KR20240072371A - 재조합 h5n1 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 이용한 고병원성 조류 인플루엔자 백신 및 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 H5N1 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 방어 효과를 나타내는 유전자 재조합 백신을 제조함으로써, 해외로부터 유입되거나 국내에서 발생하는 H5형 고병원성 조류 인플루엔자 발생에 대비한 효과적인 방어 효과를 통해 질병방제에 기여할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물에서 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열은 일반적인 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스가 가지고 있는 HA 단백질 분절부위의 저병원성 유전자 배열로 치환되어 고병원성 특성을 제거됨으로써 고병원성에 따른 치명적인 질병이 야기될 수 있는 위험요소가 적을 뿐만 아니라, 가금류에서의 안정성과 방어능이 우수하다.
Description
본 발명은 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5N1 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스를 예방하기 위한 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스, 이의 제조방법 및 백신 조성물에 관한 것이다.
조류인플루엔자(Avian Influenza, AI)는 조류인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 발생하는 닭과 기타 가금류에 대한 조류 급성 전염병으로, 일반적으로 전파가 빠르고, 임상증상이 전혀 나타나지 않는 경우부터 치사율이 100%인 경우까지 그 병원성이 매우 다양하다.
인플루엔자 바이러스(Influenza Virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A, B, C형 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 다양한 종류의 가금과 야생조류와 더불어 사람, 돼지, 기타 포유류에서도 감염이 확인되고 있다.
A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분되며, HA는 바이러스 세포에 부착하여 감염을 매개하는 역할을 하고, NA는 세포 내에서 증식된 바이러스가 세포로부터 분리될 수 있도록 한다.
조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus, AIV)는 모두 A형에 속하는 바이러스로, 바이러스 외막에 있는 HA(16종류)와 NA(9종류)의 조합에 따라 총 144종류의 혈청형(HxNx)으로 분류할 수 있으며, 다른 혈청형 간에 교차방어가 되지 않는 것이 특징이다. AIV는 감염된 가금에서 나타나는 병원성에 따라 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(High Pathogenicity Avian Influenza Virus, HPAIV)와 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(High Pathogenicity Avian Influenza Virus, HPAIV)로 나뉘며, 그 중에서 현재까지 발생한 고병원성 조류인플루엔자는 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 확인된다. 1996년 고병원성 조류인플루엔자 바이러스인 A/Gs/Gd/1/1996(H5N6)가 중국의 거위농장에서 처음으로 분리되었다. 그 이후, H5 바이러스는 감염된 야생조류 및 가금류의 AIV와 유전적 재조합에 의해 새로운 형태로 지속해서 진화했으며, Gs/Gd 계통의 H5형 바이러스에 대하여, H5N1, H5N2, H5N6, H5N8 등 다양한 아형의 H5 고병원성 조류인플루엔자 바이러스가 보고되고 있다.
최근까지 가금 및 야생조류에서 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5형 바이러스의 발생이 우리나라를 포함한 아시아와 유럽, 아프리카까지 전세계적으로 지속해서 보고되고 있으며, AI가 상재화된 국가 중에서 중국, 베트남, 멕시코, 이집트, 인도네시아 등은 백신 정책을 실시하고 있고, 특히, 가금류에서 조류인플루엔자 백신을 사용하고 있다.
그러나, 조류인플루엔자는 전술한 바와 같이 다양한 혈청형과 유전형이 존재하며, 2003년 이후 아시아지역에서 유행하고 있는 조류인플루엔자 바이러스에 높은 방어능을 보이면서 백신 제조 과정 중 안정성이 검증되고, 효능이 우수한 고병원성 백신주를 이용한 백신 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 신규한 유전자 재조합 백신을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, H5N1형 고병원서 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열을 저병원성 유전자 배열로 치환하여 약독화된 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgH526 백신주)를 제조하고, 이의 높은 안정성, 면역성 및 백신 효능을 검증함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgH526 백신주)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 H5 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 2021년 11월 국내에서 분리된 H5N1 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스주(A/quail/Korea/H526/2021(H5N1))을 이용하여 본 발명을 개발하였다.
2021년 국내 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스주(원바이러스; A/quail/Korea/H526/2021(H5N1))에서 분리된 H5N1 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여, H5N1형에 높은 방어 능력을 나타내는 고병원성 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5형 바이러스의 HA 유전자를 포함하는 백신주를 선발하여 이를 이용한 백신을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 제공한다:
(a) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(b) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랙스펙션(transfection)하는 단계; 및
(d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 수득하는 단계.
본 명세서에서 용어 '조류 인플루엔자'는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병을 의미한다. 상기 조류 인플루엔자 원인체는 인플루엔자 A 바이러스이다.
