KR20240066519A - A novel MERS coronavirus vaccine composition and use thereof - Google Patents
A novel MERS coronavirus vaccine composition and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240066519A KR20240066519A KR1020220145593A KR20220145593A KR20240066519A KR 20240066519 A KR20240066519 A KR 20240066519A KR 1020220145593 A KR1020220145593 A KR 1020220145593A KR 20220145593 A KR20220145593 A KR 20220145593A KR 20240066519 A KR20240066519 A KR 20240066519A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mers
- protein
- vesicular stomatitis
- stomatitis virus
- vaccine composition
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 115
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 96
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims abstract description 83
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 claims description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical group NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 claims description 12
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 7
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 6
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 102100034338 Glycosyl-phosphatidylinositol-anchored molecule-like protein Human genes 0.000 claims description 4
- 208000019202 Orthocoronavirinae infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108700001624 vesicular stomatitis virus G Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 19
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 83
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- -1 inactivators Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101150093210 DPP4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 101100458289 Drosophila melanogaster msps gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220506215 Lysophospholipid acyltransferase 5_M51R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102220252346 rs1555801105 Human genes 0.000 description 2
- 102200065572 rs28364364 Human genes 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 244000147568 Laurus nobilis Species 0.000 description 1
- 235000017858 Laurus nobilis Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 235000005212 Terminalia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- AWGTVRDHKJQFAX-UHFFFAOYSA-M chloro(phenyl)mercury Chemical compound Cl[Hg]C1=CC=CC=C1 AWGTVRDHKJQFAX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- UMNKXPULIDJLSU-UHFFFAOYSA-N dichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)Cl UMNKXPULIDJLSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099364 dichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
본 발명은 메르스 코로나바이러스에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 메르스 코로나바이러스의 S 단백질을 발현하는 재조합 수포성 구내염 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 메르스 코로나바이러스 항원 단백질을 효과적으로 발현할 수 있으며, 적은 양으로도 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있고, 단일 혈청형의 백신 조성물이 프라이밍 면역화 및 부스팅 면역화 모두에 사용되는 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a recombinant vesicular stomatitis virus expressing the S protein of MERS coronavirus, which can induce an immune response against MERS coronavirus, and its use.
The recombinant vesicular stomatitis virus can effectively express the MERS coronavirus antigen protein and effectively induce an immune response even in a small amount, and the vaccine composition of a single serotype can be used for both priming immunization and boosting immunization. It is characterized by
Description
본 발명은 신규한 메르스 코로나바이러스 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것이며, 특히 재조합 수포성 구내염 바이러스에 기반한 신규한 메르스 코로나바이러스 백신 조성물로서, 한가지 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스를 사용하여 프라이밍 및 부스팅 면역을 유도할 수 있는 신규한 메르스 코로나바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a novel MERS coronavirus vaccine composition and uses thereof, and in particular to a novel MERS coronavirus vaccine composition based on a recombinant vesicular stomatitis virus, comprising priming and It relates to a novel MERS coronavirus vaccine composition capable of inducing boosting immunity.
메르스 코로나 바이러스 (MERS-CoV, Middle East Respiratory Syndrome - Coronavirus)는 막으로 둘러싸여 있고 단일가닥의 양성 센스(Positive-sense) 비분절 RNA 게놈을 포함하는 바이러스로 베타 코로나 바이러스에 속한다. 게놈 사이즈는 약 30킬로 베이스(kb) 이며 11개의 단백질을 코딩하며 복제관련 단백질과 백신 개발의 주요 타겟인 스파이크단백질, 그리고 외피단백질, 막단백질, 캡시드 단백질등 4개의 구조 단백질을 포함한다. 메르스 바이러스는 2-14일의 잠복기를 갖고 있으며 중증 호흡기 질환을 일으키며 열, 기침과 호흡이 짧아지는 증상이 있으며 신장 이상 등을 일으키기도 한다. 2012년 사우디 아라비아에서 최초로 보고되어 빠른 속도로 전파되어 중동 및 인접 국가로 전파되었으며 여행객들에 의해 미국, 유럽 및 한국(35명 감염, 3명 사망), 중국 등지에서도 감염 확산이 확인되었으며, 확진자의 약 30~40%의 치사율을 나타내어 세계적으로 약 430명(WHO 2015)이 사망한 것으로 알려졌다. 높은 치사율과 전 세계적인 이동으로 인한 사람 간 전파를 생각할 때 효과적인 메르스 코로나 바이러스 백신개발이 이 질병 발병과 전파를 방지하는데 반드시 필요하다.MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome - Coronavirus) is a membrane-enclosed virus containing a single-stranded positive-sense non-segmented RNA genome and belongs to the betacoronavirus family. The genome size is approximately 30 kilobases (kb) and encodes 11 proteins, including replication-related proteins, spike protein, which is the main target for vaccine development, and four structural proteins, including envelope protein, membrane protein, and capsid protein. The MERS virus has an incubation period of 2-14 days and causes severe respiratory disease, with symptoms such as fever, cough and shortness of breath, and can also cause kidney problems. It was first reported in Saudi Arabia in 2012 and spread rapidly to the Middle East and neighboring countries. The spread of infection was also confirmed in the United States, Europe, Korea (35 infections, 3 deaths), and China due to travelers. It is reported that about 430 people have died worldwide (WHO 2015), with a fatality rate of about 30-40%. Considering the high mortality rate and human-to-human transmission due to global movement, the development of an effective MERS coronavirus vaccine is essential to prevent the outbreak and spread of this disease.
메르스 코로나 바이러스는 스파이크 단백질(Spike, S Protein)을 이용하여 숙주 세포에 감염하게 되는데, 이 S 단백질은 호모트리머(homotrimers) 형태로 막에 존재하는 당 단백질이며 서브유닛 1, 2 (S1, S2)로 잘라지는 타입 1 막 단백질에 속한다. S protein 은 S1의 리셉터 결합 도메인(RBD, Receptor Binding Domain)을 통해서 숙주세포 막에 존재하는 수용체(receptor)인 디펩티딜 펩티데이즈 4(DPP4, Dipeptidyl peptidase 4)에 결합하고 S2의 융합(Fusion) 활동에 의해 세포막으로 결합하여 감염이 된다. 이 RBD에는 매우 효과적인 중화항체를 유도하는 핵심중화부위(CND, Critical neutralizing domain)를 포함하기 때문에 메르스 코로나바이러스에 대한 백신은 S 단백을 타겟으로 하여 개발하는 것이 중요하다. 이미 많은 다양한 백신 후보들이 S 단백질을 타겟으로 개발 중에 있지만 여전히 안전하고 매우 효과적인 백신이 출현하지 않고 있어 신속한 백신 개발이 반드시 필요한 상황이다.The MERS coronavirus infects host cells using the spike protein (Spike, S Protein), which is a glycoprotein that exists in the membrane in the form of homotrimers and is composed of subunits 1 and 2 (S1, S2). ) belongs to type 1 membrane proteins that are cleaved. S protein binds to dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), a receptor present in the host cell membrane, through the receptor binding domain (RBD) of S1 and has fusion activity in S2. It binds to the cell membrane and becomes infected. Because this RBD contains a critical neutralizing domain (CND) that induces highly effective neutralizing antibodies, it is important to develop a vaccine against the MERS coronavirus targeting the S protein. Many different vaccine candidates are already being developed targeting the S protein, but a safe and highly effective vaccine has not yet emerged, making rapid vaccine development essential.
이런 필요성에 의거하여 이미 메르스 바이러스에 대하여 면역반응을 일으키는 백신이 개발되어 있지만 기존 백신의 경우, 프라이밍 백신 조성물과 부스팅 백신 조성물에서 상이한 혈청형의 백신 유닛을 사용함에 따라, 생산비가 상승하는 등의 어려움이 있었고 또한 효과적이고 강한 면역 반응 유도에 미치지 못하였으므로 이를 개선하고자 하였다.Based on this need, a vaccine that causes an immune response against the MERS virus has already been developed, but in the case of existing vaccines, production costs increase as vaccine units of different serotypes are used in the priming vaccine composition and boosting vaccine composition. There were difficulties and it did not reach the level of inducing an effective and strong immune response, so we sought to improve this.
본 발명자들은 기존의 메르스 코로나바이러스 백신보다 매우 효과적이고 백신을 제조하고자 하며, 또한The present inventors seek to manufacture a vaccine that is more effective than the existing MERS coronavirus vaccine, and also
본 발명자들은 기존의 재조합 수포성 구내염 바이러스의 2가지 상이한 혈청형을 포함하는 프라임-부스트 메르스 코로나 백신으로부터 한 가지 혈청형만으로 매우 효과적인 면역을 유도하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하고자 한다.The present inventors seek to prepare a vaccine or immunogenic composition that induces highly effective immunity with only one serotype from a prime-boost MERS coronavirus vaccine containing two different serotypes of an existing recombinant vesicular stomatitis virus.
본 발명자들은 메르스 코로나 스파이크 S 단백질(이하, S 단백질)이 바이러스 외막에 호모트리머로 존재한다는 것은 이들의 3차원적 구조가 바이러스 기능과 세포로의 감염에 필수적임을 암시하는 것으로 파악하고, S 단백질의 고유의 구조가 백신에 표현되도록 S 단백질 전체가 재조합 수포성 구내염 바이러스 표면에 발현되도록 디자인하였다. 이렇게 디자인된 백신은 투여시 백신자체에 발현되어 있는 메르스 코로나 바이러스의 S 단백질과 인체 내에서 증폭되는 S 단백질에 직 간접적으로 면역반응을 유도할 뿐 아니라, 한 가지 혈청형의 백신유닛이 프라임백신 및 부스트 백신으로 동일하게 사용되는 경우에도 효과적으로 메르스 코로나 바이러스를 방어 할 수 있는 백신을 완성할 수 있게 되었다.The present inventors understood that the presence of the MERS corona spike S protein (hereinafter referred to as S protein) as a homotrimer in the viral outer membrane suggests that their three-dimensional structure is essential for viral function and infection into cells, and that the S protein The entire S protein was designed to be expressed on the surface of the recombinant vesicular stomatitis virus so that its unique structure could be expressed in the vaccine. The vaccine designed in this way not only directly or indirectly induces an immune response to the S protein of the MERS coronavirus expressed on the vaccine itself and the S protein amplified in the human body when administered, but also the vaccine unit of one serotype is the prime vaccine. It has been possible to complete a vaccine that can effectively protect against the MERS coronavirus even when used as a boost vaccine.
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하고 대상체에서 메르스 코로나 바이러스 감염을 예방하는데 유용한 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV), 면역화 플랫폼, 면역 요법 및 약제를 특징으로 한다. 본 발명의 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 메르스 코로나 바이러스 스파이크(S) 유전자를 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서, 상기 스파이크 S 유전자는 N-말단에 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드 (msp)로 유전자 변형되고, 상기 수포성 구내염 바이러스 당 단백질 (Gtc)의 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리는 MERS-CoV S 단백질에 대해 효과적인 체액성 면역반응을 촉발하는 슈도타입 수포성 구내염 바이러스를 형성하기 위하여 유전자 변형된다. The present invention features recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV), immunization platforms, immunotherapies and pharmaceuticals useful for inducing an immune response in a subject and preventing MERS coronavirus infection in the subject. The recombinant vesicular stomatitis virus of the present invention is characterized by the MERS coronavirus spike (S) gene. In an embodiment of the present invention, the Spike S gene is genetically modified with a bee melittin signal peptide (msp) at the N-terminus, and the transmembrane domain and cytoplasmic tail of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (Gtc) are MERS-CoV Genetically modified to form a pseudotype vesicular stomatitis virus that triggers an effective humoral immune response against the S protein.
