KR20240072334A - Genetically engineered cells and the use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드 또는 이의 단편을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포에 관한 것이다. The present invention relates to cells genetically engineered to express a peptide or fragment thereof capable of inhibiting the transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathway.

Description

유전자 조작된 세포 및 이의 용도 {Genetically engineered cells and the use thereof}Genetically engineered cells and the use thereof}

본 발명은 면역 요법에 의해 암 등의 질환에 대한 치료 효과가 증대되도록, 유전적으로 조작시킨 면역 이펙터 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to genetically engineered immune effector cells and uses thereof to increase the therapeutic effect for diseases such as cancer by immunotherapy.

세포 면역치료는 암 치료에 있어서 매우 장래성이 있는 치료법이다. 그러나, 대부분의 면역치료학적 접근법은 고형 종양을 비롯한 대부분의 악성 종양에 대한 치료 효과에 아래와 같은 제한점이 있다: (1) 종양 세포 표면 상의 종양 항원의 발현 감소 (이는 면역계에 의한 항원의 검출을 감소시킴); (2) PD1, NKG2A, TIGIT와 같은 억제성 수용체에 대한 리간드의 발현; (3) 면역 세포 비활성화를 유도하는 CISH와 같은 세포성 체크포인트의 상향조절; 및 (4) 면역 반응을 억제하여 종양 세포 증식과 생존률을 촉진하는 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 및 아데노신과 같은 물질들을 방출하는 미시적 환경의 유도 등이 있다. 따라서, 상기한 당면과제들 중 적어도 하나라도 해결할 수 있는 세포 면역치료의 개선된 방법이 필요한 실정이다.Cellular immunotherapy is a very promising treatment method for cancer treatment. However, most immunotherapeutic approaches have the following limitations in their therapeutic effectiveness against most malignant tumors, including solid tumors: (1) Reduced expression of tumor antigens on the surface of tumor cells (which reduces detection of antigens by the immune system) Sikkim); (2) expression of ligands for inhibitory receptors such as PD1, NKG2A, and TIGIT; (3) upregulation of cellular checkpoints, such as CISH, leading to immune cell deactivation; and (4) induction of a microscopic environment that releases substances such as transforming growth factor-β (TGF-β) and adenosine, which suppress immune responses and promote tumor cell proliferation and survival. Therefore, there is a need for an improved method of cellular immunotherapy that can solve at least one of the above-mentioned challenges.

한편, TGF-β 신호전달은 암 진행에 중요한 역할을 한다. 대부분의 암 세포는 상피 항증식 반응을 비활성화하고 유전자 발현, 면역억제 사이토카인의 방출 및 상피 가소성에 대한 효과를 통해 증가된 TGF-β 발현 및 자가분비 TGF-β 신호로부터 이익을 얻고 있다. 그 결과, 암 세포에 있어서 TGF-β는 암 세포의 침윤 및 전이와, 줄기세포적 성질과 약제 내성을 증가시키는 역할을 한다. 종양 미세환경에서 암 세포, 기질 섬유아세포 및 기타 세포에서 방출되는 TGF-β는 종양의 구조를 형성하고 면역 세포의 항종양 활성을 억제함으로써 암 진행을 더욱 촉진하고, 따라서 면역억제 환경을 생성하여 항암 면역 요법의 효능을 예방하거나 약화시킨다. 따라서 TGF-β 신호전달의 억제는 TGF-β에 반응하지 않는 암 세포를 포함하는 종양을 포함하여 현재 및 향후 면역 요법의 효능을 향상시키기 위한 전제 조건 및 주요 수단으로 간주된다.Meanwhile, TGF-β signaling plays an important role in cancer progression. Most cancer cells benefit from increased TGF-β expression and autocrine TGF-β signaling through inactivation of epithelial antiproliferative responses and effects on gene expression, release of immunosuppressive cytokines, and epithelial plasticity. As a result, in cancer cells, TGF-β plays a role in increasing invasion and metastasis of cancer cells, stem cell properties, and drug resistance. TGF-β released from cancer cells, stromal fibroblasts and other cells in the tumor microenvironment further promotes cancer progression by shaping the structure of the tumor and suppressing the anti-tumor activity of immune cells, thus creating an immunosuppressive environment and anti-cancer. Prevents or attenuates the effectiveness of immunotherapy. Therefore, inhibition of TGF-β signaling is considered a prerequisite and key means to improve the efficacy of current and future immunotherapies, including for tumors containing cancer cells that are unresponsive to TGF-β.

본 발명의 일 목적은 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작시킨 면역 이펙터 세포를 제공하고자 한다. One object of the present invention is to provide immune effector cells that are genetically engineered to express a peptide capable of inhibiting the transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathway.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같이 유전적으로 조작된 세포를 제작하는 방법을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a method for producing genetically engineered cells as described above.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 세포 치료제 또는 다양한 용도의 약학 조성물을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent or pharmaceutical composition for various uses containing the genetically engineered cells.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드 또는 이의 단편을 발현하도록 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포에 관한 것이다. According to one embodiment of the present invention, it relates to immune effector cells genetically engineered to express a peptide or fragment thereof capable of inhibiting the transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathway.

본 발명에서 상기 "전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β)"란, TGF-β 초가계에 속하는 사이토카인으로서, 포유류에서 발현되는 TGF-β의 형태로는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 3가지가 알려져 있다. 상기 TGF-β에 의한 신호 전달은 다양한 생물학적 과정에서 결정적인 역할을 하며 세포 성장 억제, 세포 사멸, 분화 및 상피-간충직 전이 (epithelial-mesenchymal transition; EMT)와 같은 다양한 기능을 수행한다. TGF-β 신호전달계는 엄격하게 조절되며 세포 항상성의 유지와 더불어 발생 및 기관 형성에 결정적인 역할을 한다. 따라서 TGF-β 신호전달의 교란은 암, 섬유증 및 선천성 기형과 같은 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다. In the present invention, the "transforming growth factor-β (TGF-β)" refers to a cytokine belonging to the TGF-β family. The forms of TGF-β expressed in mammals include TGF-β1 and TGF-β. Three are known: -β2 and TGF-β3. Signal transduction by TGF-β plays a critical role in various biological processes and performs various functions such as cell growth inhibition, apoptosis, differentiation, and epithelial-mesenchymal transition (EMT). The TGF-β signaling system is tightly regulated and plays a critical role in development and organ formation as well as maintaining cellular homeostasis. Therefore, disruption of TGF-β signaling can cause life-threatening diseases such as cancer, fibrosis, and congenital malformations.

본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.In the present invention, the peptide may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

본 발명에서 상기 펩타이드를 암호화하는 서열은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있다. In the present invention, the sequence encoding the peptide may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명에서 상기 펩타이드는 TGF-β 수용체(TGFBR1 및/또는 TGFBR2)에 결합하여 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 TGF-β와 경쟁하여 TGF-β 수용체에 결합함으로써 TGF-β 사이토카인이 TGF-β 수용체에 결합하는 것을 방해하는 기전을 통해 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.In the present invention, the peptide may bind to the TGF-β receptor (TGFBR1 and/or TGFBR2) to inhibit TGF-β signaling. Specifically, the peptide competes with TGF-β and binds to the TGF-β receptor. It may be that TGF-β signaling is inhibited through a mechanism that prevents TGF-β cytokines from binding to the TGF-β receptor.

또한, 상기 펩타이드는 세포의 TGF-β 발현 수준 자체를 억제시켜 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 자가-억제 경로(auto-inhibition pathway)를 통해 세포 내의 TGF-β 발현 수준을 감소시키거나, TGF-β의 세포외 배출량을 감소시키는 기전을 통해 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.In addition, the peptide may inhibit TGF-β signaling by suppressing the expression level of TGF-β in cells. Specifically, the peptide may inhibit TGF-β signaling in cells through an auto-inhibition pathway. It may be suppressing TGF-β signaling through a mechanism that reduces the expression level or reduces the extracellular emissions of TGF-β.

본 발명에서 상기 세포는 면역 이펙터 세포일 수 있다. 여기서, 상기 "면역 이펙터 세포"는 면역 이펙터 반응을 촉진하는 것과 같은 면역 반응에 참여하는 림프구 세포일 수 있다. In the present invention, the cells may be immune effector cells. Here, the “immune effector cell” may be a lymphoid cell that participates in an immune response, such as promoting an immune effector response.

본 발명에서 상기 "림프구(lymphocytes)"는 흔히 림프에서 발견되고, 그리고 자연살해 세포(NK 세포), T 세포, 및 B 세포를 포함하는 세포를 지칭한다. 당업계의 숙련자라면 상기에 나열된 면역세포 유형들이 아형으로 더 나눠질 수 있음을 이해할 것이다.As used herein, the term “lymphocytes” refers to cells that are commonly found in lymph and include natural killer cells (NK cells), T cells, and B cells. Those skilled in the art will understand that the immune cell types listed above can be further divided into subtypes.

본 발명의 일 예시에서 상기 림프구는 자연살해세포(Natural Killer Cells; NK cells)이거나 이를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the lymphocytes may be or include Natural Killer Cells (NK cells), but are not limited thereto.

