IgG1f-P238K; 서열식별번호: 67)의 항체 폴리펩티드 융합체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 71)을 도시한다. Fc 도메인 (서열식별번호: 67)의 아미노산 서열은 이탤릭체표시된다. 도 1A 및 1B 둘 다에서, 단일 가변 도메인의 3개의 상보성-결정 영역, CDR1 (서열식별번호: 1), CDR2 (서열식별번호: 2) 및 CDR3 (서열식별번호: 3)은 밑줄표시된다. 4개의 프레임워크 영역, FR1 (서열식별번호: 42), FR2 (서열식별번호: 44), FR3 (서열식별번호: 47) 및 FR4 (서열식별번호: 54)의 아미노산은 밑줄표시되어 있지 않다. 링커 아미노산 서열 AST (서열식별번호: 57)는 이중-밑줄표시되어 있다.
도 2A-2E를 포함하는 도 2는 최대 9종의 iDC 공여자에 대한 dAb-Fc 융합체의 다양한 농도에서의 iDC 활성화 데이터를 도시한다. 도 2A-2D: CD86 발현 (도 2A), ICAM-1 발현 (도 2B), IL-6 방출 (도 2C) 및 TNF-알파 방출 (도 2D)에 대한 BMS-986090 (IgG4 Fc와 융합된 항-CD40 dAb), CD40L (가용성 CD40L 삼량체 (이소류신 지퍼 삼량체화 모티프를 통함) 및 mAb 134-2141 (효능작용 항-CD40 항체)의 용량 반응. ChiL6-IgG4 (대조군-L6): 음성 대조군. 비자극: iDC 단독 (비자극됨). μg/ml 단위의 농도가 표시된다. 도 2E는 최대 9종의 공여자로부터 100 μg/ml 처리된 iDC에서의 BMS-986090과 3h-59-269-aba (dAb-IgG1 융합체)의 비교를 도시한다.
도 3A-3D를 포함하는 도 3은 CD86 발현 (도 3A), ICAM 발현 (도 3B) 및 시토카인 방출 (도 3C에서 IL-6 및 도 3D에서 TNF-알파)에 의해 측정시 iDC 활성화가 3h-59-269-IgG4의 CD32 매개 가교/클러스터링에 의해 증가한다는 것을 도시한다. 용액 중에서 또는 가교되어 ('x-link') 표시된 농도 (μg/ml 단위)로 처리된 iDC가 표시되며; 가교는 CD32-발현 CHO 세포의 첨가를 지칭한다. ChiL6-IgG4는 음성 대조군으로서의 역할을 한다.
도 4는 IgG4, IgG1.1f, IgG1.3f, 및 CT Fc 테일을 갖는 항-CD40 dAb를 사용한 iDC 활성화 검정으로부터의 데이터를 도시한다. L6-IgG4 (ChiL6-IgG4)는 음성 대조군으로서의 역할을 하고; 효능작용 항-CD40 mAb1234-2141은 양성 대조군이다. iDC는 표시된 농도 (μg/ml)로 처리된다. iDC 배양물에 대한 CD32 발현 CHO 세포의 첨가 (우측 패널)는 3h-59-269-CT를 제외한 모든 융합 단백질에 대해 시토카인 방출의 큰 증가 및 활성화 마커 상향조절을 야기한다.
도 5A-5E를 포함하는 도 5는 dAb-Fc 분자에 대한 DSC 온도기록도 데이터를 도시한다. 도 5A) 3h56-269-IgG4.1. 도 5B) 3h56-269-CT. 도 5C) 3h56-269-IgG1-D265A. 도 5D) 3h56-269-IgG1.1f. 도 5E) 3h56-269-IgG1.3f. 각각의 패널에서, 굵은 선은 온도기록도 데이터를 나타내고, 보다 가는 선은 가장 단순한 최적 피트를 나타낸다.
도 6A-6F를 포함하는 도 6은 dAb-Fc 분자에 대한 icIEF 데이터를 도시한다. 도 6A) 3h56-269-IgG4.1. 도 6B) 3h56-269-CT. 도 6C) 3h56-269-CT (UCOE-CHO 세포로부터 생산됨). 도 6D) 3h56-269-IgG1-D265A. 도 6E) 3h56-269-IgG1.1f. 도 6F) 3h56-269-IgG1.3f. pI 마커는 패널 A에서 pI 5.85 및 pI 10.10에 표시된다.
도 7은 1 μM에서 4종의 1F4 항체의 결합을 갖는 7 μg/ml hCD64-His의 포획에 대한 SPR 센소그램 데이터를 도시한다.
도 8은 pI 값이 표지된, 상이한 Fc 도메인을 갖는 13종의 1F4 모노클로날 항체에 대한 icIEF 데이터를 도시한다.
도 9는 3h-59-269-IgG1-P238K 및 3h-59-269-IgG1-N297A에 대한 iDC 활성화 데이터를 도시한다. L6-IgG4 (ChiL6-IgG4)는 음성 대조군으로서의 역할을 하고; BMS-986090 (3h-59-269-IgG4)은 양성 대조군이다. iDC는 표시된 농도 (μg/ml)의 항체로 처리된다. iDC 배양물에 대한 CD32-발현 CHO 세포의 첨가 ("+CD32 CHO"로 표시된 각각의 그래프의 좌측 상의 데이터)는 양성 대조군 3h-59-269-IgG4에 대해서는 시토카인 방출의 큰 증가 및 활성화 마커 상향조절을 야기하지만, 위치 P238 또는 위치 N297에서 단일 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 테일에 융합된 dAb에서는 그렇지 않다.
도 10은 상이한 Fc 테일을 갖는 항-CD40 도메인 항체-Fc 융합 단백질에 대한 iDC 활성화를 도시한다. L6-IgG4 (ChiL6-IgG4)는 음성 대조군으로서의 역할을 하고; 효능작용 mAb1234-2141 및 BMS-986090 (3h-59-269-IgG4)은 양성 대조군이다. iDC는 표시된 농도 (μg/ml)의 항체로 처리된다. iDC의 활성화는 모든 융합 단백질에서 관찰되고, P238K 또는 N297A 돌연변이를 함유하는 융합체를 제외하고, CD32 발현 CHO의 첨가 ("+CD32 CHO"로 표시된 각각의 그래프의 좌측 상에 제시됨)로 증가된다.
도 11A-11D를 포함하는 도 11은 dAb-Fc 분자에 대한 DSC 온도기록도 데이터를 도시한다. 도 11A) 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S. 도 11B) 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K. 도 11C) 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K. 도 11D) 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A.
본 상세한 설명에 따라, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어 "항체"에 대한 언급은 복수의 이러한 항체를 포함하고, "투여량"에 대한 언급은 하나 이상의 투여량 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고, 사용되는 문맥에 따라 어느 정도까지 변경될 것이다. 일반적으로, 약은 참조 값의 ± 10%인 값의 범위를 포괄한다.
본원에 제시된 범위 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분 정수는 본원에 포함되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 약어:
APC 항원 제시 세포
CD54 ICAM-1로도 지칭됨
CDR 상보성 결정 영역
CH 불변 중쇄
CL 불변 경쇄
CHO 세포 차이니즈 햄스터 난소 세포
dAb 도메인 항체
DSC 시차 주사 열량측정
FcgR Fc-감마 수용체 (FcγR과 상호교환가능함)
FR 프레임워크 영역
FSB 소 태아 혈청
GM-CSF 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자
iDC 미성숙 수지상 세포
icIEF 영상화 모세관 등전 포커싱
IFN 인터페론
IgG 이뮤노글로불린 G
IL-4 인터류킨-4
IL-6 인터류킨-6
mAb 모노클로날 항체
mg 밀리그램
ml 또는 mL 밀리리터
ng 나노그램
pI 등전점
SPR 표면 플라즈몬 공명
TNF 종양 괴사 인자
μg 마이크로그램
VL 가변 경쇄
VH 가변 중쇄
추가의 약어 및 정의가 본원에 제공된다.
1. Fc 도메인
중쇄의 카르복시-말단 "절반"은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역 (Fc)을 규정한다. 본원에 사용된 용어 "Fc 도메인"은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)]에 따라 규정된 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 불변 영역 항체 서열을 지칭한다. 본원에 개시된 Fc 도메인은 인간 IgG, 및 보다 구체적으로 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된다. 인간 IgG1 Fc 도메인은 카바트 위치 238에서 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 프롤린 238 (P238)을 리신 (K), 세린 (S), 알라닌 (A), 아르기닌 (R) 및 트립토판 (W)으로부터 선택되는; 또는 리신 및 세린으로부터 선택되는; 또는 리신으로부터 선택되는 아미노산으로 치환한다.
IgG1 Fc 도메인에 대한 예시적인 컨센서스 서열은 하기와 같다:
Figure pat00005
,
여기서 X는 K, S, A, R 또는 W이고, Z는 K 또는 부재이다. 이 서열에서, 위치 23 (밑줄표시된 X)은 카바트 위치 238에 상응한다.
예시적인 IgG Fc 도메인 서열은 표 1에 있다. 돌연변이된 잔기는 밑줄표시된다. 서열식별번호: 134 및 135는 추가의 예시적인 IgG Fc 도메인 서열이다.
표 1
Figure pat00006
인간 IgG 중쇄 유전자가 C-말단 리신을 코딩하지만, 리신은 종종 혈액 순환에서의 절단의 결과로서 내인성 항체에 부재한다. C-말단 리신을 포함하는 IgG 중쇄를 갖는 항체는, 포유동물 세포 배양물에서 발현되는 경우에, 가변 수준의 존재하는 C-말단 리신을 또한 가질 수 있다 (Cai et al., 2011, Biotechnol Bioeng. 108(2):404-12). 따라서, 본원에 개시된 임의의 IgG 중쇄 Fc 도메인의 C-말단 리신은 생략될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 66 및 134, 및 서열식별번호: 67 및 135를 참조한다. 유사하게, 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69의 C-말단에서의 리신이 임의로 부재할 수 있다.
돌연변이된 IgG1 Fc 도메인은 Fc 감마 수용체에 대한 감소된 결합을 나타낸다. 유리하게는, Fc 감마 수용체에 대한 감소된 결합은 1) 시토카인 IL-6 및/또는 TNF-알파의 방출; 및 2) CD86 및/또는 CD54의 세포 표면 발현의 상향조절 중 적어도 하나에 의해 측정시 iDC 활성화를 감소시키거나 배제한다. Fc 감마 수용체에 대한 감소된 결합은 또한 미성숙 수지상 세포에 대한 FcgR의 클러스터링/가교를 감소시키거나 배제하는 것으로 여겨진다. 추가적으로, 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인은 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드의 열 안정성 및 균질성에 기여할 수 있다.
2. 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드
본 개시내용은 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다.
2.1. 이종 폴리펩티드
본 개시내용은 본 개시내용의 이종 폴리펩티드 및 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인의 융합 폴리펩티드를 포함한다. 이종 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc 도메인의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 중쇄 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc 도메인의 아미노 말단에 그 자체로 융합된 링커 아미노산 서열의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 중쇄 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc 도메인에 그 자체로 융합된 CH1 도메인의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 융합 폴리펩티드는 CH1과 CH2 도메인 사이에 힌지 영역을 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있다. 임의로, 아미노산 링커 서열은 중쇄 가변 도메인 및 Fc 도메인 사이에 존재한다.
2.2. 도메인 항체
본 개시내용은 Fc 도메인에 융합된 단일 가변 도메인 (도메인 항체)을 추가로 포함한다. "도메인 항체" (dAb)는 특이적으로 및 1가로 항원, 예컨대 CD40에 결합할 수 있는 단일 가변 도메인 (VL 또는 VH) 도메인을 포함한다. 단일 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc CH2 도메인의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 단일 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc 도메인의 아미노 말단에 그 자체로 융합된 링커 아미노산 서열의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 가변 도메인의 카르복실 말단은 Fc CH2 도메인에 그 자체로 융합된 CH1 도메인의 아미노 말단에 연결 또는 융합될 수 있다. 단백질은 CH1과 CH2 도메인 사이에 힌지 영역을 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있다. 임의로, 아미노산 링커 서열은 단일 가변 도메인과 Fc 도메인 사이에 존재한다. 항-인간 CD40 도메인 항체 및 변형된 인간 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드인 항체 폴리펩티드가 또한 제공된다. 임의로, 항체 폴리펩티드는 도메인 항체와 Fc 도메인 사이에 개재되는 아미노산 링커를 추가로 포함한다. 예시적인 항체 폴리펩티드가 도 1에 도시된다.
2.2.1. 항-CD40 도메인 항체
본 개시내용의 항체 폴리펩티드는 인간 CD40에 특이적으로 결합하고, CD40 효능제 활성을 나타내지 않는 도메인 항체를 포함한다. "도메인 항체" (dAb)는 특이적으로 및 1가로 항원, 예컨대 CD40에 결합할 수 있는 단일 가변 도메인 (VL 또는 VH) 도메인을 포함한다. 도메인 항체는 "VH 도메인"을 함유하고, 인간이다. 결합된 CD40 분자를 세포 표면 상에 가교시키는 그의 능력 때문에, 2가 항-CD40 항체는 효능제 활성을 나타낼 것으로 여겨진다. 어떠한 특정한 이론에 제한되지는 않지만, 1가 dAb는 CD40을 가교시키지 않기 때문에 이러한 dAb는 CD40을 활성화시키지 않는 것으로 여겨진다.
CD40은 B-세포 표면 항원 CD40, Bp50, CD40L 수용체, CDw40, CDW40, MGC9013, p50, TNFRSF5, 및 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 5로 또한 공지되어 있다. "인간 CD40"은 하기 아미노산 서열을 포함하는 CD40을 지칭한다.
Figure pat00007
본원에 사용된 용어 "가변 도메인"은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)]에 규정된 이뮤노글로불린 가변 도메인을 지칭한다. 가변 도메인 내의 CDR 아미노산 잔기의 넘버링 및 위치지정은 널리 공지된 카바트 넘버링 규정에 따른다. 예를 들어, BMS3h-56-269 (서열식별번호: 41)에 대한 카바트 넘버링은 표 2에서 아미노산이 순차적으로 넘버링된 동일한 서열과 비교된다. 카바트 넘버링에서, BMS3h-56-269는 삽입 잔기 52A, 82A, 82B, 82C를 갖고, 잔기 100이 누락된다.