상기 플랫폼, 요법 및 약제는 메르스 코로나 바이러스 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 수포성 구내염 바이러스 (rVSV) 인디아나 혈청형 (rVSVInd)을 포함하는 하나의 백신 또는 면역원성 조성물로 구성되며 실시예에서, 상기 S 폴리 펩타이드는 N-말단에 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드 를 그리고 C-말단에 수포성 구내염 바이러스 당 단백질을 갖는다. The platforms, therapies and medicaments consist of a vaccine or immunogenic composition comprising a recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) Indiana serotype (rVSVInd) expressing MERS coronavirus polypeptide and, in an embodiment, the S poly The peptide has a bee melittin signal peptide at the N-terminus and a vesicular stomatitis virus glycoprotein at the C-terminus.
본 발명은 한가지 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 특징으로 한다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 대상체에게 생체내(in vivo)투여하기에 적합한 형태이다. 상기 물질은 임의의 동물 또는 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 동결 및 동결 건조 제제로 제공될 수 있다. 또한 본 발명의 백신은 수송을 위해 동결될 수 있는 용액으로서 제공될 수 있다. 추가적으로, 상기 백신은 적합한 보존제(preservatives), 예컨대 인간 알부민, 소 알부민(bovine albumin), 수크로스(sucrose), 글리세롤을 함유할 수 있고 또는 보존제 없이 제형화될 수 있다. 적절한 경우 (즉, 상기 백신에서 VSV에 대한 손상이 없는 경우), 상기 백신은 또한 적합한 희석제(diluents), 보조제(adjuvants) 및/또는 담체(carriers)를 함유할 수 있다. 상기 백신의 용량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 성능과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여 방법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 또한 상기 백신의 용량은 상황에 따라 적합한 예방적 용량 반응을 제공하기 위하여 다양해질 수 있다.The present invention features a vaccine or immunogenic composition comprising a recombinant vesicular stomatitis virus of one serotype. The vaccine or immunogenic composition of the present invention is in a form suitable for in vivo administration to a subject. The substances can be administered to any animal or subject, preferably humans. The vaccine of the present invention may be provided in frozen and lyophilized formulations. The vaccine of the present invention can also be provided as a solution that can be frozen for transport. Additionally, the vaccine may contain suitable preservatives, such as human albumin, bovine albumin, sucrose, glycerol, or may be formulated without preservatives. Where appropriate (i.e. there is no damage to VSV in the vaccine), the vaccine may also contain suitable diluents, adjuvants and/or carriers. The dose of the vaccine may vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual, and the ability of the antibody to induce the desired response in the individual. The method of administration may be adjusted to provide optimal therapeutic response. Additionally, the dose of the vaccine may be varied to provide an appropriate protective dose response depending on the situation.
본 발명은 대상체에 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 방법을 포함하는, 대상체에서 메르스 코로나 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법 및/또는 대상체에서 메르스 코로나 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다The present invention provides a method for inducing an immune response against MERS coronavirus in a subject, including a method of administering an effective amount of the vaccine or immunogenic composition of the present invention to the subject, and/or preventing or preventing MERS coronavirus infection in the subject. Features a treatment method
또한, 본 발명은 대상체에서 메르스 코로나 바이러스에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 메르스 코로나 바이러스 스파이크(S) 유전자를 운반하는 하나의 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 유효량의 백신 또는 면역원성 조성물을 대상체에 1회 이상 투여하는 방법을 특징으로 하며, 바람직하게는 2회를 투여하며, 필요에 따라 3회 이상 투여 할 수 있다. The present invention also provides a method of inducing an immune response against MERS coronavirus in a subject, the method comprising a recombinant vesicular stomatitis virus of one serotype carrying the MERS coronavirus spike (S) gene. It is characterized by a method of administering an effective amount of a vaccine or immunogenic composition to a subject at least once, preferably twice, and can be administered at least three times if necessary.
일 실시예에서, 상기 메르스 코로나 바이러스 스파이크(S) 유전자는 상기에 기술된 유전자 변형된 메르스 코로나 바이러스 스파이크(S) 유전자 중 하나를 포함한다.In one embodiment, the MERS coronavirus spike (S) gene comprises one of the genetically modified MERS coronavirus spike (S) genes described above.
본 발명의 재조합 VSV 기반 플랫폼 기술의 장점은 한 가지 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스로도 효과적으로 프라이밍(priming) 및 부스팅(boosting)을 시킬 수 있어서 백신 개발에 유리 하며, 본 발명의 유전자 변형된 VSVInd M 유전자 돌연변이 (rVSVInd-GML) 벡터는 완전히 안전하고, 약독화된 온도-민감성 돌연변이이다. 또한, 외래 유전자를 운반하는 rVSVInd-GML, 벡터는 매우 효율적으로 복제된다. 따라서, 고역가(high titer) 재조합 수포성 구내염 바이러스 기반 백신은 비교적 제조하기 쉽다. rVSVInd-GML, 벡터는 바이러스 역가를 감소시키지 않으면서 최대 6,000개의 뉴클레오티드를 가진 대형 외래 유전자를 수용할 수 있고, 마지막으로, 재조합 수포성 구내염 바이러스는 인간을 포함한 매우 넓은 숙주 범위를 갖는다.The advantage of the recombinant VSV-based platform technology of the present invention is that it can effectively priming and boosting even with one serotype of recombinant vesicular stomatitis virus, which is advantageous for vaccine development, and the genetically modified VSVInd of the present invention The M gene mutant (rVSVInd-GML) vector is a completely safe, attenuated temperature-sensitive mutant. Additionally, the rVSVInd-GML, vector carrying the foreign gene replicates very efficiently. Therefore, high titer recombinant vesicular stomatitis virus-based vaccines are relatively easy to prepare. The rVSVInd-GML, vector can accommodate large foreign genes of up to 6,000 nucleotides without reducing viral titer, and finally, the recombinant vesicular stomatitis virus has a very wide host range, including humans.
본원 발명의 백신조성물은메르스 코로나바이러스 항원 단백질을 효과적으로 발현하며 적은 양으로도 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 바, 메르스 코로나바이러스 백신 개발에 유용하게 이용할 수 있다.The vaccine composition of the present invention effectively expresses the MERS coronavirus antigen protein and can effectively induce an immune response even with a small amount, so it can be usefully used in the development of a MERS coronavirus vaccine.
또한, 본원 발명의 백신조성물은 한 가지 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)로도 효과적으로 프라이밍(priming) 및 부스팅(boosting) 면역화를 유도할 수 있어서 효과적으로 개체의 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였는 바, 비용 절감 및 생산 시간 단축 등으로 인해 효과적으로 우수한 백신 개발에 유리하다는 장점이 있다.In addition, it was confirmed that the vaccine composition of the present invention can effectively induce priming and boosting immunization even with one serotype of recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV), thereby effectively inducing an immune response in the subject. As such, it has the advantage of being advantageous for effectively developing excellent vaccines due to cost reduction and shortened production time.
본 발명은 본 명세서에 개시된 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 완전히 이해 될 수 있을 것이며, 이는 예시적으로 설명한 것에 불과하며 본 발명의 의도된 범위를 한정하지 않는다.
도 1은 본 발명의 메르스 코로나바이러스 S 단백질을 발현하는 구조물(rVSV-mS)을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 비병원성 수포성 구내염 바이러스(VSV)인 인디아나 혈청형 (VSVInd-GML)의 매트릭스 유전자 변이를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 pVSV MERS S 및 pVSV MERS mspS-Gtc의 벡터맵을 나타낸 도면이다.
도 4는 pVSV MERS S 및 pVSV MERS mspS-Gtc 벡터의 제한효소 분석법의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 메르스 코로나바이러스 S(MERS S) 및 pVSV MERS mspS-Gtc의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 메르스 코로나바이러스 S(MERS S) pVSV MERS mspS-Gtc의 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 메르스 코로나바이러스 백신 조성물의 면역 효과 시험 일정 및 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 메르스 코로나바이러스 백신 조성물의 면역원성 평가(ELISpot) 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 메르스 코로나바이러스 백신 조성물에 대한 챌린지 보호 실험 일정을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 메르스 코로나바이러스 백신 조성물에 대한 챌린지 보호 실험 결과를 나타낸 도면이다.The present invention may be more fully understood with reference to the detailed description disclosed herein and the accompanying drawings, which are illustrative only and do not limit the intended scope of the present invention.
Figure 1 is a diagram schematically showing a construct (rVSV-mS) expressing the MERS coronavirus S protein of the present invention.
Figure 2 is a diagram schematically showing the matrix gene mutations of Indiana serotype (VSVInd-GML), a non-pathogenic vesicular stomatitis virus (VSV).
Figure 3 is a diagram showing vector maps of pVSV MERS S and pVSV MERS mspS-Gtc.
Figure 4 is a diagram showing the results of restriction enzyme analysis of pVSV MERS S and pVSV MERS mspS-Gtc vectors.
Figure 5 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of MERS coronavirus S (MERS S) and pVSV MERS mspS-Gtc.
Figure 6 is a diagram showing the results of Western blotting analysis of MERS coronavirus S (MERS S) pVSV MERS mspS-Gtc.
Figure 7 is a diagram showing the immune effect test schedule and analysis results of the MERS coronavirus vaccine composition of the present invention.
Figure 8 is a diagram showing the immunogenicity evaluation (ELISpot) results of the MERS coronavirus vaccine composition of the present invention.
Figure 9 is a diagram showing the challenge protection test schedule for the MERS coronavirus vaccine composition of the present invention.
Figure 10 is a diagram showing the results of a challenge protection test for the MERS coronavirus vaccine composition of the present invention.
본 명세서에서 사용된 실시예 및 첨부된 청구 범위에 사용된 특정 용어 및 문구의 의미가 하기에 제공된다. 다른 설명이 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. The meaning of certain terms and phrases used in the examples and appended claims herein are provided below. Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
본 명세서에 사용된 용어 "동물" 및 "대상체"는 포유 동물이다.As used herein, the term "animal" and "subject" is a mammal.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 결과를 달성하는데 필요한 효과적 용량 및 투여량 및 기간을 의미한다.As used herein, the term "effective amount" refers to the effective dose and dosage and period of administration required to achieve the desired result.
본 명세서에 사용된 용어 "rVSV"는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 지칭하기 위해 사용된다.As used herein, the term "rVSV" is used to refer to recombinant vesicular stomatitis virus.
본 명세서에 사용된 용어 "인디아나" 및 "IND"는 VSV 혈청형 인디아나 (VSVInd)를 지칭하기 위해 사용된다.As used herein, the term "Indiana" and "IND" are used to refer to VSV serotype Indiana (VSVInd).
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하고 대상체에서 메르스 코로나 바이러스(MRERS-CoV) 감염을 예방하는데 유용한 재조합 수포성 구내염 바이러스 (rVSV), 면역화 플랫폼, 면역 요법 및 약제를 제공한다. The present invention provides recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV), immunization platforms, immunotherapies and pharmaceuticals useful for inducing an immune response in a subject and preventing MERS-CoV infection in a subject.
