KR20240049832A - 항-TGFβ1,2,3 항체 및 이의 치료적 용도 - Google Patents

항-TGFβ1,2,3 항체 및 이의 치료적 용도 Download PDF

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리사 마리 버거론
헨리 루이스 캄포스
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조에티스 서비시즈 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 신규한 항-TGFβ1,2,3 항체 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 개시내용은 TGFβ-관련된 장애의 치료 및/또는 예방, 특히 개 및 고양이의 섬유증 관련된 장애의 관리를 위한 발명의 신규한 항체 및/또는 뉴클레오티드의 용도를 추가로 제공한다.

Description

항-TGFβ1,2,3 항체 및 이의 치료적 용도
본 출원은 단클론 항체, 이의 생산 방법, 및 이들 항체의 치료적 용도에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 단클론 항체는 형질전환 성장 인자-베타(TGFβ, TGFB, TGFb 또는 TGF베타)에 대해 지향된다. 다른 실시형태에서, 항체는 키메라 또는 새로운 종으로 분화된 항체이다. 다른 실시형태에서 발명의 항체를 포함하는 치료의 방법이 개시된다.
형질전환 성장 인자-베타(본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 TGFB, TGFβ 또는 TGF 베타)는 증식, 분화, 생존, 이동 및 상피 중간엽 전이를 포함한 많은 주요 세포 기능을 조절하는 사이토카인이다. 이는 TGFβ, 뼈 형태형성 단백질(BMP), 성장 분화 인자, 인히빈 및 액티빈을 포함하는 38개 사이토카인의 수퍼패밀리의 구성원이다. TGFβ 단백질은 세포외 기질 형성, 상처 치유, 배아 발달, 뼈 발달, 조혈, 면역 및 염증 반응 및 악성 형질전환과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절한다. TGFβ의 조절완화는 태생적 결손, 암, 만성 염증, 자가면역 및 섬유증 질환을 포함하는 병리학적 병태를 유발한다.
TGFβ는 3가지 알려진 이소형인, TGFβ1, 2 및 3을 갖는다. 3가지 이소형은 모두 초기에 프로-펩티드로 번역된다. 이소형은 소포체에서 이량체 복합체를 형성하는 큰 전구체 단백질(pro-TGFβ)로 합성되고 이후 카르복시-말단 근처에서 절단되어 3개의 TGFβ 이소형에 걸쳐 60-80% 보존을 공유하는 성숙한 112-아미노산 폴리펩티드를 생성한다. 성숙한 TGFβ 이량체는 불활성인 잠재성 복합체로서 전구체의 절단된 잠복기 펩티드 부분과 계속 연관되어 있다. 작은 잠재성 복합체(SLC)를 형성하는 잠복기-연관된 펩티드(LAP)에 결합된 새롭게 합성된 TGFβ는 생물학적으로 불활성이고 그 수용체인 TGFβRII에 결합할 수 없다. 이황화 결합의 형성을 통해 이 복합체는 잠재성 TGFβ 결합 단백질(LTBP)에 느슨하게 결합하여 큰 잠재성 복합체(LLC)를 형성한다. TGFβ는 그 다음 잠복 상태로 분비되어 세포외 기질(ECM)에 저장된다. TGFβ의 활성화는 TGFβ 시그너링의 개시를 위해 그 세포 표면 수용체에 대한 결합을 허용하는, 인테그린, 프로테아제, 메탈로프로테이나제, 반응성 산소종(ROS), 플라스민 및 산을 포함한 다수의 서로 다른 요인에 노출된 후 잠재성 복합체로부터의 방출을 포함한다.
TGFβ1,2 및 3은 그 기능면에서 다면발현성이고 세포 및 조직 유형에 따라 서로 다른 패턴으로 발현된다. 이들은 유사한 시험관내 활성을 갖지만, 특정 세포 유형에서의 개별 녹아웃은 동일한 수용체에 결합하는 그 공유된 능력에도 불구하고 생체내에서 동일하지 않은 역할을 시사한다(Akhurst 등, Nat Rev Drug Discov (2012) 11 (10): 790-811). TGFβ가 TGFβRII에 결합하면, 수용체의 구성적 키나제 활성이 TGFβRI를 인산화하고 활성화하여 차례로 SMAD2/3을 인산화하여 SMAD4와 회합을 허용한다. 이 복합체는 핵에 국지화하고 TGFβ 반응성 유전자에 대한 전사 인자로 역할을 한다. 이 규범적 시그널링 캐스케이드 외에도 비-규범적 경로는 p38, MAPK, PI3K, AKT, JUN, JNK 및 NK-KB를 포함한 다른 요소를 통해 신호를 전송한다. 최종 결과는 세포의 상태와 환경을 통합하는 이들 모든 시그널링 경로의 누화이다.
많은 심각한 질환은 TGFβ 유도된 시그널링 경로의 오작동과 연결되어 있다. 본 발명은 개 및 고양이 만성 신장 질환(CKD) 둘 모두의 잠재적인 치료에 대한 것이다. CKD는 장기간의 진행성 과정으로 인해 기능성 신장 조직의 손실을 수반한다. 신장에서의 구조적 및 기능적 변화는 단지 느슨하게 연관되어 있지만 신장 구조에서 극적인 변화가 나타날 수 있다. 질환은 일반적으로 임상적으로 명백해지기 전 수개월 또는 수년 동안 존재하고 그것은 변함없이 되돌릴 수 없다. 선천성 질환은 >3세령의 동물에서 유병률에서의 일시적인 증가를 초래하지만, 유병률은 5-6세 이후로 연령이 높아짐에 따라 증가한다. 노인 모집단에서 CKD는 도그의 10%, 캣트의 40-80% 만큼에 영향을 미친다. 수의학의 분야에서는 TGFβ 단백질의 과잉생산에 의해 영향을 받는 상태인 것으로 제안되는 도그와 캣트 둘 모두에서의 CKD를 치료해야 하는 뚜렷하고 충족되지 않은 요구가 있다.
본 발명은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하는 신규한 항-전환 성장 인자 베타(본 명세서에 정의되고 상호교환적으로 사용되는 TGFB, TGF베타, TGFb 또는 TGFβ) 항원 결합 단백질(본 명세서에 정의되고 상호교환적으로 사용되는, 항체, 항체 단편, 길항제 항체)을 제공한다. 발명의 항원 결합 단백질은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 생물학적 활성을 차단하여 그 수용체에 대한 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 결합을 방지하고 결합과 연관된 경로의 활성화를 방지한다. 추가로, 본 발명은 발명의 항체의 길항제 작용이 본 명세서에 정의된 TGFβ 관련된 장애를 예방 및/또는 치료한다는 것을 제공한다. 발명은 발명의 항원 결합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드뿐만 아니라 벡터 및 숙주 세포의 생산을 추가로 제공한다. 발명은 상기 항체/항원 결합 단백질을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라 발명의 항체를 투여함에 의해 개 및 고양이에서 TGFβ 장애를 치료하는 치료의 방법을 추가로 제공한다.
일 양태에서, 발명은 개 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하고 서열번호 23; 서열번호 33 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 및 이의 변이체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 서열번호 77과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개 IgGB 불변 영역을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 발명은 개 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하고 서열번호 42-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 67-70으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체를 제공한다.
일 실시형태에서 항체는 개화된 항체를 포함한다.
일 양태에서, 발명은 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열번호 23, 서열번호 33 및 서열번호: 39 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호: 5를 포함하는, 고양이 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 변이체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 서열번호 75와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 고양이 IgG1a 불변 영역을 포함한다.
일 양태에서, 발명은 다음을 포함하는 고양이 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 항체:
a. 다음을 포함하는 가변 중쇄(VH):
i. 서열번호 22(G-Y-X1-X2-X3-S-N-V-X4-X5)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), 여기서:
ㆍX1은 T 또는 G를 포함하고;
ㆍX2는 F 또는 P를 포함하고;
ㆍX3은 S 또는 T를 포함하고;
ㆍX4는 M 또는 I로 포함하고;
ㆍX5는 H 또는 S를 포함함; 및
ii. 서열번호 32(X6-V-I-P-I-V-D-I-A-X7-Y-A-X8-X9-X10-X11-G-R)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2), 여기서:
ㆍX6은 G, Y 또는 S를 포함하고;
ㆍX7은 N, Y 또는 T를 포함하고;
ㆍX8은 Q 또는 R을 포함하고;
ㆍX9는 R 또는 S를 포함하고;
ㆍX10은 F 또는 V를 포함하고;
ㆍX11은 K 또는 Q를 포함함; 및
iii. 서열번호 38(A-X12-T-L-G-L-V-L-D-A-M-D-Y)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3), 여기서:
ㆍX12는 R 또는 S를 포함함; 및
b. 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
i. 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1);
ii. 서열번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2(CDR2);
iii. 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 3(CDR3); 및
하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공하며; 여기서 상기 항체는 서열번호 75와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 고양이 IgG1a 불변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 발명은 서열번호: 87-94로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호: 6-13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는 항체를 제공한다.
일 실시형태에서, 발명은 고양이화된 항체를 포함하는 항체를 제공한다.
