KR20240085399A

KR20240085399A - Dna 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용한 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱 분석방법

Info

Publication number: KR20240085399A
Application number: KR1020220170207A
Authority: KR
Inventors: 박지환; 안현수; 최신영
Original assignee: 광주과학기술원
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2024-06-17

Abstract

본 발명은 단일세포 다중체 전장 시퀀싱 분석 기술에 관한 것이다. 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱의 낮은 퀄리티 및 세포 이질성 연구의 한계점을 극복하기 위한 개발 연구로서, 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립방법을 이용하여, 전장 시퀀싱의 효율 및 에러율을 크게 개선하고, 단일세포 다중체의 전장 시퀀싱을 완성함으로써, 유전자 동형 발현양 분석, 돌연변이 검출 또는 암세포 특이적 다중체 분석등에 크게 이용될 수 있다.

Description

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용한 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱 분석방법{Single-cell omics full-length sequencing analysis method using multi-DNA fragment binding assembly reaction}

본 발명은 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용한 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱 분석방법에 관한 것이다.

게놈을 정확하고 신속하게 서열 분석하는 능력은 혁신적인 생물학 및 의료학을 가능하게 하였다. 복잡한 게놈의 연구, 및 특히 인간에서 질환의 유전학적 근거에 대한 연구는 대규모의 유전학적 분석을 포함한다. 전체 게놈 수준에 대한 상기 유전학적 분석은 금전상으로 고가일 뿐만 아니라 시간 및 노동 소모적이다. 이들 비용은 별도의 개별 DNA 샘플의 분석을 포함하는 프로토콜과 함께 증가한다. 질환 발병과 연계된 게놈에서 다형성 영역의 서열 분석은 암 및 치료제 개발과 같은 질환의 이해에 크게 기여하고 약물 반응에서 변동성과 관련된 유전자 및 기능적 다형성을 동정하기 위한 약리게놈학적 과제에 충족하도록 이끌어 준다.

인간 게놈 프로젝트의 종료 후, 10년동안 차세대 염기서열 해독법(Next Generation Sequencing, 이하 NGS) 기술의 비약적인 발전이 있었다. 일루미나 (Illumina) 혹은 이온토렌트(IonTorrent)와 같은 2세대 NGS 기술은 매우 강력하지만, 100 내지 500bp 길이의 짧은 길이(short read)만 시퀀싱이 가능하여 분석되는 분자의 길이가 제한되었다. 따라서 2세대 기술은 반복서열, 복제수변이(CNV)와 같이 유전체의 복잡한 구조를 이해하는 대는 한계가 존재한다. 이를 개선하기 위하여 3세대 긴 길이 시퀀싱 기법이 개발이 되었다. 그러나, 3세대 단일분자 긴 길이 시퀀싱 라이브러리 제작에 한계가 있으며, 특히 긴 길이 시퀀싱을 위해 높은 가격 문제와, 세포 이질성 연구 해상도에 한계가 나타났다. 이에 따라, 보다 효율적이고 개선된 시퀀싱의 필요성이 대두되고 있다.

따라서, 본 발명은 단일세포의 전사체를 포함한 다중체 전장 시퀀싱의 낮은 퀄리티 및 고비용, 세포 이질성 연구의 한계점을 극복하기 위한 개발 연구로서, 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립방법을 이용하여, 전체 길이 시퀀싱의 효율 및 에러율을 크게 개선하고, 단일세포 다중체의 전장 시퀀싱을 가능하게 하였다. 이를 이용하여 유전자 동형의 발현량 분석, 돌연변이 검출 또는 암세포 특이적 다중체 분석등에 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명자들은 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱의 낮은 퀄리티 및 세포 이질성 연구의 한계점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립방법을 이용하여, 전체 길이 시퀀싱의 효율 및 에러율을 크게 개선하고, 단일세포 다중체의 전장 시퀀싱을 완성함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 단일세포의 다중체 전장 서열 분석 방법으로서,

(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리(Library)를 제작하는 단계;

(b) 상기 라이브러리에 DNA 단편의 멀티 결합 조립 어댑터를 부착하는 단계;

(c) DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용하여 라이브러리 내 DNA분자를 선별적으로 원형화 하는 단계;

(d) 핵산 외부 가수분해 효소(exonuclease)를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계; 및

(e) 라이브러리 내 원형 DNA를 선형화(Linearization) 시키고 증폭시키는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법을 제공하는 데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 서열 분석 방법으로서,

(e) 라이브러리 내 원형 DNA를 선형화(Linearization) 시키고 증폭시키는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법을 제공한다.

본 발명자들은 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱의 낮은 퀄리티 및 세포 이질성 연구의 한계점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, DNA 단편의 멀티 결합조립 반응을 이용하여, 전장 시퀀싱의 효율 및 에러율을 크게 개선하고, 단일세포 다중체의 전장 시퀀싱을 가능하게 하며, 특히, 원하는 타겟 DNA 분자만을 선별하여 시퀀싱하는 것을 완성하였다.

본 발명에 따르면, 오로보로스(Ouroboros)는 머리가 꼬리를 문 형상을 띈고대의 상징을 의미하며, 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립방법을 활용한 다양한 DNA 분자 타겟을 제거하거나 선별하는 기술을 상징한다. 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립 반응을 활용하여 세포 바코드를 가진 DNA 선별 방법으로 타겟 선별하는 기술을 이용할 수 있다. 선별 기술을 이용하여 암유전자 변이 검출을 위한 타겟 선별, 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA, 그리고 특정 세포군을 선별할 수 있다. 또한, 타겟을 제거(depletion)하는 기술을 이용하여 리보솜 및 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA를 제거할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료”는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “전사체(transcriptome)”는 발현된 모든 RNA의 총합을 의미한다. 이와 관련된 용어로, 유전체(genome), 후성유전체(epigenome), 공간전사체(spatial transcriptome) 단백체(proteome), 상호작용체(connectome), 그리고 이들을 모두 포함하는 다중체(multiome) 등이 있다.

본 명세서에서 용어 “라이브러리(Library)”는 특정 생물체내에 존재하는 모든 단일 유전자를 포함할 만큼 충분한 수의 DNA 분자의 집합체를 의미한다.

본 발명에 따르면, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응은멀티 DNA 단편 결합 조립 어셈블리라고도 하며, 단일 등온 반응에서 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 분자 조립 방법을 의미한다. 구체적으로는 깁슨 조립 반응(Gibson assembly reaction)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “핵산 외부 가수분해 효소(exonuclease)”는 폴리뉴클레오타이드의 말단으로부터 한 번에 하나씩 뉴클레오타이드를 절단함으로써 작용하는 효소를 의미한다. 3' 말단 또는 5' 말단에서 인산다이에스터 결합을 파괴하는 가수분해 반응이 발생한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 다중체는 전사체, 유전체, 공간전사체, 후성유전체, 또는 단백질체인 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단일세포는 10X Genomics사의 기술, Drop-Seq 기술, SPLiT-Seq 기술, Sci-Seq 기술, Microwell-Seq의 기술, SMART-Seq 기술, Fluidigm사의 C1 단일세포 기술, BGI사의 DNBelab C4 단일세포 기술, CITE-Seq 기술, CEL-Seq 기술, scifi-RNA-Seq 기술, Sci-Seq 기술, Visium 기술, Slide-Seq 기술, Seq-Scope 기술, 및 Stereo-Seq 기술로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 사용하여에 기반하여 단일세포 전사체 및 유전체 라이브러리로 제작되는 것인, 방법이다.

본 명세서에서 용어 “10x Genomics사의 단일세포 시퀀싱”은 단일 세포 RNA 시퀀싱(RNA-sequencing) 기술을 의미한다. 단일 세포를 캡처하고 바코드가 있는 차세대 시퀀싱(NGS) cDNA 라이브러리를 준비하기 위해 미세 유체 분할을 사용하여 세포별로 전사체를 분석할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전사체 라이브러리는 RNA 서열의 3' 말단에 Read1(R1) 프라이머 및 세포 바코드가 연결되고, 5' 말단에 템플릿 스위칭 올리고(Template-switching-oligo; TSO) 프라이머가 연결되는 것인, 방법이다.

본 발명에 따르면, 템플릿 스위칭 올리고(Template-switching-oligo; TSO)는 역전사 동안 역전사효소에 의해 추가된 주형되지 않은 C 뉴클레오티드에 혼성화하는 올리고를 의미한다. TSO는 다운스트림 cDNA 증폭에 사용되는 전장 cDNA에 공통 5' 서열을 추가한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 다중체 라이브러리는 3' 말단에 정방향 어댑터(forward adaptor sequence)가 연결되고, 5' 말단에 역방향 어댑터(reverse adaptor sequence)가 연결되는 것인, 방법이다.

본 발명의 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 정방향 어댑터와 역방향 어댑터가 조립 어댑터로 원형 DNA를 형성하는 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 선형화 시키는 단계의 DNA는 단일세포의 전장 다중체 라이브러리인 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 선형화 시키는 단계는 CRISPR/Cas 핵산분해효소, 제한효소(Restriction Enzyme)또는 탈렌 핵산가수분해효소(TALEN; Transcription Activator-Like Effector Nucleases)를 사용하여 선형화 시키는 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12, CRISPR/Cas13, 및 CRISPR/Cas14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법이다.