본 명세서에서 용어 '인플루엔자 A 바이러스'는 동물 및 인간에서 발생하는 통상 '독감(flu)'으로 불리는 고-전염성 호흡기 질환의 원인 바이러스로, 단일 가닥 음성 RNA 절편으로 이루어진 절편화된 지놈(genome)을 갖는 외피가 있는 RNA 바이러스를 의미한다.
본 명세서에서 용어 '유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스'는 유전자 재조합 기술을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 RNA 단편이 재조합된 바이러스를 의미한다. 예를 들어, 적어도 2개의 공여자 바이러스(고병원성 인플루엔자 A 바이러스 및 저병원성 인플루엔자 A 바이러스)의 RNA 단편의 조합에 의해 생성되는 유전물질을 함유하는 바이러스이다.
본 명세서에서 용어 '고병원성 인플루엔자 A 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza A virus, HPAI)'는 (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 6수 이상(75%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성지수(intravenous pathogenicity, IVPI, 10수의 4-8주령 감수성 닭의 정맥내로 바이러스를 접종하고 10일 동안 24시간 간격으로 닭의 임상증상 및 폐사정도를 확인하고 호흡기 증상, 침울, 설사, 외피나 벼슬의 청색증, 두부의 부종, 신경증상의 경중을 점수로 기록하여 각 증상의 합에 증상 수치를 곱한 총합을 100으로 나눈 지수)가 1.2 이상인 경우; (iii) HA 단백질의 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성으로 알려진 바이러스의 분절 부위의 서열정보와 같거나 유사하다고 판정되는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 용어 '저병원성 인플루엔자 A 바이러스(Low Pathogenic Avian Influenza A Virus, LPAI)'는 고병원성 인플루엔자 A 바이러스보다, (i) 4-8주령 감수성 닭 8수에 접종하여 10일 이내에 2수 이하(25%) 폐사할 경우; (ii) 정맥내 병원성 지수가 1.2 미만인 경우; (iii) HA 단백질의 분절 부위의 아미노산 서열이 고병원성으로 알려진 바이러스의 분절 부위의 서열정보와 상이하다고 판정되는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 용어 'H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스'는 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H5형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N1형인 인플루엔자 A 바이러스를 의미한다.
본 발명의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 단계별로 설명한다.
단계 (a): 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
먼저, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
본 명세서에서 용어 '뉴클레오타이드 서열'은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '벡터'는 벡터의 전사에 제공되는 추가 단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 이와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료 암호 서열을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 벡터는 일반적으로 플라스미스 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 pHW2000 벡터(Hoffmann E et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000 23;97(11):6108-13 참조)이다.
상기 단계 (a)의 재조합 플라스미드는 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래의 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 재조합 플라스미드는 HA를 포함하는 제1재조합 플라스미드로 구성된다.
단계 (b): 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS를 각각 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
다음, 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
상기 단계 (b)의 재조합 플라스미드는 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 유래의 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS를 각각 포함한다.
본 발명의 일 구현예 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 PB2를 포함하는 제2재조합 플라스미드, PB1을 포함하는 제3재조합 플라스미드, PA를 포함하는 제4재조합 플라스미드, NP를 포함하는 제5재조합 플라스미드, NA를 포함하는 제6재조합 플라스미드, M을 포함하는 제7재조합 플라스미드 및 NS를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.
단계 (c): 패키징 세포로의 트랙스펙션(transfection)
다음, 상기 단계 (a) 및 (b)의 제1내지 제8재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랙스펙션한다.
본 명세서에서 용어 '패키징 세포(packaging cell)'는 비-바이러스성 트랜스펙션 방법을 통해 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 패키징 세포는 트랜스펙션된 제1 내지 제8재조합 플라스미드로부터 발현된 HA, PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 단백질이 어셈블리(aseembly)된 유전자 재조합의 H5N1형 조류 인플루엔자 A 바이러스를 생산할 수 있다.
단계 (d): H5N1형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 수득
마지막으로, 상기 패키징 세포의 배양 상층액을 원심분리하여 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgH526(H5N1))를 수득한다.
본 발명의 용어 'rgH526(H5N1)'는 본 발명에 따른 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법으로 수득된 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)이다.
조류 인플루엔자 바이러스의 명명법 [아형/기원숙주/분리지역/분리순번/분리년도(HA형, NA형)]에 따라, 상기 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)는 조류 인플루엔자 A 바이러스로 메추라기를 숙주로 하며, 대한민국에서 2021년에 분리된 바이러스로 Clade 2.3.4.4b에 속하는 유전형을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.4.4b에 속하는 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)이다.
