KR20240052030A - 높은 열 안정성 및 감쇠된 효과기 기능을 갖는 fc 변이체 - Google Patents
높은 열 안정성 및 감쇠된 효과기 기능을 갖는 fc 변이체 Download PDFInfo
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Abstract
하나 이상의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 여기서 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에 있는 CH2 도메인 중 적어도 하나는 변이체 CH2 도메인이고, 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표시되는 위치)에서 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Gly, 또는 Ala, Ala, 및 Asn이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 3일 출원된, 일본 특허 출원 번호 2021-144352의 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 pdf 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2022년 8월 30일에 생성된 상기 pdf 사본은 ZYME086WO_Sequence Listing.pdf로 명명되었고 크기는 716,800 바이트이다.
분야
본 개시내용은 Fc 변이체 분야에 관한 것이며 특히 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 분자, 및 상기 폴리펩티드가 약물에 접합되어 있는 폴리펩티드-약물 접합체에 관한 것이며, 이는 약제로 유용하다.
항체의 Fc 영역은 혈액 내 긴 반감기 및 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)과 같은 효과기 기능을 항체에 제공한다. Fc 영역이 대부분의 항체 약물에 사용되는 IgG 서브클래스에서 파생되는 경우, 효과기 기능은 Fcγ 수용체 (FcγR)라고 불리는 수용체 계열에 대한 Fc 영역의 결합에 따라 다르다. 그러나, FcγR에 대한 결합 활성은 주입 반응과 같은 안전성 위험과 관련이 있는 것으로 제안되었으며 (J Immunotoxicol; 5(1):11-5 (2008) 참조), 따라서 일부 상황에서는 약물로 사용되는 항체에 대한 바람직하지 않은 특성이 될 수 있다.
인간 FcγR에 대한 결합 활성을 감소시키는 IgG 항체의 Fc 영역에서의 다양한 아미노산 치환이 이전에 보고되었다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 1988/07089; WO 1999/51642; WO 2000/42072; WO 2013/092001; WO 2015/109131 및 WO 2020/086776, 및 Protein Eng Des Sel; 29(10):457-66 (2016), 및 J Biol Chem; 292(5):1865-75 (2017) 참조.
FcγR에 대한 Fc 영역의 결합을 감소시키는 아미노산 치환은 Fc 영역의 열 안정성을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2020/086776 및 J Biol Chem; 292(5):1865-75 (2017) 참조).
국제 공개 번호 WO 2013/118858은 열 안정성을 향상시킬 뿐만 아니라 효과기 기능을 증가 또는 감소시키는 Fc 영역에서의 아미노산 치환이 기술되어 있다. WO 2013/118858은 각각 독립적으로 열 안정성을 향상시키는 아미노산 치환의 조합이 반드시 부가적인 방식으로 열 안정성을 향상시키는 것은 아니라는 것을 보여준다.
높은 열 안정성 및 감쇠된 효과기 기능을 갖는 Fc 변이체가 본원에 기술되어 있다. 본 개시내용의 한 양태는 하나 이상의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 여기서 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에 있는 적어도 하나의 CH2 도메인은 위치 234, 235 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표시되는 위치)에서 아미노산 치환을 포함하는 변이체 CH2 도메인이며, 여기서 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265의 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Gly, 또는 각각, Ala, Ala, 및 Asn이고, 여기서 각각의 하나 이상의 변이체 Fc 영역은 변이체 IgG1 Fc 영역, 변이체 IgG4 Fc 영역 또는 변이체 IgG1/IgG4 Fc 영역이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 분자에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 하나 이상의 약물 또는 변형제에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드-약물 접합체에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 양태는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배지에서 폴리펩티드 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 본원에 기술된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 분자, 또는 약물 또는 변형제에 접합된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드-약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 분자, 또는 약물 또는 변형제에 접합된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드-약물 접합체의 치료법에서의 용도에 관한 것이다.
도 1은 일반적인 IgG 항체의 구조를 나타내는 개략도이다. IgG 항체는 각각 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3로 이루어진 중쇄, 및 각각 VL 및 CL로 이루어진 경쇄로 구성된다.
도 2a는 SPR 방법에 의해 평가된, 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG2 Fc 영역을 인간 야생형 IgG1 Fc 영역으로 대체하여 얻은 IgG1 WT; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A (LALA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265A (LALA-DA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/P329G (LALA-PG) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 2b는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIa에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2c는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIb/c에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2d는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIIa에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2e는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIIb에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 3은 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 4a는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 피크 상단의 온도 (T m)를 나타낸다.
도 4b는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 4c는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DA 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 4d는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-PG 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 5는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 WT는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG2 Fc 영역을 인간 야생형 IgG1 Fc 영역으로 대체하여 얻은 것인, IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265A (LALA-DA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265G (LALA-DG) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265N (LALA-DN) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265Q (LALA-DQ) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265T (LALA-DT) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대한 인간 FcγRI에 대한 결합 활성을 나타낸다.
도 6은 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 5a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 7a는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DG 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7b는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DN 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7c는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DQ 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7d는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DT 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 8은 마우스에서 정맥 내 (i.v.) 투여 후 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT, LALA 변이체, 및 LALA-DG 변이체의 혈중 농도의 시간 의존적 변화를 나타낸다. 도면의 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (n = 3).
도 9a는 SPR 방법에 의해 평가된, 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DG 변이체, 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265G/P329A (LALA-DGPA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대해 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 9b는 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 9a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 10a는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 항체인 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 10b는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 항체인 항-LPS 항체, O11-1111의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 11a는 야생형 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 1을 나타낸다. 밑줄, 이중 밑줄 및 박스 안 부분은 각각, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 아미노산 치환 (돌연변이) 위치를 나타낸다.
도 11b는 야생형 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 2를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 11c는 야생형 인간 IgG4 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 3을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 12a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 4를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 12b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 5를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 13a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 6을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 13b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 7을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 14a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 8을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 14b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 9를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15a는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 10을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15b는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 11을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15c는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 12를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 16a는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 13을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 16b는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 14를 나타낸다. 밑줄, 이중 밑줄 및 박스 안 부분은 각각, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 아미노산 치환 (돌연변이) 위치를 나타낸다.
도 17a는 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체의 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 15를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 17b는 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체의 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 16을 나타낸다. 표기는 도 16b와 같다.
도 18a는 항-LPS 항체, O11-1111의 IgG1 WT 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 17을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 18b는 항-LPS 항체, O11-1111의 IgG1 WT 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 18을 나타낸다. 표기는 도 16b와 같다.
도 19a는 인간 Fc 감마 RI (수탁#: P12314)의 아미노산 서열, 서열 번호 19를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RI/CD64 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19b는 인간 Fc 감마 RIIa (R167) (수탁#: AAA35827)의 아미노산 서열, 서열 번호 20을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIa/CD32a (R167) 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19c는 인간 Fc 감마 RIIa (H167) (수탁#: P12318-1 (P12318.4))의 아미노산 서열, 서열 번호 21을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIa/CD32a (H167) 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19d는 인간 Fc 감마 RIIb/c (수탁#: P31994)의 아미노산 서열, 서열 번호 22를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIB/C (CD32b/c) 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19e는 인간 Fc 감마 RIIIa (수탁#: AAH17865)의 아미노산 서열, 서열 번호 23을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIIa/CD16a 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19f는 인간 Fc 감마 RIIIb (수탁#: O75015)의 아미노산 서열, 서열 번호 24를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIIB/CD16b 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20a는 시노몰구스 Fc 감마 RI (수탁#: NP_001270969)의 아미노산 서열, 서열 번호 25를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RI/CD64 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20b는 시노몰구스 Fc 감마 RIIa (수탁#: NP_001270598)의 아미노산 서열, 서열 번호 26을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIIa/CD32a 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20c는 시노몰구스 Fc 감마 RIIb (수탁#: NP_001271060)의 아미노산 서열, 서열 번호 27을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIIB 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20d는 시노몰구스 Fc 감마 RIII (수탁#: NP_001270121)의 아미노산 서열, 서열 번호 28을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIII/CD16 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 21은 인간 신생아 Fc 수용체 거대 서브유닛 p51 (수탁#: P55899)의 아미노산 서열, 서열 번호 29를 나타낸다.
도 22는 베타2-마이크로글로불린 (수탁#: NP_004039.1)의 아미노산 서열, 서열 번호 30을 나타낸다.
도 23은 인간 Fc 감마 RIIIa (V176F) (수탁#: P08637)의 아미노산 서열, 서열 번호 31을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIA/CD16a (V176F) 단백질 (R & D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 2a는 SPR 방법에 의해 평가된, 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG2 Fc 영역을 인간 야생형 IgG1 Fc 영역으로 대체하여 얻은 IgG1 WT; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A (LALA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265A (LALA-DA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/P329G (LALA-PG) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 2b는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIa에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2c는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIb/c에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2d는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIIa에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 2e는 SPR 방법에 의해 평가된, 인간 FcγRIIIb에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 3은 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 2a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 4a는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 피크 상단의 온도 (T m)를 나타낸다.
도 4b는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 4c는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DA 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 4d는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-PG 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 5는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 WT는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG2 Fc 영역을 인간 야생형 IgG1 Fc 영역으로 대체하여 얻은 것인, IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265A (LALA-DA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265G (LALA-DG) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265N (LALA-DN) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265Q (LALA-DQ) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체; 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265T (LALA-DT) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대한 인간 FcγRI에 대한 결합 활성을 나타낸다.
도 6은 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 5a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 7a는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DG 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7b는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DN 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7c는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DQ 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 7d는 DSC로 측정한 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DT 변이체의 온도 의존적 열 용량 변화를 나타낸다. 각 피크 근처의 숫자는 T m을 나타낸다.
도 8은 마우스에서 정맥 내 (i.v.) 투여 후 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT, LALA 변이체, 및 LALA-DG 변이체의 혈중 농도의 시간 의존적 변화를 나타낸다. 도면의 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (n = 3).
도 9a는 SPR 방법에 의해 평가된, 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 LALA-DG 변이체, 및 IgG1 WT의 Fc 영역에 L234A/L235A/D265G/P329A (LALA-DGPA) 돌연변이를 도입하여 얻은 변이체에 대해 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 9b는 SPR 방법에 의해 평가된, 시노몰구스 FcγRI에 대한 도 9a에 도시된 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 10a는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 항체인 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 10b는 SPR 방법에 의해 평가된, IgG1 항체인 항-LPS 항체, O11-1111의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체에 대한 인간 FcγRI의 결합 활성을 나타낸다.
도 11a는 야생형 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 1을 나타낸다. 밑줄, 이중 밑줄 및 박스 안 부분은 각각, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 아미노산 치환 (돌연변이) 위치를 나타낸다.
도 11b는 야생형 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 2를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 11c는 야생형 인간 IgG4 불변 영역의 아미노산 서열, 서열 번호 3을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 12a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 4를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 12b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 5를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 13a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 6을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 13b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 7을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 14a는 인간 IgG1 (G1m17) 불변 영역의 LALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 8을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 14b는 인간 IgG1 (G1m3) 불변 영역의 LALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 9를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15a는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DG 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 10을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15b는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DN 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 11을 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 15c는 인간 IgG4 불변 영역의 FALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열, 서열 번호 12를 나타낸다. 표기는 도 11a와 같다.
도 16a는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 13을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 16b는 항-EGFR 항체, 파니투무맙의 IgG1 WT 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 14를 나타낸다. 밑줄, 이중 밑줄 및 박스 안 부분은 각각, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 아미노산 치환 (돌연변이) 위치를 나타낸다.
도 17a는 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체의 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 15를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 17b는 항-CD70 항체, 보르세투주맙의 LALA 변이체의 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 16을 나타낸다. 표기는 도 16b와 같다.
도 18a는 항-LPS 항체, O11-1111의 IgG1 WT 경쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 17을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 가변 영역을 나타낸다.
도 18b는 항-LPS 항체, O11-1111의 IgG1 WT 중쇄의 아미노산 서열, 서열 번호 18을 나타낸다. 표기는 도 16b와 같다.