본 발명에서 상기 "자연살해세포(Natural Killer Cells; NK cells)"는 큰 과립 림프구 (LGL)로 정의되며, 일반적인 림프 전구세포-생성 B 및 T 림프구로부터 분화되는 3종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화되고 성숙하여 순환계로 진입하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명에서 상기 NK 세포로는 어떠한 종류의 NK 세포라도 제한없이 포함될 수 있으며, 예컨대, 배양된 NK 세포, 예를 들면, 일차 NK 세포, 배양된 NK 세포주로부터의 NK 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 NK 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. NK 세포가 포유동물로부터 수득되는 경우, NK 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 공급원들로부터 수득될 수 있다. NK 세포는 농축될 수도 있거나 정제될 수도 있다. NK 세포는 바람직하게는 인간 NK 세포일 수 있다(예를 들면, 인간으로부터 단리될 수 있다). NK 세포주는 예를 들면, ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 입수가능하고, 예를 들면, NK-92 세포(ATCC CRL-2407), NK92MI 세포(ATCC CRL-2408) 또는 이들의 유도체 등을 포함한다.In the present invention, the "Natural Killer Cells (NK cells)" are defined as large granular lymphocytes (LGL), which constitute three types of cells differentiated from common lymphoid progenitor cells-producing B and T lymphocytes. NK cells are known to differentiate and mature in the bone marrow, lymph nodes, spleen, tonsils, and thymus and enter the circulation. In the present invention, the NK cells may include any type of NK cell without limitation, for example, cultured NK cells, such as primary NK cells, NK cells from a cultured NK cell line, or NK cells obtained from a mammal. It may be an NK cell, but is not limited thereto. When NK cells are obtained from a mammal, the NK cells can be obtained from a number of sources, including but not limited to blood, bone marrow, lymph nodes, thymus, or other tissues or body fluids. NK cells may be concentrated or purified. The NK cells may preferably be human NK cells (eg, isolated from humans). NK cell lines are available, for example, from ATCC (American Type Culture Collection) and include, for example, NK-92 cells (ATCC CRL-2407), NK92MI cells (ATCC CRL-2408) or derivatives thereof, etc. .

본 발명에서 펩타이드와 관련하여 본 명세서에 사용된 "재조합" 또는 "조작"은 펩타이드를 암호화하는 핵산 및 펩타이드를 발현하는 세포 또는 유기체에 대한 유전공학 기술의 적용 결과로 변경된 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다. 핵산과 관련하여, 용어 "재조합" 또는 "조작"은 유전공학 기술의 적용 결과로 변경된 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. 유전공학 기술은 PCR 및 DNA 클로닝 기술; 형질주입, 형질도입, 형질전환 및 다른 유전자 전달 기술; 상동 재조합; 부위-특이적 돌연변이; 및 유전자 융합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. As used herein, “recombinant” or “manipulated” in relation to a peptide means having an amino acid sequence that has been altered as a result of the application of genetic engineering techniques to the nucleic acid encoding the peptide and to the cell or organism expressing the peptide. . With regard to nucleic acids, the terms “recombinant” or “engineered” mean having a nucleic acid sequence that has been altered as a result of the application of genetic engineering techniques. Genetic engineering technologies include PCR and DNA cloning technologies; Transfection, transduction, transformation and other gene transfer techniques; homologous recombination; site-specific mutation; and gene fusions.

본 발명에서 상기 "유전자 조작된 (engineered)" 또는 "유전적으로 조작된"이라는 용어는 게놈 DNA 서열이 재조합 기술에 의해 의도적으로 변형된 세포 또는 유기체, 또는 이의 조상을 의미한다. 본 발명에서 상기 "유전자 조작"은 "유전자 이식"을 포함한다.As used herein, the term “genetically engineered” or “genetically engineered” refers to a cell or organism, or an ancestor thereof, whose genomic DNA sequence has been intentionally modified by recombinant technology. In the present invention, the “genetic manipulation” includes “gene transplantation.”

본 발명에서 상기 면역 이펙터 세포에서 상기 펩타이드 또는 그 단편이 발현되도록 유전적으로 조작하는 방법으로는, 벡터, 특이적 수용체 또는 세포 융합법 등의 생물학적 방법, 마이크로 인젝션법, 일렉트로포레이션법, 유전자총 또는 초음파 유전자 도입법 등의 물리적 방법, 또는 인산칼슘 공침전법, 리포솜법, 리포펙션법, DEAE 덱스트런법, 또는 알칼리 금속법 등의 화학적 방법을 통하여 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 유전자를 도입하는 방법에 의할 수 있다. 상기 방법들이나 그 외에 다양한 기법이 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 개시되어 있다. 바람직하게는 본 발명에서는 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 면역 이펙터 세포에 형질 감염시켜 상기 세포에 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 외래 유전자를 도입할 수 있다.In the present invention, methods for genetically manipulating the expression of the peptide or its fragment in the immune effector cell include biological methods such as vector, specific receptor or cell fusion methods, microinjection method, electroporation method, gene gun or A method of introducing a gene encoding the peptide or its fragment through a physical method such as the ultrasonic gene introduction method, or a chemical method such as the calcium phosphate coprecipitation method, liposome method, lipofection method, DEAE dextran method, or alkali metal method. It can be based on . These methods and various other techniques are known to those skilled in the art, see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Preferably, in the present invention, a vector containing a gene encoding the peptide or its fragment can be transfected into the immune effector cell to introduce a foreign gene encoding the peptide or its fragment into the cell.

본 발명에서 상기 "벡터"란, 적당한 숙주 세포에 형질 주입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 여기서, 상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.In the present invention, the "vector" refers to a recombinant vector that can be transfected into a suitable host cell to express a protein of interest, and refers to a genetic construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. Here, the term “operably linked” means that the nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the protein of interest are functionally linked to perform a general function. Operational linkage with a recombinant vector can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cutting and ligation can be easily performed using enzymes generally known in the art. there is.

본 발명에서 상기 외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 나노입자, 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 이용될 수 있다. In the present invention, various types of vectors such as nanoparticles, plasmids, viruses, and cosmids can be used as recombinant expression vectors for inserting the foreign genes. The type of recombinant vector is not particularly limited as long as it functions to express the desired gene and produce the desired protein in various host cells of prokaryotic and eukaryotic cells, but specifically, it has a highly active promoter and strong expression ability while maintaining a natural state. Vectors that can produce large quantities of foreign proteins of a similar form can be used.

다양한 유전자 전달 비히클은 당 분야에 공지되어 있으며, 바이러스 및 비-바이러스(예를 들어, 네이키드 DNA, 플라스미드) 벡터 둘 모두를 포함한다. 유전자 전달에 적합한 바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 바이러스 벡터의 비제한적 예시로는 레트로바이러스 벡터 (몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도), 이의 복제 컴피턴트, 복제 결여 및 무기력한 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인 바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터, 파보바이러스 벡터, 소아 마비 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 마라바 바이러스 벡터 및 그룹 B 아데노바이러스 에나데노툭시레브 벡터 등을 포함할 수 있다.A variety of gene delivery vehicles are known in the art and include both viral and non-viral (e.g., naked DNA, plasmid) vectors. Viral vectors suitable for gene transfer are known to those skilled in the art. Non-limiting examples of the viral vectors include retroviral vectors (derived from Moloney murine leukemia virus vector (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV, etc.), lentiviral vectors (e.g., HIV-1, HIV-2) , derived from SIV, BIV, FIV, etc.), adenovirus (Ad) vectors, including replication-competent, replication-deficient and anergic forms thereof, adeno-associated virus (AAV) vectors, simian virus 40 (SV-40) vectors , bovine papilloma virus vector, Epstein Barr virus vector, herpes virus vector, chicken pox virus vector, Harvey rat sarcoma virus vector, rat mammary tumor virus vector, Rous sarcoma virus vector, parvovirus vector, polio virus vector, vesicular stomatitis virus vector. , Maraba virus vector, Group B adenovirus enadenotuxirev vector, etc.

유전자 전달을 위한 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA, 플라스미드, 트랜스포존 및 mRNA 등을 포함한다. 비제한적인 예는 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, Calif.), pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, Mass.)를 포함한다. Non-viral vectors for gene transfer include naked DNA, plasmids, transposons, and mRNA. Non-limiting examples include pKK plasmid (Clonetech), pUC plasmid, pET plasmid (Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET or pREP plasmid (Invitrogen, San Diego, Calif.), pMAL plasmid (New England Biolabs, Beverly , Mass.).

본 발명에서 상기 벡터는 본원에 개시되거나 인용되거나 관련 기술 분야의 당업자에게 달리 공지된 방법을 사용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다.The vectors in the present invention can be introduced into many suitable host cells using methods disclosed or cited herein or otherwise known to those skilled in the art.

