KR20240067014A

KR20240067014A - 신규한 재조합 PCV2d 항원 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240067014A
Application number: KR1020230149933A
Authority: KR
Inventors: 오종민; 최재방; 윤빛나래; 박상미; 이지훈; 오미경; 한범구; 김현일
Original assignee: 주식회사 옵티팜
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2023-11-02
Publication date: 2024-05-16

Abstract

본 발명은 신규한 재조합 PCV2d 항원 및 이의 용도에 관한 것으로, 기존 PCV2의 ORF2 서열을 곤충세포에서 발현이 증진되도록 코돈 및 벡터를 최적화하고, 최적 배양 방법을 적용하여 재조합 단백질의 수득률을 높임으로써 돼지 써코바이러스 감염성 질환 예방에 널리 사용될 수 있다.

Description

신규한 재조합 PCV2d 항원 및 이의 용도 {Novel recombinant PCV2d antigen and uses thereof}

본 발명은 신규한 재조합 PCV2d 항원 및 이의 용도에 관한 것이다.

PCV2(Porcine Circovirus type2)는 원형의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은(17 nm) 정이십면체 비외피형바이러스로서 지금까지 알려진 가장 작은 동물 바이러스 중 하나이다. PCV2 게놈의 길이는 약 1768 bp이다. PCV2는 이유후 전신성 소모성 증후군(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)의 원인체로 감염된 돼지는 만성적으로 위축돈이 되고, 피부의 창백함, 호흡곤란, 설사, 황달을 보이는 것이 특징이다. 또한 PCV2에 감염된 돼지는 이유자돈에서 높은 폐사율을 나타내기 때문에 전 세계적으로 높은 경제적 손실을 초래하고 있다. PCV2는 PMWS 외에도 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반한다.

PCV2 유전형(genotype)의 분류 기준은 염기서열의 차이가 3.5% 이상을 보일 때 새로운 유전형으로 분류한다. 1996년부터 2000년대 초반까지 PCV2a가 유행하였고, 이후 PCV2b로 유전형의 이동(1차 유전형의 변이: 1st genotype shift)이 일어났다. 특히 PCV2b의 출현은 2003년 PCV2a로 제조된 백신 접종 이후 바로 출현되었으며, PCV2b의 출현은 북미와 유럽을 중심으로 나타났고, 특히 임상증상이 심한 돼지에서 분리되었다. 세 번째 유전형인 PCV2c는 1980년대 덴마크에서 출현한 것으로 소급적 검사에서 확인되었다. PCV2d의 출현은 브라질의 야생돼지에서 처음 보고되었으며, 비슷한 시기에 중국의 사육돼지에서 보고되었다. PCV2b에서 PCV2d로의 두 번째 유전형의 유행성 변화(2차 유전형의 변이: 2nd genotype shift)는 2012년에 시작되어 현재 PCV2d는 전 세계적으로 유행하는 유전형으로 점차 더 많이 확산되고 있다. 따라서, PCV2d 유전자형의 감염 예방을 위한 PCV2d 기반의 백신 개발이 필요하다.

한편, PCV2의 ORF2(Open Reading Frame 2) 유전자는 외피단백질(capsid protein)을 암호화하는 것으로, ORF2에 의해 생성된 외피단백질은 바이러스 유사 입자(Virus like particle, VLP)를 형성한다. 바이러스 유사 입자는 바이러스 모양이 매우 유사하지만 유전 물질이 없기 때문에 감염을 일으키지 않고, 면역반응을 유도할 수 있다.

VLP 백신 연구나 생산에는 다양한 발현계가 사용되고 있으며 대표적으로 곤충세포를 이용한 배큘로바이러스 발현계가 사용되고 있다. 곤충세포에서 단백질 생산 및 변형 과정은 종종 인간과 유사하며 다양한 VLP를 생산할 수 있어 최근 다양한 백신이 허가되고 있다. PCV2의 ORF2에 의해 생성된 VLP 제작 방법은 ORF2 유전자를 포함하는 바이러스로 세포를 감염시켜, 이로부터 분리하는 방법을 통해 일반적으로 수득 되는데, 이러한 방법은 단백질 추출 과정에서 비용과 시간이 요구된다는 단점이 있다. 따라서 백신 등에 사용하기 위해 단백질 추출 과정을 단축하여 비용과 시간이 감소되면서도 충분한 양의 단백질 수득을 위한 방법에 대한 연구가 필요하다.