표 2
Figure pat00008
용어 "인간"은, 항체 폴리펩티드에 적용되는 경우, 항체 폴리펩티드가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 서열, 예를 들어, FR 및/또는 CH 도메인을 갖는다는 것을 의미한다. 서열이 (a) 인간 개체로부터 또는 인간 개체로부터의 세포 또는 세포주로부터 단리된 경우; (b) 클로닝된 인간 항체 유전자 서열의 또는 인간 항체 가변 도메인 서열의 라이브러리로부터 단리된 경우; 또는 (c) 상기 폴리펩티드 중 1종 이상으로부터의 돌연변이 및 선택에 의해 다양화된 경우에 서열은 인간 이뮤노글로불린 코딩 서열"로부터 유래된" 것이다. 본원에 사용된 "단리된" 화합물은 화합물이 자연에서 자연적으로 회합되어 있는 적어도 1종의 성분으로부터 분리된 것을 의미한다.
본원에 사용된 "특이적 결합"은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정 시 약 1 μM 이하의 해리 상수 (Kd)로 항체 폴리펩티드가 항원에 결합하는 것을 지칭한다. 적합한 검정 시스템은 비아코어(BIAcore)™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템 및 비아코어™ 동역학 평가 소프트웨어 (예를 들어, 버전 2.1)를 포함한다.
본 발명의 항체 폴리펩티드가 CD40에 결합하는 것은 CD40 활성에 길항한다. "CD40 활성"은 T 세포 활성화 (예를 들어, T 세포 증식 또는 시토카인 분비의 유도), 대식세포 활성화 (예를 들어, 대식 세포에서의 반응성 산소 종 및 산화질소의 유도), 및 B 세포 활성화 (예를 들어, B 세포 증식, 항체 이소형 전환, 또는 형질 세포로의 분화)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CD40 활성은 다른 분자와의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. "CD40 활성"은 CD40과 하기 분자들 (괄호 안의 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호로 확인됨) 사이의 기능성 상호작용을 포함한다.
Figure pat00009
예를 들어, CD40 "활성"은 TRAF2와의 상호작용을 포함한다. CD40/TRAF2 상호작용은 NF-κB 및 JNK를 활성화시킨다. 문헌 [Davies et al., Mol. Cell Biol. 25: 9806-19 (2005)]을 참조한다. 따라서, 이러한 CD40 활성은 참조물에 비한 CD40-의존성 세포 NF-κB 및 JNK 활성화에 의해 결정될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "활성화시키다", "활성화시킨다" 및 "활성화된"은 참조물에 비해 적어도 10%, 예를 들어 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 또는 심지어 100%, 또는 그 초과만큼 주어진 측정가능한 CD40 활성이 증가된 것을 지칭한다. 길항제의 부재에 비해 CD40 활성이 적어도 10%만큼, 및 예시적인 실시양태에서는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% (즉, 검출가능한 활성이 없음)만큼 감소된 경우에, CD40 활성은 "길항된다". 예를 들어, 항체 폴리펩티드는 CD40 활성을 활성화시키지 않으면서 일부 또는 모든 CD40 활성에 길항할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 폴리펩티드는 B 세포 증식을 활성화시키지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체 폴리펩티드는 T 세포에 의한 시토카인 분비를 활성화시키지 않으며, 여기서 시토카인은 IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 시토카인이다.
본 개시내용의 항체 폴리펩티드는 종종 다른 종, 예를 들어 마우스로부터의 항체의 투여에 의해 촉발되는 항-항체 면역 반응을 대부분 피하면서 인간 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 절차에 따라 뮤린 CDR을 인간 가변 도메인 FR 상에 그라프팅함으로써 "인간화"될 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체는 뮤린 항체 서열의 유전자 조작의 필요 없이 생산될 수 있다.
본 개시내용에 유용한 항-CD40 도메인 항체는 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열되는 3개의 상보성-결정 영역 (CDR) 및 4개의 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3개의 CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하고 주로 항원 인식을 담당하는 잔기의 대부분을 함유한다.
단일 CD40 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인 항체 폴리펩티드의 속은 발명의 명칭이 "CD40에 길항하는 항체 폴리펩티드"인 2014년 4월 10일에 공개된 미국 공개 번호 2014/0099317에 기재되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 항체 폴리펩티드는 구조적으로 및 기능적으로 특징화되었고, 그 데이터가 또한 2014년 4월 10일에 공개된 미국 공개 번호 2014/0099317에 기재된다. BMS3h-56-269는 미국 공개 번호 2014/0099317에 개시된 바와 같이, 인간 CD40에 특이적으로 결합하나 그에 길항하지는 않는 예시적인 단일 가변 도메인 항체 폴리펩티드이다.
CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하는 잔기의 대부분을 함유한다. 본 개시내용의 항체 폴리펩티드의 단일 가변 도메인은 BMS3h-56-269 (서열식별번호: 41)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역과 각각 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산만큼 상이한 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함한다.
BMS3h-56-269 (서열식별번호: 41)의 아미노산 서열이 하기에 제시된다.
Figure pat00010
3개의 상보성-결정 영역의 아미노산은 밑줄표시된다. CDR1의 아미노산 서열은 DYEMW (서열식별번호: 1)이다. CDR2의 아미노산 서열은 AINPQGTRTYYADSVKG (서열식별번호: 2)이고, CDR3의 아미노산 서열은 LPFRFSD (서열식별번호: 3)이다. BMS3h-56-269의 아미노산 서열을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 하기와 같다.
Figure pat00011
본 개시내용에 의해 제공되는 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 BMS3h-56-269의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 (각각 서열식별번호: 1-3)과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역과 각각 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산만큼 상이한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함한다. CDR1 영역은 서열식별번호: 1과 최대 2개 아미노산만큼 달라질 수 있다. CDR2 영역은 서열식별번호: 2와 최대 3개 아미노산만큼 달라질 수 있다. CDR3 영역은 서열식별번호: 3과 최대 6개 아미노산만큼 달라질 수 있다. 따라서, 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 1의 CDR1 영역과 최대 2개의 아미노산만큼 상이한 CDR1 영역, (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 2의 CDR2 영역과 최대 3개의 아미노산만큼 상이한 CDR2 영역, 및 (c) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 3의 CDR3 영역과 최대 6개의 아미노산만큼 상이한 CDR3 영역을 포함할 수 있고, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 CD40에 결합한다. 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열식별번호: 1의 CDR1 영역과 최대 2개 아미노산만큼 상이한 CDR1 영역, (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열식별번호: 2의 CDR2 영역과 최대 3개 아미노산만큼 상이한 CDR2 영역, 및 (c) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열식별번호: 3의 CDR3 영역과 최대 6개 아미노산만큼 상이한 CDR3 영역을 포함할 수 있고, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 CD40에 결합한다.
예시적인 항체 폴리펩티드는 섹션 2.5에 기재된다. 추가의 예시적인 항체는 여기에 기재된다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열 X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (서열식별번호: 4)로 이루어지며, 여기서 X1은 Asp 또는 Gly이고, Y1은 Met 또는 Leu인 CDR1 영역; (b) 서열 Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (서열식별번호: 5)로 이루어지며, 여기서 X2는 Gln, Tyr, His, Trp, 또는 Ala이고, Y2는 Thr, Asn, Gly, Ser, 또는 Gln이고, Z2는 Arg, Leu, Tyr, His, 또는 Phe이고, A2는 Lys 또는 Met인 CDR2 영역; 및 (c) 서열 X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3 (서열식별번호: 6)으로 이루어지며, 여기서 X3은 Leu, Pro, 또는 Glu이고, Y3은 Phe, Gln, Thr, Met, 또는 Tyr이고, Z3은 Arg, Tyr, Pro, Leu, Thr, Ile, Phe, Met, 또는 Ser이고, A3은 Phe 또는 Tyr이고, B3은 Ser, Gln, His, Asp, Lys, Glu, 또는 Gly이고, C3은 Asp, Tyr, Glu, 또는 Ser인 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열 X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (서열식별번호: 4)로 이루어지며, 여기서 X1은 Asp이고, Y1은 Met인 CDR1 영역; (b) 서열 Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (서열식별번호: 5)로 이루어지며, 여기서 X2는 Gln, Tyr, His, Trp, 또는 Ala이고, Y2는 Thr, Asn, Gly, Ser, 또는 Gln이고, Z2는 Arg, Leu, Tyr, His, 또는 Phe이고, A2는 Lys인 CDR2 영역; 및 (c) 서열 X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3 (서열식별번호: 6)으로 이루어지며, 여기서 X3은 Leu이고, Y3은 Phe, Gln, Thr, 또는 Met이고, Z3은 Arg, Tyr, Leu, Thr, 또는 Phe이고, A3은 Phe이고, B3은 Ser, Gln, His, Asp, 또는 Glu이고, C3은 Asp 또는 Glu인 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
Figure pat00012
Figure pat00013
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역; 및 (c) 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호:; 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 및 서열식별번호: 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역; 및 (c) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 및 서열식별번호: 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 35, 및 서열식별번호: 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역; 및 (c) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 36, 및 서열식별번호: 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역; 및 (c) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 39 및 서열식별번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 27의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역; 및 (c) 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 영역, 및 (c) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 영역을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 서열식별번호: 41 (3h-56-269 서열)의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다.
본원에 개시된 항체 폴리펩티드의 가변 도메인은 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 CDR1 영역의 아미노산 서열, CDR2 영역의 아미노산 서열, 및 CDR3 영역의 아미노산 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(1) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 3;
(2) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 7;
(3) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 8;
(4) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 9;
(5) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 10;
(6) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 11;
(7) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 12;
(8) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 13;
(9) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 14;
(10) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 15;
(11) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 16;
(12) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 17;
(13) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 18;
(14) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 19;
(15) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 20;
(16) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 21;
(17) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 22;
(18) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 및 서열식별번호: 23;
(19) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 7;
(20) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 8;
(21) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 24;
(22) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 25;
(23) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 26;
(24) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 28 및 서열식별번호: 7;
(25) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 8;
(26) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 30 및 서열식별번호: 7;
(27) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 31 및 서열식별번호: 8;
(28) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 32 및 서열식별번호: 7;
(29) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 8;
(30) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 8;
(31) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 35 및 서열식별번호: 7;
(32) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 36 및 서열식별번호: 8;
(33) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 7;
(34) 각각 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 38 및 서열식별번호: 8;
(35) 각각 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 8;
(36) 각각 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 24;
(37) 각각 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 8;
및
(38) 각각 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 24.
항체 폴리펩티드 내의 가변 도메인은 BMS3h-56-269의 가변 도메인과 최대 10개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 정수 값만큼 상이할 수 있으며, 여기서 변이체 가변 도메인은 CD40에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, 변이체 가변 도메인은 BMS3h-56-269의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 92%, 95%, 또는 98% 서열 동일성)을 가질 수 있다. 비-동일 아미노산 잔기 또는 2개의 서열 사이에서 상이한 아미노산은 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 나타낼 수 있다. 2개의 서열 사이에서 상이한 잔기는 2개의 서열이 임의의 적절한 아미노산 서열 정렬 알고리즘, 예컨대 BLAST에 의해 정렬된 경우에 비-동일 위치인 것으로 나타난다.
가변 도메인은 인간 배선 항체 유전자 절편에 의해 코딩되는 상응하는 프레임워크 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 프레임워크 영역 (FR)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도메인 항체는 VH 배선 유전자 절편 DP47, DP45 또는 DP38, Vκ 배선 유전자 절편 DPK9, JH 절편 JH4b, 또는 Jκ 절편 Jκ1을 포함할 수 있다.
예시적인 프레임워크 영역은 3h-56-269로부터의 프레임워크 영역: FR1 = EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR (3h-56-269의 아미노산 1-30); FR2 = WVRQAPGKGLERVS (3h-56-269의 아미노산 36-49); FR3 = RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (3h-56-269의 아미노산 67-98); FR4 = RGQGTLVTVSS (3h-56-269의 아미노산 106-116)를 포함한다. 이들 서열은 표 3에서 각각 서열식별번호: 42, 44, 47 및 54에 상응한다. 다른 예시적인 프레임워크 영역은 표 3에 제시된다.
표 3
Figure pat00014
다른 예시적인 프레임워크 영역은 미국 공개 번호 2014-0099317에 개시된 3h-56-269 계열 클론의 것들이다.
돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-CD40 항체 폴리펩티드는 면역 질환의 치료 또는 예방에서 치료 가치를 갖는다. 단백질 치료제를 시판하기 위해서는 분자가 화학 제조 및 관리 (CMC)로 통상적으로 지칭되는, 개발을 위한 적합한 물리적 및 화학적 특성을 갖는 것을 필요로 한다. 안정성, 용해도 및 균질성을 포함한 분자의 물리적 및 화학적 특성은 또한 집합적으로 "개발가능성"으로 지칭된다. 유리하게는, 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-CD40 항체 폴리펩티드는 다른 IgF1 및 IgF4 Fc 도메인에 연결된 동일한 항-CD40 가변 도메인과 비교하여 개선된 개발가능성을 나타낸다. 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-CD40 항체 폴리펩티드는 SPR에 의해 측정시 Fc 감마 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내고, 1) 시토카인 IL-6 및/또는 TNF-알파의 방출; 및 2) CD86 및/또는 CD54의 세포 표면 발현의 상향조절 중 적어도 하나에 의해 측정시 감소된 또는 검출불가능한 iDC 활성화를 나타낸다. 추가적으로, 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-CD40 항체 폴리펩티드는 DSC에 의해 측정시 개선된 열 안정성, 뿐만 아니라 가속 스트레스 조건 하에 측정시 개선된 물리적 안정성을 갖는다. 돌연변이된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-CD40 항체 폴리펩티드는 개선된 균질성을 갖는다.
2.3. 링커
한 실시양태에서, 융합 항체 폴리펩티드의 항체 폴리펩티드는 "아미노산 링커" 또는 "링커"에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, dAb는 아미노산 링커의 N-말단에 융합될 수 있고, Fc 도메인은 링커의 C-말단에 융합될 수 있다. 아미노산 링커는 임의의 길이일 수 있고 아미노산의 임의의 조합으로 이루어질 수 있지만, 링커 길이는 연결된 도메인들 사이의 상호작용을 감소시키기 위해 비교적 짧을 수 있다 (예를 들어, 5개 이하의 아미노산). 링커의 아미노산 조성은 또한 벌키 측쇄를 갖는 아미노산 또는 2차 구조를 도입할 가능성이 있는 아미노산의 수를 감소시키기 위해 조정될 수 있다. 적합한 아미노산 링커는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산 길이를 갖는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 링커 AST (서열식별번호: 57)가 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 다른 대표적인 아미노산 링커 서열은 GGGGS (서열식별번호: 58) 및 GGGGS의 2, 3, 4 또는 5개 카피를 포함하는 링커 (각각 서열식별번호: 59-62)를 포함한다. 표 4는 본 개시내용에 사용하기 위한 예시적인 링커 서열을 열거한다.