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 또는 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 본 발명에서 상기 "프로모터"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자와 같은 암호화 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 나타낸다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적, 유도성, 억제성, 또는 조직-특이적일 수 있다. 프로모터는 전사의 시작 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열이다. 본 발명에서 상기 프로모터의 비-제한적 예시로는 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus: RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, EF1알파 짧은 형태 (EFS) 프로모터, 인간 폴리펩타이드 사슬 연장 인자 (EF1a) 프로모터, P5 프로모터, Ubc 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C (UbiC), H1 프로모터, U6 프로모터, 알파-1-안티트립신 프로모터, 비장 병소 형성 바이러스 (spleen focus-forming virus: SFFV) 프로모터 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 프로모터는 전사 효율을 증가시키기 위해 인핸서에 커플링될 수 있다. 이때 상기 인핸서의 비-제한적 예시로는 RSV 인핸서, CMV 인핸서, 또는 α-태아 단백질 MERII 인핸서 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. A suitable expression vector of the present invention may include a base sequence encoding a signal peptide for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, start codon, stop codon, polyadenylation signal, or enhancer. The initiation codon and stop codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be functional in the subject when the genetic construct is administered and must be in frame with the coding sequence. In the present invention, the "promoter", as used herein, refers to any sequence that regulates the expression of a coding sequence, such as a gene. Promoters can be, for example, constitutive, inducible, repressible, or tissue-specific. A promoter is a control sequence, a region of polynucleotide sequence where the initiation and rate of transcription is controlled. Non-limiting examples of the promoters in the present invention include Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter (optionally with RSV enhancer), cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, dihydrofolate reductase Promoter, β-actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, U6 promoter, EF1alpha short form (EFS) promoter, human polypeptide chain elongation factor (EF1a) promoter, P5 promoter, Ubc promoter, CAG promoter, TRE promoter , UAS promoter, Ac5 promoter, polyhedrin promoter, CaMKIIa promoter, Gal1 promoter, TEF1 promoter, GDS promoter, ADH1 promoter, CaMV35S promoter, ubiquitin (Ubi) promoter such as ubiquitin C (UbiC), H1 promoter, U6 promoter, alpha- 1-Antitrypsin promoter, spleen focus-forming virus (SFFV) promoter, etc. may be included. Additionally, in the present invention, the promoter can be coupled to an enhancer to increase transcription efficiency. At this time, non-limiting examples of the enhancer may include, but are not limited to, the RSV enhancer, the CMV enhancer, or the α-fetoprotein MERII enhancer.

본 발명의 일 예시에서, 상기 프로모터는 SSFV 프로모터일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 SSFV 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the promoter may be the SSFV promoter, preferably the SSFV promoter represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 면역 이펙터 세포에 도입되는 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트), 혹은 이를 포함하는 벡터는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 함유할 수 있다. In the present invention, a polynucleotide (or gene construct) encoding the peptide or fragment thereof introduced into the immune effector cell, or a vector containing the same, may contain a sequence encoding a signal peptide.

본 발명에서 상기 "신호 펩타이드"는 "리더 서열"이라고도 불리우는 것으로, 본 발명에서 나타낸 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩타이드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 위치선정을 지시한다. 본 발명에서 이용된 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 종종 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다. 본 발명에서 상기 신호 펩타이드의 비제한적 예시로는 IL-2 신호 펩타이드, CD8 신호 펩타이드 (아미노산 21개), CD33 신호 펩타이드 (아미노산 17개), CD4 신호 펩타이드 (아미노산 25개), IL-2R (CD25) 신호 펩타이드 (아미노산 21개), 트립시노겐-2 신호 펩타이드 (아미노산 15개), VEGFR1 신호 펩타이드 (아미노산 26개), EGFR 신호 펩타이드 (아미노산 24개), GMCSFR 신호 펩타이드 (아미노산 22개), IgVL 신호 펩타이드, IgVK 신호 펩타이드 또는 Ig VH 신호 펩타이드 등일 수 있다. In the present invention, the "signal peptide" is also called a "leader sequence" and represents an amino acid sequence that can be linked to the amino terminus of the protein shown in the present invention. A signal peptide/leader sequence typically directs protein positioning. The signal peptide/leader sequence used in the present invention preferably promotes secretion of the protein from the cell in which it is produced. The signal peptide/leader sequence is often cleaved from the remainder of the protein, often referred to as the mature protein, upon secretion from the cell. A signal peptide/leader sequence is linked to the N terminus of the protein. Non-limiting examples of the signal peptide in the present invention include IL-2 signal peptide, CD8 signal peptide (21 amino acids), CD33 signal peptide (17 amino acids), CD4 signal peptide (25 amino acids), and IL-2R (CD25 signal peptide). ) signal peptide (21 amino acids), trypsinogen-2 signal peptide (15 amino acids), VEGFR1 signal peptide (26 amino acids), EGFR signal peptide (24 amino acids), GMCSFR signal peptide (22 amino acids), IgVL It may be a signal peptide, an IgVK signal peptide, or an Ig VH signal peptide.

본 발명의 일 예시에서 상기 신호 펩타이드는 IL-2 신호 펩타이드일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 신호 펩타이드이거나, 서열번호 7로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 신호 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the signal peptide may be an IL-2 signal peptide, preferably the signal peptide represented by SEQ ID NO: 6, or the signal peptide encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. It is not limited to this.

본 발명에서 상기 면역 이펙터 세포에 도입되는 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트), 혹은 이를 포함하는 벡터는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어 하나 이상의 마커 및/또는 하나 이상의 이펙터 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. In the present invention, the polynucleotide (or gene construct) encoding the peptide or fragment thereof introduced into the immune effector cell, or the vector containing the same, may include one or more additional polypeptides, for example, one or more markers and/or one It may include a polynucleotide encoding one or more effector molecules.

본 발명에서 상기 하나 이상의 마커는 형질 도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는, 예컨대 전달된 세포의 생존 능력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예컨대 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위해 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하는 핵산 서열; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성 양성 선택 가능 마커의 음성 선택 가능 마커와의 융합에서 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992008796 및 WO 1994028143] 및 미국 특허 번호 제6,040,177호를 참조할 수 있다.In the present invention, the one or more markers may include a transduction marker, a surrogate marker, and/or a selection marker. For example, among the additional nucleic acid sequences introduced, encoding one or more additional polypeptides, may be nucleic acid sequences that can improve the efficacy of the therapy, such as by promoting the viability and/or function of the transferred cells; Nucleic acid sequences that provide genetic markers for evaluation and/or selection of cells, such as to assess survival or localization in vivo; Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); Reference may also be made to literature [WO 1992008796 and WO 1994028143] and US Patent No. 6,040,177, which describe the use of bifunctional selectable fusion genes derived from the fusion of a dominant positive selectable marker with a negative selectable marker.

본 발명에서 상기 마커는 형질 도입 마커 또는 대리 마커일 수 있다. 상기 형질 도입 마커 또는 대리 마커는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트), 즉 본 발명의 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 여기서, 상기 형질 도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있고, 상기 대리 마커는 상기 펩타이드 또는 단편과 함께 세포 표면 상에 공발현되도록 제조된 단백질일 수 있다. 본 발명에서 상기 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질일 수 있다. 본 발명에서, 상기 대리 마커는 상기 펩타이드 또는 단편을 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 암호화될 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산 서열은, 선택적으로 자가 절단 펩타이드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩타이드, 예컨대 2A 서열을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다. In the present invention, the marker may be a transduction marker or a surrogate marker. The transduction marker or surrogate marker can be used to detect cells into which a polynucleotide (or gene construct) of the present invention, that is, a polynucleotide containing a sequence encoding the peptide of the present invention or a fragment thereof, has been introduced. Here, the transduction marker may indicate or confirm transformation of the cell, and the surrogate marker may be a protein prepared to be co-expressed on the cell surface together with the peptide or fragment. In the present invention, the surrogate marker may be a surface protein modified to have little or no activity. In the present invention, the surrogate marker may be encoded on the same polynucleotide encoding the peptide or fragment. In the present invention, the nucleic acid sequence encoding the peptide or fragment thereof may optionally be operably linked to a nucleic acid encoding a self-cleaving peptide or a peptide that causes ribosome skipping, such as a 2A sequence.

본 발명에서 상기 예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태, 예컨대 비기능적이며 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의한 신호 또는 이에 의해 일반적으로 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단형 세포 표면 폴리펩타이드는, 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태, 예컨대 절단형 인간 표피 성장 인자 수용체 2(truncated human epidermal growth factor receptor 2, tHER2), 절단형 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 또는 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA) 또는 이의 변형된 형태, 예컨대 절단형 PSMA(tPSMA)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다. 일부 측면에서, 마커, 예를 들어 대리 마커는, CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단형 CD19, 예를 들어 절단형 비-인간 CD19를 포함한다. In the present invention, the exemplary surrogate marker is a truncated form of a cell surface polypeptide, e.g., a non-functional, non-functional, full-length form of the cell surface polypeptide that cannot or will not transmit and/or will be internalized to transmit signals or signals normally transmitted by the cell surface polypeptide. It may contain truncated forms that cannot or are not internalized. Exemplary truncated cell surface polypeptides include truncated forms of growth factors or other receptors, such as truncated human epidermal growth factor receptor 2 (tHER2), truncated epidermal growth factor receptor (tEGFR), or It may include prostate-specific membrane antigen (PSMA) or a modified form thereof, such as truncated PSMA (tPSMA). In some aspects, tEGFR may contain an epitope recognized by the antibody cetuximab (Erbitux) or other therapeutic anti-EGFR antibody or binding molecule, which identifies cells engineered with the tEGFR construct and the encoded exogenous protein. or to select and/or remove or isolate cells expressing the encoded exogenous protein. See US Pat. No. 8,802,374 and Liu et al., Nature Biotech. April 2016; 34(4): 430-434]. In some aspects, the marker, e.g., a surrogate marker, includes all or part of CD34 (e.g., a truncated form), NGFR, CD19, or truncated CD19, e.g., truncated non-human CD19.