일 실시형태에서, 발명은 단클론 항체; 단일 사슬 항체, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 도메인-결실된 항체, 융합 단백질, ScFc 융합 단백질, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, ScFv 단편, Fd 단편, 단일 도메인 항체, dAb 단편, 소형 모듈형 면역약제(SMIP) 나노바디, 및 IgNAR 분자로 구성된 군으로부터 선택된 항체를 제공한다. 일 실시형태에서 항체는 단클론 항체를 포함한다.
하나 이상의 실시형태에서 발명은 TGFβ-관련된 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항체를 제공한다. 일 실시형태에서, TGFβ-관련된 장애는 섬유증 장애, 결합 조직 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, TGFβ-관련된 장애는 섬유증 장애를 포함한다. 일 실시형태에서 섬유증 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환; 폐 섬유증; 간경변; 신경교 흉터; 및 전신 경화증/경피증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서 TGFβ 관련된 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환이다.
일 양태에서, 발명은 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 발명은 치료적 양의 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여함에 의해 TGFβ 관련된 장애에 대해 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서 대상체는 개를 포함한다. 일 실시형태에서 대상체는 고양이를 포함한다. 하나 이상의 실시형태에서 TGFβ 관련된 장애는 섬유증 장애, 결합 조직 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서 TGFβ 관련된 장애는 섬유증 장애를 포함한다. 일 실시형태에서 섬유증 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환; 폐 섬유증; 간경변; 신경교 흉터; 및 전신 경화증/경피증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서 TGFβ 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환이다.
일 양태에서, 발명은 발명의 약학적 조성물을 투여함에 의해 대상체에서 TGFβ1, 2 및 3 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서 대상체는 개를 포함한다. 일 실시형태에서 대상체는 고양이를 포함한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 하나 이상의 항체 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 하나 이상의 항체 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공하며 여기서 상기 서열은 서열번호 55-66과 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 71-74와 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 하나 이상의 항체 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공하며 여기서 상기 서열은 서열번호 97-104와 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 14-21과 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 발명은 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 발명은 항체의 생산을 초래하는 조건 하에서 발명의 숙주 세포를 배양하고 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리함에 의해 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
도 1은 항원 결합 부위를 강조하는 천연 마우스 면역글로불린 G(IgG)의 일반적인 구조를 나타낸다.
도 2는 마우스: 개 IgG의 일 실시형태의 일반적인 구조의 개략도이다.
도 3은 이종키메라 분자를 나타낸다.
도 4는 마우스 IgG의 종분화 또는 개화를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
ㆍ서열번호: 1 고양이/ 인간 키메라 항-TGFβ1,2,3 VH 아미노산
ㆍ서열번호: 2 고양이/ 인간 키메라 항-TGFβ1,2,3 VH 핵산 서열
ㆍ서열번호: 3 항-TGFβ1,2,3 VL CDR1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 4 항-TGFβ1,2,3 VL CDR1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 5 항-TGFβ1,2,3 VL CDR1 아미노산
ㆍ서열번호: 6 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 7 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL2 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 8 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL3 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 9 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL4 아미노산
ㆍ서열번호: 10 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL5 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 11 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL6 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 12 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL7 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 13 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL8 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 14 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL1 핵산 서열
ㆍ서열번호: 15 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL2 핵산 서열
ㆍ서열번호: 16 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL3 핵산 서열
ㆍ서열번호: 17 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL4 핵산 서열
ㆍ서열번호: 18 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL5 핵산 서열
ㆍ서열번호: 19 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL6 핵산 서열
ㆍ서열번호: 20 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL7 핵산 서열
ㆍ서열번호: 21 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VL8 핵산 서열
ㆍ서열번호: 22 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산 제형
ㆍ서열번호: 23 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 24 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH8, VH2.8, VH3.8
ㆍ서열번호: 25 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH9
ㆍ서열번호: 26 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH4
ㆍ서열번호: 27 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH3
ㆍ서열번호: 28 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH3.2
ㆍ서열번호: 29 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH2.1
ㆍ서열번호: 30 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH6.1
ㆍ서열번호: 31 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR1 아미노산: VH2.2
ㆍ서열번호: 32 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR2 아미노산: 제형
ㆍ서열번호: 33 항-TGFβ1,2,3 VH CDR2 아미노산
ㆍ서열번호: 34 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR2 아미노산: VH8, VH4,3, VH2.1, VH 6.1, VH2.8, VH3.8
ㆍ서열번호: 35 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR2 아미노산: VH9
ㆍ서열번호: 36 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR2 아미노산: VH3.2
ㆍ서열번호: 37 고양이화된 항-TGFβ1,2,3VH CDR2 아미노산: VH2.2
ㆍ서열번호: 38 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR3 아미노산: 제형
ㆍ서열번호: 39 항-TGFβ1,2,3 VH CDR3 아미노산:
ㆍ서열번호: 40 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR3 VH8, VH9 아미노산 경우
ㆍ서열번호: 41 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH CDR3 VH3, VH 3.2, VH 2.2 아미노산 경우
ㆍ서열번호: 42 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH2 아미노산
ㆍ서열번호: 43 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH6 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 44 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH3 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 45 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH4 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 46 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH4.11 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 47 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH5.10 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 48 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH4.5 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 49 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 50 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.5 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 51 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.6 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 52 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH4.7 아미노산 서열
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ㆍ서열번호: 60 개화된 항-TGFβ1,2,3 VH5.10 핵산 서열
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ㆍ서열번호: 67 개화된 항-TGFβ1,2,3 VL1 아미노산 서열
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ㆍ서열번호: 69 개화된 항-TGFβ1,2,3 VL3 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 70 개화된 항-TGFβ1,2,3 VL4 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 71 개화된 항-TGFβ1,2,3 VL1 핵산 서열
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ㆍ서열번호: 74 개화된 항-TGFβ1,2,3 VL 4 핵산 서열
ㆍ서열번호: 75: 고양이 중쇄 불변 영역 IgG1a 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 76: 고양이 중쇄 불변 영역 IgG1a 핵산 서열
ㆍ서열번호: 77: 개 중쇄 불변 영역 IgGB 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 78 개 중쇄 불변 영역 IgGB 핵산 서열
ㆍ서열번호: 79 GC1008 VH 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 80 GC1008 VL 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 81 개 경쇄 불변 영역 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 82 개 경쇄 불변 영역 핵산 서열
ㆍ서열번호: 83 고양이 경쇄 불변 영역 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 84 고양이 경쇄 불변 영역 핵산 서열
ㆍ서열번호: 85 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 86 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH4 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 87 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH8 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 88 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH9 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 89 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.2 아미노산 서열
ㆍ 서열번호: 90 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 91 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH6.1 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 92 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.2 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 93 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.8 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 94 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.8 아미노산 서열
ㆍ서열번호: 95 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3 핵산 서열
ㆍ서열번호: 96 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH4 핵산 서열
ㆍ서열번호: 97 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH8 핵산 서열
ㆍ서열번호: 98 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH9 핵산 서열
ㆍ서열번호: 99 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.2 핵산 서열
ㆍ서열번호: 100 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.1 핵산 서열
ㆍ서열번호: 101 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH6.1 핵산 서열
ㆍ서열번호: 102 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.2 핵산 서열
ㆍ서열번호: 103 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH2.8 핵산 서열
서열번호: 104 고양이화된 항-TGFβ1,2,3 VH3.8 핵산 서열
본 명세서에 개시된 발명은 높은 친화도 및 특이성으로 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ 단백질에 결합하는 항-TGFβ 항체/항체 단편(상호교환적으로 사용되는 용어)을 제공한다. 발명은 상기 항체의 변이체인 본 명세서에 기술된 TGFβ1, 2 및 3 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 폴리펩티드뿐만 아니라 상기 항체를 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 발명은 또한 상기 항체 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에 개시된 발명은 또한 본 명세서에 기술된 발명의 치료적으로 유효한 양의 항-TGFβ1, 2, 및 3 항체 및 각각의 변이체의 투여에 의해 섬유증 장애, 결합 조직 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애의 군으로부터 선택된 TGFβ 관련된 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
일반 기술 및 정의
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시형태를 기술하기 위해 사용된 것으로, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 더욱이, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 이용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 명명법이고 단일 설명에 제한되지 않는다. 기술되어진 것을 다른 기술로 대체할 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있다.
식별된 모든 특허 및 기타 간행물은 예를 들어 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기술된 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 참조로 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그 공개를 위해서만 제공된다.
표준 기술은 당업자에게 잘 알려진 많은 다른 일반적으로 사용되는 기술 중에서 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 합성, 조직 배양, 세포의 형질감염 및 형질전환에 사용된다. 당업자에게 잘 알려진 일반적인 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기술된 대로 수행된다.
본 발명을 구체적으로 기술하기에 앞서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 여러 가지 용어에 대해 정의될 것이다. 이들 용어 외에도 필요에 따라 다른 용어도 명세서의 다른 곳에서 정의된다. 상기 및 개시내용 전반에 걸쳐 이용된 바와 같이, 다음 용어 및 약어는 달리 명시되지 않는 한 다음 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 용어는 그 기술 분야에서 인식되는 의미를 가질 것이다.
명세서 및 청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 그러한 항체의 복수를 포함한다.
