KR20240086717A - 벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제 유전자의 게놈 편집 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제(lycopene ε-cyclase) 유전자의 게놈 편집 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시키기 위한 HDR (homology-directed repair) 기반의 유전체 교정용 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제 유전자의 게놈 편집 방법{Genome editing method of Golden SNP-carrying lycopene epsilon-cyclase gene using CRISPR/Cas9 and geminiviral replicon system in rice}
본 발명은 벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제(lycopene ε-cyclase) 유전자의 게놈 편집 방법에 관한 것이다.
표적 유전체 편집은 유전자 기능을 연구하고 새로운 기능을 도입하거나 결함이 있는 유전자를 수정하기 위한 강력한 유전 도구가 되었다. 따라서 기존에 새로운 유전적 변이를 발생시키기 위해 사용되었던 무작위 돌연변이 발생 및 재조합 기술에 비해 식물 육종에서 매우 중요한 도구가 되고 있다. 정확한 게놈 편집은 clustered regularly spaced short palindromic repeats (CRISPR) 및 CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템을 통한 표적 이중 가닥 절단(double strand break, DSB) 유도를 통해 달성되었다. 현재까지 많은 연구에서 CRISPR-Cas9 매개 유전체 편집이 특정 InDel 돌연변이, 유전자 타겟팅(gene targeting, GT) 및 유전자 발현 제어의 가능성을 입증했다. 다만, GT나 유전자 치환은 가능하지만 여전히 낮은 빈도로 인해 일상적인 방법은 아니다. 게놈 표적과 염색체 외 상동의(homologous) 공여체 사이의 HDR (homology-directed repair) 빈도를 증가시키기 위한 다양한 방법이 수년간 보고되었다. 식물에서 HDR 또는 유전자 치환은 게놈 표적에서 DSB를 유도하는 것과 세포에 공여체 회복 템플릿의 존재 사이의 조정을 필요로 했다. 그러나 식물 게놈 공학 분야에서는 녹아웃(knock-out) 방법에 의해 매개되는 NHEJ (non-homologous end joining DNA repair)가 HDR 방법보다 여전히 선호된다. 그 이유는 HDR을 위한 표적 세포에 충분한 수의 DRT (donor repair template)를 전달하기 어렵고, 세포 내에서 DRT의 안정성이 보장되지 않기 때문이다. HDR 매개 DSB 수리를 위해 DRT를 식물에 전달하는 것은 상당히 어려운 일이다. 최근에, 벼의 유전자 녹인(knock-in) 빈도를 높이기 위해 제미니바이러스 레플리콘(geminiviral replicon) 기반 기증자 템플릿 전달 시스템을 구축했다고 보고되었다(Wang, M. et al., Mol. Plant (2017) 10:1007-1010). 제미니바이러스 게놈의 높은 복제 수와 단일 가닥 DNA 특성으로 인해, 이들 게놈은 식물에서 GT의 DNA 템플릿 운반체로 사용될 수 있다. 현재까지 제미니바이러스 복제 시스템을 사용한 성공적인 유전자 타겟팅은 편집된 대립유전자와 관련된 선발마커를 필요로 했으며, 이는 선발마커를 사용하지 않고 식물 유전자를 표적화하는 것이 여전히 과제임을 나타낸다(Butler, N.M. et al., Front. Plant Sci. (2016) 7:1045; Gil-Humanes, J. et al., Plant J. (2017) 89:1251-1262; Hummel, A.W. et al., Plant Biotechnol. J. (2018) 16:1275-1282). 따라서 식물의 GT, 특히 선발 가능한 마커가 없는 대립 유전자는 여전히 많은 연구를 통해 개선되어야 한다.
카로티노이드는 색소체에서 합성되어 적색, 주황색 및 황색 색소로 축적되는데, 그 중 β카로틴, 라이코펜 및 루테인은 강력한 항산화제로서 산업적으로 중요한 성분이다. 라이코펜 β-시클라제(lycopene β-cyclase)와 라이코펜 ε-시클라제에 의해 촉매되는 라이코펜 말단의 고리화는 β-카로틴 또는 α-카로틴을 형성한다. Wakasa 등(J. Plant Physiol. 1984, 117:223-231)은 약배양(anther culture) 유래 돌연변이 캘러스의 반복적인 계대배양을 통해 오렌지색과 귤색을 나타내는 2개의 벼 캘러스 계통을 보고하였다. 이시하라 등(Plant Biotechnol. 2015, 32:193-203)은 귤색 캘러스 계통이 523번째 아미노산인 히스티딘(His)을 루신(Leu)으로 치환을 유도하는 단일 염기 다형성을 가지는 LcyE 유전자(H523L)를 가지는데, 야생형 캘러스에 비해 극적으로 높은 카로티노이드 함량을 나타내는 것을 보여주었다.