본 발명의 일 양상에서, 메르스 코로나바이러스의 스파이크(S) 단백질을 발현하는 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)를 제공한다. 상기 메르스 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 유전자 변형된 것(이하 항원 단백질이라 함)으로, 메르스 코로나바이러스의 전장(full-length) S 단백질 유래 서열을 포함하고, N-말단은 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열을 추가하여 포함하며, C-말단은 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV G 단백질) 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열을 포함한다. 상기 멜리틴 신호 펩타이드는 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드(msp)가 사용되어, S 유전자의 N-말단이 변형되고, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열은 메르스 코로나바이러스의 S 단백질에 대해 효과적인 체액성 면역반응을 촉발하는 슈도타입 수포성 구내염 바이러스를 형성하기 위해 유전자 변형된 것이다. 본원 발명의 일 예에서, 상기 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스에 의해 발현되는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. In one aspect of the invention, a recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) expressing the spike (S) protein of MERS coronavirus is provided. The spike protein of the MERS coronavirus is genetically modified (hereinafter referred to as antigen protein) and contains a sequence derived from the full-length S protein of the MERS coronavirus, and the N-terminus is derived from a melittin signal peptide. Additional sequences include, wherein the C-terminus includes sequences derived from the vesicular stomatitis virus G protein (VSV G protein) transmembrane domain and cytoplasmic tail. The melittin signal peptide is a bee melittin signal peptide (msp), in which the N-terminus of the S gene is modified, and the transmembrane domain and cytoplasmic tail-derived sequences provide effective humoral immunity against the S protein of MERS coronavirus. It has been genetically modified to form a pseudotype of vesicular stomatitis virus that triggers the response. In one example of the present invention, the protein expressed by the recombinant vesicular stomatitis virus includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본원 발명의 재조합 수포성 구내염 바이러스는 바람직하게는 인디아나 혈청형 (rVSVInd)이며, 상기 인디아나 혈청형은 바람직하게는 돌연변이 매트릭스 단백질(mutant matrix protein; M)을 포함하고, GML 돌연변이 (rVSVInd-GML)일 수 있다.The recombinant vesicular stomatitis virus of the invention is preferably of the Indiana serotype (rVSVInd), wherein the Indiana serotype preferably comprises a mutant matrix protein (M) and has a GML mutation (rVSV Ind -GML). It can be.
본원발명의 다른 양상에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다. 본원 발명의 백신 조성물은 특히 프라이밍 백신 조성물 및 부스팅 백신 조성물에 동일하게 사용될 수 있다.In another aspect of the present invention, a vaccine composition for preventing MERS coronavirus infection disease is provided, comprising the recombinant vesicular stomatitis virus as an active ingredient. The vaccine composition of the present invention can be used equally in priming vaccine compositions and boosting vaccine compositions.
상기 백신 조성물은 근육 투여용, 피하 투여용, 복강 투여용, 정맥 투여용, 정맥 투여용, 진피 투여용, 안구 투여용 및 뇌 투여용 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.The vaccine composition may be provided as a composition for intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intravenous administration, dermal administration, ocular administration, and brain administration, and the vaccine composition is pharmaceutically acceptable. Possible excipients, diluents or carriers may be additionally included.
또 다른 양상은 상기 재조합 VSV를 포함하는 유효량의 조성물을 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스에 대한 포유 동물의 면역 반응 유도 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of inducing an immune response in a mammal against MERS coronavirus, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition comprising the recombinant VSV.
하나의 실시예에서, 본원의 조성물을 포유 동물에게 투여하여 프라이밍 면역 반응을 유도하는 단계 및, 이후, 동일한 백신 조성물을 동물에게 투여하여 부스팅 면역화를 유도하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스에 대한 면역 반응 유도 방법을 제공한다.In one embodiment, immunization against MERS coronavirus comprising administering the composition of the present disclosure to a mammal to induce a priming immune response, and then administering the same vaccine composition to the animal to induce boosting immunization. A method for inducing a reaction is provided.
본 명세서에서의 용어, "스파이크 S 단백질"은 바이러스의 표면에 배열되어 있는 돌기상 구조물로서, 길이는 10~15nm로 세포막에 있는 단백질 수용체와 결합해 우리 몸에 침투하는 일을 전담하고 있다. 따라서, 바이러스가 사람의 세포 속으로 들어갈 때 중요한 역할을 하고 있는 것이 상기 스파이크 단백질이다. 특히 바이러스는 스파이크 단백질의 결합 능력에 따라 감염되는 숙주가 달라진다. 따라서, S 단백질을 이용해 바이러스 치료용 백신, 항체 및 진단 개발에 활용할 수 있다.The term "Spike S protein" in this specification is a protruding structure arranged on the surface of the virus, is 10 to 15 nm long, and is responsible for infiltrating our body by binding to the protein receptor on the cell membrane. . Therefore, the spike protein plays an important role when the virus enters human cells. In particular, the host that a virus infects varies depending on the binding ability of the spike protein. Therefore, the S protein can be used to develop vaccines, antibodies, and diagnostics for virus treatment.
상기 항원 단백질은 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열, 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열 및 수포성 구내염 바이러스 G 단백질 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열을 포함하는 재조합 항원으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.The antigen protein is a recombinant antigen comprising a sequence derived from a melittin signal peptide, a sequence derived from the S protein of MERS coronavirus, and a sequence derived from the vesicular stomatitis virus G protein transmembrane domain and cytoplasmic tail, and includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be, and specifically may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 상기 항원 단백질은 상기 서열번호 1로 구성된 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.In addition, the antigen protein is not only the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 98% or more, and most specifically is an amino acid sequence showing more than 99% homology, and includes without limitation any amino acid sequence that is substantially the same as that of the protein or shows a corresponding effect. In addition, it is clear that, as long as the amino acid sequence has such homology, amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added are also included within the scope of the present invention.
본 명세서에서의 용어 "상동성" 이란, 단백질을 암호화하는 염기 서열이나 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물 및 단백질은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 또한, 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도에 따라 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.In this specification, the term "homology" This refers to the degree of similarity of the base sequence encoding a protein or the amino acid sequence constituting the protein. If the homology is sufficiently high, the expression product and protein of the gene may have the same or similar activity. Homology can also be expressed as a percentage based on the degree of matching to a given amino acid or base sequence. In this specification, a given amino acid or nucleotide sequence and its homologous sequence having the same or similar activity are indicated as "% homology". For example, standard software for calculating parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or hybridization used under defined stringent conditions. It can be confirmed experimentally by comparing sequences, and appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the relevant technology and methods well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
상기 항원 단백질은 N-말단부터 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열, 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열 및 VSV G 단백질 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열 순으로 연결된 것일 수 있으며, 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 연결된 것일 수 있다.The antigen protein may be linked in the following order from the N-terminus to the melittin signal peptide-derived sequence, the MERS coronavirus S protein-derived sequence, and the VSV G protein transmembrane domain and cytoplasmic tail-derived sequence, directly or indirectly through a linker. It may be connected.
상기 항원 단백질에서 상기 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 및/또는 상기 수포성 구내염 바이러스 G 단백질 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.In the antigen protein, the melittin signal peptide-derived sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the S protein-derived sequence of the MERS coronavirus may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and /Or the sequence derived from the vesicular stomatitis virus G protein transmembrane domain and cytoplasmic tail may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
상기 항원 단백질의 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열은 야생형 S 단백질의 C-말단의 57개의 아미노산이 결실된 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 9의 아미노산 서열에서 C-말단의 57개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 서열번호 10은 서열번호 9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.The sequence derived from the MERS coronavirus S protein of the antigen protein may be one in which 57 amino acids from the C-terminus of the wild-type S protein have been deleted. Specifically, 57 amino acids from the C-terminus have been deleted from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. It may have happened. SEQ ID NO: 10 represents the polynucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 9.
상기 재조합 항원은 링커를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 링커는 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열, 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열 및 VSV G 단백질 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열을 연결하여 메르스 코로나바이러스 항원 단백질을 만드는 경우, 및/또는 상기 메르스 코로나바이러스 항원 단백질과 수포성 구내염 바이러스 유래 단백질을 연결하여 재조합 단백질을 만드는 경우, 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시키거나 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드일 수 있다. 상기 링커는 융합되는 각 단백질의 활성을 저해하지 않으면서 불필요한 면역반응을 일으키지 않는 것이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개로 구성된 펩타이드 링커일 수 있다.The recombinant antigen may further include a linker, and specifically, the linker connects the melittin signal peptide-derived sequence, the MERS coronavirus S protein-derived sequence, and the VSV G protein transmembrane domain and cytoplasmic tail-derived sequence. When making a MERS coronavirus antigen protein, and/or when making a recombinant protein by linking the MERS coronavirus antigen protein with a vesicular stomatitis virus-derived protein, the structural flexibility of these proteins is increased or the activity of each protein is increased. In order to improve it, it may be a peptide inserted between proteins. The linker is not limited as long as it does not inhibit the activity of each protein to be fused and does not cause an unnecessary immune response, but is preferably a peptide linker composed of 1 to 20 amino acids.
일 구현예에 따르면, 상기 메르스 코로나바이러스 항원 단백질은 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질의 C-말단에 연결된 것일 수 있으며, 구체적으로 VSV intergenic junction 서열로 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 수포성 구내염 바이러스 intergenic junction 서열은 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment, the MERS coronavirus antigen protein may be linked to the C-terminus of the G protein of vesicular stomatitis virus, and may specifically be linked to a VSV intergenic junction sequence. Additionally, the vesicular stomatitis virus intergenic junction sequence may include the base sequence of SEQ ID NO: 11.
상기 항원 단백질에서 상기 수포성 구내염 바이러스는 인디아나 혈청형(VSVInd) 인 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 인디아나 혈청형은 돌연변이 매트릭스 단백질 (mutant matrix protein; M)을 포함하는 것일 수 있다.In the antigen protein, the vesicular stomatitis virus may be an Indiana serotype (VSV Ind ), and specifically, the Indiana serotype may include a mutant matrix protein (M).
상기 돌연변이 매트릭스 단백질은 GML 돌연변이 (VSVInd-GML)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 GML 돌연변이는 G21E, M51R 및 L111F를 포함하는 것일 수 있다. 상기 G21E는 위치 21에서 글리신이 글루탐산으로 변경된 것을 의미하고, M51R은 위치 51에서 메티오닌이 아르기닌으로 변경된 것을 의미하고, L111F는 위치 111에서 류신이 페닐알라닌으로 변경된 것을 의미한다.The mutant matrix protein may include a GML mutation (VSV Ind -GML). The GML mutation may include G21E, M51R, and L111F. G21E means that glycine is changed to glutamic acid at position 21, M51R means that methionine is changed to arginine at position 51, and L111F means that leucine is changed to phenylalanine at position 111.
상기 재조합 VSV은 메르스 코로나바이러스에 대한 면역원 또는 항원일 수 있으며, 상기 재조합 VSV는 메르스 코로나바이러스에 대한 백신 조성물 또는 면역원성 조성물 용도로 이용할 수 있다. The recombinant VSV may be an immunogen or antigen for MERS coronavirus, and the recombinant VSV may be used as a vaccine composition or immunogenic composition for MERS coronavirus.
일 실시예에 따르면, 상기 재조합 VSV는 메르스 코로나바이러스의 S 단백질을 효과적으로 발현함으로서 면역원성이 우수한 것을 확인하였으며, 상기 재조합 VSV를 이용하여 프라임-부스팅 면역 반응을 수행하는 경우 메르스 코로나바이러스에 대한 항체 유도 효과가 우수하며 중화 항체 역가 또한 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 VSV는 T 세포 반응을 강하게 유도하였으며, 메르스 코로나바이러스 감염에 대한 보호 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. According to one embodiment, the recombinant VSV was confirmed to have excellent immunogenicity by effectively expressing the S protein of the MERS coronavirus, and when a prime-boosting immune response is performed using the recombinant VSV, it is effective against the MERS coronavirus. It was confirmed that the antibody induction effect was excellent and the neutralizing antibody titer could also be significantly improved. In addition, it was confirmed that the recombinant VSV strongly induced a T cell response and could effectively induce a protective immune response against MERS coronavirus infection.
따라서, 본 발명의 재조합 VSV를 이용하는 경우 적은 양의 투여로도 효과적인 체액성 면역 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 바, 메르스 코로나바이러스에 대한 백신 조성물로서 효과적으로 이용할 수 있다.Therefore, when using the recombinant VSV of the present invention, effective humoral immunity and cellular immune response can be induced even with a small amount of administration, so it can be effectively used as a vaccine composition against MERS coronavirus.
다른 양상은 본 발명의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 폴리뉴클레오타이드에도 공히 적용된다.Another aspect is providing a polynucleotide encoding an antigenic protein of the invention. The same parts as described above also apply to the polynucleotide.
