KR20240056310A - 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 뷰베리아 바시아나 ３３１ｒ 균주 및 이의 용도 - Google Patents
살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 뷰베리아 바시아나 ３３１ｒ 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 뷰베리아 바시아나 331R 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 식물해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 신규한 뷰베리아 바시아나 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP), 뷰베리아 바시아나 331R 균주를 유효성분로 포함하는 해충과 식물병 동시 방제용 조성물 및 뷰베리아 바시아나 331R 균주를 이용한 해충 및 식물병 동시 방제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뷰베리아 바시아나 331R 균주는 인축이나 환경 생태계에 안전한 해충 방제원으로서 작물에 유해한 해충과 다양한 식물병원균을 동시에 방제할 수 있어 새로운 생물학적 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물 해충 및 식물병 병원균에 대한 살충 및 살균 활성을 갖는 신규한 곤충병원성 곰팡이 뷰베리아 바시아나 331R 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 생육의 가장 큰 장애 요인으로 지적받고 있는 해충과 식물병을 방제하기 위하여 다양한 작물 보호제들이 사용되고 있으며, 더욱 효과적인 보호제의 개발을 위한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 식량 생산 등의 경제적인 목적뿐만 아니라 조경 목적을 위해서도 해충 및 식물병의 방제를 위한 작물 보호제는 매우 필수적으로 요구되고 있고, 그에 따른 경제적 비용도 매우 높은 실정이다. 현재까지 이러한 작물 보호제는 거의 대부분이 화학물질을 이용하여 개발되어 왔으며, 그로 인해 근래에는 이들 화학물질을 바탕으로 한 작물 보호제의 인축에 대한 위해성을 비롯하여 생태계 파괴 등의 다양한 부작용이 발생하고 있다. 이러한 작물보호제의 부작용을 해결하기 위하여 각종 친환경 방제 방법들이 개발되고 있으며, 그 중 주목 받고 있는 한 가지가 곤충병원성 미생물을 이용한 미생물 살충제의 개발과 이용이다.
미생물 살충제의 소재로 이용될 수 있는 미생물은 세균, 바이러스 및 곰팡이 등 다양한 미생물이 있으며, 그 중에서 곤충병원성 곰팡이는 가장 오랜 역사를 지니고 있다. 곤충병원성 곰팡이는 곤충에 병을 일으켜 치사시키는 미생물로서 곤충 기주에 침입하여 증식하는 과정 중에 다양한 세포외 효소나 독소물질 및 2차 대사산물들을 생산하여 기주 곤충의 면역 반응을 극복하거나, 기주를 치사시킬 수 있고 또한 다른 미생물들과의 경쟁에도 이용된다.
한편, 식물에 피해를 주는 해충과 병을 효과적으로 방제하기 위해서는 각각의 개별적 방제를 위한 작물보호제의 사용이 필수적으로 요구되고 있으나, 식물에 유해한 다양한 해충과 함께 식물병원균을 동시에 효과적으로 방제할 수 있는 작물 보호제의 개발이 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 점박이응애로부터 신규한 곤충병원성 곰팡이 균주인 뷰베리아 바시아나 331R(Beauveria bassiana 331R) 균주를 분리 및 동정하였고, 상기 균주가 점박이응애, 복숭아혹진딧물, 목화진딧물에 대한 살충효과를 가질 뿐만 아니라 다양한 식물병원균에 대해 높은 항균활성이 있음을 확인함에 따라 이를 해충 및 식물병원균의 동시 방제를 위한 새로운 작물 보호제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 균주, 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해충은 점박이응애, 복숭아혹진딧물 또는 목화진딧물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병원균에 대한 방제활성은 식물병의 원인이 되는 진균에 대한 항진균 활성일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)일 수 있다.
또한 본 발명은 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP), 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해충은 점박이응애, 복숭아혹진딧물 또는 목화진딧물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 의해 발생하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지역은 토양 또는 작물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 작물은 가지, 고추, 토마토, 딸기, 배추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 고구마, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무일 수 있다.