이에 본 발명자들은 PCV2의 ORF2에 대한 VLP를 효율적으로 생산하기 위해서 국내 분리주 기반 PCV2d의 ORF2 유전자의 codon 최적화 및 다양한 strain과의 조합을 통해 세포 밖으로 약 90%의 VLP 항원이 효율적으로 생산되는 최적 조건을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

KR

10-2168646

B

KR

10-2017-0050990

A

KR

10-2014-0140158

B

본 발명의 목적은 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자, 상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 형질도입한 배큘로바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 배큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 써코바이러스 2형을 예방할 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방 방법 및 상기 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방용 백신 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 형질도입한 배큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 배큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 배큘로바이러스에 형질도입하는 단계; 상기 배큘로바이러스를 세포에 접종하여 부유 배양하는 단계; 및 상기 세포로부터 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 단백질을 수득하는 단계; 를 포함하는 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방용 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 코돈 최적화된 PCV2d의 유전자를 포함하는 secretion 벡터 선발을 위한 재조합발현벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 코돈 최적화된 PCV2d의 유전자를 포함하는 secretion 벡터에 따른 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Optipharm-PCV2d 재조합 배큘로바이러스의 비특이 밴드 유무를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Optipharm-PCV2d 재조합바이러스의 유전자 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Optipharm-PCV2d ORF2 단백질의 발현량을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 감염된 Hi5 세포에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질의 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 7은 감염된 Hi5 세포에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질의 일자별 발현량을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8는 감염된 HI5 세포에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질의 일자별 발현량을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 9는 GPC 분석을 통한 PCV2d ORF2 단백질로 이루어진 VLP와 Monomer의 특성을 나타낸 도이다.
도 10는 GPC 분석을 통한 PCV2d ORF2 단백질로 이루어진 VLP와 Monomer를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 11는 GPC 분석을 통한 PCV2d ORF2 단백질로 이루어진 VLP와 Monomer를 TEM 분석을 통해 확인한 도이다.
도 12는 돼지에서 PCV2d 백신 조성물에 의한 항체 생성능을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 돼지에서 PCV2d 백신 조성물에 의해 생성된 항체로 PCV2b 와 PCV2d의 ORF2 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 14은 배양법에 따른 PCV2d ORF2 단백질의 발현량을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, PCV2는 PCV2a, PCV2b, PCV2c 및 PCV2d 타입으로 분류되며, PCV2의 OFR2(Open Reading Frame 2) 유전자는 캡시드 단백질(capsid protein)을 암호화하는 것으로, 상기 ORF2에 의해 생성된 캡시드 단백질은 바이러스 유사 입자(virus like particle, VLP)을 형성한다.

본 발명의 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'는 NCBI에 등록된 PCV2d ORF2 유전자(NCBI accession number: OQ144266.1)가 암호화하는 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'가 암호화하는 아미노산 서열과 NCBI에 등록된 PCV2d ORF2 유전자(NCBI accession number: OQ144266.1)가 암호화하는 캡시드 단백질 아미노산 서열은 동일하나, 본 발명의 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'는 곤충세포에서의 PCV2d ORF2 단백질의 발현을 위해 코돈 최적화된 것으로, 상기 PCV2d ORF2 유전자(NCBI accession number: OQ144266.1)와 염기서열이 상이한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체일 수 있다.

