KR20240086730A - Pharmaceutical composition for treating cancer comprising IFITM1 shRNA - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IFITM1의 유전자 또는 단백질의 작용 억제를 통하여 암세포의 전이성 및 침습성에 대한 강력한 억제효과를 갖는 전이성 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 IFITM1의 발현 및 작용 억제를 통해서 암세포의 전이 또는 침습에 대한 강력한 억제효과를 가진다는 점을 새롭게 밝힌 바, 전이성 암의 치료와 예방에 널리 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition for the treatment of metastatic cancer that has a strong inhibitory effect on the metastasis and invasion of cancer cells through inhibition of the action of the IFITM1 gene or protein. It has been newly discovered that it has a strong inhibitory effect on cancer, so it can be widely used in the treatment and prevention of metastatic cancer.
Description
본 발명은 IFITM1의 발현 억제를 이용한 암세포 사멸효과 및 전이성 암세포의 이동성과 침습성 억제효과의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of cancer cell killing effect and inhibition of mobility and invasion of metastatic cancer cells by inhibiting the expression of IFITM1.
인터페론(Interferon; IFN)은 감염에 대한 염증 반응에서 다양한 세포에서 생성되는 단백질이다. 이들의 생산은 병원체 또는 사이토카인에 대한 반응으로 면역계에 의해 유발된다. 일단 촉발되면 세포 성장과 염증을 포함한 세포 반응에 영향을 미치는 수많은 분자 변화를 유도한다. 인터페론은 신경계에서 병리학적 및 유익한 역할을 모두 수행할 수 있다(Daroff, Robert B and Michael J. Aminoff. Academic press, (2014)). 인터페론에 의해 유도된 막횡단 단백질인 Interferon-induced transmembrane protein 1 (IFITM1)은 I형 및 II형 인터페론에 의해 유도되는 transmembrane protein family에 속하는 인자이다(Deblandre, Gisele A, et al. Journal of Biological Chemistry (1995): 23860-23866; Huang, I-Chueh, et al. PLoS pathogens (2011): e1001258). IFITM1은 Leu13 또는 CD225라고도 하는데 이는 IFITM2 및 IFITM3와 함께 인터페론에 의해 발현이 유도되는 유전자군인 Interferon-stimulating genes (ISG)에 속하며, 17kDa 크기의 세포 표면 막 단백질이다. IFITM1은 림프구에서 항증식 및 동형 세포 부착 신호의 전달에 관여하는 막 복합체의 일부인 백혈구 항원으로 확인되었다(Johnson, Mark C, et al. Veterinary immunology and immunopathology (2006): 357-362). IFITM1은 세포간 통신과 신호 전달을 매개하는 데 중추적인 역할을 하며, 병원체에 대한 반응으로 IFN-α 및 IFN-γ에 의해 그 발현이 유도될 수 있다(LEWIN, Andrew R., et al. European journal of biochemistry (1991): 417-423). 또한 마우스 원시생식세포(primordial germ cell; PGC)에서도 발현되며 PGC 발생과 관련이 있다(Tanaka, Satomi S., et al. Developmental cell (2005): 745-756). 돌연변이 및 과발현 등과 같은 막관통 단백질의 이상은 암에서 흔히 관찰되며, 많은 경우 이러한 이상은 전이를 포함하여 발암 및 암 진행과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Kampen, Kim R. The Journal of membrane biology (2011): 69-74). IFITM1의 과발현은 자궁경부암(Pan, Z, et al. Neoplasma (2010): 123), 식도암(Chattopadhyay, Indranil, et al. Oncology reports (2009): 1135-1146), 난소암(Gyrffy, B, et al. International Journal of Gynecologic Cancer (2008), 위암(Li, Hao, et al. Oncotarget (2014): 2318), 결장직장암(Yu, Fang, et al. Cancer letters (2015): 135-143) 및 폐암(Yang, Ying-Gui, et al. International journal of cancer (2019): 2020-2032)을 포함한 많은 암에서 암 진행 및 전이와 관련이 있음이 입증되었다. 또한 IFITM1 발현의 억제가 신경아교종 세포의 증식 및 침입을 억제할 수 있다고 보고되었다(Yu, Fang, et al. Journal of neuro-oncology (2011): 187-195). IFITM1은 Wnt/β카테닌 신호전달에 의해 상향 조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 IFITM1이 발암성에 관여함을 암시한다(Andreu, Pauline, et al. Cancer research (2006): 1949-1955).Interferon (IFN) is a protein produced by various cells in inflammatory response to infection. Their production is triggered by the immune system in response to pathogens or cytokines. Once triggered, it induces numerous molecular changes that affect cellular responses, including cell growth and inflammation. Interferons can play both pathological and beneficial roles in the nervous system (Daroff, Robert B and Michael J. Aminoff. Academic press, (2014)). Interferon-induced transmembrane protein 1 (IFITM1), a transmembrane protein induced by interferon, is a factor belonging to the transmembrane protein family induced by type I and type II interferons (Deblandre, Gisele A, et al. Journal of Biological Chemistry ( 1995): 23860-23866; Huang, I-Chueh, et al. PLoS pathogens (2011): e1001258). IFITM1, also known as Leu13 or CD225, belongs to the Interferon-stimulating genes (ISG), a group of genes whose expression is induced by interferon, along with IFITM2 and IFITM3, and is a 17kDa cell surface membrane protein. IFITM1 has been identified as a leukocyte antigen that is part of a membrane complex involved in the transduction of antiproliferative and homotypic cell adhesion signals in lymphocytes (Johnson, Mark C, et al. Veterinary immunology and immunopathology (2006): 357-362). IFITM1 plays a central role in mediating intercellular communication and signaling, and its expression can be induced by IFN-α and IFN-γ in response to pathogens (LEWIN, Andrew R., et al. European journal of biochemistry (1991): 417-423). It is also expressed in mouse primordial germ cells (PGC) and is related to PGC development (Tanaka, Satomi S., et al. Developmental cell (2005): 745-756). Abnormalities in transmembrane proteins, such as mutations and overexpression, are commonly observed in cancer, and in many cases, these abnormalities are known to be related to carcinogenesis and cancer progression, including metastasis (Kampen, Kim R. The Journal of membrane biology (2011 ): 69-74). Overexpression of IFITM1 is associated with cervical cancer (Pan, Z, et al. Neoplasma (2010): 123), esophageal cancer (Chattopadhyay, Indranil, et al. Oncology reports (2009): 1135-1146), and ovarian cancer (Gy rffy, B, et al. International Journal of Gynecologic Cancer (2008), stomach cancer (Li, Hao, et al. Oncotarget (2014): 2318), colorectal cancer (Yu, Fang, et al. Cancer letters (2015): 135-143), and lung cancer (Yang It has been proven to be associated with cancer progression and metastasis in many cancers, including Ying-Gui, et al. (International journal of cancer (2019): 2020-2032). It has also been reported that inhibition of IFITM1 expression can inhibit the proliferation and invasion of glioma cells (Yu, Fang, et al. Journal of neuro-oncology (2011): 187-195). IFITM1 has been reported to be upregulated by Wnt/βcatenin signaling, suggesting that IFITM1 is involved in carcinogenesis (Andreu, Pauline, et al. Cancer research (2006): 1949-1955).
암전이는 암의 진행의 결과로 나타나는 현상이나, 실질적으로 원발소 암을 제거 또는 치료한다고 하더라도, 전이를 막을 수 없다면 암의 재발 등에 의해서 생존률이 매우 낮아진다. 암의 크기가 커질수록 주변 림프절 및 다른 조직으로 전이하는 비율이 높은 것으로 여겨지나, 암의 크기가 작음에도 불구하고 전이가 되는 경우가 있어, 아직까지 암의 전이와 증식의 관계는 여전히 명확하게 규명되어 있지 않다. 암의 치료에 있어, 암 세포의 증식 억제와 전이의 억제가 항상 같이 나타나는 효과가 아니고, 암의 전이를 억제할 수 있다면 많은 암의 치료 효율을 비약적으로 개선할 수 있다는 측면에서, 전이성 암의 치료를 위한 암의 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하는 치료 타겟 또는 치료제의 개발이 필요하다.Cancer metastasis is a phenomenon that occurs as a result of cancer progression, but even if the primary cancer is actually removed or treated, if metastasis cannot be prevented, the survival rate is very low due to cancer recurrence. It is believed that the rate of metastasis to nearby lymph nodes and other tissues increases as the size of the cancer increases. However, there are cases where the cancer metastasizes despite its small size, and the relationship between cancer metastasis and proliferation is still not clearly identified. It is not done. In the treatment of cancer, inhibition of cancer cell proliferation and inhibition of metastasis do not always have the same effect, and if cancer metastasis can be inhibited, the treatment efficiency of many cancers can be dramatically improved. There is a need to develop treatment targets or treatments that effectively inhibit cancer metastasis and invasion.
본 발명은 IFITM1 발현을 억제하는 유전자 치료를 기반으로 전이암을 치료하는 항암제 개발에 노력한 결과, IFITM1의 mRNA 발현을 억제하는 IFITM1 shRNA가 전이성 암세포의 이동성, 침습성을 감소시키는 결과를 확인하고, 특히 암에서 과발현 되는 것으로 알려진 FoxM1에 의하여 전이가 일어나는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혀 그 용도를 제공하는데 목적이 있다.As a result of efforts to develop an anticancer agent to treat metastatic cancer based on gene therapy that suppresses IFITM1 expression, the present invention confirmed that IFITM1 shRNA, which suppresses the mRNA expression of IFITM1, reduces the mobility and invasiveness of metastatic cancer cells, especially cancer cells. The purpose is to provide its use by revealing that it can be useful in the treatment of cancer that metastases due to FoxM1, which is known to be overexpressed in .
본 발명은 IFITM1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 mRNA에 상보적으로 결합하여 IFITM1 단백질의 발현을 저하시키는 핵산분자를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 IFITM1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 포함하고, 본 발명의 다른 실시예에서 상기 핵산분자는 서열번호 1의 373 내지 393번째 핵산 또는 413 내지 433번째 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 포함하고, 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 핵산분자는 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하며, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 핵산분자는 shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 DNA/RNA, miRNA, 및 라이보자임으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이고, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 암은 IFITM1 단백질을 과발현하거나, 25번째 아미노산 Ser이 Asp, 또는 Glu로 치환된 FOXM1 단백질을 발현하는 암이고, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 암은 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암이고, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 약학 조성물은 암세포의 사멸을 유도하거나, 암세포의 성장성, 이동성, 침습성, 및 전이성으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 억제한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer, which includes a nucleic acid molecule that reduces the expression of IFITM1 protein by binding complementary to the gene or mRNA encoding the IFITM1 protein. In one embodiment of the present invention, the gene or mRNA encoding the IFITM1 protein includes the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and in another embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is nucleic acids 373 to 393 of SEQ ID NO: 1. or a nucleic acid sequence that specifically binds to the 413th to 433rd nucleic acid, and in another embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule includes any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs. 3 to 6, and another nucleic acid molecule of the present invention. In an embodiment, the nucleic acid molecule is any one selected from the group consisting of shRNA, siRNA, antisense RNA, antisense DNA, chimeric antisense DNA/RNA, miRNA, and ribozyme, and in another embodiment of the present invention, the cancer It is a cancer that overexpresses IFITM1 protein or expresses FOXM1 protein in which the 25th amino acid Ser is substituted with Asp or Glu. In another embodiment of the present invention, the cancer is brain tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, and esophageal cancer. , colon cancer, liver cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colorectal cancer, lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma, or skin cancer, and in another embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition induces death of cancer cells or inhibits one or more selected from the group consisting of growth, mobility, invasiveness, and metastasis of cancer cells.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하고, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 DNA/RNA, miRNA, 및 라이보자임으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 핵산 분자는 IFITM1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 mRNA에 상보적으로 결합하고, 본 발명의 다른 실시예에서, 서열번호 1의 373 내지 393번째 핵산 또는 413 내지 433번째 핵산에 특이적으로 결합한다. In one embodiment of the present invention, any nucleic acid sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 3 to 6 and selected from the group consisting of shRNA, siRNA, antisense RNA, antisense DNA, chimeric antisense DNA/RNA, miRNA, and ribozyme Provides one nucleic acid molecule. In one embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule binds complementary to a gene or mRNA encoding the IFITM1 protein, and in another embodiment of the present invention, the nucleic acid 373 to 393 or the nucleic acid 413 to 433 of SEQ ID NO: 1 binds specifically to.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터을 제공하며, 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 DNA/RNA, miRNA, 및 라이보자임으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 발현한다. In one embodiment of the present invention, a recombinant viral vector is provided comprising any one nucleic acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 6, and in another embodiment of the present invention, the recombinant viral vector includes shRNA, siRNA, antisense RNA, and antisense DNA. , chimeric antisense DNA/RNA, miRNA, and ribozyme.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 IFITM1의 발현 억제제는 전이 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 일반적인 전이암 뿐만 아니라 특히, FoxM1이 과발현 되어있는 전이암의 증식, 이동성, 침습성에 대한 강력한 억제효과가 있어 전이성 암의 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.As seen above, the IFITM1 expression inhibitor of the present invention can be effectively used in the treatment of metastatic cancer. It has a strong inhibitory effect on the proliferation, mobility, and invasiveness of metastatic cancer in general as well as metastatic cancer in particular, where FoxM1 is overexpressed, so it can be effectively used in the treatment of metastatic cancer.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 중 침습성인 암세포와 비침습성인 암세포에서 IFITM1의 발현이 증가를 분석한 결과이다.
A: FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 중 침습성인 암세포와 비침습성인 암세포를 이용한 마이크로어레이(Microarray) 분석 결과를 토대로 침습성 인산화 점 돌연변이체 FoxM1이 발현된 암세포에서 높아지는 유전자를 순서대로 나열한 그래프이다.
B: 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 중 침습성인 암세포에서의 mRNA 분석결과 그래프이다.
C: 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체가 발현되는 total 암세포에서의 mRNA 분석결과 그래프이다.
D: FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체를 마우스 꼬리에 정맥주사하여 전이성 분석한 마우스의 폐조직에서 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 IFITM1의 증가가 현저함을 mRNA 분석으로 관찰한 결과 그래프이다.