본 명세서에서 용어 “CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas”는 미생물의 적응면역 현상에서 기인한 유전자 편집 기술을 의미한다. 타겟(target) DNA를 정밀하게 잘라낸 다음 자연적으로 DNA가 복구되도록 함으로써 보다 간단하고 효율적으로 유전자 조작을 가능하게 한다. 이 시스템은 가이드 RNA(guide RNA; gRNA)와 Cas nuclease로 구성되며, RNA 유전자 가위(RNA-guided engineered nucleases, RGENs) 기술이라고도 한다. gRNA는 target 서열에 상보적으로 결합하는 crRNA와 Cas-binding을 위한 tracrRNA로 구성되고, gRNA는 Cas를 target 부분으로 안내하는 역할을 하며, target DNA 서열과 상보적으로 결합한다. Target DNA 서열 3’ 말단에는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열이 있어야 한다. gRNA가 Cas nuclease와 복합체를 형성하고 target 서열에 특이적으로 결합하면, Cas nuclease는 PAM 서열을 인식하고 PAM의 3 bp upstream 부분에 이중 가닥 손상(Double Strand Break, DSB)을 일으키게 된다.

본 발명에 따르면, 상기 Cas는 Cas9, Cas12, Cas13, 및 Cas14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, CRISPR/Cas 복합체이다. 구체적으로는 Cas9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “Cas9(CRISPR associated protein 9)”은 DNA 바이러스 및 플라스미드에 대한 특정 박테리아의 면역 방어에 중요한 역할을 하는 160 킬로 달톤 단백질을 의미한다. 유전 공학 응용 분야에서 많이 활용되며, 주요 기능은 DNA를 절단하여 세포의 게놈을 변경하는 것이다.

본 명세서에서 용어 “Cas12”는 일부 박테리아에서 CRISPR 시스템의 일부를 형성하는 RNA 유도 엔도뉴클레아제를 의미한다. Cas12는 프로토스페이서의 인식에 따른 표적 유전자 절단 외에도 표적이 아닌 주변의 단일가닥 DNA(single stranded, ssDNA)의 부수적 절단을 유발한다. Cas12는 부수적인 절단 기능을 이용하여 다양한 휴대용 진단 기술의 개발에 활용된다. Cas12a crRNA복합체는 부수적으로 단일 가닥 DNA를 분해하는데, 표적 이중 가닥 DNA에 결합을 하면 1초에 대략 1250회의 부수적 절단을 일으키기 때문에, 핵산 검출 및 신호 증폭을 동시에 할 수 있는 효소로서 Cas12a를 주목하고 있다. Cas12는 5’-(T)TTN-3’의 PAM 서열을 가지는 이중가닥구조의 서열을 특이적으로 인식하는데, 일반적으로 사용되는 Cas12는 Cas12a와 Cas12b이다. 표적이 단일가닥 DNA인 경우에는 PAM의 서열이 100% 일치하지 않고, 변화가 있더라도 효소적 절단을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 “Cas13”은 RNA로 유도된 RNA 엔도뉴클레아제를 의미하며, DNA는 절단하지 않고 단일 가닥 RNA만 절단한다. Cas13 그룹은 표적 유전자를 인식할 수 있는 28-30 bp의 스페이서로 이루어진 gRNA와 리보핵단백질을 형성한다. Cas13 단백질은 DNA 분해 효소가 아닌 RNA 분해 효소로 작용을 하며, Cas13은 DNA를 부수적으로 절단하는 Cas12와는 달리 RNA를 부수적으로 절단한다. Cas13 그룹 중에는 이전에는 C2C2로 알려졌던 Cas13a가 가장 먼저 핵산 검출에 활용되었다. Cas13a는 crRNA에 맞는 프로토스페이서를 가진 단일 가닥 RNA 표적을 분해시킨다. 단일 가닥 RNA에 한 번 결합을 하면, Cas13a 단백질은 비특이적 RNA 분해효소로 작용을 하여 주변에 있는 RNA가 표적 RNA가 아니더라도 분해를 시킨다. 한 번의 표적 인식으로 최소 104회의 부수적 절단을 일으키는 것으로 보고되어 있다. 표적 유전자에 대한 절단과 비특이적인 주변 RNA 서열의 절단 2가지 방식의 효소적 절단을 하는 것이다. Cas13는 상보적인 프로토스페이서를 절단하는 것이 아니고, 그 주변을 절단하기 때문에, 프로토스페이서 가 온전히 유지되기 때문에 결합을 절단을 여러 차례 할 수도 있어 증폭효과를 나타내므로 민감한 검출에 활용될 수 있다. Cas13 단백질은 PAM 서열을 필요로 하지 않으나 protospacer flaking site(PFS)라고 해서 염기 구아닌이 프로토스페이서 옆에 있어야한다. 생명공학 및 진단 부문에서 가장 널리 사용되는 Cas13 단백질은 Cas13a와 Cas13b인데, Cas13b는 세포 유전자 조작에 더욱 안정적인 것으로 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 라이브러리에서 선택적 DNA 분자 제거 후 서열 분석을 위한 방법으로서,

(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리를 제작하는 단계;

(d) 제거하고자 하는 타겟 서열들을 포함하는 원형 DNA를 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 선택적으로 선형화 하는 단계;

(e) 핵산 외부 가수분해 효소를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계;

(f) 선형 DNA를 제거하는 단계; 및

(g) 라이브러리 내 원형 DNA를 선형화(Linearization) 시키고 증폭하는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “CRISPR/Cas9”은 1세대 ZFN (Zinc Finger Nuclease), 2세대 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)보다 경제적이고 효율적인 강력한 3세대 유전자 편집 도구(Genome Editing Tool)를 의미한다. CRISPR-Cas9 시스템은 target DNA를 정확하게 인식하고 결합하는 guide RNA와 target DNA를 절단하는 Cas9 nuclease로 구성되어 DNA 이중 가닥을 손상시키고 이것을 복구하는 과정을 통해 유전자를 조작할 수 있다.

본 발명에 따르면 DNA 분자의 쪼개짐은 DNA의 당 인산 골격을 구성하는 뉴클레오티드 사이의 공유 당-인산 결합(covalent sugar-phosphate linkages) 중 하나를 절단하는 반응을 의미한다. 이 반응은 효소, 화학적 또는 방사선에 의해 촉매가 된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 원형 DNA에만 적용되는 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 선형 DNA를 제거하는 단계의 선형 DNA는 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 인식되는 선택된 DNA 분자인 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (g) 단계의 DNA는 단일세포의 전장 다중체 라이브러리인 것인, 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 라이브러리에서 선택된 DNA 분자를 선별 후 서열 분석을 위한 방법으로서,

(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리를 제작하는 단계;

(d) 핵산 외부 가수분해 효소를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계;

(e) 선별하고자 하는 타겟 서열들을 포함하는 원형 DNA를 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 선택적으로 선형화 하는 단계;

(f) 원형 DNA를 제거하는 단계; 및

(g) 라이브러리 내 선형 DNA를 증폭하는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (g) 단계의 선형 DNA는 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 인식되는 선택된 DNA 분자인 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (g) 단계는 Y-어댑터(Y-adaptor) 또는 헤어핀 어댑터(hairpin adaptor) 결합(ligation)이 일어나는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법이다.

본 발명에 따르면, Y-어댑터 결합(Y-adaptor ligation)은 알려진 염기서열을 가진 합성 올리고뉴클레오티드를 DNA 단편의 양쪽 끝 또는 양쪽 끝에 부착하는 방법을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (g) 단계의 DNA는 단일세포의 전장 cDNA 전사체, 유전체, 단백체, 공간전사체, 또는 후성유전체 라이브러리인 것인, 방법이다.

본 발명에 따르면, 단일세포 시퀀싱 분석기술(Single-cell sequencing)은 하나의 세포의 단백체, 전사체, 유전체, 공간전사체, 또는 후성 유전체를 분석할 수 있다. 한 조직 내 존재하는 다양한 세포들을 동시에 분석을 진행할 수 있으며, 개별 세포의 종류, 계보, 질환, 및 변이 등에 대한 정확한 정보를 제공할 수 있다. 단일세포 시퀀싱 분석기술은 암 종양 이질성연구, 면역학, 또는 발생학 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 구체적으로는 면역학 연구에 있어서 면역체계에 대한 종합적인 분석이 가능하며, 면역세포 집단을 특성화(clonal analysis)할 수 있으며, 면역세포 발생 경로를 재구성할 수 있다. 또한, 암 종양 이질성 연구(Intratumor Heterogeneity)를 통해서 암 줄기세포(cancer stem cell) 또는 혈중암세포(circulating tumor cell; CTC)에 대해 분석을 진행할 수 있다.