본 개시내용에서, "포함한다", "포함된", "포함하는", "함유한다", "함유하는", "구성되는", "구성된", "본질적으로 구성되는", "포괄한다", "포괄된" 등과 같은 용어는 미국 표준 및 국제 특허법 관행에 따라 정의된다.
용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 용어 "적어도 약"은 범위의 하한을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 용어 "적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는" 경우, 이는 95% 서열 동일성 내지 100% 서열 동일성을 포함한다는 것이 당업자에게 명백해야 한다. 청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 비록 개시내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지원하지만, 대안만을 언급하거나 대안이 상호 배타적이라고 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용된다.
용어 "아미노산"은 자연적으로 발생하는 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형되는 이들 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R기를 가지나 이에 제한되지 않는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 가지지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학 화합물을 지칭한다.
아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회에서 권장하는 한-글자 기호로 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드도 일반적으로 허용가능한 단일-글자 코드로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드 구조와 같은 거대분자 구조는 다양한 수준의 조직화의 관점에서 기술될 수 있다. "일차 구조"는 펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. "이차 구조"는 폴리펩티드 내의 국소적으로 정렬된 3차원 구조를 지칭한다. 이들 구조는 일반적으로 도메인, 예를 들어 효소 도메인, 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 기공 도메인 또는 세포질 꼬리 도메인으로 알려져 있다. 도메인은 폴리펩티드의 컴팩트 단위를 형성하는 폴리펩티드의 일부이다. 예시적인 도메인에는 효소 활성을 갖는 도메인이 포함된다. 도메인은 β-시트 및 α-나선의 스트레치와 같이 더 낮은 조직화의 섹션으로 구성될 수 있다. "3차 구조"는 폴리펩티드 단량체의 완전한 3-차원 구조를 지칭한다. "4차 구조"는 독립적인 3차 단위의 비공유 회합에 의해 형성된 3-차원 구조를 지칭한다.
용어 '보존적 아미노산 치환'은 주어진 아미노산 잔기에 대한 임의의 아미노산 치환을 나타내며, 여기서 치환 잔기는 주어진 잔기의 것에 화학적으로 유사하여 폴리펩티드 기능(예를 들어, 효소 활성)에서의 실질적인 감소를 초래하지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 일반적으로 알려져 있고, 그 예는 예를 들어 미국 특허 번호 6790639, 6774107, 6,194167 또는 5350576에 기술되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 다음 6개 그룹 중 하나 내에서 발생하는 임의의 것일 것이다:
ㆍ작은 지방족, 실질적으로 비-극성 잔기: Ala, Gly, Pro, Ser 및 Thr;
ㆍ큰 지방족, 비-극성 잔기: Ile, Leu 및 Val; Met;
ㆍ극성의 음으로 하전된 잔기 및 그 아미드: Asp 및 Glu;
ㆍ극성의 음으로 하전된 잔기의 아미드: Asn 및 Gln; His;
ㆍ극성의 양으로 하전된 잔기: Arg 및 Lys; His; 및
ㆍ큰 방향족 잔기: Trp 및 Tyr; Phe.
바람직한 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 천연 잔기(보존적 치환) 쌍으로 나열된, 다음 중 임의의 하나일 것이다: Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Gin (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gln); Ile (Leu; Val); Leu (Ile; Val); Lys (Arg; Gln; Glu); Met (Leu; Ile); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); 및 Val (Ile; Leu).
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 그것은 가능하기로는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어는 또한; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형인, 자연적으로 또는 개재에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 정의에는 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기반으로 하기 때문에 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연관된 사슬로 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체", "항원 결합 단백질" 등은 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 항체 단편에 의해 코딩되는 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함할 수 있으며, 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬의 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)을 갖다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 가변 경쇄 및 가변 중쇄라는 용어는 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 온전한 면역글로불린으로 존재하거나 다양한 펩티다제로 소화에 의해 생성된 여러 잘-특징화된 단편으로 존재한다. 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화의 관점에서 정의되지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "항체"에는 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로 합성된 것들 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 식별된 것들도 포함된다.
본 명세서에 사용된, 임의의 척추동물 종으로부터의 온전한 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 2가지 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 모든 경쇄는 하나의 가변 도메인(VL)과 하나의 불변 도메인(CL)을 함유한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 항체의 클래스 또는 이소형을 정의하는 여러 가지 다른 유형의 중쇄가 존재한다. 모든 중쇄는, 일반적으로 항원 결합에 중요한 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)과 1개의 가변 도메인(VH)을 갖는, 일련의 면역글로불린 도메인을 함유한다.
용어 "가변" 영역은 프레임워크 및 CDR(달리는 "초가변 영역"으로도 알려짐)을 포함하고, 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열이 광범위하게 다르고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 "상보성 결정 영역(CDR)" 또는 "초가변 영역"이라고 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 주로 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 구성을 채택하는, 다중 FR을 포함하며, 이는 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat, 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), 페이지 647-669 및 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않지만, 본 명세서에 기술된 바와 같이 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
4가지 인간 IgG 서브클래스의 특성은 잘 확립되어 있다; 각각은 뚜렷한 특징을 갖고 면역체계와 매우 다르게 계합한다. 인간 IgG 서브클래스는 신생아 Fc 수용체(FcRn), Fc 감마 수용체(FcγR) 및 보체 단백질 C1q를 포함한 면역 효과기 단백질에 대한 그 결합 친화도에 의해 구별된다. 이들 수용체 단백질은 각각 혈청 반감기, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)에서 역할을 수행한다. 이들 수용체에 대한 친화도는 종종 항체의 기능적 특성을 특징화하는데 사용되었다(Bruggemann 등, 1987). FcγR1 및 FcγRIII에 대한 더 높은 친화도는 항체가 ADCC 활성을 갖는 반면, 억제성 수용체인 FcγRIIb에 대한 결합은 더 적은 ADCC 활성에 기여한다는 것을 나타낸다(Daeron, 1997; Armor 등, 1999; Clynes 등, 2000). 유사하게, 보체 캐스케이드의 제1 단백질인 C1q에 결합하는 것은 식세포를 활성화하고 병원체를 파괴하는데 도움이 되는 보체 활성을 나타낸다(Schifferli 등, 1986; Garred 등, 1989; Moore 등, 2010). FcRn 결합은 항체 재순환과 연관되어 있고 생체내 반감기와 상관관계가 있다(Ghetie 등, 1996; Israel 등, 1996; Praetor and Hunziker, 2002; Jefferis, 2007). IgG 서브클래스의 고유한 기능은 항체 치료제의 설계에 도움이 된다.
1967년에 Johnson과 Vaughan은 6개 개 면역글로불린의 존재를 보고했다(Johnson and Vaughan, 1967; Johnson 등, 1967). 후속 연구에서는 Mazza 등(1993)이 IgG가 풍부한 개 혈청에서 4개의 분획을 단리하고 겔 여과, 단백질 A/G 결합 및 전기영동 이동성에 의해 각각을 분리한 IgG로 초점을 좁혔다. 이들 분획은 개 IgG에 특이적인 항체 시약을 얻기 위해 사용되었다(Mazza 등, 1994). 이 연구는 다양한 질환 상태에서의 개 IgG를 조사하는 연구의 실체를 개시시켰지만, 개 면역글로불린의 기능과 면역 효과기 단백질과 상호작용하는 방식은 여전히 불분명했다. 2001년 Tang 등(2001)은 이들 질문에 답하기 시작하는데 필요한 개 IgG 서열을 제공했다. 인간 IgG와 마찬가지로, 개 IgG는 4개의 서브클래스로 구성된다. Bergeron 등(Veterinary Immunology and Immunopathology 157 (2014) 31-41)은 수탁 번호 [AF354264, AF354265, AF354266 및 AF354267]의 순서에 따라 이들 개 IgG 서브클래스를 각각 A, B, C 및 D로 지칭했다. 개 IgG 서열과 연관된 알파벳 명명법은 신체에서의 유병률을 기준으로 한다. Bergeron 등은 각 서브클래스의 기능적 분석을 제공했다.