본 명세서에서 'Clade'는 H5형 인플루엔자의 HA 유전자의 계통수적 특징(phylogenetic characterization) 및 서열 상동성에 기초하여 H5형 인플루엔자의 그룹을 분류하는 기준이 되는 것으로, 각 clade는 WHO/WOAH/FAO의 전문가 그룹에 의하여 정의된다.
본 발명의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A형 바이러스의 병원성을 결정함에 있어서 다양한 요인들이 관여하지만, HA 분절부위(HA cleavage site, HACS)가 주된 역할을 하며, HA 분절부위(HACS)의 분자적 특성, 즉, 분절부위에 특정한 병원성 관련 유전자 배열에 따라 고병원성 또는 저병원성으로 분류될 수 있다.
구체적으로, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스(Low pathogenicity avian influenza viruses, LPAIVs)의 HA 분절부위 모티프는 1개 또는 2개의 비연속 염기성 아미노산 잔기를 포함하고, 일반적으로 단일염기 특이성(monobasic specificity)을 갖는 트립신 및 트립신 유사 세린 프로테아제에 의해 절단되는 것을 특징으로 한다. 대조적으로, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(High pathogenicity avian influenza viruses, HPAIVs)의 HA 분절부위 모티프는 다수의 염기성 아미노산 잔기, 즉 최소 4개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하고, 다염기성 특이성(polybasic specificity)을 갖는 유비쿼터스 발현 단백질 가수분해효소, 특히 퓨린(furin)에 의해 분열이 촉진되는 것을 특징으로 한다.
또한, 인플루엔자 A 바이러스의 HA는 표면 당단백질로, 인플루엔자 A 바이러스가 세포 내로 도입되는 경우, 세포 표면의 특이적 수용체와 상호작용을 하는 역할을 한다. 상기 HA는 HA1 및 HA2 서브유닛으로 구성되며, 상기 HA1의 수용체-결합 부위(receptor-binding site, RBS) 모티프가 세포 수용체 특이성에 중요한 역할을 하고, 바이러스의 숙주 범위를 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 저병원성 유전자 배열로 치환된 것이다.
본 발명의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 HA 단백질 분절부위에 고병원성을 나타내는 유전자 배열(Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg)이 존재하여 가금에게 전신 장기에 감염하여 치명적인 질병을 야기할 수 있으므로, 이에 대한 안전한 백신주를 개발하기 위해 상기 단백질 분절 부위의 고병원성을 나타내는 유전자 배열에 해당하는 아미노산 Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg(RERRRKR)을 저병원성을 나타내는 유전자 배열에 해당하는 아미노산 Arg-Glu-Thr-Arg(RETR)로 치환한다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 339번 내지 345번에 위치하는 아미노산 Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg(RERRRKR)이 Arg-Glu-Thr-Arg(RETR)으로 치환된 것이다.
본 발명은 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA 분절부위의 고병원성 유전자 배열에 해당하는 아미노산 339번 내지 345번에 위치하는 RERRRKR을 RETR로 치환하여 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 약독화(attenuation)한다.
또한, 본 발명의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA 분절부위의 1016번 내지 1036번에 위치하는 고병원성 유전자 배열에 해당하는 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA가 존재하여 가금에게 전신 장기에 감염하여 치명적인 질병을 야기할 수 있으므로, 이에 대한 안전한 백신주를 개발하기 위해 상기 분절부위의 고병원성 유전자 배열에 해당하는 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA를 AGAGAAACAAGA로 치환한다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 1016번에서 1036번에 위치하는 뉴클레오타이드 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA가 AGAGAAACAAGA로 치환된 것이다.
본 발명은 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA 분절부위의 고병원성 유전자 배열에 해당하는 뉴클레오타이드 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA를 AGAGAAACAAGA로 치환하여 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스를 약독화한다.
본 발명의 일 구현예 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34(H1N1)이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다.
상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS를 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB2를 포함하는 제2재조합 플라스미드, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PB1을 포함하는 제3재조합 플라스미드, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 PA를 포함하는 제4재조합 플라스미드, 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NP를 포함하는 제5재조합 플라스미드, 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NA를 포함하는 제6재조합 플라스미드, 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 M을 포함하는 제7재조합 플라스미드 및 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NS를 포함하는 제8재조합 플라스미드로 구성된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분리된 세포이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 293T 세포이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 H5N1형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법은 상기 단계 (d)의 배양 상층액을 특정병원체부재(SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종하여 바이러스를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스주는 다음의 단계를 포함하는 제조방법으로 수득될 수 있다: A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)주로부터 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열을 저병원성 유전자 배열로 치환한 HA 유전자를 증폭하는 제1단계; 상기 1단계의 유전자를 재조합하여 형질전환하는 제2단계; 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 A/PR/8/34(H1N1)주로부터 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 유전자를 증폭하는 제3단계; 상기 2단계 및 3단계에서 수득한 플라스미드를 HEK-293T 세포에 트랙스펙션하는 제4단계; 및 상기 배양 상층액을 특정병원체부재(SPF, specific pathogenic free) 부화란에 접종하는 제5단계.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다:
(i) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자; 및
(ii) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 저병원성 유전자 배열로 치환된 것이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 339번 내지 345번에 위치하는 아미노산 Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg이 Arg-Glu-Thr-Arg으로 치환된 것이다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 1016번에서 1036번에 위치하는 뉴클레오타이드 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA가 AGAGAAACAAGA로 치환된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다.