본 발명에 따르면, 단일세포 분석은 다양한 세포를 동시에 분석하는 방식과 달리 단일세포 수준에서 유전체학, 전사체학, 공간전사체학, 후성유전체학, 또는 단백체학 등을 분석하는 기술을 의미한다. 단일 세포는 세포군에서 분리해낸 1개의 세포를 말하며, 동일한 세포에서 유래한 세포들 사이에서도 세포 이질성이 존재함으로 정확한 분석을 위해 단일 세포 차원에서의 연구가 중요하다. 특히, 줄기 세포 연구 또는 암과 같이 본질적으로 이질적인 세포집단의 분석이 필요한 질병을 다룰 때, 세포의 평균 수준이 아니라 단일 세포 수준에서 분자 마커를 조사해야 한다는 사실이 점점 더 강조되는 중이며, 단일세포 분석기술의 발전으로 모든 인간 세포의 체계적인 Reference Map 구축 가능성이 있다. 단일세포 분석기술을 활용하여 다양한 질병 조직을 분석하는 프로젝트가 여러 국가에서 진행되고 있으며 진단, 건강관리 및 신약개발 등도 활발하게 진행되고 있다. 단일세포 분석이 아닌 기존 분석법(bulk analysis)은 지금까지 특정한 오믹스 영역에 관련된 정보들을 손쉽게 축적하는 데 큰 도움을 주었으나 개별 오믹스들의 평균값만을 보여 주어 질병과 직접적인 상관관계가 있는 신호를 정확히 식별하기 어려운 한계가 있었다. 그러나 단일세포의 다중오믹스를 분석하면 개별 오믹스 만을 대상으로 했을 경우보다 각 세포에 대한 더 완전한 정보를 도출할 수 있으며, 이것을 통해 세포의 기능을 담당하는 복잡한 상호작용 네트워크를 더 정확히 밝혀내는 것이 가능하며, 하나의 세포에서 파생된 세포들이라 해도 다양한 유형의 세포들을 생성하며 조직은 이러한 세포 집단으로 구성되어 있어 단일세포 다중오믹스 분석을 통해 개별 세포의 특이성을 확인하고 동정해야만 정확한 질병 진단이나 치료가 가능하다. 또한, 단일세포 다중오믹스 분석은 특정 세포에 대한 다층 수준의 오믹스 정보를 통합하고 분석하여 유의미한 정보를 빠르게 도출할 수 있는 특징을 갖는다.

본 발명에 따르면, 다중 오믹스(multi-omics)분석은 세포 내 다양한 생체분자(biomolecule)들의 총체적 변화를 측정하고 이를 통합 분석하는 최신 연구 기법으로써, 특히 유전자 기능을 해석하고, 질병의 기전을 파악하는 등, 기초 생명과학 및 임상연구에 매우 높은 활용도를 보이고 있다. 최근 next-generation sequencing (NGS)기법이 도입됨에 따라, 저비용으로 대용량 다중 오믹스 데이터 생성이 가능하게 되었으며, 그로 인해 다중 오믹스 빅데이터들이 널리 보급되고 있다.

본 발명에 따르면, 다중 오믹스는 생체 내 정보 전달 및 조절과 관련된 유전체(genomics), 후성유전체(epigenomics), 전사체(transcriptomics), 공간전사체(spatial transcriptome), 또는 단백질체(proteomics)등을 포함하여, 이에 대한 세포 내 대사 산물인 대사체(metabolomics), 지질체(lipidomics)등을 포함한다.

본 발명에 따르면, 유전체(genomics) 연구는 next-generation sequencing (NGS) 기법을 활용하여 각 개인의 유전적 조성을 연구하는 오믹스 분야를 의미한다. 전체 유전자를 측정하는 whole-genome sequencing (WGS)과 단백질 코딩 지역만을 확인하는 whole-exome sequencing (WES), 그리고 single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping 연구를 포함한다. 상기 기술로 생성된 유전체 정보를 genome-wide association study(GWAS) 연구를 통해 질병의 원인 유전자 (causal variant)를 찾아내며, 이를 바탕으로 질병의 유전적 위험도를 예측하고, 약물 반응 예측에 활용하는 유전체 의학(genomic medicine)에 대한 연구가 활발하며, 그 외 집단유전학, 진화생물학, 합성생물학 등의 다양한 생명과학 분야에 활용되고 있다.

본 발명에 따르면, 후성유전체(epigenomics) 연구는 유전체의 epigenetic modification을 연구하는 분야로써, 후천적인 영향으로 나타나는 표현형 특징들을 해석하는 연구 분야를 의미한다. 주로 DNA methylation과 histone modification의 변화와 유전적 조절에 대한 연관성을 연구하며, 이를 바탕으로 유전자 조성으로는 해석할 수 없는 표현형의 다양성(phenotypic plasticity)을 해석할 수 있다. DNA methylation을 측정하는 bisulfite sequencing, histone modification marking 지역을 확인하는 chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing, open/closed chromatin 지역을 분석하는 DNase/ATAC-seq 등의 실험 기법을 활용한다. 최근 m6A와 같이 전사체의 modification을 연구하는 후성전사체 (epitranscriptomics)연구 역시 활발하게 진행되고 있으며, 이를 바탕으로 세포 분화, 발달과정, 종양형성 등 다양한 생명현상의 원인을 규명하고 있다.

본 발명에 따르면, 전사체(transcriptomics) 연구는 유전자 발현(gene expression)을 총체적으로 연구하는 오믹스 분야로 단백질 코딩에 관여하는 coding 유전자뿐만 아니라 microRNA와 같이 코딩에 관여하지 않는 non-coding RNA들을 모두 포괄하는 연구를 의미한다. microarray기술이 도입되면서 2000년도 초반에 큰 주목을 받았으며, 2010년 이후로 NGS기술이 도입되면서 RNA-sequencing으로 대체되고 있다. 최근에는 단일세포 전사체(single-cell transcriptomics) 기술이 도입됨에 따라 조직 내 각 세포 유형별 유전자 발현 분석이 가능케 되어, 질병 기전 연구 등에 활발하게 활용되고 있다. 전사체 연구는 생명과학 분야에서 가장 광범위하게 활용되고 있으며, 특히, 세포 분화, 줄기세포, 종양형성, 유전자 조절, 또는 바이오마커 발굴 등에 활용가능하며, expression-profiling 뿐만 아니라 alternative splicing 분석, RNA editing분석 등에도 활용되고 있다.

본 발명에 따르면, 공간전사체(spatial transcriptome) 연구는 조직 절편 공간상에서 각 세포의 위치 정보와 유전자 발현 패턴을 동시에 관측할 수 있는 기술로써, 실제 조직 내 공간상에서 세포의 분포와 세포간 상호작용을 연구할 수 있는 분야를 의미한다. 수 십 개의 세포에서부터 각 세포 내 구획까지 구분할 수 있는 고해상도의 기술이 개발되면서 특히 암조직 내 미세환경를 이해하기 위한 연구에 활용되고 있다.

본 발명에 따르면, 단백질체(proteomics) 연구는 생명체를 구성하는 단백질 발현 또는 변형을 분석하는 오믹스 연구 분야로써, 인체의 생리적 작용을 직접적으로 매개하는 단백질들을 총체적으로 연구할 수 있는 분야를 의미한다. human genome project 이후 크게 관심을 받고 있는 functional genomics연구의 핵심 축으로써, 유전체, 전사체 분석으로 확인 불가능한 post-translational modification 조절, 또는 protein isoform들을 분석할 수 있으며, 임상현장에서 사용되는 다양한 바이오마커 발굴이 가능하다. 단백질체학은 단백질 고유의 복잡성으로 인해서, 다양한 분석 기술이 필요로 하며, 항체 기반 affinity proteomics, mass spectrometry 기반 shotgun proteomics 등의 기술이 널리 활용되고 있다.

본 발명에 따르면, 비드 기반 단일세포 전사체 분석기술은 단일세포 시퀀싱 기술에서 가장 많이 사용되는 기술이다. 액적(droplet)기반 기술로서, 바코드를 포함하는 비드가 기술의 핵심이다. 비드 기반 단일세포 전사체 분석 기술의 원리는 첫째, 하나의 세포와 하나의 비드를 페어링하고 둘째, 하나의 세포로부터 추출된 DNA 또는 RNA에 비드에서 유래한 식별가능한 바코드를 붙이며 셋째, 증폭 후 시퀀싱으로 바코드를 파악해 개별 세포의 특징을 분석하는 원리를 이용한다. 단일세포 전사체 분석 기술의 사용 예를 보면, 인간 세포 지도(Tabula Sapiens)가 있으며, 24개 조직과 장기에서 약 백만 개 세포의 전사체를 분석하였다.