도 19a는 인간 Fc 감마 RI (수탁#: P12314)의 아미노산 서열, 서열 번호 19를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RI/CD64 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19b는 인간 Fc 감마 RIIa (R167) (수탁#: AAA35827)의 아미노산 서열, 서열 번호 20을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIa/CD32a (R167) 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19c는 인간 Fc 감마 RIIa (H167) (수탁#: P12318-1 (P12318.4))의 아미노산 서열, 서열 번호 21을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIa/CD32a (H167) 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19d는 인간 Fc 감마 RIIb/c (수탁#: P31994)의 아미노산 서열, 서열 번호 22를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIB/C (CD32b/c) 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19e는 인간 Fc 감마 RIIIa (수탁#: AAH17865)의 아미노산 서열, 서열 번호 23을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIIa/CD16a 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 19f는 인간 Fc 감마 RIIIb (수탁#: O75015)의 아미노산 서열, 서열 번호 24를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIIB/CD16b 단백질 (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20a는 시노몰구스 Fc 감마 RI (수탁#: NP_001270969)의 아미노산 서열, 서열 번호 25를 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RI/CD64 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20b는 시노몰구스 Fc 감마 RIIa (수탁#: NP_001270598)의 아미노산 서열, 서열 번호 26을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIIa/CD32a 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20c는 시노몰구스 Fc 감마 RIIb (수탁#: NP_001271060)의 아미노산 서열, 서열 번호 27을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIIB 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 20d는 시노몰구스 Fc 감마 RIII (수탁#: NP_001270121)의 아미노산 서열, 서열 번호 28을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 시노몰구스 원숭이 Fc 감마 RIII/CD16 단백질, CF (R&D Systems)의 서열을 나타낸다.
도 21은 인간 신생아 Fc 수용체 거대 서브유닛 p51 (수탁#: P55899)의 아미노산 서열, 서열 번호 29를 나타낸다.
도 22는 베타2-마이크로글로불린 (수탁#: NP_004039.1)의 아미노산 서열, 서열 번호 30을 나타낸다.
도 23은 인간 Fc 감마 RIIIa (V176F) (수탁#: P08637)의 아미노산 서열, 서열 번호 31을 나타낸다. 밑줄 친 부분은 재조합 인간 Fc 감마 RIIA/CD16a (V176F) 단백질 (R & D Systems)의 서열을 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 주어진 값으로부터 대략 +/-10% 변이를 지칭한다. 이러한 변이는 구체적으로 언급되었는지에 관계없이 본원에 제공된 임의의 주어진 값에 항상 포함된다는 것을 이해해야 한다.
본원에서 용어 "포함하는"과 함께 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상," "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와도 일치한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)," "가지는," "포함하는(including)" 및 "함유하는," 및 이들의 문법적 변형은 포괄적이거나 제한이 없으며 추가적인, 인용되지 않은 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본원에서 사용될 때 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 추가 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 이러한 추가가 언급된 조성물, 방법 또는 용도 기능이 수행되는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 본원에서 사용될 때 용어 "이루어지는(consisting of)"은 추가적인 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로 본원에 기술된 조성물, 용도 또는 방법은 또한 특정 구현예에서는 본질적으로 그러한 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있고, 다른 구현예에서는 이러한 구현예가 구체적으로 언급되든 없든 그러한 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있다.
본원에 논의된 임의의 구현예는 본원에 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대도 가능하다는 것이 고려된다.
본 개시내용은 하나 이상의 변이체 IgG1 Fc 영역 또는 변이체 IgG4 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 여기서 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에서 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 변이체 CH2 도메인(들)이고, 여기서 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Gly (및 선택적으로 위치 329의 아미노산 잔기는 Ala), 또는 각각, Ala, Ala, 및 Asn (및 선택적으로 위치 329의 아미노산 잔기는 Ala)이다. 본 개시내용은 추가로 상기 폴리펩티드를 포함하는 분자; 상기 폴리펩티드가 약물에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체; 상기 폴리펩티드, 분자 또는 접합체를 포함하는 약학 조성물; 및 상기 폴리펩티드, 분자, 접합체, 또는 약학 조성물로 인간 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 변이체 IgG Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 분자, 및 상기 폴리펩티드가 약물에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체에 관한 것이며, 이는 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 감소되고 열 안정성이 우수하고 약제로 유용하다. 예를 들어, 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 분자, 및 폴리펩티드가 약물에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체는 모 CH2 도메인 (즉, 변이체 CH2 도메인에 포함된 위치 234, 235 및 265 (및 선택적으로 위치 329)에 돌연변이를 도입하기 전 CH2 도메인)을 포함하는 각각, 모 폴리펩티드, 분자 및 접합체에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 감소한다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드, 분자 및 접합체는 모 CH2 도메인을 포함하는, 각각, 모 폴리펩티드, 분자 및 접합체에 비해 개선되거나 동등한 열 안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드, 분자 및 접합체는 모 CH2 도메인을 포함하는 각각, 모 폴리펩티드, 분자 및 접합체에 비해 항원에 대한 결합 활성을 유지하고 혈액 내 반감기가 감소하지 않는다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드, 분자 또는 접합체의 CH2 도메인은 아미노산 치환 횟수 증가로 인해 발생할 수 있는 면역원성 위험을 낮추는 모 CH2 도메인을 포함하는 각각, 모 폴리펩티드, 분자 및 접합체로부터 적은 수의 아미노산 치환 (예를 들어, 3 또는 4개 아미노산 치환)을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, Fc 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한 EU 인덱스 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 63, No.1 (May 15, 1969), pp. 78-85)에 따른다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 전형적으로 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 약 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 또는 합성 또는 재조합 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 단편, 융합 단백질 등일 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리펩티드를 포함하는 분자에 관한 것이다. 이러한 분자는 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 가용성 수용체, 면역사이토카인, 항체 또는 이의 기능적 단편 이외의 항원 또는 표적에 결합하는 모이어티 (예를 들어, 비면역글로불린 단백질, 수용체, 리간드, 핵산 압타머, 안티센스 핵산 분자, 저분자량 화합물 등)를 포함하지만 이제 제한되지 않는다. 본 개시내용에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자가 그 자체로 폴리펩티드인 경우, 분자는 본 개시내용에 따른 "폴리펩티드"로 간주될 수 있고, 이에 따라 본원에서는 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드" 또는 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자"로 지칭될 수 있다. 하기에 기술된 "융합 단백질"은 또한 일부 구현예에서 그 자체가 폴리펩티드일 수 있고, 따라서 본원에서는 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드" 또는 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자"로서 지칭될 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용은 상기 기술된 폴리펩티드가 약물에 접합되는, 폴리펩티드-약물 접합체에 관한 것이다. 약물은 예를 들어, 치료 약물 또는 진단 약물일 수 있다. 폴리펩티드-약물 접합체에 포함된 폴리펩티드가 종양 세포를 표적으로 하는 항체인 경우, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 폴리펩티드-약물 접합체는 일반적으로 링커를 통해 폴리펩티드를 약물에 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 당업계에 공지된 링커, 예를 들어, 당 링커 및/또는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 또한, 폴리펩티드-약물 결합체를 사용하려는 치료 목적에 따라 다양한 약제를 약물로 사용할 수 있다. 상기 기재된 폴리펩티드가 약물에 접합된, 폴리펩티드-약물 접합체는 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자"의 다른 구현예 중 하나로 간주될 수 있다.
변이체 Fc 영역
본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 변이체 IgG1 Fc 영역, 변이체 IgG4 Fc 영역 또는 변이체 IgG1/IgG4 영역 (집합적으로 "변이체 Fc 영역")을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fc 영역"은 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭하고 2개의 CH2 도메인 및 2개의 CH3 도메인을 포함한다. Fc 영역은 2개의 중쇄에서 힌지 영역에 의해 연결된 C 말단 영역의 동종이량체 또는 이종이량체의 형태이지만, 또한 일부 구현예에서 단일 가닥 Fc (scFc) 영역일 수 있다. Fc 영역이 IgG1 항체로부터 유래되는 경우, Fc 영역은 위치 231의 아미노산 잔기로부터 C-말단까지의 영역을 의미하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지" 또는 "힌지 영역"은 CH1 도메인의 C-말단에서 CH2 도메인의 N-말단을 포함하는 IgG 항체의 부분을 지칭한다. Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4 항체로부터 유래되는 경우, 힌지는 제한 없이, 약 위치 216의 아미노산 잔기부터 약 위치 230의 아미노산 잔기까지 확장된다. 상기 기술된 바와 같이, Fc 영역이 IgG1 항체로부터 유래되는 경우, Fc 영역은 일반적으로 위치 231의 아미노산 잔기에서 잔기부터 중쇄의 C-말단까지의 부분을 지칭하지만, 일부 구현예에서, "힌지"는 Fc 영역에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "CH2 도메인"은 힌지와 연결되는 지점부터 CH3 도메인과 연결되는 지점까지 확장되는 영역을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4 항체로부터 유래되는 경우, CH2 도메인은 일반적으로 약 위치 231의 아미노산 잔기로부터 약 위치 340의 아미노산 잔기까지 확장된다. 인간 야생형 IgG1 또는 IgG4의 Fc-영역의 위치 234, 235, 265, 및 329에 있는 아미노산 잔기는 CH2 도메인에 존재한다. CH2 도메인은 일반적으로 Fc-영역에 고리형 구조를 갖고 있으나, 이러한 구조에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "CH3 도메인"은 Fc 영역의 CH2 도메인과 연결되는 지점부터 중쇄의 C-말단까지 연장된 영역을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4 항체로부터 유래되는 경우, CH3 도메인은 일반적으로 IgG1의 약 위치 341의 아미노산 잔기로부터 약 위치 447의 아미노산 잔기까지 확장되지만 이에 제한되지는 않는다. CH3 도메인은 일반적으로 Fc-영역에 고리형 구조를 갖고 있으나, 이러한 구조에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "변이체 IgG1 Fc 영역" 또는 "변이체 IgG4 Fc 영역"은 2개의 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두가 변이체 CH2 도메인(들)인 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역을 지칭한다. 변이체 IgG1 Fc 영역 및 변이체 IgG4 Fc 영역은 "변이체 Fc 영역"으로 집합적으로 지칭될 수 있다. 용어 "변이체 Fc 영역"은 또한 2개의 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두가 변이체 CH2 도메인(들)인 혼합 IgG1/IgG4 Fc 영역을 포함한다. "변이체 CH2 도메인"은 위치 234, 235, 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)의 아미노산 잔기가 Ala, Ala, 및 Gly; 또는 각각, Ala, Ala, 및 Asn (즉, 234A, 235A, 및 265G; 또는 234A, 235A, 및 265N)인 CH2 도메인을 지칭한다. 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인은 위치 234, 235, 265, 및 329에서 각각, Ala, Ala, Gly, 및 Ala로 치환된 아미노산 잔기 (즉, 234A, 235A, 265G, 및 329A)를 포함한다.
본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 변이체 Fc 영역 이외의 또 다른 (하나 이상의) 성분(들), 예를 들어 IgG 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 어느 하나의 부분, 영역, 또는 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 바람직하게는 포유동물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 또는 시노몰구스 원숭이 (예를 들어, 게잡이 원숭이, 붉은 털 원숭이, 마모셋, 다람쥐 원숭이 등을 포함함)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간으로부터 유래된다.
야생형 인간 IgG1의 Fc 영역의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 1 또는 2의 114번째 내지 330번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공되고 (도 11a 및 11b 참조), 야생형 인간 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 3의 111번째 내지 327번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에서 제공된다 (도 11c 참조). 상기 언급된 아미노산 치환에 의한 돌연변이 도입 전 인간 IgG1 Fc 영역의 위치 234, 235, 265, 및 329 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기는 각각, Leu, Leu, Asp, 및 Pro (즉, L234, L235, D265 및 P329)이다. 따라서 상기 언급된 아미노산 치환은 본원에서 L234A/L235A/D265G (LALA-DG), L234A/L235A/D265G/P329A (LALA-DGPA), 및 L234A/L235A/D265N (LALA-DN)으로 표시될 수 있으며, 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 본원에서 각각, "LALA-DG 변이체", "LALA-DGPA 변이체" 및 "LALA-DN 변이체"로 지칭될 수 있다. 돌연변이 도입 전 인간 IgG4 Fc 영역의 위치 234, 235, 265, 및 329 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기는 위치 234의 아미노산 잔기가 Phe인 것을 제외하고, IgG1 Fc 영역과 동일하다 (즉, F234, L235, D265, 및 P329). "본 개시내용에 따른 CH2 도메인"이 IgG4 항체로부터 유래되는 경우, 상기 언급된 아미노산 치환은 따라서 본원에서 F234A/L235A/D265G (FALA-DG), F234A/L235A/D265G/P329A (FALA-DGPA), 및 F234A/L235A/D265N (FALA-DN)으로 표시될 수 있으며, 그리고 이들 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 따라서 본원에서 각각, "FALA-DG 변이체", "FALA-DGPA 변이체" 및 "FALA-DN 변이체"로 지칭될 수 있다.