E: FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체를 마우스 꼬리에 정맥주사하여 전이성 분석한 마우스의 폐조직에서 마우스 조직을 면역블롯을 이용하여 IFITM1의 단백질 발현과 EMT 마커의 변화를 관찰한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 IFITM1의 발현과 폐선암 환자에서의 생존률과의 상관관계를 분석한 결과이다.
A: 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 IFITM1을 발현시킨 세포에서의 FoxM1의 양적 변화를 분석한 결과 그래프이다.
B: 면역블랏(Immunoblotting)을 이용하여 IFITM1을 발현시킨 세포에서의 FoxM1과 EMT 마커인 E-cadherin과 Vimentin의 변화를 분석한 그래프이다.
C: KM PLOTTER 분석을 통해서 폐선암 (LUAD, 왼쪽 그래프) 환자와 편평상피세포폐암 (LUSQ, 오른쪽 그래프) 환자에서 IFITM1발현에 따른 생존률을 분석한 결과 그래프이다.
D: KM PLOTTER 분석을 통해서 폐선암 3단계 환자에서 IFITM1발현에 따른 생존률을 분석한 결과 그래프이다.
E: Heatmap 분석을 통하여 폐선암 환자에서 종양 단계별로 IFITM1 발현을 보여주는 그림이다.
도 3는 전이성 조건에서 IFITM1 mRNA 발현 억제 물질인 IFITM1 shRNA 처리에 의한 암세포의 전이성 억제 효과를 확인한 결과이다.
A: IFITM1 shRNA의 타겟 시퀀스(#373-393, #413-433)에 따른 IFITM1 발현 억제 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 측정한 그래프이다.
B: 폐암세포 A549에 IFITM1 shRNA (#373-393, #413-433)처리로 IFITM1 발현억제가 세포사멸성을 유도 및 증가시키는 것을 보여주는 결과이다.
C: TGF-β 유도성 전이환경에서 IFITM1의 shRNA (#413-433) 처리에 의한 단백질 수준의 상피간엽이행 마커 변화를 면역블롯법으로 관찰한 결과이다.
D: TGF-β 유도성 전이환경에서 IFITM1의 shRNA (#413-433) 처리에 의한 mRNA수준의 상피간엽이행 마커 및 종양관련 대식세포 분화유도 인자 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
E: FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 IFITM1의 shRNA (#413-433) 처리에 의한 단백질 수준의 상피간엽이행 마커 변화를 면역블롯법으로 관찰한 결과이다.
F: FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 IFITM1의 shRNA (#413-433) 처리에 의한 상피간엽이행 마커 및 종양관련 대식세포 분화유도 인자의 mRNA 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
도 4는 FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 IFITM1 mRNA 발현 억제 물질인 IFITM1의 shRNA 처리에 의한 암세포의 이동성과 침습성 및 종양관련 대식세포 분화유도에 대한 억제효과를 관찰한 결과이다.
A: FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 Transwell을 이용하여 IFITM1의 shRNA 처리에 의한 세포의 이동성이 억제되는 효과를 관찰한 결과이다.
B: FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 Transwell 및 matrigel을 이용하여 IFITM1의 shRNA 처리에 의한 세포의 침습성이 억제되는 효과를 관찰한 결과이다.
C: FoxM1의 Ser25 인산화 점돌연변이체에 의해 유도된 전이환경에서 IFITM1의 shRNA 처리시 변화된 폐암세포의 성질이, 폐암세포와 공동배양을 진행한 THP-1 세포에서 종양관련 대식세포로 분화유도를 억제함을 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 서열번호 1 내지 7의 서열을 나타낸다: 서열번호 1은 접근번호 NM_003641의 인간 IFITM1의 mRNA 서열, 서열번호 2는 접근번호 NP_003632의 인간 IFITM1의 단백질 서열, 서열번호 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 첫번째 타겟의 정방향 서열, 서열번호 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 두번째 타겟의 정방향 서열, 서열번호 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 첫번째 타겟의 역방향 서열, 서열번호 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 두번째 타겟의 역방향 서열, 및 서열번호 7은 FOXM1B의 단백질 서열.Figure 1 shows the results of analyzing the increase in expression of IFITM1 in invasive and non-invasive cancer cells among circular or phosphorylated point mutants of FoxM1 according to an example of the present invention.
A: Based on the results of microarray analysis using invasive and non-invasive cancer cells among the original or phosphorylated point mutants of FoxM1, this is a graph listing genes that are upregulated in cancer cells expressing the invasive phosphorylated point mutant FoxM1.
B: This is a graph of the results of mRNA analysis in invasive cancer cells among the original or phosphorylated point mutants of FoxM1 using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR).
C: This is a graph of mRNA analysis results from total cancer cells expressing the original or phosphorylated point mutant of FoxM1 using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR).
D: A significant increase in IFITM1 was observed by mRNA analysis using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) in the lung tissue of mice that were analyzed for metastasis by intravenously injecting the original or phosphorylated point mutant of FoxM1 into the mouse tail. This is a graph of the results.
E: This is the result of observing the protein expression of IFITM1 and changes in EMT markers using immunoblot in lung tissue of mice that were analyzed for metastasis by intravenously injecting the original or phosphorylated point mutant of FoxM1 into the mouse tail.
Figure 2 shows the results of analyzing the correlation between the expression of IFITM1 and the survival rate in lung adenocarcinoma patients according to an embodiment of the present invention.
A: This is a graph showing the results of analyzing the quantitative changes in FoxM1 in cells expressing IFITM1 using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR).
B: This is a graph analyzing changes in FoxM1 and EMT markers E-cadherin and Vimentin in cells expressing IFITM1 using immunoblotting.
C: This is a graph showing the results of analyzing the survival rate according to IFITM1 expression in patients with lung adenocarcinoma (LUAD, left graph) and squamous cell lung cancer (LUSQ, right graph) through KM PLOTTER analysis.
D: This is a graph showing the results of analyzing the survival rate according to IFITM1 expression in patients with stage 3 lung adenocarcinoma through KM PLOTTER analysis.
E: This figure shows IFITM1 expression by tumor stage in lung adenocarcinoma patients through heatmap analysis.
Figure 3 shows the results confirming the effect of suppressing metastasis of cancer cells by treatment with IFITM1 shRNA, a substance that inhibits IFITM1 mRNA expression, in metastatic conditions.
A: This is a graph measuring the degree of inhibition of IFITM1 expression according to the target sequence (#373-393, #413-433) of IFITM1 shRNA using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR).
B: Results showing that inhibition of IFITM1 expression by treating lung cancer cell A549 with IFITM1 shRNA (#373-393, #413-433) induces and increases apoptosis.
C: This is the result of observing changes in epithelial-mesenchymal transition markers at the protein level by treatment with IFITM1 shRNA (#413-433) in a TGF-β-induced metastatic environment using immunoblotting.
D: Real-time PCR for changes in epithelial-mesenchymal transition markers and tumor-related macrophage differentiation-inducing factors at the mRNA level by treatment with shRNA (#413-433) of IFITM1 in a TGF-β-induced metastatic environment. This is the result of observation.
E: This is the result of observing changes in protein-level epithelial-mesenchymal transition markers by shRNA (#413-433) treatment of IFITM1 in the metastatic environment induced by the Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1 using immunoblotting.
F: Changes in mRNA of epithelial-mesenchymal transition markers and tumor-related macrophage differentiation-inducing factors by shRNA (#413-433) treatment of IFITM1 in the metastatic environment induced by Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1 were measured by real-time polymerase chain reaction ( This is the result observed through real-time PCR).
Figure 4 shows the results of observing the inhibitory effect on the mobility and invasiveness of cancer cells and the induction of tumor-related macrophage differentiation by shRNA treatment of IFITM1, an IFITM1 mRNA expression inhibitor, in the metastatic environment induced by the Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1. .
A: This is the result of observing the effect of suppressing cell mobility by shRNA treatment of IFITM1 using Transwell in a metastatic environment induced by a Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1.
B: This is the result of observing the effect of suppressing cell invasiveness by shRNA treatment of IFITM1 using Transwell and matrigel in a metastatic environment induced by a Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1.
C: In the metastatic environment induced by the Ser25 phosphorylation point mutant of FoxM1, the properties of lung cancer cells changed upon shRNA treatment of IFITM1 inhibit the induction of differentiation into tumor-related macrophages in THP-1 cells co-cultured with lung cancer cells. This is a result observed through real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR).
Figure 5 shows the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7: SEQ ID NO: 1 is the mRNA sequence of human IFITM1 with accession number NM_003641, SEQ ID NO: 2 is the protein sequence of human IFITM1 with accession number NP_003632, and SEQ ID NO: 3 is an embodiment of the present invention. The forward sequence of the first target according to the example, SEQ ID NO: 4 is the forward sequence of the second target according to an embodiment of the present invention, SEQ ID NO: 5 is the reverse sequence of the first target according to an embodiment of the present invention, SEQ ID NO: 6 is the present sequence The reverse sequence of the second target according to one embodiment of the invention, and SEQ ID NO: 7 is the protein sequence of FOXM1B.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through embodiments of the present invention with reference to the attached drawings. However, the following embodiments are provided as examples of the present invention, and if it is judged that a detailed description of a technology or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the description of the claims described below and the scope of equivalents interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express preferred embodiments of the present invention, and may vary depending on the intention of the user or operator or the customs of the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Throughout the specification, when a part is said to “include” a certain element, this means that it may further include other elements rather than excluding other elements, unless specifically stated to the contrary.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, are used with the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art in the field related to the present invention. In addition, preferred methods and samples are described in this specification, but similar or equivalent methods are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications incorporated herein by reference are hereby incorporated by reference.
본 발명은 IFITM1의 발현 억제제를 이용한 암의 전이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating cancer metastasis using an expression inhibitor of IFITM1.
본 발명에서 IFITM1 (Interferon-induced transmembrane protein 1) (mRNA NM_003641, 단백질 NP_003632)를 사용하였다. In the present invention, IFITM1 (Interferon-induced transmembrane protein 1) (mRNA NM_003641, protein NP_003632) was used.
IFITM1의 발현 억제가 암세포의 전이성과 종양관련 대식세포로의 분화를 감소시키는 용도에 대해서는 밝혀진 바 없다. 본 발명자는 IFITM1의 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 억제하여 이에 따른 암세포의 전이, 이동 및 침습을 개선 또는 치료할 수 있음을 새롭게 밝혔다. 이러한 측면에서, 본 발명은 IFITM1의 mRNA 및/또는 단백질의 발현 억제제는 암세포의 전이 억제용 조성물일 수 있다.The use of inhibiting the expression of IFITM1 in reducing the metastasis of cancer cells and differentiation into tumor-related macrophages has not been revealed. The present inventors have newly discovered that the metastasis, migration, and invasion of cancer cells can be improved or treated by suppressing the expression of IFITM1 mRNA and/or protein. In this respect, in the present invention, the inhibitor of mRNA and/or protein expression of IFITM1 may be a composition for inhibiting metastasis of cancer cells.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 shRNA를 이용하여 상기 mRNA의 발현을 억제하는 경우, 암세포의 이동성과 침습성을 감소시키는 것을 확인함으로서, IFITM1가 전이암 치료 타겟으로 적합함을 확인하였다. In a specific embodiment of the present invention, when the expression of IFITM1 mRNA is suppressed using shRNA, it is confirmed that the mobility and invasiveness of cancer cells are reduced, showing that IFITM1 is suitable as a treatment target for metastatic cancer. Confirmed.
본 발명에서 "IFITM1 억제제"는 IFITM1 mRNA 또는 IFITM1 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하며, 구체적으로는 IFITM1의 발현을 전사 수준에서 방해하여 IFITM1의 발현을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "IFITM1"는 별도의 언급이 없는 한 IFITM1 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석될 수 있다. In the present invention, “IFITM1 inhibitor” refers to all agents that reduce the expression or activity of IFITM1 mRNA or IFITM1 protein, and specifically may include all agents that reduce the expression of IFITM1 by interfering with the expression of IFITM1 at the transcription level. there is. In the present invention, “IFITM1” can be interpreted to refer to both IFITM1 mRNA and protein, unless otherwise specified.
본 발명의 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 IFITM1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 구체적인 예로, 서열번호 1에서 373-393 번째 뉴클레오티드; 413-433 번째 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 IFITM1 mRNA 발현을 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열을 표적으로 하는 경우, 더욱 효과적으로 IFITM1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 “표적 서열로 한다”는 것은 해당 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하여 IFITM1의 발현을 억제하는 것을 의미한다. The oligonucleotide that inhibits the expression of IFITM1 mRNA of the present invention may be an oligonucleotide that inhibits the mRNA expression of IFITM1 using 5 to 50 nucleotides or 10 to 30 nucleotides consecutive to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a target sequence. there is. As a specific example, nucleotides 373-393 in SEQ ID NO: 1; IFITM1 mRNA expression may be suppressed using nucleotides 413-433 as the target sequence, but is not limited thereto. When targeting the above sequence, the expression or activity of IFITM1 can be more effectively inhibited. In the present invention, “as a target sequence” means inhibiting the expression of IFITM1 by binding complementary to the corresponding nucleotide sequence.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 서열번호 1의 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 약학적 조성물은 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터의 형태로 포함할 수 있고, 따라서, 본 발명은 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention may be a recombinant vector expressing an oligonucleotide that inhibits the expression of IFITM1 mRNA of SEQ ID NO: 1. In this aspect, the pharmaceutical composition of the present invention may include an oligonucleotide that inhibits the expression of IFITM1 mRNA in the form of a recombinant vector expressing the nucleotide. Therefore, the present invention provides an oligonucleotide that inhibits the expression of IFITM1 mRNA. Provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a recombinant vector expressing the nucleotide.
"핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고, 단일 가닥 형태나 이중 가닥 나선(helix)으로의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티민 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 인산 에스테르의 중합체 형태 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 티오에스테르와 같은 이의 임의의 인산 에스테르 유사체를 지칭한다. 이중 나선 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 상기 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하며 어느 특정 삼차 형태에 제한하지는 않는다. 따라서, 이 용어는 그 중에서도 선형 또는 환형 DNA 분자(예컨대, 제한효소 단편), 플라스미드, 초나선형(supercoiled) DNA 및 염색체로 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논할 때, 서열을 전사되지 않은 DNA 가닥(즉, mRNA에 일치하는 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로만 제시하는 일반적인 규약에 따라 본 명세서에 서열이 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.“Nucleic acid,” “nucleic acid molecule,” “oligonucleotide,” and “polynucleotide” are used interchangeably and refer to ribonucleosides (adenosine, guanosine, uridine or cytidine; “RNA molecule”) or a polymeric form of a phosphate ester of a deoxyribonucleoside (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytimine or deoxycytidine; “DNA molecule”) or phosphorothioate. (phosphorothioate) and any of its phosphoric acid ester analogues, such as thioesters. Double helix DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA helices are possible. The term nucleic acid molecule, and especially DNA or RNA molecule, refers only to the primary and secondary structures of the molecule and is not limited to any particular tertiary form. Accordingly, the term includes double-stranded DNA found in linear or circular DNA molecules (e.g., restriction enzyme fragments), plasmids, supercoiled DNA, and chromosomes, among others. When discussing the structure of a particular double-stranded DNA molecule, the sequence is presented herein in accordance with the general convention of presenting the sequence only in the 5' to 3' direction along the non-transcribed DNA strand (i.e., the strand with the sequence matching the mRNA). This can be described. A “recombinant DNA molecule” is a DNA molecule that has undergone molecular biological manipulation. DNA includes, but is not limited to, cDNA, genomic DNA, plasmid DNA, synthetic DNA, and semi-synthetic DNA.
본 발명에서, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 도입시킬 수 있는 것을 의미하며, 도입 및 발현할 수 있는 발현벡터를 포함하며, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 유전자 발현이 안정적이고, 세포에 효과적으로 유전자를 전달할 수 있는 렌티 바이러스 벡터(Lenti Viral Vector), 아데노 바이러스 벡터(Adono Viral Vector) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(Adeno-associated Viral Vector, AAV) 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 렌티 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터 일 수 있다. 렌티바이러스를 벡터로 사용하는 경우 유전자 전달 효율이 높고, 면역 반응 부작용이 거의 없다는 장점이 있다. 상기 벡터는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것을 이용할 수 있다. 상기 벡터는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것으로, 개체 내에 투여되는 경우, 장시간에 걸쳐 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써, 우수한 항암효과를 가질 수 있다. In the present invention, “vector” means something capable of introducing a target protein or target RNA into a suitable host cell, and includes an expression vector capable of introduction and expression, and essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. It means a genetic construct containing. The vector may be, for example, a viral vector. In one embodiment of the present invention, a lenti viral vector, an adeno viral vector, or an adeno-associated viral vector, which has stable gene expression and can effectively transfer genes to cells, is used. , AAV). In one embodiment of the invention, it may be a lentiviral vector or an adeno-associated viral vector. Using lentivirus as a vector has the advantage of high gene transfer efficiency and almost no immune response side effects. The vector may be one commonly used in the technical field of the present invention. The vector is capable of expressing the oligonucleotide of the present invention, and when administered into a subject, it can have an excellent anticancer effect by providing the oligonucleotide over a long period of time.
상기 IFITM1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 IFITM1 mRNA에 특이적인 shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 DNA/RNA, miRNA, 및 라이보자임으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다. The oligonucleotide that inhibits the expression of IFITM1 mRNA may be selected from the group consisting of shRNA, siRNA, antisense RNA, antisense DNA, chimeric antisense DNA/RNA, miRNA, and ribozyme specific for IFITM1 mRNA.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 IFITM1 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 일 예로, 서열번호 3과 4의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열에 상보적인 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 염기, 또는 8 내지 60 염기, 또는 10 내지 40 염기, 또는 10 내지 30 염기 일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성는 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시키는 재조합벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 상법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 서열번호 1의 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 일 예로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 것 일 수 있다.In the present invention, "antisense oligonucleotide" is DNA, RNA, or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a characteristic mRNA, and has the effect of inhibiting the translation of mRNA into protein by binding to the complementary sequence in the mRNA. can do. Antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the IFITM1 sequence of SEQ ID NO: 1 and can bind to the sequence. As an example, it may include or consist of a sequence complementary to any one sequence selected from the group consisting of sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, but is not limited thereto. The antisense oligonucleotide may be 5 to 100 bases, or 8 to 60 bases, or 10 to 40 bases, or 10 to 30 bases. The antisense oligonucleotide may be synthesized in vitro using a conventional method and administered in vivo, or the antisense oligonucleotide may be synthesized in vivo. Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by biological/chemical methods according to conventional methods in the technical field of the present invention. In addition, the form in which the antisense oligonucleotide is synthesized in vivo can be realized using a recombinant vector expressing the antisense oligonucleotide, and this commercial method can be easily carried out according to a conventional method in the technical field of the present invention. there is. Therefore, the design of the antisense oligonucleotide of the present invention can be easily produced according to methods known in the art, referring to the base sequence of SEQ ID NO: 1. As an example, the antisense oligonucleotide may include a base sequence complementary to a base sequence selected from the group consisting of sequences of SEQ ID NO: 3 or 4.
일 실시예에서, 억제성 핵산은 약 15 내지 약 50개의 염기쌍, 예를 들어 21 내지 25개의 염기쌍을 포함하고, 세포 내 표적 유전자 또는 RNA와 동일하거나 거의 동일한 핵산 서열을 갖는 이중 가닥 구조를 포함하는 siRNA일 수 있다. 안티센스 핵산은 모폴리노(morpholinos), 2′-O-메틸 폴리뉴클레오티드, DNA, 또는 RNA 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. RNA 폴리머라아제 III 전사된 DNA는 U6 프로모터와 같은 프로모터를 함유한다. 이들 DNA는 전사되어 세포 내에서 siRNA로서 작동할 수 있는 작은 헤어핀 RNA 또는 안티센스 RNA로 작동할 수 있는 선형 RNA를 생성한다. IFITM1의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산은 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 또는 표적 RNA 및/또는 유전자가 저해될 수 있는 적합한 조합을 포함할 수 있다. 또한, 핵산의 형태는 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 가닥 또는 사중 가닥일 수 있다. In one embodiment, the inhibitory nucleic acid comprises a double-stranded structure comprising about 15 to about 50 base pairs, for example, 21 to 25 base pairs, and having a nucleic acid sequence that is identical or nearly identical to the target gene or RNA in the cell. It may be siRNA. Antisense nucleic acids include, but are not limited to, morpholinos, 2'-O-methyl polynucleotides, DNA, or RNA. RNA polymerase III transcribed DNA contains promoters such as the U6 promoter. These DNAs are transcribed to produce linear RNAs that can act as small hairpin RNAs or antisense RNAs that can act as siRNAs within cells. Inhibitory nucleic acids that inhibit the expression or activity of IFITM1 may include ribonucleotides, deoxyribonucleotides, synthetic nucleotides, or any suitable combination such that the target RNA and/or gene is inhibited. Additionally, the form of the nucleic acid may be single-stranded, double-stranded, triple-stranded, or quadruple-stranded.
본 발명에서 "압타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고뉴클레오티드로, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 압타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 압타머는 IFITM1 mRNA에 결합하여 IFITM1의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 압타머는 서열번호 1의 IFITM1의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.In the present invention, “aptamer” refers to a single-stranded oligonucleotide, about 20 to 60 nucleotides in size, and a nucleic acid molecule that has binding activity to a predetermined target. It has a variety of three-dimensional structures depending on its sequence, and can have high affinity for specific substances, like an antigen-antibody reaction. An aptamer can inhibit the activity of a given target by binding to it. The aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may also be in a linear or circular form. Preferably, the aptamer may bind to IFITM1 mRNA and inhibit the expression or activity of IFITM1. Such an aptamer can be prepared by a method known to those skilled in the art from the sequence of IFITM1 of SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀(hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서(dicer)에 의해 절단되면서 8 내지 30 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 IFITM1에 특이적으로 작용하여 IFITM1 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 IFITM1을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the terms "siRNA" and "shRNA" are nucleic acid molecules that can mediate RNA interference or gene silencing, and can suppress the expression of a target gene, thereby providing an efficient gene knockdown method or gene silencing method. It is used as a treatment method. shRNA forms a hairpin structure by binding between complementary sequences within a single-stranded oligonucleotide, and in vivo, the shRNA is cleaved by a dicer into small RNA fragments of 8 to 30 nucleotides in size. It becomes siRNA, a double-stranded oligonucleotide, and can specifically bind to mRNA with a complementary sequence to inhibit its expression. Therefore, which of shRNA and siRNA to use can be decided by a person skilled in the art, and if the mRNA sequences they target are the same, a similar expression reduction effect can be expected. For the purpose of the present invention, IFITM1 can be inhibited by acting specifically on IFITM1 to cleave the IFITM1 mRNA molecule and thereby inducing RNA interference (RNAi). siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for producing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art can be used. For example, a method of directly chemically synthesizing siRNA, a method of synthesizing siRNA using in vitro transcription, a method of cutting long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using enzymes, Expression methods include, but are not limited to, expression methods through intracellular delivery of shRNA expression plasmids or viral vectors and expression methods through intracellular delivery of PCR (polymerase chain reaction)-induced siRNA expression cassettes.
특히, 본 발명의 IFITM1에 대한 siRNA, shRNA는 센스 뉴클레오티드와 이와 상보적인 서열의 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 뉴클레오티드 사이에 루프서열을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 IFITM1에 대한 siRNA는 서열번호 3 또는 4의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 서열; 및/또는 상기 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오디트의 이중가닥으로 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 IFITM1에 대한 shRNA는 서열번호 2 또는 3의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하는 것일 수 있고, 또는, 서열번호 2 또는 3서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 서열; 및/또는 상기 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것 일 수 있다. In particular, the siRNA or shRNA against IFITM1 of the present invention may include a sense nucleotide and an antisense nucleotide with a complementary sequence, and may include a loop sequence between the sense and antisense nucleotides. As a specific example, the siRNA against IFITM1 of the present invention includes any one oligonucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3 or 4; And/or it may be composed of a double strand of oligonucleotides having a sequence complementary to the oligonucleotide sequence, but is not limited thereto. In addition, the shRNA for IFITM1 of the present invention may have as a target sequence any base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 or 3, or any base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 or 3. One oligonucleotide sequence; And/or it may include a sequence complementary to the oligonucleotide sequence.
본 발명에서 "miRNA(micro RNA)"는 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다. 본 발명의 IFITM1의 발현 또는 작용을 억제할 수 있는 miRNA라면 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 포함된다. In the present invention, “miRNA (micro RNA)” refers to a substance that naturally exists within cells and is involved in the regulation of specific genes by inducing RNAi phenomenon. Any miRNA that can inhibit the expression or action of IFITM1 of the present invention is not limited to its type and is included in the present invention.
상기의 억제성 핵산은 15개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역 사이에 비상보성 영역(3 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이)을 포함하여 표적 RNA와 듀플렉스를 형성하도록 설계되고 합성될 수 있다. IFITM1에 의해 코딩되는 핵산의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제성 핵산은 18 내지 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 일 실시예에서 통상의 기술자는 성숙한 형태로 변형되도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 성숙된 miRNA는 19 내지 30개 뉴클레오티드, 21 내지 25개의 뉴클레오티드, 또는 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 여기서 miRNA 전구체는 70 내지 100개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 헤어핀 구조를 가질 수 있다. The inhibitory nucleic acid can be designed and synthesized to form a duplex with the target RNA, including a non-complementary region (3 to 6 nucleotides long) between the complementary regions of 15 to 30 nucleotides in length. Inhibitory nucleic acids capable of inhibiting the expression or activity of the nucleic acid encoded by IFITM1 can be 18 to 100 nucleotides in length, and in one embodiment, can be designed by one of ordinary skill in the art to be modified into the mature form. For example, the mature miRNA may be 19 to 30 nucleotides, 21 to 25 nucleotides, or 21, 22, 23, 24, or 25 nucleotides in length, wherein the miRNA precursor is 70 to 100 nucleotides in length. It may have a hairpin structure.
상술된 억제성 핵산은 RNA, DNA 또는 이 둘의 올리고머 또는 폴리머일 수 있다. 이 용어는 자연적으로 발생되는 핵염기, 당, 및 백본뿐 아니라 기능적 유사성을 갖는 비-자연적 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. The inhibitory nucleic acids described above may be RNA, DNA, or oligomers or polymers of both. The term can include oligonucleotides having naturally occurring nucleobases, sugars, and backbones as well as non-natural moieties with functional similarities.
억제성 핵산은 IFITM1에 결합될 수 있을 정도로 충분한 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 충분한 상보성은 12 내지 25개의 뉴클레오티드, 13 내지 23개의 뉴클레오티드, 14 내지 23개의 뉴클레오티드, 또는 15 내지 23개의 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 사실 임의의 길이일 수 있다. IFITM1을 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제성 핵산은 20 내지 100개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. The inhibitory nucleic acid may comprise sufficient complementary nucleotide sequence to bind to IFITM1. In one embodiment, sufficient complementarity may be 12 to 25 nucleotides, 13 to 23 nucleotides, 14 to 23 nucleotides, or 15 to 23 nucleotides. The nucleic acid molecules of the invention may be of virtually any length. Inhibitory nucleic acids capable of inhibiting the expression or activity of the protein encoding IFITM1 are 20 to 100 nucleotides long, e.g., 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31. , 32, 33, 34, 35, 36, 37 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, It may be 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99 nucleotides in length.
일 실시예에서, 억제성 핵산은 만약 본 발명의 억제성 핵산의 존재 하에서 표적 유전자 전사체의 안정성이 부재 시의 안정성보다 감소되고/거나 억제성 핵산이 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개의 길이에 대하여 표적 전사체와 90% 이상의 상동성있는 서열을 갖고/거나, 엄격한 조건 하에서 억제성 핵산이 표적 전사체에 결합한다면 IFITM1을 표적으로 하는 것으로 간주된다. In one embodiment, the inhibitory nucleic acid is selected from the group consisting of at least 17, at least 18, and at least 19 inhibitory nucleic acids if the stability of the target gene transcript in the presence of the inhibitory nucleic acid of the invention is reduced compared to stability in the absence of the inhibitory nucleic acid. , at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23 sequences that are at least 90% homologous to the target transcript for a length of at least 23, and/or IFITM1 if the inhibitory nucleic acid binds to the target transcript under stringent conditions. is considered to be targeting.