Strietzel 등(Veterinary Immunology and Immunopathology 158 (2014) 214-223)이 고양이 비장 cDNA 라이브러리로부터 이전에 단리된 2개의 공지된 서열과 연관된 기능적 특성을 개시한 때인 2014년까지 고양이 IgG에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 이들 2개의 IgG 서열인, IgG1a 및 IgG1b는 단리되었지만 특징화되지는 않았다(Kanai, T.H., 등, 2000 Vet Immunol, Immunopathol. 73(1), 53-62). Strietzel 등은 IgG2라고 불리는 제3 고양이 IgG 서열을 보고했으며 식별된 고양이 FcγRI, FcγRIII, FcRn 및 C1q와의 3가지 고양이 IgG 상호작용을 기술했다. 고양이 카파 및 람다 경쇄 영역을 추가로 단리했다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 신생아 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합되어야할 필요가 있고 그러한 항체 효과기 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 Fc 영역 서열에 대한 서열의 비-제한적 예는 서열번호 70 및 서열번호 72와 약 80-99% 사이의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 70을 포함하는 천연 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 72를 포함하는 천연 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에서의 천연 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 이와 적어도 약 95%의 서열 동일성을 보유할 것이다. "변이체 Fc 영역" 또는 "돌연변이된" 또는 "돌연변이체" Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 다른 아미노산 서열을 포함하고, 천연 Fc 영역 서열과 비교하여 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기 기능을 유지하거나 유지하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 95% 서열 동일성을 보유할 것이다. 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역은 또한 항체의 Fc 영역의 기능을 본질적으로 제거할 수 있다. 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역은 또한 항체의 Fc 영역의 기능을 추가하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 돌연변이는 항체의 효과기 기능을 제거할 수 있다. 또 다른 예에서 돌연변이된 Fc 영역은 항체의 효과기 기능을 증강시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 돌연변이된 Fc 영역은 반감기를 변경하거나 항체의 특성을 결정할 수 있는 세포에서의 다른 요인의 결합에 영향을 줄 수 있다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 70과 약 80-99% 사이의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능에 영향을 미치는 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 72와 약 80-99% 사이의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능에 영향을 미치는 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 70을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능에 영향을 미치는 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서 발명의 항체는 서열번호 72를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 효과기 기능에 영향을 미치는 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용리를 야기하는 세포-매개된 반응을 지칭한다. 관심있는 분자의 ADCC 활성은 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것과 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어 Clynes 등, 1998, PNAS (USA), 95:652-656에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재에서 표적의 용리를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어 항체)에 대한 보체 시스템의 제1 성분(C1q)의 결합함에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods, 202: 163(1996)에 기술된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
항체, 예를 들어 재조합, 단클론 또는 다클론 항체의 제조의 경우, 당업계에 공지된 많은 기술이 사용될 수 있다. 관심있는 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝되고 재조합 단클론 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 단클론 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자 라이브러리도 사용될 수 있다. 중쇄와 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합은 다른 항원 특이성을 갖는 항체의 대규모 풀을 생성한다. 단일 사슬 항체 또는 재조합 항체를 생성하는 기술은 당업계에서 발견되고 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하도록 조정될 수 있다. 파지 디스플레이 기술은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이형의 단편을 식별하는 데에도 사용될 수 있다. 항체는 또한 이중특이적으로 만들어질 수 있으며, 즉 2개의 서로 다른 항원 또는 이종접합체, 예를 들어 2개의 공유적으로 연결된 항체 또는 면역독소를 인식할 수 있다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(l)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있는 반면, 이황화 연결의 수는 다양한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화물 다리를 가지고 있다. 각 중쇄는 일 말단에 가변 도메인(VH)과 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 일 말단에 가변 도메인(VL)과 그 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 도 1은 항원 결합 부위를 강조하는 천연 마우스 면역글로불린 G(lgG)의 일반적인 구조의 예이다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있는, 본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합 단백질", "항체", "길항제 항체", "항원 결합 단편" 등은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭한다. 따라서, 단리된 항체 또는 단편은 다클론 항체, 단클론 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 이종키메라 항체, 개화된 항체, 고양이화된 항체, 완전 개 항체 또는 완전 고양이 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 용어 "항원 결합 단백질" "항체" "길항제 항체" 등은 바람직하게는 TGFβ 단백질 및 이의 단편에 결합할 수 있는 단클론 항체 및 이의 단편, 및 이의 면역학적 결합 등가물을 지칭한다. 예시적인 항체 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 디아바디, 이의 항원-인식 단편, 소형 모듈식 면역약제(SMIP) 나노바디, IgNAR 분자 및 항체 또는 항체 단편 및 임의의 상기 언급된 단편인 것으로 당업자에 의해 인식되는 등가물 및 이의 화학적으로 또는 유전적으로 조작된 대응물, 뿐만 아니라 다른 항체 단편 및 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성이 포함된다. 항체 및 항원 결합 단백질은, 예를 들어 전통적인 하이브리도마 기술(Kohler 등, Nature 256:495 499 (1975)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 번호 4,816,567), 또는 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 기술(Clackson 등, Nature 352:624 628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581 597 (1991)) 또는 기타 당업자에게 이용되고 잘 알려져 있는 기술을 통해 제작될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 정의된 "단클론 항체"는 단일의 순수 동종 유형의 항체이다. 생산된 모든 단클론 항체는 동일하고 같은 항원 특이성을 갖는다. 단클론 항체는 단클론 항체가 항원의 선택적 결합에 관여하는 아미노산(자연적으로 발생하는 및 비-자연적으로 발생하는 것)으로 구성된 동종 항체 모집단이다. 단클론 항체의 모집단은 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지향된다. 용어 "단클론 항체"는 온전한 단클론 항체 및 전장 단클론 항체뿐만 아니라 이의 단편(Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 디아바디, 이의 항원-인식 단편, 소형 모듈식 면역약제(SMIP) 나노바디, IgNAR 분자 등), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위 및 항원에 결합하는 능력을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포괄한다. 이는 항체의 공급원이나 항체가 만들어지는 방식(예를 들어 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물 등)에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 쉽게 결정화되는 그 능력을 반영하는 명칭인 잔기의 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 가지고 여전히 항원을 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀한 비-공유 회합으로 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이 구성에서는 각 가변 도메인의 3개 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 정의한다는 것이다. 종합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서 이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가지고 있다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서 몇 개의 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 담지하는 Fab'에 대한 본 명세서에서의 지칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
본 명세서에 기술된 단클론 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 동종인 반면, 사슬(들)의 나머지 부분은, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래된 항체뿐만 아니라 그러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 동종인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다. 전형적으로, 키메라 항체는 다른 종에 속하는 항체 가변 및 불변 영역 유전자로부터 전형적으로 유전 공학에 의해 그 경쇄 및 중쇄 유전자가 구축된 항체이다. 예를 들어, 마우스 단클론 항체(또는 고양이를 포함하는 임의의 다른 종 항체)로부터의 유전자의 가변 세그먼트는 개 불변 세그먼트, 예를 들어 효과기 기능 돌연변이가 있는 및 없는 둘 모두의 서열번호 72로 본 명세서에서 표시되는 IgGB 개 중쇄 불변 영역 또는 효과기 기능 돌연변이가 있는 및 없는 둘 모두의 서열번호 70으로 본 명세서에서 표시되는 IgG1a 고양이 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 조합될 수 있다. 추가적으로, 키메라 고양이 항체는 고양이 중쇄 불변 영역인, 서열번호 75를 포함하는 아미노산이 다른 종 항체(마우스, 개, 고양이 등)의 가변 세그먼트에 이어진다는 것을 제회하고 동일한 양식으로 생산된다. 도 2는 마우스: 개 IgG의 일 실시형태의 일반적인 구조의 개략도이다. 이 실시형태에서, 항원 결합 부위는 마우스로부터 유래되는 반면, Fc 부분은 개이다. 이 예시는 청구된 발명을 마우스/개 키메라에만 제한하지 않고, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 몇 가지를 나열하면 개, 고양이, 뮤어라인 및 인간인: 임의의 종 항체의 조합에도 적용될 수 있다.
본 명세서에 정의된 용어 "이종키메라"는 항체 사슬(중쇄 또는 경쇄) 중 하나가 새로운 종으로 분화(즉, 개화 또는 고양이화)되고 다른 하나는 키메라인 항체를 지칭한다. 이 실시형태에서, 개화된 가변 중쇄(여기서 모든 CDR이 마우스이고 모든 FR이 개임)은 키메라 가변 경쇄(여기서 모든 CDR은 마우스이고 모든 FR은 마우스임)와 페어링된다. 이 실시형태에서, 가변 중쇄와 가변 경쇄 둘 모두는 개 불변 영역에 융합된다. 키메라 항체와 마찬가지로 항체의 종과 부분의 조합에는 제한이 없다.
본 명세서에 사용된 용어 "개 항체", "고양이 항체", "인간 항체" 등은 표적에 대해 생성된 항체 및 표적 종 내의 림프구로부터 단리된 항체를 지칭한다. 본 명세서에 기술된 이들 항체는 표적 종의 특정 불변 영역을 포함하도록 시험관내에서 재조합적으로 변형되었거나 그렇지 않으면 재조합적으로 변형되었다.
문구 "재조합 개 항체", "재조합 고양이 항체", "재조합 인간 항체" 등은 모두 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 새로운 종으로 분화된 항체, 예컨대 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포 안으로 발현된 항체, 재조합, 조합 개(또는 고양이, 인간 등) 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 개, 고양이 또는 다른 종 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어 Taylor, L. D., 등 (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 개(또는 고양이, 인간 등) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 재조합하는 것과 관련된 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 항체를 포함한다.
단순화를 위해 다음은 "개화된" 항체를 기술하지만 고양이화된, 인간화된 또는 임의의 기타 새로운 종으로 분화된 항체에도 동일한 것이 적용될 수 있다. 예를 들어, "개화"는 도그에서 치료제로 유용한 치료를 생성하기 위해 공여자 항체로부터 비-개 항원-결합 영역을 면역원성이 덜한 개 항체 수용체로 전달하는 방법으로 정의된다. 개화된 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 마우스, 랫트, 토끼, 캣트, 도그, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비-인간 영장류, 인간, 인간화된, 재조합 서열, 또는 원하는 특성, 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 조작된 서열과 같은 비-개 종(공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 개 항체 서열이다. 더욱이, 개화된 항체에는 수용체 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기가 포함될 수 있다. 이들 변형은 항체 수행성을 더욱 개선하기 위해 이루어졌다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 초가변 영역 및/또는 프레임워크 영역에 대한 변형은 당업자에게 공지된 실험을 기초로 하여 각각 별도로 조작된 새로운 종으로 분화된(개화된) 항체에 대해 결정되지만 상기 실험 이전에는 예측할 수 없다. 개화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 전체, 또는 적어도 일부, 전형적으로 개 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 도 4는 마우스 IgG의 새로운 종으로 분화 또는 개화를 보여주는 일 실시형태의 예시이다. 이 실시형태에서, 마우스 CDR은 개 프레임워크 상에 접목된다. 일부 경우에는 초가변 영역의 외부에 있는 마우스 프레임워크 또는 잔기가 유지된다. 항체의 개화 및 개화된 항체의 것에 대한 모든 설명은 개념적으로 그것이 개화, 고양이화, 인간화 등이든 간에 임의의 "새로운 종으로 분화된" 항체에 적용가능할 수 있다.