표 4
Figure pat00015
2.4 예시적인 항체 폴리펩티드
예시적인 항체 폴리펩티드는 (1) 단일 가변 도메인이며, 상기 단일 가변 도메인이 (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 1의 CDR1 영역과 최대 2개의 아미노산만큼 상이한 CDR1 영역, (b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 2의 CDR2 영역과 최대 3개의 아미노산만큼 상이한 CDR2 영역, 및 (c) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 3의 CDR3 영역과 최대 6개의 아미노산만큼 상이한 CDR3 영역을 포함하고, 여기서 상기 단일 가변 도메인은 CD40에 결합하는 것인 단일 가변 도메인; 및 (2) FC-감마-수용체에 대한 결합을 감소시키는 카바트 위치 238에서의 돌연변이이며, 여기서 프롤린 238 (P238)은 리신, 세린, 알라닌, 아르기닌 및 트립토판으로부터 선택되는 잔기 중 1개로 돌연변이된 것인 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드인 Fc 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 항체 폴리펩티드의 단일 가변 도메인은 CD40의 적어도 하나의 활성에 길항한다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드는 야생형 IgG1 Fc 도메인에 융합된 동일한 단일 가변 도메인 서열을 갖는 참조 폴리펩티드에 비해 증가된 안정성을 갖는다. (1) 상기 기재된 바와 같은 단일 가변 도메인을 포함하는 항체 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 인간 IgG1 Fc 도메인은 카바트 위치 238에서 치환된 리신을 갖는다.
인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure pat00016
예시적인 항체 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같으며, 여기서 (a) CDR1 영역은 서열 X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (서열식별번호: 4)로 이루어지며, 여기서 X1은 Asp 또는 Gly이고, Y1은 Met 또는 Leu이고; (b) CDR2 영역은 서열 Ala-Ile-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (서열식별번호: 5)로 이루어지며, 여기서 X2는 Gln, Tyr, His, Trp, 또는 Ala이고, Y2는 Thr, Asn, Gly, Ser, 또는 Gln이고, Z2는 Arg, Leu, Tyr, His, 또는 Phe이고, A2는 Lys 또는 Met이고; (c) CDR3 영역은 서열 X3-Pro-Y3-Z3-A3-B3-C3 (서열식별번호: 6)으로 이루어지며, 여기서 X3은 Leu, Pro, 또는 Glu이고, Y3은 Phe, Gln, Thr, Met, 또는 Tyr이고, Z3은 Arg, Tyr, Pro, Leu, Thr, Ile, Phe, Met, 또는 Ser이고, A3은 Phe 또는 Tyr이고, B3은 Ser, Gln, His, Asp, Lys, Glu, 또는 Gly이고, C3은 Asp, Tyr, Glu, 또는 Ser이다.
예시적인 항체 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같으며, 여기서 (a) CDR1 영역은 서열식별번호: 1 (3h-56-269의 CDR1)의 아미노산 서열로 이루어지고, (b) CDR2 영역은 서열식별번호: 2 (3h-56-269의 CDR2)의 아미노산 서열로 이루어지고, (c) CDR3 영역은 서열식별번호: 3 (3h-56-269의 CDR3)의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드가 추가로 제공되며, 여기서 단일 가변 도메인의 아미노산 서열은 서열식별번호: 41 (= 3h-56-269 서열)에 제시된다.
예시적인 항체 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
Figure pat00017
예시적인 항체 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
Figure pat00018
예시적인 항체 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
Figure pat00019
예시적인 항체 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
Figure pat00020
2.5. 항체 폴리펩티드 제조
본 개시내용의 항체 폴리펩티드는 임의의 적합한 포유동물 숙주 세포주, 예컨대 CHO, HEK293, COS, NSO 등에서 통상의 기술만을 사용하여 생산 및 정제되고, 이어서 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이온 교환, 역상 기술 등을 포함한 방법 중 하나 또는 그의 조합을 사용하여 정제될 수 있다.
본 개시내용은 본 개시내용의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산은 벡터, 예컨대 적합한 발현 벡터, 예를 들어, pHEN-1 내에 삽입될 수 있다 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137). 개시된 항체 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 및/또는 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포가 추가로 제공된다.
3. 제약 조성물 및 치료 방법
제약 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 항체 폴리펩티드 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는, 예를 들어 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 그의 조합을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 융합 단백질의 보관-수명 또는 유효성을 증진시키는 미량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 투여 후에 활성 성분(들)의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 적합한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co. (2005)]을 참조한다.
제약 조성물은 면역억제제/면역조정제 및/또는 항염증제를 추가로 포함할 수 있다.
면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 면역 질환을 치료하는 방법은 환자에게 치료 유효량의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. CD40-매개 T 세포 활성화에 길항하는 것은 예를 들어 자가면역, 이식 거부, 또는 알레르기 반응 동안 발생하는 바람직하지 않은 T 세포 반응을 억제할 수 있다. CD40-매개 T 세포 활성화를 억제하는 것은 이들 질환의 진행 및/또는 중증도를 완화할 수 있다.
면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 면역 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 개시내용의 항체 폴리펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도가 또한 제공된다. 의약은 예를 들어 면역억제제/면역조정제 및/또는 항염증제와 조합하여 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "환자"는 동물, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물을 의미한다. 환자는 면역 질환으로 진단될 수 있다. "치료" 또는 "치료하다" 또는 "치료하는"은 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도의 완화를 수반하는 과정을 지칭한다. "면역 질환"은 개체에서의 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 포함한 면역 반응의 발생과 연관된 임의의 질환을 지칭한다. 면역 질환의 예는 염증, 알레르기, 자가면역 질환, 또는 이식편-관련 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "자가면역 질환"은 개체에서의 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 포함한 자가면역 반응의 발생과 연관된 임의의 질환을 지칭한다. 자가면역 질환의 예는, 궤양성 결장염 및 크론병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 염증성 장 질환 (IBD)이다. 다른 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 경피증, 및 아테롬성동맥경화증을 포함한다. 이식편-관련 질환은 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있는 질환은 애디슨병, 알레르기, 아나필락시스, 강직성 척추염, 천식, 아테롬성동맥경화증, 아토피성 알레르기, 귀의 자가면역 질환, 눈의 자가면역 질환, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 기관지 천식, 관상동맥 심장 질환, 크론병, 당뇨병, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 염증성 장 질환, 재조합 약물 제품 (예를 들어, 혈우병환자에서의 인자 VII)에 대한 면역 반응, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 천포창, 건선, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추관절병증, 갑상선염, 이식 거부, 혈관염, 및 궤양성 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
제약 조성물은 단독으로 또는 면역억제제/면역조정제 및/또는 항염증제와의 조합 요법으로 (즉, 동시에 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 상이한 면역 질환은 면역 질환을 치료하는 데 유용한 특정 보조 화합물의 사용을 필요로 할 수 있으며, 이는 환자별로 결정될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 1종 이상의 적합한 아주반트, 예를 들어 시토카인 (예를 들어 IL-10 및 IL-13) 또는 다른 면역 자극제, 예를 들어 케모카인, 종양-연관 항원 및 펩티드와 조합되어 투여될 수 있다. 적합한 아주반트는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
임의의 적합한 방법 또는 경로가 항체 폴리펩티드 또는 제약 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 항체 폴리펩티드(들)의 치료 유효 용량은, 예를 들어 치료되는 면역 질환의 유형 및 중증도, 조합 요법의 사용, 항체 폴리펩티드(들) 또는 제약 조성물의 투여 경로, 및 환자의 체중을 포함한 수많은 인자에 따라 달라진다. 도메인 항체의 치료 유효량에 대한 비제한적 범위는 환자의 체중에 대해 0.1-20 mg/kg, 및 한 측면에서, 1-10 mg/kg이다.
4. 키트
인간 환자에서 면역 질환을 치료하는 데 유용한 키트가 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 (a) 소정 용량의 본 개시내용의 항체 폴리펩티드 및 (b) 본원에 개시된 바와 같은 인간 환자에서 면역 질환을 치료하는 방법에서 항체 폴리펩티드를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "지침서"는 키트 내 본 발명의 조성물 및/또는 화합물의 유용성을 알리기 위해 사용될 수 있는 간행물, 녹음물, 다이어그램 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 키트의 지침서는, 예를 들어, 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 또는 화합물 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 출하될 수 있다. 대안적으로, 지침서는 수취인이 지침서 및 화합물을 협력하여 사용하게 할 의도로 용기와 별도로 출하될 수 있다. 지침서의 전달은 예를 들어 키트의 유용성을 알리는 간행물 또는 다른 표현 매체의 물리적 전달에 의할 수 있거나, 또는 대안적으로 전자 전송에 의해, 예를 들어 컴퓨터에 의해, 예컨대 전자 메일에 의해 달성되거나 또는 웹사이트로부터 다운로드받을 수 있다.
실시예
물질 및 방법: 이 섹션은 하기 실시예에 사용된 물질 및 방법을 기재한다. 추가의 방법은 실시예에 개시된다.
단백질: 항체 및 dAb-Fc 단백질을 HEK293 (인간 배아 신장 세포로부터 유래된 세포주) 또는 Expi293 세포에서 발현시키고, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 정제용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 몇몇 선택 샘플을 또한 발현시키고, UCOE-CHO 세포로부터 정제하였다 ("UCOE-CHO"로 표시된 샘플).
CD40 결합 동역학 및 친화도: dAb-Fc 및 항체 분자의 CD40 결합 친화도는, 비아코어™ T100 또는 T200 기기 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 매사추세츠주 말보로) 상 SPR에 의해, 고정화된 단백질 A 센서 칩 표면 상에 dAb-Fc 또는 항체를 포획한 다음, PBS-T pH 7.1 중에서 분 당 30 마이크로리터 (μl/분)에서 180초의 회합 시간, 360초의 해리 시간을 사용하여 인간-CD40-단량체 단백질 (사내 생성됨)을 결합시킴으로써 측정하였다. 결합을 결합력으로 특징화하기 위해, 인간-CD40-Fc (사내 생성됨)를 CM5 센서 칩 상에 고정화시키고, dAb-Fc 또는 항체 분석물을 30 μl/분에서 180초 회합 시간 및 240초 해리 시간을 사용한 결합에 대해 시험하였다.
실시예 1: FcγR 가교의 존재 또는 부재 하의 dAb-Fc 분자를 사용한 iDC의 처리
3h56-269-IgG4.1은 항-CD40 dAb-FC (IgG4) 융합 단백질 (서열식별번호: 75)이다. 예를 들어 WO 2012/145673에 기재된 바와 같이, B 세포 또는 T-세포-고갈된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 3h56-269-IgG4.1에 대해 어떠한 직접적인 효능제 활성도 관찰되지 않았다. 3h56-269-IgG4.1의 생물학적 활성 및 안전성 프로파일을 추가로 특징화하기 위해, 미성숙 수지상 세포 (iDC)에 대한 3h56-269-IgG4.1의 효과를 검정하였다.
본 실시예에 사용된 물질 및 방법은 하기를 포함한다:
1차 세포 단리 및 배양: 말초 혈액을 정상, 건강한 인간 공여자로부터 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 밀도 구배 분리에 의해 헤파린화 인간 혈액으로부터 단리하였다. 단핵구를 매뉴얼 이지셉(Manual EasySep) 프로토콜 (스템셀(STEMCELL)™ 테크놀로지스, 캐나다 밴쿠버)에 따라 PBMC로부터 단리하였다. 백만개의 단리된 단핵구를 IL-4 (밀리리터 당 100 나노그램 (ng/ml)) 및 인간 GM-CSF (100 ng/ml)를 추가로 함유하는 완전 배지 (RPMI-1640, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청, 100 단위/ml 페니실린-스트렙토마이신) 6 ml 중에 6-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 배지를 격일로 바꾸고, 동일한 농도의 시토카인을 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 제6일에 원심분리에 의해 수거하고, 철저히 세척하고, 완전 배지 중에 재현탁시켰다.
미성숙 수지상 세포 활성화 검정: 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 특정 시토카인의 방출 및 특정 세포 표면 분자의 발현을 평가함으로써 활성화에 대해 검정하였다. 다양한 생물학적 작용제의 적정을 완전 배지에서 제조하고, 이중 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 가교 (CD32a-발현 CHO 세포의 첨가를 통함)의 경우에, 검정되는 항체를 iDC에 30분 동안 첨가한 후 CD32a-발현 CHO 세포를 첨가하였다. CD32a-발현 CHO 세포 대 iDC의 비는 1:6이었다.
시토카인을 평가하기 위해, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 대략 18-20시간 동안 인큐베이션하고; 150 마이크로리터 (μL)의 상청액을 각 웰로부터 분리하고, 1:5 희석하고, 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 IL-6, TNFα 및 IL-12의 단백질 농도에 대해 평가하였다.
CD86, ICAM-1 (CD54로도 불림) 및 CD83 발현을 평가하기 위해, 수거된 상청액으로부터 플레이트에 남아있는 세포를 이중 처리당 1개 샘플로 합하고, 새로운 96-웰 둥근 바닥 (RB) 플레이트에 옮기고, 4℃에서 플레이팅하였다. 세포를 D-PBS, Ca++ 및 Mg++ 무함유로 세척하고, 라이브/데드(LIVE/DEAD)® 고정가능한 근적외선 사멸 세포 염색 키트 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 세포 생존율을 위해 얼음 상에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, D-PBS, Ca++ 및 Mg++ 무함유, 2% FBS, 0.1 % NaN3 (염색 완충제) 중에 재현탁시키고, 염색 완충제 중 5 μL/웰의 인간 트루스테인(TruStain) FcX™ (Fc 수용체 차단 용액, 바이오레전드(Biolegend), 캘리포니아주 샌디에고)로 차단하였다. iDC를 PerCpCy5.5-접합된 αCD3, αCD19, αCD14 (Lin-), BUV395-접합된 αCD11c (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 샌디에고), APC-접합된 αCD86 (바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고), PE-접합된 αCD83 (이바이오사이언스(eBioscience), 캘리포니아주 샌디에고), FITC-접합된 αCD54 (바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)로 면역-염색하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 염색 완충제 중에서 2회 세척하고, 비디 시토픽스(BD Cytofix) 고정 완충제 (비디 바이오사이언스, 캘리포니아주 샌디에고) 100 μl를 첨가함으로써 고정시켰다 (실온 (RT)에서 15분, 광으로부터 보호됨). iDC를 LSRII-포르테사(Fortessa)™ 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌디에고), 및 플로우조(FlowJo)® 분석 소프트웨어 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.), 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 CD86, ICAM-1 및 CD83 발현에 대해 평가하였다.