상기 재조합 단백질의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.The polynucleotide encoding the antigen protein of the recombinant protein may include the base sequence of SEQ ID NO: 5, and may specifically consist of the base sequence of SEQ ID NO: 5.
상기 항원 단백질을 암호화하는 서열에서 상기 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 메르스 코로나바이러스의 S 단백질 유래 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 및/또는 상기 VSV G 단백질 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 8의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.In the sequence encoding the antigen protein, the sequence encoding the melittin signal peptide-derived sequence may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, and the sequence encoding the S protein-derived sequence of the MERS coronavirus is SEQ ID NO: It may contain the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and/or the sequence encoding the sequence derived from the VSV G protein transmembrane domain and cytoplasmic tail may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
또 다른 양상은 본 발명의 재조합 VSV를 유효성분으로 포함하는, 메르스 코로나바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.Another aspect is to provide a vaccine composition for preventing or treating MERS coronavirus infectious disease, comprising the recombinant VSV of the present invention as an active ingredient. The same parts as described above also apply to the composition.
본 명세서에서의 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유니트 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.The term "vaccine" as used herein refers to a pharmaceutical composition containing at least one immunologically active ingredient that induces an immunological response in animals. The immunologically active component of the vaccine may contain appropriate elements of live or dead virus (subunit vaccine), whereby these elements destroy the entire virus or its growth culture, which then destroys the desired structure(s). by a purification step to obtain an appropriate pharmaceutical composition, or by a synthetic process followed by isolation and purification guided by appropriate manipulation of a suitable system such as, but not limited to, bacteria, insects, mammals or other species. Vaccines are prepared by direct incorporation of genetic material using the induction of the synthetic process in animals in need (polynucleotide vaccination). The vaccine may contain one or more of the elements described above.
본 명세서에서의 용어 "예방"은 메르스 코로나바이러스 백신 조성물의 투여로 인해 메르스 코로나바이러스의 감염 및 상기 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" refers to all actions that suppress or delay MERS coronavirus infection and the onset of disease caused by the infection by administering the MERS coronavirus vaccine composition.
본 명세서에서의 용어 "치료"는 메르스 코로나바이러스 백신 조성물의 투여로 인해 메르스 코로나바이러스의 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action that improves or benefits the symptoms of a disease already caused by infection with the MERS coronavirus due to the administration of the MERS coronavirus vaccine composition.
상기 백신 조성물은 프라임-부스팅 면역 요법에 이용하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 백신 조성물은 프라이밍 백신 조성물 및/또는 부스팅 백신 조성물일 수 있다.The vaccine composition may be used for prime-boosting immunotherapy, and specifically, the vaccine composition may be a priming vaccine composition and/or a boosting vaccine composition.
일 실시예에 따르면, 상기 백신 조성물을 이용하여 프라임 면역화 유도 및 부스팅 면역화 유도를 모두 진행할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 백신 조성물은 메르스 코로나바이러스에 대한 프라이밍 백신 및/또는 부스팅 백신으로 사용할 수 있다.According to one embodiment, it has been confirmed that both induction of prime immunization and induction of boosting immunization can be performed using the vaccine composition, and the vaccine composition can be used as a priming vaccine and/or boosting vaccine for MERS coronavirus. .
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 부형제, 희석제 또는 담체를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.The vaccine composition may further include pharmaceutically acceptable excipients, diluents, or carriers. The term "pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier" may mean an excipient, diluent or carrier that does not irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the injected compound. Here, "pharmaceutically acceptable" This means that the activity of the active ingredient is not inhibited and the subject of application (prescription) does not have more toxicity than can be adapted.
백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 면역보조제로서는 비정형 알루미늄 겔, 오일 에멀젼, 또는 이중 오일 에멀젼 그리고 이뮤노졸 등이 사용될 수 있다. 또한, 면역반응의 촉진을 위해 다양한 식물 유래 사포닌, 레바미솔, CpG 다이뉴클레오티드, RNA, DNA, LPS, 다양한 종류의 사이토카인 등이 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.Suitable carriers for vaccines are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, proteins, sugars, etc. The carrier may be an aqueous solution, or a non-aqueous solution, suspension or emulsion. As an adjuvant to increase immunogenicity, structured or amorphous organic or inorganic polymers can be used. Immune adjuvants are generally known to play a role in promoting immune responses through chemical and physical binding to antigens. As adjuvants, amorphous aluminum gels, oil emulsions, double oil emulsions, and immunosols can be used. Additionally, various plant-derived saponins, levamisole, CpG dinucleotides, RNA, DNA, LPS, and various types of cytokines can be used to promote the immune response. The immune composition as described above can be used as a composition for inducing an optimal immune response by combining various adjuvants and additives to promote immune response. Additionally, compositions that can be added to the vaccine include stabilizers, inactivators, antibiotics, preservatives, etc. Depending on the route of administration of the vaccine, vaccine antigens may be mixed with distilled water, buffer solutions, etc.
상기 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태의 주사제의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 상기 백신 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 추가하여 조제될 수 있다.The vaccine composition is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and aerosols, external preparations, suppositories, unit dosage ampoules, or injections in the form of multiple dosages according to conventional methods. It can be used. When formulating the vaccine composition, it can be prepared by adding diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, or surfactants.
상기 백신 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.When the vaccine composition is prepared as a parenteral formulation, it can be formulated in the form of injections, transdermal administration, nasal inhalants, and suppositories along with a suitable carrier according to methods known in the art. When formulated as an injection, suitable carriers include sterilized water, ethanol, polyols such as glycerol or propylene glycol, or mixtures thereof, preferably Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, or sterile for injection. Isotonic solutions such as water or 5% dextrose can be used. When formulated for transdermal administration, it can be formulated in the form of ointments, creams, lotions, gels, external solutions, paste preparations, linear preparations, and aerol preparations. In the case of nasal inhalation, it can be formulated in the form of an aerosol spray using suitable propellants such as dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, and carbon dioxide. When formulated as a suppository, the base is Wethepsol ( witepsol), Tween 61, polyethylene glycols, cocoa fat, laurel paper, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene stearates, sorbitan fatty acid esters, etc. can be used.
상기 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로 상기 백신 조성물은 근육 투여용, 피하 투여용, 복강 투여용, 정맥 투여용, 경구 투여용, 진피 투여용, 안구 투여용, 및 뇌 내 투여용 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The administration route of the vaccine composition can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Specifically, the vaccine composition is for intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, and oral administration. , may be selected from the group consisting of compositions for dermal administration, ocular administration, and intracerebral administration.
상기 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 메르스 코로나바이러스 감염 또는 감염 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.The vaccine composition may be administered in a pharmaceutically effective amount, where the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat or prevent a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention. This means that the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, gender, the patient's sensitivity to the drug, the administration time of the composition of the present invention used, the route of administration and excretion rate, treatment period, and use. It can be determined according to factors including drugs combined or used simultaneously with the composition of the present invention and other factors well known in the medical field. The vaccine composition can be administered alone or in combination with ingredients known to exhibit preventive or therapeutic effects against known MERS coronavirus infections or infectious diseases. It is important to consider all of the above factors and administer the amount that will achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects.
상기 백신 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The dosage of the vaccine composition can be determined by a person skilled in the art considering the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the patient's age, weight, gender, antecedent history, or the type of substance used as an active ingredient. For example, the vaccine composition of the present invention can be administered at about 0.1 ng to about 1,000 mg/kg, preferably 1 ng to about 100 mg/kg per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically determined accordingly. Although not limited, it can be administered once a day, or the dose can be divided and administered several times. The above dosage or frequency of administration does not limit the scope of the present invention in any way.
또 다른 양상은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.Another aspect provides a method of preventing or treating MERS coronavirus infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject. The same parts as described above also apply to the above method.
상기 개체는 메르스 코로나바이러스 감염 및 상기 감염에 의한 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.The object refers to mammals, including cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, cats, rats, livestock, humans, etc., that are infected with MERS coronavirus or are at risk of developing diseases caused by the infection. Can include animals, farmed fish, etc. without limitation.
상기 방법은 메르스 코로나바이러스에 대한 상기 개체의 면역 반응을 유도하는 방법일 수 있다.The method may be a method of inducing the subject's immune response to the MERS coronavirus.
본 명세서에서의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The term "administration" as used herein means introducing a predetermined substance into an individual by an appropriate method, and the administration route of the vaccine composition of the present invention is administration through any general route as long as it can reach the target tissue. It can be. It may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, topically, intranasally, intrapulmonaryly, or rectally, but is not limited thereto. However, when administered orally, proteins are digested, so it is desirable for oral compositions to be coated with the active agent or formulated to protect them from decomposition in the stomach. Additionally, pharmaceutical compositions can be administered by any device that can transport the active agent to target cells.
상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The vaccine composition may be administered as an individual treatment or in combination with other treatments, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional treatments. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
상기 면역 반응 유도 방법은 프라임-부스트 면역화 요법일 수 있으며, 상기 재조합 VSV를 포함하는 조성물을 최초 투여하는 것은 프라임 면역화 유도이고, 2회 이상 투여하는 경우 2번째 투여부터는 부스팅 면역화 유도일 수 있다. 즉, 상기 면역 반응 유도 방법은 동일한 백신 조성물을 2회 이상 투여하는 것일 수 있다.The method of inducing the immune response may be a prime-boost immunization therapy, and the first administration of the composition containing the recombinant VSV may be a prime immunization induction, and when administered more than twice, the second administration may be a boosting immunization induction. That is, the method of inducing an immune response may involve administering the same vaccine composition twice or more.
기존의 기술의 경우(대한민국 공개특허 10-2021-0123190호), 프라임 면역화와 부스팅 면역화를 유도하기 위해 각각 다른 혈청형의 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 사용하였으며, 구체적으로, 인디아나 혈청형 (VSVInd-GML) 및 뉴저지 혈청형 (VSVNJ-GMM)의 두가지 다른 혈청형을 사용하였다. 이는 프라이밍(priming) 인디아나 혈청형 (VSVInd)에 대한 벡터 내성이 부스팅(boosting) 뉴저지 혈청형 (VSVNJ) 벡터를 중화시키지 않기 때문에, 2개의 항원적으로 구별되는 rVSV 벡터의 혈청형으로 고효율 프라임-부스트 백신 접종을 달성하기 위함이었다 (공개특허 10-2021-0123190호, 단락 [0133]).In the case of the existing technology (Korean Patent Publication No. 10-2021-0123190), different serotypes of vesicular stomatitis virus (VSV) were used to induce prime immunization and boosting immunization, specifically, Indiana serotype (VSV). Two different serotypes were used: Ind -GML) and New Jersey serotype (VSV NJ -GMM). This is because vector resistance to the priming Indiana serotype (VSV Ind ) does not neutralize the boosting New Jersey serotype (VSV NJ ) vector, so high-efficiency priming with two antigenically distinct serotypes of rVSV vectors -It was to achieve boost vaccination (Public Patent Publication No. 10-2021-0123190, paragraph [0133]).
그러나, 본 발명의 경우에는 한 가지 혈청형의 재조합 수포성 구내염 바이러스(rVSV)로도 효과적으로 프라이밍(priming) 및 부스팅(boosting) 면역화를 유도할 수 있어서 효과적으로 개체의 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인하였는 바, 비용 절감 및 생산 시간 단축 등으로 인해 효과적으로 우수한 백신 개발에 유리하다는 장점이 있다.However, in the case of the present invention, it was confirmed that even one serotype of recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) can effectively induce priming and boosting immunization, thereby effectively inducing an individual's immune response. However, it has the advantage of effectively developing an excellent vaccine due to cost reduction and shortened production time.