본 발명의 H5N1형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스는 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 H5N1형 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법에 의해 제조되므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는, H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다:
(i) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자; 및
(ii) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5형 바이러스의 HA 유전자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것이다.
본 명세서에서 용어 '백신 조성물'은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미한다. 상기 백신 조성물은 대상(subject)에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어, 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물의 대상은 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 H5N1 혈청형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 동물 예방용 백신이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 백신 조성물의 대상은 닭, 메추라기, 칠면조, 거위를 포함하는 가금류이다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스(rgH526(H5N1))를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명인 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.
본 발명의 백신 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상(subject)의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있다. 한편, 본 발명의 백신 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종 용도일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 본 발명의 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여방식을 의미한다. 본 발명의 백신의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약제학적으로 허용가능한 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하여야 한다.
본 발명의 백신의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 주사용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 사이토카인과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 상이한 외래 유전자 또는 면역증강제를 보유하는 2 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 면역증강제를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant, 어쥬번트)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다. 본 발명의 면역증강제에는 alum, 완전 프로인트 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬번트, LPS, poly IC, poly AU, 리포펙틴(Lipofectin), 리포탁시(LipoTaxi), CaPO4, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(Polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질, 젤, 리소레시틴, 플루로릭 폴리올스(pluronic polyols), 플리음이온(polyanions), 펩타이드(peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물 내 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것이다.
상기 불화하는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스에 포르말린, 자외선, 열, BEI(Binary Ethyleneimine), 베타-프로피오락톤(Beta-Propiolactone) 등의 처리로 달성될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 불활화 된 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스에 추가로 오일 어쥬번트를 첨가해 혼합하여 불활화 오일 백신 또는 사독백신으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 H5N1 혈청형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스주를 이용하 사독백신이다.
상기 사독백신의 제조방법은 본 발명에 따른 약독화된 재조합 H5N1형 혈청형 바이러스주인 rgH526(H5N1)주(기탁기관: KVCC 기탁번호: VR2200054)를 특정병원체부재(SPF) 부화란에 12시간 내지 72시간 또는 50시간 내지 60시간 배양하여 요막강액을 수득하는 제1단계; 및 제1단계에서 수득한 요막강액에 0.01% 내지 0.1% 포르말린(formalin)을 첨가한 후 0℃ 내지 10℃에서, 바람직하게는 4℃에서, 6시간 내지 24시간, 바람직하게는 12시간 처리하여 불활화시키는 제2단계를 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 사독백신의 제조방법의 제1단계는 rgH526(H5N1)주를 특정병원체부재 부화란에 36 내지 48시간 배양하여 요막강액을 수득하는 단계이다. 본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 사독백신의 제조방법의 제2단계는 제1단계에서 수득한 요막강액을 1/10로 농축한 후, 농축한 바이러스에 0.01% 포르말린을 첨가한 후 4℃에서 12시간 불활화 시키는 단계이다.
본 발명의 백신 조성물은 H5 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스의 예방에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 '예방'은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다.
본 발명의 H5 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하므로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
[서열에 대한 간단한 설명]
서열번호 1은 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)의 HA의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 2는 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)의 HA의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 rgH526(H5N1)의 HA의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 4는 rgH526(H5N1)의 HA의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 A/PR/8/34(H1N1)의 PB2의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 6은 A/PR/8/34(H1N1)의 PB1의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 7은 A/PR/8/34(H1N1)의 PA의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 8은 A/PR/8/34(H1N1)의 NP의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 9는 A/PR/8/34(H1N1)의 NA의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 10은 A/PR/8/34(H1N1)의 M의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 11은 A/PR/8/34(H1N1)의 NS의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 12 내지 29는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조를 위해 사용된 HA, PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 유전자에 대한 프라이머 서열이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.