CP-870,893 mAb는 널리 공지된 효능작용 CD mAb이다 (예를 들어, 문헌 [Vonderheide et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25(7): 876-883] 참조). 이들 연구에서, CP-870,893 mAb (본원에서 mAb 134-2141로 지칭됨; 사내 생성됨)가 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. 제2 양성 대조군은 이소류신 지퍼 삼량체화 모티프에 의해 삼량체화된 가용성 CD40L 삼량체 분자 (사내 생성됨)였다. 일부 실험에서, 비-CD40 결합 단백질과 IgG4.1 Fc 테일 사이의 융합 단백질인 CHI-L6 IgG4 (사내 생성됨)가 음성 대조군으로서의 역할을 하였다.
dAb-Fc: 이 실험에서 연구된 dAb-Fc의 아미노산 서열은 표 5에 제시된다. 이들 서열에서, 단일 가변 도메인 3h56-269 잔기는 아미노산 1- 118 (밑줄표시됨)이다. 링커, AST (서열식별번호: 57)는 이중-밑줄표시된다. 비포맷화된 C-말단 잔기는 Fc 도메인이다.
표 5
Figure pat00021
결과: 미성숙 수지상 세포 (iDC)에 대한 3h56-269-IgG4.1의 효과를 검정하였다. CD86 및 ICAM-1 (CD54) 발현의 상향-조절뿐만 아니라 시토카인 방출 (예를 들어, IL-6, TNF)을 평가하였다. 검정을 9종의 상이한 공여자로부터의 iDC에 대해 수행하였다. iDC 상의 CD86 발현의 적당한 증가가 3h56-269-IgG4.1에 의해 30 μg/ml에서 9종의 공여자 중 1종 및 100 μg/ml에서 9종의 공여자 중 2종에서 관찰되었으며, 시토카인 방출의 유사하게 적당한 증가가 9종의 공여자 중 1종에서 관찰되었다. 도 2A-D를 참조한다. 따라서, Fc-항-CD40 dAb 융합체 3h56-269-IgG4.1은 공여자의 작은 하위세트에서 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 활성화시킨 것으로 결론지었다.
미성숙 DC는 FcgR 및 CD40 둘 다를 발현하고, CD40 활성화에 감수성이다. 따라서 FcgR 매개 클러스터링 또는 가교가 3h56-269-IgG4.1에 의해 관찰된 iDC 활성화를 담당할 수 있는 잠재력을 조사하였다. 3h-56-269-CT (서열식별번호: 76)는 본원에서 "CT" 또는 "aba"로 지칭되는, 감소된 FcgR 결합을 갖는 IgG1 Fc 테일에 대한 동일한 항-CD40 dAb (3h-56-269)의 융합체이다. CT Fc 도메인은 오렌시아(Orencia)® (아바타셉트, 브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Company), 뉴욕주 뉴욕)에 존재하는 Fc 도메인이다. 아바타셉트는 Fc 도메인 이펙터 기능을 감소시키고 IgG1 힌지 영역에서 쇄간 디술피드 결합을 제거하도록 변형된 IgG1 Fc 도메인에 대한 CTLA-4의 세포외 도메인의 융합체이다. 3h-56-269-CT는 감소된 FcgR 결합을 갖는다.
3h-59-269-CT를 9종의 공여자로부터의 iDC로 100 μg/ml에서 시험하였다. 9종의 공여자 iDC는 비-CD40 단백질과 IgG4 Fc 테일 사이의 융합 단백질인 CHI-L6 IgG4로 이루어진 음성 대조군과 비교할 때 시토카인 방출도 CD86 또는 CD54의 상향조절도 보여주지 않았다. 대조적으로, 3h56-269-IgG4.1은 iDC 활성화의 적어도 하나의 척도가 대조군보다 더 큰 것으로 관찰된 9종의 공여자 중 3종의 하위세트에서 iDC 활성화를 나타내었다. CD40 효능제 mAb 134-214는 시험된 모든 공여자에서 CD86 및 ICAM 발현 및 시토카인 방출을 자극하였다. 도 2E를 참조한다.
이들 데이터는 iDC 활성화에서 융합 단백질의 Fc 부분의 역할을 시사한다. 구체적으로, 이러한 관찰은 iDC의 표면 상의 3h56-269-IgG4.1의 IgG4.1 Fc 도메인에 의한 FcgR 클러스터링 또는 가교가 공여자의 하위세트에서 관찰된 활성화를 설명할 수 있다는 것을 시사한다. 3h-59-269-CT 융합 단백질의 감소된 iDC 활성화는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 평가시, CD32 (FcgRII) 및 CD16 (FcgRIII)을 포함한 FcgR 수용체에 대한 감소된 결합과 일치한다.
iDC의 세포 표면 마커 발현 및 시토카인 방출에 대한 FcgR-매개 dAb 가교의 영향을 추가로 조사하기 위해, 추가의 실험을 8종의 혈액 공여자에 걸쳐 수행하였고, 여기서 저친화도 FcgR인 CD32a를 고도로 과다발현하는 CHO 세포를 사용하여 3h56-269-IgG4.1을 클러스터링/가교시켰다. 이들 실험에서 CHO 세포 대 iDC의 비는 1:6이었음에 주목하여야 한다. 이러한 비는 클러스터링/가교의 과장된 수준이고, 정상적인 생리학적 조건 하에서 일어날 것으로 예상되는 것 초과일 가능성이 있다. 이전의 iDC 연구에서 관찰된 것과 유사하게 (도 2), 가교의 부재 하에 3h56-269-IgG4.1은 CHI-L6 IgG4 대조군과 비교할 때 몇몇 공여자에서 CD86 및 IL-6 생산에 의해 측정시 적당한 양의 iDC 활성화를 유발하였다. 대조적으로, CD32 과다발현 CHO 세포가 혼입된 경우, ≥ 10 μg/ml 농도의 3h56-269-IgG4.1은 세포 표면 마커 및 시토카인 방출 둘 다에 의해 측정시 효능제 CD40 항체를 가교시키는 것과 유사한 iDC 활성화를 발생시켰다 (도 3).
실시예 2: 손상된 FcgR 결합을 갖는 dAB-Fc 분자
추가의 Fc 돌연변이가 FcgR 클러스터 또는 가교에 의해 매개되는 간접적인 iDC 활성화를 감소시킬 수 있는지 결정하기 위해, FcgR 결합을 감소시키기 위해 Fc 도메인 내에 돌연변이를 갖는 다른 dAb-Fc 분자를 생산하였다. FcgR 결합 친화도를 SPR에 의해 특징화하였다. 본 실시예에 사용된 물질 및 방법은 하기를 포함한다.
FcgR 결합 SPR: 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 정제된 FcgR을 사용하여 시험관내에서 FcgR 결합을 측정할 수 있다. 본원에서 2가지 방법을 사용하였다.
하나의 방법은 항-His 항체의 고정화된 Fab 단편 상에 포획된 His-태그부착된 FcgR 단백질 (FcgR-His)에 대한 정제된 항체 또는 dAb-Fc 단백질의 결합을 시험한다. 이들 실험은 25℃에서 비아코어™ T100 또는 비아코어™ T200 기기 (지이 헬스케어) 상에서 수행된다. 뮤린 항-6xHis 항체 (사내 생성됨)로부터의 Fab 단편을 에탄올아민 차단을 갖는 표준 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)/N-히드록시숙신이미드 (NHS) 화학을 사용하여, 10 밀리몰 (mM) HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 p20 (HBS-EP+)의 구동 완충제 중 ~3000 공명 단위 RU의 밀도로 CM5 센서 칩 상에 고정화시킨다. 모든 남아있는 연구는 pH 7.1의 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T)의 구동 완충제를 사용하여 수행한다. C-말단 6x 폴리-히스티딘 태그를 함유하는 다양한 FcgR 단백질 (사내 생성됨)을 10 μl/분에서 30초(들)의 접촉 시간을 사용하여 이 표면 상에 포획하였다 (전형적으로 ~7 μg/ml의 FcgR-His 단백질 농도를 사용함). 다양한 농도의 정제된 항체 또는 dAb-Fc 단백질을 결합에 대해, 예를 들어 30 μl/분에서 120초의 회합 시간 및 30 μl/분에서 120초의 해리 시간을 사용하여 시험한다. 이들 연구에서 시험된 FcgR 단백질은 "고친화도" FcgR hCD64 (hFcgRI), 뿐만 아니라 "저친화도" FcgR hCD32a-H131 (FcgRIIa-H131), hCD32a-R131 (FcgRIIa-R131), hCD32b (FcgRIIb), hCD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), hCD16a-F158 (FcgRIIIa-F158), hCD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1), 및 hCD16b-NA2 (FcgRIIIb-NA2)를 포함한다.
결합 반응을 정량적으로 분석하고 상이한 분자의 FcgR 결합을 비교하기 위해, 일반적으로 Eq. 1에 제시된 바와 같이 최대 결합 반응을 이론적 최대 결합 반응의 백분율 (%Rmax)로서 계산함으로써 SPR 결합 데이터를 분석할 수 있다.
Figure pat00022
구체적으로, %Rmax는 하기 방정식을 사용하여 계산된다:
Figure pat00023
여기서 "분석물"은 항체 또는 dAb-Fc이고, "리간드"는 포획된 FcgR 단백질이다. 이러한 분석은 항체, dAb-Fc 또는 FcgR의 글리코실화의 질량을 고려하지 않고, 포획된 리간드에 대해 100% 분율 활성을 가정한다.
"%Rmax 분석"은 시험된 분석물 농도 (1 마이크로몰 (μM)) 근처 또는 그 미만에서 비교적 빠른 회합률 및 해리율 및 친화도를 갖는 "저친화도" FcgR, 예를 들어, hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16a-F158, hCD16b-NA1 및 hCD16b-NA2의 결합을 평가하는 데 특히 유용하고, 따라서 표면의 포화는 일반적으로 이들 조건 하에 달성되지 않는다. 대조적으로, "고친화도" FcgR hCD64는 특히 IgG1 및 IgG4에 대해 다른 FcgR보다 더 높은 친화도 및 더 느린 해리 동역학으로 결합하고, 따라서 이들 이소형은 전형적으로 마이크로몰 분석물 농도 하에 hCD64 표면을 포화시키고, %Rmax를 사용하여 친화도를 구별하기가 더 어렵다. 이들 상호작용에 대해, 항체 사이의 차이는 센소그램 데이터에서 해리 속도를 비교함으로써 용이하게 관찰할 수 있다.
항체 또는 dAb-Fc 단백질과 FcgR 단백질 사이의 상호작용을 시험하기 위한 제2 SPR 검정은 단백질 A 포획 방법이다. 이들 실험은 또한 25℃에서 비아코어™ T100 또는 비아코어™ T200 기기 (지이 헬스케어) 상에서 수행된다. 이들 연구를 위해, 단백질 A를 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 p20의 구동 완충제 중에서 ~3000 RU의 밀도로, 에탄올아민 차단을 갖는 표준 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)/N-히드록시숙신이미드 (NHS) 화학을 사용하여 CM5 센서 칩의 유동 셀 1-4 상에 고정화시킨다. 항체 또는 dAb-Fc 단백질 (전형적으로 ~3-10 μg/ml)을 단백질 A 표면 상에 포획하고, FcgR 분석물의 결합을, 예를 들어 30 μl/분의 유량에서 120초 회합 시간 및 180초 해리 시간을 사용하여, 25℃에서 pH 7.1의 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20, 완충제 (PBS-T)로 이루어진 구동 완충제 중에서 시험하였다.
단백질 A 포획 검정을 또한 사용하여 항체 또는 dAb-Fc 분자를 함유하는 정제되지 않은 상청액을 분석할 수 있다. 이러한 분석을 위해, 희석되지 않은 상청액 또는 구동 완충제로 희석된 상청액으로부터 항체 또는 dAb-Fc 단백질을 포획할 수 있다. 결합 반응을 정량적으로 분석하고 상이한 분자의 FcgR 결합을 비교하기 위해, 상기 Eq. 1을 사용하여 %Rmax를 계산함으로써 SPR 결합 데이터를 분석할 수 있으며, 여기서 분석물은 정제된 FcgR 단백질이고, 리간드는 포획된 항체 또는 dAb-Fc 단백질이다.
%Rmax 분석 이외에, 결합의 동역학 및 친화도의 정량적 분석은 단백질 A 포획된 항체 또는 dAb-Fc 단백질에의 결합에 대해 FcgR 분석물의 적정을 시험함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 3:1 연속 희석물 중 FcgR은 10 μM에서 아래로 0.15 nM (hCD64) 또는 1.5 nM (모든 다른 FcgR)로 적정될 수 있다. 이들 동역학적 데이터는 동역학 및 친화도 값을 수득하기 위해 비아코어™ T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 모델 또는 정상-상태 결합 모델에 피팅될 수 있다.
dAb-Fc: 본 실시예에서 연구된 dAb-Fc는 표 5에 제시된 것들을 포함한다. 본 실험에서 연구된 추가의 dAb-Fc의 아미노산 서열이 표 6에 제시된다. 이들 서열에서, 단일 가변 도메인 3h56-269 잔기는 아미노산 1- 118 (밑줄표시됨)이다. 링커 AST (서열식별번호: 57)는 이중-밑줄표시된다. C-말단 잔기는 Fc 도메인이다.
표 6
Figure pat00024
대조군 mAb: 대조군 모노클로날 항체 (1F4)를 또한 유사한 Fc 도메인 돌연변이로 포맷화하였다. 항체는 CD40에 결합하지 않는다. 표 7에서 서열식별번호: 80은 대조군 항체 중쇄 가변 영역 (밑줄표시됨) 및 CH1의 서열이고, 서열식별번호: 81은 경쇄 가변 영역 (밑줄표시됨) 및 CL의 서열이다. 다양한 포맷화된 중쇄가 표 7에 서열식별번호 82-87로서 제시된다. IF4 중쇄 가변 영역 및 CH1 영역 서열은 서열식별번호: 82-87에 밑줄표시된다. 각각의 1F4 mAb 변이체에 대한 중쇄 및 경쇄 서열의 쌍은 표 8에 제시된다.