본 개시내용에 따른 "변이체 CH2 도메인"은 위치 234, 235, 및 265에서 (및 선택적으로 위치 329에서) 상기 언급된 특정 아미노산 치환을 포함하고, 상기 언급된 특정 아미노산 치환 이외의 아미노산 변형(들) (예를 들어, 결실, 첨가, 치환, 또는 삽입)을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 변이체 Fc 영역은 상기 언급된 특정 아미노산 치환 이외의 아미노산 변형(들) (예를 들어, 결실, 첨가, 치환, 또는 삽입)을 포함할 수 있다. Fc 영역이 추가적인 아미노산 변형을 포함하는 경우, 추가적인 아미노산 변형은 CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 영역 (포함되는 경우) 또는 이들의 조합에 있을 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, Fc 영역은 2개의 CH2 도메인 및 2개의 CH3 도메인을 포함한다. Fc 영역이 추가적인 아미노산 변형을 포함하는 경우, 변형은 대칭 변형 (CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인 모두에 존재하는 동일한 변형)이거나 비대칭 변형 (각 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 상이한 변형, 또는 CH2 도메인 중 하나 및/또는 CH3 도메인 중 하나에만 존재함)일 수 있다.
인간 IgG1 Fc 영역의 LALA-DG 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 4 또는 5의 114번째 내지 330번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공되고 (도 12a 및 12b 참조), 인간 IgG1 Fc 영역의 LALA-DN 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 6 또는 7의 114번째 내지 330번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공되고 (도 13a 및 13b 참조), 인간 IgG1 Fc 영역의 LALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 8 또는 9의 114번째 내지 330번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에서 제공된다 (도 14a 및 14b 참조). 인간 IgG4 Fc 영역의 FALA-DG 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 10의 111번째 내지 327번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공되고 (도 15a 참조), 인간 IgG4 Fc 영역의 FALA-DN 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 11의 111번째 내지 327번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공되고 (도 15b 참조), 인간 IgG4 Fc 영역의 FALA-DGPA 변이체의 아미노산 서열의 예는 서열 번호 12의 111번째 내지 327번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열로서 본원에 제공된다 (도 15c 참조). 이들 서열은 단지 예시로서 제공된 것이며 본 개시내용의 변이체 CH2 도메인은 이에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, "LALA-DGPA 변이체" 또는 "FALA-DGPA 변이체"의 265번째 Gly가 Asn으로 각각 대체된 "LALA-DNPA 변이체" 및 "FALA-DNPA 변이체"가 본 개시내용에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
위치 234, 235, 및 265에서 (및 선택적으로 위치 329에서) 상기 언급된 특정 아미노산 치환 (돌연변이)을 도입하기 전의 CH2 도메인은 본원에서 "모 CH2 도메인"으로 지칭된다. 모 CH2 도메인은 IgG1 항체 또는 IgG4 항체의 야생형 CH2 도메인일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 언급된 특정 아미노산 치환을 도입하기 전에 아미노산 변형(들)이 이미 CH2 도메인에 포함된 경우, "모 CH2 도메인"은 그러한 이전 변형(들)을 포함하는 CH2 도메인을 의미한다.
마찬가지로, 상기 언급된 "모 CH2 도메인"을 포함하는 Fc 영역은 본원에서 "모 Fc 영역"으로 지칭되고 상기 언급된 "모 CH2 도메인" 또는 "모 Fc 영역"을 포함하는 폴리펩티드는 본원에서 "모 폴리펩티드"로 지칭된다. 모 폴리펩티드는 전형적으로 모 CH2 도메인을 본 개시내용의 변이체 CH2 도메인 대신에 모 폴리펩티드를 포함하는 것을 제외하고는, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드와 동일하거나 동등한 폴리펩티드를 지칭하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 상기 언급된 특정 아미노산 치환이 모 CH2 도메인(들)에 도입된 변이체 Fc 영역을 포함한다. 전술한 바와 같이, 하나의 Fc 영역에 2개의 CH2 도메인이 존재하므로, 변이체 Fc 영역의 아미노산 치환은 2개의 모 CH2 중 하나만 도입될 수도 있거나 모 CH2 도메인에 모두 도입될 수도 있다. 또한, 아미노산 치환이 모 CH2 도메인 모두 도입되는 경우, 동일하거나 상이한 아미노산 치환이 도입될 수 있다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역의 2개의 변이체 CH2 도메인 중 하나는 아미노산 치환 L234A/L235A/D265G를 포함할 수 있고, 다른 하나는 아미노산 치환 L234A/L235A/D265N을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변이체 Fc 영역의 2개의 변이체 CH2 도메인 중 하나는 아미노산 치환 L234A/L235A/D265G를 포함할 수 있고, 다른 하나는 아미노산 치환 L234A/L235A/D265G/P329A를 포함할 수 있다. 다른 조합도 가능하며 본 개시내용에 포함된다. Fc 영역의 2개의 CH2 도메인에 동일한 아미노산 치환이 도입된 경우, 도메인 및 Fc 영역은 "동종이량체화"에 의해 형성된 "동종이량체"로 지칭될 수 있고, Fc 영역의 2개의 CH2 도메인에 상이한 아미노산 치환이 도입된 경우, 도메인 및 Fc 영역은 "이종이량체화"에 의해 형성되는 "이종이량체"로 지칭될 수 있다. "이종이량체화"는 "노브-인투-홀(knobs-into-holes)" 기술 (국제 공개 번호 WO 96/027011), "정전기 스티어링" (J Biol Chem, 285:19637-46 (2010)), 가닥 교환 조작 도메인 (SEED) 기술 (Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010)), Fab-아암 교환 (Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013))과 같은, 다양한 공지 기술 및 국제 공개 번호 WO 2012/058768 및 WO 2013/063702에 설명된 바와 같이 안정한 비대칭 변형 Fc 영역을 생성하기 위해 양성 및 음성 디자인 전략을 결합하는 접근법을 사용하여 달성될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 폴리펩티드가 복수의 항체를 포함하는 경우, 항체 중 적어도 하나는 적어도 하나의 변이체 CH2 도메인을 포함해야 한다. 더욱이, 일부 구현예에서, 변이체 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 중 하나는 IgG1 항체로부터 유래된 CH2 도메인일 수 있고 다른 하나는 IgG4 항체로부터 유래된 CH2 도메인일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 변이체 Fc 영역의 CH2 도메인 둘 다 IgG1 항체로부터 유래될 수 있거나 둘 다 IgG4 항체로부터 유래될 수 있다.
한 구현예에서, 아미노산 치환 LALA-DG, LALA-DN 또는 LALA-DGPA가 모 CH2 도메인으로 도입된 변이체 CH2 도메인은 모 CH2 도메인, 즉, 위치 234, 235, 및 265에서 (및 선택적으로 위치 329에서) 상기 언급된 특정 아미노산 치환을 도입하기 전 CH2 도메인과 비교하여 향상된 열 안정성을 갖는다. 추가 구현예에서, 변이체 CH2 도메인은 모 CH2 도메인과 비교하여 동등하거나 향상된 열 안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 위치 234, 235 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기가 각각, Ala, Ala 및 Gly인 변이체 CH2 도메인, 및 위치 234, 235, 265, 및 329 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기가 각각, Ala, Ala, Gly, 및 Ala인 변이체 CH2 도메인은 각각의 모 CH2 도메인과 비교하여 동등한 열 안정성을 갖는다. 다른 구현예에서, 위치 234, 235 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기가 각각, Ala, Ala 및 Asn인 변이체 CH2 도메인은 위치 234, 235 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 잔기가 각각, Leu, Leu 및 Asp인 모 CH2 도메인과 비교하여 동등한 열 안정성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "열 안정성"은 Fc 영역의 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)에 의해 결정된다. 열 변성 중간점 온도 (Tm)는 예를 들어, DSC (시차 주사 열량계) 또는 DSF (시차 주사 형광 측정법)에 의해 측정할 수 있다.
한 구현예에서, 열 변성 중간점 온도 (Tm)는 온도가 증가함에 따라 열 용량의 변화가 관찰되는 DSC 측정에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 열 변성 중간점 온도 (Tm) 측정에 있어서, CH2 도메인의 열 안정성의 평가는 IgG 항체, 즉, Fc 영역 (즉, 힌지 부분, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 이량체) 및 Fab 영역을 포함하는 항체를 제조하고, 이어서 DSC에 의해 항체의 열 안정성을 평가함으로써 수행할 수 있다 (예를 들어, 본원의 실시예 섹션 참조). IgG 항체에 대해 DSC 분석을 하면 일반적으로 온도가 증가함에 따라 CH2 도메인, Fab 영역, 및 CH3 도메인 순으로 열 변성 피크가 관찰된다. 본 개시내용에서, 열 변성 중간점 온도 (Tm)를 열변성에 대한 피크 온도를 결정하여 열적 안정성을 평가하는데 사용하였다.
DSC에 의한 Tm 측정을 위한 구체적인 절차의 예는 다음과 같다: 먼저, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 용액을 (일반적으로, 0.1μg/mL 내지 100μg/mL로) 히스티딘 완충액, 시트레이트 완충액, TBS 등에서 제조한 다음, 폴리펩티드의 용액을 DSC 장비의 측정 팬에 놓는다. 후속적으로, 온도를 일정한 온도 상승 속도로 상승시켜 CH2 도메인에 대한 흡열 피크를 관찰하고, 이에 기초하여 Tm 값이 결정된다. 모 폴리펩티드의 DSC 측정은 모 폴리펩티드의 Tm을 결정하기 위해 유사한 방식으로 수행될 수 있고, 그런 다음 본 개시내용의 폴리펩티드와 모 폴리펩티드 사이 Tm 값의 차이 (ΔT m)가 결정될 수 있다. MicroCal VP-Capillary DSC 시스템 (Malvern Panalytical Ltd., Malvern, UK)과 같이 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 DSC 측정용 기기를 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 폴리펩티드의 열 안정성은 본원의 실시예 5, 11 또는 14에 기술된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "개선된 열 안정성"은 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 참조 CH2 도메인 (예를 들어, 모 CH2 도메인)의 열 변성 중간점 온도 (Tm)보다 1℃ 이상 높다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "동등한 열 안정성"은 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 참조 CH2 도메인 (예를 들어, 모 CH2 도메인)보다 1℃만큼 높지 않고 1℃만큼 낮지 않음 (즉, (+) 1℃ 이내임)을 의미한다. 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인이 LALA-DG 변이체인 경우, Tm은 야생형 Fc 영역의 CH2 도메인보다 3℃ 이상 또는 4℃ 이상이고, Tm은 LALA 변이체 (인간 IgG1 Fc 영역에서 위치 234 및 235 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)의 아미노산 잔기가 각각, Ala 및 Ala인 변이체)의 CH2 도메인보다 3℃ 이상 높다. 따라서, 한 구현예에서, LALA-DG 변이체의 열 안정성은 야생형 CH2 도메인 및 또한 LALA 돌연변이의 CH2 도메인 둘 다의 열 안정성에 비해 개선되며, LALA-DG 변이체는 265 위치에서 단지 1개의 추가 치환만 다르다. 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인은 모 CH2 도메인보다 약 0.1℃, 0.5℃, 1℃ 이상인 Tm을 갖는다. 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인 모 CH2 도메인보다 약 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 또는 3℃ 이상인 Tm을 갖는다. 한 구현예에서, 변이체 CH2 도메인은 모 CH2 도메인보다 약 3.5℃, 4℃, 4.5℃, 또는 5℃ 이상인 Tm을 갖는다. 전술한 바와 같이, 다른 추가적인 아미노산 변형(들) (결실(들), 첨가(들), 치환(들), 등)이 위치 234, 235, 및 265 (선택적으로, 위치 329)에서 특정 아미노산 치환 이외에 변이체 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 표시된 값의 ±10%를 지칭한다.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 또는 감쇠된 결합 친화도를 갖는다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 또는 감쇠된 결합 친화도를 갖고, 이로써 폴리펩티드의 효과기 기능이 모 폴리펩티드와 비교하여 감소된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도" 및 "결합 활성"은 동일한 의미를 갖는다. 용어 "Fcγ 수용체" (Fc 감마 수용체 또는 FcγR로도 지칭됨)는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 지칭한다. FcγR은 인간, 원숭이, 또는 고양이와 같은 포유동물로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, FcγR은 인간 FcγR 또는 시노몰구스 FcγR이다. 한 구현예에서, FcγR은 인간 FcγR이다. 인간 수용체 계열은 FcγRI (CD64) (동형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc 포함), FcγRII (CD32) (동형 FcγRIIa (동종이형 H131 (H 유형) 및 R131 (R 유형) 포함), FcγRIIb (FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함), 및 FcγRIIc (FcγRIIc 포함), 및 FcγRIII (CD16) (동형 FcγRIIIa (동종이형 V158 및 F158 포함), FcγRIIIb (동종이형 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2 포함), 및 FcγRIIIc)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 시노몰구스 Fcγ 수용체 계열은 FcγRIIc 및 FcγRIIIb를 제외하고 상기 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII (이들의 동형 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. FcγR 수용체는 또한 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 접합된 형태를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "FcγR에 대해 감소된 결합 친화도"는 전술한 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII의 9개의 동형 중 적어도 하나에 대한 활성이 감소될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 모든 FcγR 동형에 대한 결합 친화도가 감소될 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 중 하나 이상에 대해 결합이 감소된다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII에 대한 결합이 감소된다. FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII는 인간 FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII 또는 시노몰구스 FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII일 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 인간 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 또는 FcγRIIIb 중 하나 이상에 대한 결합이 감소된다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 인간 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb에 대한 결합이 감소된다. 인간 및 시노몰구스 기원의 Fcγ 수용체로서, 본원의 비교예 및 실시예에 개시된 수용체를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하거나 이에 의해 매개되는 생물학적 활성을 지칭한다. 효과기 기능은 보체-의존성 세포 매개 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 매개 식균작용 (ADCP), Fc-수용체 결합, C1q 결합, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절, 및 사이토카인 생산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 위치 234, 235, 및 265에서 (및 선택적으로 위치 329에서) 상기 언급된 특정 아미노산 치환에 의해 효과기 기능을 감소시킬 수 있으며, 여기서 효과기 기능은 CDC 활성, ADCC 활성, ADCP 활성, Fc-수용체 결합, C1q 결합, 세포 표면 수용체의 하향 조절, 또는 과도한 사이토카인 생산 중 하나 이상이고, 효과기 기능이 불필요한 약학적 적용에 유용할 수 있다. 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 변형은 본원에서 "무효과기 돌연변이"로 지칭될 수 있다. 효과기 기능은 당업계에 공지된 검정뿐만 아니라 본원에 개시된 것과 같은 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도의 측정을 사용하여 평가될 수 있다.
"Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도"는 공지된 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들어, 리간드와 분석물 사이의 상호작용을 측정하는 표면 플라즈마 공명 (SPR) 방법으로 측정할 수 있다. 이 측정은 예를 들어, Biacore™ SPR 시스템 (Cytiva, Marlborough, MA)을 사용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 이 방법에서는, 각각의 His 태그된 FcγR을 리간드로서 센서 칩에 직접 고정시키거나 항-His 태그 항체와 함께 센서 칩에 포획하여 고정시킨 후, 본 개시내용의 폴리펩티드를 분석물로서 센서 칩에 첨가한다. 첨가된 분석물이 고정된 리간드에 결합하면 고정된 리간드 분자의 겉보기 질량이 증가한다. 센서 칩 표면의 용매 굴절률 변화에 따라 SPR 신호의 위치 이동량이 측정된다. 이동된 양에 따라, 리간드 (FcγR)에 결합된 분석물 (항체)의 양을 결합 반응의 값 (공명 단위, RU)으로 결정한다 (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 103(11):4005-4010 (2006) 등 참조). 대안적으로 또는 추가적으로, Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도는 ELISA, FACS 등에 의해 측정될 수 있다. 한 구현예에서, "Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도"는 본원의 실시예 1-4, 9-10, 12 또는 13에 기술된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "Fcγ 수용체에 대한 감소된 또는 감쇠된 결합 친화도"는 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 동일한 검정에 의해 결정된 바와 같이 동일한 Fcγ 수용체에 대한 참조 폴리펩티드 (예를 들어, 모 폴리펩티드)의 결합 친화도보다 낮다는 것을 의미한다. 감소된 또는 감쇠된 결합 친화도는 예를 들어, 상기 기술된 표면 플라즈마 공명 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 RU 값이 동일한 검정에 의해 결정된 동일한 Fcγ 수용체에 대한 참조 폴리펩티드 (예를 들어, 모 폴리펩티드)의 RU 값과 비교하여 감소되는지 여부를 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 구현예에서, 효과기 기능을 효과적으로 감소시키기 위해, 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 100%로 간주할 때, 동일한 Fcγ 수용체에 대한 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 결합 친화도는 80% 미만, 70% 미만 또는 60% 미만으로 감소된다. 한 구현예에서, 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 100%로 간주할 때, 동일한 Fcγ 수용체에 대한 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 결합 친화도는 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만으로 감소된다. 한 구현예에서, 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 100%로 간주할 때, 동일한 Fcγ 수용체에 대한 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 결합 친화도는 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 0.1% 미만으로 감소한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 다양한 영역 (Fc 영역 포함)에서의 아미노산 치환으로 인해 항체의 항원 결합 활성이 감소될 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 유의하게 감소된 "항원-결합 활성"을 나타내지 않는다. 폴리펩티드의 항원-결합 활성은 공지된 방법, 예를 들어, SPR 방법 (예를 들어, 본원의 실시예 6에 기재된 방법 참조)에 의해 측정할 수 있다.
당업계에 또한 공지된 바와 같이, 항체의 다양한 영역 (Fc 영역을 포함)에서의 아미노산 치환으로 인해 항체의 혈액 내 반감기가 감소될 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 유의하게 감소된 "혈액 반감기"를 나타내지 않는다. 폴리펩티드의 혈액 반감기는 공지된 방법, 예를 들어, 본원의 실시예 8에 기술된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체 또는 이의 기능적 단편의 혈액 반감기는 화학적 변형, 예를 들어 중합체에의 공유 결합에 의해 연장될 수 있다.
당업계에 또한 공지된 바와 같이, 신생아 Fc 수용체, FcRn에 대한 항체의 결합 활성은 항체의 다양한 영역 (Fc 영역을 포함)에서의 아미노산 치환에 의해 감소될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 언급된 혈액 반감기와 관련하여, 본 개시내용의 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교하여 유의하게 감소된 "신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 활성"을 나타내지 않는다. 당업계에 공지된 바와 같이, 항체는 투여 시 음세포작용에 의해 일정한 속도로 혈관 내피 세포 등에 비특이적으로 흡수된다. 항체는 낮은 pH (약 pH 6.0)에서 엔도솜 내 FcRn에 결합하고 FcRn을 통해 세포 외부로 수송되므로 리소좀 전좌 및 항체 분해를 피할 수 있다. 따라서 FcRn에 대한 항체의 결합은 혈액 내 항체의 긴 반감기에 기여한다. FcRn에 대한 폴리펩티드의 결합 활성은 공지된 방법, 예를 들어, 생체층 간섭 측정 방법 (예를 들어, 본원의 실시예 7에 기재된 방법 참조)에 의해 측정될 수 있다.
항체 및 이의 기능적 단편
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, 기능적 단편)일 수 있다. "항체"는 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하고, 일반적으로 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 분자 (면역글로불린)이다. "항체"는 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이의 기능적 단편, 또는 이의 변형제 중 어느 하나일 수 있다. 항체는 인간, 시노몰구스 원숭이, 랫트, 마우스, 낙타, 라마, 상어, 토끼 등을 포함하는 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이로부터 유래된다. 한 구현예에서, 항체는 인간으로부터 유래된다. 한 구현예에서, 항체가 비-인간 종으로부터 유래된 경우, 항체는 널리 공지된 기술을 사용하여 키메라화되거나 인간화된다. 한 구현예에서, 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 한 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 단편이 상기 언급된 특정 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 "항체의 기능적 단편"일 수 있다. "항체의 항원-결합 단편"으로도 지칭되는 "항체의 기능적 단편"은 항원-결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하며, 선형 항체 단편 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870 참조) 및 다중특이적 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항원-결합 단편은 전장 항체 분자를 적절한 효소로 처리하여 생성된 단편뿐만 아니라 유전자 조작된 항체 유전자를 사용하여 적절한 숙주에서 생산된 단백질 (즉, 재조합 단백질)을 포함한다. 기능적 단편은 또한 예를 들어, 아스파라긴 (Asn297)을 포함하는 항원-결합 단편을 포함하며, 이는 IgG 중쇄의 Fc 영역에 잘 보존된 N-연결된 당 사슬, 뿐만 아니라 인접 아미노산으로 변형을 겪는다.
한 구현예에서, 폴리펩티드는 "이중특이적 항체" 또는 "다중특이적 항체"일 수 있다. 다중특이적 항체는 복수의 항원-결합 도메인을 포함하는 항체일 수 있으며, 여기서 각각의 항원-결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다. 이중특이적 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 항원-결합 도메인은 상이한 항원에 결합하는 항체이다. 두 경우 모두, 아미노산 치환은 항체 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 다에 포함될 수 있고, 둘 다에 포함되는 경우에는, 동일한 또는 상이한 아미노산 치환이 포함될 수 있다. 대안적으로, 다중특이적 항체는 서로 상이한 항원-결합 도메인을 갖는 복수의 항체가 결합된 인공 단백질일 수 있고, 이중특이적 항체는 상이한 항원-결합 도메인을 갖는 2개의 항체가 서로 결합된 인공 단백질일 수 있다. 이러한 경우, 아미노산 치환은 복수의 항체의 적어도 하나의 항체의 Fc 영역 내 2개의 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 다에 포함될 수 있고, 둘 다에 포함되는 경우에는, 동일한 또는 상이한 아미노산 치환이 포함될 수 있다. 2개의 CH2 도메인에 상이한 아미노산 치환을 도입하는 것은 2개의 상이한 중쇄 (이종이량체)로부터 항체 분자를 생산할 수 있는 기술, 예를 들어 "노브-인투-홀" 기술 (국제 공개 번호 WO 1998/050431), "정전기 스티어링" (J Biol Chem, 285:19637-46 (2010)), 가닥 교환 조작 도메인 (SEED) 기술 (Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010)), 또는 국제 공개 번호 WO 2012/058768 및 WO 2013/063702에 설명된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 또한 전장 항체 또는 이의 단편으로서 생성될 수 있다 (예를 들어, 국제 공개 번호 WO 96/16673, 및 미국 특허 번호 5,837,234 참조). 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려졌으며 예를 들어, 두 사슬이 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 공동 발현하는 방법 (예를 들어, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983) 참조); 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생산하는 기술 (Brennan et al., Science, 229:81 (1985) 참조), 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 방법을 포함한다.
한 구현예에서, 항체는 "키메라 항체"일 수 있다. "키메라 항체"는 하나의 항체로부터 유래된 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터 유래된 하나 이상의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 예를 들어, Fc 서열은 인간 항체로부터 유래될 수 있고 가변 영역 서열은 시노몰구스 원숭이와 같은 비인간 종 항체로부터 유래될 수 있다.
한 구현예에서, 항체는 "인간 항체"일 수 있다. "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 한 구현예에서, 항체의 모든 가변 및 불변 도메인은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다 ("완전 인간 항체"로 지칭됨). 이들 항체는 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 유전자로부터 유래된 항체를 발현하도록 유전적으로 변형된 비인간 동물의 면역화와 같은 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
한 구현예에서, 항체는 "인간화 항체"일 수 있다. "인간화 항체"는 비인간 종에서 생산된 항체의 항원-결합 부위 (예를 들어 하나 이상의 CDR)를 인간 항체의 서열에 삽입하여 생산된 항체이다. 인간화 항체는 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 등을 갖는 비인간 동물의 초가변 영역의 잔기로 대체되거나 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 대체된 인간 면역글로불린을 포함한다. 인간 대상체에 투여될 때, 인간화 항체는 비인간 종의 항체에 비해 면역 반응을 유도하거나 덜 심각한 면역 반응을 유도할 가능성이 작다.