본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R(Beauveria bassiana 331R) 균주는 점박이응애, 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대하여 우수한 살충 효과를 가지며 동시에 다양한 식물병원균에 대한 살균 활성도 가지고 있는 특징이 있다. 또한 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주는 인축이나 환경 생태계에 안전한 해충 방제원으로서, 작물에 유해한 해충과 다양한 식물병원균을 동시에 방제할 수 있어 새로운 생물학적 제제로 유용하게 사용될 수 있어 농가의 경제성 향상에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자, 상기 균주를 액체배양하여 수득한 배양액 및 출아포자를 각각 처리한 군에 대한 점박이응애 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자에 의한 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 보트리티스 시네레아에 대한 항진균 활성 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 콜레토트리쿰 아쿠타툼에 대한 항진균 활성 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 콜레토트리쿰 프루티콜라에 대한 항진균 활성 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자에 의한 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 살충력 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 보트리티스 시네레아에 대한 항진균 활성 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 콜레토트리쿰 아쿠타툼에 대한 항진균 활성 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 액체배양을 통해 수득한 배양액의 콜레토트리쿰 프루티콜라에 대한 항진균 활성 결과 그래프이다.
본 발명은 식물해충 및 식물병원균에 대한 방제 활성을 동시에 갖는 신규한 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP)를 제공함에 특징이 있다.
본 발명에서 용어 “방제"는 농작물 해충 또는 식물병원균의 유의적인 사망률을 증가시키거나 성장률을 저해하는 물질의 능력을 의미한다.
식물을 재배함에 있어서 대표적인 장애 요인으로는 다양한 해충과 식물병이 있고, 이들 문제의 해결을 위해서 살충제와 살균제, 진균제 및 바이러스제제 등이 사용되고 있는데, 이러한 다양한 해충과 식물병들의 방제를 위해서는 각각의 방제제를 이용해야 하는 것이 현실이며 이들을 동시에 방제할 수 있는 효과적인 방제제는 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 보다 효과적인 해충 및 식물병들을 동시에 방제할 수 있는 미생물 제제를 개발하기 위해 연구하던 중, 점박이응애의 사육 과정에서 분리된 신균한 뷰베리아 바시아나 331R 균주가 해충에 대한 우수한 살비력과 함께 다양한 식물병원균들에 대해 높은 항균 활성이 있음을 확인하였다.
그러므로 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주를 2022년 04월 15일자로 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC83066BP를 부여받았다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주가 해충에 대한 살비활성이 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 뷰베리아 바시아나 331R 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주를 액체배양하여 수득한 출아포자 및 이의 배양액(균체가 제거된 상기 균주로부터 분비된 대사산물을 포함하는 배양액)에 대한 해충의 살충력을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자, 출아포자 및 배양액 모두 점박이응애, 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물 모두에 대해 높은 살충활성이 있음을 확인할 수 있었다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 따르면, 점박이응애 30마리에 곡물배지에서 형성된 포자 현탁액을 스프레이하여 7일 동안 매일 관찰하며 사충을 확인한 결과, 뷰베리아 바시아나 331R 균주는 처리 후 7일에 약 99% 이상의 높은 살비력을 보였고, 출아포자 현탁액을 처리한 경우에는 처리 후 7일에 약 100%의 살비력을 보였으며, 배양액만을 처리한 경우에는 처리 후 7일에 약 89% 이상의 높은 살비력을 보였다. 또한, 곡물배지에서 형성된 포자 또는 액체배양에서 형성된 출아포자와 배양액을 동시에 처리한 경우에는 처리 후 7일에 약 100%의 높은 활성을 보였으며, 배양액과의 혼합 처리에 의해 두 가지 경우 모두 더욱 빠른 살비효과를 보였다.
뿐만 아니라 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대해 살충 활성 분석결과, 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자는 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물 모두에 대해 거의 100%의 높은 살충 활성을 보였고, 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 배양액은 복숭아혹진딧물에 대해 약 71.3%, 목화진딧물에 대해 약 63.3%의 높은 살충율을 보였다.