이하 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, it will be described in more detail through examples and experimental examples. However, these examples and experimental examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: 세포 및 바이러스(Cells and viruses)Example 1: Cells and viruses
T7 박테리오파지 RNA 중합효소를 발현하는 BHK 세포주인 BSR T7/5 세포는 Drs. Buchholz와 Conzelmann (독일 동물 바이러스 연방 연구소)으로부터 제공받았고, 5% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 500 μg/ml Geneticin (Gibco)을 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였으며, 역유전자 시스템에 의해 재조합 VSV를 재생하는데 이용하였다. BSR T7/5 cells, a BHK cell line expressing T7 bacteriophage RNA polymerase, were obtained from Drs. It was provided by Buchholz and Conzelmann (German Federal Institute for Animal Viruses) and cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 5% fetal bovine serum (FBS) and 500 μg/ml Geneticin (Gibco). Recombinant VSV was used to reproduce by genetic system.
한국 식약처에서 분양받은 Vero 세포주는 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양하였고 재조합 VSV를 증식하는데 사용하였다. The Vero cell line distributed from the Korean Ministry of Food and Drug Safety was cultured in DMEM containing 10% FBS and used to propagate recombinant VSV.
MERS-CoV Spike (S)유전자는 사우디아라비아 제다에서 폐렴으로 사망한 60세 남성 환자로부터 분리된 바이러스의 유전자(GenBank: AFS88936.1)를 기반으로 인간 코돈 최적화(Human codon optimization)하여 합성하였다. The MERS-CoV Spike (S) gene was synthesized through human codon optimization based on the gene of the virus (GenBank: AFS88936.1) isolated from a 60-year-old male patient who died of pneumonia in Jeddah, Saudi Arabia.
역유전학법으로 확보한 재조합 VSV는 0.03의 다중 감염(MOI)으로 Vero 세포에 감염시켰고, 감염 2 일 후에 수거되었다. 바이러스를 함유하는 배양배지를 0.2 μm 필터로 여과하여 잔해물을 제거하고 이온교화 수지 트로마토그래피법에 의해 정제하여 적절한 보존제와 함께 -80℃에서 보관하였다. 바이러스 역가를 확인하기 위해 용균반검사(plaque assay)를 수행하였다.Recombinant VSV obtained by reverse genetics was infected with Vero cells at a multiplicity of infection (MOI) of 0.03 and harvested 2 days after infection. The culture medium containing the virus was filtered through a 0.2 μm filter to remove debris, purified by ion exchange resin chromatography, and stored at -80°C with an appropriate preservative. Plaque assay was performed to confirm virus titer.
실시예 2: 플라스미드 제조(Plasmids construction)Example 2: Plasmids construction
MERS-CoV S 유전자 (GenBank# AFS88936.1)을 기반으로 인간 코돈 최적화한 서열을 합성하여 완성하였다. 5'에 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드 (msp)를 갖고 3'에 VSV G 유전자의 c-말단 서열 Gtc를 갖는 S 유전자 역시 합성하여 완성하였다. 합성된 유전자들은 합성 시 포함시킨 적절한 제한효소를 이용하여 pBKS 벡터에 각각 클로닝 하여 pBKS MERS S 와 pBKS MERS mspS-Gtc 로 명명하고 염기서열을 확인하였다. A human codon-optimized sequence was synthesized and completed based on the MERS-CoV S gene (GenBank# AFS88936.1). An S gene containing the bee melittin signal peptide (msp) on the 5' and the c-terminal sequence Gtc of the VSV G gene on the 3' was also synthesized and completed. The synthesized genes were cloned into the pBKS vector using appropriate restriction enzymes included during synthesis, named pBKS MERS S and pBKS MERS mspS-Gtc, and their base sequences were confirmed.
상기 pBKS에서 S 유전자와 mspS-Gtc 유전자는 PmeI와 MluI 제한 부위를 사용하여 pVSVInd-GML 의 G 와 L 유전자 사이에 삽입하여 pVSV MERS S 와 pVSV MERS mspS-Gtc로 명명하였다. 상기 pVSVInd-GML 벡터의 구체적인 정보는 'Kim et al, J. Virol. 89:6338, 2015'에 기재되어 있다.The S gene and mspS-Gtc gene in pBKS were inserted between the G and L genes of pVSVInd-GML using PmeI and MluI restriction sites, and were named pVSV MERS S and pVSV MERS mspS-Gtc. Specific information about the pVSVInd-GML vector can be found in 'Kim et al , J. Virol. 89:6338, 2015.
제조된 백터에서 바이러스 재생은 이전 문헌에서 제시한 바와 같이 역유전학으로 진행하였고 Vero 세포에서 증폭 배양 정제된 후 바이러스 역가는 용균반검사(plaque assay)를 수행하여 결정되었다.Virus reproduction in the prepared vector was performed by reverse genetics as suggested in previous literature, and after amplification, culture, and purification in Vero cells, the virus titer was determined by performing a plaque assay.
실시예 3: 재조합 VSV 배양 및 정제Example 3: Recombinant VSV culture and purification
한 개의 10 Cell stack(10 CS)과 한 개의 5CS 에 vero 세포를 2x10^4 세포/cm 로 3일간 배양한 후 95 -100% confluent한 상태에서 배양배지를 제거하고 1.5리터 감염배지로 교체한 후 MOI=0.03 (multiplicity of infection 0.03)으로 rVSV를 접종하고 31℃, 5% CO2 인큐베이터에서 넣어 44~48시간 동안 배양하였다. 배양액은 잔해물을 제거한 다음 음이온 교환수지 크로마토그래피법으로 정제 하였고 할로화이버를 이용하여 농축과 버퍼 교환을 수행하여 최종 산물을 제조하였다. After culturing vero cells at 2x10^4 cells/cm in one 10 Cell stack (10 CS) and one 5CS for 3 days, remove the culture medium when it is 95-100% confluent and replace it with 1.5 liter infection medium. rVSV was inoculated at MOI=0.03 (multiplicity of infection 0.03) and cultured in an incubator at 31°C and 5% CO 2 for 44 to 48 hours. The culture medium was purified by anion exchange resin chromatography after removing debris, and concentration and buffer exchange were performed using halofiber to prepare the final product.
실시예 4: 면역화(Immunization)Example 4: Immunization
모든 동물 실험에서, 프라이밍 면역화를 1Х10^8 PFU의 rVSV-MERS S 및 rVSV-MERS-msp-S-Gtc 또는 rVSV-Mock으로 면역화하였다. 2주 후에, 같은 백신으로 부스팅 면역화를 수행하였다. 각 면역화 2주 후, 안와정맥총에서 혈액을 수득하고 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 상기 혈청을 추가 분석할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 또한 T 세포에 의한 면역반응시험을 위한 비장도 부스팅 면역 후 2주에 수거하여 시험시까지 80 ℃에서 보관하였다. 프라이밍 후 부스팅 면역화는, 프라이밍 후 며칠 또는 몇 주를 포함하여 제한없이, 상기 프라이밍 후 언제라도 수행될 수 있다. 또한 부스팅은 1회 또는 여러번 수행할 수 있다.In all animal experiments, priming immunization was with 1Х10^8 PFU of rVSV-MERS S and rVSV-MERS-msp-S-Gtc or rVSV-Mock. Two weeks later, a boost immunization was performed with the same vaccine. Two weeks after each immunization, blood was collected from the orbital venous plexus and centrifuged to obtain serum. The serum was stored at -80°C until further analysis. In addition, spleens for testing immune responses by T cells were collected 2 weeks after boosting immunization and stored at 80°C until testing. Post-priming boosting immunizations can be performed at any time after priming, including, but not limited to, days or weeks after priming. Additionally, boosting can be performed once or multiple times.
용량은 1Х10^8 PFU에서 투여되었고 동일한 양의 rVSV-Mock을 음성 대조군으로 근육내 주사를 통하여 면역화하였다. 면역 반응 증감를 위해 용량은 더 늘리거나 줄일 수 있다.The dose was administered at 1Х10^8 PFU, and the same amount of rVSV-Mock was immunized through intramuscular injection as a negative control. The dose can be increased or decreased to increase or decrease the immune response.
실시예 5: 생 MERS-CoV 챌린지 보호 실험(Live MERS-CoV challenge protection experiment)Example 5: Live MERS-CoV challenge protection experiment
생 MERS-CoV 챌린지 보호 실험을 위하여, DPP4 유전자가 형질 전환된 마우스를 1Х10^8 PFU의 rVSV-MERS S 및 rVSV-MERS-msp-S-Gtc 또는 rVSV-Mock으로 면역화하였다. 부스트 면역화는 2주 후 같은 양으로 투여 하였고, 2주 후 면역원성 평가를 위한 체혈을 하였고 4주후 상기 마우스는 코를 통하여 2Х10^4PFU의 생 MERS-CoV로 챌린지 하였다. 체중 감량 및 생존율을 14일 동안 매일 모니터링 하였다. 챌린지 3일 및 7일 후 허파에서 MERS-CoV를 분석하기 위하여 허파를 채취하여 보관하였다. For live MERS-CoV challenge protection experiments, mice transgenic for the DPP4 gene were immunized with 1Х10^8 PFU of rVSV-MERS S and rVSV-MERS-msp-S-Gtc or rVSV-Mock. Boost immunization was administered in the same amount 2 weeks later, blood was collected for immunogenicity evaluation 2 weeks later, and 4 weeks later, the mice were challenged with 2Х10^4PFU of live MERS-CoV through the nose. Weight loss and survival rates were monitored daily for 14 days. 3 and 7 days after challenge, lungs were collected and stored to analyze MERS-CoV.
실시예 6: SDS-PAGE 웨스턴 블랏Example 6: SDS-PAGE Western Blot
상기 실험은 MERS rVSV의 S 단백질을 검출하기 위해 사용하였다. 구체적으로, 완전히 환원된 모든 rVSV의 단백질들을 SDS-PAGE로 분리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 PVDF 막로 옮기고 BSA로 비특이적 결합(Nonspecific binding)을 블락한 후, MERS S 단백질에 매우 특이적인 S1 1차 항체(Primary antibody)를 결합시켰다. 다음으로, 상기 1차 항체에 결합할 수 있고, HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 첨가한 후, 기질과 반응하여 PVDF 막에서 S 및 S1 단백질을 크기 별로 검출하였다.The above experiment was used to detect the S protein of MERS rVSV. Specifically, all completely reduced rVSV proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane through Western blot, and non-specific binding was blocked with BSA, followed by S1 primary antibody, which is highly specific for the MERS S protein. (Primary antibody) was combined. Next, a secondary antibody capable of binding to the primary antibody and coupled to HRP (horseradish peroxidase) was added, and then reacted with the substrate to detect S and S1 proteins by size on the PVDF membrane.
실시예 7: 플라크 어세이(Plaque assay)를 통한 감염성 평가Example 7: Evaluation of infectivity through plaque assay
감염 역가(Infectivity titer)는 Vero 세포를 이용한 플라크 어세이로 결정하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 약 7.0 x 105 cell/well을 넣어 1일 동안 37 ℃ CO2 인큐에이터에서 배양한 후, 각 웰을 PBS로 1회 씻은 다음 연속 희석(Serial dilution)한 rVSV MERS 바이러스를 흡착 시킨 후, 아가로스를 도포하여 고정한 상태로 3일간 배양하였다. 형성된 플라크수는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 계수하여 감염 역가를 결정하였다.Infectivity titer was determined by plaque assay using Vero cells. Specifically, about 7.0 After the virus was adsorbed, agarose was applied, fixed, and cultured for 3 days. The number of plaques formed was stained with crystal violet and counted to determine the infection titer.