본 발명에서 상기 마커는 검출 가능한 단백질, 예컨대 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP) 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화되고 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 이의 변이체이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, 대장균 유래 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타제, 분비 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT), β-갈락토시다제 또는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS)이거나 이를 포함한다. 상기 효소의 발현은, 효소의 발현 및 기능적 활성 시 검출될 수 있는 기질의 첨가로 검출될 수 있다.In the present invention, the marker is a detectable protein, such as a fluorescent protein, such as green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), such as super-fold GFP. , sfGFP), red fluorescent protein (RFP), such as tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed or DsRed2, cyan fluorescent protein (CFP), blue green fluorescent protein (BFP) ), enhanced blue fluorescent protein (EBFP) yellow fluorescent protein (YFP) and its variants, including species variants, monomer variants and codon-optimized, stabilized and/or enhanced variants of fluorescent proteins. It may be or contain a variant. In addition, in the present invention, the marker is an enzyme such as luciferase, E. coli-derived lacZ gene, alkaline phosphatase, secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP), chloramphenicol acetyl transferase (CAT), and β-gal. It is or includes lactosidase or β-glucuronidase (β-glucuronidase, GUS). Expression of the enzyme can be detected by addition of a substrate that can be detected upon expression and functional activity of the enzyme.

본 발명의 일 예시에서 상기 마커는 그린 형광 단백질(GFP)일 수 있고, 바람직하게는 상기 마커는 서열번호 4로 표시되는 그린 형광 단백질(GFP)이거나, 서열번호 5로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 그린 형광 단백질(GFP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the marker may be green fluorescent protein (GFP), preferably the marker is green fluorescent protein (GFP) represented by SEQ ID NO: 4, or encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5. It may be green fluorescent protein (GFP), but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 마커는 선택 마커일 수 있다. 상기 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드거나 이를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있고, 비제한적 예시로는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나 이를 포함할 수 있다.In the present invention, the marker may be a selection marker. The selection marker may be or include a polypeptide that confers resistance to an exogenous agent or drug. In the present invention, the selection marker may be an antibiotic resistance gene, non-limiting examples include a puromycin resistance gene, hygromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, neomycin resistance gene, geneticin resistance gene, or zeocin. It may be or contain a resistance gene or a modified form thereof.

본 발명의 일 예시에서 상기 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트)는 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 면역 이펙터 세포에 벡터를 통하여 도입될 수 있다. In one example of the present invention, the polynucleotide (or gene construct) may include a base sequence encoding the peptide or a fragment thereof and a base sequence encoding one or more additional polypeptides, and the polynucleotide may be used to It can be introduced into effector cells via vectors.

본 발명의 다른 예시에서 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열과 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어 마커 및/또는 이펙터 분자를 암호화하는 염기 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트)에 포함될 수 있다. In another example of the present invention, the base sequence encoding the peptide or fragment thereof and the base sequence encoding one or more additional polypeptides, such as marker and/or effector molecules, are included in one polynucleotide (or gene construct). may be included.

본 발명의 또 다른 예시에서, 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열과 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어 마커 및/또는 이펙터 분자를 암호화하는 염기 서열은 각각 상이한 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트)에 포함될 수 있다. 예를 들어, 2개의 별도의 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트)가 제공되고, 각각은 세포 내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. In another example of the present invention, the base sequence encoding the peptide or fragment thereof and the base sequence encoding one or more additional polypeptides, such as marker and/or effector molecules, are each different polynucleotides (or gene constructs) ) can be included. For example, two separate polynucleotides (or gene constructs) are provided, and each can be individually delivered or introduced into a cell for intracellular expression.

본 발명의 또 다른 예시에서, 하나의 벡터 또는 발현 작제물은 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열을 포함하고, 별도의 다른 벡터 또는 발현 작제물은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다. In another example of the present invention, one vector or expression construct includes a base sequence encoding the peptide or fragment thereof, and another vector or expression construct contains a base sequence encoding one or more additional polypeptides. It can be included.

본 발명의 또 다른 예시에서, 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열은 하나의 벡터에 포함될 수 있으나, 이때 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산과 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 하나의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상류에 존재할 수 있고, 혹은 상기 펩타이드 그 단편을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 하류에 존재할 수 있다.In another example of the present invention, the base sequence encoding the peptide or its fragment and the base sequence encoding one or more additional polypeptides may be included in one vector, but in this case, the nucleic acid encoding the peptide or its fragment is one Nucleic acids encoding one or more additional polypeptides may be operably linked to a promoter. In the present invention, the nucleic acid encoding the peptide or fragment thereof may be upstream of the nucleic acid encoding one or more additional polypeptides, or the nucleic acid encoding the peptide fragment may be downstream of the nucleic acid encoding one or more additional polypeptides. can exist in

본 발명의 또 다른 예시에서, 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 염기 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열은 하나의 벡터에 포함될 수 있으나, 이때 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산과 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 2개 이상의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상류에 존재할 수 있고, 혹은 상기 펩타이드 그 단편을 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 하류에 존재할 수 있다.In another example of the present invention, the base sequence encoding the peptide or its fragment and the base sequence encoding one or more additional polypeptides may be included in one vector, but in this case, the nucleic acid encoding the peptide or its fragment is one Nucleic acids encoding these additional polypeptides may be operably linked to two or more different promoters. In the present invention, the nucleic acid encoding the peptide or fragment thereof may be upstream of the nucleic acid encoding one or more additional polypeptides, or the nucleic acid encoding the peptide fragment may be downstream of the nucleic acid encoding one or more additional polypeptides. can exist in

본 발명에서 상기 면역 이펙터 세포에 도입되는 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트), 혹은 이를 포함하는 벡터가 하나 이상의 마커 및/또는 하나 이상의 이펙터 분자를 암호화하는 염기 서열을 포함하는 경우, 자가-절단성 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다. In the present invention, a polynucleotide (or gene construct) encoding the peptide or fragment thereof introduced into the immune effector cell, or a vector containing the same, has a base sequence encoding one or more markers and/or one or more effector molecules. If included, it may further include a nucleic acid sequence encoding a self-cleavable peptide.

본 발명에서 상기 "자가-절단성 펩타이드(self-cleavage peptide)"란, 세포 내에서 합성되는 단백질의 절단을 유도할 수 있는 10개 내지 50개, 12개 내지 42개, 14개 내지 34개, 16개 내지 26개 또는 18개 내지 22개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다. 상기 자가-절단성 펩타이드는 바이러스 유전자의 2A 영역(region)에서 유래된 것일 수 있다. 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A, E2A, F2A 또는 T2A로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 자가-절단성 펩타이드 대신 세포질 내 존재하는 분해효소에 의해 절단되는 펩타이드를 사용할 수 있다.In the present invention, the "self-cleavage peptide" refers to 10 to 50, 12 to 42, 14 to 34 peptides that can induce cleavage of proteins synthesized within cells. It refers to a peptide consisting of 16 to 26 or 18 to 22 amino acids. The self-cleaving peptide may be derived from the 2A region of the viral gene. The self-cleaving peptide may be derived from P2A, E2A, F2A or T2A. Specifically, the self-cleaving peptide may be derived from P2A. Additionally, instead of the self-cleaving peptide, a peptide that is cleaved by a degrading enzyme present in the cytoplasm can be used.

본 발명의 일 예시에서, 상기 자가-절단성 펩타이드는 P2A 또는 그 유래의 펩타이드일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 P2A이거나, 서열번호 9로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 P2A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the self-cleavable peptide may be P2A or a peptide derived therefrom, and is preferably P2A represented by SEQ ID NO: 8, or P2A encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9. However, it is not limited to this.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포를 유효 성분으로 포함하는, 세포 치료제에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to a cell therapeutic agent comprising the genetically engineered immune effector cells provided by the present invention as an active ingredient.

본 발명에서 상기 "세포 치료제"는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제로, 암의 억제를 위해 사용되는 치료제를 의미한다. 상기 면역 이펙터 세포, 예를 들어 유전적으로 변형된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하면 암의 치료 및 예방을 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다.In the present invention, the “cell therapy” refers to a treatment using autologous, allogenic, or xenogenic cells to restore tissue function, and is used to suppress cancer. If the immune effector cells, for example, genetically modified natural killer cells, are included as active ingredients, they can be used as a cell therapy for the treatment and prevention of cancer.

본 발명에서 상기 세포 치료제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.In the present invention, the cell therapeutic agent may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier may be, for example, saline solution, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, HSA (Human serum albumin), and a mixture of one or more of these ingredients. Other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added as needed.

본 발명에서 상기 세포 치료제는 그 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황(含硫)환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다. 상기 현탁제의 예로는, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라간트말, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, if necessary depending on the formulation, the cell therapeutic agent may be used as a suspending agent, solubilizing agent, stabilizer, isotonic agent, preservative, anti-adsorption agent, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, analgesic agent, buffer, sulfur-containing agent, etc.硫) Reducing agents, antioxidants, etc. can be added appropriately. Examples of the suspending agent include, but are not limited to, methylcellulose, polysorbate 80, hydroxyethylcellulose, gum arabic, traganmal, sodium carboxymethylcellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, etc. no.

본 발명에서 상기 용액 보조제로는, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리소르베이트 80, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 메크로골, 피마자유지방산에틸에스테르 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타황산나트륨 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the solution auxiliary agent includes polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, mecrogol, castor oil fatty acid ethyl ester, etc. Stabilizers include, but are not limited to, dextran 40, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, and sodium metasulfate.