본 발명의 억제성 핵산은 in vivo에서 세포 기반으로 합성되거나 in vitro에서 화학적 합성을 통해 생산될 수 있다. IFITM1에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산은 당해 기술 분야의 공지된 방법에 따라 화학적 합성 및/또는 효소적 라이게이션 반응을 사용하여 생산될 수 있다. The inhibitory nucleic acid of the present invention can be synthesized in vivo on a cell basis or produced in vitro through chemical synthesis. Inhibitory nucleic acids that inhibit the expression or activity of the protein encoded by IFITM1 can be produced using chemical synthesis and/or enzymatic ligation reactions according to methods known in the art.
상기의 억제성 핵산은 표적 핵산에 충분히 상보적인 영역을 포함하고, miRNA가 표적 핵산과 듀플렉스 구조를 형성할 정도의 충분한 길이로 구성된다. IFITM1에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제성 핵산은 표적 RNA에 대하여 부분 적으로, 또는 완전히 상보적인 영역을 포함한다. IFITM1에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제성 핵산과 표적 서열이 완벽하게 상보적일 필요는 없지만, 표적 유전자의 발현을 억제할 정도로는 상응해야 한다. The inhibitory nucleic acid contains a region sufficiently complementary to the target nucleic acid, and is of sufficient length for the miRNA to form a duplex structure with the target nucleic acid. Inhibitory nucleic acids capable of inhibiting the expression or activity of the protein encoded by IFITM1 include a region that is partially or fully complementary to the target RNA. The inhibitory nucleic acid capable of inhibiting the expression or activity of the protein encoded by IFITM1 and the target sequence do not have to be perfectly complementary, but must correspond to the extent that they inhibit the expression of the target gene.
억제성 핵산은 요망되는 특성을 갖도록 변형되어 합성될 수 있다. 예를 들어, 변형은 안정성을 향상시키거나, 표적 핵산과 열역학적으로 하이브리드 확률을 높이거나 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적성을 높이거나, 세포에 대한 침투성을 높이도록 수행될 수 있다. 변형은 서열 특이성을 높이고 비특이적 결합을 줄이기 위하여 수행될 수 있다. Inhibitory nucleic acids can be synthesized and modified to have the desired properties. For example, modifications may be made to improve stability, increase the probability of thermodynamic hybridization with the target nucleic acid, increase targetability to a specific tissue or cell type, or increase permeability to cells. Modifications may be performed to increase sequence specificity and reduce non-specific binding.
억제성 핵산 분자는 IFITM1을 코딩하는 핵산의 일부와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, IFITM1을 코딩하는 핵산의 적어도 일부와 실질적으로 동일한 단일가닥 올리고뉴클레오티드는 암을 갖거나 암을 가질 위험이 있는 환자에 투여될 수 있다. The inhibitory nucleic acid molecule may have a nucleotide sequence that is substantially identical to a portion of the nucleic acid encoding IFITM1. As described above, single-stranded oligonucleotides that are substantially identical to at least a portion of the nucleic acid encoding IFITM1 can be administered to patients who have cancer or are at risk of having cancer.
억제성 핵산은 네이키드 플라스미드 또는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하는 DNA 바이러스와 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 발현 벡터나 리포좀에 제형화된 다른 DNA를 포함하는 다양한 임의의 형태로 세포로 전달될 수 있다. 필요한 핵산의 양은 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 전달 제형이나 사용하는 핵산이 DNA인지 RNA인지에 따라 결정할 수 있을 것이다. Inhibitory nucleic acids include naked plasmids or other DNA formulated in liposomes or expression vectors, including viral vectors, including DNA viruses and RNA viruses, including adenoviruses, lentiviruses, alphaviruses, and adeno-associated viruses. It can be delivered to cells in any of a variety of forms. The amount of nucleic acid needed can be determined by a person skilled in the art depending on the delivery formulation and whether the nucleic acid used is DNA or RNA.
억제성 핵산을 발현하는 벡터의 전달은 혈관내 또는 근육내 주사와 같이 전신으로, 또는 표적 기관이나 조직 등으로 국소적으로 투여될 수 있다. Delivery of a vector expressing an inhibitory nucleic acid can be administered systemically, such as by intravascular or intramuscular injection, or locally to a target organ or tissue.
DNA 내 포스포다이에스터 결합을 자르는 핵산 가수분해 효소는 대부분의 세포에서 발현되기 때문에, 억제성 올리고뉴클레오티드와 같은 변형되지 않은 DNA는 대부분 분해되지 않기 위해 일반적으로 변형이 일어난다. 또한, 안티센스의 대부분의 표적은 세포 내에 존재하기 때문에, 핵산이 세포 내로 들어가는 것을 고려해야 한다. 임상적 사용을 위해 분해되지 않도록 변형된 뉴클레오티드를 갖는 억제성 핵산이 선호된다. 또한, 특정 세포를 표적으로 할 수 있는 선택성을 높이거나 세포 막 등을 통과할 수 있도록 하기 위하여 다른 분자가 융합되기도 한다. Since nucleic acid hydrolases that cleave phosphodiester bonds in DNA are expressed in most cells, unmodified DNA, such as inhibitory oligonucleotides, is usually modified to avoid degradation. Additionally, since most targets of antisense exist within cells, the entry of nucleic acids into cells must be considered. For clinical use, inhibitory nucleic acids with nucleotides modified so that they are not degraded are preferred. In addition, other molecules may be fused to increase selectivity for targeting specific cells or to enable passage through cell membranes.
억제성 핵산의 화학적 변형을 통해 생리학적 활성을 현저히 향상시킬 수 있다. 안티센스핵산을 포스포로시오에이트 변형함으로써 세포 표면 단백질에 대한 결합력을 향상시킬 수 있다. PMO-변형된 안티센스 핵산에 대하여 양전하를 띄는 아르기닌이 풍부한 펩티드를 융합시킴으로써 세포 전달을 개선할 수 있다. Physiological activity can be significantly improved through chemical modification of inhibitory nucleic acids. Antisense nucleic acids can be modified with phosphorothioate to improve binding ability to cell surface proteins. Cell delivery can be improved by fusing positively charged arginine-rich peptides to PMO-modified antisense nucleic acids.
세포내 전달 시스템은 안티센스 핵산 융합체와 양이온성 지질 전달체, 세포 특이적 수용체에 결합하는 운반체 분자, 사이클로덱스트린, 덴드리머, 미세입자, 및 거대분자를 포함한다. 이 전달 시스템은 안티센스 핵산을 핵산 분해로부터 보호하고/거나 흡수성 엔도사이토시스를 촉진하여 세포내 전달 효율을 향상시킬 수 있다. Intracellular delivery systems include antisense nucleic acid fusions and cationic lipid carriers, carrier molecules that bind to cell-specific receptors, cyclodextrins, dendrimers, microparticles, and macromolecules. This delivery system can improve intracellular delivery efficiency by protecting antisense nucleic acids from nucleic acid degradation and/or promoting absorptive endocytosis.
거대분자에는 세포-관통 펩티드 (CPP), 이황화 결합을 통해 안티센스 핵산에 융합된 양이온성 짧은 펩티드 서열을 포함한다. 일반적으로 사용되는 CPP는 penetratin, HIV TAT 펩티드 48-60, 및 transportan을 포함한다. 또한, 리포솜 전달 시스템에 다이올레일포스파티딜에탄올아민을 결합함으로써 엔도좀 막을 불안정화시키고 엔도사이토시스 후에 안티센스 핵산의 방출을 촉진할 수 있다. Macromolecules include cell-penetrating peptides (CPPs), short cationic peptide sequences fused to antisense nucleic acids through disulfide bonds. Commonly used CPPs include penetratin, HIV TAT peptide 48-60, and transportan. Additionally, by binding dioleylphosphatidylethanolamine to the liposome delivery system, it is possible to destabilize the endosomal membrane and promote the release of antisense nucleic acids after endocytosis.
투여 후 생리학적 활성을 증진시키기 위해서 불활성 생분해성 알부민 폴리머 매트릭스에 캡슐화할 수 있는데, 이를 통해 9% 내지 70%의 생리학적 활성을 증진시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 또한, 반감기나 분포용적과 같은 약동학적 지표 역시 미세캡슐화를 통해 증가시킬 수 있음이 보고된 바 있다.To enhance physiological activity after administration, it can be encapsulated in an inert, biodegradable albumin polymer matrix, and it has been reported that this can improve physiological activity by 9% to 70%. Additionally, it has been reported that pharmacokinetic indices such as half-life and volume of distribution can also be increased through microencapsulation.
몇몇 나노입자 기반의 siRNA 전달 시스템이 FDA에 승인되어 암 치료 관련 임상에 도입된 바 있다. 현재 암 치료에 관하여 임상 시험 중인 모든 나노입자로 제형화된 siRNA 전달 시스템은 폴리머 또는 리포좀에 기반한다. Several nanoparticle-based siRNA delivery systems have been approved by the FDA and have been introduced into clinical trials for cancer treatment. All nanoparticle-formulated siRNA delivery systems currently in clinical trials for cancer treatment are based on polymers or liposomes.
효과적인 siRNA 전달을 위하여 표적 리간드에 융합된 나노입자는 종양 표면 수용체에 결합할 수 있는 확률이 증가하지만, 이러한 공정으로 인해 나노입자의 전체적인 크기가 증가하게 된다. 나노입자를 PEG로 코팅하면 RES에 의한 흡수를 감소시키고, 결과적으로 순환 반감기를 증가시키지만, PEG 분자가 공간학적으로 선택적 결합을 방해하기 때문에 표적 특이성이 감소하게 된다. 따라서, 적절한 세포 특이적 표적 모이어티를 선택하고 안정하고 효능이 있는 나노입자 전달 시스템을 설계하는 것이 중요하다. 양이온성 지질, 폴리머, 덴드리머, 및 무기 나노입자와 같은 다양한 나노입자 기반의 전달 시스템이 in vitro 및 in vivo에서 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있는 것으로 공지되어 있다. For effective siRNA delivery, nanoparticles fused to targeting ligands have an increased probability of binding to tumor surface receptors, but this process also increases the overall size of the nanoparticles. Coating the nanoparticles with PEG reduces uptake by RES and consequently increases the circulating half-life, but reduces target specificity because the PEG molecules interfere with spatially selective binding. Therefore, it is important to select appropriate cell-specific targeting moieties and design stable and efficacious nanoparticle delivery systems. It is known that various nanoparticle-based delivery systems, such as cationic lipids, polymers, dendrimers, and inorganic nanoparticles, can effectively deliver siRNA in vitro and in vivo.
안티센스 핵산은 흡수가 가능하도록 화학적인 변형을 수반하여 식염수 내에 제형화되어 경구 투여와 같이 전신으로, 또는 종양으로의 국소 투입을 통해 전달될 수 있다. 이들의 포스포로시오에이트 백본은 혈청 단백질에 결합하여 신장에 의한 분비를 늦춘다. 방향성 핵염기는 혈청 내 및 세포 표면 상의 다른 소수성 분자와 상호작용한다. 많은 형태의 세포들이 in vivo에서 올리고뉴클레오티드를 흡수하는 표면 수용체를 발현되는데, 배양된 세포에서는 종종 사라지기도 하며, 이는 in vivo에서보다 배양 시 지질이 ASO (allele-specific oligonucleotide) 전달에 더 중요하게 보이는지를 설명한다. Antisense nucleic acids can be formulated in saline solution with chemical modifications to enable absorption and delivered systemically, such as by oral administration, or through topical administration to tumors. Their phosphorothiate backbone binds to serum proteins and slows secretion by the kidneys. The aromatic nucleobases interact with other hydrophobic molecules in serum and on the cell surface. Many cell types express surface receptors that take up oligonucleotides in vivo, but these often disappear in cultured cells, suggesting that lipids may be more important for allele-specific oligonucleotide (ASO) delivery in culture than in vivo. Explain.
전달은 단일 가닥 핵산보다는 이중 가닥 RNA가 더 어렵다. siRNA에서, 모든 방향족 핵염기는 안쪽에 위치하고, 오직 상당량 수화된 인산만이 이중 가닥의 바깥쪽에 위치한다. 수화된 표면은 세포 표면과는 거의 상호작용하지 못하고, 소변으로 빠르게 배출된다. 따라서 연구자들은 siRNA의 전달체를 개발하기 위해 많은 연구를 수행하였다. siRNA를 전달하기 위한 주된 기술은, 비록 요망되는 결과가 펩티드 형질도입 도메인 및 양이온성 폴리머로도 얻어지긴 하였으나, RNA를 양이온성 및 중성 지질과 혼합하는 것이다. 제제 내에 PEG화된 지질을 포함함으로써, 입자의 순환 반감기를 연장시킬 수 있다. siRNA의 하나의 가닥에 콜레스테롤을 융합함으로써 마우스의 간에서 효과적으로 녹다운을 유발하였으나 유효성분의 필요량이 통상의 지질 기반 제형보다 수배 높에 낮다는 단점이 있었다. Delivery of double-stranded RNA is more difficult than single-stranded nucleic acid. In siRNA, all aromatic nucleobases are located on the inside, and only the significantly hydrated phosphates are located on the outside of the double strand. The hydrated surface has little interaction with the cell surface and is quickly excreted in the urine. Therefore, researchers have conducted a lot of research to develop siRNA delivery vehicles. The main technique for delivering siRNA is mixing RNA with cationic and neutral lipids, although desired results have also been obtained with peptide transduction domains and cationic polymers. By including PEGylated lipids in the formulation, the circulating half-life of the particles can be extended. By fusing cholesterol to one strand of siRNA, it effectively induced knockdown in the liver of mice, but it had the disadvantage of being that the amount of active ingredient required was several times higher than that of conventional lipid-based formulations.