표 7
Figure pat00025
Figure pat00026
표 8
Figure pat00027
결과: FcgR 결합을 감소시키기 위해 Fc 도메인 내에 돌연변이를 갖는 dAb-Fc 분자를 생산하였다. 구체적으로, 항-CD40 도메인 항체 3h56-269를 하기 Fc 도메인 변이체: IgG1.1f, IgG1.3f 및 IgG1-D265A로 포맷화하였다. 각각의 3h-56-269-IgG1.1f (서열식별번호: 77), 3h-56-269-IgG1.3f (서열식별번호: 78), 및 3h-56-269-IgG1-D265A (서열식별번호: 79)에서, 아미노산 1-116은 3h-56-269 dAb이고, 아미노산 117-119는 링커이고, 아미노산 120-351은 Fc 도메인이다.
각각의 이들 dAb-Fc 융합 단백질, 뿐만 아니라 각각의 3h56-269-IgG4.1 및 3h56-269-CT는 비아코어™ SPR에 의해 측정시 정제된 인간-CD40 단량체 (hCD40단량체, 사내 생성됨)에 대해 고친화도로 결합하는 것으로 확인되었다. 표 9에 제시된 바와 같이, KD 값은 상이한 Fc 변이체에 대해 7.3 nM 내지 11.5 nM 범위이다. 각각의 dAb-Fc 분자는 또한 센서 칩의 표면 상의 hCD40-Fc 및 용액 중 가용성 분석물로서의 dAb-Fc 분자를 사용하여 SPR에 의해 측정시 높은 결합력으로 인간 CD40에 결합하였고, 여기서 250 nM 및 25 nM dAb-Fc 분석물 주입에 대한 데이터를 1:1 랭뮤어 모델에 피팅시켜 모든 dAb-Fc에 대한 결합력-영향 겉보기 KD 값 (KD겉보기)을 <1 nM로서 추정하였다. 표 9를 참조한다.
표 9: 인간 CD40에 대한 dAb-Fc 분자의 결합에 대한 SPR 데이터.
Figure pat00028
dAb-Fc 분자 및 다양한 대조군 모노클로날 1F4 항체의 FcgR 결합 특성을 SPR에 의해 특징화하였다. 제1 검정은 항-His Fab 포획된 FcgR-His 표면에 대한 1 μM 또는 10 μM dAb-Fc 또는 인간-IgG1f 항체 대조군 (1F4-IgG1f)의 결합을 수반하였다. 이들 데이터는 표 10에 제시된다.
표 10: 항-His Fab 포획된 hFcgR-His 단백질에 대한 1μM 또는 10μM dAb-Fc 또는 1F4-IgG1f 항체 대조군 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00029
또 다른 검정에서, FcgR 분석물 (1 μM 또는 10 μM)을 단백질 A-포획된 dAb-Fc 표면에 대한 결합 (데이터는 표 11에 제시됨) 및 항체 표면에 대한 결합 (데이터는 표 12에 제시됨)에 대해 시험하였다.
표 11: 단백질 A-포획된 dAb-Fc 단백질에 대한 1 μM 또는 10 μM FcgR 결합에 대한 %RMax 데이터.
Figure pat00030
표 12: 단백질 A 포획된 항체에 대한 1 μM 또는 10 μM FcgR 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00031
이들 실험에서의 결합 반응 또는 그의 결여에 기초하여, 분석물 적정 (단백질 A 포획된 항체 또는 dAb-Fc에 결합하는 FcgR 분석물)을 사용하는 동역학/친화도 특징화를 위해 가장 강한 결합 반응을 갖는 보다 높은 친화도 dAb-Fc/FcgR 또는 Ab/FcgR 상호작용의 하위세트를 선택하였다. 이들 데이터는 표 13에 제시된다.
표 13: 단백질 A 포획된 항체 또는 dAb-Fc에 결합하는 정제된 FcgR 분석물에 대한 KD 값 (nM 단위).
Figure pat00032
집합적으로, 이들 FcgR 결합 SPR 데이터는 IgG1f 및 IgG4.1 이소형 분자가 변형된 Fc 변이체 IgG1-D265A, IgG1.1f, IgG1.3f, 또는 CT 분자와 비교하여 모든 FcgR에 걸쳐 유의하게 더 높은 FcgR 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 변형된 Fc 변이체 중에서, hCD64 결합 친화도는 3h56-269-CT의 경우에 가장 강하고 (KD = 4.6nM), 3h56-269-IgG1-D265A의 경우에 보다 약하고 (KD = 62nM), 3h56-269-IgG1.1f 및 3h56-269-IgG1.3f의 경우에 가장 약하였으며, 이들은 친화도가 시험된 조건 하에 정량하기에 너무 약하였다 (KD > 5 μM, 시험된 최고 분석물 농도의 절반). IgG1-D265A, IgG1.1f, IgG1.3f 및 CT 변이체에 대한 모든 다른 FcgR 상호작용 (hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16b-NA2)은 또한 신뢰성 있는 KD 값을 수득하기에 너무 약하였다 (KD > 5 μM). 그러나, 상대 결합 반응에서의 차이는 %Rmax 데이터에서 관찰할 수 있다. 예를 들어, IgG1-D265A 변이체는 IgG1.1f, IgG1.3f 또는 CT 변이체와 비교하여 hCD32a-H131에 대해 보다 강한 결합 반응을 갖는다 (표 11). 대조적으로, IgG1.1f 및 IgG1.3f 변이체는 IgG1-D265A 및 CT 변이체와 비교하여 hCD32a-R131에 대해 보다 강한 결합 반응을 갖는다 (표 11).
dAb-Fc 분자를 CD32-과다발현 CHO 세포 가교의 존재 및 부재 하에 iDC 검정 (실시예 1에 기재됨)에서 시험하였다. 이들 데이터는 도 4에 제시된다. 3h-59-269-CT 분자는 최대 100 μg/ml의 농도에서의 대조군 수준 초과의 iDC 활성화를 생성하지 않았으며 (도 4의 좌측 패널), CD32-발현 CHO 세포를 사용하여 가교결합된 경우에도 그러하였다 (도 4의 우측 패널). 그러나, FcgR 결합을 최소화하도록 설계된 변화를 갖는 도메인 항체의 Fc-융합체 (3h-59-269-IgG1.1f 및 3h-59-269-IgG1.3f)는 100 μg/ml의 시험된 최고 농도에서 시험된 4종의 공여자 중 적어도 1종으로부터 CD54 (ICAM 1로도 불림) 및 CD86 발현의 상향조절 및 증가된 시토카인 방출에 의해 측정시 감소된, 그러나 여전히 측정가능한, iDC 활성화를 나타내었다. CD32-발현 CHO 세포를 포함시켜 가교를 도입하는 것은 모든 4종의 공여자에서 CD86 및 CD54 발현 상향조절에 의해 측정시 강건한 iDC 활성화를 야기하였다. 이들 데이터는 iDC 활성화의 FcgR 의존성이 관찰되었음을 입증한다.
실시예 3: dAb-Fc 단백질에 대한 개발가능성 평가
단백질 치료제를 시판하기 위해서는 분자가 화학 제조 및 관리 (CMC)로 통상적으로 지칭되는, 개발을 위한 적합한 물리적 및 화학적 특성을 갖는 것을 필요로 한다. 안정성, 용해도 및 균질성을 포함한 분자의 물리적 및 화학적 특성은 또한 집합적으로 "개발가능성"으로 지칭된다. 단백질 치료제 후보 분자의 개발가능성을 평가하기 위한 많은 기술 및 검정이 개발되었고, 그 중 일부는 시차 주사 열량측정법 (DSC), 영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF), 질량 분광측정법 (MS 또는 질량 스펙), 및 가속 안정성 연구를 포함한다.
다양한 dAb-Fc 단백질의 개발가능성을 DSC, icIEF 및 질량 분광측정법에 의해 평가하였다. 물질 및 방법은 하기에 기재된다.
시차 주사 열량측정법: DSC 실험을 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl pH 7.1 중에서 마이크로칼(MicroCal) VP-모세관 DSC 기기 (말번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 영국 말번) 상에서 수행하였다. 1 mg/ml dAb-Fc 또는 항체의 샘플을 10-110℃의 스캔 범위 및 90℃/hr의 스캔 속도를 사용하여 시험하였다. 마이크로칼-오리진 7.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
영상화 모세관 등전 포커싱: icIEF 실험을 프로테인심플(ProteinSimple) iCE3™ 시스템 (프로테인심플, 캘리포니아주 산호세) 상에서 수행하였다. 이들 연구를 위해, 전형적으로 2 mg/ml 농도의 dAb-Fc 또는 항체 샘플을 2M 우레아, 0.35% 메틸셀룰로스, 1% 파마라이트 5-8, 3% 파마라이트 8-10.5, 및 pI 마커 5.85 및 10.10으로 이루어진 담체 양성전해질 혼합물과 0.20 mg/mL의 최종 단백질 농도로 혼합하고, 1.5 kV에서 1분의 사전-포커싱 시간 및 3 kV에서 10분의 포커싱 시간을 사용하여 분석하였다.
질량 분광측정법: 질량 분광측정법 (질량 스펙) 분석을 위해, 샘플을 100 mM DTT를 사용하여 환원시키고, 펩티드:N-글리코시다제 (FPNGaseF)를 사용하여 N-탈글리코실화를 수행하였다. 사용된 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC/MS) 기기는 워터스 액퀴티(Waters Acquity)® UPLC (초고성능 액체 크로마토그래피)를 구비한 워터스 시냅트(Waters Synapt)® G2 (워터스 코포레이션(Waters Corporation), 매사추세츠주 밀포드)였다. UPLC 칼럼은 워터스 액퀴티® BEH (에틸렌 가교된 하이브리드 입자) C4 (2.1 x 150 mm, 300 Å, 1.7 um 입자)였다. 구배는 10분 내에 200 μL/분 유량에서 10%에서 38% (이동상 B)였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산이었다. 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 칼럼 온도는 60℃였다. 데이터 분석을 워터스 매스링스(MassLynx)™ 소프트웨어의 도움으로 수동으로 수행하였고; MaxEnt1 알고리즘을 사용하여 스펙트럼 디컨볼루션을 수행하였다.
가속 안정성 연구: 먼저 4℃에서 표적 제제 완충제 중에서 dAb-Fc 분자를 광범위하게 투석함으로써 가속 안정성 연구를 수행하였다. 샘플을 회수하고, 아미콘(Amicon)® 울트라 원심분리 필터 유닛 (머크 카게아아(Merck KgaA), 독일)을 사용하여 농축시키고, 투석 완충제 중에서 상이한 표적 농도로 제조하였다. 이들 샘플을 다양한 온도, 전형적으로 4℃, 25℃, 32℃, 및/또는 40℃에서 수주 동안 인큐베이션하면서, 분취물을 분리하고 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 7.3, 0.3 ml/분의 유량의 이동상에서 쇼덱스(Shodex)™ K403-4F 칼럼 (쇼와 덴코 아메리카, 인크.(Showa Denko America, Inc.), 뉴욕주 뉴욕)을 사용하여 애질런트 1260 HPLC 상에서 수행하였다.
결과- 시차 주사 열량측정법: DSC를 사용하여 단백질의 열 안정성을 측정할 수 있다. 상이한 Fc 도메인으로 포맷화된 3h56-269 dAb에 대한 DSC 데이터가 도 5에 제시된다. 최상 피트 Tm 값은 표 14에 요약된다.
표 14: DSC에 의해 결정된 dAb-Fc 분자에 대한 열 용융 온도 (Tm) 값.
Figure pat00033
IgG Fc 도메인에 대한 특징적인 열 변성 프로파일에 기초하여, 3h56-269-IgG4.1에 대한 Fc CH3 도메인 전이는 69.6℃의 중간점 (Tm) 값을 갖는 전이로 할당되었고; 다양한 IgG1 분자의 Fc CH3 도메인은 ~82 - 83℃ 근처의 Tm을 갖는 전이로 할당되었다. dAb-Fc에 대한 dAb 도메인 및 CH2 도메인의 변성은, 상이한 구축물들 사이에서, 열 변성의 개시 (T개시), 언폴딩 전이의 형상, 및 최상 피트 Tm 값 모두가 상이한 65℃ 미만의 전이(들)로 할당되었다. 예를 들어, 3h56-269-IgG4.1의 dAb 및 CH2 도메인에 대한 열 전이는 단일 중첩 또는 협동 전이로 나타났고, Tm 값은 62.8℃였다. 3h56-269-IgG1-D265A, 3h56-269-IgG1.1f 및 3h56-269-IgG1.3f의 dAb 및 CH2 도메인에 대한 변성 프로파일은 모두 보다 비대칭인 전이와 일치하였고, 이는 ~56 - 63℃의 Tm 값을 갖는 2개의 전이에 의해 가장 잘 설명되었다. 3h56-269-CT는 40℃ 근처에서 언폴딩하기 시작하는 최저 T개시를 가졌고, 이는 광범위한 열 전이 및 Tm1 = 55.4℃ 및 Tm2 = 60.4℃의 최저 피팅된 Tm 값을 가졌다.
결과 - 영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF): 영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)을 사용하여 샘플 균질성 또는 불균질성을 특징화할 수 있다. 균질한 제품을 생성하는 능력은 또 다른 중요한 개발가능성 기준이다. 결과적으로, 신규 단백질 치료제의 발견 및 최적화 동안, 다양한 분석 방법을 이용하여 샘플 불균질성을 특징화 및 정량화하고 가장 균질한 분자를 선택한다.
dAb-Fc 분자에 대한 전하 프로파일을 icIEF에 의해 특징화하였다. 데이터는 도 6에 제시된다. 3h56-269-IgG4.1 (도 6A), 3h56-269-IgG1.1f (도 6E) 및 3h56-269-IgG1.3f (도 6F)에 대한 icIEF 프로파일은 모두 비교적 간단하고, 각각은 69-86%의 면적을 갖는 별개의 주요 피크, 및 보다 낮은 존재비의 2 내지 4종의 전하 변이체로 이루어진다. 이러한 icIEF 프로파일은 항체에 대해 수득된 전형적인 프로파일과 유사하다. 3h56-269-IgG1-D265A에 대한 주요 피크 (도 6D)는 다소 더 낮은 존재비 (49%)이며 적어도 6종의 검출가능한 종을 갖는 산성 변이체의 상응하는 더 높은 수준을 갖는다. 대조적으로, 3h56-269-CT에 대한 프로파일 (도 6B)은 고도로 불균질하며, 적어도 16종의 상이한 종으로 이루어지고 명백한 주요 피크가 없다. 상이한 세포주 (UCOE-CHO)에서 발현된 3h56-269-CT에 대한 icIEF 프로파일은 동등하게 불균질하였지만 (도 6C), 전하 변이체의 분포는 HEK293-발현된 물질과 상당히 상이하였다.