실시예 8: BCA를 이용한 총 단백질 농도 정량 분석Example 8: Quantitative analysis of total protein concentration using BCA
정제된 rVSV 시료의 총 단백질 농도는 BCA (bicinchoninic acid) 어세이를 사용하여 결정하였다. BCA 어세이는 아미노산 조성에 영향을 덜 받으며 Detergent-compatible한 아주 정확한 단백질 정량법이다. 알칼리 환경에서 단백질에 의해 Cu2+가 Cu1+로 환원되고 환원된 Cu1+를 BCA에 의해 아주 정확하고 정량적으로 검출하는 원리를 이용하여 단백질을 정량한다. 시료와 BSA Standard는 0.25% Triton X-100로 1:1 로 섞은 다음 PBS로 연속 희석된 시료를 만들어 96 well plate에 시료와 시약을 넣고 37 ℃에서 30분 동안 반응 후 562nm 파장에서 흡광도를 측정하고 Standard 값과 비교하여 정량하였다.The total protein concentration of purified rVSV samples was determined using bicinchoninic acid (BCA) assay. The BCA assay is a highly accurate protein quantification method that is detergent-compatible and less affected by amino acid composition. Proteins are quantified using the principle that Cu 2+ is reduced to Cu 1+ by proteins in an alkaline environment and the reduced Cu 1+ is detected very accurately and quantitatively by BCA. The sample and BSA Standard were mixed 1:1 with 0.25% Triton It was quantified by comparison with the standard value.
실시예 9: SDS-PAGE 쿠마시(Coomassie)Example 9: SDS-PAGE Coomassie
rVSV의 최종 산물의 품질, 순도와 알려진 크기의 단백질 확인하기 위해 SDS-PAGE를 이용하였다. SDS-PAGE 는 환원조건으로 수행되었고 전기 영동이 끝난 후 Coomassie Brilliant Blue로 염색하고 탈색한 후 단백질을 분석하였다.SDS-PAGE was used to confirm the quality, purity, and protein size of the final product of rVSV. SDS-PAGE was performed under reducing conditions, and after electrophoresis, the samples were stained with Coomassie Brilliant Blue, destained, and then analyzed for protein.
실시예 10: RT-PCR을 이용한 M 변이 및 MERS 스파이크 유전자 검출Example 10: Detection of M mutation and MERS spike gene using RT-PCR
VSV 기반 벡터는 매트릭스 유전자를 돌연변이시켜 약독화하였으며 백신에서 M 변이를 확인하여 Identity를 확보하고자 하였다. 구체적으로, 최종 정제 산물에서 총 Viral RNA 를 추출한 이후 M 변이만 검출하도록 디자인된 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR(Reverse transcription Polymerase chain reaction)을 수행하여 검출을 확인하였다.The VSV-based vector was attenuated by mutating the matrix gene, and the identity was secured by confirming the M mutation in the vaccine. Specifically, after extracting total viral RNA from the final purified product, detection was confirmed by performing reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using a primer set designed to detect only M mutations.
VSV 기반 MERS 백신은 MERS 바이러스의 Spike 유전자를 탑재한 백신이다. 따라서, S 유전자 탑재를 확인하기 위하여 S 유전자를 검출하도록 디자인된 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 검출을 확인하였다.The VSV-based MERS vaccine is a vaccine loaded with the Spike gene of the MERS virus. Therefore, to confirm the loading of the S gene, RT-PCR was performed using a primer set designed to detect the S gene to confirm detection.
실시예 11: ELISAExample 11: ELISA
MERS-CoV S 단백질-특이적 항체 역가를 측정하기 위하여, 96-well plates(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 4 ℃에서 16시간 동안 50mM NaHCO3 완충액에서 2 μg/ml의 MERS-CoV S 단백질로 코팅하였다. 37 ℃에서 1시간 동안 차단 완충액[blocking buffer: 1 %BSA (Merck, Darmstadt, Germany)를 포함하는 PBS]으로 차단한 후, 마우스로부터의 혈청 샘플을 차단 완충액에 1:30 희석으로 시작하여 5배 연속 희석으로 플레이트에 첨가하여 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 1:3000 희석된 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)를 적용하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 (TMB) 용액 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 각 웰에 첨가하고 실온 (RT)에서 10분 이내로 반응시켰다. 0.5N HCl (Merck, Darmstadt, Germany)을 첨가하여 발색을 정지시키고, ELISA 판독기 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 파장 450nm에서 광학 밀도 (OD) 값을 측정 하였다. 항체 역가는 0.2의 OD 값을 나타내는 혈청 희석의 가역 log2 역가로 표현되었다.To measure MERS-CoV S protein-specific antibody titers, 96-well plates (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) were incubated with 2 μg/ml of MERS-CoV in 50mM NaHCO 3 buffer for 16 hours at 4°C. It was coated with S protein. After blocking with blocking buffer [PBS containing 1% BSA (Merck, Darmstadt, Germany)] for 1 hour at 37°C, serum samples from mice were diluted 5-fold starting with a 1:30 dilution in blocking buffer. It was added to the plate by serial dilution and reacted at 37°C for 1 hour. Then, HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) diluted 1:3000 was applied and incubated at 37°C for 1 hour. After washing, peroxidase substrate (TMB) solution (Millipore, Billerica, MA, USA) was added to each well and allowed to react within 10 minutes at room temperature (RT). Color development was stopped by adding 0.5 N HCl (Merck, Darmstadt, Germany), and optical density (OD) values were measured at a wavelength of 450 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Antibody titers were expressed as reversible log2 titers of serum dilutions giving an OD value of 0.2.
실시예 12: 포커스 감소 중화 시험(Focus reduction neutralization assay)Example 12: Focus reduction neutralization assay
혈청의 MERS-CoV 특이 중화 활성을 포커스 감소 중화 시험법(FRNT)으로 분석하였다. 열처리된 마우스 혈청은 2% FBS+DMEM로 연속적으로 2배씩 희석되었다. 상기 희석된 혈청을 500 PFU의 MERS-CoV 으로 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 바이러스-혈청 혼합물을 Vero cell에 첨가하고 37 ℃, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 4 % (v/v) 포름알데히드 용액 (Sigma, Darmstadt, Germany)으로 빛을 차단한 상태로 4 ℃에서 하루 동안 Vero 세포를 고정시키고 100% 메탄올로 10분 동안 반응시켜 세포의 투과율을 높여 준 후 블락킹 버퍼 (1% BSA, 0.5% goat serum, 0.1% tween-20 in PBS)로 블락킹하고 난 후 블락킹 버퍼에 1:3000으로 희석한 1차 항체 anti-MERS N rabbit mAb를 넣어 주고 37 ℃에서 1시간 동안 반응한 다음 goat anti-rabbit IgG-HRP 2차 항체를 블락킹 버퍼에 1:2,000으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이후 TMB 를 넣고 발색된 포커스들을 Spot reader(CTL immunospot S5)로 개수를 확인하였다. 항체와 반응시킨 well과 항체와 반응시키지 않은 well의 foci 개수를 비교하여 50% 이하의 foci가 형성된 혈청의 희석배수를 FRNT50이라고 하고 중화능을 보이는 중화항체의 역가를 결정하였다. The MERS-CoV specific neutralizing activity of serum was analyzed by focus reduction neutralization test (FRNT). Heat-treated mouse serum was serially diluted two-fold in 2% FBS+DMEM. The diluted serum was incubated with 500 PFU of MERS-CoV at 37°C for 30 minutes. The virus-serum mixture was added to Vero cells and cultured for 4 hours in a cell incubator at 37°C and 5% CO 2 conditions. After incubation, Vero cells were fixed with a 4% (v/v) formaldehyde solution (Sigma, Darmstadt, Germany) at 4°C for one day while blocking light and reacted with 100% methanol for 10 minutes to determine the permeability of the cells. After raising, blocking with blocking buffer (1% BSA, 0.5% goat serum, 0.1% tween-20 in PBS), primary antibody anti-MERS N rabbit mAb diluted 1:3000 in blocking buffer was added. Add and react at 37°C for 1 hour, then dilute goat anti-rabbit IgG-HRP secondary antibody 1:2,000 in blocking buffer and react at 37°C for 1 hour. Afterwards, TMB was added and the number of colored foci was confirmed using a spot reader (CTL immunospot S5). By comparing the number of foci in the wells reacted with the antibody and those not reacted with the antibody, the dilution factor of the serum in which less than 50% of foci was formed was called FRNT 50 , and the titer of the neutralizing antibody showing neutralizing ability was determined.
실시예 13: ELISpot 어세이Example 13: ELISpot Assay
백신투여 후 T 세포 반응을 측정하기 위하여, IFN-γ ELISpot 분석을 제조사의 지시서에 따라 마우스 IFN-γELISPOT 키트 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 부스트 면역화 후 2 주에 각 마우스에서 비장을 제거하고, 그 다음 상기 비장을 70μm 세포 여과기(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 통과시켜 비장세포의 세포 현탁액을 수득하였다. ACK Lysing Buffer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 용혈로 적혈구 (RBCs)를 제거하였다. 2Х10^5 세포를 5% CO2 배양기에서 37 ℃에서 16시간 동안 자극의 존재 또는 부재하에 사전-코팅된 BDTM ELISPOT 플레이트에 첨가하였다. 자극 후, 세포 및 펩타이드 자극제를 버리고 각각의 웰을 3-5 분 동안 증류수에 담갔다. 세척 완충액(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)으로 3회 세척 후, 분석 희석액(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 중 100㎕의 희석된 검출항체[Biotinylated anti-mouse IFN-γ (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)]를 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 분석 희석액 중 1:100 희석된 스트렙트아비딘-HRP(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 각 웰에 첨가하고, 이어서 플레이트를 실온에서 1시간 이내로 반응시켰다. 상기 플레이트를 세척 완충제로 4회 세척한 다음 PBS로 2 회 세척하였다. 세척 후, AEC 기질 완충액(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)을 갖는 1:50 희석된 AEC 발색체를 각 웰에 첨가하였다. 각 웰을 증류수로 세척하여 스팟 발색(spotdevelopment)을 중지시켰다. 공기 건조된 플레이트를 사용하여 스팟의 수를 세었다. 상기 스팟은 ELISPOT 리더(Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세었다.To measure T cell responses after vaccination, IFN-γ ELISpot analysis was performed using the mouse IFN-γELISPOT kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Specifically, the spleen was removed from each mouse 2 weeks after boost immunization, and the spleen was then passed through a 70 μm cell strainer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) to obtain a cell suspension of splenocytes. Red blood cells (RBCs) were removed by hemolysis using ACK Lysing Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 2Х10^5 cells were added to pre-coated BD ™ ELISPOT plates with or without stimulation for 16 hours at 37°C in a 5% CO 2 incubator. After stimulation, cells and peptide stimulants were discarded and each well was soaked in distilled water for 3–5 min. After washing three times with washing buffer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), 100 ㎕ of diluted detection antibody [Biotinylated anti-mouse IFN-γ (BD) was used in assay diluent (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Bioscience, San Jose, CA, USA)] was added to each well and reacted at room temperature for 2 hours. After washing, streptavidin-HRP (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) diluted 1:100 in assay diluent was added to each well, and the plate was then incubated for less than 1 hour at room temperature. The plate was washed 4 times with wash buffer and then 2 times with PBS. After washing, 1:50 diluted AEC chromogen with AEC substrate buffer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) was added to each well. Each well was washed with distilled water to stop spot development. The number of spots was counted using air-dried plates. The spots were counted using an ELISPOT reader (Molecular devices, San Jose, CA, USA).