한편, 한국등록특허 제2002443호에는 '식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0052862호에는 '식물의 베타카로틴 함량을 증가시키는 라이코펜 ε-사이클라아제 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제 유전자의 게놈 편집 방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은CRISPR/Cas9 시스템과 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 사용하여 Golden SNP를 포함하는 OsLcyE (Oryza sativa lycopene ε-cyclase) 유전자를 가진 HDR (homology-directed repair) 캘러스 돌연변이체(LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2)를 제조하였다. 상기 LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 계통은 야생형과 비교하여 총 카로티노이드 함량이 현저히 높은 것으로 확인 되었으며, 염 스트레스 조건에서 야생형보다 활성산소종의 축적을 현저히 감소시킨다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시키기 위한 HDR (homology-directed repair) 기반의 유전체 교정용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전체 교정용 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전체 교정용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 카로티노이드 함량 증진을 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 CRISPR/Cas9 및 HDR (homology-directed repair) 시스템을 통해 카로티노이드 함량이 증가된 벼 식물체를 제조하였으며, 본 발명의 재조합 벡터를 활용하면 목표하는 유전자 단편을 엘리트 계통에 신속하게 도입 및 대체할 수 있으므로, 식물체의 신품종 육종에 기여할 수 있을 것이다.
도 1(A)는 LcyE 유전자 및 표적 부위를 나타낸 것이고, (B)에서 빨간색으로 표시된 뉴클레오티드는 SNP로 의도된 변형에 해당하며, 파란색으로 표시된 뉴클레오티드는 재절단을 피하고 절단된 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 생성하기 위한 침묵 돌연변이를 나타내며, 별표는 동일한 뉴클레오타이드를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 두 개의 가이드 RNA의 절단 부위는 PAM이 있는 두 개의 노란색 화살표로 표시되었다. (C)는 CRISPR/Cas9 벡터와 상동 DNA 공여체 주형 구성을 개략적으로 나타낸 것이고, (D)는 pGEMBos::LcyE 벡터가 도입된 벼의 캘러스에서 bar 유전자와 NOS 터미네이터 영역(프라이머 세트 NOS-bar F/R)의 PCR 분석 결과이다. M: 1kb DNA 마커, WT: 야생형, P: pGemBos::LcyE 플라스미드 벡터.
도 2(A)는 LcyE 표적 사이트의 주요 SNP 교체 위치(BamHI 제한 효소 부위가 공여체 내부에 생성됨)를 나타내며, (B)는 PCR 및 제한효소 분석을 이용한 선별 과정으로, 두 번째 PCR 산물은 BamHI 제한효소로 처리되었다. M: 1kb DNA 마커, N: 음성 대조군, P: pGemBos::LcyE_sg2 플라스미드 벡터, WT: 야생형. (C)는 벼에서 CRISPR-Cas9 기반 제미니바이러스 복제 시스템을 이용하여 편집된 캘러스 라인의 표현형을 보여주는 것이며, (D)는 Deep 시퀀싱을 통한 표적 서열 영역의 돌연변이 패턴 분석 결과이다. LcyE_sg1과 LcyE_sg2의 표적 DNA 서열은 정렬된 시퀀스의 상단의 WT에 파란색 텍스트로 표시되었으며, PAM 시퀀스는 밑줄이 표시되었다. 삭제는 -로 표시되고, 삽입은 빨간색으로 표시되며, 치환은 녹색 형광으로 표시된다. 우측의 숫자는 삽입 또는 결손된 크기를 의미하며, i는 삽입, d는 삭제를 의미한다.
도 3은 야생형 OsLcyE와 HDR 돌연변이형 OsLcyE의 구조 비교 결과로, (A)는 야생형 OsLcyE의 Asp296 위치를 나타내며, 검정 박스에는 주요 아미노산(Leu183, Asp296, Tyr297, Ser306, His307, Pro308, 및 Asn407)이 모두 표시되어 있다. (B)는 돌연변이 OsLcyE의 Asp296 위치를 나타내며, 검정 박스에는 주요 아미노산(Tyr182, Leu183, Gly185, Asn186, Lys187, Pro188, Ile189, Phe294, Asp296, Arg298, Phe301, Lys302, Ser306, 및 Thr324)이 모두 표시되어 있다.