결과- 질량 분광측정법: IgG 또는 Fc-함유 단백질의 Fc 도메인 상의 전형적인 글리코실화는 G0F, G1F 및 일부 G2F 종의 혼합물이다. 다른 당형태, 예컨대 시알릴화 또는 비-푸코실화 형태는 일반적으로 훨씬 더 낮은 존재비 또는 검출불가능한 수준으로 발견된다.
dAb-Fc 단백질의 글리코실화 프로파일을 특징화하기 위해, 및 dAb-Fc 단백질을 유사한 Fc 돌연변이를 갖는 대조군 항체와 비교하기 위해, 질량 분광측정법 실험을 수행하였다. 데이터는 표 15에 제시된다.
표 15: 질량 분광측정법에 의해 결정된 dAb-Fc 및 항체 분자의 검출가능한 당형태.
Figure pat00034
대조군 항체 1F4-IgG1f 및 1F4-IgG1.3f, 뿐만 아니라 dAb-Fc 항체 3h56-269-IgG4.1, 3h56-269-IgG1.1f, 3h56-269-IgG1.3f에 대한 질량 분광측정법 데이터는 이들 단백질이 G0F, G1F 당형태의 전형적인 혼합물로 이루어지고, 더 낮은 존재비의 G2F 종을 갖는다는 것을 보여주었다.
Fc 도메인 내에 D265A 돌연변이를 함유하는 dAb-Fc 및 항체 분자 둘 다는 또한 G0F, G1F 및 G2F 종의 혼합물을 함유하였지만, 추가로 이들은 더 높은 수준의 시알릴화 당형태를 가졌다. 모든 이들 D265A 분자는 표준 PNGase 효소 처리 프로토콜을 사용하여 탈글리코실화될 수 있고; 이 데이터는 N-연결되고 Fc 도메인 내에 공통 Asn297 잔기를 점유하는 D265A 분자의 글리칸과 일치한다.
대조적으로, HEK293 또는 UCOE-CHO 세포에서 발현되는 3h56-269-CT, 또는 대조군 1F4-CT 항체에 대한 질량 분광측정법 데이터는, 고도로 시알릴화된 종을 포함한 수많은 상이한 복합 글리코실화 종에 대한 증거와 함께, 이들 단백질이 매우 불균질하다는 것을 밝혀냈다. 3h56-269-CT에 대한 데이터는 표 16에 제시된다.
표 16: 질량 분광측정법에 의해 결정된 3h56-269-CT 분자의 검출가능한 당형태.
Figure pat00035
Figure pat00036
Figure pat00037
대조군 1F4-CT 항체에 대한 질량 스펙 데이터는 표 17에 제시된다.
표 17: 질량 분광측정법에 의해 결정된 1F4-CT의 검출가능한 당형태.
Figure pat00038
또한, 3h56-269-CT 및 1F4-CT 분자는 PNGase로 처리하여 효과적으로 탈글리코실화될 수 없었고; 이들 결과는 복합 글리칸 중 적어도 일부가 Ser 또는 Thr 잔기 상에서 O-연결된다는 것을 시사한다. 이들 데이터는 C220S, C226S, C229S 및 P238S 돌연변이를 함유하는 동일한 변형된 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 아바타셉트의 공지된 글리코실화와 일치한다. 아바타셉트에서, 이들 도입된 Ser 돌연변이는 힌지 영역에서 O-연결된 글리코실화 부위이며, 이는 불균질하게 글리코실화되고 시알산 종에서 높은 것으로 밝혀졌다.
결과 - 가속 안정성 연구: 추가의 개발가능성 평가를 포함한 추가의 연구를 위해 3h56-269-CT를 선택하였는데, 이는 3h56-269-CT가 CD32 과다발현 CHO 세포 가교의 부재 또는 존재 하에 iDC 검정에서 반응을 입증하지 않은 유일한 dAb-Fc 분자였기 때문이다. 특히, 안정성 연구를 32℃ 및 40℃의 가속 스트레스 조건, 뿐만 아니라 4℃ 및 25℃의 보다 낮은 온도 하에 수행하였다. 이들 연구를 위한 제제 완충제 (20 mM 인산칼륨, 250 mM 수크로스, 50 μM DTPA 및 0.05% PS80, pH7.0)를 UNit 플랫폼 (언체인드 랩스(Unchained Labs), 매사추세츠주 워번)을 사용한 분자의 열 안정성의 스크리닝에 기초하여 선택하여 유리한 열 안정성 (Tm) 및 응집 개시 (Tagg)를 제공하는 조건을 확인하였다. 상기 제제 완충제를 투석에 의해 정제된 3h56-269-CT 단백질로 교환한 다음, 농축시키고, 50 mg/ml 또는 150 mg/ml의 최종 농도로 제조하고, 다양한 온도에서 4주 동안 인큐베이션하였다. 단백질의 물리적 안정성을 평가하기 위해, 분취물을 상이한 온도 인큐베이션의 개시 후 시점 0 (t0), 1주 (1w) 및 4주 (4w)에 분리하였다. 샘플을 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (aSEC)에 의해 분석하여 단량체 단백질, 고분자량 응집체 (HMW) 및 저분자량 종 (LMW) 종의 수준을 결정하였다. HMW 데이터는 표 18에 제시된다.
표 18: 상이한 온도에서 4주 동안 인큐베이션된 3h56-269-CT의 샘플 중 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 고분자량 (HMW) 종의 백분율.
Figure pat00039
aSEC 데이터는 특히 보다 높은 단백질 농도 및 보다 높은 온도에서 3h56-269-CT에 대해 높은 수준의 HMW 형성을 보여주었다.
실시예 4: 변이체 Fc 도메인
실시예 1 및 2에 제시된 바와 같이, 3h56-269-CT 분자는 유리하게는 특히 저친화도 FcgR (hCD32a, hCD32b, hCD16a, hCD16b)에 대해 유리하게 약한 FcgR 결합을 갖는 것으로 밝혀졌고, 또한 예컨대 CD32 과다발현 CHO 세포 가교 하의 것을 포함한 iDC 검정에서 반응의 결여를 입증하였다. 그러나, 실시예 3에 제시된 바와 같이, 3h56-269-CT의 생물물리학적 특징화는 분자가 낮은 열 안정성, 높은 불균질성, 및 불량한 물리적 안정성을 갖는다는 것을 보여주었다. 결과적으로, 유리하게 약한 FcgR 결합 및 iDC 검정에서의 신호의 결여를 유지하면서 O-연결된 글리칸을 감소시키거나 제거하고, 시알산 함량을 감소시키거나 제거하고, 불균질성을 감소시키고, 열 및 물리적 안정성을 개선시킬 목적으로, 3h56-269-CT 분자를 개선시키기 위해 개시한 노력을 수행하였다.
3h56-269-CT의 생물물리학적 특징을 개선시키기 위해, 일련의 돌연변이체 dAb-Fc 분자를 3h56-269-CT의 특성에 대한 개별 C220S, C226S, C229S 및 P238S 돌연변이의 기여를 이해하려고 시도하고, 바람직하지 않은 개발가능성 과제를 바람직한 약한 FcgR 결합 및 Fc-매개 신호전달의 결여로부터 분리하도록 설계하였다. 돌연변이 전략은 위치 220, 226, 229, 및 238 (카바트 넘버링)에서의 여러 변이체의 설계를 수반하였다. 하기 변이체를 설계하였다:
a) 이들 돌연변이의 개별 및 조합 효과를 시험하기 위한, 위치 220, 226, 229 및 238에서의 단일 및 조합 Ser 돌연변이체의 세트. 표 19에서의 서열식별번호: 88-96을 참조한다. 밑줄표시된 서열은 항-CD40 단일 가변 도메인이다.
표 19
Figure pat00040
Figure pat00041
b) O-연결된 글리코실화의 1차 부위 및 분자 특성에 대한 영향을 확인하기 위한, 위치 226, 229 및 238에서의 단일 및 조합 Ala 또는 조합 Ala 및 Ser 돌연변이체의 세트. Ser 돌연변이와 같이, C220, C226 및 C229에서의 Ala 돌연변이는 디술피드 결합 형성을 방지할 것으로 예상된다. 그러나, Ser과 달리, Ala 잔기는 O-연결된 글리코실화 부위가 아니다. 표 20에서의 서열식별번호: 97-109를 참조한다.
표 20
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
c) 리신으로 돌연변이된 P238 (P238K)을 갖는 돌연변이체의 세트를 설계하여 FcgR 결합 친화도가 이러한 보다 낮은 힌지 영역 내의 이러한 위치에서의 비-보존적 양으로 하전된 잔기에 의해 감소될 수 있는지를 시험하였다. 표 21에서의 서열식별번호: 110-116을 참조한다.
표 21
Figure pat00045
Figure pat00046
d) IgG1a 및 IgG1f 동종이형 둘 다와 관련된 L234A, L235A 돌연변이 ("LALA"로 약칭됨)를 갖는 dAb-Fc 분자를 또한 생성하였다. 표 22에서의 서열식별번호: 117-118을 참조한다.
표 22
Figure pat00047
e) IgG1a 및 IgG1f 동종이형 둘 다와 관련된 단일 N297A 돌연변이를 함유하는 dAb-Fc 분자를 또한 생성하였다. 표 23에서의 서열식별번호: 119-120을 참조한다.
표 23
Figure pat00048
dAb-Fc 변이체 이외에, 관련 Fc 돌연변이체의 보다 작은 세트를 설계하여 전체 IgG와 관련된 유사한 돌연변이가 dAb-Fc 포맷에서와 같은 특성에 대해 유사한 영향을 미칠 것인지를 결정하였다. 대조군 1F4 항체의 가변 도메인을 갖는 모든 IgG 변이체를 생산하였다. 이들 변이체의 중쇄의 서열이 표 24에 제시된다. 가변 영역 및 CH1 영역을 포함한 1F4 중쇄의 부분의 서열 (서열식별번호: 80)은 이탤릭체표시된다. 각각의 이들 변이체 1F4 모노클로날 항체에 대해, 경쇄 서열은 서열식별번호: 81이었다 (표 7 참조). 변이체는 하기를 포함하였다:
a) 단일 및 이중 C226S 및 C229S 변이체. 표 24에서의 서열식별번호: 121-123을 참조한다.
b) 단일 및 이중 C226A 및 C229A 변이체. 표 24에서의 서열식별번호: 124-126을 참조한다.
c) P238S 및 P238K 변이체. 표 24에서의 서열식별번호: 127-128을 참조한다.
d) C226S,C229S,P238S 삼중 돌연변이체를 IgG1f 동종이형과 관련하여 시험하였다. 표 24에서의 서열식별번호: 129를 참조한다.
e) N297A 돌연변이를 IgG1f 동종이형과 관련하여 시험하였다. 표 24에서의 서열식별번호: 130을 참조한다.
표 24
Figure pat00049
Figure pat00050
Figure pat00051
각각의 1F4 mAb 변이체에 대한 중쇄 및 경쇄 서열의 쌍은 표 25에 제시된다.
표 25
Figure pat00052
항체 경쇄의 C-말단 Cys 잔기와 쌍형성하기 위한 무손상 야생형 Cys220 잔기를 갖는 모든 1F4-IgG 변이체를 생산하였다.
실시예 5: 변이체 Fc 도메인을 갖는 1F4 대조군 항체의 특징화
Fc-조작된 1F4 항체 분자의 FcgR 결합 특성을 특징화하기 위해, 실시예 2에 기재된 바와 같이 항-His 포획된 FcgR 표면에 대한 1 μM 또는 10 μM 정제된 항체 분석물 결합을 시험함으로써 SPR 실험을 수행하였다. 결합 반응을 분석하고, %Rmax 값으로 나타내었다; 결과는 표 26에 제시된다.
표 26: 항-His Fab 포획된 hFcgR-His 단백질에 대한 1 μM 또는 10 μM 1F4-IgG1f 항체 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00053
Figure pat00054
이들 데이터는 야생형 IgG1f 항체 (1F4-IgG1f)와 비교하여, 힌지 영역 내 위치 226 (1F4-IgG1a-C226S) 또는 위치 229 (1F4-IgG1a-C229S)에서의 단일 Cys→Ser 돌연변이가 FcgR 결합에 최소 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이중 C226S, C229S 돌연변이체 (1F4-IgG1a-C226S-C229S)는 모든 저친화도 FcgR 단백질에 대해 유의하게 더 약한 결합 반응을 갖지만; 결합 반응은 1F4-CT 분자의 것보다 여전히 유의하게 더 강하다. 이들 데이터는 1F4-CT 분자에서의 추가의 P238S 돌연변이가 감소된 FcgR 결합에 추가로 기여한다는 것을 시사한다.
단일 C226A (1F4- IgG1a-C226A) 또는 C229A (1F4- IgG1a-C229A) 돌연변이체는 단일 C226S 또는 C229S 돌연변이체와 유사하게 FcgR에 결합하였고; 마찬가지로 C226A,C229A 이중 돌연변이체 (1F4- IgG1a-C226A-C229A)는 C226S,C229S 이중 돌연변이체 (1F4- IgG1a-C226S-C229S)와 유사하게 FcgR에 결합하였다. 이들 부위에서의 Ala 돌연변이는 이들 부위에서의 Ser 돌연변이와 유사하게 중쇄간 디술피드 결합 형성을 방지할 것이다. 그러나, Ser 돌연변이와 달리, Ala 돌연변이는 O-글리코실화 부위가 아닐 것이다. 따라서, 이들 데이터는 S226 및/또는 S229에서의 O-글리코실화가 FcgR 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
P238K 및 N297A 변이체 (각각 1F4- IgG1a-P238K 및 1F4-N297A)는 저친화도 FcgR에 대한 가장 약한 결합 반응을 입증하며, 이는 hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 또는 hCD16b-NA2에 대한 검출가능한 결합 신호가 본질적으로 없다는 것을 입증한다. 1F4-IgG1a-P238K 변이체는 또한 1F4-IgG1a-P238S 변이체보다 더 약한 FcgR 결합을 입증하였으며, 이는 위치 238에서의 Lys가 그 위치에서의 Ser보다 FcgR 결합을 파괴하는 데 더 효과적이라는 것을 시사한다. 또한, SPR 센소그램 데이터는 hCD64에 대한 1F4-IgG1f-N297A 및 1F4-IgG1a-P238K 결합의 해리율이 1F4-IgG1f 또는 1F4-CT의 것보다 유의하게 더 빠르다는 것을 보여주었다. 도 7을 참조한다.