따라서 본 발명자들은 상기 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자, 출아포자 및 상기 균주의 배양액 모두가 다양한 해충들을 방제하기 위한 방제제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 균주에 대한 항진균 활성을 확인하기 위해, 딸기 탄저병원균인 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola), 고추탄저병원균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 대해 항균활성을 분석하였는데, 그 결과, 본 발명의 균주가 상기 식물병원균들에 대해 우수한 방제 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
그러므로 본 발명은 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP)를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 균주가 방제할 수 있는 해충으로는 이에 제한되지는 않으나, 점박이응애, 복숭아혹진딧물 또는 목화진딧물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 균주는 식물병의 원인이 되는 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 진균의 종류는 이에 제한되지는 않으나, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 균주, 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 배양물은 통상적인 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양하여 수득할 수 있으며, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 상기 탄소원으로는 전분, 수크로즈, 시트레이트, 말토스, 글루코스, 만니톨, 글리세롤 또는 자일로스를 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 포함하는 배양물 자체의 형태로도 사용할 수 있으며, 또는 균체를 제거하고 배양액만을 사용할 수 있으며, 또는 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 배양액 또는 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 실제 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 상기 기재한 유효성분(균주, 균주 배양물, 균주 배양액, 균주 배양물의 농축물 또는 균주 배양물의 건조물) 이외에 추가로 물, 담체, 희석제, 계면활성제, 약효증진제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제와 같은 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 분자 중에 친수성 분자단과 친유성 분자단을 동시에 갖는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력이 우수하다는 특징을 갖는 것으로 이해되는 물질로서, 본 발명에 따른 모기 살충용 조성물 중의 유효성분(균주 또는 이의 배양물)이 효과적으로 약효를 발현하도록 수화, 현탁, 분산시키는 작용을 하는 것으로 이해될 수 있다.
상기 계면활성제로는 알킬벤젠설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트, 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 나프탈렌설포석시네이트, 폴리옥시알킬렌석시네이트와 같은 석시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등의 음이온성 계면활성제, 에톡실화 알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬페닐폴리머, 다중 알코올과 같은 비이온성 계면활성제가 단독으로 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들은 모두 예시적으로 열거한 것들로서 이들 이외의 계면활성제가 사용될 수 있음은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 증량제는 계면활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착, 분상화할 수 있는 물질로서, 예를 들면, 전분, 대두박, 밀기울, 입상 섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 단독 또는 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
상기 결합제는 조성물 내 성분들을 서로 결합시키는 물질로서, 예를 들면, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검 또는 잔탄검 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물을 살포하는 지역으로는 토양 또는 작물일 수 있으며, 상기 작물의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 작물은 가지, 고추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예 및 실험방법>
해충 사육조건
점박이 응애(Tetranychus urticae)는 강낭콩을 공급하였고 온도 25℃, 상대습도 70%, 광조건 12L:12D으로 실험실 조건 하에서 사육하면서 실험에 이용하였다.
복숭아혹진딧물(Myzus persicae)은 봄배추를 공급하였고, 목화진딧물(Aphis gossypii)은 오이잎을 공급하였으며 온도 25℃, 상대습도 70%, 광조건 12L:12D 으로 실험실 조건 하에서 사육하면서 미술용 브러쉬로 분리하여 실험에 사용하였다.
고체 배양
본 발명에서 분리 및 동정한 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 고체배양은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 균주는 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 플레이트 상에서 25℃에서 14일 동안 배양한 다음, PDA 플레이트에서 14일된 곰팡이 분생포자를 긁어내고 0.01% 트윈-80(Difco, USA) 용액에 물질을 재현탁시켜 수집하였다. 균사 잔해물을 제거하기 위해 상기 분생포자 현탁액을 격렬하게 교반하고 면거즈를 통해 여과시켰다. 혈구계산기를 사용하여 포자 농도를 측정하였다.
곡물 배지로는 기장을 비닐봉지에 담고 0.15% 시트릭산(citric acid)을 함유한 물을 곡물의 절반 부피로 부어주었다. 95℃에서 15분간 처리한 후, 121℃에서 30분간 고압멸균 처리하여 식혀주고, 액체 배양한 곰팡이를 접종하여 25℃ 조건으로 14일간 배양하였다. 곰팡이가 배양된 곡물을 0.02% 트윈-80 (Tween-80) 용액에 넣어 격렬하게 교반하고 분생포자를 수거한 후 혈구계수기를 이용하여 포자농도를 측정하였다.