본 명세서에 기술된 "모" 항체는 변이체의 제조에 사용된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 것이다. 바람직하게는, 개화된 항체 또는 개 항체의 경우 모 항체는 개 프레임워크 영역을 갖고, 존재하는 경우 개 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 개화된 항체 또는 개 항체일 수 있다. 고양이화된, 인간화된, 말화된, 소화된 항체의 경우에도 이는 마찬가지이다.
용어 "역돌연변이"는 개 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산 중 일부 또는 전부가 상동 생식계열 항체 서열로부터 상응하는 생식계열 잔기로 대체되는 과정을 지칭한다. 발명의 개 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 가장 높은 상동성을 갖는 서열을 식별하기 위해 생식계열 서열과 별도로 정렬된다. 발명의 개 항체에서의 차이는 이러한 다른 아미노산을 인코딩하는 정의된 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시킴으로써 생식계열 서열로 복귀된다. 역돌연변이 후보로 이렇게 식별된 각 아미노산의 역할은 항원 결합에서 직접적 또는 간접적인 역할에 대해 조사되어야 하고, 개 항체의 임의의 바람직한 특징에 영향을 미치는 돌연변이 후에 발견된 임의의 아미노산은 최종 개 항체에 포함되지 않아야 한다; 예를 들어, 선택적 돌연변이유발 접근법으로 식별된 활성 증강 아미노산은 역돌연변이의 대상이 되지 않을 것이다. 역돌연변이 대상이 되는 아미노산의 수를 최소화하기 위해 가장 가까운 생식계열 서열과는 다르지만 제2 생식계열 서열에서의 상응하는 아미노산과 동일한 것으로 밝혀진 이들 아미노산 위치는 유지될 수 있으며, 단 제2 생식계열 서열은 발명의 개 항체의 서열과 동일하고 동일선상이다. 선택된 표적 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 역돌연변이는 친화도를 회복하고 하거나 개선하기 위해 필요할 수 있다.
"항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 일반적으로, 에피토프는 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화, 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고 특정 3-차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 면역체계에 의해 인식되는 단백질 상의 항원 결정자이다. 에피토프를 인식하는 면역체계의 구성요소는 항체, T-세포, B-세포이다. T-세포 에피토프는 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에 표시되고 전형적으로 길이가 8-11(MHC 클래스 I) 또는 15 플러스(MHC 클래스 II) 아미노산이다. T-세포에 의한 표시된 MHC-펩티드 복합체의 인식은 그의 활성화에 매우 중요하다. 이들 메커니즘을 통해 박테리아 및 바이러스와 같은 "자기" 단백질 대 "비-자기" 단백질을 적절하게 인식할 수 있다. 반드시 인접할 필요는 없는 독립적인 아미노산 잔기는 APC 결합 틈과의 상호작용 및 T-세포 수용체에 의한 후속 인식에 기여한다(Janeway, Travers, Walport, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition New York: Garland Science; 2001). 가용성 항체 및 세포 표면 연관된 B-세포 수용체에 의해 인식되는 에피토프는 길이와 연속성의 정도에서 크게 다르다(Sivalingam and Shepherd, Immunol. 2012; 51(3-4): 304-309). 다시 말하면, 선형 에피토프 또는 단백질 서열의 연속적인 스트레치에서 발견되는 에피토프조차도 항체 파라토프 또는 B-세포 수용체와의 주요 접촉 지점을 나타내는 연속되지 않은 아미노산을 종종 가질 것이다. 항체와 B-세포에 의해 인식되는 에피토프는 3-차원 공간에서 단백질에 대한 공통 접촉 영역을 포함하는 아미노산과 구조적일 수 있고 단백질의 3차 및 4차 구조적 특성에 의존한다. 이들 잔기는 종종 일차 아미노산 서열의 공간적으로 구별되는 영역에서 발견된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "TGF 베타", "TGF β" 및 "TGFB"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 형질전환 성장 인자 베타 단백질 1(TGFβ1), 형질전환 성장 인자 베타 단백질 2(TGFβ2) 및 형질전환 성장 인자 베타 단백질 3(TGFβ3)을 지칭한다. TGFβ 단백질은 세포 증식 및 이동, 세포 분화, 세포자멸사, ECM(세포외 기질) 생성 및 면역 조절을 조절함에 의해 상처 치유에 다면발현성 효과를 발휘하는 관련된 성장 인자의 슈퍼패밀리의 일부이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 발명의 항체의 사용을 통한 TGFβ 단백질의 억제는 섬유증 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애와 같은 TGFβ 관련된 장애를 치료하는데 사용된다.
본 명세서에 사용된 "항-TGFβ 항체"는 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 단백질이 그 특정 수용체에 결합하는 것을 억제하여 이의 연관된 TGFβ 시그널링 경로의 생물학적 기능을 억제하는 임의의 기능성 분자를 기술하는 "항-TGFβ 항원 결합 단백질" 및 "항-TGFβ 길항제 항체", "항-TGFβ 항원 결합 단편", "항-TGFβ 항원 결합 부분" 및 "항-TGFβ 항원 결합 부분" 등으로 상호교환적으로 명명될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항-TGFβ 항체는 TGFβ1, 2 및 3 단백질에 결합한다. 발명의 항-TGFβ 항체는 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 시그널링에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하여 TGFβ 생물학적 활성을 차단, 길항, 억제 또는 감소(상당히 감소시키는 것을 포함)하고/하거나 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 단백질에 대한 세포 반응의 수용체 결합 및/또는 유도와 같은 TGFR2 수용체를 TGFβ 단백질이 결합하는 것을 억제하는 결합 단백질 및 항체를 포괄한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "항-TGFβ 항체" 또는 "항-TGFβ-길항제 항체" 또는 "TGFβ B 항원 결합 단백질"은 섬유증 장애, 뼈 장애 및/또는 세포 증식 장애 또는 생물학적 활성의 결과와 같은 TGFβ 관련된 장애의 발달 또는 치료의 임의의 양태를 매개하는 그 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않는, TGFβ 자체의 생물학적 활성이 임의의 의미 있는 수준으로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 이전에 식별된 모든 용어, 제목 및 기능적 상태 및 특징을 포괄한다는 것이 명시적으로 이해될 것이다. 항-TGFβ 항체의 예가 본 명세서에 제공된다.
"변이체" 항-TGFβ 항체는 본 명세서에서 모 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 추가, 결실 및/또는 치환으로 인해 "모" 항-TGFβ 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 다르고 모 항-TGFβ-항체의 적어도 하나의 원하는 활성을 유지하는 분자를 지칭한다. 원하는 활성에는 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 동물에서 TGFβ 활성을 감소, 억제 또는 중화하는 능력, 및 세포-기반 검정에서 TGFβ-매개된 SMAD 시그널링을 억제하는 능력이 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역(들)에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 및/또는 프레임워크 영역에 적어도 1개, 또는 약 1 내지 약 10개 또는 약 2 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 일반적으로 변이체는 모 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 적어도 50%의 아미노산 서열 동일성 또는 모 항체와의 적어도 약 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 사이의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본 명세서에서 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부 확장, 결실 또는 항체 서열 안으로의 삽입은 전체 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되어서는 안된다. TGFβ 변이체에 결합하는 능력을 보유하는 변이체는 더 강한 결합 친화도, 동물에서 TGFβ 활성을 감소, 억제 또는 중화하는 증강된 능력, 및/또는 세포-기반 검정에서 TGFβ-매개된 SMAD 시그널링을 억제하는 증강된 능력을 가질 수 있다.
"TGFβ 수용체"는 TGFβ 단백질에 의해 결합되거나 활성화되는 폴리펩티드를 지칭한다. TGFβ 수용체는 TGFβ 수용체 계열에 속하는 단일-통과 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. 이들은 동종- 또는 이종이량체가 될 수 있는 여러 가지 다른 이소폼으로 존재한다. TGFβ 단백질에 특이적인 3가지 TGFβ 수용체는 그 구조적 및 기능적 특성으로 구별될 수 있다. TGFβR1(ALK5)과 TGFβ R2는 유사한 리간드-결합 친화도를 가지고 있다. TGFβ R1과 TGFβ R2 둘 모두는 TGFβ1에 대해 높은 친화도를 갖고 TGFβ2에 대해 낮은 친화도를 갖는다. TGFβR3(β-글리칸)은 동종이량체 TGFβ1 및 TGFβ2 둘 모두에 대해 그리고 부가하여 이종이량체 TGFβ1,2에 대해 높은 친화도를 갖는다. TGFβ 수용체는 또한 TGFβ3에도 결합한다. 기계적으로 TGFβ 단백질은 초기에 TGFβR1을 동원하고 인산화시키는 TGFβR2 수용체에 결합한다. 그런 다음 TGFβR1은 수용체-조절 SMAD(R-SMAD)를 인산화한 다음 co-SMAD SMAD4에 결합할 수 있다. R-SMAD/co-SMAD 복합체는 핵에 축적되어 전사 인자로 작용하고 표적 유전자 발현의 조절에 참여한다.