Fc-변이체 1F4 항체의 열 안정성을 실시예 3에 기재된 바와 같이 DSC에 의해 특징화하였다. 열 전이는 IgG 분자에 대한 잘 특징화된 열 변성 프로파일에 기초하여 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 Fab 도메인에 할당되었고, 최적 피트 Tm 값은 표 27에 요약되어 있다.
표 27: DSC에 의해 결정된 1F4 항체에 대한 열 용융 온도 (Tm) 값.
Figure pat00055
1F4 항체의 Fab 도메인은 71.6℃ 내지 74.7℃의 피트 Tm을 갖는다. 모든 분자의 CH3 도메인은 야생형 (비변형된) IgG1 CH3 도메인에 대해 전형적인 82.1℃ 내지 83.1℃에서 용융되었다. CH2 도메인은 항체의 가장 덜 안정한 도메인이었고, 용융 온도는 상이한 돌연변이체에 대해 상이하였으며, 이는 힌지/CH2 영역에서의 돌연변이가 CH2의 열 안정성에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 1F4-CTf (54.3℃), 및 1F4-CT (55.1℃)의 CH2 도메인에 대한 Tm 값은 1℃ 미만 상이하였으며, 이는 IgG1 동종이형이 CH2 도메인의 열 안정성에 최소 영향을 미친다는 것을 시사한다. 그러나, 이들 CH2 도메인은 1F4-IgG1f (72.2℃)의 야생형 CH2 도메인에 비해 ~17-18℃만큼 극적으로 탈안정화되었다. 이들 데이터는 3h56-269-CT의 CH2/dAb 도메인에 대해 관찰된 낮은 열 안정성과 일치한다.
힌지 영역 내에 단일 Cys→Ser 돌연변이를 갖는 Fc 돌연변이체는 야생형 IgG1f와 비교하여 적당하게 더 낮은 CH2 도메인 안정성을 갖고, CH2 도메인 Tm 값은 1F4-IgG1a-C226S의 경우 70.3℃이고 1F4-IgG1a-C229S의 경우 69.9℃였다. 힌지 Cys 잔기 둘 다의 Ser로의 돌연변이는 1F4-IgG1a-C226S,C229S의 경우 CH2 도메인 Tm을 64.8℃로 추가로 감소시켰다. 단일 P238S 돌연변이도 또한 야생형 1F4-IgG1f와 비교하여 CH2 도메인 안정성을 감소시켰다 (62.4℃). 따라서, 이들 데이터는 1F4-CT에서의 3종의 개별 돌연변이 중 어느 것도 낮은 CH2 도메인 안정성을 단독으로 담당하지 않고, 오히려 모든 3종의 돌연변이 (C226S, C229S, P238S)의 조합이 CH2 도메인의 극적인 탈안정화를 야기한다는 것을 보여준다.
힌지 1F4-IgG1a-C226A 및 1F4-IgG1a-C229A 내의 단일 Cys→Ala 돌연변이체는 이들 위치에서의 Cys→Ser 돌연변이체와 거의 동일한 CH2 도메인 Tm 값을 갖고, 이중 돌연변이체 1F4-C226A,C229A는 이중 Cys→Ser 돌연변이체 1F4-C226S,C229S의 것보다 적당하게 (1.2℃) 더 안정한 CH2 도메인 Tm을 갖는다. 1F4-IgG1a-P238K의 CH2 도메인 (Tm = 64.0℃)은 이 위치에서의 Ser 돌연변이체인 1F4-IgG1a-P238S (Tm = 62.4℃)보다 1.6℃ 더 안정하다.
샘플 불균질성에 대한 힌지/Fc 돌연변이의 영향을 결정하기 위해, 실시예 3에 기재된 바와 같이 1F4-IgG 분자를 icIEF에 의해 특징화하였다. 1F4-IgG1f 단백질에 대한 icIEF 프로파일은 모노클로날 IgG1 항체에 대해 전형적이며, 79.7% 존재비의 주요 피크, 및 훨씬 더 낮은 존재비의 ~2-4종의 산성 또는 염기성 변이체를 갖는다. 도 8을 참조한다. CT Fc 도메인을 갖는 도메인 항체 (3h56-269-CT)와 같이, 1F4-CT 분자에 대한 icIEF 프로파일은 불균질하며, 적어도 8종의 별개의 전하 변이체로 이루어지고 명백한 우세한 종이 없었다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 불균질성은 질량 분광측정법에 의해 관찰된 글리칸 불균질성과 관련될 가능성이 있다 (표 17).
이중 Cys→Ser 변이체 1F4-IgG1a-C226S,C229S에 대한 icIEF 데이터는 1F4-CT 분자의 것과 유사하였고, 이는 별개의 주요 피크를 갖지 않는 수많은 상이한 전하 변이체의 존재를 보여주는 반면, 단일 돌연변이체 C226S, C229S 및 P238S에 대한 데이터는 모두 1F4-IgG1f에 대해 유사한 복잡성을 가졌다. 이들 데이터는 힌지/Fc 영역에서의 높은 수준의 O-연결된 시알릴화 글리코실화가 중쇄간 힌지 디술피드 결합 둘 다를 파괴하는 C226S 및 C229S 돌연변이 둘 다를 필요로 한다는 것을 시사한다.
1F4-IgG1.3f, 1F4-N297A, 1F4-IgG1a-P238K 및 각각의 단일 및 이중 Ala 돌연변이체에 대한 icIEF 데이터는 1F4-IgG1f의 것과 유사한 균질성을 입증하였고, 각각은 62-80% 존재비의 주요 피크와 더 작은 존재비의 ~2-3종의 산성 또는 염기성 변이체로 이루어졌다.
집합적으로, icIEF 데이터는 Ser으로 돌연변이된 힌지 Cys226 및 Cys229 잔기 둘 다를 갖는 모든 분자가 다른 변이체보다 유의하게 더 높은 불균질성을 갖는다는 것을 보여준다.
대조군 항체 데이터의 요약:
1F4-IgG 분자에 대한 SPR, DSC, icIEF, 및 질량 스펙 데이터는 CT Fc 도메인의 FcgR 결합, 열 안정성, 및 불균질성에 대한 C226, C229 및 P238 돌연변이의 역할에 대한 이해를 제공한다.
단지 적당하게 감소된 열 안정성을 갖는 단일 힌지 C226S 및 C229S 돌연변이체는 1F4-IgG1f와 유사한 불균질성, 및 유사한 FcgR 결합을 갖는 반면, 이중 C226S,C229S 힌지 돌연변이체는 1F4-IgG1f와 비교하여 유의하게 더 낮은 열 안정성, 증가된 불균질성, 및 감소된 FcgR 결합을 가졌다. 단일 P238S 돌연변이는 열 안정성 및 FcgR 결합을 감소시키는 데 있어서 이중 C226S,C229S 돌연변이체와 유사한 영향을 미쳤으나, 불균질성을 증가시키지는 않았다. 전체 1F4-CT 분자를 생성하기 위한 P238S와 C226S,C229S 힌지 돌연변이의 조합은, C226S,C229S 단독과 유사한 불균질성을 갖지만 추가로 감소된 열 안정성 및 FcgR 결합을 가졌다. 집합적으로, 이들 데이터는 조합된 C226S,C229S 돌연변이 + P238S가 각각 야생형 Fc와 비교하여 감소된 열 안정성 및 감소된 FcgR 결합에 기여하고, O-연결된 글리코실화에 대한 1차 부위가 돌연변이된 힌지 S226 및 Ser229 잔기 상에 있다는 것을 시사한다.
힌지 영역 내의 위치 226 및 229에서의 단일 및 이중 Cys→Ala 돌연변이는 이들 부위에서의 Cys→Ser 돌연변이체와 유사한 열 안정성 및 FcR 결합을 갖는다. 그러나, C226A,C229A 돌연변이체는 Ser 잔기 상의 O-연결된 글리코실화 부위가 결여되어 있고, C226S,C229S 돌연변이체에서 관찰되는 높은 불균질성을 갖지 않는다. 이는 힌지 영역 내의 O-연결된 글리코실화가 FcgR 결합에 대해 유의한 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
1F4-IgG1a-P238K 돌연변이체는 1F4-IgG1a-P238S와 비교하여 유사한 불균질성 및 우수한 열 안정성을 가지면서 1F4-IgG1a-P238S보다 더 약한 FcgR 결합을 입증하였다. 1F4-CT 분자와 비교하여, 1F4-IgG1a-P238K는 보다 약한 FcgR 결합, 개선된 열 안정성, 및 우수한 균질성을 입증하였다. 따라서, 단일 P238K 돌연변이는 예상외로 이러한 힌지/Fc 변이체 세트를 설계하는 경우에 바람직한 특성 중 3개 모두를 제공하였다 (1F4-CT와 비교하여 대등하거나 보다 약한 FcgR 결합, 우수한 열 안정성 및 감소된 불균질성).
1F4-N297A 분자는 1F4-IgG1f와 비교하여 보다 낮은 CH2 도메인 열 안정성 및 보다 약한 FcgR 결합을 입증하였고, 이는 N297A 돌연변이를 함유하는 다른 IgG1 항체에 대한 문헌 보고와 일치하는 특성이다. 1F4-N297A에 대한 균질성은 1F4-IgG1f의 것과 유사하였다.
전반적으로, 가장 약한 FcgR 결합을 입증하는 1F4-IgG 분자는 1F4-IgG1a-P238K, 1F4-N297A 및 1F4-CT 분자였다. 이들 중, 1F4-IgG1a-P238K 및 1F4-N297A는 1F4-CT와 비교하여 우수한 열 안정성 및 균질성을 갖고, 1F4-IgG1a-P238K는 1F4-N297A에 비해 우수한 열 안정성을 가졌다. 결과적으로, P238K 및 N297A 이소형을 추가 특징화를 위한 리드로서 선택하였다.
실시예 6: 변이체 Fc 도메인을 갖는 dAb-Fc 항체의 특징화
1F4-IgG 분자에 대한 FcgR 결합 SPR, DSC, icIEF, 및 MS 데이터는 실시예 5에서 논의된 바와 같이 FcgR 결합, 안정성 및 불균질성에 기여하는 CT 이소형에서의 영역 및 돌연변이에 대한 상당한 이해를 제공하였다. 따라서, 이들 데이터를 사용하여, FcgR 결합에 대한 SPR에 의한 스크리닝을 위해, 소규모 발현 상청액으로서의 발현을 위한 dAb-Fc 이소형 변이체의 하위세트를 우선순위화하였다.
예를 들어, 1F4 항체에서의 P238K 및 N297A 단일 돌연변이체는 CT 이소형 분자에 비해 우수한 열 안정성 및 균질성을 유지하면서 유리하게 약한 FcgR 결합 특성을 제공하였다. 따라서, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A 분자가 dAb-Fc 분석에 포함되었다.
또한, C226S,C229S 이중 돌연변이체와 비교하여 C226A,C229A 이중 돌연변이체의 우수한 균질성, 그러나 유사한 열 안정성 및 FcgR 결합 특성은, P238S 또는 P238K와 조합된 C226A,C229A 이중 돌연변이체가 바람직한 약한 FcgR 결합을 보유할 수 있지만, C226,C229 각각을 Ser로 돌연변이시킨 결과인 높은 불균질성 및 O-연결된 글리칸은 갖지 않을 확률을 높인다. 그 결과, 추가로 조사하기 위해 변이체가 선택되었다 (즉, 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S 및 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K 변이체).
1F4-IgG1 분자 내의 C220 잔기가 항체 경쇄와의 천연 디술피드 결합을 보장하기 위해 야생형 Cys로서 유지되기 때문에, 위치 220에서의 돌연변이의 영향은 1F4-IgG 분자와 관련하여 조사되지 않았다. 그러나, dAb-Fc 항체 폴리펩티드가 경쇄를 갖지 않기 때문에, C220 잔기는 유리 Cys, 또는 파트너 dAb-Fc 쇄의 C220 잔기와 같은 또 다른 유리 Cys와의 잠재적 디술피드 결합을 형성할 것이다. 따라서, dAb-Fc 변이체 분석에서 분자의 FcgR 결합 특성에 대한 그 위치에서의 돌연변이의 영향을 결정하기 위해 C220 돌연변이체의 하위세트가 포함되었다.
비교를 위해, 이중 L234A,L235A (LALA) 돌연변이체를 IgG1a 및 IgG1f 동종이형 둘 다와 관련하여 생성하였다.
이전에 기재된 방법 이외에, 본 실시예에 사용된 방법은 하기를 포함한다.
CD40L 유도된 인간 B 세포 증식의 억제: 인간 편도 B 세포를 상용 편도선절제 동안 소아과 환자로부터 수득하고, 조직을 세절하고 완만하게 분쇄하고, 세포를 스크린을 통해 통과시키고, 인간 림포라이트(Lympholyte)®-H 분리 배지 (세달란 랩스(Cedarlane Labs), 오레곤주 벌링톤)를 사용하여 밀도 구배 분리로 단핵 세포를 단리함으로써 단리하였다. 단핵 세포를 계면으로부터 수집하고, 세척하고, 양 적혈구 (SRBC, 콜로라도 세럼 캄파니(Colorado Serum Company); 콜로라도주 덴버)로 1시간 동안 4℃에서 로세팅한 후, 밀도 구배 분리하여 T 세포를 제거하였다. 세포를 다시 세척하고, 10% FBS를 함유하는 RPMI (완전 배지) 중에 재현탁시켰다. 항체의 적정을 완전 배지에서 제조하고, 96-웰 둥근 바닥 (RB) 플레이트에 삼중으로 첨가하였다. 1 X 105개의 편도 인간 B 세포를 첨가하고, 가용성 IZ-hCD40L (2 μg/mL), 또는 10,000 rad로 조사된 인간 CD40L로 안정하게 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-hCD40L)로 자극하고, 2 X 103개 세포/웰로 각 웰에 200 μL의 최종 부피로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 마지막 6시간 동안 웰당 0.5 μCi의 3[H]-티미딘으로 표지하고, 수거하고, 액체 섬광에 의해 카운팅하였다. B 세포 증식을 티미딘 혼입에 기초하여 정량화하였다.
결과- SPR: 선택된 dAb-Fc 변이체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 소규모 상청액으로서 발현시키고, 고정화된 단백질 A 비아코어™ SPR 센서 칩 표면 상에 포획하고, 정제된 FcgR 분석물 (μM)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 데이터는 표 28에 제시된다.