단일 가닥 DNA 또는 RNA의 최적화 중 한가지 방법은 포스포다이에스터 결합 위치에 포스포로시오에이트 (PS) 결합을 도입하는 것과 같이 핵산 분해 효소에 대한 저항성을 증가시키기 위한 화학적 변형을 사용하는 것이다. 이와 같은 변형은 핵산 분해 효소에 의한 소화에 대한 안정성을 크게 향상시킨다. PS 결합은 또한 in vivo에서 혈청 단백질에 대한 결합력을 향상시키고, 반감지를 증가시키며 조직으로의 활성 성분이 더 잘 전달될 수 있도록 한다. PS 변형만을 포함하는 ASO는 안티센스 효과를 세포 내에서 만들어낼 수 있으나 효력이 항상 높지 않을 뿐더러 결과가 신뢰할만큼 일상적이지도 않다. One way to optimize single-stranded DNA or RNA is to use chemical modifications to increase resistance to nucleases, such as introducing phosphorothioate (PS) bonds at the phosphodiester bond sites. Such modifications greatly improve stability against digestion by nucleolytic enzymes. PS binding also improves binding to serum proteins in vivo, increases half-sensitivity, and allows better delivery of the active ingredient to tissues. ASOs containing only PS modifications can produce an antisense effect intracellularly, but the potency is not always high and the results are not routine enough to be reliable.
화학적 변형은 또한 상보적 서열에 대한 핵산의 결합 친화도를 높임으로써 효능 및 선택성을 증진시킬 수 있다. 널리 사용되는 변형은 2′-O-methyl (2′-O-Me), 2′-fluoro (2′-F), 및 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE) RNA이다. 또한 라이보오스의 2' 및 4' 위치 사이의 메틸렌 브릿지를 함유하는 LNA (locked nucleic acid)로 올리고뉴클레오티드를 변형함으로써 더 높은 친화력을 얻을 수 있다. 브릿지는 상보적 서열에 대한 결합 및 높은 친화력을 달성할 수 있는 이상적인 구조로 라이보오스 고리를 고정시킨다. 관련된 BNA(bridged nucleic acid) 화합물이 개발되었고 이러한 요망되는 성질을 공유한다. 이들의 높은 친화력은 기존에 생각하던 가능한 길이보다 훨씬 짧은 올리고뉴클레오티드를 개발할 수 있도록 하였다. 2′-O-Me, 2′-MOE, 2′-F, 또는 LNA를 올리고뉴클레오티드에 도입하기 위한 합성법은 DNA 또는 RNA 합성과 양립가능하여, DNA 또는 RNA와의 키메라가 쉽게 얻어질 수 있다. 이러한 양립가능성은 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 특정 용도에 미세 조정될 수 있도록 한다. Chemical modifications can also improve efficacy and selectivity by increasing the binding affinity of the nucleic acid to its complementary sequence. Widely used modifications are 2′-O-methyl (2′-O-Me), 2′-fluoro (2′-F), and 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE) RNA. Additionally, higher affinity can be achieved by modifying the oligonucleotide with a locked nucleic acid (LNA) containing a methylene bridge between the 2' and 4' positions of the ribose. The bridge anchors the ribose ring in an ideal structure capable of achieving high affinity and binding to complementary sequences. Related bridged nucleic acid (BNA) compounds have been developed and share these desirable properties. Their high affinity made it possible to develop oligonucleotides much shorter than previously thought possible. Synthetic methods for introducing 2'-O-Me, 2'-MOE, 2'-F, or LNA into oligonucleotides are compatible with DNA or RNA synthesis, so that chimeras with DNA or RNA can be easily obtained. This compatibility allows chemically modified oligonucleotides to be fine-tuned for specific applications.
지난 10년 동안, 이중 가닥 siRNA는 유전자 발현을 억제하기 위한 수단으로 광범위하게 활용되었다. 이중 가닥 RNA가 세포에 들어가면, RISC의 단백질 기작에 결합한다. 유전자를 결손시키기 위해 사용되는 합성된 RNA는 일반적으로 19 내지 22 bp의 이중 가닥이다. 이 길이는 안정한 이중 가닥을 형성하고 RISC에 의해 인식되기에 충분하면서도 30 bp이상의 길이의 이중 가닥이 유발하는 강한 인터페론 반응을 회피하기에 충분히 짧다. Over the past decade, double-stranded siRNA has been widely utilized as a means to suppress gene expression. When double-stranded RNA enters the cell, it binds to the protein machinery of RISC. The synthesized RNA used to delete genes is generally double stranded, 19 to 22 bp. This length is sufficient to form a stable duplex and be recognized by RISC, yet short enough to avoid the strong interferon response induced by duplexes longer than 30 bp.
2001년에 포유동물 세포에서 유전자 결실에 관한 첫 번째 논문이 발표된 후, siRNA는 기능을 시험하기 위한 수천가지의 실험적 연구의 대상이 되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 유전자 결실에 계속 사용되는 동안, siRNA의 강력한 특성과 상대적으로 용이한 활성 siRNA의 확인법으로 인해 많은 실험실에서 선호하는 결실 수단이 되었다. Since the first paper on gene deletion in mammalian cells was published in 2001, siRNA has been the subject of thousands of experimental studies to test its function. While antisense oligonucleotides continue to be used for gene deletion, the powerful properties of siRNA and the relative ease of identifying active siRNA have made them the preferred method of deletion in many laboratories.
배양된 세포에서 변형되지 않은 이중 가닥 RNA는 놀랍게도 안정하고 화학적으로 변형된 siRNA는 일반적으로 유전자 발현의 결손에 필수적이지는 않다. 그러나 in vivo에서는 변형되지 않은 siRNA는 활성이 높지 않고, 화학적 변형을 통해 이들의 특성을 현저히 개선할 수 있다. 화학적으로 변형된 siRNA는 개선된 핵산 분해 효소 안정성 및 활성의 지속 시간의 증가를 보일 수 있다. 변형되지 않은 RNA는 또한 빠르게 제거되고, 화학적 변형, 담체와의 복합체 형성, 및 질환 표적에 국소적 전달은 개선된 in vivo에서의 결과를 달성하는 데에 도움을 줄 수 있다. In cultured cells, unmodified double-stranded RNA is surprisingly stable, and chemically modified siRNA is generally not essential for defects in gene expression. However, in vivo, unmodified siRNA does not have high activity, and its properties can be significantly improved through chemical modification. Chemically modified siRNAs can show improved nuclease stability and increased duration of activity. Unmodified RNA is also rapidly cleared, and chemical modification, complex formation with carriers, and localized delivery to disease targets can help achieve improved in vivo outcomes.
본원 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 공지된 기술, 예를 들어, 고체상 합성을 통해 생산될 수 있다. 이러한 합성법에 사용되는 장비는 시중에서 구할 수 있으며, 합성을 위해 다른 수단들 역시 부가될 수 있다. Oligonucleotides used in the present invention can be produced through commonly known techniques, for example, solid phase synthesis. The equipment used in this synthesis method is commercially available, and other means may also be added for synthesis.
IFITM1 핵산에 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 억제성 핵산의 세포로의 치료학적 투여는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 임의의 핵산을 투여하는 방법을 포함한다. 암을 치료하기 위하여, 경구 투여 또는 주사, 또는 둘 모두를 통해 전달할 수 있다. 핵산 분자는 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법을 통해 세포에 전달될 수 있으며, 예를 들어, 이온영동, 또는 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생접합성 미소구체와 같은 다른 담체로의 병합, 또는 단백질성 벡터에 의해 리포좀으로의 캡슐화를 이용할 수 있다. Therapeutic administration of inhibitory nucleic acids to cells to inhibit the expression or activity of the protein encoded by the IFITM1 nucleic acid includes administering any nucleic acid known to those skilled in the art. To treat cancer, it can be delivered via oral administration or injection, or both. Nucleic acid molecules can be delivered to cells through a variety of methods known in the art, such as iontophoresis or transfer to other carriers such as hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, and bioconjugate microspheres. Incorporation, or encapsulation into liposomes by proteinaceous vectors can be used.
특정 구체예에서, IFITM1 핵산에 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 억제성 핵산은 세포 기관, 세포, 조직, 종양, 또는 생물에 피하, 피내, 근육내, 정맥내, 복강내 주사 등으로 투여될 수 있다. In certain embodiments, the inhibitory nucleic acid to inhibit the expression or activity of the protein encoded by the IFITM1 nucleic acid is administered to a cell organelle, cell, tissue, tumor, or organism by subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal injection, etc. may be administered.
상기의 억제성 핵산 또는 다른 활성 성분이 투여에 적합한 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 IFITM1 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 억제성 핵산 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. The above inhibitory nucleic acids or other active ingredients may be added to pharmaceutical compositions suitable for administration. For example, the pharmaceutical composition includes one or more inhibitory nucleic acids capable of reducing the expression or activity of a protein encoded by an IFITM1 nucleic acid and a pharmaceutically acceptable carrier.
상기의 억제성 핵산은 서방형 조성물로 제공될 수 있다. 즉시 방출 또는 서방형 조성물은 치료될 환자의 조건에 따라 결정될 수 있다. 만약 환자의 상태가 급성 또는 과급성 질환인 경우, 치료는 즉시 방출형을 사용하여야 하고, 반면 예방적 또는 장기적 치료인 경우에는 서방형 조성물이 적합하다. The inhibitory nucleic acid may be provided as a sustained-release composition. Immediate or sustained release compositions may be determined depending on the condition of the patient being treated. If the patient's condition is an acute or hyperacute disease, the treatment should use an immediate-release composition, whereas in the case of preventive or long-term treatment, a sustained-release composition is suitable.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중쇄(heavy chain) 및 두 개의 경쇄(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중쇄 및 경쇄는 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위(Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.The term "antibody" used in the present invention is a protein molecule containing immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with a specific antigen, and serves as an antigen receptor that specifically recognizes and reacts when a specific antigen invades the body. refers to a protein molecule. One antibody molecule consists of two heavy chains and two light chains, each of which includes a variable region and a constant region. The variable region includes three complementarity determining regions (CDR) and four framework regions (FR), and a binding site between the antibody and antigen is formed by the complementarity determining regions to form a specific Binding specificity of antibodies to antigens can be generated.
본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 IFITM1 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.Antibodies that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they inhibit the activity of the IFITM1 protein, and may include, for example, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or antibody fragments. In addition, it may also include genetically engineered antibodies such as chimeric antibodies or heterologous antibodies.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, IFITM1 shRNA에 의한 암세포의 이동성 및 침습성 억제효과는 IFITM1의 발현 또는 작용을 억제함으로써 전이 또는 침습을 억제하는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 IFITM1 억제제가 항암제로 사용되는 경우 전이성 암에서 전이 및 침습을 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있다. In a specific example of the present invention, it was confirmed that the inhibitory effect on the mobility and invasion of cancer cells by IFITM1 shRNA inhibits metastasis or invasion by inhibiting the expression or action of IFITM1, and the IFITM1 inhibitor of the present invention is used as an anticancer agent. In this case, it can be seen that it has the effect of suppressing metastasis and invasion in metastatic cancer.
본 발명의 일 실시예에서, IFITM1 핵산에 의해 발현되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 하나 이상의 억제성 핵산을 포함하는 약학 조성물에 관하여 개시한다. 본 발명의 일 실시예에서, 예를 들어, 환자의 세포와 같은 종양 세포에서 IFITM1 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하기 위한 억제성 핵산을 치료학적 유효량을 투여함으로써 암 환자를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물에 기재된 억제성 핵산은 표적 유전자인 IFITM1의 핵산 서열에 실질적으로 상보적이다. In one embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition comprising one or more inhibitory nucleic acids capable of inhibiting the expression or activity of a protein expressed by IFITM1 nucleic acid is disclosed. In one embodiment of the invention, a cancer patient may be treated, for example, by administering a therapeutically effective amount of an inhibitory nucleic acid to inhibit the expression or activity of the protein encoded by the IFITM1 nucleic acid in tumor cells, such as the patient's cells. there is. The inhibitory nucleic acid described in the composition of the present invention is substantially complementary to the nucleic acid sequence of the target gene, IFITM1.
본 발명은 암 또는 IFITM1의 발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 것으로 진단받은 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, IFITM1 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제성 핵산을 투여함으로써 IFITM1의 과발현과 관련된 증상이 완화되어 질환이 치료될 수 있다. The present invention relates to a method of treating a patient diagnosed with cancer or a disease characterized by the expression of IFITM1 by administering an inhibitory nucleic acid capable of inhibiting the expression or activity of the protein encoded by the IFITM1 nucleic acid. The symptoms associated with overexpression can be alleviated and the disease can be treated.
본 발명의 일 실시예에 따른 IFITM1의 발현 또는 활성을 억제하는 약제학적 유효량은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 환자의 나이, 체중 및 반응 등을 치료 또는 예방될 질환의 맥락에서 고려하여 결정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 유효량은 IFITM1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 약학 조성물, 또는 약물의 조직, 동물, 인간 등에서 암의 억제, 예방 또는 치료를 유발하는 양을 의미한다. The pharmaceutically effective amount for inhibiting the expression or activity of IFITM1 according to an embodiment of the present invention can be determined by a person skilled in the art by considering the patient's age, weight, response, etc. in the context of the disease to be treated or prevented. You can. In one embodiment of the present invention, an effective amount refers to an amount that causes the inhibition, prevention or treatment of cancer in tissues, animals, humans, etc. of a compound, pharmaceutical composition, or drug capable of inhibiting the expression or activity of IFITM1.
본 발명의 일 실 시예에서, IFITM1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물의 약제학적 유효량은 약학 조성물로서 전달될 수 있다. 일 실시예에서, 약학 조성물은 IFITM1의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물을 함유하는 제품일 수 있고, 상기 제품은 특정 양의 특정 성분을 포함한 제품 또는 직접적 또는 간접적으로, 특정 양에서 특정 성분의 조합에 의한 제품일 수 있다. In one embodiment of the present invention, a pharmaceutically effective amount of a compound capable of inhibiting the expression or activity of IFITM1 may be delivered as a pharmaceutical composition. In one embodiment, the pharmaceutical composition may be a product containing a compound that inhibits the expression or activity of IFITM1, wherein the product contains a specific ingredient in a specific amount or, directly or indirectly, a combination of specific ingredients in a specific amount. It may be a product caused by
본 발명에서 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 암의 진행에 1차 암과 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나는 전이성(침습성) 암으로 구분할 수 있다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 한다. In the present invention, “cancer” refers to a disease related to the regulation of cell death, and refers to a disease caused by excessive cell proliferation when the normal cell death balance is broken. In some cases, these abnormal hyperproliferating cells invade surrounding tissues and organs, forming tumors, and destroying or deforming the normal structure of the body. This condition is called cancer. In general, a tumor refers to a lump that grows abnormally due to autonomous overgrowth of body tissue, and can be divided into benign tumor and malignant tumor. Malignant tumors grow much faster than benign tumors, and can be divided into primary cancer and metastatic (invasive) cancer that infiltrates surrounding tissues and metastases. These malignant tumors are commonly referred to as ‘cancer.’