본 발명에서 상기 등장화제로는, 예를 들어 D-만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the isotonic agent includes, for example, D-mannitol, sorbitol, etc., but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 보존제로는, 예를 들어 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the preservative includes, for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol, etc., but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 흡착방지제로는, 예를 들어 인간혈청알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥사이드프로필렌옥사이드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the anti-adsorption agent includes, for example, human serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyethylene glycol, etc. , but is not limited to this.

본 발명에서 상기 함황환원제로는, 예를 들어 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥토산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소원자수 1~7 의티오알칸산 등의 술푸히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the sulfur-containing reducing agent includes, for example, N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctoic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, sodium thiosulfate, Examples include those having a sulfuhydryl group such as glutathione and thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms, but are not limited thereto.

본 발명에서 상기 산화방지제로는, 예를 들어 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the antioxidants include, for example, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, α-tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, L-ascorbic acid palmitate, Chelating agents such as L-ascorbate stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or sodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate may be included, but are limited thereto. It doesn't work.

본 발명에서 상기 세포 치료제는 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000 세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.In the present invention, the cell therapeutic agent is used, for example, based on an adult patient weighing 70 kg, about 1,000 to 10,000 cells/time, 1,000 to 100,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000. , 1,000~100,000,000 cells/time, 1,000~1,000,000,000 cells/time, 1,000~10,000,000,000 cells/circuit, can be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals, or can be administered multiple times at regular time intervals.

본 발명에 따른 주사제품은 환자의 체질 및 결함의 종류에 따라 당 업계에 통상적으로 알려진 분량을 취하여 충전된 주사의 형태로 제조될 수 있다.The injectable product according to the present invention can be manufactured in the form of a filled injection by taking the amount commonly known in the art depending on the patient's constitution and type of defect.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving, or treating cancer, comprising the genetically engineered immune effector cells provided by the present invention as an active ingredient.

본 발명에서 상기 "암" 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 예를 들면, 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 담관계암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있다.As used herein, "cancer" refers to or refers to a physiological condition typically characterized by uncontrolled cell growth in mammals. The cancer subject to prevention, improvement, or treatment in the present invention may be a solid tumor consisting of a lump generated by abnormal cell growth in a solid organ, for example, stomach cancer, liver cancer, and glioblastoma. , ovarian cancer, colon cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, melanoma, or lung cancer.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, “prevention” refers to all actions that inhibit cancer or delay its progression by administering the composition of the present invention.

본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, “treatment” and “improvement” mean any action in which cancer symptoms are improved or beneficially changed by administration of the composition of the present invention.

본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.For administration, the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated to include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above. Pharmaceutically acceptable carriers may be saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and a mixture of one or more of these ingredients, and if necessary, antioxidants. , other common additives such as buffer solutions and bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, as well as pills, capsules, granules, or tablets, and can act specifically on target organs. Target organ-specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton PA). there is.

본 발명의 약학 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be a solution, suspension, dispersion, emulsion, gel, injectable solution, or sustained-release preparation of the active compound, and is preferably an injection.

본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.When the pharmaceutical composition of the present invention is formulated as an injection, the pH is adjusted using a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used as an injection to ensure product stability according to the distribution of the injection prescription, making the injection very physically and chemically stable. It can be manufactured with

보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.More specifically, the injection can be prepared by dissolving it in water for injection along with a stabilizer or solubilizing agent and then sterilizing it, especially by high-temperature reduced-pressure sterilization or aseptic filtration. The water for injection may be distilled water for injection or a buffer solution for injection, for example, a phosphate buffer solution with a pH in the range of 3.5 to 7.5 or a sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)-citric acid buffer solution. The phosphate salt used may be in the form of sodium salt or potassium salt, anhydrous or hydrated, and may be citric acid or in anhydrous or hydrated form.

또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO3), 메타중아황산나트륨(Na2S2O3) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO3) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH3COOH)과 같은 산을 포함한다.In addition, the stabilizer used in the present invention includes sodium pyrosulfite, sodium bisulfite (NaHSO 3 ), sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 3 ), or ethylenediaminetetraacetic acid, Solubilizing agents include bases such as sodium hydroxide (NaOH), sodium bicarbonate (NaHCO 3 ), sodium carbonate (NaCO 3 ) or potassium hydroxide (KOH), or acids such as hydrochloric acid (HCl) or acetic acid (CH 3 COOH). .

본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.The injectable agent according to the present invention can be formulated to be bioabsorbable, biodegradable, and biocompatible. By bioabsorbable we mean that the injectable agent can disappear from the body upon initial application without decomposition or decomposition of the dispersed injectable agent. Biodegradability means that the injectable agent can be broken down or decomposed in the body by hydrolysis or enzymatic degradation. Biosynthesis means that all ingredients are non-toxic to the body.

본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.The injection according to the present invention can be prepared using conventional fillers, weighting agents, binders, wetting agents, diluents such as surfactants, or excipients.

본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.The composition or active ingredient of the present invention may be administered by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, intranasal, subcutaneous, intrathecal, inhalational, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal route depending on the purpose. It can be administered in a conventional manner through the like, and preferably intravenously. The composition or active ingredient of the present invention may be administered by injection or catheter.

본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 상기 약학 조성물 내에 포함되는 형질 전환된 숙주 세포가 1 x 101 ~ 1 x 1050개/kg, 바람직하게는 1 x 101 ~ 1 x 1030개/kg, 보다 바람직하게는 1 x 105 ~ 1 x 1020개/kg, 가장 바람직하게는 1 x 107 ~ 1 x 109개/kg의 범위 내로 투여될 수 있도록 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.In the composition of the present invention, the dosage of the active ingredient is 1 x 10 1 to 1 x 10 50 cells/kg, preferably 1 x 10 transformed host cells contained in the pharmaceutical composition, based on an adult weighing 60 kg. So that it can be administered within the range of 1 to 1 x 10 30 pieces/kg, more preferably 1 x 10 5 to 1 x 10 20 pieces/kg, and most preferably 1 x 10 7 to 1 x 10 9 pieces/kg. It can be adjusted. However, the optimal dosage to be administered can be easily determined by a person skilled in the art, and can be determined based on the type of disease, the severity of the disease, the content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of dosage form, and the patient's age, weight, and general health. It can be adjusted according to various factors, including condition, gender and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs.

본 발명의 약학 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the active ingredient may be contained in an amount of 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition. However, the content is not limited to this.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 항암제를 더 포함할 수 있다.Additionally, the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more anticancer agents.

본 발명에서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the anticancer agents include nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axitinib, Cediranib, lestaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, Viscum album, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide , dasatinib, estramustine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tusetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab, procarbazine, alprostadil, holmium nitrate chitosan, Gemcitabine, doxyfluridine, pemetrexed, tegafur, capecitabine, gimeracin, oteracil, azacitidine, methotrexate, uracil, cytarabine, fluorouracil, fludagabine, enocitabine, Flutamide, decitabine, mercaptopurine, thioguanine, cladribine, carper, raltitrexed, docetaxel, paclitaxel, irinotecan, belotecan, topotecan, vinorelbine, etoposide, vincristine, vinblastine , teniposide, doxorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, mitomycin, bleromycin, daunorubicin, dactinomycin, pyrarubicin, aclarubicin, pepromycin, temsirolimus. , tezolomide, busulfan, ifosphamide, cyclophosphamide, melphalan, altretmin, dacarbazine, thiotepa, nimustine, chlorambucil, mitolactol, leucovorin, tretonin, exemestane. , aminoglutethimide, anagrelide, navelvin, padrazole, taciphen, toremifene, testolactone, anastrozole, letrozole, borozole, bicalutamide, lomustine and carmustine. One or more types selected from the group may be used, but are not limited thereto.

본 발명에서 제공하는, 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포, 특히 자연살해세포는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 단편을 발현하여 면역 이펙터 세포의 기본적인 항-종양 활성에 더하여 상기 세포에서 발현되는 펩타이드 또는 이의 단편에 의한 전환성장인자 베타(TGF-β) 신호전달 경로의 억제 효과에 의한 미세종양 내부로의 침윤능 향상 및 종양 세포에 대한 세포 독성 향상 효과로 인하여 항암 활성이 매우 우수한 장점이 있다. Genetically engineered immune effector cells, especially natural killer cells, provided by the present invention express the peptide or fragment thereof according to the present invention, and in addition to the basic anti-tumor activity of the immune effector cell, the peptide or fragment thereof expressed in the cell It has the advantage of excellent anti-cancer activity due to its improved ability to invade into microtumors and its cytotoxic effect on tumor cells due to the inhibitory effect of the transforming growth factor beta (TGF-β) signaling pathway.