액체 배양
고체 배양을 통해 얻어진 포자현탁액은 액체배지에 접종하기 전 SDAY (Saboraud dextrose agar with 1% yeast extract, pH 5.6) 배지에 0.05% 베노밀(benomyl, 95% active ingredient)이 첨가된 SDAY+B 배지에서 포자의 발아 여부를 확인하여, 90% 이상 생존율을 보이는 경우만 사용하였다. 포자현탁액을 PDB (potato dextrose broth, pH 5.6) 배지에 접종하고 25℃, 150 rpm, 암 조건에서 14일간 배양하였다. 14일간 배양된 배양산물을 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였고, 얻어진 배양액은 거름종이(filter paper, ADVANTEC, No. 2)로 1차 여과한 후, 항진균 활성 검정을 위해 배양액을 pH 5.6으로 조정하였다. pH 조절 후 0.45 um 필터를 이용한 2차 여과로 얻어진 순수한 배양액을 실험에 사용하였다. 출아포자(blastospore) 수거는 원심분리 후 분리된 균체를 멸균된 증류수로 2번 세척하여 배양액을 제거하고, 증류수를 본래의 배양액만큼 넣어준 후 균질화하여 현탁액을 제조하였다. 이후 멸균된 거즈로 균체를 제거하고 출아포자만을 수거하여 실험에 이용하였다.
곰팡이 게놈 DNA 추출
곰팡이의 게놈 DNA 추출은 화학적 분해방법을 부분 변형해서 수행하였다. 배지에서 증식된 곰팡이 균체를 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄하고, 약 1 g의 균체 시료에 400ul의 용해완충액 (0.2 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 10mM EDTA (pH 8.0), 1% w/v SDS)과 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(phenol-chloroform-isoamylalcohol(25:24:1))을 섞고 5분 동안 강하게 교반하였다. 그 후, 9.800 x g로 8분간 원심 분리하고 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 1ul의 RNase (20 mg/ml, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 다시 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(25:24:1)을 넣고 위와 같은 조건으로 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 2.5배에 해당하는 100% 냉 알코올을 첨가한 후, 4℃에서 16.000x g, 10분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 얻어진 DNA 침전물은 70% 알코올로 세척하고 건조 후 멸균수 50ul를 넣어 녹였다.
분자생물학적 동정
분자생물학적 동정을 위해서 곰팡이의 게놈 DNA 추출은 PDA에서 2주간 자란 곰팡이 균체 일부를 fungal DNA extraction buffer (0.2 M Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M Nacl, 10 nM EDTA (pH 8.0) and 1% (w/v) SDS)를 처리한 후 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)로 원심분리하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA 용액은 냉에탄올을 이용하여 침전시키고 원심분리 후 멸균 증류수에 녹여 실험에 이용하였다.
추출된 곰팡이의 DNA를 대상으로 rDNA의 ITS(internal transcribed space) 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)과 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′)를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응은 PCR PreMix (250mM dNTPs,10mM Tris-HCl (pH 9.0), 30mM KCl, 1.5mM MgCl2, Taq DNA polymerase 1unit; BioneerCo., Korea)에 1uL의 DNA solution과 각 프라이머 10pmol을 넣어 총 볼륨 20 uL로 맞추어 수행하였다. 반응조건은 초기 변성을 94℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation) 조건 94℃에서 30초, 아닐링(annealing) 조건 53℃에서 30초, 신장(extension)조건 72℃에서 1분으로 35 사이클을 수행한 후 마지막에 72℃에서 10분간 최종 반응하였다.
PCR 반응 후 증폭 산물은 1.0% agarose gel을 이용하여 전기영동 분석하고 Power Gel Extraction Kit (Dyne Bio Inc., Korea)를 이용하여 순수 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 Macrogen (Korea)사에 direct sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)를 이용하여 정렬 한 다음 NCBI BLAST search tool을 이용하여 기 보고된 다른 곰팡이들 서열과 비교 분석하였다.