도 4는 DAB 염색을 통한 야생형(WT), LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인 캘러스의 염-유도 산화적 스트레스 내성을 평가한 결과로, (A)는 DAB 염색을 통한 스트레스 처리 후의 WT, LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인 캘러스의 손상을 가시적으로 확인한 사진이다. NT: 염처리 전 각 계통 캘러스의 사진. (B)는 150 mM NaCl에서 배양한 WT, LcyEsg2-HDR1, LcyEsg2-HDR2 라인의 산화된 DAB 함량을 나타낸 것으로, 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시키기 위한 HDR (homology-directed repair) 기반의 유전체 교정용 재조합 벡터로서,
상기 유전체 교정용 재조합 벡터는 Ti 플라스미드의 LB (left border) 및 RB (right border) 서열 사이에 BeYDV (Bean Yellow Dwarf virus) 기반 레플리콘(replicon)을 포함하며,
상기 레플리콘은 NOS 터미네이터; 바스타 저항성 유전자; NOS (nopaline synthase) 프로모터; LIR (long intergenic region); CaMV 35S 프로모터; Cas9 (CRISPR associated protein 9) 코딩 서열; OsU3 프로모터-sgRNA 서열; HDR 공여체 서열(HDR donor); SIR (short intergenic region); Rep/RepA 단백질 코딩서열; 및 LIR;이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질은 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 벼 LcyE 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃 또는 녹-인하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 또한, "유전자 교정"은 "유전자 편집"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 재조합 벡터는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시켜, 카로티노이드 함량이 증가된 유전자 교정 벼 식물체를 제조하기 위함이 목적이다.
본 발명에서 HDR은 NHEJ (non-homologous end joining)과 함께 DNA가 손상되었을 때 일어나는 수선경로이나, HDR은 NHEJ의 1/1,000의 빈도로 일어난다고 보고되었다. CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 유전체의 특정 위치 유전자에 DSB를 만들면, 체세포에서 우세한 DNA 수선경로인 NHEJ 경로를 통해 DNA 수선이 일어날 때 종종 부정확한 수선으로 다양한 종류의 삽입결실(InDel) 돌연변이가 생성된다. 즉, 상기 기술은 무작위 돌연변이를 얻는 데는 유용하지만 진정한 의미의 유전체 교정/편집 기술은 아니다. 반면, HDR 기반 유전체 교정 기술은 외래 유전자의 표적 특이적 삽입, 특정 DNA 조각의 절단 또는 유사 DNA로 대체하는 등 실제 자유자재로 DNA 염기서열을 바꿀 수 있는 기술이며, HDR의 효율이 DSB의 유도에 의해 대폭 증가된다는 사실은 HDR 연구의 매우 중요한 단초로 작용했다. 하지만, DSB 유도가 HDR의 효율을 대폭 향상시킴에도 불구하고 HDR 효율은 NHEJ보다 여전히 약 1/100 수준으로 매우 낮아 실질적인 활용과는 거리가 멀었다. 이에, DSB에 의한 식물 HDR 기술을 개선하기 위한 많은 노력을 기울여왔고, 그 중에서 주목할 만한 진보는 바이러스 레플리콘(viral replicon)을 사용하면서 이루어졌다(Baltes et al., 2014, Plant Cell 26(1):151-163).
본 발명에서 용어 "레플리콘(replicon)"은 자율적 제어를 하는 복제단위를 의미하는 것으로, 복제단위는 연속된 DNA 분자로, 복제는 분자 내의 특정부위에서 개시하여 축차적으로 진행하여 종결한다. 플라스미드, 바이러스의 DNA 및 세균의 염색체는 모두가 1개의 복제단위이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 재조합 벡터는, Ti 플라스미드의 LB 및 RB 사이에 제미니바이러스인 BeYDV (Bean Yellow Dwarf virus)의 레플리콘을 포함하고 있는 것이 특징이다.