발명의 단클론 항체의 활성과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "중화시킨다"는 생물학적 활성이나 특성, 질환 또는 병태를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 억제되어 지는 것의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 금지하거나, 예방하거나, 제한하거나, 느리게 하거나, 방해하거나, 제거하거나, 중단하거나, 감소시키거나 역전시키는 능력을 의미한다. 억제 또는 중화는 바람직하게는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다. 항원에 결합한 항체가 항원의 생물학적 기능을 부분적으로 또는 완전히 억제하거나 감소시키는 경우 항체는 그 항원을 "중화시킨다"고 언급된다. TGFβ 단백질의 생물학적 활성의 중화는 TGFβ 수용체 결합 및 시그널링 경로의 차이와 같은 TGFβ 활성의 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 지표의 부분적 또는 완전한 억제 또는 감소를 측정하여 평가된다. TGFβ 활성을 중화시키는 능력은 본 명세서에 기술된 시험관내 검정에 기술된 바와 같이 Smad2 인산화의 억제를 측정함에 의해, 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가된다. 생체내 TGFβ의 중화는 질환의 상태에서 TGFβ로 인한 세포 표현형 전환, 세포 증식 및 세포 생존의 억제를 초래할 수 있다.
본 명세서에 사용된 항체의 "면역특이적" 결합은 항체의 항원-결합 부위와 해당 항체에 의해 인식되는 특정 항원 사이에서 발생하는 항원 특이적 결합 상호작용을 지칭한다(즉, 항체는 ELISA 또는 다른 면역검정에서 단백질과 반응하고 관련되지 않은 단백질과 검출가능하게 반응하지 않으며, 부가적으로 이는 또한 발명의 항체가 또한 생체내 에피토프에서 표적 항원에 결합할 것임을 의미한다). 항체 또는 폴리펩티드에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"(본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)하는 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법도 당업계에 잘 알려져 있다. 분자가 대체 세포 또는 물질과 반응하는 것보다 상기 항원을 포함하는 특정 세포 또는 물질과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 결합하는 경우 항체는 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, TGFβ 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 에피토프 또는 비-TGFβ 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 이 에피토프에 결합하는 단백질이다.
항체 결합의 맥락에서 용어 "특이적으로"는 특정 항원, 즉 폴리펩티드 또는 에피토프에 대한 항체의 높은 결합력 및/또는 높은 친화도 결합을 지칭한다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체는 동일한 항체가 다른 항원에 결합하는 것보다 더 강하다. 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 약하지만 검출가능한 수준(예를 들어, 관심있는 폴리펩티드에 나타난 결합의 10% 이하)에서 다른 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 이러한 약한 결합 또는 배경 결합은, 예를 들어 적절한 대조군의 사용에 의하여, 대상체 폴리펩티드에 결합하는 특정 항체로부터 쉽게 식별할 수 있다. 일반적으로 특정 항체는 10.7 M 이하, 10-8 M 이하 10-9 M 이하, 10·10 M 이하, 10·11 M 이하, 10.12 M 이하, 또는 10.13 M 이하 등의 KD를 갖는 결합 친화도로 항원에 결합한다.
본 명세서에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원-결합 부위와 항원 결정자와의 결합 강도를 지칭한다. 친화도는 항체와 항원 결정자 사이의 입체화학적 적합의 접근성, 이들 사이의 접촉 영역의 크기, 하전된 소수성 그룹의 분포 등에 따라 달라진다. 항체 친화도는 평형 분석 또는 표면 플라스몬 공명 "SPR" 방법(예를 들어 BIACORE™)에 의해 측정될 수 있다. SPR 방법은 표면 플라즈몬 파동이 금속/액체 경계면에서 여기될 때 발생하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 현상에 의존한다. 빛은 샘플과 접촉하지 않는 표면 쪽을 향하고 반사되며, SPR은 각도와 파장의 특정 조합에서 반사된 빛의 강도에서의 감소를 야기한다. 이중분자 결합 이벤트는 SPR 신호의 변화로 검출되는 표면 층에서 굴절 지수에서의 변화를 야기한다.
본 명세서에 사용된 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 해리 상수 KD 및 회합 상수 Ka는 친화도의 정량적 척도이다. 평형상태에서, 유리 항원(Ag)과 유리 항체(Ab)는 항원-항체 복합체(Ag-Ab)와 평형상태를 이루고, 속도 상수 ka 및 kd는 개별 반응의 속도를 정량화한다. 평형상태에서 ka [Ab][Ag]=kd [Ag-Ab]. 해리 상수 Kd는 KD=kd/ka=[Ag][Ab]/[Ag-Ab]로 주어진다. KD는 농도의 단위, 가장 전형적으로 M, mM, μM, nM, pM 등을 갖는다. KD로 표시되는 항체 친화도를 비교할 때 TGFβ에 대한 친화도가 클수록 낮은 값으로 표시된다. 회합 상수 Ka는 Ka=ka/kd=[Ag-Ab]/[Ag][Ab]로 주어진다. Ka는 역농도의 단위, 가장 전형적으로 M-1, mM-1, μ.M-1, nM-1, pM-1, 등을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "결합력"은 가역적 복합체의 형성 후 항원-항체 결합의 강도를 지칭한다. 항-TGFβ 항체는 TGFβ 단백질에 그 결합에 대한 KD의 관점에서 "약(하위 KD 값) 내지 약(상위 KD 값)의 범위인 해리 상수(KD)"로 결합하는 것으로 특징화될 수 있다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있고 DNA 및 RNA에서 일련의 뉴클레오티드 염기("뉴클레오티드"라고도 함)를 지칭한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 이의 유사체를 함유할 수 있다. 용어 "핵산"에는, 예를 들어 단일-가닥 및 이중-가닥 분자가 포함된다. 핵산은, 예를 들어 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, DNA 분자(예를 들어 cDNA), RNA 분자(예를 들어 mRNA), 재조합 핵산, 플라스미드 및 기타 벡터, 프라이머 및 프로브일 수 있다. 5'에서 3'(센스) 및 3'에서 5'(안티센스) 폴리뉴클레오티드 둘 모두가 포함된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체에 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 접합에 의한 것과 같이 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형에는, 예를 들어 "캡", 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드 간 변형 예컨대, 예를 들어 비하전된 연결(예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결(예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티를 함유하는 것 예컨대, 예를 들어, 단백질(예를 들어 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신, 등), 인터칼레이터를 갖는 것(예를 들어 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 함유하는 것(예를 들어 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 연결을 갖는 것(예를 들어 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태가 포함된다. 더욱이, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나 표준 보호기에 의해 보호되거나 활성화되어 추가 뉴클레오티드에 대한 추가 연결을 생성할 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 1 내지 20 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실도 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환식 당 유사체, 아노머성 당, 에피머성 당 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체 예컨대 메틸 리보시드를 포함하여 당업계에 일반적으로 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대체 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), "(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")에 의해 대체되는 실시형태를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 선택적으로 에테르(-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜을 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드에서 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 선행하는 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본 명세서에 사용된 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심있는 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 바람직하게는 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예에는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜, 및 특정 진핵 세포 예컨대 생산자 세포에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에 기술된 벡터는 발현 조절 서열을 가지며 이는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사되는 핵산 서열에 '작동가능하게 연결'된다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다.
폴리펩티드가 보존적 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있는 것과 마찬가지로, 이의 폴리뉴클레오티드도 보존적 코돈 치환(들)을 함유할 수 있다. 코돈 치환은 코돈 치환이 발현되었을 때 상기 기술된 바와 같이 보존적 아미노산 치환을 생성하는 경우 보존적인 것으로 간주된다. 아미노산 치환을 초래하지 않는 축퇴 코돈 치환도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 유용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 실시형태에 유용한 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이로 형질전환되는 발현 숙주 세포에 의해 나타나는 코돈 사용 빈도에 근접하거나 달리 이의 발현을 개선하기 위해 축퇴 코돈 치환에 의해 돌연변이될 수 있다.
"변이체" 핵산은 본 명세서에서 "모" 핵산과 서열이 다른 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열 분기는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 추가와 같은 돌연변이 변화로 인해 발생할 수 있다. 이들 각 변화는 단독으로 또는 조합하여 주어진 순서대로 한 번 이상 발생할 수 있다.