도 1은 본 발명의 일 예시에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 벡터 맵을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1에서 미세종양과 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드 및 GFP를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 공배양한 뒤 미세종양 내 GFP의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 HCC-1806 유방암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 NCI-N87 위암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 NCI-H292 폐암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 SW-620 대장암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 HEP-G2 간암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실험예 2에서 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 Capan-2 췌장암 세포주에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 처리한 뒤 루시퍼라제 활성을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 참고예 1에서 췌장암 세포주인 Aspc1에서의 본 발명의 펩타이드 처리에 따른 pSmad2/3 발현 수준 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 참고예 1에서 췌장암 세포주인 Bxpc3에서의 본 발명의 펩타이드 처리에 따른 pSmad2/3 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 참고예 1에서 췌장암 세포주인 Panc1에서의 본 발명의 펩타이드 처리에 따른 pSmad2/3 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다.Figure 1 shows a vector map containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 encoding a peptide capable of inhibiting the TGF-β signaling pathway according to an example of the present invention.
Figure 2 shows the expression level of GFP in the microtumor after co-culturing the microtumor in Experimental Example 1 of the present invention with a NK cell line genetically engineered to express GFP and a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. This shows the results of confirmation.
Figure 3 shows the HCC-1806 breast cancer cell line into which a luciferase reporter gene was introduced in Experimental Example 2 of the present invention, after treatment with an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown graphically.
Figure 4 shows the NCI-N87 gastric cancer cell line into which a luciferase reporter gene was introduced in Experimental Example 2 of the present invention, after treatment with an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown graphically.
Figure 5 shows the NCI-H292 lung cancer cell line into which a luciferase reporter gene was introduced in Experimental Example 2 of the present invention, after treatment with an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown graphically.
Figure 6 shows that in Experimental Example 2 of the present invention, the SW-620 colon cancer cell line into which a luciferase reporter gene was introduced was treated with an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown in a graph.
Figure 7 shows the HEP-G2 liver cancer cell line into which the luciferase reporter gene was introduced in Experimental Example 2 of the present invention, after treatment with the NK cell line genetically engineered to express the peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown graphically.
Figure 8 shows the Capan-2 pancreatic cancer cell line into which a luciferase reporter gene was introduced in Experimental Example 2 of the present invention, after treatment with an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention. The results of comparing luciferase activity are shown graphically.
Figure 9 shows the change in pSmad2/3 expression level in Aspc1, a pancreatic cancer cell line, according to treatment with the peptide of the present invention in Reference Example 1 of the present invention.
Figure 10 is a diagram showing the change in pSmad2/3 expression level in Bxpc3, a pancreatic cancer cell line, according to treatment with the peptide of the present invention in Reference Example 1 of the present invention.
Figure 11 is a diagram showing the change in pSmad2/3 expression level in Panc1, a pancreatic cancer cell line, according to treatment with the peptide of the present invention in Reference Example 1 of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

[참고예 1] 본 발명의 펩타이드의 TGF-β-신호전달 억제 효과 확인[Reference Example 1] Confirmation of the TGF-β-signaling inhibition effect of the peptide of the present invention

1. TGF-β-신호전달 억제 펩타이드 설계1. Design of TGF-β-signaling inhibitory peptide

TGF-β 신호전달을 억제하는 펩타이드를 개발하기 위해, TGF-β 수용체를 표적으로 하는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드(P6)를 설계하여 제작하였다. In order to develop a peptide that inhibits TGF-β signaling, a peptide (P6) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 targeting the TGF-β receptor was designed and produced.

2. 펩타이드의 TGF-β-신호전달 억제효과 확인2. Confirmation of the TGF-β-signaling inhibition effect of the peptide

이렇게 제작한 펩타이드의 TGF-β 신호전달 억제효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이전의 실험에서 Bxpc3 및 Aspc1 세포주의 경우 TGF-β를 처리하고 12~24시간에 pSmad2/3 발현 수준이 높은 것을 확인하였는 바, 본 실험에서는 TGF-β를 처리하고 24시간 후의 pSmad2/3 발현 수준을 확인하여 TGF-β 신호전달 경로의 억제 여부를 확인하였다. 구체적으로, 췌장암 세포주인 Aspc1, Bxpc3 및 Panc1 세포주를 6웰 플레이트에 1X106/웰의 농도로 시딩하여 하룻동안 배양한 뒤, 다음날, TGF-β 또는 TGF-β+후보 펩타이드(P6)를 24시간동안 처리하고(대조군: 15% ACN - 후보 펩타이드 용매, DMSO - P144 펩타이드 용매, P144: TSLDASIWAMMQNA(서열번호 10)) pSmad2/3와 전체 Smad2/3의 발현 수준을 웨스턴 블랏팅 방법으로 분석하였다. In order to confirm the inhibitory effect of the peptide produced in this way on TGF-β signaling, the following experiment was performed. In previous experiments, it was confirmed that the pSmad2/3 expression level was high 12 to 24 hours after treatment with TGF-β in Bxpc3 and Aspc1 cell lines. In this experiment, the expression level of pSmad2/3 24 hours after treatment with TGF-β It was confirmed whether the TGF-β signaling pathway was inhibited. Specifically, pancreatic cancer cell lines Aspc1, Bxpc3, and Panc1 cell lines were seeded in a 6-well plate at a concentration of 1 (Control group: 15% ACN - candidate peptide solvent, DMSO - P144 peptide solvent, P144: TSLDASIWAMMQNA (SEQ ID NO: 10)) and the expression levels of pSmad2/3 and total Smad2/3 were analyzed by Western blotting method.

그 결과, 도 9 내지 11에서 보는 바와 같이, Aspc1, Bxpc3 및 Panc1 세포주 모두에서 본 발명에 따르는 펩타이드(P6)가 pSmad2/3의 발현 수준을 현저히 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 토대로, 본 발명에서 제작한 TGF-β 신호전달 억제 펩타이드(P6)는 실제로 TGF-β 신호전달을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.As a result, as shown in Figures 9 to 11, it was confirmed that the peptide (P6) according to the present invention significantly suppressed the expression level of pSmad2/3 in all Aspc1, Bxpc3, and Panc1 cell lines. Based on the above results, it can be seen that the TGF-β signaling inhibitory peptide (P6) prepared in the present invention can actually effectively inhibit TGF-β signaling.

[실시예 1] TGF-β 신호전달 경로를 억제할 수 있는 유전자가 포함된 벡터의 제작[Example 1] Construction of a vector containing a gene capable of suppressing the TGF-β signaling pathway

도 1과 같이, 그린 형광 단백질(GFP), P2A, IL-2 신호 펩타이드 및 TGF-β 신호전달 경로 억제 펩타이드(P6) 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 렌티 바이러스 전달 벡터에 삽입하였다. 이때 상기 재조합 유전자는 SFFV 단일 프로모터의 제어 하에 배치하였다. 실험에 사용된 SFFV 프로모터의 염기 서열과, 그 외의 각 유전자의 염기 서열은 하기 표 1에 나타내었고, 이들 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 하기 표 2에 나타내었다. As shown in Figure 1, polynucleotides encoding each of green fluorescent protein (GFP), P2A, IL-2 signal peptide, and TGF-β signaling pathway inhibitory peptide (P6) were inserted into the lentiviral delivery vector. At this time, the recombinant gene was placed under the control of the SFFV single promoter. The base sequence of the SFFV promoter used in the experiment and the base sequences of each other gene are shown in Table 1, and the amino acid sequences encoded by these base sequences are shown in Table 2 below.

유전자 이름gene name 염기 서열base sequence 서열번호 sequence number SFFV 프로모터SFFV promoter GTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGGGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCCA AGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGACAGACTGAGTCGCCCGGG 33 GFPGFP ATGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCAAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGGTGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGTGCTGGTGGGCAGCTTCGCCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTTCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGCTGCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCCATTGCCTTCGCCATGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCAAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAA CACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGTGTGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGTGCTGGTGGGCAGCTTCGCCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCT TCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGCTGCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCCATTGCCTTCGCC 55 P2AP2A GCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT 99 IL-2 신호 서열IL-2 signal sequence ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT 77 TGF-β 신호전달 경로 억제 유전자TGF-β signaling pathway inhibition gene TTCTGCCTGGGCCCCTGCCCCTACATCTGGAGCCTGGACACCGTGCTGAGCCTGTTCTGCCTGGGCCCCTGCCCCTACATCTGGAGCCTGGACACCGTGCTGAGCCTG 22

펩타이드 이름peptide name 아미노산 서열amino acid sequence 서열번호 sequence number GFPGFP MPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPKQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVVGTGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNVLVGSFARTFSLRDGGYYSFVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEELHSNTELGIVEYQHAFKTPIAFAMPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPKQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVVGTGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNVLVGSFARTFSLRDGGYYSFVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEELHSNTELGIVE YQHAFKTPIAFA 44 P2AP2A ATNFSLLKQAGDVEENPGPATNFSLLKQAGDVEENPGP 88 IL-2 신호 펩타이드IL-2 signal peptide MYRMQLLSCIALSLALVTNSMYRMQLLSCIALSLALVTNS 66 TGF-β 신호전달 경로 억제 펩타이드TGF-β signaling pathway inhibitory peptide FCLGPCPYIWSLDTVLSLFCLGPCPYIWSLDTVLSL 1One

[실시예 2] 렌티바이러스의 NK 세포로의 형질 도입[Example 2] Transduction of lentivirus into NK cells