본 발명의 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'는 PCV2d 야외분리주(NCBI accession number: OQ144266.1)의 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으며 서열번호 2로 이루어진 것 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 'PCV2d의 ORF2 유전자'가 암호화하는 아미노산 서열과 PCV2d 야외분리주(NCBI accession number: OQ144266.1)의 캡시드 단백질 아미노산 서열은 동일하나, 본 발명의 'PCV2d의 ORF2 재조합 유전자'는 곤충세포에서의 유전자 발현에 최적화된 것으로, 상기 PCV2d 야외분리주(NCBI accession number: OQ144266.1)의 OFR2 유전자(서열번호 3)와 염기서열이 상이한 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1으로 표시되는 염기서열 및 상기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체일 수 있으며, 코돈 최적화에 의해 재조합 단백질의 생산량이 현저히 증대된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 다양한 벡터에 상기 재조합 유전자를 도입하여 목적 단백질 발현 및 분비 수준을 확인하였고, 그 결과 서열번호 5로 표시되는 벡터에 코돈 최적화된　PCV2d의　ORF2　재조합 유전자 서열(서열번호 1)을 도입한 경우 대부분의 목적 단백질이 세포 밖으로 분비되어 우수한 효율을 확인하였다. 상기 코돈 최적화된　PCV2d의　ORF2　재조합 유전자 서열이 도입된 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 형질도입한 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 '벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있고, 바람직하게는 배큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 pOET1(Oxford Expression Technologies)일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 유전자 전달을 위해 사용될 수 있는 통상적인 유전자 전달 방법에 의해 형질도입될 수 있으며, 바람직하게는 배큘로바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 벡시니아로 이루어진 군에서 선택된 바이러스를 이용한 유전자 전달 시스템으로 형질도입되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 배큘로바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 형질도입되는 것 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 막대 모양의 바이러스로서 인간 세포에서 곤충-특이 프로모터로부터 자신의 유전자를 발현하지 않으며, 곤충 세포에서 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 상기 재조합 배큘로바이러스에 의해 형질도입되어, 형질도입된 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 제한없이 포함할수 있으며, 바람직하게는 곤충세포일 수 있고, 가장 바람직하게는 Sf9(Spodoptera frugiperda) 세포 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 개체에 접종되어 PCV2d 바이러스로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터, 재조합 배큘로바이러스, 재조합 단백질을 이용하면, PCV2d를 예방할 수 있는 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 PCV2d 야외분리주(NCBI accession number: OQ144266.1)의 캡시드 단백질 서열일 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질은 개체에 접종되면 다양한 혈청형의 PCV로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있으며, 특히, PCV2d형으로부터 보호할 수 있는 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서 '백신'은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, PCV2에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.

본 발명의 '돼지 써코바이러스의 감염성 질환'에는 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome), 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신 조성물은 유효 성분인 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 또는 바이러스 유사 입자 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에의 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.

본 발명에서 개체에 백신 조성물을 투여하는 방법은 일반적인 백신 투여 방법에 의할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 장내 또는 비경구 경로, 경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내 또는 다른 적절한 경로를 통한 투여를 수행할 수 있고, 바람직하게는 근육 내, 피내, 피하에 투여된다.

본 발명에서 상기 백신 접종의 대상은 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이 및 토끼로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 가장 바람직하게는 돼지일 수 있다.

본 발명에서 상기 개체에게 백신 조성물 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 '면역학적 유효량'이란 PCV2 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들은 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 코돈 최적화된 PCV2d의 ORF2 유전자의 제조

곤충세포에서 유전자의 발현 효율을 높이기 위해 국내 분리주로부터 얻은 PCV2d의 ORF2 유전자(NCBI accession number: OQ144266.1)의 코돈을 최적화(optimization)하였다.

구체적으로, 국내 분리주로부터 얻은 PCV2d의 ORF2 유전자(NCBI accession number: OQ144266.1)가 코딩하는 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 각 아미노산별로 목적하는 곤충세포에 주로 사용되는 염기서열로 변경하였다. 상기와 같은 방법으로 코돈 최적화된 PCV2d의 ORF2 염기 서열은 서열번호 1로 표시된다.

<실시예 2> PCV2d ORF2 유전자 발현을 위한 재조합 벡터의 구축

상기 실시예 1에서의 코돈 최적화된 PCV2d ORF2 서열을 포함하는 다양한 재조합 벡터를 제작하였으며 이의 구조는 도 1에 간략하게 나타내었다. 전달 벡터로는 pVL1392, pBacPAK9, pBacPAK9-p6.9, pBacPAK9-H6, pFastBAC Dual-p6.9, pFastBAC Dual-H6, pFastBAC Dual를 이용하였으며, 코돈 최적화된 PCV2d ORF2 서열을 In-Fusion 방법을 통해 도입한 후 클로닝하였다. 상기 방법으로 제작한 재조합 벡터의 DNA를 주형으로 PCR을 실시하여 목적 유전자의 벡터내 형질 도입을 확인하였다.

<실시예 3> PCV2d ORF2 단백질 발현 재조합바이러스의 제작

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 벡터를 이용하여 코돈 최적화된 PCV2d ORF2 유전자를 발현하는 재조합 벡터와 StrainF-u, StrainF-g, StrainsF-p, StrainM, Optipharm 바이러스 DNA를 이용하여 코돈 최적화된 PCV2d ORF2 유전자를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제작하였다(도 1).