용어 "단리된"은 물질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체 또는 핵산)이 그 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된다는 것을 의미한다. 그 자연 환경의 오염 성분은 물질에 대한 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 핵산과 관련하여, 단리된 핵산에는 정상적으로 염색체에서 회합되어 있는 5'에서 3' 서열로 분리된 것이 포함될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 물질은 물질의 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로 정제될 것이다. 물질의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 물질은 재조합 세포 내에 원 위치 물질을 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 물질은 본 명세서에 사용된 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어에는 모든 후속 세대인 그 자손도 포함된다. 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손이 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이종 핵산 서열을 발현시키는 맥락에서, "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내 위치 여부에 관계없이 원핵 또는 진핵 세포(예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, 포유동물 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포는 형질전환 동물에 위치될 수 있다. 숙주 세포는 벡터의 수용체로 사용될 수 있고 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 인코딩된 이종 핵산을 발현할 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용될 때 단어 "표지"는 항체 또는 핵산에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 자체 검출가능하거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"대상체" 또는 "환자"는 발명의 분자에 의해 영향을 받을 수 있는 치료가 필요한 동물을 지칭한다. 발명에 따라 치료될 수 있는 동물에는 척추동물, 특히 특히 바람직한 예인 개 또는 고양이와 같은 포유동물이 포함된다.
"조성물"은 화학적 조성물, 생물학적 조성물 또는 생물치료제(특히 본 명세서에 기술된 항체) 같은 활성제 및, 보조제와 같은 불활성(예를 들어, 표지) 또는 활성일 수 있는 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미하도록 의도된다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 발명에 사용하기에 적합한 "약학적으로 허용가능한 담체"는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 담체에는 물, 식염수, 완충 식염수, 인산염 완충액, 알코올/수성 용액, 유제 또는 현탁액이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 기타 통상적으로 이용되는 희석제, 보조제 및 부형제는 통상적인 기술에 따라 첨가될 수 있다. 이러한 담체에는 에탄올, 폴리올 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일 및 주사가능한 유기 에스테르가 포함될 수 있다. 완충액 및 pH 조절제가 또한 활용될 수 있다. 완충액에는, 제한 없이, 유기산이나 염기로부터 제조된 염이 포함된다. 대표적인 완충액에는, 제한 없이, 유기산염, 예컨대 구연산, 구연산염, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-Hel, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염, 트리스, 트리메탄민 염산염 또는 인산염 완충액이 포함된다. 비경구 담체에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정 오일이 포함될 수 있다. 정맥내 담체에는 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반된 것 등이 포함될 수 있다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제(예를 들어 EDTA), 불활성 가스 등과 같은 방부제 및 기타 첨가제도 약학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장성, 안정성 및 기타 통상적인 특징을 갖는 상기-기재된 성분으로부터 이들 약학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 당업계의 기술 내에 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, publ., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.sup.th edit., eds. R. C. Rowe 등, APhA Publications, 2003와 같은 텍스트를 참조한다.
"치료적으로 유효한 양"(또는 "유효량")은 대상체 또는 환자에게 투여될 때 유익하거나 원하는 결과를 가져오기에 충분한 활성 성분, 예를 들어 발명에 따른 작용제의 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 복용량으로 투여될 수 있다. 발명에 따른 조성물의 치료적으로 유효한 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "치료적으로 유효한 양"은 통증 감각에서의 완화 또는 감소와 같은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 가져오기에 충분한 TGFβ 관련된 병태(들)와 연관된 하나 이상의 매개변수에서 객관적으로 측정된 변화를 생성하는 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조성물의 유효량은 본 명세서에서 섬유증 장애, 뼈 장애 또는 세포 증식 장애로 정의되는 TGFβ 관련된 장애를 예방, 치료, 감소 또는 제거하기에 충분한 양이다. 치료적으로 유효한 양은 치료할 특정 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 선택된 특정 조성물, 이어지는 복용 섭생, 투여 시기, 투여의 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이들 모두는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료적"은 질환, 병태 또는 장애에 대한 치료의 전체 범위를 포괄한다. 발명의 "치료적" 작용제는 위험에 처해 있는 것으로 식별될 수 있는 표적 대상체에 대해 설계된 절차를 포함하는 것을 포함하는 예방적 또는 방지적 방식으로; 또는 본질적으로 개선적이거나 치료적인 방식으로 작용할 수 있거나; 또는 치료 중인 질환이나 장애의 적어도 하나의 증상의 진행의 속도나 정도를 늦추는 작용을 할 수 있다.
추가 양태에서, 발명은 본 발명의 항체가 치료적 또는 예방적 용도로 제공되는 수의학적 조성물을 특징으로 한다. 발명은 특정 항원, 예를 들어 질환 또는 병태와 연관된 항원을 가진 개 또는 고양이 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 발명의 항체와 함께 하나 이상의 TGFβ 단백질에 특이적인 항체의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.
발명의 항체는 대상체에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 발명의 화합물은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합하여 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여용 조성물은 선택된 투여 방식에 적합하도록 설계되고, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 및/또는 부형제 예컨대 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다.
발명의 항체를 포함하는 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 포함하는 표준 투여 기술을 사용하여 본 명세서에 기술된 병리 또는 장애를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 발명의 항체의 투여 경로는 비경구적일 수 있다. 주입은 전형적으로 정맥내 경로로 제공된다. 바람직하게는, 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 비경구라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여를 포함한다. 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달이 바람직하다. 더욱이, 발명의 방법의 대상체는 환자로도 지칭되고, 본 명세서에서는 개 또는 고양이로 기술된다.
본 명세서에 사용된 TGFβ 관련된 장애는 하나 이상의 TGFβ 단백질의 조절 또는 전체 수준이 결합 조직 장애, 섬유증/섬유증 장애, 뼈 장애 또는 세포 증식 장애를 초래하는 장애이다. TGFβ는 증식, 세포자멸사, 분화 및 염증을 포함한 다양한 세포 기능을 조절하므로 이들 단백질의 조절장애는 여러 가지의 명명된 장애를 유발할 수 있다.
본 명세서에 사용된 결합 조직 장애는 장기 및 기타 신체 부위를 지지하는 단백질-풍부 조직과 관련된 장애의 군을 지칭한다. 결합 조직의 예로는 지방, 뼈, 및 연골이 있다. 이들 장애는 종종 관절, 근육, 피부와 관련이 있지만, 눈, 심장, 폐, 신장, 위장관, 혈관을 포함한 다른 기관과 기관계도 관련될 수 있다.
본 명세서에 기술된 섬유증 관련 장애는 흉터 형성 및 조직 손상에 대한 반응으로 결합 조직에 의한 세포외 기질의 과잉 생산을 포함하는 병리학적 과정에 관한 것이다. 분자 과정은 정상적인 기관에서의 결합 조직 및 세포외 기질의 정상적인 형성과 다르지 않다. 생리학적으로, 섬유증은 결합 조직을 침착시키는 역할을 하며, 이는 밑에 있는 기관이나 조직의 정상적인 구조와 기능을 방해하거나 완전히 억제할 수 있다. 섬유증은 섬유 조직의 과도한 침착의 병리학적 상태뿐만 아니라 치유 시 결합 조직 침착의 과정을 기술하는데 사용될 수 있다. 세포외 기질(ECM) 단백질의 병리학적 축적으로 정의되는 섬유증은 영향받은 조직의 흉터 및 두꺼워짐을 초래하며, 이는 본질적으로 정상적인 기관 기능을 방해하는 과장된 상처 치유 반응이다. 섬유증 형성에는 많은 세포 유형과 사이토카인 간의 상호작용이 포함되고, 균형이 섬유화로 될 때 섬유증이 형성된다. 섬유증은 둘 모두가 콜라겐과 글리코사미노글리칸을 포함한 결합 조직을 내려놓는 자극된 섬유아세포를 포함한다는 점에서 흉터의 과정과 유사하다. 과정은 대식세포와 같은 면역 세포가 섬유아세포를 자극하는 가용성 인자를 방출할 때 시작된다. 가장 잘 특성화된 전-섬유화 매개체는 대식세포뿐만 아니라 간질이라고 불리는 표면 사이의 임의의 손상된 조직에 의해 방출되는 TGFβ이다. 본 명세서에 정의된 섬유성 병태는 낭성 및 특발성 폐섬유증 둘 모두를 포함하는 폐섬유증; 간경변; 뇌의 신경교 흉터, 무릎, 어깨 및 기타 관절의 관절섬유증, 후복막 섬유증, 전신 경화증(피부경화증), 및 특히 만성 신장 질환(CKD)으로 이어지는 신장 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 섬유증은 혈관, 피부, 폐, 신장, 심장 및 GI 관의 진행성 퇴행성 장애이고, 현재까지는 되돌릴 수 없는 과정으로 간주되어 전통적으로 항-염증제 및 면역억제제로 치료되어 왔으며, 이는 여러 번 해를 야기한다.