식물병원균
항진균 활성 실험에 사용된 식물병원성 곰팡이로는 잿빛곰팡이병균인 보트리스 시네레아 (Botrytis cinerea T3-4), 고추 탄저병균인 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 및 딸기 탄저병균인 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)을 사용하였으며, 이들 병원성 곰팡이는 충북대학교 식물진균병학 연구실에서 분양받았으며, 곰팡이 균주들은 PDA배지에 접종하였으며, 보트리스 시네레아는 22℃, 나머지 균주는 25℃ 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다.
생물학적 검정(Bioassay)
본 발명의 신균주에 대한 해충 방제효과를 확인하기 위해, 곰팡이 뷰베리아 바시아나 331R(Beauveria bassiana 331R) 균주를 이용하여 생물 검정 시료를 준비하였다. 즉, 곡물배지에서 형성된 곰팡이 포자, 액체배양을 통해 수득한 출아포자, 액체배양에서 균사와 출아포자가 제거된 배양액을 각각 하기 실험의 생물 검정에 사용하였다. 포자는 생존율이 90%를 초과하는 포자 현탁액을 생물 검정에 사용하였으며, 포자의 생존력은 SDAY+B 배지에서 결정하였다.
① 살충력 검정
점박이응애, 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 생물검정은 과습된 탈지면이 포함된 60 mm 페트리디쉬(petri dish)에 지름 25 mm로 잘린 각 기주식물잎을 놓고, 그 위에 해충 30마리를 올려놓은 후에 곡물배지로부터 수거된 포자현탁액 1 mL (1 × 108 포자/mL)와 액체배양으로 수거된 출아포자 1 mL (1 × 108 포자/mL), 균사와 출아포자가 제거된 배양액 1 mL를 분무 접종하였다. 접종 후 온도 25℃, 광조건 12L:12D, 습도 70% 조건으로 유지하고 24시간 간격으로 매일 관찰하였으며, 대조구로는 0.02% 트윈-80 용액만을 처리하였고 생물검정은 3반복 수행하였다.
② 곰팡이 배양액의 항진균 활성분석
곰팡이 균주 배양액의 항진균 활성 검정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 보트리티스 시네레아(B. cinerea)를 PDA배지에서 배양하여 포자형성을 유도하고, 곰팡이 표면을 긁어 수확된 포자를 10% PDB배지를 이용하여 포자현탁액을 만들었다. 수거한 포자현탁액을 멸균된 거즈를 이용하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)의 균사를 제거하였으며, 포자를 혈구계수기(hemocytometer)로 계수하고 2 X PDB배지(pH 5.6)를 이용하여 약 2 × 104 포자/ml이 되도록 조절한 후, 96 웰 플레이트에 100 ul 접종하였다. 접종 후, 본 발명의 곤충병원성 곰팡이 뷰베리아 바시아나 331R의 배양액 100%를 멸균수로 희석하여, 1%(v/v) 및 10%(v/v)의 배양액이 되도록 한 후, 이를 100 ul씩 접종하고, 22℃, 암조건에서 48시간 배양 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)의 생장을 관찰하였다. 이때 대조구는 배양액 대신 100 ul의 멸균수를 사용하였다. 또한 다른 식물병원성 곰팡이인 고추 탄저병균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32), 딸기 탄저병균 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대한 항진균 활성도 동일한 방법으로 수행하였다.
통계분석
살충활성과 항균활성 평가는 3회 반복 수행하였으며, 결과 값은 SPSS 통계프로그램으로 유의수준 0.05 이하로 유의성 검정을 하였다. 자료는 평균 ± 표준오차(SE)로 표시하였다.
<실시예 1>
해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 갖는 병원성 균주의 선발
실내 사육중인 점박이응애에서 곰팡이 병이 관찰되어, 그로부터 곰팡이를 분리하였다. 곰팡이 포자로 뒤덮인 점박이응애 사충으로부터 곰팡이 포자를 분리하여, 곤충병원성 곰팡이 선택배지인 SDAY+B 배지에 접종하고 25℃, 암조건에서 7일간 배양하였다. 선택배지에서 증식된 곰팡이는 다시 PDA배지 접종하고 25℃, 암조건에서 14일간 배양하였다.