본 발명의 조성물은 암의 증식을 억제할 뿐 아니라, 다른 조직으로 전이되는 전이성 암으로 발달된 경우에도 암세포의 전이성을 억제하는 효과를 가진다는 점에서, 본 발명은 전이성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 일 수 있다. 또한, 본 발명의 유효성분은 IFITM1의 발현 또는 작용을 억제함으로써 암의 증식, 전이 또는 침습을 억제한다는 점에서 IFITM1 과발현이 나타나는 암, 또는 FoxM1 과발현이 나타나는 고형암 또는 FoxM1 과발현이 나타나는 전이성 고형암 치료용 조성물 일 수 있다. In that the composition of the present invention not only inhibits the growth of cancer, but also has the effect of suppressing the metastasis of cancer cells even when metastatic cancer has developed into metastatic cancer that spreads to other tissues, the present invention is a pharmaceutical for preventing or treating metastatic cancer. It may be an enemy composition. In addition, the active ingredient of the present invention is a composition for treating cancer with IFITM1 overexpression, solid cancer with FoxM1 overexpression, or metastatic solid cancer with FoxM1 overexpression, in that it inhibits cancer proliferation, metastasis, or invasion by inhibiting the expression or action of IFITM1. It can be.
상기 암은 고형암 일 수 있고, 구체적인 암의 종류로는 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다.The cancer may be a solid cancer, and specific cancer types include brain tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, and reproductive cancer. These include cytomas, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colon cancer, lymphoma, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma, and skin cancer, but the types of cancer of the present invention are not limited to the above examples.
본 발명에서 "개체"는 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물 또는 항암보조제용 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다. In the present invention, "individual" refers to all animals, including humans, that have or have developed a cancer disease, and that cancer, including liver cancer, can be alleviated or treated by administering the pharmaceutical composition or anticancer adjuvant composition of the present invention to the individual. there is. The alleviation refers to all actions in which cancer disease is improved or beneficial by administration of the composition according to the present invention.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 IFITM1을 억제하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. As used herein, the term “treatment” refers to clinical intervention to alter the natural processes of the individual or cell being treated, which may be performed during the course of a clinical pathology or to prevent it. The desired therapeutic effects include preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, and alleviating the disease state. Or it includes providing temporary relief and improving prognosis. Preferably, the present invention includes all actions to improve the course of cancer by administering a composition that inhibits IFITM1.
또한, "예방"은 본 발명에 따른 IFITM1의 억제제 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.In addition, “prevention” refers to all actions that inhibit or delay the onset of cancer by administering the IFITM1 inhibitor composition according to the present invention.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.The effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention refers to the amount required to achieve treatment of the disease. Therefore, the type of disease, the severity of the disease, the type and content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of dosage form and the patient's age, weight, general health condition, gender and diet, administration time, administration route and composition. It can be adjusted depending on a variety of factors, including secretion rate, duration of treatment, and concurrent medications.
또한, 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 전이성 감소 효과를 나타내는 항암용 조성물은 성인의 체중 1㎏ 당 0.01 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.In addition, the dosage is preferably selected according to the absorption, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, the patient's age, gender and condition, and the severity of the disease to be treated. The composition can be administered once or several times daily in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg, per 1 kg of body weight in an adult.
또한, 본 발명의 암세포 사멸 촉진 항암제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 촉진 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.In addition, the anticancer agent for promoting cancer cell death of the present invention can be administered parenterally, and when administered parenterally, it is preferably administered by intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection. To formulate for parenteral administration, the apoptosis-promoting anticancer agent can be mixed with water along with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which can be formulated into a unit dosage form of an ampoule or vial.
본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, '약제학적으로 허용가능한 담체'는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 유효성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include appropriate carriers, excipients, or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. As used herein, 'pharmaceutically acceptable carrier' means a known pharmaceutical excipient that is useful when formulating a pharmaceutically active compound for administration and is substantially non-toxic and non-sensitizing under the conditions of use. The exact proportions of these excipients are determined by the solubility and chemical properties of the active ingredient, the chosen route of administration, as well as standard pharmaceutical practice.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. The composition containing a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral dosage forms. When formulated, it can be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration may include tablets, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include one or more compounds and at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose. It can be prepared by mixing (lactose), gelatin, etc. Additionally, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, etc. may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is. Preparations for parenteral administration may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.
또한, 본 발명의 조성물은 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but may include tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, and emulsions. , it may have any one formulation selected from the group consisting of freeze-dried preparations and suppositories. In addition, it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method published in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예 1] 전이능을 가진 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 중 침습성인 암세포와 비침습성인 암세포에서 IFITM1의 발현 분석[Example 1] Expression analysis of IFITM1 in invasive and non-invasive cancer cells among circular or phosphorylated point mutants of FoxM1 with metastatic ability
FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549를 전이 능력의 하나인 침습성을 갖도록 matrigel을 통과시켜 수취하고 비침습성 세포, 침습성 세포의 mRNA를 얻어 Microarray분석을 진행하였다. Lung cancer cells A549, which express the original or phosphorylated point mutant protein of FoxM1, were collected by passing through matrigel to have invasiveness, which is one of the metastatic abilities, and mRNA from non-invasive and invasive cells was obtained and microarray analysis was performed.
구체적으로, 4℃에서 16~20시간동안 matrigel을 완전히 녹인 후 matrigel을 1 mg/ml이 되도록 차가운 RPMI (Serum-free)로 희석하였다. 이를 8.0 mm 6 well 인서트(insert)에 0.5 ml의 matrigel 혼합물(1 mg/ml)을 넣고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 matrigel insert에 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549들을 2X10 5 cells/well의 세포수로 RPMI(36℃ Serum-free)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 RPMI(10% FBS 포함)을 1 ml/well씩 분주하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습 되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 7일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어내어 인서트 내부에 세포와 matrigel의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면에 붙어있는 침습성 세포를 떼어 내기 위하여 6 Well 플레이트에 3 ml의 트립신을 분주하고 인서트를 넣은 상태에서 36℃ 인큐베이터에 5 분간 두었다. 5분 후 인서트에 붙어있는 세포를 피펫으로 떼어 내어주고 6 well 플레이트에 떨어진 침습성 세포까지 취하여 1000 rpm, 5 분간 원심 분리하여 세포를 취하였다. 수취한 세포에 trizol을 분주하여 세포를 충분히 녹여준 뒤, 클로로포름(chloroform)을 분주하고 상온에서 10 분간 반응시켰다. 14000 rpm, 4℃ 10 분간 원심분리하여 유기층을 제거하고 수층을 새로운 1.5 ml 튜브에 옮겨 담았다. 이소프로판올 (Isopropanol)을 분주하고 14000 rpm, 4℃ 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, DEPC에 녹여진 75% 에탄올을 이용하여 가라앉은 RNA를 세척하였다. 14000 rpm, 4℃ 10 분간 원심분리하고 상층액 제거 후, 무균작업대에서 RNA를 말려주었다. 말려진 RNA는 멸균된 증류수에 녹여 보관하였다. 얻어진 RNA는 Microarray 분석팀에 의뢰하였다.Specifically, after completely dissolving the matrigel at 4°C for 16 to 20 hours, the matrigel was diluted with cold RPMI (Serum-free) to 1 mg/ml. 0.5 ml of matrigel mixture (1 mg/ml) was added to an 8.0 mm 6 well insert and hardened in an incubator at 37°C for 12-20 hours. Lung cancer cells A549 expressing the original or phosphorylated point mutant protein of FoxM1 were diluted in RPMI (36°C Serum-free) at a cell number of 2X10 5 cells/well and dispensed onto the solid matrigel insert. Here, 1 ml/well of warm RPMI (containing 10% FBS) at 36°C was dispensed. After that, the medium was changed once every three days and the degree of invasion was observed. On the 7th day, when it was observed that cancer cell invasion had sufficiently occurred, the medium was removed, washed with 1XPBS, and the cells inside the insert were scraped off with a cotton swab. Cells and matrigel residues were removed from the inside of the insert. To remove the invasive cells attached to the outer surface of the insert, 3 ml of trypsin was dispensed into a 6-well plate and placed in an incubator at 36°C for 5 minutes with the insert inserted. After 5 minutes, the cells attached to the insert were removed with a pipette, and the invasive cells that fell on the 6-well plate were collected and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After dispensing trizol into the collected cells to sufficiently dissolve the cells, chloroform was dispensed and reacted at room temperature for 10 minutes. The organic layer was removed by centrifugation at 14000 rpm, 4°C for 10 minutes, and the aqueous layer was transferred to a new 1.5 ml tube. Isopropanol was dispensed and centrifuged at 14000 rpm for 10 minutes at 4°C to remove the supernatant, and then the settled RNA was washed using 75% ethanol dissolved in DEPC. Centrifugation was performed at 14000 rpm at 4°C for 10 minutes, the supernatant was removed, and the RNA was dried on a sterile workbench. The dried RNA was dissolved in sterilized distilled water and stored. The obtained RNA was submitted to the Microarray analysis team.
Microarray를 통하여 얻어진 유전자 발현 데이터를 이용하여 침습성과 비침습성을 가진 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 발현 세포에서 그 발현이 가장 높은 상위 유전자 12 개를 확인하였다. 이중 상위 5개 인자를 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 침습성 세포와 전체 세포에서 FoxM1의 인산화 점 돌연변이체 발현 세포에서 IFITM1의 발현이 가장 높음을 관찰하였다. Using gene expression data obtained through microarray, 12 top genes with the highest expression were identified in cells expressing the original or phosphorylated point mutant of invasive and non-invasive FoxM1. Among these, the top five factors were analyzed using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) to observe that the expression of IFITM1 was highest in cells expressing phosphorylated point mutants of FoxM1 in invasive cells and whole cells.
도 1A에 나타낸 Microarray 분석과 같이, 침습성을 가진 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체 발현 폐암세포 A549에서 IFITM1 유전자 발현은 3순위로 발현이 증가되었다. As shown in the microarray analysis shown in Figure 1A, IFITM1 gene expression was increased in the third order in lung cancer cells A549 expressing the invasive circular or phosphorylated point mutant of FoxM1.
도 1B에 나타낸 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)결과에서는 상위 5개 인자 중 침습성을 가진 FoxM1의 인산화 점 돌연변이체 발현 폐암세포 A549에서 IFITM1 유전자가 가장 급증하는 결과를 관찰하였다. In the real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) results shown in Figure 1B, the IFITM1 gene showed the most rapid increase in lung cancer cells A549 expressing a phosphorylated point mutant of FoxM1, which has invasiveness, among the top five factors.
도 1C에 나타낸 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체가 발현되는 total 암세포에서의 mRNA 분석한 결과 도1B와 같이 IFITM1 유전자가 가장 많이 증가하는 결과를 관찰하였다.As a result of mRNA analysis in total cancer cells expressing the original or phosphorylated point mutant of FoxM1 using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) shown in Figure 1C, the IFITM1 gene was observed to increase the most as shown in Figure 1B. did.
도 1D에서는 FoxM1의 원형 또는 인산화 점 돌연변이체를 마우스 꼬리에 정맥주사하여 전이성을 검토한 실험에서의 폐조직으로 IFITM1의 증가가 현저함을 마우스 조직을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)에서도 알 수 있었다. In Figure 1D, real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) using mouse tissue shows a significant increase in IFITM1 in lung tissue in an experiment to examine metastasis by intravenously injecting the original or phosphorylated point mutant of FoxM1 into the mouse tail. It was also possible to know
구체적으로, 점 돌연변이를 포함하는 FoxM1 단백질이 안정적으로 발현되는 A549 폐암세포(2X106 세포수)를 PBS에 넣어 마우스의 꼬리 정맥에 주사하여, 15주 동안 사육하고, 개복하여 장기에 암세포가 전이 및 종양형성능을 관찰하였다. 비교를 위해 대조군(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군), FoxM1 단백질 발현되는 A549 폐암세포주 투여군(WT), 인산화 점 돌연변이체 FoxM1 단백질 발현되는 A549 폐암세포주 투여군(S25E), 비인산화 점 돌연변이체 FoxM1 단백질 발현되는 A549 폐암세포주 투여군(S25A)에 대해서 암세포 전이 및 종양형성 여부를 관찰하였다. 각 실험군 마다 5마리의 마우스에 대하여 실험을 실시하고 폐조직으로 간엽형질 마커인 CDH1, CDH2, SNAl1, VIM 그리고 면역회피 인자인 CD274와 IFITM1의 mRNA 발현을 관찰하였다.Specifically, A549 lung cancer cells ( 2 Tumor formation ability was observed. For comparison, control group (Mock; lentivirus treatment group in which target gene is not expressed), group administered A549 lung cancer cell line expressing FoxM1 protein (WT), group administered A549 lung cancer cell line expressing phosphorylated point mutant FoxM1 protein (S25E), non-phosphorylated point group. Cancer cell metastasis and tumor formation were observed in the A549 lung cancer cell line administration group (S25A) expressing mutant FoxM1 protein. Experiments were performed on 5 mice in each experimental group, and the mRNA expression of mesenchymal markers CDH1, CDH2, SNAl1, and VIM and immune evasion factors CD274 and IFITM1 were observed in lung tissue.
이러한 결과는 도 1E에서 나타낸 면역블롯 실험에서도 유사하게 IFITM1 단백질의 발현이 FoxM1의 인산화 점 돌연변이체에서 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다.These results were similarly observed in the immunoblot experiment shown in Figure 1E, where the expression of IFITM1 protein was significantly increased in the phosphorylated point mutant of FoxM1.