본 발명에 따르면, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응은 기존 기술과의 차별성을 가진다. 기존 circular DNA ligation과정을 사용하는 것은 동일하나, 깁슨 조립 반응(Gibson assembly reaction)을 사용하는 본 발명과 달리 Uracil-containing primer를 사용한 hemi-nested gene-specific PCR, USERII enzyme, 및 T4 DNA-ligase를 사용한 복잡한 circularization과정을 사용하는 것을 나타내고 있다. 본 발명에서는 기존 circular DNA의 PCR 반응의 효율이 떨어지는 점을 고려하여 circular DNA의 PCR과정 이전에 CRISPR/Cas9 endonuclease를 사용하여 circular DNA를 선형화 하는 과정을 거치도록 설계되어 있는 특징을 가진다. 반면, 기존 방법에서는 별다른 선형화 과정을 거치지 않고 PCR반응을 진행하고 있다. 구체적으로는 Single-cell RNA-sequencing library에서 cell-barcode containing molecules들을 선별하는 기존의 기술은 biotin 이 추가된 R1 프라이머를 사용하여, 세포 바코드를 가진 분자들을 biotin분자로 표지한 뒤, biotin과 결합하는 streptavidin beads를 사용하여 낚시하듯 세포 바코드를 가진 분자들을 선별한다. 기존의 기술의 biotin을 사용하여 선별하는 기술은 전반적으로 분자의 크기에 큰 영향을 받으며, DNA의 분자의 길이가 1 내지 2 kbp를 넘어가게 되면 (인간 mRNA길이는 평균적으로 2.2kbp임) 선별 효율이 급격히 떨어지게 되는 단점이 있으며, 양쪽에 세포 바코드가 달린 분자들('머리' 만 두 개 인 분자들)도 같이 선별이 되는 문제점 또한 가지고 있으며, 오히려 이러한 분자들이 분자 길이도 짧은 편이고 biotin 분자도 두 개를 가지고 있으므로 선별이 더 잘 되어서 문제를 일으킬 수 있다. 본 발명에서 사용하는 DNA 단편의 멀티 결합을 이용하는 세포 바코드를 가진 분자 선별 방법은 DNA 분자 길이에 따른 제한이 매우 적은 편이며 세포 바코드가 한 쪽 끝에만 달린 분자들만 효과적으로 선별해 낼 수 있다는 장점이 있다.

또한, Single-cell RNA-sequencing library에서 cell-barcode containing molecules들을 선별하는 기존의 기술은 비대칭 PCR 반응(asymmetric PCR)을 사용하여 세포 바코드를 가진 분자들의 수를 선형적으로 증폭시킴으로써 세포 바코드를 가진 분자들을 선별하는 기술로서, 세포 바코드가 한 쪽 끝에만 달린 분자들은 선형적으로 증폭되지만, 양쪽에 세포 바코드를 가진 기형적인 분자들은 기하 급수적으로 증폭되어 기형적인 분자들의 수가 지나치게 많아지는 문제가 발생하기 쉬운 단점이 있다. 반면, 본 발명에서 사용하는 DNA 단편의 멀티 결합을 이용하는 세포 바코드를 가진 분자 선별 방법은 세포 바코드가 한 쪽 끝에만 달린 분자들만 선별해 내며, 양쪽에 세포 바코드가 달려있거나 양쪽에 둘 다에 세포 바코드가 달리지 않은 기형적인 분자들을 효과적으로 제거할 수 있는 특징을 지닌다.

본 발명에 따르면, 선택적 DNA분자 제거가 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응은 기존 기술과의 차별성을 가진다. 구체적으로 single-cell RNA-seq library에 CRISPR/Cas9시스템을 사용해 negative enrichment를 진행한 기존 기술은 단일 세포 전사체 라이브러리에서 원치 않는 DNA(리보솜 RNA 유래 cDNA)를 제거하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하였고, 58개의 sgRNA를 사용하였으며, 58개의 타겟 서열 중 하나라도 포함한 선형의 DNA분자들은 CRISPR/Cas9시스템에 의해 인식되어 두 동강이 나게 된다. 조각이 난 선형의 DNA분자들에는 PCR증폭에 필요한 프라이머가 제대로 붙을 수 가 없어 이후 PCR과정에서 두 동강이 난 분자들은 증폭되지 않는 원리이다. 반면, 본 발명의 선택적 DNA분자 제거가 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기술은 CRISPR/Cas9 시스템을 선형의 DNA가 아닌 원형의 DNA에 적용하며, 원형의 DNA가 CRISPR/Cas9시스템에 의해 인식되어 분해되면 선형의 DNA로 바뀌게 되고, 선형의 DNA는 이후 exonuclease처리에 의해 완전히 라이브러리에서 제거되게 된다. 또한, 기존 기술의 경우 원치 않는 분자들의 잔해(두 동강이 난 선형 DNA분자들)가 PCR과정에 남아있게 되어 PCR과정에서 원치 않는 간섭을 일으킬 가능성이 있지만, 본 발명의 선택적 DNA분자 제거가 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기술을 사용하면 원치 않는 분자들이 exonuclease로 완전히 제거된 상태에서 PCR과정이 진행되므로, 비교적 안전하고 정확하게 라이브러리를 증폭할 수 있다는 기술적 가장 큰 차이점이 존재한다.

본 발명에 따르면, 선택적 cDNA 타겟 선별이 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응은 기존 기술과의 차별성을 가진다. 구체적으로 10X Genomics 사에서 제공하는 Targeted Gene Expression Panel을 사용한 선별 기술은 혼성화 캡쳐(hybridization capture)라는 방법이다. Single-cell RNA-Seq library를 단일 가닥으로 분리한 뒤, 비오틴이 달려있는 단일 가닥 RNA/DNA프로브와 혼성화를 하여 타겟 DNA 분자들에 비오틴을 붙이게 되고, 이후 비오틴과 결합하는 streptavidin beads를 사용해서 타겟 DNA 분자들만 선별하는 기술이다. 기존 혼성화 캡쳐(hybridization capture)타겟 선별 전략은 타겟 DNA분자와 RNA/DNA 프로브(probe)를 결합하는 원리에 기반하고 있으며 다양한 타겟 DNA분자들이 모두 단일 가닥으로 분리되어 RNA/DNA 프로브와 결합할 수 있도록 하기 위해서는 복잡한 실험 조건이 필요하며 최적화에 많은 노력이 필요하다. 단일 가닥으로 분리된 타겟 DNA가 가질 수 있는 다양한 2차 구조가 RNA/DNA프로브와 결합하는 것을 방해할 수 있기 때문이다. 또한, 수천 내지 수만개의 RNA/DNA 프로브 스스로, 또는 서로 만나서 형성할 수 있는 이차 구조를 예측하고 방지하기 위해 복잡한 캡쳐 프로브 디자인 알고리즘이 필요하다. 선별되는 분자의 길이가 길수록 선별과정의 효율성이 줄어들어 전장(full-length) cDNA의 선별은 어렵다는 한계도 가지고 있다. 반면 본 발명의 선택적 DNA 타겟 선별이 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기술을 사용하는 타겟 선별 전략은 타겟 DNA 분자의 타겟 서열을 높은 정확도로 인식하는 CRISPR/Cas9시스템에 기반하고 있다. 수천 내지 수만개의 타겟 DNA 서열이 있다고 하더라도, 타겟 DNA서열을 인식하는 sgRNA는 CRISPR/Cas9 단백질과 단단히 결합하여 RNP(ribonucleoprotein)를 이루어 각 sgRNA 분자들이 물리적으로 분리되기 때문에 수천 내지 수만개의 sgRNA가 서로의 간섭 없이 각자 자신의 타겟 DNA서열을 찾을 수 있다. 혼성화 캡쳐 기술의 경우처럼 single-cell RNA-Seq 라이브러리를 복잡한 실험 조건을 사용하여 단일 가닥의 형태로 만들 필요 없이, 이중 가닥(dsDNA)상태에서 선별이 이루어져서 선별 과정이 훨씬 간단하다는 것도 큰 장점이다.

또한, CRISPR/Cas9 시스템을 사용해 긴 길이 분자를 선별하는 선행 기술은 CRISPR/Cas9 시스템에 인식되어 의해 절단된 DNA분자가 5'-Phosphate으로 표시되는 원리를 사용해 타겟을 선별하는 방식으로 먼저, 선형 DNA의 말단에 있는 5'-Phosphate를 모두 제거하게 된다. 이후, CRISPR/Cas9 시스템을 사용해서 타겟 DNA 지역을 둘러싼 지역을 절단하게 되고, 절단된 타겟 DNA 지역을 포함한 분자는 5'-Phosphate로 표시되게 된다. DNA ligation 반응을 위해서는 5'-Phosphate가 필요하며, 이러한 점을 사용하면 CRISPR/Cas9로 절단된 DNA분자들에만 시퀀싱에 필요한 adaptor를 붙여줄 수 있게 된다. 이후 CRISPR/Cas9로 절단된 DNA분자들만 긴 길이 시퀀싱 기술을 통해 분석되게 된다. 이 기존 기술은 DNA 샘플을 다루는 과정에서 DNA가 불가피하게 물리적으로 절단되게 되고(mechanical shearing), 이 과정에서 DNA의 절단면이 5'-Phosphate로 표지 되게 된다. 이렇게 무작위적으로 5'-Phosphate로 표지된 DNA가 생겨나게 되기 때문에, 타겟 DNA의 선별의 효율성이 높지 않은 문제점이 있다. 반면, 본 발명의 선택적 DNA 타겟 선별이 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기술은 선별되지 않은 분자를 원형의 DNA 형태로 남기고, 선별된 타겟 DNA만 선형의 DNA 형태로 변환하여 증폭하기 때문에 5'-Phosphate를 제거하고, 표지하는 과정이 필요하지 않는다. 또한, 원형의 DNA를 정제할 때 exonuclease를 사용해 선형의 DNA를 분해하는데, 원래 제거하고자 했던 선형의 DNA에 어댑터가 실수로 붙어서 증폭되는 것을 방지하기 위해 기존 기술처럼 alkaline phosphatase를 사용해서 원하지 않는 5'-Phosphate를 제거하고, CRISPR/Cas9에 의해 절단된 타겟 DNA에만 adaptor를 붙이도록 개선할 수 있다.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용해 긴 길이 분자를 선별하는 선행 기술은 또한, CRISPR/Cas9 RNP(단백질 + RNA 복합체)가 타겟 DNA와 강하게 결합한다는 원리를 활용한 타겟 DNA선별 방법으로 CRISPR/Cas9 RNP가 결합한 DNA는 마치 뚜껑을 덮어놓은 것처럼 exonuclease에 의해 분해되지 않기 때문에, 타겟 DNA 지역의 양 끝 부분을 CRISPR/Cas9 시스템으로 절단하게 되고, exonuclease를 처리해 CRISPR/Cas9 RNP가 결합해서 보호되고 있는 타겟 DNA 분자들만 선별하는 과정이 필요하다. 반면, 본 발명의 선택적 DNA 타겟 선별이 가능한 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응기술은 선별되지 않은 분자를 원형의 DNA 형태로 남기고, 선별된 타겟 DNA만 선형의 DNA 형태로 변환하여 증폭하기 때문에 exonuclease를 사용해서 CRISPR/Cas9 RNP로 보호되고 있는 분자들을 선별할 필요가 없다. 이는 본 발명과 기존 선행기술은 CRISPR/Cas9를 공통으로 사용한다는 것 외에는 전혀 다른 기술임을 보여준다.