실시예 14: 통계(Statistics)Example 14: Statistics
그래프 상의 결과는 평균과 표준 편차 (SD)의 오차 막대로 표시되었다. 마우스 군 사이의 통계적 차이는 다중비교를 위하여 Tukey's correction으로 일원분산분석 (ANOVA)에 의해 결정되었다. GraphPad Prism 8.3을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 확률 수준 <0.05 Results on graphs are presented as mean and standard deviation (SD) error bars. Statistical differences between mouse groups were determined by one-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's correction for multiple comparisons. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 8.3. Probability level <0.05
실험예 1: VSV-MERS 재조합 바이러스의 제조(Construction of VSV-MERS S, VSV-MERS mspS-Gtc)Experimental Example 1: Construction of VSV-MERS recombinant virus (Construction of VSV-MERS S, VSV-MERS mspS-Gtc)
MERS S 단백질에 대한 체액성 면역 반응은 바이러스 중화 항체를 유도하는 것으로 여겨진다. 따라서 상기 S 단백질은 MERS 백신 개발의 일차 표적으로 간주되어 왔다[Van Boheemen S et al. mBio 2012, G Lu et al. Nature 2013]. 이전 발명에서는 다양한 S 단백질 구조 중 RBD에 집중하여 연구를 진행하여 확실한 중화 항체를 유도하는 것을 확인하였으나, 본 발명에서는 좀 더 개선된 면역효과를 유도하기 위하여 S 유전자 전체를 이용하는 것으로 결정하고 전장 S(Full length S) 단백질을 이용하였다. 또한, 보다 강력한 면역 반응을 유도하기 위해, 전장 S 단백질의 C-말단의 57개의 아미노산을 제거한 후, 이의 N-말단에 꿀벌 멜리틴 유전자의 신호서열(21개 아미노산)을 추가하고, 이의 C-말단에 VSV의 G 단백질의 막횡단 및 세포질 꼬리(Transmembrane and cytoplasmic tail, 49개 아미노산) 부분을 추가하여 msp-S-Gtc를 제작하여 면역원성을 비교하기로 결정 하였다 (도 1). 또한, 본 발명에서는 메트릭스(M) 유전자가 변형된 비병원성 VSV인 인디아나 혈청형 (VSVInd-GML)을 사용하였으며 (도 2), 인디아나 혈청형 만으로도 프라이밍 및 부스팅의 효과가 충분함을 확인하였다. 상기 MERS-msp-SF-Gtc의 구체적인 서열 정보는 하기 표 1에 기재하였다.The humoral immune response to the MERS S protein is believed to induce virus-neutralizing antibodies. Therefore, the S protein has been considered the primary target for MERS vaccine development [Van Boheemen S et al. mBio 2012, G Lu et al. Nature 2013]. In the previous invention, research was conducted focusing on RBD among various S protein structures and it was confirmed that it induces reliable neutralizing antibodies. However, in the present invention, it was decided to use the entire S gene to induce a more improved immune effect, and the full-length S ( Full length S) protein was used. Additionally, in order to induce a stronger immune response, 57 amino acids from the C-terminus of the full-length S protein were removed, then the signal sequence (21 amino acids) of the bee melittin gene was added to its N-terminus, and its C-terminus was added to the C-terminus. It was decided to compare immunogenicity by creating msp-S-Gtc by adding the transmembrane and cytoplasmic tail (49 amino acids) of the G protein of VSV to the terminal (Figure 1). In addition, in the present invention, the Indiana serotype (VSVInd-GML), a non-pathogenic VSV with a modified matrix (M) gene, was used (Figure 2), and it was confirmed that the priming and boosting effects were sufficient only with the Indiana serotype. Specific sequence information of the MERS-msp-S F -Gtc is listed in Table 1 below.
상기 내용을 토대로, 인간 코돈으로 최적화된 MERS 스파이크(S) 유전자와 msp와 Gtc를 가진 S 유전자를 합성하였고(Genescript, USA), pBKS 클로닝 백터에 클로닝하고 염기서열을 확인하였다. 이렇게 확인된 유전자들은 pVSV 인디아나 벡터에 Pme I 과 Mlu I사이트를 이용하여 삽입하였고, 각각 pVSV MERS S 및 pVSV MERS mspS-Gtc 로 명명하였다 (도 3 및 도 4). 상기 제작된 pVSV MERS S 와 Rvsv MERS mspS-Gtc는 이전 문헌에서 언급한 VSV 역유전학 시스템에 의해 회수되었다 [Buchholz, Fink & Conzelmann, J. Virol. 73:251, 1999]. Based on the above, the MERS spike (S) gene optimized with human codons and the S gene with msp and Gtc were synthesized (Genescript, USA), cloned into the pBKS cloning vector, and the base sequence was confirmed. The genes identified in this way were inserted into the pVSV Indiana vector using the Pme I and Mlu I sites, and were named pVSV MERS S and pVSV MERS mspS-Gtc, respectively (Figures 3 and 4). The constructed pVSV MERS S and Rvsv MERS mspS-Gtc were recovered by the VSV reverse genetics system mentioned in the previous literature [Buchholz, Fink & Conzelmann, J. Virol. 73:251, 1999].
실험예 2: MERS S 단백질 발현 확인 (Detection of MERS S proteins)Experimental Example 2: Detection of MERS S proteins
상기 실험예 1에서 제작한 rVSV MERS S 및 rVSV MERS mspS-Gtc의 MERS S 단백질 유전자 발현을 확인하기 위해, 바이러스로 감염된 세포와 정제된 rVSV를 이용하였다. 구체적으로, Vero 세포를 0.03의 다중감염 (MOI)으로 감염시키고 감염 후 40-48 시간에 수거하였고, 세포내 S 단백질의 검출을 위하여 상층액과 세포를 용해하여 준비하였다. 한편 rVSV를 정제는 음이온 교환 수지 크로마토그래피법을 이용하여 정제하였다. 상기 감염된 세포 상층액과 용해물, 그리고 정제 산물을 전기영동 하였고, 항-MERS S1 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 S 단백질의 존재를 측정하였다. To confirm the MERS S protein gene expression of rVSV MERS S and rVSV MERS mspS-Gtc produced in Experimental Example 1, virus-infected cells and purified rVSV were used. Specifically, Vero cells were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 0.03 and harvested 40-48 hours after infection, and the supernatant and cells were lysed and prepared for detection of intracellular S protein. Meanwhile, rVSV was purified using an anion exchange resin chromatography method. The infected cell supernatant, lysate, and purified product were subjected to electrophoresis, and the presence of S protein was measured by Western blot analysis using an anti-MERS S1 antibody.
그 결과, 도 5의 SDS-PAGE에서 보는 바와 같이 바이러스 상층액의 대부분 불순물이 음이온 수지 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거되었고 rVSV MERS S 및 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스 정제물에서 rVSV의 주요 단백질인 G, N, M 단백질을 확인할 수 있다.As a result, as shown in SDS-PAGE in Figure 5, most impurities in the virus supernatant were removed by anion resin column chromatography, and the major proteins of rVSV, G and N, were removed from the rVSV MERS S and rVSV MERS mspS-Gtc virus purifications. , M protein can be confirmed.
다음으로, 도 6의 웨스턴 블랏 결과에 나타낸 바와 같이, rVSV MERS S 및 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스로 감염된 세포 상층액과 세포 용해물에서 S 단백질 전체크기와 S 단백질이 잘려진 S1 단백질이 검출되었다. 한편 정제한 바이러스에서는 rVSV MERS S 바이러스에서는 S 단백질이 검출되지 않는데 반해 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스에서는 S 단백질이 검출되었다. 이는 rVSV MERS S 바이러스에서는 S 단백질이 바이러스 표면에 박히지 못하고 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스에서는 S 단백질이 바이러스 표면에 많은 양이 붙어있다는 사실을 시사한다. 또한 세포 상층액과 용해물에서 S 단백질 발현은 rVSV MERS S 바이러스 보다는 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스에서 더 많은 양이 관찰되는데 이를 종합하면 rVSV MERS S 보다 rVSV MERS mspS-Gtc 바이러스가 면역원성이 높을 것으로 예상된다.Next, as shown in the Western blot results in Figure 6, full-size S protein and truncated S1 protein were detected in cell supernatants and cell lysates infected with rVSV MERS S and rVSV MERS mspS-Gtc viruses. Meanwhile, in the purified virus, the S protein was not detected in the rVSV MERS S virus, whereas the S protein was detected in the rVSV MERS mspS-Gtc virus. This suggests that in the rVSV MERS S virus, the S protein is unable to stick to the virus surface, and in the rVSV MERS mspS-Gtc virus, a large amount of S protein is attached to the virus surface. In addition, S protein expression in cell supernatants and lysates is observed in greater amounts in the rVSV MERS mspS-Gtc virus than in the rVSV MERS S virus. Taken together, it is expected that the rVSV MERS mspS-Gtc virus will be more immunogenic than the rVSV MERS S virus. do.
실험예 3: 마우스를 통한 면역 반응(Immune responses in Mice)Experimental Example 3: Immune responses in Mice
본 발명자들의 선행 마우스 면역 시험에 다르면 rVSV 백신으로 5x10^8pfu/mouse으로 투여 시 기대 이상의 높은 면역반응을 유도하였는 바, 본 시험에서는 그보다 현저히 적은 용량인 1x10^8 pfu/mouse 용량으로 rVSVInd 혈청형으로 마우스를 프라임과 2주 후 부스팅 면역을 수행하였다 (도 7).According to the present inventors' previous mouse immunity test, the rVSV vaccine induced a higher-than-expected immune response when administered at 5x10^8 pfu/mouse. In this test, the rVSVInd serotype was administered at a significantly lower dose of 1x10^8 pfu/mouse. Mice were primed and boosted immunized 2 weeks later (Figure 7).
도 7 에서와 같이, 그룹 1은 PBS, 그룹 2는 재조합 VSV-Mock로 대조군이며, 그룹 3은 1x10^8 pfu/mouse의 rVSV MERS S 투여군, 그룹 4는 1x10^8 pfu/mouse의 rVSV MERS mspS-Gtc 투여군으로서, 각각 5마리의 C57BL/6 마우스에 대퇴근육에 투여하였고, 2주 후 같은 용량, 같은 시료로 부스트 투여를 수행하였다.As shown in Figure 7, group 1 is a control group with PBS, group 2 is a control group with recombinant VSV-Mock, group 3 is a group administered rVSV MERS S at 1x10^8 pfu/mouse, and group 4 is a group administered rVSV MERS mspS at 1x10^8 pfu/mouse. -As a Gtc administration group, each of 5 C57BL/6 mice was administered to the thigh muscle, and 2 weeks later, a boost was administered with the same dose and the same sample.
그 결과, 도 7C에 나타난 것과 같이 대조군에서는 면역반응이 전혀 나타나지 않았으나, 백신 투여군에서는 프라임 투여 후 13일과 부스팅후 2주 후인 27일에서 뛰어난 항체유도 효과를 나타내었다. 또한, 프라임 후보다는 부스팅 후 더 많은 항체를 유도하였고 rVSV MERS S 보다는 rVSV MERS mspS-Gtc 투여가 높은 항체(항체 역가 최고치는 부스트 면역 후 rVSV MERS S: 221,390, rVSV MERS mspS-Gtc: 1,177,625)를 유도하였음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 7C, no immune response occurred in the control group, but the vaccine administration group showed an excellent antibody induction effect on the 13th day after prime administration and on the 27th day, two weeks after boosting. In addition, more antibodies were induced after boosting than after priming, and higher antibodies were induced by rVSV MERS mspS-Gtc administration than by rVSV MERS S (the highest antibody titer was after boost immunization, rVSV MERS S: 221,390, rVSV MERS mspS-Gtc: 1,177,625). It was confirmed that this was done.
상기 결과를 토대로, 재조합 VSV-MERS 백신이 적은 양 투여로도 매우 효과적인 면역 반응을 유도하는 것을 확인하였으며, 강력한 백신이 되기 위해서는 이런 높은 항체 역가가 강력한 중화 항체를 유도할 수 있어야 한다. 따라서, 중화 실험을 위하여 500 PFU의 MERS-CoV를 면역화된 마우스의 연속 희석된 항혈청으로 사전 배양하였고, 잔류 감염성 MERS-CoV는 Vero 세포에 대한 포커스 감소 분석으로 중화 항체의 역가를 측정하였다.Based on the above results, it was confirmed that the recombinant VSV-MERS vaccine induces a very effective immune response even with a small dose, and in order to be a powerful vaccine, such high antibody titers must be able to induce strong neutralizing antibodies. Therefore, for neutralization experiments, 500 PFU of MERS-CoV was pre-incubated with serially diluted antisera from immunized mice, and the titers of neutralizing antibodies were measured for residual infectious MERS-CoV by focus reduction assay on Vero cells.