(c) 본 발명은 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명의 백신 조성물을 이용하는 경우, H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 방어 효과가 우수하고, 해외로부터 유입되거나 국내에서 발생하는 H5형 고병원성 조류 인플루엔자 발생에 대비한 효과적인 방어 효과를 통해 질병 방제에 기여할 수 있으며, 상기 백신 조성물에서 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 저병원성 유전자 배열로 치환되어 고병원성 위해 수준에 대한 위험성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 가금류에서의 안정성과 방어능이 우수하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. H526/H5N1 바이러스 분리 동정 방법
2021년 11월 국내 가금농장에서 사육 중인 메추라기로부터 H5N1 바이러스의 분리를 위한 시료를 채취하였다. 유전자 검사(rRT-PCR)를 통하여 조류 인플루엔자 바이러스의 M(matrix protein) 유전자를 확인하고 종란 접종을 통하여 바이러스를 증식하였다. 10일령 SPF 종란에 접종하여 37℃, 60-72시간 배양 후 SPF 종란의 요막액으로부터 바이러스를 분리하였다. 상기 유전자 검사를 통하여 Clade 2.3.4.4b H5형에 속하는 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스(A/quail/korea/H526/2021(H5N1))를 확인하였다.
하기 표 1에 정리한 바와 같이, A/quail/korea/H526/2021(H5N1) 인플루엔자 바이러스의 HA(hamagglutinin)의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타내었고, 이의 HA의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.
| 바이러스주 | 유전자 | 구분 | 서열번호 |
| A/quail/Korea/H526/2021(H5N1) | HA | 핵산 | 1 |
| A/quail/Korea/H526/2021(H5N1) | HA | 아미노산 | 2 |
실시예 2. 백신 제조
2.1. 고병원성 바이러스주의 HA 유전자 고병원성 부위 치환
H5N1형 조류 인플루엔자 바이러스주는 이의 HA 단백질 분절부위의 339~345번 위치에 고병원성 유전자 배열이 존재하여 가금에게 감염시 전신 장기에 감염하여 치명적인 질병을 야기할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이에 본 발명자들은 보다 안전한 백신주를 개발하기 위해 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열(339~345번 아미노산 위치)을 저병원성 유전자 배열로 치환하여 고병원성의 특성을 제거한 약독화된 백신주를 개발하였다.
A/quail/Korea/H526/2021(H5N1) 바이러스로부터 RNA extraction kit(iNtRON, Korea)를 사용하여 RNA를 추출하였다. HA 분절부위의 고병원성 서열을 치환하기 위해 하기 표 2에 나타낸 중첩되는 프라이머들(overlapping primers)을 사용하여 2개의 분절을 증폭한 후 이 두 개의 분절을 이용하여 PCR을 통해 HA 유전자를 증폭(PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/ 35회)하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.
| 이름 | 염기서열 | 서열번호 |
| HA1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CAA AAG CAG GGG | 12 |
| HA26-H5R | CCT CTT GTT TCT CTT TGA GGA CTA TTT CTG AGC CC | 13 |
| HA26-H5F | CTC AAA GAG AAA CAA GAG GAC TAT TTG GAG CTA TA | 14 |
| NS-890R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGG TG | 15 |
2.2. 고병원성 H5N1주의 벡터 클로닝
상기 실시예 2.1에서 PCR을 이용하여 증폭한 HA 유전자를 pHW2000 vector에 In-Fusion HD Cloning kit(Takara, Japan)로 접합시킨 후 대장균(E. coli, stella competent cells)를 이용하여 37℃ 회전배양기(shaking incubator)에 18시간 배양증폭한 후 Plasmid DNA purification Kit(iNtRON, Korea)로 정제하여 HA 유전자를 얻었다.
2.3. A/PR/8/34(H1N1) 주의 클로닝
A/PR/8/34(H1N1) 바이러스(ATCC,USA)에서 상기 실시예 2.1 및 2.2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 유전자들을 하기 표 3에 나타낸 특정 프라이머들을 이용하여 PCR을 통해 증폭((PCR 조건: 94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 4분/ 35회)한 후, pHW2000 vector에 In-Fusion HD Cloning kit (Takara, Japan)로 접합시킨 다음, 대장균(E. coli, stella competent cells)을 이용하여 형질전환한 후 LB broth (Bioscience, Korea)를 이용하여 37℃ 회전배양기(shaking incubator)에 18시간 배양증폭한 후 Plasmid DNA purification Kit(iNtRON, Korea)로 정제하여 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 유전자를 얻었다.
| 이름 | 염기서열 | 서열번호 |
| Phw-PB2-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CGA AAG CAG GTC | 16 |
| Phw-PB2-2341R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGT CG | 17 |
| Phw-PB1-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CGA AAG CAG GCA | 18 |
| Phw-PB1-2341R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGC AT | 19 |
| Phw-PA-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CGA AAG CAG GTA | 20 |
| Phw-PA-2233R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGT AC | 21 |
| Phw-NP-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CAA AAG CAG GGT | 22 |
| Phw-NP-1565R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGG TA | 23 |
| Phw-NA-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CAA AAG CAG GAG | 24 |
| Phw-NA-1413R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGA GT | 25 |
| Phw-M-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CAA AAG CAG GTA | 26 |
| Phw-M-1027R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGT AG | 27 |
| Phw-NS-1F | TCC GAA GTT GGG GGG GAG CAA AAG CAG GGT | 28 |
| Phw-NS-890R | GGG CCG CCG GGT TAT TAG TAG AAA CAA GGG TG | 29 |
하기 표4에 정리한 바와 같이, 위에서 얻은 A/PR/8/34(H1N1) 바이러스의 PB2, PB1, PA, NP, NA, M 및 NS 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5 내지 서열번호 11에 각각 나타내었다.