따라서, 본 발명을 통해 단일세포 다중체 전장 길이를 효율적으로 시퀀싱 분석함으로써 단순히 유전자 발현뿐만 아니라, 유전자 동형을 효과적으로 동정하여 발현 정도를 분석할 수 있고 유전자 내 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있다. 단일세포 수준에서 유전자 동형을 정확하게 구분함으로써, 지금까지 정확한 진단이 어려웠던 다양한 암 종류에 대한 새로운 바이오마커를 제시할 수 있다. 암 종류에 따라 다르게 발현되는 유전자 동형에 대한 예는 “Splice variants as cancer biomarkers, Clinical Biochemistry, 2004)에 잘 정리되어 있다. 또한, 현재는 표적 항암 치료제를 처방하기 위해서 우선 암 조직에서 많이 발현되거나 돌연변이가 있는 유전자를 검출하여, 이를 표적하는 치료제를 선정하고 있다. 그러나, 암 조직은 여러가지 돌연변이를 포함하는 다양한 암세포 클론들로 구성이 되어있으므로 기존의 전체 암 조직을 분석하여 표적 유전자를 찾는 접근으로는 서로 다른 돌연변이를 가진 소수의 암세포 클론들을 검출하기 어렵다. 따라서, 돌연변이에 대한 표적치료를 수행한다고 하더라도 다른 돌연변이를 가진 소수의 암세포가 계속해서 남아있어 암 재발을 일으키게 된다. 그러므로, 본 발명을 통해 암 조직을 단일세포 수준으로 분석하여 서로 다른 돌연변이를 가진 소수의 암세포 클론들을 검출 해냄으로써, 이에 대한 조합으로 표적 항암 치료제를 처방할 수 있을 것이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 단일세포 다중체 전장 시퀀싱 분석 기술을 제공한다.

(b) 본 발명은 단일세포의 다중체 전장 시퀀싱의 낮은 퀄리티 및 세포 이질성 연구의 한계점을 극복하기 위한 개발 연구로서, 여러 DNA 단편의 결합을 허용하는 조립방법을 이용하여, 전체 길이 시퀀싱의 효율 및 에러율을 크게 개선하고, 단일세포 다중체의 전장 시퀀싱을 완성함으로써, 유전자 발현양 분석, 유전자 동형 분석, 돌연변이 검출 또는 암세포 특이적 다중체 분석등에 크게 이용될 수 있으며, 나아가 유전자 동형 기반 질병 진단 및 돌연변이 기반 암 표적치료에도 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 복제 방법의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 복제 방법을 사용한 DNA 선별방법에 대한 작동원리를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 세포 바코드를 가진 DNA 분자 선별결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른, 마우스 심장 단일 세포에서 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 세포 바코드를 가진 DNA 분자 선별 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 선택적 DNA 분자 제거에 대한 작동원리를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 선택적 DNA 분자 제거 방법이 적용된 예를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 전장 cDNA 타겟 선별에 대한 작동원리를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 전장 cDNA 타겟 선별 방법을 적용한 예를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른, 급성 골수성 백혈병(AML)이 재발한 환자의 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플에서 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 전장 cDNA 타겟 선별 방법을 적용한 예를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따른, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 세포 바코드를 가진 DNA 분자 선별결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실험예에 따른, 전장 cDNA 타겟 선별방법의 적용한 예를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른, SPLiT-Seq 기술을 사용해 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실험예에 따른, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 기술을 적용하거나 또는 적용하지 않은 결과의 비교를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1]

1. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜

1 단계 - 단일 세포 cDNA 라이브러리 준비 및 정리

10X Genomics Single Cell 3' Expression Kit 또는 기타 단일 세포 RNA-seq 라이브러리 준비 방법이 가능하다.

2 단계 - 세포 바코드를 가진 DNA 분자의 선별

① 아래 표시된 프로그램을 사용하여 R1 및 TSO 서열을 포함하는 분자의 끝에 자가-원형화 조립 반응에 필요한 22bp의 멀티 결합 조립 어댑터를 추가하기 위해 R1일부와 추가 22bp, TSO일부와 추가 22bp를 포함하는 프라이머로 PCR을 수행한다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105℃	50 μl	20 min
Step	Temperature	Duration
1	98℃	00:03:00
2	98℃	00:00:15
3	63℃	00:00:20
4	72℃	00:03:00
5	Go to Step 2 four times (total 5 cycles of Step2-5)
6	72℃	00:01:00
7	4℃	Hold

② 다음 표와 프로그램에 따라 자가 결합 반응(Self-ligation reaction) 혼합물을 조립한다. 반응 설정 전에 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix를 얼음으로 옮기고, 튜브를 사용하기 전에 손가락으로 가볍게 치면서 혼합한다.

Component	Amount (Final Concentration)
2X NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	5 μl
DNA	10 ~ 100 ng (1 ~ 10ng/μl)
Nuclease-free Water	to 10 μl
Total Reaction Volume	10 μl

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	10 μl	60 min
Step	Temperature	Duration
1	50°C	01:00:00
2	4°C	Hold

③ 얼음 위에서 반응 혼합물에 Exonuclease III1㎕, Lambda Exonuclease 1㎕, Exonuclease I 1㎕를 추가하고, 다음 프로그램을 사용하여 선형 DNA 분자를 제거한다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	12 μl	30 min
Step	Temperature	Duration
1	37°C	00:20:00
2	70°C	00:10:00
3	4°C	Hold

④ 분해과정 이후 원형의 DNA를 정제하기 위해 14μl의 SPRI-Beads(SPRI-비드)를 추가하고, 용출 완충액 (elution buffer) 10μl로 정제된 원형 DNA를 용출한다. 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 Invitrogen Qubit 4 Fluorometer(큐빗) (1μl 사용)으로 분석한다.

⑤ 새로운 tube에 다음의 순서로 시약을 첨가하여 자가 결합부위를 타겟하는 Cas9-gRNA ribonucleoproteins을 조립하고 상온에서 10분간 반응시킨다.

Component	Amount (Final Concentration)
Nuclease-free water	7 μl
NEBuffer r3.1 (10x)	2 μl
300 nM sgRNA * (10ng/ul)	9 μl (90 nM final, total 90ng sgRNA)
1 μM Cas9 Nuclease (160ng/ul) **	2 μl (~66 nM final)
Reaction volume	20 μl
incubate for 10 minutes at room temperature

⑥ 실온에서 다음 반응을 설정하고 다음 프로그램을 사용하여 모든 원형 DNA 분자를 선형화한다.

Component	Amount (Final Concentration)
Purified circular DNA	9 μl
NEBuffer r3.1 (10x)	1 μl
Assembled Cas9-gRNA ribonucleoproteins	20 μl
Total Reaction volume	30 μl

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	30 μl	25 min
Step	Temperature	Duration
1	37°C	00:25:00
2	4°C	Hold

⑦ 1μl의 Proteinase K를 반응 혼합물에 추가하고, 부드럽게 혼합하고 원심분리기를 사용해 용액을 튜브의 아래로 모은다.

⑧ 실온에서 10분 동안 배양한다.

⑨ DNA를 정제하기 위해 37μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 11μl로 정제된 DNA를 용출한다. 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 큐빗(1 μl 사용)으로 분석한다.