구체적으로, sf-900 III SFM 배지(Invitrogen)에 배양된 곤충세포(Spodoptera frugiperda, Sf9)를 T-25 cell culture flask에 2X10^6 cells/3ml 로 분주하여 27℃에서 1시간 정치시켰다. 형질도입을 위해 각각 상기 실시예 2에서 제작한 재조합 벡터와 상기 5가지의 바이러스 DNA를 혼합 용액과 sf-900 III SFM 배지 100uL, baculoFECTIN II(Oxford Expression Technologies) 1.2 uL를 첨가하여 조심스럽게 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치시켰다. 15분 후 각 혼합액을 세포에 조심스럽게 분주하여 sf9 세포주에 재조합 배큘로바이러스를 감염시켰다.

상기 방법으로 제작된 재조합 배큘로바이러스를 접종하여 감염된 곤충세포로부터 DNA를 추출하여 전기영동으로 형질감염 여부를 확인하였다.

<실시예 4> 재조합 배큘로바이러스를 이용한 PCV2d ORF2 단백질 발현 확인 및 secretion 효율 비교

<4-1> PCV2d ORF2 단백질 발현 확인 및 secretion 효율 확인

상기 실시예 3에서 제작한 재조합 배큘로바이러스들의 발현 및 secretion 효율 비교를 위하여 Hi5 세포에 접종 후 15일차에 수거하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

구체적으로, 각 벡터별 바이러스들을 Hi5 cell을 5×10^5 cells/mL에 0.1MOI 로 동일 조건에서 15일 동안 배양 후 cell과 sup으로 나누어 SDS-PAGE를 통해 전체 target protein 대비 sup에 존재하는 단백질량을 Luminescent Image Analyzer 3 (#BR17001401, BioRad) 와 Image Lab Software를 이용하여 band density 비교하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, Optipharm-PCV2d 재조합 배큘로바이러스의 secretion 효율이 90%로 가장 높은 것으로 확인되어 해당 strain을 선발하였다.

한편, 웨스턴 블랏을 수행하기위해 시료를 12% SDS-PAGE gel에서 250V 전압으로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔은 Coomassie brilliant blue solution로 염색하고 Destaining solution으로 탈색하여 관찰하였다. SDS-PAGE gel을 nitrocellulose membrane에 25V로 7분 동안 transfer하였고, blocking을 위해 TBS-T 완충액에 녹인 5% skim milk를 1시간 처리하였다. 1차 항체로 메디안디노스틱사의 PCV2d 특이 단클론항체 (Anti-PCV2, 12B87, 1:4,000)를 5% skim milk를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 처리한 후, 10분씩 3번 세척하였다. 2차 항체 역시 5% skim milk를 녹인 TBS-T 완충액에 희석하여 1시간 동안 처리하였고, 10분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 membrane에 WESTSAVEUP(Abfrontier, USA)을 처리하여 특이 밴드를 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Optipharm-PCV2d를 이용하여 생산한 목적 단백질의 특이적인 밴드만이 관찰되었고, 생산된 목적 단백질의 대다수가 세포 밖으로 분비(secretion)되어 상층액(sup)에 존재함을 확인하였다.

<4-2> Optipharm-PCV2d 재조합바이러스의 역가 확인

발현 및 secretion 효율이 높은 Optipharm-PCV2d 재조합바이러스의 역가를 확인하였다.

구체적으로, Optipharm-PCV2d 재조합바이러스는 96 well plate에 Sf9 세포를 분주 후 희석접종하여 titer 측정 진행 후 End-point dilution 방법을 통해 plaque forming unit(PFU)/ml 값을 계산하였으며 3번 반복 실험을 수행하였다.

그 결과, 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 3회 반복 실험에서 Optipharm-PCV2d는 모두 1X10^8PFU/mL 이상의 높은 seed 역가를 나타냄을 확인하였다.