한 구현예에서, 항체는 "단일 사슬 항체"일 수 있다. "단일 사슬 항체"는 원래 이중 가닥으로 되어 있던 중쇄가 링커로 연결되어 단일 사슬을 형성한 항체를 지칭한다 (예를 들어, Biomaterials, 117:24-31 (2017) 참조). 따라서, 단일 사슬 항체는 또한 2개의 CH 도메인을 포함하고, 상기 기술된 특정 아미노산 치환은 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다.
일반적으로, 항체는 당해 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 사용하여 항원 역할을 하는 폴리펩티드로 동물을 면역화시키고 생체 내에서 생성된 항체를 수집 및 정제함으로써 획득될 수 있다. 항원의 기원은 인간에 제한되지 않으며, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 랫트와 같은 비인간 동물 유래의 항원을 사용하여 동물을 면역화시켜 항체를 생성할 수도 있다. 항원은 다양한 항원, 예를 들어, 사이토카인, 가용성 또는 불용성 인자, 병원체에서 발현되는 분자, 세포에서 발현되는 분자, 또는 암세포에서 발현되는 분자 중 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 암 항원이다. 단일클론 항체는 예를 들어, 공지된 방법을 사용하여 골수종 세포를 항체 생산 세포와 융합함으로써 획득될 수 있다 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975), Kennett, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980) 참조). 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다. 인간 질환에 적용할 수 있는 항체는 인간 항원과 획득한 이종 항원에 결합하는 항체의 교차 시험을 통해 선택할 수도 있다.
배양된 포유동물 세포에서 생산된 항체에서, 중쇄 카르복실기 말단의 라이신 잔기가 결실되어 있는 것으로 알려졌다 (Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995)), 중쇄 카르복실 말단의 글리신 및 라이신의 두 아미노산 잔기가 또한 결실되고, 카르복실 말단에 위치한 프롤린 잔기가 새로 아미드화된다 (Analytical Biochemistry, 360:75-83 (2007)). 그러나, 이들 중쇄 서열의 결실 또는 변형은 항원에 결합하는 항체의 능력 또는 항체의 효과기 기능 (예를 들어 보체 활성화 및 항체-의존성 세포독성)에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 개시내용에 따른 항체는 또한 중쇄 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실된 결실을 갖는 항체, 및 결실 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄, 및 카르복실 말단에 라이신 잔기가 결여된 중쇄)을 갖는 아미드화된 항체 등을 포함하여, 그러한 결실 또는 변형을 겪은 항체 및 그러한 항체의 기능적 단편을 포함한다. 그러나, 항원-결합 능력 및 감소된 효과기 기능이 유지되는 한, 항체 중쇄의 카르복실 말단에서의 결실은 상기 예에 제한되지 않는다. 항체를 구성하는 2개의 중쇄는 전장 항체, 상기 기재된 바와 같은 결실을 갖는 항체, 또는 둘 모두의 조합으로부터의 중쇄 중 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 각 결실의 비율은 항체를 생산하는 배양된 포유동물 세포의 유형 및 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있지만, 한 구현예에서 항체는 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 2개의 중쇄 모두에서 결실된 항체이다.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 항체인 경우, 항체는 종양 세포 또는 면역 세포를 표적화하는 항체이다. 한 구현예에서, 항체는 종양 세포를 표적화하는 항체이다. 한 구현예에서, 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 한 구현예에서, 폴리펩티드가 종양 세포를 표적화는 항체인 경우, 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 갖는다: 종양 세포를 인식할 수 있고, 종양 세포에 결합할 수 있고, 종양 세포에 통합되고 내재화되고/되거나 종양 세포를 손상시킨다.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 종양 세포를 표적화하는 항체인 경우, 항체는 예를 들어, 항-HER2 항체, 항-HER3 항체, 항-DLL3 항체, 항-FAP 항체, 항-CDH11 항체, 항-CDH6 항체, 항-A33 항체, 항-CanAg 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD30 항체, 항-CD33 항체, 항-CD56 항체, 항-CD70 항체, 항-CD98 항체, 항-LPS 항체, 항-TROP2 항체, 항-CEA 항체, 항-크립토 항체, 항-EphA2 항체, 항-G250 항체, 항-MUC1 항체, 항-GPNMB 항체, 항-인테그린 항체, 항-PSMA 항체, 항-테나신-C 항체, 항-SLC44A4 항체, 항-메소텔린 항체, 항-ENPP3 항체, 항-CD47 항체, 항-EGFR 항체 또는 항-DR5 항체일 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 종양 세포를 표적화는 항체인 경우, 항체는 항-CD70 항체, 항-LPS 항체 또는 항-EGFR 항체일 수 있다. 이러한 항체는 공지된 방법에 의해 제조되었다 (예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Nature 3211:522-525 (1986), 및 국제 공개 번호 WO 90/07861 참조). 또한 항-CD70 항체 (국제 공개 번호 WO 2004/073656 및 WO 2007/038637), 항-LPS 항체 (국제 공개 번호 WO 2015/046505 및 WO 2019/065964), 및 항-EGFR 항체 (국제 공개 번호 WO 1998/050433 및 WO 2002/092771)에 대해 참조.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 종양 세포를 표적화하는 항체인 경우, 항체는 파니투무맙, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 벨리무맙, 블리나투모맙, 글렌바투무맙, 이브리투모맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 데노수맙, 피딜리주맙, 모가물리주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 디누툭시맙, 더발루맙, 엘로투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 타볼릭시주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레멜리무맙, 바릴루맙, 보르세투주맙, 또는 O11-1111일 수 있다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 종양 세포를 표적화하는 항체인 경우, 항체는 파니투무맙, 보르세투주맙, 또는 O11-1111일 수 있다.
한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 종양 세포를 표적화하는 항체일 수 있고 추가로 예를 들어, 염증성 질환, 면역 질환, 감염성 질환 등의 치료, 또는 재생 의학 등에 사용될 수 있다.
또한, 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 예를 들어, 1가 항체, 가닥 교환 조작 도메인 (SEED), 트리오맙, 이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig), 미니항체, 이중 친화도 재표적화 분자 (Fc-DART 또는 Ig-DART), LUZ-Y 항체, 바이클론 항체, 이중 표적화 (DT)-Ig 항체, 투-인-원 항체, 가교결합된 Mab, mAb２, CovX-바디, Ts2Ab, BsAb, HERCULES 항체, TvAb, 또는 SCORPION일 수 있다.
융합 단백질
본 개시내용의 특정 구현예는 변이체 Fc 영역 또는 폴리펩티드를 포함하는 "융합 단백질" 또는 또 다른 단백질 또는 폴리펩티드 ("이종" 단백질 또는 폴리펩티드)에 융합된 변이체 Fc 영역을 포함하는 항체 모이어티에 관한 것이다. 다양한 이종 단백질 또는 폴리펩티드는 변이체 Fc 영역, 폴리펩티드 또는 항체 모이어티에 융합되어 재조합 기술을 사용하여 융합 단백질을 생산할 수 있다. 예시는 수용체 또는 이의 표적-결합 영역, 부착 분자, 리간드, 효소, 사이토카인, 면역사이토카인, 비-면역글로불린 단백질, 케모카인, 다양한 단백질 도메인 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다른 관심 단백질에는 융합 단백질을 치료 표적으로 유도하는 치료제가 포함되며, 이러한 표적은 표적에 결합하는 수용체 단백질과 같은 질환과 관련된 분자일 수 있다. 표적에 결합하는 수용체 단백질을 포함하는 융합 단백질의 예는 VEGFR-Fc 융합체, TNFR-Fc 융합체, CTLA4-Fc 융합체 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 융합 단백질은 또한 scFv의 아미노- 또는 카르복시-말단에 Fc 영역을 융합함으로써 구성될 수 있는 scFv를 포함할 수 있다 (예를 들어, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 1995, Oxford University Press 참조). "융합 단백질"은 상기 언급된 "본 개시내용에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자"의 한 구현예인 것으로 이해된다.
폴리펩티드-약물 접합체
본 개시내용의 특정 구현예는 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 하나 이상의 약물 또는 변형제에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드-약물 접합체는 변형된 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 화학요법제, 세포독성제, 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체와 같은 다양한 비단백질성 중합체에 접합될 수 있다. 폴리펩티드가 약물 및 중합체 (변형제) 둘 다에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체가 특정 구현예에서 포함된다.
폴리펩티드-약물 접합체는 링커를 통해 폴리펩티드를 약물 또는 변형제에 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 링커는 전형적으로 항체 상의 표적 그룹 또는 그룹들과 반응할 수 있는 작용기 및 약물 또는 변형제 상의 표적 그룹과 반응할 수 있는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 적합한 작용기 및 링커는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어, Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press) 및 Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology (Ducry (Ed.), 2013, Springer)에 설명된 것들을 포함한다.
약학 조성물
특정 구현예에서 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 분자, 또는 폴리펩티드-약물 접합체는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로 제공될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 부형제, 불활성 희석제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 습윤제, 착색제, 방부제, 수성 비히클 및 용매, 유성 비히클 및 용매, 계면활성제, 분산제, 감미제, 향수, 유화제, 윤활제, 완충제, 증점제, 충전제, 항산화제, 안정제 등을 포함한다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (이전에 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"), Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)에 기재되어 있다.
한 구현예에서, 상기 기술된 약학 조성물은 하나 이상의 다른 "치료제"를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 다른 "치료제"와 조합하여 사용 또는 투여될 수 있다. 예를 들어, 암 치료 목적으로 사용되는 경우, 암 치료를 위한 다른 치료제의 예는 아브락산, 카보플라틴, 시스플라틴, 젬시타빈, 이리노테칸 (CPT-11), 파클리탁셀, 페메트렉시드, 소라페닙, 빈블라스틴 또는 국제 공개 번호 WO 2003/038043에 기술된 약물, 뿐만 아니라 LH-RH 유사체 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴 인산염, 에스트로겐 길항제 (타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타제 억제제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 등), 면역관문억제제 (니볼루맙, 이필리무맙 등), 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약학 조성물의 투여 경로는 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 또는 피하 경로를 통한 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 치료제와 조합되는 경우, 약학 조성물 및 하나 이상의 다른 치료제는 동시에 또는 다른 시점에, 단일 조성물로서 또는 별도로 사용되거나 투여될 수 있다.
사용 방법
특정 구현예에서, 폴리펩티드, 이를 포함하는 분자, 또는 폴리펩티드-약물 접합체는 인간 치료 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 폴리펩티드, 이를 포함하는 분자, 또는 폴리펩티드-약물 접합체는 암 또는 종양, 면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리펩티드, 이를 포함하는 분자, 또는 폴리펩티드-약물 접합체는 인간의 진단 방법에 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리펩티드, 이를 포함하는 분자, 또는 폴리펩티드-약물 접합체는 인간의 종양 또는 암 치료에 사용될 수 있다. 종양 질환 및 암은 폐암, 신장암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 고환암, 자궁경부암, 태반 융모막암종, 다형성 교모세포종, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 위장관기질종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암종, 편평상피암 세포 암종, 백혈병, 악성 림프종, 골수종 또는 육종 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 아미노산 변형
상기 기술된 특정 아미노산 치환(들) (예를 들어, LALA-DG, LALA-DGPA, 및 LALA-DN 돌연변이) 외에도, 폴리펩티드는 Fc 영역에 추가적인 아미노산 변형(들)을 포함할 수 있다. 따라서, 유사하게, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드의 "변이체 Fc 영역"은 또한 상기 기술된 특정 아미노산 치환 (예를 들어, LALA-DG, LALA-DGPA, 및 LALA-DN)에 더하여 Fc 영역에서 추가적인 아미노산 변형(들)을 포함할 수 있다. 추가적인 아미노산 변형은 폴리펩티드의 Fc 영역뿐만 아니라 폴리펩티드의 하나 이상의 다른 영역에도 이루어질 수 있다.
"아미노산 변형"은 아미노산의 치환, 결실, 첨가, 삽입, 변형 등을 지칭하고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 아미노산 치환, 첨가, 결실, 및 삽입은 임의의 잘 알려진 PCR-기반 기술을 사용하여 이루어질 수 있으며, 아미노산 치환은 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 이루어질 수 있다 (예를 들어, Zoller and Smith, Nucl. Acids Res 10:6487-6500 (1982); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82:488 (1985) 참조). 아미노산의 "변형"의 예는 당 사슬의 첨가 또는 결실을 포함한다.