⑩ R1 일부 및 TSO 일부 서열에 대한 프라이머를 사용하여 Q5 DNA 중합효소, 또는 KAPA HiFi HotStart ReadyMix로 50μl 용량의 PCR을 수행하여 아래 표시된 프로그램을 사용하여 전체 길이 cDNA를 증폭한다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	50 μl	35 min
Step	Temperature	Duration
1	98°C	00:03:00
2	98°C	00:00:15
3	63°C	00:00:20
4	72°C	00:03:00
5	Go to Step 2 seven times (total 8 cycles of Step2-5)
6	72°C	00:01:00
7	4°C	Hold

⑪ SPRI-비드를 사용해 DNA 정제 과정을 수행하고, 큐빗 또는 Bioanalyzer로 분석하여 샘플에 포함된 DNA의 양과 품질을 확인한다.

선형화가 완료된, 전장 분자('머리' 와 '꼬리'가 둘 다 존재하는 분자)들을 PCR 반응을 통해 증폭하는 과정이다.

3 단계 - Long-read 시퀀싱

단일 세포 유래 전체 길이 분자들을 Nanopore/PacBio 긴길이 시퀀싱 기술을 사용하여 분석을 진행한다.

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜 분석

DNA 단편의 멀티 결합 반응의 진행과정이며, 양 끝에 '머리'(R1과 세포바코드, mRNA의 3' 끝을 나타냄)와 '꼬리'(TSO, mRNA의 5' 끝을 나타냄)가 다 있는 분자들만 원형으로 조립되고, 나머지 분자들은 조립되지 않은 채로 남게 된다. DNA 단편의 멀티 결합 반응이 완료되고 나서 원형으로 조립되지 않은 분자를 제거하는 과정에서는 선형의 분자들이 Exonuclease에 의해 제거되게 된다. 기술적으로는, 다양한 Exonuclease의 조합을 사용하는것이 효과적이다. 원형으로 조립되지 않고 선형으로 남은 분자들의 제거가 완료되고 나서, 원형의 형태의 분자들은 다시 선형으로 변형하는 과정에 CRISPR/Cas9 Endonuclease를 사용하여 DNA 단편의 멀티 결합 어댑터 서열을 정확하게 인식하여 선형화를 진행한다. 제한효소 등 다른 Endonuclease가 사용될 수 있다.

2. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 사용한 선별 방법의 작동 원리

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응은 원형화 자가 조립을 하는 특성을 지닌 작동 원리를 갖는다. 작동원리의 시작은 원형화(self-cyclization)자가 조립으로 mRNA의 3'끝에 추가된 세포 바코드 및 Read1(R1) 프라이머와 5' 끝에 추가된 템플릿 스위칭 올리고(Template-switching-oligo; TSO) 프라이머를 둘 다 가진 DNA 형태를 갖는다. 다음으로, 원형 DNA는 선별되고, 원형화 되지 않는 DNA는 핵산 외부 가수분해 효소(Exonuclease)에 의해 제거된다. 이후, 선형화(Linearization) 단계를 거쳐, 단일세포 전체 길이 cDNA 라이브러리가 선별되게 된다.

3. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 활용 결과

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용하여 세포 바코드를 가진 DNA 분자를 선별하게 된다. 마우스 심장에서 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 이용하여 세포 분리를 진행하였다. 먼저, 마우스 심장에서 단일 세포 분리를 하였다. 이후, 10X 단일세포 전사체 라이브러리 제작을 했으며, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 세포 바코드를 가진 DNA 분자 선별하는 과정으로 최종적으로 선별하게 된다. 마우스 심장 단일세포의 선별과정에서 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 과정에 올바르게 세포 바코드가 부착된 분자들이 효과적으로 선별됨을 확인하였다(도 4).

선별 결과, 다양한 유전자에서 세포 바코드를 가진 분자들의 비율을 50% 이하에서 90% 이상으로 개선하였다(도 3). 심장을 제외한 마우스의 다른 다섯 개의 조직에서도 효과가 있음을 확인하였다.

4. 기술 검증 결과(Technical validation)

SPLiT-Seq 기술을 사용해 제작한 single-cell RNA-Seq라이브러리에 적용한 결과는 하기와 같다. SPLiT-Seq 기술을 사용해 2개의 마우스 cell line과 1개의 인간 cell line 세포들의 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 그 결과, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 기술을 적용하기 전, 세포 바코드를 가진 분자들의 비율은 8.3%이였지만, Ouroboros 세포 바코드 선별 기술을 적용한 후, 세포 바코드를 가진 분자들의 비율은 85.1%으로, 10배 이상으로 크게 증가하였음을 확인하였다(도 12).

10X Genomics사의 기술(3' Gene Expression Kit, v3)을 사용해 마우스 간조직에서 분리된 세포들의 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작하였고, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 기술을 적용하기 전, 세포 바코드를 가진 분자들의 비율은 19.1%이였지만, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 기술을 적용한 후, 세포 바코드를 가진 분자들의 비율은 91.1%으로, 약 4.8배로 크게 증가하였음을 확인하였다(도 13).

[실시예 2]

1. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜 (선택적 DNA분자 제거)

1 단계 - 단일 세포 cDNA 라이브러리 준비 및 정리

2 단계 - 세포 바코드를 가진 DNA 분자의 선별 및 선택적 DNA 분자 제거

③ 새로운 tube에 다음의 순서로 시약을 첨가하여 Cas9-gRNA ribonucleoproteins을 조립하고 상온에서 10분간 반응시킨다.

Component	Amount (Final Concentration)
Nuclease-free water	7 μl
NEBuffer r3.1 (10x)	2 μl
1.5 μM sgRNA (제거를 원하는 타겟을 인식하는 sgRNA 분자들. 본 구현 예에서는 MT DNA와 rRNA를 인식하는 sgRNA분자들을 사용) (50ng/ul)	9.5 μl (~475 nM final, total 475ng sgRNA)
20 μM Cas9 Nuclease, S. pyogenes	0.5 μl (~300 nM final)
Reaction volume	20 μl
incubate for 10 minutes at room temperature

④ 실온에서 다음 반응을 설정한다. 다음 프로그램을 사용하여 원하지 않는 원형 DNA 분자를 선형화한다.

Component	Amount (Final Concentration)
Gibson reaction mixture (DNA)	10 μl
Assembled Cas9-gRNA ribonucleoproteins	20 μl
Total Reaction volume	30 μl

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	30 μl	30 min
Step	Temperature	Duration
1	37°C	00:30:00
2	4°C	Hold

⑤ 1μl Thermolabile Proteinase K를 반응 혼합물에 추가한다. 부드럽게 혼합하고 원심분리기에서 펄스 회전한다. 다음 프로그램을 사용하여 반응 혼합물을 반응시킨다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	31 μl	25 min
Step	Temperature	Duration
1	37°C	00:15:00
2	55°C	00:10:00
3	4°C	Hold

⑥ Exonuclease III 1㎕, Lambda Exonuclease 1㎕, Exonuclease I 1㎕를 얼음 위의 반응 혼합물에 첨가한다. 다음 프로그램을 사용하여 선형 DNA 분자를 제거한다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	33 μl	30 min
Step	Temperature	Duration
1	37°C	00:20:00
2	70°C	00:10:00
3	4°C	Hold

⑦ 선형 DNA의 분해 반응이 완료되고 나서, 원형의 DNA를 정제하기 위해 14μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 10μl로 정제된 DNA를 용출한다. 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 큐빗(1μl 사용)으로 분석한다.

⑧ 새로운 tube에 다음의 순서로 시약을 첨가하여 자가 결합부위를 타겟하는 Cas9-gRNA ribonucleoproteins을 조립하고 상온에서 10분간 반응시킨다.

⑨ 실온에서 다음 반응을 설정하고 다음 프로그램을 사용하여 원형 DNA 분자를 선형화 한다.

⑩ 1μl의 Proteinase K를 반응 혼합물에 추가하고 부드럽게 혼합하고 원심분리기에서 펄스 회전한다.

⑪ 실온에서 10분 동안 배양한다.

⑫ 분해 반응 후 DNA 정제(clean-up)를 위해 37μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 11μl로 정제된 DNA를 용출한다. 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 큐빗(1μl 사용)으로 분석한다.

⑬ R1 일부 및 TSO 일부 서열에 대한 프라이머를 사용하여 Q5 DNA 중합효소, 또는 KAPA HiFi HotStart ReadyMix로 50μl 부피 PCR을 수행하여 아래 표시된 프로그램을 사용하여 전체 길이 cDNA를 증폭한다.

⑪ 실온에서 10분 동안 배양한다.

⑭ SPRI-비드를 사용한 DNA 정제 과정을 수행하고, 큐빗 또는 Bioanalyzer로 분석하여 샘플에 포함된 DNA의 양과 품질을 확인한다.

상기 ⑬ 내지 ⑭는 선형화가 완료된, 전장 분자('머리' 와 '꼬리'가 둘 다 존재하는 분자)들을 PCR 반응을 통해 증폭하는 과정이다.