따라서 전이를 유도하는 것으로 알려진 FoxM1 인산화 점 돌연변이체 발현에 의한 전이 환경에서 IFITM1가 증가하는 것을 확인하여 IFITM1가 전이암에서의 타겟이 될 수 있음을 증명하였다.Therefore, it was confirmed that IFITM1 increases in the metastatic environment due to the expression of a FoxM1 phosphorylation point mutant known to induce metastasis, proving that IFITM1 can be a target in metastatic cancer.
[실시예 2] IFITM1의 발현과 선폐암 환자 단계별 생존률과의 상관관계 분석[Example 2] Correlation analysis between the expression of IFITM1 and the survival rate of patients with adenocarcinoma by stage
IFITM1의 발현과 FoxM1의 상관관계를 알기 위하여 IFITM1 과발현 세포를 구축하였다. To determine the correlation between IFITM1 expression and FoxM1, IFITM1 overexpressing cells were constructed.
구체적으로 폐암세포 A549를 5 x 104 개의 세포를 분주 후 다음날 pCMV-VSV.G, pCMV-Δ8.2, pCMV-SPORT6-IFITM을 넣고 형질전환을 시켜 IFITM1 과발현 세포를 구축하였다.Specifically, 5
그림 2A와 같이 IFITM1 과발현된 상태에서 FoxM1 발현도 증가됨을 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)관찰할 수 있었다.As shown in Figure 2A, real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) observed that FoxM1 expression was also increased in the overexpressed state of IFITM1.
또한 그림 2B와 같이 면역블롯 실험을 이용하여 IFITM1 과발현 된 상태에서 FoxM1 및 간엽형질 마커인 Vimentin이 증가하고 상피형질 마커인 E-Cadherin의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 IFITM1 발현과 FoxM1 발현은 상관관계 있음을 보여준다.In addition, as shown in Figure 2B, using an immunoblot experiment, it was observed that when IFITM1 was overexpressed, FoxM1 and Vimentin, a mesenchymal marker, increased, and the amount of E-Cadherin, an epithelial marker, decreased. This shows that IFITM1 expression and FoxM1 expression are correlated.
비소세포폐암 환자에서 FOXM1과 IFITM1이 임상적 연관성을 확인하기 위해서 FOXM1과 IFITM1의 발현량에 따른 환자의 전체 생존율을 빅데이터 분석을 통해서 확인하였다(도 2C, D). 비소세포폐암은 폐선암(adenocarcinoma)과 편평세포폐암 (Squamous lung cell carcinoma) 나누는 데, 이를 나누어서 분석한 결과에 따르면, 폐선암 환자에서, FOXM1과 IFITM1 발현이 높은 환자의 생존율은 FOXM1과 IFITM1의 발현이 낮은 환자의 생존율에 비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다. 하지만 평편세포폐암에서는 이러한 양상을 보여주지 않는다(도 2C). 또한 폐선암환자 중 전이암이 관찰되는 stage 3인 환자 대상으로 재분석한 결과, FOXM1과 IFITM1 발현이 높은 환자의 생존율은 FOXM1과 IFITM1의 발현이 낮은 환자의 생존율에 비해 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 2D). 추가적으로 폐선암 환자를 stage 별로 FOXM1과 IFITM1의 발현정도를 heatmap으로 분석한 결과, 정상 조직에 비해 암환자에서 stage에 따라 조직에서, FOXM1과 IFITM1 발현이 높음을 확인하였다(도 2E).To confirm the clinical correlation between FOXM1 and IFITM1 in non-small cell lung cancer patients, the overall survival rate of patients according to the expression level of FOXM1 and IFITM1 was confirmed through big data analysis (Figure 2C, D). Non-small cell lung cancer is divided into adenocarcinoma and squamous lung cell carcinoma. According to the results of the analysis of these divisions, in lung adenocarcinoma patients, the survival rate of patients with high FOXM1 and IFITM1 expression was higher than that of those with high FOXM1 and IFITM1 expression. It was confirmed that this was significantly lower than the patient's survival rate. However, squamous cell lung cancer does not show this pattern (Figure 2C). In addition, as a result of re-analysis of lung adenocarcinoma patients with stage 3 metastatic cancer, it was confirmed that the survival rate of patients with high FOXM1 and IFITM1 expression was lower than that of patients with low FOXM1 and IFITM1 expression (Figure 2D ). Additionally, as a result of analyzing the expression levels of FOXM1 and IFITM1 in lung adenocarcinoma patients by stage using a heatmap, it was confirmed that FOXM1 and IFITM1 expression was higher in tissues depending on the stage in cancer patients compared to normal tissues (Figure 2E).
[실시예 3] 전이환경에서 IFITM1 shRNA에 의한 상피간엽이행 및 종양관련 대식세포 분화에 대한 억제 효과 평가[Example 3] Evaluation of the inhibitory effect on epithelial-mesenchymal transition and tumor-related macrophage differentiation by IFITM1 shRNA in a metastatic environment
IFITM1의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해서, shRNA 및 이를 포함하는 렌티바이러스를 제작하였다. To confirm the effect of suppressing mRNA expression of IFITM1, shRNA and a lentivirus containing it were produced.
구체적으로 IFITM1의 mRNA 발현을 억제하기 위하여 사람의 IFITM1 mRNA(Human IFITM1 mRNA [NM_ 003641.5])서열 중 373-393 또는 413-433 위치의 뉴클레오티드 서열을 타겟으로 하는 shRNA를 만들고자 프라이머를 제작하였다. 373-393 뉴클레오티드 타겟 서열 센스 부위(sense region)로는 5'- CCGCCAAG TGCCTGAACATCT-3'를, 안티센스 부위(antisense region)로는 5'- AGATGTTCAGGCA CTTGGCGG-3'부위를 이용하여 이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-IFITM1 플라스미드를 제작하였다. 포워드 프라이머로 5'- CCGG - CCGCCAAGTGCCTGAACATCT - CTCGAG - AGATGTTCAGGCACTTGGCGG - TTTTTG -3'를 사용하였고, 리버스 프라이머로 5'- AATTCAAAAA - CCGCCAAGTGCCTGAACATCT - CTCGAG - AGATGTTCAGGCACTTGGCGG -3'를 사용하였다. 413-433 뉴클레오티드 서열을 타겟으로 하는 shRNA의 센스 부위(sense region)로는 5'-CCTCATGACCATTGGATTCAT -3'를, 안티센스 부위(antisense region)로는 5'-ATGAATCCAATGGTCATGAGG-3'부위를 이용하여 이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-IFITM1 플라스미드를 제작하였다. 포워드 프라이머로 5'-CCGG - CCTCATGA CCATTGGATTCATCTCGAGATGAATCCAATGGTCATGAGGTTTTTG -3'를 사용하였고, 리버스 프라이머로 5'-AATTCAAAAACCTCATGACCATTGGATTCATCTCGAGATGAATCCAATGGTCATGAGG -3'를 사용하였다. 루프서열은 5'-CTCGAG-3'이고, 프라이머에 포함된 형태로 shRNA를 제작하였다. 이를 pHR'-CMV-VSVG, pHR'-CMV-deltaR8.2와 함께 HEK293 세포 형질감염을 통해 발현시킨 후, 세포의 배양배지를 모아 렌티 바이러스를 생산하였다. 원심분리기를 이용하여 상기 렌티 바이러스를 농축시켰다. 바이러스 발현 확인을 위하여 A549 세포를 5X104 개/ml으로 배양한 후, 다음 날 10 mM HEPES buffer(Sigma-Aldrich, USA), 1 mg/ml polybrene (Sigma-Aldrich, USA)에 렌티바이러스를 50 νl/well로 첨가하여 암세포를 감염시켰다. 24시간이 지난 후 Puromycine (Sigma-Aldrich, USA)을 48시간동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 감염된 세포를 선별하였고, 선별한 세포의 RNA를 취하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 IFITM1의 발현이 억제되었음을 관찰하였다. Specifically, in order to suppress the mRNA expression of IFITM1, primers were created to create shRNA targeting the nucleotide sequence at positions 373-393 or 413-433 of the human IFITM1 mRNA (Human IFITM1 mRNA [NM_ 003641.5]) sequence. The 373-393 nucleotide target sequence sense region is Using 5'- CCGCCAAG TGCCTGAACATCT-3' and 5'- AGATGTTCAGGCA CTTGGCGG-3' as the antisense region, pLKO-puro.1-IFITM1 plasmid was created using the pLKO-puro.1 vector. did. 5'- CCGG - CCGCCAAGTGCCTGAACATCT - CTCGAG - AGATGTTCAGGCACTTGGCGG - TTTTTG -3' was used as the forward primer, and 5'- AATTCAAAAA - CCGCCAAGTGCCTGAACATCT - CTCGAG - AGATGTTCAGGCACTTGGCGG -3' was used as the reverse primer. The sense region of shRNA targeting the 413-433 nucleotide sequence is The pLKO-puro.1-IFITM1 plasmid was constructed using the pLKO-puro.1 vector based on 5'-CCTCATGACCATTGGATTCAT -3' and 5'-ATGAATCCAATGGTCATGAGG-3' as the antisense region. 5'-CCGG - CCTCATGA CCATTGGATTCATCTCGAGATGAATCCAATGGTCATGAGGTTTTTG -3' was used as the forward primer, and 5'-AATTCAAAAACCTCATGACCATTGGATTCATCTCGAGATGAATCCAATGGTCATGAGG -3' was used as the reverse primer. The loop sequence is 5'-CTCGAG-3', and shRNA was produced in the form included in the primer. This was expressed through HEK293 cell transfection along with pHR'-CMV-VSVG and pHR'-CMV-deltaR8.2, and the culture medium of the cells was collected to produce lentivirus. The lentivirus was concentrated using a centrifuge. To confirm virus expression, A549 cells were cultured at 5 /well was added to infect cancer cells. After 24 hours, Puromycin (Sigma-Aldrich, USA) was treated for 48 hours to select viable infected cells, and RNA from the selected cells was used to identify IFITM1 through real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR). It was observed that expression was suppressed.
도 3A에 나타낸 바와 같이 IFITM1 shRNA (shIFITM1)를 넣어 준 폐암세포 A549는 대조군 shRNA (shCtrl)에 감염된 세포에 비하여 IFITM1의 mRNA의 발현이 감소하였고, 이는 IFITM1의 발현이 억제되었음을 보여준다(도 3A). As shown in Figure 3A, the expression of IFITM1 mRNA was reduced in lung cancer cells A549 into which IFITM1 shRNA (shIFITM1) was added compared to cells infected with control shRNA (shCtrl), showing that the expression of IFITM1 was suppressed (Figure 3A).
또한 IFITM1 shRNA 처리에 의한 IFITM1의 발현 억제로 A549 세포에서 암세포의 세포사멸정도를 관찰하기 위하여 caspase-3 assay을 진행하여 caspase-3 효소의 활성을 측정하였다(도 3B). A549 세포에 shCtrl, shIFITM1#373 (IFITM1 shRNA 타겟 서열 373-393 bp), shIFITM1#413 (IFITM1 shRNA 타겟 서열 413-433 bp)를 48시간 동안 처리한 후, puromycin을 이용한 선별 과정을 48시간동안 진행한 후 얻은 세포를 용해하였다. 용해된 세포 중에 존재하는 caspase-3의 활성을 측정하기 위하여, caspase-3의 형광기질(Ac-DEVD-AMC)와 1시간 반응 후 전자분광분석기(spectramax M4 system)을 이용하여 형광값(Ex. 380nm/Emi. 430nm)을 측정하였다. 측정된 형광값은 caspase-3 활성으로 대조군의 측정값을 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 측정값의 정도를 산출하여 그래프로 표시하였다. 그 결과, shIFITM1#413 세포에서 caspase-3 효소의 활성이 가장 높게 측정되었으며 그리고 shIFITM1#773 세포에서 caspase-3 효소의 활성이 높았고 shCtrl 세포에서는 caspase-3 효소 활성이 가장 낮게 측정된 것을 관찰하였다. 이런 결과로 shIFITM1 처리에 의한 IFITM1의 발현 억제로 세포사멸성을 유도 및 증가시키는 것을 알 수 있었다.In addition, to observe the degree of apoptosis of cancer cells in A549 cells by suppressing the expression of IFITM1 by IFITM1 shRNA treatment, caspase-3 assay was performed to measure the activity of caspase-3 enzyme (Figure 3B). A549 cells were treated with shCtrl, shIFITM1#373 (IFITM1 shRNA target sequence 373-393 bp), and shIFITM1#413 (IFITM1 shRNA target sequence 413-433 bp) for 48 hours, followed by selection using puromycin for 48 hours. After that, the obtained cells were lysed. To measure the activity of caspase-3 present in dissolved cells, after reacting with the fluorescent substrate (Ac-DEVD-AMC) of caspase-3 for 1 hour, the fluorescence value (Ex. 380 nm/Emi 430 nm) was measured. The measured fluorescence value was caspase-3 activity, and assuming that the control group's measurement value was 1, the relative measurement value in each experimental group was calculated and displayed on a graph. As a result, the highest caspase-3 enzyme activity was measured in shIFITM1#413 cells, the highest caspase-3 enzyme activity was observed in shIFITM1#773 cells, and the lowest caspase-3 enzyme activity was observed in shCtrl cells. These results showed that inhibition of IFITM1 expression by shIFITM1 treatment induced and increased apoptosis.
다음으로 본 발명자는 IFITM1의 발현 억제에 따른 상피간엽이행 감소 평가를 위하여 TGF-β 처리한 전이성 IFITM1 shRNA를 이용하여 IFITM1의 발현을 억제하고 상피간엽이행 마커를 단백질 수준에서 관찰하였다. Next, to evaluate the decrease in epithelial-mesenchymal transition due to inhibition of IFITM1 expression, the present inventors used TGF-β-treated metastatic IFITM1 shRNA to suppress the expression of IFITM1 and observed epithelial-mesenchymal transition markers at the protein level.