한 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 "보존적 아미노산 치환(들)"일 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 그룹을 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되고 일반적으로 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않음을 의미한다. 보존적 아미노산 치환의 예는 당업계에 잘 알려졌으며 예를 들어, 다음 중 하나 이상으로 표시되는 아미노산 부류 내에서 치환(들)을 함으로써 이루어질 수 있다: 산성 잔기: Asp, Glu; 염기성 잔기: Lys, Arg, His; 친수성 비하전 잔기: Ser, Thr, Asn, Gln; 지방족 비하전 잔기: Gly, Ala, Val, Leu, Ile; 비극성 비하전 잔기: Cys, Met, Pro, 및 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.
추가적인 아미노산 변형(들)은 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 약 20개 이하, 약 10개 이하, 또는 약 1 내지 약 5개 아미노산 변형일 수 있다. 추가적인 아미노산 변형(들)이 야생형 서열 (예를 들어, 야생형 Fc 영역의 서열)에 이루어질 때, 변이체 서열 (예를 들어, 변이체 Fc 영역)의 서열은 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 한 구현예에서, 변이체 서열 (예를 들어, 변이체 Fc 영역)의 서열은 상응하는 야생형 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일성을 갖는다. 폴리펩티드의 서열 유사성 또는 동일성은 공지된 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA)를 사용하여 측정할 수 있다.
추가적인 아미노산 변형의 예는 아미노산 치환, 예를 들어 G236A, G236P, G236L, G236K, G236R, G236T, G236H, G236N, G237R, P238I, S239M, S239K, S239R, S239T, S239H, S239H, S239Q, V266I, V266L, S267P, S267K, H268A, H268V, H268F, H268P, H268M, H268I, H268L, H268K, H268R, H268T, H268Y, H268Q, H268W, E269A, E269V, E269D, E269K, E269R, E269S, E269T 및 E269H (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)를 포함하고, 이는 국제 공개 번호 WO 2013/118858에 기술된 바와 같이 모 폴리펩티드에 비해 항체 Fc의 Tm을 증가시키는 것으로 나타났다.
한 구현예에서, Fcγ 수용체 결합 활성을 추가로 감소시키는 아미노산 치환이 사용될 수 있다. Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 감소시키는 추가적인 아미노산 치환의 예는, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2011/120134에 제시된 G237F/S239E/A327H, G237/A327/A330I, S239E/S267E/H268D (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)와 같은 아미노산 치환을 포함한다.
한 구현예에서, 추가적인 아미노산 변형은 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키는 치환, 산화에 대한 민감성을 감소시키는 치환, 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경시키는 치환, 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 치환, 탈아미드화 반응 등을 억제하는 변형 등을 포함한다.
제조 방법
본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 당업계에 공지된 재조합 단백질 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기 방법에 제한되지 않고, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 획득될 수 있다: 먼저 상기 기술된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 설계한 후, DNA를 화학적으로 합성하여 DNA를 벡터 등으로 삽입하고, 이어서 DNA/벡터를 숙주 세포에 도입하고, 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배지에서 배양하고, 배지 또는 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계. 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터는 예를 들어, 관련 돌연변이를 야생형 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로 도입함으로써, 예를 들어, 제조업체의 지침에 따라 KOD-Plus-Mutagenesis 키트 (Toyobo Co., Ltd., Osaka, 일본)를 사용하여 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 상기 기재된 것 이외의 다른 관심 아미노산 변형 (예를 들어, 첨가, 결실, 치환 등)을 포함하는 경우, 상기 기술된 변이체 Fc 영역에 대한 특정 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열 및 다른 관심 아미노산 변형(들)을 설계하고 상기 기재된 것과 동일한 방법에 의해 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 본 개시내용의 폴리펩티드는 재조합 방법 외에 펩티드 합성, 화학적 합성, 시험관 내 번역 등의 방법으로도 제조될 수도 있다.
따라서, 한 구현예에서, 본 개시내용은 상기 기술된 변이체 Fc 영역 또는 그의 일부, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 개시내용은 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 개시내용은 상기 기술된 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 개시내용은 예를 들어, 상기 변이체 Fc 영역을 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포를 변이체 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배지에서 배양하는 단계, 및 배지 또는 세포로부터 변이체 Fc 영역 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본원에 기술된 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
구현예
본 개시내용의 예시적인 비제한적인 구현예는 다음을 포함한다:
[1] 하나 이상의 변이체 IgG1 Fc 영역 또는 변이체 IgG4 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에 있는 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 변이체 CH2 도메인(들)이고, 여기서 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)의 아미노산 잔기가 각각, Ala, Ala, 및 Gly인 폴리펩티드.
[2] [1]에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 위치 329의 아미노산 잔기가 Ala인 폴리펩티드.
[3] 하나 이상의 변이체 IgG1 Fc 영역 또는 변이체 IgG4 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에 있는 CH2 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 변이체 CH2 도메인(들)이고, 여기서 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)의 아미노산 잔기가 각각, Ala, Ala, 및 Asn인 폴리펩티드.
[4] [1] 또는 [2]에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 돌연변이를 도입하기 전의 모 CH2보다 1℃ 이상 높은 폴리펩티드.
[5] [4]에 있어서, 상기 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 모 CH2보다 3℃ 이상 높은 폴리펩티드.
[6] [3]에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 돌연변이를 도입하기 전의 모 CH2의 값보다 1℃ 높지 않고 돌연변이를 도입하기 전의 모 CH2의 값보다 1℃ 낮지 않는 폴리펩티드.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 돌연변이를 도입하기 전의 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 감소된 폴리펩티드.
[8] [7]에 있어서, 상기 폴리펩티드 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도가 모 폴리펩티드와 비교하여 50% 이상 감소된 폴리펩티드.
[9] [7] 또는 [8]에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fcγ 수용체는 인간 Fcγ 수용체 및 시노몰구스 Fcγ 수용체로부터 선택되는 적어도 하나인 폴리펩티드.
[10] [9]에 있어서, 상기 Fcγ 수용체는 인간 Fcγ 수용체인 폴리펩티드.
[11] [7] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fcγ 수용체는 FcγRI인 폴리펩티드.
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 변이체 IgG1 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 이의 기능적 단편인 폴리펩티드.
[14] [13]에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편이 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드.
[15] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자.
[16] [15]에 있어서, 분자는 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드의 융합 단백질인 분자.
[17] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드가 약물에 접합된 폴리펩티드-약물 접합체.
[18] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
[19] [18]에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
[20] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, [15] 또는 [16]에 따른 분자, 또는 [17]에 따른 폴리펩티드-약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
[21] 치료에 사용하기 위한, [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, [15] 또는 [16]에 따른 분자, 또는 [17]에 따른 폴리펩티드-약물 접합체.
[22] 치료법이 암, 면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 포함하는, [21]에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드, 분자 또는 폴리펩티드-약물 접합체.
실시예
하기 실시예는 설명의 목적으로 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
비교 실시예 1:
인간 FcγRI에 대한 공지된 무효과기 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가.
인간 FcγRI (hFcγRI)에 대한 공지된 무효과기 돌연변이가 도입된, 항-EGFR 항체의 결합 활성을 Biacore™ T200 (Cytiva, Marlborough, MA)을 사용하여 평가하였다. 원래 인간 IgG2 항체인, 항-EGFR 항체 파니투무맙의 Fc 영역을 인간 IgG1의 것으로 대체하고 생성된 항체를 IgG1 WT라고 한다. IgG1 WT의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각, 서열 번호 13 및 14로 표시된다 (도 16a 및 16b 참조). IgG1 WT 및 다음 변이체가 평가되었다: L234A/L235A (LALA) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 통합하여 얻은 변이체; L234A/L235A/D265A (LALA-DA) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체; 및 L234A/L235A/P329G (LALA-PG, 국제 공개 번호 WO 2012/130831에 기재됨) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체. 언급된 돌연변이는 Fc 영역의 CH2 도메인 모두에 도입되었다. 이러한 항-EGFR 항체 ("항-EGFR 항체의 변이체"로도 지칭됨)는 다음 단계에 의해 획득되었다: 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계; 숙주 세포를 배지에서 배양하여 숙주 세포가 상기 세포에서 DNA를 발현하도록 하는 단계. 카르복실 말단에 6 x His 태그가 첨가된, 서열 번호 19의 위치 16의 Gln 잔기부터 위치 288의 Pro 잔기를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 RI/CD64 단백질, CF (R&D Systems, Minneapolis, MN, 수탁 #: P12314)로 이루어진 His-태그된 인간 FcγRI를 리간드로 사용하였다 (도 19a 참조). FcγRI 리간드는 항-His 항체가 고정된 센서 칩에 포획되었다. 이어서, 분석물로서 다양한 항-EGFR 항체를 센서 칩에 첨가하여 표면 플라즈마 공명 (SPR) 방법으로 리간드와 분석물 사이의 상호작용을 측정하였다.
간략하게, 항-6X His 태그 항체 [AD1.1.10] (Abcam plc, Cambridge, UK)를 제조사 지침에 따라 Sensor Chip CM5 (Cytiva, Marlborough, MA)에 고정시킨 다음, HBS-EP+ (GE Healthcare, Chicago, IL) 중 10 μg/mL로 제조한 재조합 인간 Fc 감마 RI/CD64 단백질 (R & D Systems)을 60초 동안 10 μL/분으로 센서 칩과 접촉시켜 포획했다. 그런 다음, HBS-EP+에 각각의 주어진 농도로 제조된 항-EGFR 항체를 120초 동안 30 μL/분의 유속으로 센서 칩에 첨가하였다. 도 2a는 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 결합 반응 (공명 단위, RU)의 그래프를 나타낸다. 하기 표 1은 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 1. 다양한 인간 Fcγ 수용체에 대한 변이체 및 IgG1 WT의 결합 활성
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 무효과기 돌연변이를 갖는 모든 변이체는 IgG1 WT보다 인간 FcγRI에 대한 결합을 나타내는 RU 값이 더 낮았다. 변이체의 RU 값은 LALA > LALA-PG > LALA-DA 순으로 나타났다.
비교 실시예 2: 다양한 인간 Fcγ
R에 대한
공지된 무효과기 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
Biacore™ T200을 비교 실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 인간 FcγRIIa, FcγRIIa (H167), FcγRIIb/c, FcγRIIIa, FcγRIIIa (V176F), 및 FcγRIIIb에 대한 결합 활성을 평가하기 위해 사용하였다. 인간 FcγR을 리간드로 센서 칩에 직접 고정시킨 후, 분석물로서 다양한 항-EGFR 항체를 센서 칩에 첨가하여 리간드와 분석물 사이의 상호작용을 SPR 방법으로 측정하였다. 다음 FcγR이 사용되었으며, 각각은 카르복실 말단에서 10 x His 태그 또는 6 x His 태그를 포함하고, 모두 R & D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입했다: 재조합 인간 Fc 감마 RIIA/CD32a (R167) 단백질 (수탁 #: AAA35827, 서열 번호 20의 위치 36의 Ala 잔기부터 위치 218의 Ile 잔기를 포함 (도 19b 참조), a10 x His 태그 포함), 재조합 인간 Fc 감마 RIIA/CD32a (H167) 단백질 (수탁 #: P12318-1(P12318.4), 서열 번호 21의 위치 34의 Ala 잔기부터 위치 218의 Ile 잔기 포함 (도 19c 참조) 10 x His 태그 포함), 재조합 인간 Fc 감마 RIIB/C (CD32b/c) 단백질 (수탁 #: P31994, 서열 번호 22의 위치 46의 Ala 잔기부터 위치 217의 Pro 잔기 포함 (도 19d 참조) 10 x His 태그 포함), 재조합 인간 Fc 감마 RIIIA/CD16a 단백질 (수탁 #: AAH17865, 서열 번호 23의 위치 17의 Gly 잔기부터 위치 208의 Gln 잔기 포함 (도 19e 참조) 6 x His 태그 포함), 재조합 인간 Fc 감마 RIIIA/CD16a (V176F) 단백질 (수탁 #: P08637, 서열 번호 31의 위치 17의 Gly 잔기부터 위치 208의 Gln 잔기 포함 (도 23 참조) 6 x His 태그 포함), 및 재조합 인간 Fc 감마 RIIIB/CD16b 단백질 (수탁 #: O75015, 서열 번호 24의 위치 20의 Thr 잔기부터 위치 208의 Gln 잔기 포함 (도 19f 참조) 10 x His 태그 포함).