표 28: 단백질 A 포획된 dAb-Fc 분자에 대한 1 μM FcgR 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00056
3h56-269-IgG1a-C220S 변이체에 대한 FcgR 결합 SPR 데이터는 3h56-269-IgG1a에 대한 것과 유사하였고, 이는 C220S 돌연변이가 FcgR 결합에 최소 영향을 미친다는 것을 시사한다. 그러나, 이러한 돌연변이는 제조 또는 보관 수명 동안 불균질성의 위험일 수 있는 잠재적으로 반응성인 티올 기를 제거할 것이기 때문에, dAb-Fc 포맷의 개발가능성 측면에서 유리할 수 있다.
다른 dAb-Fc 분자에 대한 FcgR 결합 SPR 데이터는 1F4-IgG 변이체에 대한 데이터와 잘 일치하였다. 예를 들어, P238K 또는 N297A를 함유하는 모든 변이체는 야생형과 비교하여 hCD64에 대한 보다 약한 결합, 및 모든 다른 FcgR에 대한 본질적으로 검출불가능한 결합을 입증하였다. P238K 및 N297A 변이체는 또한 유사한 1F4-IgG 변이체에 대해 관찰된 것과 유사하게, 3h56-269-CT보다 더 약한 hCD64 결합을 입증하였다. 또한 1F4-IgG 변이체와 같이, 단일 P238S 돌연변이 또는 이중 C226S/C229S 돌연변이는 FcgR 결합을 감소시켰지만, 이들 3종의 돌연변이의 조합 (3h56-269-CT)보다는 덜 감소시켰다. 또한, Ala로 돌연변이된 힌지 Cys 둘 다를 갖는 돌연변이체 (3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A)는 이중 Cys에서 Ser로의 힌지 변이체 (3h56-269-IgG1a-C220S,C226S,C229S)와 유사한 FcgR 결합을 입증하였다. P238S 돌연변이의 부가는 또한 1F4-IgG 분자에서 관찰된 것과 유사하게, FcgR 결합을 추가로 감소시켰다 (3h56-269-IgG1a-C220S, C226A, C229A, P238S).
시험된 LALA 변이체는 특히 야생형과 비교하여 유의하게 감소된 FcgR 결합을 가졌고, 시험된 변이체 중 임의의 것에서 가장 약한 hCD64 결합을 입증하였다. 그러나, 이들은 3h56-269-CT, 또는 P238K 또는 N297A 분자 중 임의의 것보다 더 강한 hCD16a-V158 결합을 입증하였다.
dAb-Fc 상청액에서 수득된 SPR 데이터에 기초하여, 정제 및 추가 특징화를 위해 저친화도 FcgR에 가장 약한 결합을 갖는 dAb-Fc 변이체를 선택하였다. 이들 변이체는 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S, 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K, 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A를 포함한다. 모든 4종의 분자는 SPR을 사용하여 CD40 표적에 고친화도로 결합하는 것으로 나타났다. 데이터는 표 29에 제시된다.
표 29: 인간 CD40에 대한 dAb-Fc 분자의 결합에 대한 SPR 데이터.
Figure pat00057
FcgR에 결합하는 정제된 dAb-Fc의 결합을 실시예 2에 기재된 바와 같이 SPR에 의해 평가하였다. dAb-FC뿐만 아니라 1F4 항체 대조군에 대한 데이터는 표 30에 제시된다.
표 30: 항-His Fab 포획된 hFcgR-His 단백질에 대한 1μM 또는 10 μM dAb-Fc 분자 또는 1F4-IgG1f 항체 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00058
정제된 dAb-Fc (및 1F4 항체 대조군)에 대한 SPR 데이터는 dAb-Fc 상청액 데이터와 일치하고, 이는 CT, N297A 및 P238K 변이체가 저친화도 FcgR에 대한 가장 약한 결합을 갖는다는 것을 보여준다. 표 30을 참조한다. 이러한 경향은 1F4 항체 및 dAb-Fc 포맷 둘 다에서 일치한다. 실제로, dAb-Fc 포맷에서, 시험된 최고 농도에서, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K, 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K, 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A는 모두 3h56-269-CT보다 훨씬 더 약한 FcgR 결합 반응을 입증하였다.
결과- iDC 활성화: 실시예 1에 기재된 바와 같이, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-N297A 분자를 단독으로 또는 CD32-매개 클러스터링/가교 하에 iDC를 활성화시키는 능력에 대해 시험하였다. 데이터는 IgG1 Fc 테일에서의 이들 돌연변이가 임의의 iDC 활성화를 제거함으로써 항-CD40 dAb-Fc 분자가 이러한 iDC 활성화 검정에서 불활성이도록 할 수 있다는 것을 보여준다. 도 9를 참조한다. 시토카인 생산 및 CD86 및 CD54 상향조절에 의해 측정된 iDC의 활성화는 단독으로 또는 CD32 매개 클러스터링 하에 어느 하나의 융합 단백질에 대해서도 관찰되지 않았고, 이는 면역 활성화에 대한 잠재력 없이 CD40 길항제를 생산하는 이들 돌연변이의 잠재력을 강조한다. 이들 동일한 공여자에서, 3h-59-269-IgG4.1 단독으로 자극될 때 시험된 6종의 샘플 중 2종으로부터의 iDC, 및 CD32 매개 클러스터링/가교가 포함될 때 6종의 공여자 모두로부터의 iDC에서 iDC 활성화의 적어도 하나의 척도의 적당한 증가가 관찰되었다.
결과- CD40L 유도된 인간 B 세포 증식의 억제: 상이한 Fc 테일을 갖는 융합 단백질의 차등 활성에도 불구하고, 이러한 변화는 면역 세포, 예컨대 B 세포의 CD40L 매개 활성화를 억제하는 능력에 영향을 미치지 않는다. 이는 3h-59-269-IgG1a-P238K 및 3h-59-269-IgG1f-N297A 융합체의 활성으로 예시된다. 가용성 CD40L 삼량체 및 CD40L 발현 CHO 세포 둘 다에 의해 자극된 B 세포 증식은 3h-59-269-IgG1-P238K, 또는 3h-59-269-IgG1-N297A에 의해 강력하고 유사하게 억제된다 (표 31).
표 31: Fc 테일의 변화는 CD40L 유도된 B 세포 증식을 억제하는 항-CD40 dAb의 효능에 영향을 미치지 않는다.
Figure pat00059
결과-DSC: 실시예 3에 기재된 바와 같이, 낮은 FcgR 결합을 입증한 4종의 정제된 dAb-Fc의 열 안정성을 DSC에 의해 특징화하였다. 이전에 특징화된 IgG1-유형 dAb-Fc 분자와 같이, 모든 4종의 새로운 분자는 인간 IgG1 Fc 도메인의 CH3 도메인의 특징인 83℃ 근처에서의 전이를 입증하며, dAb 및 CH2 도메인에 대해서는 보다 낮은 온도 전이가 할당된다. 이들 데이터는 표 32에 있다. 또한, 도 11을 참조한다.
표 32: DSC에 의해 결정된 dAb-Fc 분자에 대한 열 용융 온도 (Tm) 값.
Figure pat00060
3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S 및 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K 변이체 둘 다에 대한 보다 낮은 온도 전이는 3h56-269-CT에 대해 관찰된 이전의 데이터와 유사하게, ~40℃ 근처의 낮은 T개시, 및 55.7-55.8℃의 Tm1 값을 갖는 광범위한 언폴딩 전이를 가졌다. 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A의 열 안정성은 상당히 더 유리하며, ~50℃ 근처의 T개시, 및 60.5℃ (3h56-269-IgG1f-C220S,N297A) 및 61.5℃ (3h56-269-IgG1a-C220S,P238K)의 Tm1 값을 가졌다.
결과 - 가속 안정성 연구: dAb-Fc 분자의 물리적 안정성을 가속 스트레스 조건 하에 연구하였다. 먼저, 4종의 새로운 최적화된 변이체 (3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S, 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A)의 물리적 안정성을 원래의 3h56-269-CT 분자와 직접적으로 비교하기 위한 연구를 수행하였다. 여기서 샘플을 pH 5.0에서 20 mM 아세테이트, 250 mM 수크로스 중 15 mg/ml로 제조하고, 40℃에서 4주 동안 인큐베이션하였다. 분취물을 연구의 개시 (시점 0, t0), 1주, 및 4주에 분리하고, 분석용 SEC 분석 (aSEC)에 적용하였다. 데이터는 표 33에 제시된다.
표 33: 40℃에서 4주 동안 인큐베이션된 dAb-Fc 샘플에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 고분자량 (HMW) 종의 백분율.
Figure pat00061
이들 데이터는 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S, 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K, 및 3h56-269-CT에 대해 HMW 종의 큰 증가 (예를 들어, 0.5%에서 13% 초과로)를 보여주었으나, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A에 대해서는 단지 작은 증가 (예를 들어, 0%에서 1.2%로)만을 보여주었다.
4종의 최적화된 dAb-Fc 단백질의 물리적 안정성을 추가로 비교하기 위해, 보다 높은 농도에서 제2 연구를 수행하였다. 샘플을 20 mM 아세테이트, 250 mM 수크로스 pH 5.0 중에서 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K, 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A에 대해 70 mg/ml 및 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S에 대해 30 mg/ml로 제조하고 (후자의 샘플은 정제 후 보다 낮은 발현 수준 및 보다 낮은 수율에서 발생하는 물질 제한으로 인해 보다 낮은 농도를 가짐), 40℃, 25℃에서, 또는 냉장 온도 (4℃) 하에 4 내지 12주 동안 인큐베이션하였으며, 분취물을 다양한 시점에 분리하고 분석용 SEC 분석에 적용하였다. 데이터는 표 34에 제시된다.
표 34: 4℃, 25℃, 32℃ 또는 40℃에서 4주 동안 인큐베이션된 dAb-Fc 샘플에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 고분자량 (HMW) 종의 백분율.
Figure pat00062
이들 데이터는 또한 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A와 비교하여 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238S 및 3h56-269-IgG1a-C220S,C226A,C229A,P238K에 대해 HMW 종의 더 큰 내지 훨씬 더 큰 증가를 보여주었다. HMW의 증가는 시험된 각각의 3가지 온도 하에 3h56-269-IgG1a-C220S,P238K 및 3h56-269-IgG1f-C220S,N297A와 유사하였다.
야생형 IgG1f Fc 도메인을 갖는 것 (3h56-269-IgG1f), 또는 hCD32a-R131 및 hCD32b에 대한 결합을 증진시키기 위한 추가의 점 돌연변이를 갖는 것 (3h56-269-IgG1-S267E) 또는 hCD32b에 대한 특이성을 증진시키기 위한 추가의 점 돌연변이를 갖는 것 (3h56-269-IgG1f-G237D,P238D,H268D,P271G,A330R, 또한 3h56-269-IgG1-V11로도 불림)을 포함하여, 변경된 및 증진된 FcgR 결합 특성을 갖는 추가의 대조군 dAb-Fc 분자를 생성하였다. 표 35에서의 서열 131-133을 참조한다.
표 35
Figure pat00063
이들 dAb-Fc를 SPR을 사용하여 인간 FcgR에 대한 결합에 대해 시험하였고, 데이터는 예상된 결합 특이성을 입증하였다. 표 36을 참조한다.
표 36: 항-His Fab 포획된 hFcgR-His 단백질에 대한 1 μM dAb-Fc 결합에 대한 %Rmax 데이터.
Figure pat00064
3h-59-269-IgG1-V11, 3h-59-269-S267E에 대한 iDC 활성화 데이터는 CD32-발현 CHO 세포의 부재 및 존재 둘 다에서 시험된 모든 농도에서 강건한 iDC 활성화를 보여준다. 도 10을 참조한다. 면역 세포 활성화를 조정하는 능력은 3h56-269-IgG1f 융합체의 활성에 의해 입증되며, 이는 CD32 매개 가교의 부재 하에서는 적당한 활성화만을 보여주고, 이는 이어서 CD32-과다발현 CHO 세포에 의해 증가한다. 도 10을 참조한다.
본 실시양태는 상기 실시예를 참조하여 상세히 기재되었지만, 다양한 변형이 이들 실시양태의 취지로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있고 통상의 기술자에게 용이하게 공지될 것으로 이해된다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MEYERS SQUIBB COMPANY <120> MODIFIED IGG1 FC DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH <130> 200896-0014-00-WO-577544 <150> 62/511,245 <151> 2017-05-25 <160> 137 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: CDR1 of 3h-56-269" <400> 1 Asp Tyr Glu Met Trp 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: CDR2 of 3h-56-269" <400> 2 Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: CDR3 of 3h-56-269" <400> 3 Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: CDR1 consensus" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> "Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: Linker" <400> 63 Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5 <210> 64 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 65 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: Fc- consensus" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(232) <223> "Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> VARIANT <222> (23)..(23) <223> Lys, Ser, Ala, Arg or Trp <220> <221> VARIANT <222> (141)..(141) <223> Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (143)..(143) <223> Leu or Met <220> <221> VARIANT <222> (232)..(232) <223> Lys or absent <400> 65 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Xaa Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 225 230 <210> 66 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: Fc IgG1a-P238K" <400> 66 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 67 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: Fc IgG1f-P238K" <400> 67 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 68 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: Fc IgG1a-P238S" <400> 68 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 69 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: Fc IgG1a-P238S" <400> 69 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 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Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: 3h-56-269-Fc IgG1a-P238K" <400> 70 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 115 120 125 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val 130 135 140 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 145 150 155 160 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 165 170 175 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 180 185 190 Thr Lys Pro Arg 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Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 115 120 125 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Ser Val 130 135 140 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 145 150 155 160 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 165 170 175 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 180 185 190 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 195 200 205 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 210 215 220 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 225 230 235 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attactgtgc gaaacttccg 300 tttaggtttt ccgaccgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 73 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: Linker" <400> 73 Thr Val Ala 1 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic peptide: Linker" <400> 74 Ala Ser Thr Ser Gly Pro Ser 1 5 <210> 75 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Synthetic polypeptide: 3h56-269-IgG4.1 (BMS-986090)" <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 165 170 175 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 195 200 205 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 210 215 220 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 225 230 235 240 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 245 250 255 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 260 265 270 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 275 280 285 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 290 295 300 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 305 310 315 320 Gly Asn Val Phe Ser 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<400> 77 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 115 120 125 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val 130 135 140 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 145 150 155 160 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 165 170 175 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 180 185 190 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 195 200 205 Val Leu Thr 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polypeptide: 3h56-269-IgG1a-C220A, C226A, C229S, P238S" <400> 109 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Gln Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Phe Arg Phe Ser Asp Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His 115 120 125 Thr Ala Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 130 135 140 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 145 150 155 160 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 165 170 175 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 180 185 190 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 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  1. 항체 폴리펩티드의 용도.
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