그 결과, 상기 면역 항체 유도 결과에서 확인된 것처럼 rVSV MERS S 보다는 rVSV MERS mspS-Gtc 사용한 면역화가 보다 강한 중화 항체를 유도함을 확인하였다(도 7D). 구체적으로, 음성 대조군에서는 중화 항체를 전혀 유도하지 못하였고, 1x10^8 PFU의 rVSV MERS S를 투여한 마우스는 GMT(Geometry mean titer) 75.07을 기록하였으며, 1Х10^8PFU의 rVSV MERS mspS-Gtc를 투여한 마우스는 GMT 97.27을 기록하였다. 이러한 면역 반응 연구 결과는 rVSV MERS mspS-Gtc 프라이밍에 이은 부스팅이 MERS 감염을 예방하는 매우 효과적인 백신 요법이라는 것을 보여주었다.As a result, as confirmed in the immune antibody induction results, it was confirmed that immunization with rVSV MERS mspS-Gtc induced stronger neutralizing antibodies than with rVSV MERS S (Figure 7D). Specifically, in the negative control group, no neutralizing antibodies were induced at all, and mice administered 1x10^8 PFU of rVSV MERS S recorded a GMT (Geometry mean titer) of 75.07, and mice administered 1Х10^8 PFU of rVSV MERS mspS-Gtc One mouse recorded 97.27 GMT. The results of these immune response studies demonstrated that rVSV MERS mspS-Gtc priming followed by boosting is a highly effective vaccine regimen to prevent MERS infection.
다음으로, rVSV MERS 백신의 면역 반응을 추가로 조사하기 위해, IFN-γ ELISpot 분석으로 MERS S 단백질의 다양한 펩타이드에 대한 T 세포 면역 반응을 분석하였다. 상기 실험 결과, rVSV MERS S 또는 rVSV MERS mspS-Gtc로 면역화된 마우스의 비장 세포는 다양한 MERS S 펩타이드들과 S 단백질에 의해 IFN-γ 분비가 유도됨을 보여주었으며, 다양한 펩타이드 중에 S2에 분포하는 특이 펩타이드에 대해 높은 T 세포 반응이 나타났고, S 단백질 전체에 대해서는 가장 강력한 T 세포 반응이 유도되었음을 확인하였다 (도 8). 상기 결과는 중화항체 유도 실험에서 나타난 것과 같이 T 세포 유도에서도 rVSV MERS S 보다는 rVSV MERS mspS-Gtc로 면역화된 마우스 비장 세포에서 더 높은 T 세포 반응이 관찰 되었다. Next, to further investigate the immune response to the rVSV MERS vaccine, T cell immune responses to various peptides of the MERS S protein were analyzed using the IFN-γ ELISpot assay. As a result of the above experiment, spleen cells of mice immunized with rVSV MERS S or rVSV MERS mspS-Gtc showed that secretion of IFN-γ was induced by various MERS S peptides and S protein, and among the various peptides, a specific peptide distributed in S2 was shown. A high T cell response was observed, and the strongest T cell response was confirmed to be induced against the entire S protein (Figure 8). As shown in the neutralizing antibody induction experiment, a higher T cell response was observed in mouse spleen cells immunized with rVSV MERS mspS-Gtc than with rVSV MERS S.
따라서, 상기 실험 결과들을 종합해보면, rVSV MERS mspS-Gtc로 프라임 및 부스팅 면역화된 마우스는 강력한 체액성 면역 및 세포성 면역을 유도할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, taking the above experimental results together, it can be seen that mice primed and boosted immunized with rVSV MERS mspS-Gtc can induce strong humoral and cellular immunity.
실험예 4: 인간 DPP4 형질전환 마우스에서 치사량의 MERS-CoV 투여에 대한 보호 (Protection against lethal MERS-CoV challenge in hDPP4 Transgenic Mice) Experimental Example 4: Protection against lethal MERS-CoV challenge in hDPP4 Transgenic Mice
생 MERS-CoV 챌린지 보호 실험을 위하여, DPP4 유전자가 형질 전환된 마우스를 1Х10^8 PFU의 rVSV-MERS S 및 rVSV-MERS-msp-S-Gtc 또는 rVSV-Mock으로 각 11마리씩 면역화하였다 (도 9), 부스트 면역화는 2주 후 같은 양으로 투여 하였고, 4주 후 상기 마우스는 코를 통하여 2Х10^4PFU의 생 MERS-CoV로 챌린지하였다. 체중 감량 및 생존율은 각 5마리 마우스를 14일 동안 매일 모니터링 하였고, 잔류 MERS-CoV를 분석하기 위하여 챌린지 3일 및 7일 후 각 3마리씩 허파에서 바이러스량을 분석하였다. For live MERS-CoV challenge protection experiments, 11 mice transgenic for the DPP4 gene were immunized with 1Х10^8 PFU of rVSV-MERS S and rVSV-MERS-msp-S-Gtc or rVSV-Mock (Figure 9 ), boost immunization was administered in the same amount 2 weeks later, and 4 weeks later, the mice were challenged with 2Х10^4PFU of live MERS-CoV through the nose. Weight loss and survival rate were monitored daily for 14 days in each of 5 mice, and the viral load was analyzed in the lungs of 3 mice each 3 and 7 days after challenge to analyze residual MERS-CoV.
그 결과, 도 10에서 나타난 것과 같이 Mock 바이러스를 면역한 마우스는 MERS-CoV를 챌린지 한지 8일만에 모두 사망하였고, rVSV MERS S를 투여한 마우스에서도 챌린지 6일 후 1마리가 사망하였으나, rVSV MERS mspS-Gtc를 투여한 마우스는 전부 살아남았다. 챌린지 후 체중 변화를 관찰한 결과 rVSV MERS mspS-Gtc를 투여한 마우스는 챌린지하지 않은 마우스와 동일한 체중증가 양상을 보여준 반면 Mock 바이러스로 면역화된 마우스는 급격한 체중 감소를 보였다(도 10). 챌린지 후 MERS-CoV 바이러스 검출을 위해 3일 및 7일에 허파를 채취하여 바이러스를 검출한 결과 Mock 바이러스를 투여한 마우스는 챌린지 3일후 평균 464,213 pfu 가 검출되었고 7일 후에도 3,080 pfu 가 검출되었다. rVSV MERS S를 투여한 마우스에서는 챌린지 후 3일에 17pfu가 검출되었으며 7일에는 검출되지 않았다. 한편 rVSV MERS mspS-Gtc를 투여한 마우스에서는 챌린지 후 3일, 7일 모두에서 바이러스가 검출되지 않았다. As a result, as shown in Figure 10, all mice immunized with Mock virus died 8 days after challenge with MERS-CoV, and one mouse administered rVSV MERS S died 6 days after challenge, but rVSV MERS mspS -All mice administered Gtc survived. As a result of observing body weight changes after challenge, mice administered rVSV MERS mspS-Gtc showed the same weight gain as non-challenged mice, while mice immunized with Mock virus showed rapid weight loss (FIG. 10). To detect the MERS-CoV virus after the challenge, lungs were collected on the 3rd and 7th days to detect the virus. As a result, in mice administered the mock virus, an average of 464,213 pfu was detected 3 days after the challenge, and 3,080 pfu was detected 7 days later. In mice administered rVSV MERS S, 17 pfu was detected on the 3rd day after challenge and was not detected on the 7th day. Meanwhile, in mice administered rVSV MERS mspS-Gtc, the virus was not detected on both the 3rd and 7th days after challenge.
상기 결과는 rVSV MERS S 백신 및 rVSV MERS-mspS-Gtc 백신 둘 다 보호 면역 반응을 유도하였으며, rVSV MERS-mspS-Gtc가 보다 우수한 효과를 나타내는 것을 명확하게 보여주었다. 또한, 챌린지 연구는 S 단백질 단독으로 MERS CoV 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있음을 분명히 입증하였다.The results clearly showed that both the rVSV MERS S vaccine and the rVSV MERS-mspS-Gtc vaccine induced a protective immune response, and that rVSV MERS-mspS-Gtc showed a superior effect. Additionally, challenge studies clearly demonstrated that S protein alone can induce a protective immune response against MERS CoV infection.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
Claims (12)
상기 메르스 코로나바이러스의 S 단백질은 유전자 변형된 것으로,
메르스 코로나바이러스의 전장(full-length) S 단백질 유래 서열을 포함하고,
이때, N-말단은 꿀벌 멜리틴 신호 펩타이드 유래 서열을 포함하며,
C-말단은 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV G 단백질) 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리 유래 서열을 포함하는 것인, 재조합 수포성 구내염 바이러스.In the recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) expressing the spike protein (S protein) of MERS coronavirus,
The S protein of the MERS coronavirus is genetically modified,
Contains a sequence derived from the full-length S protein of MERS coronavirus,
At this time, the N-terminus includes a sequence derived from a bee melittin signal peptide,
A recombinant vesicular stomatitis virus, wherein the C-terminus comprises a vesicular stomatitis virus G protein (VSV G protein) transmembrane domain and a cytoplasmic tail derived sequence.
프라이밍 면역화 및 부스팅 면역화 모두에 사용되는 것인, 백신 조성물.A vaccine composition for preventing MERS coronavirus infectious disease comprising the recombinant vesicular stomatitis virus of any one of claims 3 to 6 as an active ingredient,
A vaccine composition for use in both priming and boosting immunizations.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240066519A true KR20240066519A (en) | 2024-05-16 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9732122B2 (en) | Attenuated recombinant vesicular stomatitis viruses comprising modified matrix proteins | |
| US20230310581A1 (en) | A live attenuated measles virus vectored vaccine for sars-cov-2 | |
| KR101749993B1 (en) | Recomvinant vaccinia virus strain and vaccine composition comprising the same | |
| US9943593B2 (en) | Modified matrix proteins of vesicular stomatitis virus | |
| JP2021529538A (en) | Vaccine composition for the prevention or treatment of severe febrile thrombocytopenia syndrome (SFTS) viral infection disease | |
| KR101266715B1 (en) | Respiratory syncytial virus with a genomic deficiency complemented in trans | |
| US11896658B2 (en) | RSV vaccines and methods of production and use thereof | |
| KR101723900B1 (en) | Different serotypes of vesicular stomatitis virus as expression vectors for immunization regimens | |
| KR20240066519A (en) | A novel MERS coronavirus vaccine composition and use thereof | |
| US20230144060A1 (en) | MERS-CoV VACCINE | |
| KR102211077B1 (en) | A pseudo type rabies virus vaccine using virus-like particles | |
| KR101366702B1 (en) | Vaccine composition for respiratory syncytial virus and manufacturing method thereof | |
| US20170096644A1 (en) | Ibv strains and uses thereof | |
| WO2024085723A1 (en) | Ferritin protein structure displaying sars-cov-2 s1-derived protein and antibody fc region protein simultaneously on surface, and use thereof for vaccine for coronavirus sars-cov-2 | |
| US20220296701A1 (en) | Synthetic plasmid dna vaccine expressing a codon-optimized sars-cov-2 spike protein and methods for its use | |
| KR20240055376A (en) | Inactivated vaccine composition for preventing severe fever with thrombocytopenia syndrome and uses thereof | |
| US20230270844A1 (en) | Multivalent beta-coronavirus vaccines, their designs and uses | |
| Gebreeziabher | Development of Dual Vaccines for the Control of Peste des Petits Ruminants and Capripox Infections of Small Ruminants | |
| OA17659A (en) | Modified matrix proteins of vesicular stomatitis virus. |