1. 세포의 준비 및 배양1. Preparation and culture of cells

상기 TGF-β 신호전달 경로 억제 펩타이드가 발현되도록 유전적으로 조작할 면역 이펙터 세포로는 자연살해세포를 이용하였다. 이러한 자연살해 세포주 (natural killer cell)로는 NK-92 세포주를 ATCC로부터 구매하였다. 또한, 실시예 1에서 제작한 렌티바이러스를 형질 도입할 세포주인 293T 세포주 역시 ATCC로부터 구매하였다. NK-92 세포주와 이하 기재할 렌티바이러스가 형질 도입된 NK-92 세포주는 모두 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 100 units/mL의 페니실린(penicillin), 20%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 10%의 MEM 비타민 용액, 1X의 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 및 400 IU의 rhIL-2가 포함된 배지에서 배양하였고, 293T 세포주는 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 100 units/mL의 페니실린(penicillin), 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 배지에서 배양하였으며, 모든 세포의 배양은 37 ℃에서 CO2가 5% (95% 공기)로 유지되는 환경에서 배양하였다.Natural killer cells were used as immune effector cells to be genetically manipulated to express the TGF-β signaling pathway inhibitory peptide. As a natural killer cell line, the NK-92 cell line was purchased from ATCC. In addition, the 293T cell line, which is the cell line to be transduced with the lentivirus produced in Example 1, was also purchased from ATCC. Both the NK-92 cell line and the lentivirus-transduced NK-92 cell line described below were treated with 100 μg/mL of streptomycin, 100 units/mL of penicillin, and 20% fetal bovine serum. serum; FBS), 10% MEM vitamin solution, 1 streptomycin), 100 units/mL of penicillin, and 10% fetal bovine serum (FBS). All cells were cultured at 37°C with 5% CO2 (95% CO2). Cultured in an environment maintained with air.

2. 렌티바이러스의 형질 도입2. Lentiviral transduction

바이러스의 물리적 역가(Physical titer) (One-Wash Lentivirus Titer Kit이용) 기준 5 x 108 TU/mL 이상의 렌티바이러스를 얻기 위하여, 1.2 x 106개의 293T 세포를 60 mm 배양 디쉬에 24시간 배양한 뒤, 상기 실시예 1에서 제조한 렌티바이러스 전달 벡터 (UCI-VD33) 5.5 μg, 패키징 벡터(UCI-VD6) 3.7 μg, 및 외피 벡터(envelope vector)(UCI-VD11) 1.8 μg와 함께 리포펙타민(lipofectamine) 3000 형질 감염 시약으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 293T 세포에서 제작된 렌티바이러스는 세포 밖으로 분출되어 나와 바이러스 입자(virus particle) 형태로 세포 배양액에 존재하였다. 이에 형질주입 48 또는 72시간 뒤, 배양 플레이트에서 세포 배양액만을 걷어내 lenti-X 농축 시약(concentrator)으로 100배 농축해 렌티바이러스 입자를 펠렛 형태로 얻었다. 이후, 24-웰 플레이트에 1 x 106 개의 NK-92 세포주와 농축된 바이러스 상층액을 MOI 100이 되도록 넣어준 후 형질 도입 유도를 위해 8 μg/mL의 폴리 브렌(polybrene)을 함께 넣어주었다. 형질 도입이 성공적으로 일어난 세포주의 선정을 위하여 세포 선별기(cell sorter) (SH800S)를 이용하여 GFP 가 발현되는 세포들을 선별하였다. In order to obtain a lentivirus of 5 , Lipofectamine ( lipofectamine) 3000 transfection reagent. After transfection, the lentivirus produced in 293T cells was ejected out of the cell and existed in the cell culture medium in the form of virus particles. Accordingly, 48 or 72 hours after transfection, only the cell culture fluid was removed from the culture plate and concentrated 100 times with lenti-X concentration reagent (concentrator) to obtain lentivirus particles in the form of a pellet. Afterwards, 1 To select cell lines in which transduction was successful, cells expressing GFP were selected using a cell sorter (SH800S).

[실험예 1] 미세종양 내부 침윤능 활성 평가[Experimental Example 1] Evaluation of microtumor internal invasion activity

종양 미세환경을 모사 가능한 미세 종양(microtumor)을 삼차원으로 배양하기 위하여 AsPC-1_mCherry 세포를 1.5 mg/mL의 콜라겐 I 용액(rat tail tendon type I collagen) 과 섞어주었다. 이 때, 세포-콜라겐 현탁액의 최종 농도는 1.5 x 105 개/mL이도록 하였다. 그 후, 세포-콜라겐 현탁액 1 μL을 96-웰 플레이트 각 웰의 중앙에 분주해준 후 ?-챔버(wet-chamber)에서 5분간의 겔화(gelation) 과정을 거쳤다. 이어서, 세포-콜라겐이 분주 되어있는 각 웰에 1.5 x 103개의 hPaSteC을 100 μL의 RPMI-1640과 섞어 추가 분주하여 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 본 발명에 따라 유전적 조작된 NK-92 세포와의 삼차원 공배양 진행 시, 미세종양 배양 3일차에 사용배지를 모두 제거하고 형광 발현 NK-92 세포주 (mock)와 NK-92_p6(p6 peptide_GFP) 1 x 104개를 200 μL의 NK-92 배양배지에 섞어 각 웰에 분주하였다. 미세종양의 배양은 6일차에 종료하였고 그 후, 4% PFA로 미세종양을 고정하였다.In order to three-dimensionally culture microtumors capable of simulating the tumor microenvironment, AsPC-1_mCherry cells were mixed with 1.5 mg/mL collagen I solution (rat tail tendon type I collagen). At this time, the final concentration of the cell-collagen suspension was 1.5 x 10 5 cells/mL. Afterwards, 1 μL of the cell-collagen suspension was dispensed into the center of each well of a 96-well plate and then subjected to a gelation process for 5 minutes in a ?-chamber (wet-chamber). Subsequently , 1.5 When performing three-dimensional co-culture with genetically engineered NK-92 cells according to the present invention, all used media were removed on the 3rd day of microtumor culture, and the fluorescent NK-92 cell line (mock) and NK-92_p6 (p6 peptide_GFP) 1 were used. x 10 4 were mixed with 200 μL of NK-92 culture medium and dispensed into each well. Culture of microtumors was terminated on day 6, and then microtumors were fixed with 4% PFA.

미세종양 내로 침윤된 NK-92 세포를 정량하기 위하여 공배양이 완료된 미세종양의 내부 GFP 량을 측정하였다. 측정에 사용된 샘플은 X-CLARITY Mounting Solution (C13101)을 통하여 전 처리하였으며, 형광 이미지는 공초점 현미경(confocal microscope) (LSM 800W)를 이용하여 획득하였다. 획득한 이미지는 IMARIS viewer (ver. 9.5.1)의 orthogonal-projection tool로 재구성되었으며 형광 강도는 ZEN software (3.6 blue edition)을 통하여 측정하였다. 형광 이미지의 pixel area는 ImageJ software (ver. 1.53q)의 analyze particle tool을 통하여 계산하였다. 단 대조군으로는 GFP 유전자를 포함하는 mock 벡터가 형질 감염된 NK-92 세포를 이용하였다. 얻어진 결과는 도 2에 나타내었다. To quantify the NK-92 cells infiltrated into the microtumor, the amount of GFP inside the microtumor for which co-culture was completed was measured. The sample used for measurement was pre-processed using X-CLARITY Mounting Solution (C13101), and fluorescence images were acquired using a confocal microscope (LSM 800W). The acquired image was reconstructed with the orthogonal-projection tool of IMARIS viewer (ver. 9.5.1), and the fluorescence intensity was measured using ZEN software (3.6 blue edition). The pixel area of the fluorescence image was calculated through the analyze particle tool of ImageJ software (ver. 1.53q). However, as a control, NK-92 cells transfected with a mock vector containing the GFP gene were used. The obtained results are shown in Figure 2.

도 2에서 보는 바와 같이, 미세종양과 본 발명에 따라 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포주를 공배양한 경우, mock 벡터가 형질 감염된 NK 세포주와 공배양한 경우와 비교하여 미세종양 내부 GFP 량이 현저히 증가하였는 바, 본 발명에 따라 유전적으로 조작된 NK 세포주는 종양 내부 침윤능이 뛰어난 것을 알 수 있었다. As shown in Figure 2, when microtumors and an NK cell line genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention were co-cultured, the mock vector was co-cultured with the NK cell line transfected. Compared to the case, the amount of GFP inside the microtumor was significantly increased, showing that the NK cell line genetically engineered according to the present invention had an excellent ability to invade inside the tumor.