간략하게, 각각의 인간 FcγR을 제조사 지침에 따라 Sensor Chip CM5에 고정시켰다. 후속적으로, HBS-EP+에서 각각의 주어진 농도로 제조된 항-EGFR 항체를 120초 동안 30 μL/분의 유속으로 센서 칩에 첨가하였다. 도 2b 내지 2e는 RU 값이 인간 FcγRIIa, FcγRIIb/c, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb가 리간드로 사용될 때 각각의 항체 농도 (0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 표 1은 4.7 μM의 항체 농도에 얻은 다양한 인간 FcγR에 대한 RU 값을 나타낸다.
표 1에서 볼 수 있듯이, 무효과기 돌연변이를 갖는 모든 변이체는 IgG1 WT보다 각각의 인간 FcγR에 대한 결합을 나타내는 RU 값이 더 낮았다. 변이체의 RU 값은 LALA> LALA-PG 순이었고, LALA-DA는 LALA-PG와 실질적으로 동일하였다.
비교 실시예 3:
시노몰구스 FcγRI에 대한 공지된 무효과기 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
비교 실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 시노몰구스 FcγRI (cFcγRI)에 대한 결합 활성을 비교 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 시노몰구스 Fc 감마 RI/CD64 단백질 (수탁 #: NP_001270969, 카르복실 말단에 6 x His 태그가 첨가된, 서열 번호 25의 위치 11의 Val 잔기부터 위치 288의 Pro 잔기 포함 (도 20a 참조): R & D Systems, Minneapolis, MN)을 시노몰구스 FcγR로서 사용하였다. 도 3a는 RU 값이 각각의 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 하기 표 2는 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 2. 다양한 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 변이체 및 IgG1 WT의 결합 활성
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 무효과기 돌연변이를 갖는 모든 변이체는 IgG1 WT보다 시노몰구스 FcγRI에 대한 결합을 나타내는, RU 값이 낮았다. 변이체의 RU 값은 LALA> LALA-PG> LALA-DA 순이었다.
비교 실시예 4:
다양한 시노몰구스 FcγR에 대한 공지된 무효과기 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
비교 실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 시노몰구스 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 결합 활성을 비교 실시예 2와 동일한 방식으로 평가하였다. 다음 시노몰구스 FcγR을 각각은 카르복실 말단에 6 x His 태그, 및 모두 R & D Systems (Minneapolis, MN)으로 입수한 것을 포함하여 사용하였다: 재조합 시노몰구스 Fc 감마 RIIA/CD32a 단백질 (수탁 #: NP_001270598, 서열 번호 26의 위치 29의 Thr 잔기부터 위치 211의 Ile 잔기까지 포함 (도 20 b 참조), 재조합 시노몰구스 Fc 감마 RIIB 단백질 (수탁 #: NP_001271060, 서열 번호 27의 위치 46의 Ala 잔기부터 위치 217의 Pro 잔기까지 포함 (도 20c 참조), 및 재조합 시노몰구스 Fc 감마 RIII/CD16 단백질 (수탁 #: NP_001270121, 서열 번호 28의 위치 17의 Gly 잔기부터 위치 208의 Gln 잔기까지 포함 (도 20d 참조). 상기 표 2는 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 무효과기 돌연변이를 갖는 모든 변이체는 IgG1 WT보다 각각의 시노몰구스 FcγR에 대한 결합을 나타내는 RU 값이 더 낮다. 변이체의 RU 값은 LALA> LALA-PG> LALA-DA 순이었다.
비교 실시예 5: 공지된 무효과기 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 열 안정성의 평가
비교 실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 열 안정성을 MicroCal VP-Capillary DSC 시스템 (Malvern Panalytical Ltd., Malvern, UK)을 사용하여 평가하였다. 각각의 항-EGFR 항체는 25 mM 히스티딘 및 5% w/v 소르비톨 (pH 6.0)에 항체 농도 0.5 mg/mL로 제조되었고, 열 용량 Cp (kcal/mol/℃) 변화는 온도를 60℃/hr의 가열 속도로 20℃에서 120℃로 상승시키면서 조사하였다. 열 용량 변화를 나타내는 곡선의 피크는 항체의 각 도메인의 열적 변성을 나타내며, 열 변성의 피크는 일반적으로 CH2 도메인, Fab, 및 CH3 도메인 순으로 관찰된다 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 355:751-757 (2007)). 도 4a 내지 4d는 IgG1 WT 및 이의 LALA, LALA-DA, 및 LALA-PG 변이체에 대한 열 용량 및 최고 온도 (T m )의 변화를 나타낸다. 관찰된 2개의 피크 중, 더 낮은 온도의 피크는 CH2 도메인의 열 변성을 나타낸다. 더 높은 온도에서의 피크는 Fab 영역 및 CH3 도메인의 피크가 겹치는 것을 나타내는 것으로 간주된다. 하기 표 3은 각각의 시험 항체에 대한 CH2 도메인의 T m 값 및 각각의 변이체와 IgG1 WT 사이 T m 값 차이 (ΔT m )를 나타낸다.
표 3. 변이체 및 IgG1 WT의 CH2 도메인의
T
m
및 변이체와 IgG1 WT 사이
T
m
차이 (ΔTm)
표 3에서 볼 수 있듯이, LALA 변이체의 T m 값은 IgG1 WT보다 0.6℃ 높은 반면, LALA-DA 변이체 및 LALA-PG 변이체의 T m 값은 IgG1 WT보다 각각, 1.9℃ 및 1.0℃ 더 낮았다.
실시예 1: 인간 FcγRI에 대한 L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
인간 FcγRI에 대한 L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성을 비교 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 원래 인간 IgG2 항체인, 항-EGFR 항체 파니투무맙의 Fc 영역을 인간 IgG1 (IgG1 WT)의 것으로 대체하였다. 평가에 사용된 변이체는 IgG1 WT의 LALA-DA 변이체; L234A/L235A/D265G (LALA-DG) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체; L234A/L235A/D265N (LALA-DN) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체; L234A/L235A/D265Q (LALA-DQ) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체; 및 L234A/L235A/D265T (LALA-DT) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역에 도입하여 얻은 변이체였다. 언급된 돌연변이는 Fc 영역의 CH2 도메인 모두에 도입되었다. 도 5는 RU 값이 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 하기 표 4는 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 4. 다양한 인간 Fcγ 수용체에 대한 변이체 및 IgG1 WT의 결합 활성
표 4에 나타낸 바와 같이, 인간 FcγRI에 대한 결합 활성에 대해, 항체 농도 4.7 μM에서 얻은 LALA-DG 변이체 및 LALA-DN 변이체의 RU 값은 LALA-DA 변이체의 RU 값의 각각, 약 1/10 및 약 1/4이었다. LALA-DQ 변이체의 RU 값은 약 LALA-DA 변이체의 RU 값의 약 2배였다.
실시예 2: 다양한 인간 FcγR에 대한 L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 인간 FcγRIIa, FcγRIIa (H167), FcγRIIb/c, FcγRIIIa, FcγRIIIa (V176F), 및 FcγRIIIb에 대한 결합 활성을 비교 실시예 2와 동일한 방식으로 평가하였다. 상기 표 4는 항체 농도 4.7 μM에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 4에서 볼 수 있듯이, 항체 농도 4.7 μM에서 얻은 인간 FcγR에 대한 RU 값은 인간 FcγRIIa (H167)를 제외하고 동일한 각각의 변이체에서 거의 동일하였다. 인간 FcγRIIa (H167)에 대한 LALA-DG 변이체의 RU 값은 다른 변이체의 RU 값의 절반 이하였다.
실시예 3: 시노몰구스 FcγRI에 대한 L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 시노몰구스 FcγRI에 대한 결합 활성을 비교 실시예 3과 동일한 방식으로 평가하였다. 도 6은 RU 값이 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 하기 표 5는 항체 농도 4.7 μM에 대한 RU 값을 나타낸다.
표 5. 다양한 시노몰구스 Fcγ 수용체에 대한 변이체 및 IgG1 WT의 결합 활성
표 5에서 볼 수 있듯이, 항체 농도 4.7 μM에서 얻은 LALA-DG 변이체의 RU 값은 LALA-DA 변이체의 RU 값의 약 1/10이었고, LALA-DN 변이체의 RU 값은 LALA-DA 변이체의 RU 값의 약 1/4이었다. 반면, LALA-DQ 및 LALA-DT 변이체의 RU 값은 LALA-DA 변이체의 RU 값의 1.4배 이상이었다.
실시예 4: 다양한 시노몰구스 FcγR에 대한 L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체의 시노몰구스 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 결합 활성을 비교 실시예 4와 동일한 방식으로 평가하였다. 상기 표 5는 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 5에서 볼 수 있듯이, 항체 농도 4.7 μM에서 얻은 시노몰구스 FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcγRIII에 대한 RU 값은 각각의 변이체에 대해 거의 동일하였다.
실시예 5: L234A/L235A 및 D265 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 열 안정성의 평가
실시예 1에 기술된 항-EGFR 항체 파니투무맙 및 변이체의 IgG1 WT의 각각의 CH2 도메인의 열 안정성을 비교 실시예 5와 동일한 방식으로 평가하였다. 도 7a 내지 7d는 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체, LALA-DN 변이체, LALA-DQ 변이체, 및 LALA-DT 변이체의 CH2 도메인에 대한 열 용량 및 T m 값의 변화를 나타낸다. 하기 표 6은 각각의 시험 항체에 대한 CH2 도메인의 T m 값 및 각각의 변이체와 IgG1 WT 사이 T m 값 차이 (ΔT m )를 나타낸다.
표 6. 변이체 및 IgG1 WT의 CH2 도메인의
T
m
및 변이체와 IgG1 WT 사이
T
m
차이 (ΔT
m
)
표 6에 나타낸 바와 같이, LALA-DA 변이체와 유사한 LALA-DQ 변이체 및 LALA-DT 변이체에 대한 T m 값은 IgG1 WT보다 약 2℃ 더 낮았다. LALA-DG 변이체의 T m 값은 IgG1 WT보다 4.5℃ 더 높았고, LALA-DN 변이체의 T m 값은 IgG1 WT보다 0.3℃ 더 높았다.
실시예 6: 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체의 항원-결합 활성의 평가
Biacore™ T200을 사용하여 IgG1 WT 및 항-EGFR 항체 파니투무맙의 LALA 및 LALA-DG 변이체의 EGFR-결합 활성을 평가하였다. 리간드로서 항-EGFR 항체를 항-인간 IgG Fc 항체가 고정화되고, EGFR을 분석물로 흘려보내는 센서 칩에서 포획하였다. 리간드와 분석물 사이의 상호작용은 SPR 방법으로 측정되었다.
간략하게, 인간 항체 캡처 키트 (Cytiva, Marlborough, MA)에 함유된 항-인간 IgG Fc 항체를 제조사 지침에 따라 센서 칩 CM5에 고정화시킨 후, 각각의 HBS-EP+ 중 2 μg/mL로 제조한 항-EGFR 항체를 30초 동안 10 μL/분의 유속으로 센서 칩과 접촉시켜 포획하였다. 후속적으로, 농도 HBS-EP+ 중 12, 37, 110, 330, 1000 pM의 농도로 제조된 인간 EGFR 단백질 (ACROBiosystems, Newark, DE)을 120초 동안 30 μL/분의 유속으로 센서 칩에 첨가한 후, 1500초 동안 해리시켰다. EGFR에 대한 각각의 항체의 해리 상수 K D는 단일 주기 동역학 분석에 의해 생성된 센서그램으로부터 계산되었다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
표 7. EGFR 항원에 대한 항-EGFR 항체의 해리 상수
K
D
표 7에서 볼 수 있듯이, EGFR에 대한 항체 K D 값은 IgG1 WT, LALA 변이체, 및 LALA-DG 변이체에 대해 각각, 27, 24, 및 26 nM으로 돌연변이의 유무 및 이의 유형에 관계없이 거의 동일하였다.