| 바이러스주 | 유전자 | 구분 | 서열번호 |
| A/PR/8/34(H1N1) | PB2 | 핵산 | 5 |
| A/PR/8/34(H1N1) | PB1 | 핵산 | 6 |
| A/PR/8/34(H1N1) | PA | 핵산 | 7 |
| A/PR/8/34(H1N1) | NP | 핵산 | 8 |
| A/PR/8/34(H1N1) | NA | 핵산 | 9 |
| A/PR/8/34(H1N1) | M | 핵산 | 10 |
| A/PR/8/34(H1N1) | NS | 핵산 | 11 |
2.4. 약독화 재조합 H5N1 혈청형 바이러스주 제조
HEK-293T 세포를 37℃, 5% CO2에 배양 후 상기 실시예 2.2 및 2.3에서 수득한 각각의 플라스미드(plasmid)를 10 ㎕씩 리포펙타민 3000 Transfection Reagent(Lipofectamin 3000, Invitrogen, USA)으로 접종(transfection)하였다. 접종 48시간 내지 60시간 후 상층액을 10일령된 특정병원체부재(SPF, specific pathogen free) 부화란에 접종하여 약독화된 재조합 H5N1 혈청형 바이러스 주(이하, rgH526(H5N1)로 명명함)를 수득하였다.
결과는 하기 표 5에 나타내었다.
| 바이러스주 | 유전자 | 구분 | 서열번호 |
| rgH526(H5N1) | HA | 핵산 | 3 |
| rgH526(H5N1) | HA | 아미노산 | 4 |
실시예 3. 사독백신의 제조방법
상기 실시예 2에서 수득한 rgH526(H5N1)주 (기탁기관: Korea Veterinary Culture Collection, KVCC, 기탁일: 2022년 7월 11일, 기탁번호: VR2200054)를 100개의 9 내지 10일령의 SPF 부환란에 접종 후 37℃ 배양기에서 36 내지 48시간 배양하였다. 배양된 부화란을 4℃에서 6시간 냉장한 후 요막강액을 수득하였다. 수득한 요막강액을 1/10로 농축한 후 농축한 바이러스를 0.01% 포르말린(formalin)으로 4℃에서 12시간 불활화 시켰다.
실험예
실험예 1. rgH526(H5N1)주 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열의 치환 여부 검증
상기 실시예 2에서 수득한 rgH526(H5N1)주의 HA 유전자 치환 여부를 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
유전자 분석에 의한 검증
본 실험예에서는 고병원성 H5N1 조류 인플루엔자 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열(RERRRKR, 339~345번 아미노산 위치)을 일반적인 저병원성 조류인플루엔자 HA 단백질 분절부위의 유전자 배열로 치환함으로써 고병원성 특성이 제거되었음을 검증하였다.
rgH526(H5N1) 백신주로부터 상기 실시예 2.1의 실험방법에 따라 HA 유전자를 PCR로 증폭하여 pHW2000 vector에 클로닝한 후, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용한 Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer로 염기서열을 얻은 다음, CLC workbench 6.0 프로그램(USA)을 이용하여 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 치환되었음을 확인하였다.
실험 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
하기 표6에 나타낸 바와 같이, HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 치환되어, 본 발명의 rgH526(H5N1) 백신주가 저병원성 조류 인플루엔자의 HA 단백질 분절부위의 저병원성 유전자 배열(RETR)을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
| 바이러스주 | 구분 | 염기서열 |
| A/quail/Korea/H526/2021(H5N1) | 핵산 | 5'-AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA-3' |
| 아미노산 | N-말단-RERRRKR--C-말단 | |
| rgH526(H5N1) | 핵산 | 5'-AGAGAAACAAGA-3' |
| 아미노산 | N-말단-RETR-C-말단 |
실험예 2. rgH526(H5N1) 백신주의 안전성 및 면역성 검증
상기 실시예 3에서 수득한 백신의 H5N1 혈청형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 안전성 및 면역성을 확인하기 위하여 SPF 닭을 사용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
SPF 닭을 실제 목적 동물로 사용하기 위해 개발된 백신이므로 고병원성 H5N1 조류 인플루엔자 백신 효능 검정에 사용하였다. 10수의 6주령 SPF 닭의 이두근(biceps muscle)에 1 ml(500 ul/dose: 항원과 부형제가 섞여있는 양) rgH526(H5N1) 조류 인플루엔자 백신 항원을 접종 2주 후, 혈청을 수득하여 항체 역가를 혈구응집억제(HI, Hemagglutination Inhibition) 반응에 의해 검증하였다. 대조군으로 사용한 10 마리의 SPF 닭은 생리식염수를 접종하여 효능 비교하였다.