분리된 곰팡이의 분자생물학적 동정을 위해 곰팡이 균체를 수거하고 DNA를 추출하여, ITS 영역에 대한 PCR 증폭 후 그 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 기 보고된 균주들과 비교 분석한 결과, 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 속 균주로 확인되었으며, 기존에 알려진 바 없는 신규 균주임을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 분리된 신규한 균주를 “뷰베리아 바시아나 331R(Beauveria bassiana 331R) 균주”로 명명하고, 상기 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R(Beauveria bassiana 331R) 균주를 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2022년 04월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KACC83066BP를 부여받았다. 또한, 본 발명에서 동정한 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 ITS 영역에 대한 DNA 서열은 다음과 같다.
<본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 ITS 영역 DNA 서열>
CCCTTCTGTG AACCTACCTA TCGTTGCTTC GGCGGACTCG CCCCAGCCCG GACGCGGACT
GGACCAGCGG CCCGCCGGGG ACCTCAAACT CTTGTATTCC AGCATCTTCT GAATACGCCG
CAAGGCAAAA CAAATGAATC AAAACTTTCA ACAACGGATC TCTTGGCTCT GGCATCGATG
AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATCCAGTGAA TCATCGAATC
TTTGAACGCA CATTGCGCCC GCCAGCATTC TGGCGGGCAT GCCTGTTCGA GCGTCATTTC
AACCCTCGAC CTCCCCTTGG GGAGGTCGGC GTTGGGGACC GGCAGCACAC CGCCGGCCCT
GAAATGGAGT GGCGGCCCGT CCGCGGCGAC CTCTGCGTAG TAATACAGCT CGCACCGGAA
CCCCGACGCG GCCACGCCGT AAAACACCCA ACTTCTGAAC GTTGACCTCG AATCAGGTAG
GAC
<실시예 2>
본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 해충에 대한 살충력 평가
본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 해충에 대한 살충효과를 하기와 같은 방법으로 분석하였다.
<2-1> 점박이응애에 대한 살충력
점박이응애에 대한 살비력은 곡물배지에서 생산된 포자와 액체배양 산물인 출아포자 및 균체를 제거한 배양액을 각각 이용하여 평가하였다.
그 결과, 액체배양을 통해 균체를 제거하고 수득한 배양액 단독 처리군에서는 처리 후 7일에 약 89%의 살비율을 보였고, 곡물배지에서 생산된 포자 또는 액체배양에서 수득한 출아포자를 단독처리한 군은 약 99%의 높은 살비율을 보였으며, 배양액과 포자 또는 배양액과 출아포자를 혼합처리한 군 모두에서는 거의 100%의 높은 살비효과를 확인할 수 있었다(도 1). 또한, 곡물배지에서 생산된 포자 보다는 액체배양에서 생산된 출아포자가 처리 후 3일부터 더 빠르고 높은 살비율을 보이는 것으로 나타났다. 포자 또는 출아포자와 배양액을 혼합 처리한 군은 처리 후 3일부터 단독 처리군에 비해 더 빠르고 높은 살비율을 보였다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 곰팡이 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주는 포자, 출아포자 및 배양액 모두에서 점박이응애에 대해 우수한 살충 효과가 있음을 알 수 있었다.
<2-2> 진딧물에 대한 살충력 평가
또한 본 발명자들은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 진딧물에 대한 살충 효과를 확인하기 위해, 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 포자와 배양액을 이용하여 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물에 대한 살충력을 평가하였다.
그 결과, 곡물배지에서 형성된 포자를 처리한 결과, 처리 후 3일에 2 종류의 진딧물 모두에 대해서 40% 이상의 살충률을 보였고, 처리 후 7일에는 거의 100%의 높은 살충률을 보이는 것으로 나타났다(도 2). 또한 액체배양 과정에서 균체를 제거하고 수득한 배양액을 처리한 군에서는 처리 1일 만에 10%이상의 살충율을 보였고, 처리 후 3일까지는 복숭아혹진딧물에 대해서는 약 71.3%, 목화진딧물에 대해 약 63.3%의 높은 살충율을 보였다(도 3).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주가 점박이응애 뿐만 아니라 식물 및 작물에 유해한 진딧물에 대해서도 높은 살충 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 식물 병원균에 대한 항균활성 평가
나아가 본 발명자들은 뷰베리아 바시아나 331R 균주의 식물병원균에 대한 항균 활성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 사용한 배양액을 이용하여 항균 활성을 평가하였다.