본 발명에 있어서, 바이러스의 LIR은 복제원점 및 프로모터와 같은 기능을 가지고 있고, SIR은 터미테이터와 같은 기능을 가지고 있는 구성요소이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 재조합 벡터에 있어서, 상기 상기 sgRNA 서열은 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "sgRNA"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질(예컨대, Cas9)을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 재조합 벡터에 있어서, 상기 Cas9은 RNA-가이드 뉴클레아제로, 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 Cas9 코딩 서열은 바람직하게는 벼 식물 코돈에 최적화된 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 HDR 공여체 서열(HDR donor)은 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 3의 염기서열은 벼 LcyE 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시킬 수 있도록 히스티딘 코딩 염기(CAT)가 루신 코딩 염기(CTT)로 변형된 교체 서열과 상기 교체 서열의 양 말단에 연결된 상동 염기서열(homology arms)로 이루어져 있다. 본 발명에 따른 상기 루신 코딩 염기에서 T 염기의 위치는 서열번호 3의 염기서열에서 559번째 위치에 해당한다. 상기 상동 염기서열(homology arms)을 이용하여 HDR이 일어나서 교체 서열을 원하는 위치로 정확하게 삽입할 수 있게 되는 것이다.
구체적으로, 서열번호 3의 염기서열에서 1 내지 521번째 염기 및 606 내지 1,116번째 염기는 각각 homology arm-Left와 homology arm-Right에 해당하며, 522번째 내지 605번째 염기가 루신 코딩 염기를 포함하는 벼 LcyE 교체 서열이다. 또한, 상기 서열번호 3의 염기서열에서 HDR 성공 후 Cas9에 의해 재절단되지 않고, HDR 이벤트를 확인할 수 있는 분자마커의 개발을 위해 상기 교체 서열 내 563 번째 및 569 번째 염기를 돌연변이시켰다. 563번째 염기는 제한효소 BamHI의 인식 서열 생성을 위해 야생형의 T 염기를 G 염기로 돌연변이시킨 것으로 코딩되는 아미노산에는 변화가 없는 silent mutation이다. 또한, 569번째 염기는 PAM 영역에 해당하는 것으로 야생형의 C 염기를 G 염기로 돌연변이시킨 것이다. 상기 PAM 영역의 변이는 sgRNA가 표적 서열에 결합하여 Cas9 효소에 의해 DNA를 자른 이후 HDR이 유도된 것을 가정하였을 경우, sgRNA이 재결합되어 Cas9에 의한 재절단이 발생하지 않도록 하기 위함이다.
일반적으로 레플리콘의 크기가 작으면 카피 수가 많아지고, 상동재조합의 확률은 공여체(HDR donor)의 카피 수가 많아질수록 확률이 증가하므로, 다양한 인자들을 고려하여 레플리콘의 구성을 조절할 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 것을 의미한다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
또한, 용어 "벡터"는 DNA 단편(들), 유전자 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 수단을 지칭할 때 사용된다. 벡터는 숙주세포에서 독립적으로 DNA를 복제시키고, 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 의미한다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유전체 교정용 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질도입하는 방법은, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터가 식물 세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 Cas9 단백질과 표적 서열로 Cas9 단백질을 이끄는 sgRNA, 및 LcyE 단백질의 523번째 아미노산이 히스티딘에서 루신으로 치환될 수 있는 SNP 염기를 포함하는 공여체 서열이 함께 발현되게 된다.
또한, 본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환된 것으로, 야생형과 비교하여 약 15배 이상 높은 카로티노이드 함량을 나타내었으며, 염 스트레스 내성이 증가한 것이 특징이다.
본 발명은 또한, 상기 유전체 교정용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 카로티노이드 함량 증진을 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시킬 수 있는 HDR 기반의 유전체 교정용 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하고 있어, 벼 식물체의 LcyE 교정에 의해 총 카로티노이드 함량을 증진시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 유전체 교정용 조성물은 HDR 경로 또는 NHEJ 경로를 조절할 수 있는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 HDR 경로를 조절할 수 있는 물질은 HDR 경로를 활성화시킬 수 있는 물질을 의미하며, 예컨대, RPA1A(replication protein A), RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B(RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DMC1(DNA Meiotic Recombinase 1), RAD52-1, RAD52-2, RAD54, XRCC1(X-Ray Repair Cross Complementing 1), XRCC2, XRCC3, ATM(ATM Serine/Threonine Kinase), XRS2/NBS(MRN/X), Mre11(MRN/X), rad50(MRN/X), Brca1(BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP/Com1/Sae2 또는 exo1의 발현을 조절(유도 또는 저해)할 수 있는 물질을 의미한다. 또한, NHEJ 경로를 조절할 수 있는 물질은 NHEJ 경로를 저해시킬 수 있는 물질을 의미하며, 예컨대, KU70(XRCC6), KU80(XRCC5) 및 LIG4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현을 저해할 수 있는 물질을 의미한다.