3 단계 - Long-read 시퀀싱(Nanopore/PacBio)

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜 분석(선택적 DNA분자 제거)

DNA 단편의 멀티 결합 반응의 진행과정으로, 양 끝에 '머리'(R1과 세포바코드, mRNA의 3' 끝을 나타냄) 와 '꼬리'(TSO, mRNA의 5' 끝을 나타냄)가 다 있는 분자들만 원형으로 조립되고, 나머지 분자들은 조립되지 않은 채로 남게 된다. CRISPR/Cas9를 사용하여 원하지 않는 DNA를 제거하는 과정으로, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하기 때문에 매우 정확하게 원하지 않는 분자들만 제거하는 것이 가능하며, 수백 개 이상의 타겟 들을 동시에 손쉽게 제거하는 것이 가능하다는 장점이 있다.

DNA 단편의 멀티 결합 반응이 완료되고 나서 원형으로 조립되지 않은 분자들과 원형으로 조립되었던 분자들 중 선형으로 변환된 DNA를 제거하는 과정으로 선형의 분자들은 exonuclease에 의해 제거되게 된다. 기술적으로는, 다양한 Exonuclease의 조합을 사용하는 것이 효과적이다. 또한, 원형으로 조립되지 않고 선형으로 남은 분자들의 제거가 완료되고 나서, 원형의 형태 분자들을 다시 선형으로 변형하는 과정에는 CRISPR/Cas9 endonuclease를 사용하며, DNA 단편의 멀티 결합 어댑터 서열을 정확하게 인식해 선형화를 진행하게 된다. 또한, 제한효소 등 다른 endonuclease가 사용될 수 있다.

2. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기전 및 활용(선택적 DNA분자 제거)

DNA 단편의 멀티 결합 조립 조립 반응을 사용한 선별과정을 거쳐, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응이 끝난 전체 길이 DNA 라이브러리에서 선택적 DNA분자를 제거하는 기전이 시작이 된다. 선택적 DNA분자 제거과정은 하기와 같다.

1) 전체 길이 DNA 라이브러리가 원형의 DNA로 자가 조립된 상태

2) CRISPR/Cas9 핵산분해효소로 특정 DNA 서열(한 개 부터 수천 개까지 가능)을 포함하고있는 DNA 분자들을 타겟(원하지 않는 DNA 타겟을 선별적으로 선형의 DNA로 전환)

3) 원형 DNA 정제, 원하지 않는 DNA 분자가 제거된 전체 길이 DNA 분자 선별

상기와 같은 단계로, 선택적 DNA 분자가 제거가 되며, 원치 않는 DNA 분자가 제거된 상태로, 남은 원형의 DNA는 선형화 과정을 거쳐 단일세포 전체 길이 DNA 라이브러리로 분석을 진행하게 된다.

CRISPR/Cas9이 원하지 않는 DNA 분자에서 타겟 DNA 서열을 인식하여 제거하고자 하는 DNA 분자를 선형으로 전환시키고, 궁극적으로 남은 원형의 DNA 분자를 정제하게 되고, 이후, 선형으로 전환시키며, PCR을 통해 선형의 분자를 증폭하는 과정으로 분석을 진행하게 된다. 선택적 DNA분자가 제거된 선별 결과는 도 6에 나타내었다. 리보솜과 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA를 타겟 하는 26개 종류의 sgRNA를 사용하여 진행하였고, sgRNA 종류의 개수를 늘려 더욱 효과적인 제거가 가능할 것이다. 마우스 조직에서 선택적 DNA분자 제거 방법을 적용하였으며, 원하는 분자의 시퀀싱 효율이 최대 2배 증가한 것을 확인하였다.

3. 기술 검증 결과(Technical validation)

미토콘드리아와 리보솜RNA유래 cDNA를 타겟하는 26개의 타겟 서열을 사용하여 single-cell RNA-Seq라이브러리에서 미토콘드리아와 리보솜RNA유래 cDNA를 제거하였다. 10X Genomics사의 기술(3' Gene Expression Kit, v3)을 사용해 마우스의 여러 조직에서 각각 분리한 단일 세포의 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작하여 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 및 분자 타겟 제거 기술을 적용하기 전, 신장 조직에서 생산한 라이브러리에서 미토콘드리아와 리보솜RNA유래 cDNA 분자들의 비율은 56%이였다. 반면 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 및 분자 타겟 제거 기술을 적용한 후, 신장 조직에서 생산한 라이브러리에서 미토콘드리아와 리보솜RNA유래 cDNA 분자들의 비율은 17%으로, 원하는 분자(미토콘드리아와 리보솜RNA유래 cDNA가 아닌 분자)의 시퀀싱 효율은 44%에서 83%로 약 2배 증가하였음을 확인하였다(도 6).

[실시예 3]

1. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜 (DNA 타겟 선별)

1 단계 - 단일 세포 cDNA 라이브러리 준비 및 정리

2 단계 - 세포 바코드를 가진 DNA 분자의 선별

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	50 μl	20 min
Step	Temperature	Duration
1	98°C	00:03:00
2	98°C	00:00:15
3	63°C	00:00:20
4	72°C	00:03:00
5	Go to Step 2 four times (total 5 cycles of Step2-5)
6	72°C	00:01:00
7	4°C	Hold

③ 얼음 위에서 반응 혼합물에 Exonuclease III 1㎕, Lambda Exonuclease 1㎕, Exonuclease I 1㎕를 추가하고, 다음 프로그램을 사용하여 선형 DNA 분자를 제거한다.

④ 분해 후 깨끗하게 하기 위해 14μl의 SPRI-비드를 추가한다. 용출 완충액(elution buffer) 10 μl로 정제된 DNA를 용출하고, 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 큐빗(1 μl 사용)으로 분석한다.

⑤ 새로운 tube에 다음의 순서로 시약을 첨가하여 자가 결합부위를 타겟하는 Cas9-gRNA ribonucleoproteins을 조립하고 상온에서 10분간 배양한다.

⑦ 1μl의 Proteinase K를 반응 혼합물에 추가하고, 부드럽게 혼합하고 원심분리기에서 펄스 회전한다.

⑧ 실온에서 10분 동안 배양한다.

⑨ 분해 후 깨끗하게 하기 위해 37μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 11 μl로 정제된 DNA를 용출한다. 원형 DNA 분자의 양을 확인하기 위해 큐빗(1 μl 사용)으로 분석한다.

⑩ 실온에서 다음 dA-tailing(End-Prep) 반응을 설정하며, 20℃에서 20분, 65℃에서 10분간 반응시킨다.

Component	Amount (Final Concentration)
Cas9-Digested target DNA	10 μl
Ultra II End-prep reaction buffer	1.75 μl
Ultra II End-prep enzyme mix	0.75 μl
Nuclease-free water	2.5 μl (to 15 μl)
Total Reaction volume	15 μl

⑪ 깨끗한 정제를 위해 20μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 11μl로 정제된 DNA를 용출한다.

⑫ 실온에서 다음 반응을 설정하고, 실온에서 30분 동안 반응시킨다.

Component	Amount (Final Concentration)
End-Prepped DNA	10 μl
Hybridized Y-adaptor (T-overhang) (0.5 μM)*(diluted in nuclease-free water)	1 μl
Blunt/TA Ligase Master Mix	14 μl
Total Reaction volume	25 μl

⑬ 분해 후 깨끗한 정제를 위해 25μl의 SPRI-비드를 추가하고, 용출 완충액(elution buffer) 11μl로 정제된 DNA를 용출한다.

상기 ⑫ 내지 ⑬은 선형의 타겟 DNA(End-Prepped된 DNA)에 Y-adaptor를 붙여주는 과정이다.

⑭ Y-adaptor에 대한 forward 및 reverse 프라이머를 사용하여 Q5 DNA 중합효소 또는 KAPA HiFi HotStart ReadyMix로 50μl 부피 PCR을 수행하여 아래 표시된 프로그램을 사용하여 선택적으로 강화된 전체 길이 cDNA 표적을 증폭한다.

Lid Temperature	Reaction Volume	Run Time
105°C	50 μl	60 min
Step	Temperature	Duration
1	98°C	00:03:00
2	98°C	00:00:15
3	61°C	00:00:20
4	72°C	00:03:00
5	Go to Step 2 9~11 times (total 10~12 cycles of Step2-5)
6	72°C	00:01:00
7	4°C	Hold

⑮ SPRI 비드를 정리하고, 큐빗 또는 Bioanalyzer로 분석하여 샘플에 포함된 DNA의 양과 품질을 확인한다.

상기 ⑭ 내지 ⑮는 Ligation에 사용된 Y-adaptor에 알맞은 프라이머를 사용하여 어뎁터가 추가된 선형 DNA 타겟들을 증폭하는 과정으로, 증폭하는 과정에서 선별되지 않은 원형의 DNA들은 제거되게 된다.

3 단계 - Long-read 시퀀싱(Nanopore/PacBio)

DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜 분석(DNA 타겟 선별)

DNA 단편의 멀티 결합 반응의 진행과정이며, 양 끝에 '머리'(R1과 세포바코드, mRNA의 3' 끝을 나타냄) 와 '꼬리'(TSO, mRNA의 5' 끝을 나타냄)가 다 있는 분자들만 원형으로 조립되고, 나머지 분자들은 조립되지 않은 채로 남게 된다. DNA 단편의 멀티 결합 반응 이 완료되고 나서 원형으로 조립되지 않은 분자를 제거하는 과정에서 선형의 분자들이 exonuclease에 의해 제거되게 된다. 기술적으로는 다양한 Exonuclease의 조합을 사용하는것이 중요하다. 원형으로 조립되지 않고 선형으로 남은 분자들의 제거가 완료되고 나면 원형 형태의 분자들을 다시 선형으로 변형하는 과정에서 CRISPR/Cas9 endonuclease를 사용하여 원하는 cDNA 분자 타겟들의 서열을 정확하게 인식해 선형화를 진행한다. 제한효소 등 다른 endonuclease가 사용될 수 있다.