실시예 7: 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체 및 LALA-DGPA 변이체의 결합 활성의 평가
Octet® RED384 시스템 (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA)을 실시예 6에 기술된 항-EGFR 항체의 인간 FcRn (인간 신생아 수용체 거대 서브유닛 p51/수탁 #: P55899/서열 번호 29/도 21) 및 베타2-마이크로글로불린 (수탁 #: NP_004039.1/서열 번호 30/도 22)에 대한 결합 활성을 평가하기 위해 사용하였다. 생체층 간섭측정법을 사용하여 비오티닐화 FcRn이 포획된, 스트렙타비딘 바이오센서 (Molecular Devices, LLC)와 항-EGFR 항체 용액을 접촉시킬 때, 항체와 FcRn 사이 결합 반응, 및 항체를 함유하지 않은 다른 용액에 바이오센서를 옮긴 후 항체와 FcRn 사이 해리 반응을 측정하였다. 결합 및 해리 반응은 모두 pH 6.0에서의 완충액에서 수행되었고, 결합 및 해리 반응의 생성된 센서그램으로부터 pH 6.0에서의 해리 상수 K D를 계산하였다. 또한, 결합 반응은 pH 6.0에서의 완충액에서 수행되었고, 해리 반응은 pH 7.4에서의 완충액에서 수행되었다. pH 7.4에서의 해리 속도 상수 k d를 해리 반응의 생성된 센서그램으로부터 계산하였다. 하기 표 8은 항-EGFR 항체에 대한 계산된 K D 및 k d 값을 나타낸다. 항-EGFR 항체 용액의 농도는 3개 지점, 즉 1.7, 6.9 및 28 nM으로 설정되었다. pH 6.0 또는 7.4에서 20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 및 0.05% 계면활성제 P20의 용액을 완충액으로 사용했다.
표 8. 인간 FcRn에 대한 항-EGFR 항체의 해리 상수
K
D
및 해리 속도 상수
k
d
표 8에서 볼 수 있듯이, IgG1 WT, LALA 변이체, LALA-DG 변이체, 및 LALA-DGPA 변이체 모두 pH 6.0에서의 K D 값이 5-6 nM이었다. 또한, pH 7.4에서의 k d 값은 각각 즉, IgG1 WT에 대해 2.1 (1/s), 및 변이체에 대해 2.8, 2.2, 2.3 (1/s)이었다.
실시예 8: 마우스에서 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체의 약동학적 검사
실시예 6에 기술된 항-EGFR 항체에 대한 약동학적 검사를 마우스에서 수행하였다. 각각의 항-EGFR 항체를 3 mg/kg으로 마우스에 정맥 투여한 후, 1, 6, 24, 72, 168, 336 및 360시간 후에 헤파린 처리된 헤마토크릿 튜브를 이용하여 이소플루란 마취 하에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고, 이어서 4℃ 및 15000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 혈장을 제공한다. 생성된 혈장 중 항-EGFR 항체의 양은 완전 자동 면역분석 플랫폼 Gyrolab™ xP 워크스테이션 (Gyros Protein Technologies AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 측정되었다. 항-EGFR 항체의 포획을 위해 비오틴 표지된 항-인간 IgG 염소 항체 (SouthernBiotech, Birmingham, AL)를 사용하고, 검출을 위해 Alexa Fluor 647-표지된 항-인간 IgG 염소 항체 (SouthernBiotech)를 사용했다. 도 8은 투여 후 시간에 대한 항-EGFR 항체의 혈중 농도를 그래프로 나타낸다.
도 8에서 볼 수 있듯이, 마우스의 항-EGFR 항체의 IgG1 WT, LALA 및 LALA-DG 변이체의 시간 경과에 따른 혈중 농도 변화에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 9: 인간 FcγRI에 대한 L234A/L235A/D265G/P329A 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
인간 FcγRI에 대한 항-EGFR 항체 파니투무맙의 LALA-DG 변이체 및 L234A/L235A/D265G/P329A (LALA-DGPA) 돌연변이를 IgG1 WT의 Fc 영역으로 도입하여 얻은 변이체의 결합 활성을 비교 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 도 9a는 RU 값이 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체 (실시예 1 참조) 및 LALA-DGPA 변이체에 대해 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다.
도 9a에서 볼 수 있듯이, LALA-DGPA 변이체는 LALA-DG 변이체보다 인간 FcγRI에 대해 더 낮은 RU 값을 나타냈다.
실시예 10: 시노몰구스 FcγRI에 대한 L234A/L235A/D265G/P329A 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 결합 활성의 평가
실시예 9에 기술된 항-EGFR 항체의 시노몰구스 FcγRI에 대한 결합 활성을 비교 실시예 3과 동일한 방식으로 평가하였다. 도 9b는 RU 값이 항-EGFR 항체의 LALA-DG 변이체 (실시예 1 참조) 및 LALA-DGPA 변이체에 대해 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다.
도 9b에서 볼 수 있듯이, 시노몰구스 FcγRI에 대한 LALA-DGPA 변이체의 RU 값은 LALA-DG 변이체의 RU 값보다 더 낮았다.
실시예 11: L234A/L235A/D265G/P329A 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체의 열 안정성의 평가
실시예 9에 기술된 항-EGFR 항체의 열 안정성을 비교 실시예 5와 동일한 방식으로 평가하였다. 하기 표 9는 항-EGFR 항체의 각각의 LALA-DG 변이체 및 LALA-DGPA 변이체의 CH2 도메인에 대한 T m 값을 나타낸다. LALA-DG 변이체의 CH2 도메인의 Tm 값은 표 6에서와 같다.
표 9. 항-EGFR 항체의 CH2 도메인의 T
m
값
표 9에 나타낸 바와 같이, LALA-DGPA 변이체의 CH2 도메인의 T m 값은 LALA-DG 변이체보다 1℃ 낮았다.
실시예 12: 다양한 인간 Fcγ 수용체에 대한 항-CD70 항체의 LALA-DG 변이체의 결합 활성의 평가
인간 FcγRI에 대한, IgG1 항체인 항-CD70 항체 보르세투주맙의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체의 결합 활성을 얻고 비교 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 보르세투주맙의 LALA 변이체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각, 서열 번호 15 및 16으로 나타낸다 (도 17a 및 17b 참조). 도 10a는 RU 값이 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 또한, 비교 실시예 2에 기술된 방법은 인간 FcγRIIa, FcγRIIb/c, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb에 대한 이들 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 사용되었다. 표 10은 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 RU 값을 나타낸다.
표 10． 다양한 인간 Fcγ 수용체에 대한 항-CD70 항체 및 항-LPS 항체의 LALA 및 LALA-DG 변이체의 결합 활성
4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 인간 FcγRI에 대한 LALA-DG 변이체의 RU 값은 LALA 변이체의 약 1/200이었다. 또한, 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 다른 인간 FcγR에 대한 LALA-DG 변이체의 RU 값은 LALA 변이체보다 낮았다.
실시예 13: 인간 Fcγ 수용체에 대한 항-LPS 항체의 LALA-DG 변이체의 결합 활성의 평가
IgG1 항체인, 항-LPS 항체 O11-1111의 LALA 변이체 및 LALA-DG 변이체의 인간 FcγRI에 대한 결합 활성을 획득하고 비교 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 011-1111 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각, 서열 번호 17 및 18로 표시된다 (도 18a 및 18b 참조). 도 10b는 RU 값이 각각의 시험된 항체 농도 (0.3, 0.4, 0.6, 0.9, 1.3, 2.0, 3.1, 및 4.7 μM)에 대해 플로팅된 그래프를 나타낸다. 또한, 비교 실시예 2에 기술된 방법은 인간 FcγRIIa, FcγRIIb/c, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb에 대한 이들 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 사용되었다. 상기 표 10은 항체 농도 4.7 μM에 대한 RU 값을 나타낸다.
표 10에서 볼 수 있듯이, 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 인간 FcγRI에 대한 LALA-DG 변이체의 RU 값은 LALA 변이체의 약 1/300이었다. 또한, 4.7 μM의 항체 농도에서 얻은 다른 인간 FcγR에 대한 LALA-DG 변이체의 RU 값은 LALA 변이체보다 낮았다.
실시예 14: LALA-DG 돌연변이를 갖는 다양한 항체의 열 안정성의 평가
다음 항체의 열 안정성을 비교 실시예 5와 동일한 방식으로 평가하였다. 평가된 항체는 항-LPS 항체, O11-1111의 모 항체 (IgG1 WT), 및 항-CD70 항체의 모 항체 (IgG1 WT), 각각의 이들 항체의 LALA 및 LALA-DG 변이체, 및 추가적으로 각각 임의의 Fab 영역이 결여된 상기 변이체로부터 유래된 항체이다. Fab가 결여된 LALA 변이체 및 Fab가 결여된 LALA-DG 변이체는 각각, 서열 번호 16의 222번째 내지 448번째 아미노산; 서열 번호 5의 104번째 내지 330번째 아미노산으로 이루어진다 (도 17b 및 12b 참조). 표 11은 각각의 시험된 항체의 CH2 도메인에 대한 T m 값을 나타낸다.
표 11. 다양한 항체의 CH2 도메인에 대한
T
m
값
표 11에 나타낸 바와 같이, 항-CD70 항체에 대하여, LALA-DG 변이체의 CH2 도메인에 대한 T m 값은 LALA 변이체보다 3.9℃ 더 높았다. 항-LPS 항체에 대하여, LALA-DG 변이체의 CH2 도메인에 대한 T m 값은 IgG1 WT보다 3.7℃ 더 높았고 LALA 변이체보다 3.3℃ 더 높았다. Fab이 결여된 Fc 영역에 대하여, LALA-DG 변이체의 CH2 도메인에 대한 T m 값은 LALA 변이체보다 3.6℃ 더 높았다.
Claims (32)
- 하나 이상의 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 각각의 변이체 Fc 영역은 2개의 CH2 도메인을 포함하며, 변이체 Fc 영역 중 적어도 하나에 있는 적어도 하나의 CH2 도메인은 위치 234, 235 및 265 (모두 EU 넘버링으로 표현되는 위치)에서 아미노산 치환을 포함하는 변이체 CH2 도메인이고, 상기 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265의 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Gly, 또는 각각, Ala, Ala, 및 Asn이고, 여기서 각각의 하나 이상의 변이체 Fc 영역은 변이체 IgG1 Fc 영역, 변이체 IgG4 Fc 영역 또는 변이체 IgG1/IgG4 Fc 영역인, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 위치 329에서 아미노산 치환을 추가로 포함하며, 상기 변이체 CH2 도메인의 위치 329에서 아미노산 잔기가 Ala인, 폴리펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 위치 234, 235 및 265에서 아미노산 치환이 없는 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대해 결합 친화도가 감소된, 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 중 하나 이상에 대해 결합이 감소된, 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII에 대해 결합이 감소된, 폴리펩티드.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII는 인간 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII인, 폴리펩티드.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII는 시노몰구스 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII인, 폴리펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 위치 234, 235, 및 265에서 아미노산 치환이 없는 모 CH2 도메인을 포함하는 모 폴리펩티드와 비교하여 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 결합 친화도가 50% 이상 감소된, 폴리펩티드.
- 제8항에 있어서, 상기 FcγR은 인간 FcγR 또는 시노몰구스 FcγR인, 폴리펩티드.
- 제8항에 있어서, 상기 FcγR은 인간 FcγR인, 폴리펩티드.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FcγR은 FcγRI인, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 변이체 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나의 변이체 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나의 변이체 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265의 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Gly인, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 CH2 도메인의 위치 234, 235, 및 265의 아미노산 잔기는 각각, Ala, Ala, 및 Asn인, 폴리펩티드.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 위치 234, 235 및 265에서 아미노산 치환이 없는 모 CH2 도메인의 Tm의 1℃ 이내인, 폴리펩티드.
- 제15항에 있어서, 변이체 CH2 도메인의 열 변성 중간점 온도 (Tm)가 위치 234, 235 및 265에서 아미노산 치환이 없는 모 CH2 도메인의 Tm보다 1℃ 이상 높은, 폴리펩티드.
- 제18항에 있어서, 상기 변이체 CH2 도메인의 Tm은 모 CH2 도메인의 Tm보다 3℃ 이상 높은, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 이의 기능적 단편인, 폴리펩티드.
- 제20항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편이 종양 항원에 결합하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분자.
- 제22항에 있어서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 이종성 폴리펩티드의 융합 단백질인, 분자.
- 하나 이상의 약물 또는 변형제에 접합된 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드-약물 접합체.
- 제24항에 있어서, 상기 약물이 화학요법제 또는 세포독성제인, 폴리펩티드-약물 접합체.
- 제24항에 있어서, 상기 변형제가 비단백질성 중합체인, 폴리펩티드-약물 접합체.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
- 제27항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제28항에 따른 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배지에서 배양하는 단계, 및 배지 또는 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제22항 또는 제23항에 따른 분자, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드-약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제22항 또는 제23항에 따른 분자, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드-약물 접합체.
- 제31항에 있어서, 치료법이 암, 면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 포함하는, 폴리펩티드, 분자 또는 폴리펩티드-약물 접합체.
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