실험 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 백신을 접종한 10마리의 모든 SPF 닭은 혈구응집억제(HI) 역가 27 이상을 나타냈으며, 사망, 체중 감소 등의 특별한 임상 증상을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
| No. | 백신접종 개체 | 대조군 | ||
| HI 역가 | 폐사/접종수 | HI 역가 | 폐사/접종수 | |
| 1 | 9 | 0/10 | < 1 | 0/10 |
| 2 | 9 | < 1 | ||
| 3 | 10 | < 1 | ||
| 4 | 9 | < 1 | ||
| 5 | 9 | < 1 | ||
| 6 | 8 | < 1 | ||
| 7 | 8 | < 1 | ||
| 8 | 9 | < 1 | ||
| 9 | 9 | < 1 | ||
| 10 | 9 | < 1 | ||
실험예 3. rgH526(H5N1) 조류 인플루엔자 백신주의 효능 검증
상기 실시예 3에서 수득한 rgH526(H5N1) 백신 항원의 효능을 검증하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실험예 3.1. H5N1 공격접종
본 발명의 백신을 접종한 가금류에서의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 면역성을 실제로 확인하고자, SPF 닭을 사용하여 H5N1 공격접종 실험을 수행하였다.
먼저, 10마리의 6주령 SPF 닭의 오른쪽 다리의 이두근에 0.5 ml씩 rgH526(H5N1) 조류 인플루엔자 백신 항원을 접종하였다. 백신 접종에 대한 실험군은 각 처리된 dose에 따라 3개의 군(1 dose, 1/10 dose, 및 1/100 dose)이 사용되었고, 백신을 접종하지 않은 10마리의 비백신 대조군을 음성 대조군으로 함께 사용하였다. 접종 3주 후, A/Quail/Korea/21H526/2021(H5N1, clade 2.3.4.4b)을 공격접종주로 사용하여 106 EID50(Egg Infection Dose)/0.1 ml을 비강 접종하였고, 14일간 생존 및 임상증상 여부를 판정하였다.
실험 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 공격접종된 백신군 중 1 dose와 1/10 dose 군은 모두 14일간 생존하였으며, 1/10 dose, 1/100 dose 및 비백신 대조군에서 각각 3일부터 10일차까지 설사, 녹변, 침울 등의 임상증상이 관찰되었다. 그 중 1/100 dose 및 비백신 대조군에서는 각각 60%, 90%의 폐사가 확인되었다.
| 공격접종주 | A/Quail/Korea/21H526/2021(H5N1, clade 2.3.4.4b) | |||
| 백신 | rgH526(clade 2.3.4.4b) | |||
| 1 dose | 1/10 dose | 1/100 dose | 비백신 대조군 | |
| 0 dpi | ||||
| 1 dpi | ||||
| 2 dpi | ||||
| 3 dpi | 1수 설사 | 2수폐사, 1수녹변 | 4수폐사(청색증) | |
| 4 dpi | ||||
| 5 dpi | 1수 설사 | 2수폐사, 1수녹변 | 2수폐사, 1수침울 | |
| 6 dpi | 1수폐사 | |||
| 7 dpi | 1수폐사 | 2수녹변 | ||
| 8 dpi | ||||
| 9 dpi | ||||
| 10 dpi | 1수녹변+침울 | |||
| 11 dpi | ||||
| 12 dpi | ||||
| 13 dpi | ||||
| 14 dpi | 1수폐사 | |||
| Survival rate | 10/10 | 10/10 | 4/10 | 1/8* |
| PD50 | 68 | |||
실험예 3.2. 조직학적 바이러스 역가 검증
상기 실험예 3.1의 실험방법에 따라 106 EID50/0.1 ml을 비강 접종 후 1, 3, 5, 7, 10 및 14일째(dpi, days post-immunization)에 실험군 및 대조군으로부터 면봉을 이용하여 스왑(swab)을 실시하여 바이러스 역가(log10EID50/0.1 ml)를 측정하였다.