DNA 타겟 선별 DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 프로토콜은 CRISPR/Cas9를 사용하여 원하는 DNA 타겟을 정보의 손실없이 선별하는 과정이다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하기 때문에 매우 정확하게 원하는 분자들만 선별하는 것이 가능하며, 수백 개 이상의 타겟들을 동시에 효율적으로 선별할 수 있다는 장점이 있다. 동일 타겟 개수를 가정할 때, RNA-hybrid capture등의 기존 기술에 비해 실험이 간단하고, 경제적이라는 장점이 있다. 기술적으로, Y-adaptor ligation 반응을 진행하기 전에 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 선형으로 전환된 타겟 DNA들에 A-tail을 붙여주는 과정은 adaptor-dimer의 생성을 줄이고 반응의 효율을 높이기 위해 반드시 진행해야 되는 필수 과정이다.

2. DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응 기전 및 활용(선택적 DNA 타겟 선별)

DNA 단편의 멀티 결합 조립 조립 반응을 사용한 선별과정을 거쳐, DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응이 끝난 정제된 원형 형태의 전체 길이 DNA 라이브러리에서 DNA 타겟 선별 기전이 시작이 된다. DNA 타겟 선별 기전은 다음과 같다.

1) 전체 길이 DNA가 원형의 DNA로 자가 조립된 상태

2) RISPR/Cas9 핵산분해효소로 관심 유전자/세포(한 개에서 수천 개까지 가능)유래 DNA 분자를 타겟(타겟 DNA 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 선별적으로 선형의 DNA로 전환)

3) 선형의 DNA에만 Y-어댑터 결합(Y- adaptor ligation), 증폭 과정을 통해 타겟 선별

cDNA 타겟 선별된 결과는 도 8에 나타내었다. 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA의 양이 제일 적었던 마우스 조직 샘플을 사용하여 그 과정을 진행하였다. 미토콘드리아 게놈의 유전자 11개에서 유래한 cDNA를 타겟으로 선별하였으며, 타겟 선별 후 시퀀싱 된 염기의 72%가 타겟 cDNA의 염기인 것으로 확인되었다. 타겟 선별 효율은 원본 라이브러리에 비해서 15배 증가한 것을 확인하였다. 또한, 암환자의 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플에서 단일 세포 분리하여 전장 cDNA 타겟 선별의 과정을 진행하였다. 분리된 단일세포에서 10X 단일세포 전사체 라이브러리를 제작하고, 단일 염기 서열 변이(SNV)가 검출된 지역을 타겟 하는 sgRNA 22개를 사용하여 타겟 선별을 진행하였다. 그 결과, 타겟 선별 효율이 17.5배 상승한 것을 확인하였다(도 9).

3. 기술 검증 결과(Technical validation)

미토콘드리아 게놈 유래 cDNA를 타겟하여 single-cell RNA-Seq라이브러리에서 11개 종류의 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA를 선별한 결과는 하기와 같다. 10X Genomics사의 기술(3' Gene Expression Kit, v3)을 사용해 마우스의 흉선 조직에서 분리한 단일 세포의 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작하였으며, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 및 분자 타겟 선별 기술을 적용하기 전, 마우스 조직에서 생산한 라이브러리에서 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA분자들의 비율은 4.2%이였다. 반면, 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 및 분자 타겟 선별 기술을 적용한 후, 마우스 조직에서 생산한 라이브러리에서 미토콘드리아 게놈 유래 cDNA분자들의 비율은 72%으로, 원하는 분자(미토콘드리아와 게놈 유래 cDNA 분자)의 시퀀싱 효율은 약 17배 증가하였음을 확인하였다(도 8).

6500개 단일 세포의 cDNA가 존재하는 단일세포 라이브러리에서 섬유아세포(fibroblast) 로 판단된 99개의 세포에서 유래한 cDNA 분자들만 선별한 결과는 하기와 같다. 10X Genomics사의 기술(3' Gene Expression Kit, v3)을 사용하여 마우스 모 신장 조직에서 분리한 단일 세포의 single-cell RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 시퀀싱 및 생물정보학 분석을 통해 99개의 섬유아세포의 세포 바코드를 파악하였으며, 99개의 섬유아세포의 세포 바코드를 가진 cDNA 분자들만 선별할 수 있는 DNA oligo들을 IDT사의 oPool 서비스를 사용하여 제작하였다. 제작된 DNA oligo를 사용하여 99개의 세포 바코드를 타겟하는 CRISPR/Cas9 sgRNA를 제작하였다. 본 발명의 Ouroboros 세포 바코드 선별 및 분자 타겟 선별 기술을 적용한 결과, 99개의 섬유아세포 유래 cDNA만 정확하게 선별된 것을 확인하였다(도 11).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

단일세포의 다중체 전장 서열 분석 방법으로서,
(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리(Library)를 제작하는 단계;
(b) 상기 라이브러리에 DNA 단편의 멀티 결합 조립 어댑터를 부착하는 단계;
(c) DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응을 활용한 라이브러리 내 DNA분자를 선별하는 단계;
(d) 핵산 외부 가수분해 효소(exonuclease)를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계; 및
(e) 라이브러리 내 원형 DNA를 선형화(Linearization) 시키고 증폭시키는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법.
제 1항에 있어서,
상기 다중체는 전사체, 유전체, 공간전사체, 단백체, 또는 후성유전체인 것인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 다중체 라이브러리는 3' 말단과 5’ 말단에 서로 다른 방향의 어댑터(forward and reverse adaptor sequence)가 연결되는 것인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 정방향 어댑터와 역방향 어댑터가 조립 어댑터로 원형 DNA를 형성하는 것인, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (e) 단계는 CRISPR/Cas 핵산분해효소, 제한효소(Restriction Enzyme)또는 탈렌 핵산가수분해효소(TALEN; Transcription Activator-Like Effector Nucleases)를 사용하여 선형화 시키는 것인, 방법.
제 5항에 있어서,
상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12, CRISPR/Cas13, 및 CRISPR/Cas14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
단일세포의 다중체 전장 라이브러리에서 선택적 DNA 분자 제거 후 서열 분석을 위한 방법으로서,
(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리를 제작하는 단계;
(b) 상기 라이브러리에 DNA 단편의 멀티 결합 조립 어댑터를 부착하는 단계;
(c) DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응으로 라이브러리 내 원형의 DNA를 제조하는 단계;
(d) 제거하고자 하는 타겟 서열들을 포함하는 원형 DNA를 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 선택적으로 선형화 하는 단계;
(e) 핵산 외부 가수분해 효소를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계;
(f) 선형 DNA를 제거하는 단계; 및
(g) 라이브러리 내 원형 DNA를 선형화(Linearization) 시키고 증폭하는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법.
제 7항에 있어서,
상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12, CRISPR/Cas13, 및 CRISPR/Cas14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 원형 DNA에만 적용되는 것인, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 (f) 단계의 선형 DNA는 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 인식되는 선택된 DNA 분자인 것인, 방법.
단일세포의 다중체 전장 라이브러리에서 선택된 DNA 분자를 선별 후 서열 분석을 위한 방법으로서,
(a) 단일 세포에서 다중체 라이브러리를 제작하는 단계;
(b) 상기 라이브러리에 DNA 단편의 멀티 결합 조립 어댑터를 부착하는 단계;
(c) DNA 단편의 멀티 결합 조립 반응으로 라이브러리 내 원형의 DNA를 제조하는 단계;
(d) 핵산 외부 가수분해 효소를 사용하여 원형 DNA가 아닌 DNA 단편을 제거하는 단계;
(e) 선별하고자 하는 타겟 서열들을 포함하는 원형 DNA를 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 선택적으로 선형화 하는 단계;
(f) 원형 DNA를 제거하는 단계; 및
(g) 라이브러리 내 선형 DNA를 증폭하는 단계;를 포함하는, 서열 분석을 위한 방법.
제 11항에 있어서,
상기 CRISPR/Cas 핵산분해효소는 CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12, CRISPR/Cas13, 및 CRISPR/Cas14로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
제 11항에 있어서,
상기 (g) 단계의 선형 DNA는 CRISPR/Cas 핵산분해효소로 인식되는 선택된DNA 분자인 것인, 방법.
제 11항에 있어서,
상기 (g) 단계는 Y-어댑터(Y-adaptor) 또는 헤어핀 어댑터(hairpin adaptor) 결합(ligation)이 일어나는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제 1항의 방법을 이용하는 단일세포 다중체 전장 시퀀싱 분석 키트.
제 1항의 방법을 이용하는 단일세포 수준의 유전자 동형 진단마커 분석 키트.
제 1항의 방법을 이용하는 단일세포 돌연변이 기반 암 표적치료 후보 분석 키트.