<실시예 5> 재조합 배큘로바이러스 NGS(Next Generation Sequencing) 분석

상기 실시예 4에서 생산한 Optipharm-PCV2d 재조합 바이러스의 유전체 서열을 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, whole genome DNA를 짧게 잘라 DNA단편을 만들고, 각각의 DNA 단편을 Sequencing 한 후 이를 조립하여 유전체 서열을 작성하는 방식인 Macrogen 사의 NGS De novo assembly을 통하여 Optipharm-PCV2d와 StrainF-p-PCV2d 재조합 배큘로바이러스의 유전자 분석을 진행하였다. Optipharm-PCV2d는 상업용 제품인 BD Gold-PCV2d와 동일한 형태를 보이고 있는데 BD Gold가 AcNPV에서 특정 유전자가 deletion 되어있어, chiA, v-cath, p10/p26/p74 모두 deletion 되어 있지 않은 flashBAC PRIME(StrainF-p)과 비교하여 secretion 효율의 차이의 원인을 확인하고자 하였다.

그 결과, 도 4 및 표 2에 나타난 바와 같이, Optipharm-PCV2d 재조합 바이러스는 총 135,317bp의 크기로, StrainF-p-PCV2d 재조합 배큘로바이러스와 동일하게 152개의 ORF가 존재함을 확인하였다. 유전자 분석 결과 기준으로 두 재조합 배큘로바이러스를 비교하였을 때 2개의 ORF(126, 136)에서 99%의 상동성을 확인하였다. ORF-126은 chitinase, ORF-136 은 hypothetical protein로 두 orf 모두 아미노산 1개의 차이가 확인되었다. 이러한 전체 ORF 분석을 통해 차이를 보인 Chitinase 유전자의 경우 곤충세포에서 secretion pathway에 관여하는 중요한 유전자로 알려져있기 때문에 chitinase의 아미노산 차이에 의해 목적 단백질의 secretion에 영향이있을 것으로 예상하였다

<실시예 6> PCV2d 항원 정량

상기 실시예 4에서 생산한 Optipharm-PCv2d의 PCV2d 항원을 정량하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4에서 생산한 Optipharm-PCv2d의 PCV2d 항원과 상용 백신인 CircoFLEX(대조군)를 INgezim사의 INgezim PCV DAS 키트 및 2차 Ab로 메디안디노스틱사의 12B87 mAb-HRP를 이용하여 ELISA 및 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, PCV2d 항원이 CircoFLEX 대비 약 3~4배 생산성이 높음을 확인하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 상 band density도 반응성 차이가 있음을 확인하였다.

<실시예 7> 일자에 따른 PCV2d 항원 정량 분석

생산성을 검정하기 위하여 일자에 따른 발현 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 Optipharm-PCV2d 재조합 배큘로바이러스를 Hi5 세포에 0.01 MOI(multiplicity of infection)로 접종 후 일자별 수거하였으며, INgezim사의 INgezim PCV DAS 키트를 이용하여 ELISA 및 SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 일자별 발현량 증대 및 secretion 증가하는 것을 확인하였으며, 15일차에 최대 발현량 도달함을 확인하였다.

<실시예 8> PCV2d ORF2 단백질의 특성 분석

상기 실시예 4에서 생산한 Optipharm-PCv2d에서 생산된 단백질의 특성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4에서 Optipharm-PCv2d 또는 CircoFLEX에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질을 포함하는 secretion된 배양액을 이용하여 GPC(Gel Permeation Chromatography)분석을 진행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, PCV2d ORF2 단백질로 이루어진 VLP(8번 fraction)와 Monomer(14번 fraction)를 확인하였다.

또한, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏, TEM 분석을 통해 추가적으로 확인하였고, 해당 결과는 도 10 및 도 11에 나타내었다. 도 10에서는 PCV2b를 control로 하여 PCV2d를 확인하였을 때, PCV2b와 같이 PCV2d도 8번, 14번 fraction에서 target이 확인되는 것을 1차적으로 SDS-PAGE와 Western Blot으로 확인하였고, 최종적으로 TEM 분석을 통하여 8번 fraction이 VLP, 14번 fraction이 monomer가 존재함을 확인하였다.

<실시예 8> PCV2d 백신 조성물의 제조 및 항체 생성능 확인

Optipharm-PCv2d에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질로부터 백신 조성물을 제조하여 항체 생성능을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4에서 Optipharm-PCv2d에서 생산된 PCV2d ORF2 단백질을 포함하는 secretion된 배양액 1.5mL과 0.2% Carbopol 1.5mL을 혼합하여 백신 조성물을 제조하였다. 주사는 2mL씩 2주 간격으로 2회 주사하였으며, 18주차까지 주차별 혈청을 분리하여 시료로 사용하였다. 항원에 대한 특이 항체의 생성여부 및 혈액 내 항체가 분석을 위해 Synbiotics사의 항체가 측정용 ELISA 키트(SERELISA®PCV2 Ab Mono Blocking)를 사용하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 18주차까지 PCV2d ORF2에 대한 특이적인 항체가 유지됨을 확인하였다.