실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
하기 표 9에 나타낸 바와 같이, rgH526(H5N1) 백신 항원을 접종한 실험군 중 1 dose 및 1/10 dose 군에서는 인후두(Oropharyngeal, OP) 및 총배설강(cloacal, CL) 스왑 샘플에서 모두 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스가 검출되지 않은 반면, 1/100 dose 군과 비백신 대조군의 인후두 및 총배설강 스왑 샘플에서 높은 역가의 바이러스가 검출되었음을 확인할 수 있었다.
| challenge | group | swab sample | No. of chickens shedding virus/total on dpi. (logTCID50/0.1mL) |
survival/total | |||||
| 1dpi | 3dpi | 5dpi | 7dpi | 10dpi | 14dpi | ||||
| H5N1 (H526) HP AIV |
1 dose | OP | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 10/10 |
| CL | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | |||
| 1/10 dose | OP | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 10/10 | |
| CL | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | |||
| 1/100 dose | OP | 1/10 (1.3±0.0) |
8/10 (2.0±0.5) |
7/8 (2.5±1.2) |
1/4 (1.5±0.0) |
0/4 | 0/4 | 4/10 | |
| CL | 0/10 | 6/10 (2.1±0.8) |
7/8 (2.3±0.8) |
2/4 (1.4±0.1) |
0/4 | 0/4 | |||
| 비백신 대조군 | OP | 1/8 (1.5±0.0) |
6/8 (1.8±0.4) |
2/6 (4.3±0.0) |
0/4 | 0/4 | 0/2 | 1/8 | |
| CL | 0/8 | 6/8 (2.4±1.1) |
2/6 (3.8±0.0) |
1/4 (1.3±0.0) |
1/4 (2.3±0.0) |
1/2 (1.8±0.0) |
|||
| dpi: days post- immunization; OP: 인후두(Oropharyngeal); CL: 총배설강(cloacal). | |||||||||
Claims (17)
- 다음의 단계를 포함하는 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법:
(a) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(b) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 재조합 플라스미드를 패키징 세포(packaging cell)에 트랙스펙션(transfection)하는 단계; 및
(d) 패키징 세포의 배양 상층액으로부터 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 수득하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/quail/Korea/H526/2021(H5N1)인 것인, H5N1형 유전자 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 저병원성 유전자 배열로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 339번 내지 345번에 위치하는 아미노산 Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg이 Arg-Glu-Thr-Arg으로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 1016번에서 1036번에 뉴클레오타이드 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA가 AGAGAAACAAGA로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34(H1N1)인 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 패키징 세포는 HEK-293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분리된 세포인 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스:
(i) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자; 및
(ii) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
- 제9항에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA 단백질 분절부위의 고병원성 유전자 배열이 저병원성 유전자 배열로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 HA의 339번 내지 345번에 위치하는 아미노산 Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Arg이 Arg-Glu-Thr-Arg으로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스.
- 제9항에 있어서, 상기 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 HA의 1016번에서 1036번에 위치하는 뉴클레오타이드 AGAGAAAGGAGAAGAAAAAGA가 AGAGAAACAAGA로 치환된 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스.
- 제9항에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것인, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스.
- 하기 유전자의 negative-sense ssRNA를 포함하는, H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는, H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스에 대한 백신 조성물:
(i) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 H5N1형 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 HA(hemagglutinin) 유전자; 및
(ii) 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein) 유전자.
- 제14항에 있어서, 상기 H5N1 혈청형 조류 인플루엔자 A 바이러스는 Clade 2.3.4.4b에 속하는 H5형 바이러스의 HA 유전자를 포함하는 것인, 백신 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 유래 PB2(polymerase B2), PB1(polymerase B1), PA(polymerase A), NP(nucleocapsid), NA(neuraminidase), M(matrix protein) 및 NS(non-structural protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 5 내지 11의 뉴클레오타이드 서열로 각각 이루어진 것인, 백신 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 백신 조성물 내 H5N1형 유전자 재조합 조류 인플루엔자 A 바이러스는 불활화 된 것인, 백신 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220153076A KR20240072371A (ko) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 재조합 h5n1 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 이용한 고병원성 조류 인플루엔자 백신 및 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220153076A KR20240072371A (ko) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 재조합 h5n1 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 이용한 고병원성 조류 인플루엔자 백신 및 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240072371A true KR20240072371A (ko) | 2024-05-24 |
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ID=91321049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020220153076A KR20240072371A (ko) | 2022-11-15 | 2022-11-15 | 재조합 h5n1 조류 인플루엔자 바이러스 및 이를 이용한 고병원성 조류 인플루엔자 백신 및 제조방법 |
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| KR (1) | KR20240072371A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190073460A (ko) | 2016-10-21 | 2019-06-26 | 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 | 조류 인플루엔자 바이러스의 항원을 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-11-15 KR KR1020220153076A patent/KR20240072371A/ko unknown
Patent Citations (1)
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