본 명세서에 사용된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다: 알라닌 Ala, A; 아르기닌 Arg, R; 아스파라긴 Asn, N; 아스파르트산 Asp, D; 시스테인 Cys, C; 글루탐산 Glu, E; 글루타민 Gln, Q; 글리신 Gly, G; 히스티딘 His, H; 이소루신 Ile, I; 루신 Leu, L; 라이신 Lys, K; 메티오닌 Met, M; 페닐알라닌 Phe, F; 프롤린 Pro, P; 세린 Ser, S; 트레오닌 Thr, T; 트립토판 Trp, W; 티로신 Tyr, Y; 발린 Val, V.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 유전자 편집 벡터의 구축 및 아그로박테리움 매개 형질전환
CRISPR-유도 HDR을 위한 식물 바이너리 벡터인 pGemBos는 pTC217(Addgene: #70018)를 변형하여 구축하였다. AtU6 프로모터와 GT 공여체(donor)는 체외에서 Cas9-RNP 절단으로 제거되었으며, OsU3 프로모터에 의해 유도되는 sgRNA 카세트와 공여체 삽입을 위한 MCS (multi-cloning site)는 Gibson assembly를 사용하여 도입되었다. 식물체의 항생제 선발을 위한 NOS 프로모터 및 터미네이터에 의해 제어되는 바스타 저항성 유전자인 포스피노트리신아세틸전달효소(Phosphinothricin acetyltransferase) 유전자(bar gene)는 MluI 절단 및 Gibson assembly에 의해 도입되었다. OsLcyE 서열에서 두 개의 CRISRP-Cas9 대상 자리는 Cas-designer(http://www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여 선택되었다.
sgRNAs for HDR by CRISPR-Cas9 system
sgRNA RGEN Target (5' to 3') Direction GC content
(%, w/o PAM)		 Out-of frame score Mismatches
0 1 2 3
sgRNA1 CAGAGAGGAGATGTCTGACAAGG
(서열번호 4)		 - 50.0 67.8 1 0 0 0
sgRNA2 TTGAGCCGGTCGGATCAGAGAGG
(서열번호 5)		 - 60.0 77.9 1 0 0 0
Under line is PAM sequence.
복제와 관련된 CRISPR 표적 서열의 경우 (주)바이오니아(한국)에서 합성한 어닐링 된 올리고뉴클레오타이드 쌍을 BsaI 처리에 의해 pGemBos로 클로닝하였다. Golden SNP 치환 돌연변이를 갖는 HDR 공여체 서열과 표적 부위의 침묵 돌연변이를 합성하여(바이오니아) SmaI 처리를 통해 MCS에 도입하였다. 이렇게 얻어진 컨스트럭트는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주를 사용하여 동진벼 유래 캘러스로 형질전환되었다(Park, J. et al., Bioinformatics (2015) 31:4014-4016). 형질전환된 캘러스는 6 mg/L의 포스피노트리신(phosphinothricin)을 사용하여 선택하였으며, PCR 분석을 통해 확인되었다. 표적 자리의 돌연변이를 확인하기 위해 PCR 앰플리콘을 MiniSeq paired-end read sequencing (Illumina, USA)을 수행하였고 Cas-Analyzer (https://www.rgenome.net/cas-analyzer)를 사용하여 분석하였다(Park, J. et al., Bioinformatics (2017) 33:286-288). 모든 형질전환 캘러스 라인은 다수의 계대배양을 수행했으며 2N6 배지(Jung, Y.J. et al., Plant Biotechnol. Rep. (2019) 13;511-520)로 유지되었다(도 2C).
2. 총 DNA 추출 및 돌연변이 검출
총 DNA 추출은 1.5 mL eppendorf 튜브에서 전기 드릴로 0.5 g의 캘러스를 액체질소(liquid nitrogen) 하에서 분쇄하여 수행하였다. 700 ㎕의 추출 버퍼(0.8 M NaCl; 0.15 M sorbitol; 0.12 M Tris-HCl, pH 7.5; 22 mM EDTA; 0.8 % CTAB; 0.8% sodium lauroyl sarcosinate)를 각 튜브에 넣고 20분 동안 반응시켰다. 각 튜브에 800 ㎕의 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)를 첨가하고 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 단계를 두 번 반복 수행하였다. 새로운 2 mL eppendorf 튜브에 상등액을 옮기고 1.4 mL의 저장 버퍼(80% EtOH 및 0.2 M Na Acetate)를 상등액에 첨가하였다. DNA 침전은 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 수행하였다. 펠릿은 50 ㎕의 증류수에 다시 현탁되었다. 그런 다음 추출된 게노믹 DNA를 주형으로 사용하여 프라이머를 사용하여 각 대상 유전자로부터 관련 단편을 증폭시켰다.