구체적으로, 뷰베리아 바시아나 331R 균주 배양액의 보트리티스 시네레아(B. cinerea)에 대한 항진균 활성을 확인하기 위해, PDB 배지(pH 5.6)에서 2주간 액체 배양한 뒤 얻은 뷰베리아 바시아나 331R 균주 배양산물로부터 균체를 제거하고 배양액을 수득한 다음, 수득한 배양액을 pH 5.6 ± 0.2로 조절하였다. 얻어진 순수한 배양액을 이용하여 보트리티스 시네레아(B. cinerea)에 대한 항진균 활성을 검정한 결과, 배양액을 100%(v/v) 농도로 처리군과, 이를 희석시켜 10%(v/v) 농도로 처리한 군 모두에서 매우 높은 항진균 활성이 관찰되었다(도 4 참조).
또한, 다른 식물병원성 곰팡이들에 대한 항진균 활성을 확인하기 위해, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대하여 상기 기술된 동일한 방법으로 항진균 활성을 분석하였다.
그 결과, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401) 식물병원성 진균에 대해 본 발명의 균주로부터 수득한 배양액을 처리함에 따라 항진균 활성이 관찰되었으며, 배양액의 처리 농도 의존적으로 높은 항진균 활성이 나타났다. 구체적으로 콜레토트리쿰 아쿠타툼에 대해서는 40%(v/v) 농도의 배양액까지 그리고 콜레토트리쿰 프루티콜라에 대해서는 40%(v/v) 농도의 배양액까지 비교적 높은 항진균 활성을 보였다(도 5 및 도 6).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 뷰베리아 바시아나 331R 균주가 보트리티스 시네레아(B. cinerea), 고추 탄저병균 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 및 딸기 탄저병균 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401) 모두에 대해 높은 항진균 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과들을 종합해 보면, 본 발명에 따른 뷰베리아 바시아나 331R 균주는 포자를 비롯한 배양산물들 모두가 복숭아혹진딧물, 목화진딧물 및 점박이응애의 식물 해충에 대해 우수한 살충력을 가지고 있음을 알 수 있었고, 동시에 식물병원성 곰팡이인 보트리티스 시네레아(B. cinerea), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32)과 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 대해서도 높은 항진균 활성을 가지고 있어, 해충뿐 아니라 식물병원균을 동시에 효과적으로 방제할 수 있는 유용한 균주임을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 해충 및 식물병원균에 대한 방제활성을 동시에 갖는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP).
- 제1항에 있어서,
상기 해충은 점박이응애, 복숭아혹진딧물 또는 목화진딧물인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP). - 제1항에 있어서,
상기 식물병원균에 대한 방제활성은 식물병의 원인이 되는 진균에 대한 항진균 활성인 것을 특징으로 하는, 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP). - 제3항에 있어서,
상기 진균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)인 것을 특징으로 하는, 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 331R 균주(기탁번호: KACC83066BP). - 제1항의 균주, 이의 포자, 상기 균주 배양물, 상기 균주 배양물에 대한 농축물 또는 상기 균주 배양물의 건조물을 유효성분로 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 해충은 점박이응애, 복숭아혹진딧물 또는 목화진딧물인 것을 특징으로 하는 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 식물병은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea T3-4), 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum 15AS32) 또는 콜레토트리쿰 프루티콜라(Colletotrichum fructicola CGF160401)에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는, 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물. - 제5항의 해충 및 식물병 동시 방제용 조성물을 해충 및 식물병이 번식한 지역에 살포하는 단계를 포함하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법.
- 제8항에 있어서,
상기 지역은 토양 또는 작물인 것을 특징으로 하는, 해충 및 식물병 동시 방제방법. - 제9항에 있어서,
상기 작물은 가지, 고추, 토마토, 딸기, 배추, 배, 사과, 오이, 장미, 벚, 돈나무, 해당화, 매실, 초피나무, 귤, 감자, 고구마, 담배, 목화, 사철나무, 협죽도, 작살나무, 구기자나무, 참오동나무, 살구나무, 자두나무 또는 고욤나무인 것을 특징으로 하는 해충 또는 식물병 방제 방법.
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