또한, 18주차 면역 혈청을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 진행하였다.

구체적으로, 샘플은 Ophtipharm-PCV2d와 PCV2b와 PCV2d의 ORF2 단백질을 사용하였고, 1차 항체로 PCV2d 백신 조성물에 의해 생성된 18주차 혈청을 사용하여 반응성을 확인하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, PCV2b와 비교하여 PCV2d에 대한 특이적 반응을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 Ophtipharm-PCV2d 단백질을 포함하는 백신 조성물이 PCV2b와 대비하여 PCV2d에 대한 특이도가 높음을 시사한다.

<실시예 9> 배양법 비교를 통한 PCV2d 재조합 배큘로바이러스의 생산성 확인

상기 실시예 4에서 제작한 재조합 배큘로바이러스 Ophtipharm-PCV2d를 곤충세포 Hi5에 같은 조건으로 접종 후 각각 roller 배양법, 부유(suspension) 배양법으로 배양 후 감염된 곤충세포 및 배양액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다.

구체적으로, roller 배양법은 Hemocytometer 이용하여 Hi5 cell line 계수하고 생존율 95% 이상 cell을 사용하였다. 850cm² Polystyrene Roller Bottle에 200 mL의 Express Five™SFM 배지를 분주하고 계수된 생존율 95%이상의 Hi5 cell을 5×10^5 cells/mL (200 mL 기준 1.0 ×10^8 cells)로 seeding 하고, 30분 동안 배양하여 cell을 부착시켜주었다. 배지와 cell을 seeding하여 준비된 850cm² Polystyrene Roller Bottle에 seed를 0.1 MOI 로 접종하고, 15일 동안 27℃ roller incubator에 0.29 rpm(0.25~0.30 rpm)으로 배양하였다.

한편, 부유 배양을 위해 Hemocytometer 이용하여 Hi5 cell line 계수하고 생존율 95% 이상 cell을 사용하였다. 1L Erlenmeyer flask에 200 mL의 Express Five™SFM 배지를 분주하고 계수된 생존율 95% 이상의 Hi5 cell을 5×10^5 cells/mL (200 mL 기준 1.0 ×10^8 cells)로 seeding 하였다. 배지와 cell을 seeding하여 준비된 1L Erlenmeyer flask에 seed를 0.01 MOI 로 접종하고, 15일 동안 27℃shaking incubator에 130 rpm으로 배양하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, roller 배양법 대비 부유 배양법에서 SDS-PAGE density 약 2배 증가되었음을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자.
제1항에 있어서,
상기 재조합 유전자는 곤충세포에서의 PCV2d ORF2 단백질의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인, 재조합 유전자.
제1항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 암호화하는 것인, 재조합 유전자.
제1항의 재조합 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 목적 단백질의 발현 및 분비가 증대된 것인, 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터가 형질도입된 재조합 베큘로바이러스.
제7항의 배큘로바이러스를 세포에 접종하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법.
제8항에 있어서,
상기 세포는 부유 배양법으로 배양되는 것인, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질 제조 방법.
제8항의 제조 방법에 의해 제조된, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질.
제11항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되는 것인, 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2 재조합 단백질을 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방용 백신 조성물.
제13항에 있어서, 상기 돼지 써코바이러스 감염성 질환은 이유후 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome), 가성 광견병 (pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 글래서병 (Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염 (streptococcal meningitis), 살모넬라증 (salmonellosis), 이유후 대장균증 (postweaning colibacillosis), 식이성 간증 (dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴 (suppurative bronchopneumonia)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방용 백신 조성물.
제13항의 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 배큘로바이러스에 형질도입하는 단계;
상기 배큘로바이러스를 세포에 접종하여 부유 배양하는 단계; 및
상기 세포로부터 돼지 써코바이러스 2d(PCV2d)의 오픈 리딩 프레임 2(open reading frame, ORF2) 재조합 단백질을 수득하는 단계;
를 포함하는 돼지 써코바이러스 감염성 질환의 예방용 백신 조성물의 제조 방법.