본 발명에 사용된 프라이머 정보
Primer name Sequence (5'→3') 서열번호
LcyE donor 1st Fw TCCTGCAACCGGTACTAACA 6
LcyE donor 1st Rw GTGGTGCAAGGAAGGAGAAG 7
LcyE donor 2nd Fw ATCCCGGGCCTGGAACCTCTCAAAGTTCC 8
LcyE donor 2nd Rw TCTCTAGACCCTTCTTCTGGGACCTAAA 9
LcyE donor OE-PCR Fw1 CGGCTCAACGATGATCAAG 10
LcyE donor OE-PCR Rv1 TGACAAGGTTCATTCGCATT 11
LcyE donor OE-PCR Rv2 CAGGTAGGTCTTGATCATCGTT 12
T-DNA confirm-Nos ter Fw TTGCGCGCTATATTTTGTTTT 13
T-DNA confirm-Bar R Rw CGTCAACCACTACATCGAGA 14
Replicon confirm-Rep Fw TTCTCCCAGAGAAACTGGAA 15
Replicon confirm-35S Rv CCATCTGTGGGTTAGCATTC 16
표준 PCR 조건은 94℃에서 3분 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 과정을 35회 반복한 후, 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 산물은 돌연변이를 식별하기 위해 내부 시퀀싱 프라이머를 사용하여 NGS 기술로 직접 시퀀싱하였다. 각 표적의 돌연변이율은 각 표적으로 편집된 형질전환 캘러스의 수와 획득한 형질전환 캘러스의 총 수를 비율로 계산하였다.
3. Golden SNP 치환 LcyE 돌연변이 캘러스의 표현형 관찰
OsLcyE 유전자에서 H523L로 치환된 HDR 돌연변이 캘러스의 표현형은 형질전환 후 두 번째 계대배양에서 광현미경으로 확인 및 촬영되었다.
4. 상동성 모델링 및 단백질 구조 분석
LcyE 서열을 번역하고, 성숙한 OsLcyE 폴리펩타이드(523개 아미노산)는 Unipro UGENE 정렬 플랫폼 Kalign, MUSCLE 및 ClusteralW를 사용하여 LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인의 돌연변이 버전과 정렬되었다. 상동성 모델링은 Pyre2를 사용하여 수행되었다. 돌연변이 단백질의 모델은 DS Visualizer를 사용하여 wild-type 버전에 중첩되었다.
5. 색소 추출 및 흡수 스펙트럼 측정
계대배양 28일 후, 캘러스 0.5 g를 액체 질소 하에서 분쇄하여 균질화하였다. 균질물에 아세톤(1 mL)을 첨가하여 잘 혼합하고, 4℃에서 5분 동안 13,000 rpm으로 원심분리 후 상등액을 채취하였다. 이 과정을 반복하고, 제2 상등액을 제1 상등액과 혼합하여 건조하고, 500 ㎕ 아세톤에 용해하였다. 이 용액을 아세톤으로 희석하여 분광광도계 Ultrospec 3000(Pharmacia Biotec, Seoul, Korea)을 이용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다.
6. 카로티노이드 함량 분석
아세톤에 뷰틸레이트 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 0.01% 첨가한 용액을 사용하여 캘러스 조직에서 카로티노이드를 추출하고 Lim 등(PNF 2009, 14:240-245)에서 설명한 방법에 따라 Agilent 1100 HPLC 시스템(Hewlette Packard, USA)을 사용하여 분석하였다.
7. 과산화수소(H 2 O 2 ) 분석
세포 내 H2O2의 수준을 측정하기 위해, 각 캘러스를 Kim 등(J. Exp. Bot. 2018, 69:3393-3400)의 방법에 따라 25℃에서 5시간 동안 1 mg·mL-1의 3,3-diaminobenzidine (DAB)-HCl(pH 3.8) 용액에 배양하였다. H2O2 측정의 경우 DAB 용액을 460 nm에서 흡광도로 측정하였다. 산화 DAB 농도는 DAB의 표준 곡선으로부터 계산하였다.