구체적으로, 폐암 세포 A549를 5X104 cells/ml으로 배양하고 대조군 바이러스(shCtrl) 또는 shIFITM1을 감염시킨 다음, puromycine을 48시간동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 세포를 선별하고 다시 5X104 cells/ml 분주하고 다음날 5 ng/ml TGF-β 48시간 처리 후 세포를 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량 하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 상피간엽이행 마커 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하여 상피간엽이행 과정의 감소를 확인하였다(도 3C). 또한 수취한 세포에서 mRNA를 정제하고 cDNA를 합성하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였고, mRNA 수준에서의 상피간엽이행 마커 N-cadherin을 비롯한 Vimentin, SNAI2, Smad2/3, p-Smad2 등 간엽이행 마커들이 감소, E-Cadherin은 증가하는것을 관찰함으로써 IFITM1 shRNA가 TGF-β에 의한 전이환경에서 상피간엽이행 과정을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 M2 마커 IL6, VEGFA의 발현도 감소시키다는 것을 확인하였다(도 3D). Specifically, lung cancer cells A549 were cultured at 5 Cells were harvested after 48 hours of treatment with 5 ng/ml TGF-β. The collected cells were incubated in 100 μl of grinding solution (0.5% Triton After treatment with 3 VO 4 , 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain), protein was quantified. The quantified protein was subjected to electrophoresis through SDS-PAGE, and then immunoblot was performed using an epithelial-mesenchymal transition marker antibody to confirm the decrease in the epithelial-mesenchymal transition process (Figure 3C). In addition, mRNA was purified from the collected cells, cDNA was synthesized, and real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) was performed. At the mRNA level, epithelial-mesenchymal transition markers N-cadherin, Vimentin, SNAI2, Smad2/3, p -By observing a decrease in mesenchymal transition markers such as Smad2 and an increase in E-Cadherin, it was confirmed that IFITM1 shRNA reduces the epithelial-mesenchymal transition process in the metastatic environment caused by TGF-β. It was also confirmed that the expression of M2 markers IL6 and VEGFA was decreased (Figure 3D).
그리고 대조군 세포(Mock)와 FoxM1 인산화 S25E가 발현되는 A549 세포를 5X104 cells/ml으로 배양하고 대조군 바이러스(shCtrl) 또는 shIFITM1을 감염시킨 다음 48시간동안 배양후 수취하였다. 수취한 세포는 100 ㎕의 분쇄 용액(0.5% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain)을 처리한 후 단백질 정량 하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 상피간엽이행 마커 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot)을 수행하여 상피간엽이행 마커 E-cadherin이 증가하고 Smad2/3, p-Smad2, SNAI1, SNAI2 그리고 p-PLK1, PLK1 등 발현의 감소를 확인하였다(도 3E). 또한 수취한 세포에서 mRNA를 정제하고 cDNA를 합성하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하였고, 상위 단백질 수준뿐만 아니라 mRNA 수준에서의 상피간엽이행 마커를 관찰함으로써 IFITM1 shRNA가 FoxM1 인산화 S25가 발현하는 전이환경에서 상피간엽이행 과정을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 M2 마커의 발현도 감소시키다는 것을 확인하였다(도 3F). Then, control cells (Mock) and A549 cells expressing FoxM1 phosphorylated S25E were cultured at 5 The collected cells were incubated in 100 μl of grinding solution (0.5% Triton After treatment with 3 VO 4 , 2 ㎍/ml leupeptin, 2 ㎍/ml pepstatin A, 100 ㎍/ml PMSF, 1 ㎍/ml antipain), protein was quantified. After electrophoresis of the quantified proteins through SDS-PAGE, immunoblot was performed using an epithelial-mesenchymal transition marker antibody, and the epithelial-mesenchymal transition marker E-cadherin increased, and Smad2/3, p-Smad2, SNAI1, and SNAI2 And a decrease in expression of p-PLK1, PLK1, etc. was confirmed (Figure 3E). In addition, mRNA was purified from the collected cells, cDNA was synthesized, real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) was performed, and epithelial-mesenchymal transition markers were observed at the mRNA level as well as the parent protein level. By observing IFITM1 shRNA, FoxM1 phosphorylated S25 It was confirmed that it reduces the epithelial-mesenchymal transition process in the metastatic environment where it is expressed. It was also confirmed that the expression of the M2 marker was also reduced (Figure 3F).
[실시예 4] 전이환경에서 IFITM1 shRNA에 의한 이동성과 침습성 및 종양관련 대식세포 분화에 대한 억제 효과 평가[Example 4] Evaluation of the inhibitory effect on mobility, invasiveness, and tumor-related macrophage differentiation by IFITM1 shRNA in a metastatic environment
또한 본 발명자는 IFITM1 shRNA가 인산화 FoxM1 S25E 발현되는 전이환경에서 인서트(Insert)를 이용하여 세포의 이동성을 억제하는 효과를 증명하였다. In addition, the present inventors demonstrated the effect of IFITM1 shRNA in suppressing cell mobility using inserts in a metastatic environment where phosphorylated FoxM1 S25E is expressed.
구체적으로 대조군 세포(Mock)와 인산화 FoxM1 S25E 발현하는 암세포에 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 IFITM1 shRNA(shIFITM1) 바이러스를 감염시켰다. 감염시킨 세포를 24 well 인서트(Insert)에 5X10 4 cells/well의 세포수로 혈청을 넣지 않은 RPM1(36℃에 희석하여 인서트에 분주하였다. 인서트 밖의 24 well에는 RPM1(10% FBS 포함)을 0.5 ml/well씩 분주하고 48시간 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 1XPBS로 3회 세척하여 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다(도 4A).Specifically, control cells (Mock) and cancer cells expressing phosphorylated FoxM1 S25E were infected with control shRNA (shCtrl) or IFITM1 shRNA (shIFITM1) virus. The infected cells were dispensed into the 24 well insert at a cell number of 5 Each ml/well was dispensed, and after 48 hours, 500 ㎕ of 4% paraformaldehyde was dispensed, washed three times with 1XPBS, and stained with 0.05% crystal-violet solution for 5 minutes, then washed five times with 1XPBS. The degree of staining was measured at 590 nm, and when the absorbance of the control group was 1, the relative absorbance of each experimental group was calculated and displayed on a graph (Figure 4A).
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이 대조군 렌티바이러스(shCtrl)를 처리한 경우, 대조군 세포(Mock_shCtrl)보다 활성형 FoxM1 인산화 S25E가 발현되는 세포(S25E_shCtrl)에서 세포의 이동성이 7배 정도 현저히 증가하였으나, IFITM1의 발현을 억제시킨 경우, FoxM1 인산화 S25E가 발현되었음에도 불구하고 세포의 이동성이 거의 나타나지 않았다 (S25E_shIFITM1). As a result, as shown in Figure 4A, when treated with the control lentivirus (shCtrl), cell mobility was significantly increased by about 7 times in cells expressing active FoxM1 phosphorylated S25E (S25E_shCtrl) compared to control cells (Mock_shCtrl). When the expression of IFITM1 was suppressed, there was little cell mobility even though FoxM1 phosphorylated S25E was expressed (S25E_shIFITM1).
다음으로, 본 발명자는 IFITM1 shRNA가 FoxM1 인산화 S25E 발현되는 전이환경에서 matrigel을 이용하여 세포의 침습성을 억제하는 효과를 증명하였다. Next, the present inventors demonstrated the effect of IFITM1 shRNA in suppressing cell invasiveness using matrigel in a metastatic environment where FoxM1 phosphorylated S25E is expressed.
본 발명을 위하여 4℃에서 16~20시간동안 matrigel을 완전히 녹인 후 matrigel을 1 mg/ml이 되도록 차가운 MEM matrigel을 (4℃, Serum-free)으로 희석하였다. 이를 8.0 mm 24 well 인서트(insert)에 0.1 ml의 matrigel 혼합물(1 mg/ml)을 넣고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 인서트(Matrigel insert)에 각각의 대조군 세포(Mock)와 인산화 FoxM1 S25E 발현하는 암세포에 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 IFITM1 shRNA(shIFITM1) 바이러스를 감염시킨 세포를 1X10 5 cells/well의 세포수로 RPM1(36℃, Serum-free)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 RPM1(10% FBS 포함)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 7일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 matrigel의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면이 있는 24 well에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.05% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.For the present invention, the matrigel was completely dissolved at 4°C for 16 to 20 hours, and then the matrigel was diluted with cold MEM matrigel (4°C, serum-free) to 1 mg/ml. 0.1 ml of matrigel mixture (1 mg/ml) was added to an 8.0 mm 24 well insert and hardened in a 37°C incubator for 12-20 hours. Each control cell (Mock) and cancer cells expressing phosphorylated FoxM1 S25E were infected with control shRNA (shCtrl) or IFITM1 shRNA (shIFITM1) virus on the hardened Matrigel insert at a cell count of 1X10 5 cells/well. It was diluted in RPM1 (36°C, serum-free) and dispensed onto the insert. Here, 0.5 ml/well of warm RPM1 (containing 10% FBS) at 36°C was dispensed. After that, the medium was changed once every three days and the degree of invasion was observed. On the 7th day, when it was observed that cancer cell invasion had sufficiently occurred, the medium was removed, washed with 1XPBS, and the cells inside the insert were scraped off with a cotton swab. and washed with 1XPBS to remove any remaining cells and matrigel inside the insert. 500 ㎕ of 4% paraformaldehyde was dispensed into 24 wells on the outer side of the insert, incubated at room temperature for 5 minutes, washed three times with 1XPBS every 5 minutes, and stained with 0.05% crystal-violet solution for 5 minutes. After 5 minutes, it was washed 5 times with 1XPBS, and the degree of staining was measured at 590 nm. Assuming that the absorbance of the control group was 1, the relative absorbance of each experimental group was calculated and displayed on a graph.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, 대조군 바이러스(shCtrl)을 처리한 인산화 FoxM1 S25E가 발현되어지는 세포는 대조군 세포(Mock)보다 세포의 침습성이 증가하였고, shIFITM1을 감염시켜 IFITM1의 발현을 억제시키자 인산화 FoxM1 S25E가 발현되었음에도 불구하고 세포의 침습성이 감소하였다. As a result, as shown in Figure 4B, the invasiveness of cells expressing phosphorylated FoxM1 S25E treated with the control virus (shCtrl) increased compared to the control cells (Mock), and the expression of IFITM1 was inhibited by infection with shIFITM1. Even though phosphorylated FoxM1 S25E was expressed, the invasiveness of the cells was reduced.
도 4의 결과를 종합하였을 때, 인산화 FoxM1 S25E 발현되는 세포는 상피간엽이행을 증가시킬 뿐만 아니라 세포의 이동성과 침습성을 증가시키는 전이 환경을 가지며, 이러한 전이 환경에서 IFITM1 shRNA를 이용하여 IFITM1의 발현을 억제하였을 때에 상피간엽이행이 감소되며, 세포의 이동성과 침습성 또한 감소하는 것을 증명하였다. When summarizing the results in Figure 4, cells expressing phosphorylated FoxM1 S25E not only increase epithelial-mesenchymal transition, but also have a metastatic environment that increases cell mobility and invasiveness. In this metastatic environment, IFITM1 expression was induced using IFITM1 shRNA. It was proven that when inhibited, epithelial-mesenchymal transition is reduced and cell mobility and invasiveness are also reduced.
본 발명자는 FoxM1 인산화 점 돌연변이체 S25E가 발현되는 암세포에서 IFITM1 shRNA를 이용하여 IFITM1의 발현을 억제하였을 때 종양미세환경에서의 대식세포 (Macrophage cell)의 분화(polarization)에 영향을 주는지 보고자 인간 단핵구 THP-1 세포와 FoxM1 점 돌연변이체가 과발현된 세포군에서 IFITM1 shRNA를 이용하여 IFITM1의 발현을 억제한 세포들을 공배양한 후, THP-1 세포에서 M2 마커를 관찰하였다.The present inventor wanted to report whether suppressing the expression of IFITM1 using IFITM1 shRNA in cancer cells expressing FoxM1 phosphorylation point mutant S25E would affect the polarization of macrophages in the tumor microenvironment. Human monocyte THP After co-culturing -1 cells and cells in which the expression of IFITM1 was suppressed using IFITM1 shRNA in the cell group overexpressing the FoxM1 point mutant, M2 marker was observed in THP-1 cells.
구체적으로 상위 암세포 (4x104개/ml)과 THP-1 세포 (1.2x105개/ml)를 48h동안 공배양 후 THP-1 세포에서 M2d-종양 관련 대식세포(M2d-TAM)의 마커(JAYASINGAM, Sharmilla Devi, et al., Frontiers in Oncology (2020) 9: 1512.) CD163, CD206, VEGFA의 mRNA 발현은 모두 shIFITM1을 감염시켜 IFITM1의 발현을 억제시키자 인산화 FoxM1 S25E가 발현되었음에도 불구하고 발현이 감소됨을 관찰하였다(도 4C). FoxM1 S25E가 발현되는 A549 세포와 공배양한 THP-1 세포에서 M2d-종양 관련 대식세포의 마커들이 발현이 높게 관찰되었으나 shIFITM1을 처리하여 IFITM1의 발현을 억제시키자, M2d-TAM로 분화력이 현저히 약해짐을 관찰하였다.Specifically, after co-culturing top cancer cells (4x10 4 cells/ml) and THP-1 cells (1.2x10 5 cells/ml) for 48 h, a marker of M2d-tumor-related macrophages (M2d-TAM) was detected in THP-1 cells (JAYASINGAM) , Sharmilla Devi, et al., Frontiers in Oncology (2020) 9: 1512.) The mRNA expression of CD163, CD206, and VEGFA were all decreased when the expression of IFITM1 was inhibited by infection with shIFITM1, despite the expression of phosphorylated FoxM1 S25E. was observed (Figure 4C). High expression of markers of M2d-tumor-related macrophages was observed in THP-1 cells co-cultured with A549 cells expressing FoxM1 S25E. However, when the expression of IFITM1 was suppressed by treatment with shIFITM1, the ability to differentiate into M2d-TAM was significantly weakened. I observed Jim.
예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.For example, for claim construction purposes, the claims set forth below should not be construed in any way narrower than their literal language, and thus exemplary embodiments from the specification should not be read as claims. Accordingly, it should be understood that the present invention has been described by way of example and not as a limitation on the scope of the claims. Accordingly, the invention is limited only by the following claims. All publications, issued patents, patent applications, books and journal articles cited in this application are each hereby incorporated by reference in their entirety.
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Claims (13)
The recombinant viral vector according to claim 12, which expresses any one selected from the group consisting of shRNA, siRNA, antisense RNA, antisense DNA, chimeric antisense DNA/RNA, miRNA, and ribozyme.
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