[실험예 2] 항암 활성 평가[Experimental Example 2] Evaluation of anticancer activity

1. 암 세포의 준비 및 배양1. Preparation and culture of cancer cells

췌장암 세포주 (Capan-2), 유방암 세포주 (HCC-1806), 위암 세포주 (NCI-N87), 폐암 세포주 (NCI-H292), 대장암 세포주 (SW-620) 그리고 간암 세포주 (Hep-G2)를 한국 세포주 은행 (KCLB)로부터 구매 후 루시퍼라제 리포터(luciferase reporter) 유전자가 도입된 세포주를 사용하였다. Capan-2_luc_puro, HCC-1806_luc_puro, NCI-N87_luc_puro, NCI-H292_luc_puro, 그리고 SW-620_luc_puro 세포주는 RPMI-1640 배지를 이용하여 배양하였고 Hep-G2_luc_puro는 high-glucose Dulbecco's modified Eagle medium 배지를 이용하여 배양하였다. 루시퍼라제 리포터 유전자가 도입된 암 세포주의 배양에 사용되는 모든 배지는 100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 100 units/mL의 페니실린(penicillin), 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 4 μg/mL의 퓨로마이신(puromycin)이 포함되었다. 모든 세포는 37 ℃에서 CO2가 5% (95% 공기)로 유지되는 환경에서 배양하였다.Pancreatic cancer cell line (Capan-2), breast cancer cell line (HCC-1806), stomach cancer cell line (NCI-N87), lung cancer cell line (NCI-H292), colon cancer cell line (SW-620), and liver cancer cell line (Hep-G2) from Korea. A cell line into which a luciferase reporter gene was introduced was used after purchasing from a cell line bank (KCLB). Capan-2_luc_puro, HCC-1806_luc_puro, NCI-N87_luc_puro, NCI-H292_luc_puro, and SW-620_luc_puro cell lines were cultured using RPMI-1640 medium, and Hep-G2_luc_puro was cultured using high-glucose Dulbecco's modified Eagle medium. All media used for culturing cancer cell lines into which a luciferase reporter gene has been introduced contain 100 μg/mL of streptomycin, 100 units/mL of penicillin, and 10% fetal bovine serum (FBS). ) and 4 μg/mL of puromycin were included. All cells were cultured at 37°C in an environment where CO 2 was maintained at 5% (95% air).

2. 항암 활성 평가2. Evaluation of anticancer activity

루시퍼라제 세포주 기반 인-비트로(in vitro) 세포사멸 시험을 수행하기 위하여, 5 x 103개의 각 암 세포주를 100 μL의 암 세포 배양 배지와 섞어 화이트(white) 96-웰 플레이트에 분주 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 48시간 동안 배양하였다. 48 시간 배양 뒤, 각 웰의 사용 배지를 제거한 후 상기 실시예 2에서 구축한 유전적 조작된 NK-92 세포(p6 peptide) 1 x 104개를 200 μL의 NK-92 세포 배양 배지와 섞어 암 세포가 배양되고 있는 웰 플레이트에 분주하고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 추가 배양하였다. 추가 배양 8시간 또는 24시간 뒤, 모든 웰을 DPBS로 세척후 Nano-GloTM Luciferase Assay System을 이용하여 multiplate-reader (Spectra MAX iD3) 장비로 루시퍼라제 활성(luciferase activity)을 측정하였다. 실험 결과는 도 3 내지 8에 나타내었다. To perform a luciferase cell line-based in vitro apoptosis test, 5 , cultured in a 5% CO 2 incubator for 48 hours. After 48 hours of incubation, the used medium from each well was removed, and then 1 x 10 4 genetically engineered NK-92 cells (p6 peptide) constructed in Example 2 were mixed with 200 μL of NK-92 cell culture medium to The cells were dispensed into a cultured well plate and further cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 . After 8 or 24 hours of additional culture, all wells were washed with DPBS and luciferase activity was measured using a multiplate-reader (Spectra MAX iD3) using the Nano-Glo TM Luciferase Assay System. The experimental results are shown in Figures 3 to 8.

도 3에서 보는 바와 같이, 유방암 세포에 본 발명에 따라 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 유방암 세포의 사멸율이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 3, when breast cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, it was confirmed that the death rate of breast cancer cells was very high. .

도 4에서 보는 바와 같이, 위암 세포에도 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 루시퍼라제 발현 위암 세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 4, when gastric cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express the peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, it was confirmed that the number of luciferase-expressing gastric cancer cells was significantly reduced. there was.

도 5에서 보는 바와 같이, 폐암 세포에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 폐암 세포의 사멸율이 높게 관찰되었다. As shown in Figure 5, when lung cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, a high death rate of lung cancer cells was observed.

도 6에서 보는 바와 같이, 대장암 세포에서 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 루시퍼라제 발현 대장암 세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 6, when colon cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, the number of colon cancer cells expressing luciferase was significantly reduced. I was able to confirm.

도 7에서 보는 바와 같이, 간암 세포에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 루시퍼라제 발현 대장암 세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 7, when liver cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, it was confirmed that the number of luciferase-expressing colon cancer cells was significantly reduced. I was able to.

도 8에서 보는 바와 같이, 췌장암 세포에 본 발명에 따른 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 처리한 경우, 췌장암 세포의 사멸율이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 8, when pancreatic cancer cells were treated with NK cells genetically engineered to express a peptide that inhibits the TGF-β signaling pathway according to the present invention, it was confirmed that the death rate of pancreatic cancer cells was very high. .

상기 결과를 종합할 때, 본 발명에 따라 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포, 특히 자연살해세포는 면역 이펙터 세포의 기본적인 항-종양 활성에 더하여, 상기 세포에서 발현되는 펩타이드 또는 이의 단편에 의한 전환성장인자 베타(TGF-β) 신호전달 경로의 억제 효과에 의해, 미세종양 내부로의 침윤능이 향상되고 종양 세포에 대한 세포 독성 효과 또한 향상되어, 유전자 조작이 없는 면역 이펙터 세포에 비하여 항암 활성이 현저히 증가된 장점이 있다.Considering the above results, the immune effector cells, especially natural killer cells, genetically engineered according to the present invention, in addition to the basic anti-tumor activity of the immune effector cells, are characterized by transforming growth factors caused by peptides or fragments thereof expressed in the cells. Due to the inhibitory effect of the beta (TGF-β) signaling pathway, the ability to invade into microtumors is improved and the cytotoxic effect on tumor cells is also improved, resulting in significantly increased anticancer activity compared to immune effector cells without genetic manipulation. There is an advantage.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.

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Claims (15)

전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드 또는 이의 단편을 발현하도록 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포.Immune effector cells genetically engineered to express peptides or fragments thereof capable of inhibiting the transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathway. 제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 면역 이펙터 세포. According to paragraph 1,
The peptide is an immune effector cell comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서,
상기 면역 이펙터 세포는 자연살해 세포(NK 세포), T 세포, 또는 B 세포를 포함하는 림프구 세포인, 면역 이펙터 세포. According to paragraph 1,
The immune effector cell is a lymphoid cell including a natural killer cell (NK cell), a T cell, or a B cell. 제1항에 있어서,
상기 면역 이펙터 세포는 상기 펩타이드 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 형질 감염된 것인, 면역 이펙터 세포. According to paragraph 1,
The immune effector cell is transfected with a vector containing a polynucleotide encoding the peptide or fragment thereof. 제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 4,
The polynucleotide includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, an immune effector cell. 제4항에 있어서,
상기 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 또는 인핸서의 발현 조절 엘리먼트를 추가로 더 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to paragraph 4,
The vector further comprises expression control elements of a promoter, start codon, stop codon, polyadenylation signal, or enhancer. 제6항에 있어서,
상기 프로모터는 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus: RSV) LTR 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, EF1알파 짧은 형태 (EFS) 프로모터, 인간 폴리펩타이드 사슬 연장 인자 (EF1a) 프로모터, P5 프로모터, Ubc 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C (UbiC), H1 프로모터, U6 프로모터, 알파-1-안티트립신 프로모터, 또는 비장 병소 형성 바이러스 (spleen focus-forming virus: SFFV) 프로모터를 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 6,
The promoter includes Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, dihydrofolate reductase promoter, β-actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter, and U6. Promoter, EF1alpha short form (EFS) promoter, human polypeptide chain elongation factor (EF1a) promoter, P5 promoter, Ubc promoter, CAG promoter, TRE promoter, UAS promoter, Ac5 promoter, polyhedrin promoter, CaMKIIa promoter, Gal1 promoter, TEF1 promoter, GDS promoter, ADH1 promoter, CaMV35S promoter, ubiquitin (Ubi) promoter such as ubiquitin C (UbiC), H1 promoter, U6 promoter, alpha-1-antitrypsin promoter, or spleen focus-forming virus. : SFFV) promoter, an immune effector cell. 제6항에 있어서,
상기 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 6,
The promoter is an immune effector cell comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. 제4항에 있어서,
상기 벡터는 신호 펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 더 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 4,
The vector further comprises a base sequence encoding a signal peptide. 제9항에 있어서,
상기 신호 펩타이드는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 9,
The signal peptide is an immune effector cell comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. 제4항에 있어서,
상기 벡터는 하나 이상의 마커를 암호화하는 염기 서열을 더 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to paragraph 4,
The vector further comprises a base sequence encoding one or more markers. 제11항에 있어서,
상기 마커는 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP), 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 루시퍼라제, 대장균 유래 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타제, 분비 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT), β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 11,
The markers include green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (EGFP), red fluorescent protein (RFP), cyan fluorescent protein (CFP), Blue green fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), yellow fluorescent protein (YFP), luciferase, lacZ gene from E. coli, alkaline phosphatase, secretion Selected from the group consisting of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP), chloramphenicol acetyl transferase (CAT), β-galactosidase and β-glucuronidase (GUS) Immune effector cells, including one or more types. 제11항에 있어서,
상기 마커는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역 이펙터 세포. According to clause 11,
The marker is an immune effector cell comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포를 유효 성분으로 포함하는 세포 치료제. A cell therapeutic agent comprising the genetically engineered immune effector cell of any one of claims 1 to 13 as an active ingredient. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 유전적으로 조작된 면역 이펙터 세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물. A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the genetically engineered immune effector cell of any one of claims 1 to 13 as an active ingredient.
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