8. 통계적 분석
모든 실험은 최소 3개의 독립적인 생물학적 반복실험이 포함되었으며 데이터는 평균±표준 오차(SEM)로 제시되었으며, 모든 데이터 분석 및 처리는 마이크로소프트 엑셀 2019(Microsoft Corporation)와 RStudio를 사용하여 수행되었다. 야생형(WT), LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 계통에 대한 염 스트레스 조건에서의 활성산소종 실험을 위한 데이터는 one-way ANOVA와 Tukey's HSD를 사용하여 비교되었다. 그룹 간의 변동을 살펴보기 위해 분산 분석을 수행하여 p < 0.05에서 가장 유의하지 않은 차이를 구했다.
실시예 1. 표적 수정을 위한 Geminiviral 레플리콘에 의한 효율적인 대립 유전자 대체
게놈의 기존 대립유전자를 선택 마커가 없는 엘리트 대립유전자로 정확하게 대체하기 위해 Dahan-Meir 등이 이전에 보고한 제미니바이러스 복제체를 사용하여 다음과 같은 방법으로 HDR 전략을 개선하였다. 첫째, HDR이 성공했을 때 Cas9/gRNA가 DRT를 절단하지 않도록 DRT의 핵심 시퀀스에서 PAM (protospacer adjacent motif) 자리를 돌연변이로 만들었다. 또한 HDR 이벤트를 식별하기 위한 마커로서 DRT에 BamHI의 인식 사이트를 만들었다(도 1A, B). 상기 전략에 따라, 본 발명에서는 Cas9와 gRNA를 모두 표현하는 Ti-plasmid 벡터를 구성했는데, 이는 표적 게놈 사이트에서 DSB를 생성하고 플라스미드에서 DRT를 방출한다(도 1C). 상기 T-플라스미드 벡터에는 OsLcyE(H523L)로 대체하기 위한 모든 성분이 포함되어 있다(도 1). 형질전환된 캘러스는 6 mg/L의 포스피노트리신을 포함하는 2N6 배지에서 3번 계대배양되었다. 첫 번째로 T-DNA 영역의 도입여부를 판단하기 위하여 프라이머 세트 NOS-bar F/R(도 1D)를 이용한 PCR 분석결과 95%에서 기대 영역을 증폭하였다. HDR 이벤트 확인을 위해 총 387개의 형질전환 캘러스를 BamHI으로 절단하거나 deep sequencing 하였다. 그 결과, HDR은 LcyEsg2에서만 발생하였으며, 형질전환 캘러스의 1.32%(4/304)는 의도된 정확한 HDR 이벤트를 보여주었다(도 2D, 표 3). 또한, 돌연변이 유형의 대부분(54.5%)이 NHEJ를 통해 생성되었다(도 2D 및 표 3). 이들 4개의 캘러스 중 2개를 선택하여 각각 LcyEsg2-HDR1과 LcyEsg2-HDR2로 명명하고, 이들의 특성을 분석하기 위해 계대배양하였다(도 2A-C).
CRISPR-Cas9-기반 geminiviral 레플리콘 시스템을 이용한 OsLcyE 유전자의 HDR 효율 및 돌연변이 유형
Targeted Region No. of Examined
Calli		 DNA Repair
Pathway		 No. of Edited
Calli (%)		 Mutant Type No. of
Mutation
LcyE-sg1 83 NHEJ 48 (57.8%) Homo 8
Bi-allelic 13
Hetero 27
HDR 0 (0%) - -
LcyE-sg2 304 NHEJ 169 (54.5%) Homo 24
Bi-allelic 46
Hetero 93
HDR 4 (1.32%) Homo 4
실시예 2. OsLcyE 의 Golden SNP 치환에 따른 단백질 모델
OsLcyE 유전자에서 Golden SNP는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 8번째 엑손에서 HDR로 대체되며, 결과적으로 His에서 Leu으로 아미노산이 변화한다. LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인을 LcyE 활성 변화를 조사하기 위해 분석하였다. 돌연변이 서열을 번역하고 야생형 LcyE와 정렬함으로써 주요 기능 잔기를 식별할 수 있었다. 그 후, 돌연변이가 효소의 구조와 주요 기능 잔기에 미치는 영향을 결정하기 위해 상동 모델링을 사용하였다(도 3). LcyEsg2-HDR1과 LcyEsg2-HDR2 라인은 523번째 아미노산이 His에서 Leu으로 변경되었다. 야생형 LcyE와 돌연변이 버전의 비교 모델에서는 세작용기 촉매(catalytic triad)와 촉매 중심 안정화에 중요한 역할을 하는 His523 잔기의 교체로 인해 frame shift가 발생함을 알 수 있었다(도 3).
야생형의 LcyE 구조는 Leu183, Asp296, Tyr297, Ser306, His307, Pro308, 및 Asn407의 펩타이드 사슬에 의해 연결되어 있는 반면 HDR 돌연변이 라인의 LcyE 구조는 Tyr182, Leu183, Gly185, Asn186, Lys187, Pro188, Ile189, Phe294, Asp296, Arg298, Phe301, Lys302, Ser306로 구성되어 있었다(도 3). 돌연변이 라인은 엡실론(epsilon) Lyc 모티프 도메인에서 Golden SNP로 대체되어 효소 구조에 약간의 변화를 보여주었다(도 3B). 따라서, LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인의 LcyE 활성 변화는 촉매 중심의 기질 특이성을 결정하는 조절 C-말단 도메인(regulatory C-terminal domain)의 de novo 획득을 반영한다.
실시예 3. LcyE sg2-HDR1 및 LcyE sg2-HDR2 라인의 카로티노이드 분석
라이코펜과 β-카로틴의 누적량은 확실한(authentic) 화합물로부터 얻어진 표준 곡선을 이용하여 HPLC 분석을 통해 측정하였다. 10.2, 30.2, 33.1 및 35.3분에서 용출된 미확인 카로티노이드 함량은 β-카로틴의 표준 곡선을 기준으로 측정하였다. LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인은 주로 루테인 및 α-카로틴과 같은 적은 양의 카로틴과 함께 라이코펜을 축적하고 있었다. 그러나 야생형(WT) 라인은 주로 다른 카로틴과 함께 β-카로틴을 축적하였다(표 4). LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인의 카로티노이드의 총량은 야생형 캘러스의 약 15배였다.
실시예 4. 염분 스트레스 조건에서의 활성산소종(ROS) 축적의 감소
총 카로티노이드 고축적을 고려할 때, LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인의 염에 의해 유도된 산화 스트레스에 대한 내성을 조사하였다. 캘러스에서 염에 의한 산화 스트레스는 DAB 염색에 의해 가시화되었으며, H2O2에 의해 산화되면 진한 갈색으로 변한다. LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인은 감귤색을 유지하였으며, 야생형(WT) 캘러스는 진한 갈색(도 4A)을 나타내었다. 이러한 결과는 LcyEsg2-HDR1 및 LcyEsg2-HDR2 라인에서 염 스트레스에 반응하여 활성산소종과 DAB 반응물이 감소했음을 보여준다(도 4B).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 LcyE (lycopene ε-cyclase) 단백질의 523번째 히스티딘을 루신으로 치환시키기 위한 HDR (homology-directed repair) 기반의 유전체 교정용 재조합 벡터로서,
    상기 유전체 교정용 재조합 벡터는 Ti 플라스미드의 LB (left border) 및 RB (right border) 서열 사이에 BeYDV (Bean Yellow Dwarf virus) 기반 레플리콘(replicon)을 포함하며,
    상기 레플리콘은 NOS 터미네이터; 바스타 저항성 유전자; NOS 프로모터; LIR (long intergenic region); CaMV 35S 프로모터; Cas9 (CRISPR associated protein 9) 코딩 서열; OsU3 프로모터-sgRNA 서열; HDR 공여체 서열(HDR donor); SIR (short intergenic region); Rep/RepA 단백질 코딩서열; 및 LIR;이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 sgRNA 서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 HDR 공여체 서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 재조합 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전체 교정용 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환하는 단계;를 포함하는, 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조 방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체.
  6. 제5항에 따른 야생형에 비해 총 카로티노이드 함량이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 종자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전체 교정용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 카로티노이드 함량 증진을 위한 유전체 교정용 조성물.
KR1020220157202A 2022-11-22 벼에서 CRISPR/Cas9 및 제미니바이러스 레플리콘 시스템을 이용한 Golden SNP를 포함하는 라이코펜 엡실론-시클라제 유전자의 게놈 편집 방법 KR20240086717A (ko)

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