본 명세서에 기술된 만성 신장 질환(CKD)은 장기간의 진행성 섬유증 과정으로 인해 기능성 신장 조직의 손실을 수반한다. 신장의 구조적, 기능적 변화는 단지 느슨하게 연관되어 있지만 신장 구조에서 극적인 변화가 나타날 수 있다. 질환은 일반적으로 임상적으로 명백해지기 전 수개월 또는 수년 동안 존재하고 변함없이 되돌릴 수 없다. CKD의 많은 원인은 진행성 간질성 섬유증과 연관되어 있다. 간질성 섬유증의 중증도는 GFR에서 감소의 정도에 양으로 상관관계가 있고 예후와 음으로 상관관계가 있다. 전신성 CKD가 있는 동물에서 발견되는 사구체, 세뇨관간질 및 혈관 병변은 개시하는 원인에 관계없이 종종 유사하다. TGFβ는 근섬유아세포 활성화를 담당하는 가장 중요한 전-섬유화 매개자로 기술되었다. 이는 다른 많은 섬유화 요인의 효과를 통합하는 수렴 경로를 구동한다. TGFβ1은 가장 풍부한 이소형이며 신장의 모든 세포 유형에 의해 합성된다. TGFβ는 논의된 바와 같이 향섬유화 사이토카인으로 기능할 뿐만 아니라, 또한 뼈 리모델링을 제어하고 적절한 뼈 질량을 유지하기 위해 조골세포와 파골세포의 형성, 기능 및 세포-세포 상호작용에 영향을 미치는 풍부한 뼈 기질 단백질이기도 하고 TGFβ 억제는 CKD로 인한 이차 신장 부갑상선 기능항진증(SRHP) 동안 뼈의 탈회를 감소시키는 잠재적인 메커니즘이다는 것이 나타났다.
"치료" "치료하는" 등은 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 동물에는 이미 장애가 있는 동물뿐만 아니라 장애가 시작되거나 진행되는 것을 방지해야 하는 동물도 포함된다. 치료는 증상이나 병태의 발현을 지연하거나 발현의 심각성을 지연시키는 것으로 기술될 수도 있다. 용어 질환이나 장애의 "치료" 또는 "치료하는 것"은 질환이나 장애에 대한 예방 또는 보호(즉, 임상 증상이 전개되지 않도록 하는 것); 질환 또는 장애 억제(즉, 임상 증상의 발생을 정지 또는 억제 및/또는; 질환 또는 장애 완화(즉, 임상 증상의 퇴행 유발)를 포함한다. 인지된 바와 같이, 궁극적인 유도 사건 또는 사건들이 알려지지 않거나 잠재되어 있을 수 있기 때문에 질환이나 장애를 "예방"과 "억제"를 구별하는 것은 항상 가능하지는 않다. 따라서, 용어 "예방"은 "예방" 및 "억제" 둘 모두를 포괄하는 "치료" 유형을 구성하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "치료"는 따라서 "예방"을 포함한다.
본 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 설명된 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이고 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 개시된 발명은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(본 명세서에 기술된 용어 "항원 결합 단백질", "길항제 항체", "항체 단편" 등과 상호교환적으로 사용됨) 및 특히 그것이 개 또는 고양이이든, 재조합 방법, 하이브리도마 기술 또는 파지 디스플레이 기술에 의해 생산된 개화 또는 고양이화되든 또는 개 또는 고양이 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하여 모두가 TGFβRII 수용체에 결합하는 것을 방지하여 시그널링 경로가 TGFβ 단백질 중 하나에 의해 활성화되는 것을 방지한다는 점에서 길항제로서 작용하는 완전히 새로운 종으로 분화된 단클론 항체가 되든, 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 TGFβ1 및 TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하는 항체를 제공한다.
항체의 특성은 이들을 매우 매력적인 치료제로 만들지만 다수의 제한사항이 있다. 이전에 언급한 바와 같이, 대부분의 단클론 항체(mAb)는 설치류 기원이다. 그러한 항체가 다른 종에 투여될 때, 환자/대상체는 그러한 이종 항체에 대한 그 자신의 항체 반응을 나타낼 수 있다. 이러한 반응은 결국 항체의 중화 및 제거를 초래할 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, 항체의 생산이 마우스에만 제한되는 것은 아니지만 마우스는 단클론 항체 생산에 광범위하게 사용되고 있다. 개와 같은 종은 회수되고 특징화되는 항원 및 항체로 면역화될 수 있다. 예를 들어 원래 마우스에서 생성된 경우, 특정 종에 의해 생성된 항체를 사용할 때의 한 가지 문제점은 상기 항체로 치료받는 비-뮤어라인 대상체가 마치 그것이 이물질인 것처럼 마우스 항체에 반응하여 마우스 항체에 대한 새로운 항체 세트를 창출한다는 것이다. 마우스 항체는 비-뮤어라인 동물, 예를 들어 개(또는 다른 비-뮤어라인 종)에 의해 "인식"되며, 면역체계는 이종 항체를 이물질로 "인식"할 것이고 따라서 분자에 대한 면역 반응을 나타낼 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 항원 특이적 항체로 대상체를 치료할 수 있어야 하지만 사용하기에 특이적인 그 항체 종을 보유해야 할 필요성을 인식할 것이다. 예를 들어 개에게 투여되는 마우스 단클론 항체인, 종에 걸친 항체 투여로 인해 발생하는 반응의 일부는 발진과 같은 경미한 형태부터 신부전과 같은 보다 극단적이고 생명을 위협하는 반응까지의 범위일 수 있다. 이 면역 반응은 또한 치료의 효과를 감소시키거나 대상체에게 마우스 항체가 함유된 후속 치료가 제공되는 경우 향후 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 제시된 바와 같이, 발명의 항체의 "개화" 또는 "고양이화"에 의해 이 단점을 극복하기 위해 제시된다. 특히 이 과정은 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역에 초점을 맞추지만 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)을 또한 포함될 수 있다. 이 과정에 대한 실행 가능 단계 및 감소는 본 개시내용에 기재되어 있고 CDR의 서열 주변의 친화도 성숙의 과정은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
다른 종에 대한 치료적 투여를 위해 동물로부터 단클론 항체(본 명세서에 기술된 항체, 길항제 항체 등 및 상호교환적으로 사용되는 용어)를 변형하여 낮은 면역원성을 부여하는 과정이 적극적으로 추구되어 왔으며 다수의 간행물에 기술되어 있다(예를 들어 Antibody Engineering: A practical Guide. Carl A. K. Borrebaeck ed. W.H. Freeman and Company, 1992). 그러나, 이 과정은 최근까지 비-인간에 대한 치료법이나 진단법의 개발에 일상적으로 적용되지 않았다. 실제로 개, 고양이 또는 기타 종-특이적 가변 도메인에 관해 발표된 내용은 거의 없었다. Wasserman and Capra, Biochem. 6, 3160 (1977)에서는 개과 중쇄 둘 모두의 가변 영역의 아미노산 서열을 결정하였다. Wasserman and Capra, Immunochem. 15, 303 (1978)에서는 개 IgA로부터 κ 경쇄의 아미노산 서열을 결정하였다. McCumber and Capra, Mol. Immunol. 16, 565 (1979)에는 개 뮤 사슬의 완전한 아미노산 서열을 개시한다. Tang 등, Vet. Immunology Immunopathology 80, 259 (2001)에는 단일 개 IgG-A y 사슬 cDNA 및 4개의 개 IgG-A y 사슬 단백질 서열을 개시한다. Bergeron 등은 4개의 개 중쇄의 기능적 특성을 기술한다. 현재까지 개 항체에 대해 이용할 수 있는 정보가 부족하여 개 질환 치료를 위한 치료제로서의 개발이 방해를 받았다.
이들 언급된 제한은 치료적 항체의 "인간화"의 관점에서 당업자에게 잘 알려진 "새로운 종으로 분화"로 알려진 공학 기술의 개발을 촉발시켰다. 항체의 "개화", "고양이화", "인간화"는 "새로운 종으로 분화"의 기술의 몇 가지 예이다. 이들 분자는 비-표적 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 항체 또는 단편으로 생성된다. 예를 들어, 수용체/표적의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 잔기가 특이성, 친화도 및 효력과 같은 원하는 특성을 갖는 마우스와 같은 비-표적 종의 CDR(즉, "공여자 항체" 또는 "원래하는 종 항체")으로부터 잔기에 의해 대체되는 개화된 항체("표적 종 항체"). 이 전략은 가장 적합한 표적(CDR 이식을 위한 생식세포 항체 서열)을 식별하는 데 기반을 둔다. 가변 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 이용가능한 모든 생식세포 서열의 광범위한 분석에 이어서, 생식계열 후보는 마우스/공여자 mAb와의 상동성을 기준으로 선택되고, 마우스/공여자 전구체 mAb의 CDR을 사용하여 천연 개 CDR을 대체했다. 목표는 치료제로 사용되는 경우 항상 높은 친화도와 최종 생체내 효능을 유지하는 것이다. 개 항체 프레임워크를 사용하면 일반적으로 개에게 투여할 때 생체내 면역원성의 가능성이 최소화할 것이다. 그러나 일부 경우에는, 개 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 감소된 친화도 또는 기능이 관찰될 때 상응하는 비-개 잔기에 의해 대체된다. 언급된 바와 같이, 선택된 표적 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 역돌연변이는 친화도를 회복 및 또는 개선하기 위해 필요할 수 있다. US 7,261,890에 기술된 바와 같이, 개화 및 친화도 성숙을 위해 구조-기반 방법을 이용할 수도 있다. 상기 설명에서는 개를 표적 종으로, 마우스를 공여자 종으로 사용했다. 새로운 종으로 분화된 항체는 이들 표적과 공여자에 제한되지 않다. 고양이 등을 표적 종으로 사용할 수 있다.
단백질을 표적화하는 치료적 항체를 개발하기 위한 또 다른 과제는 다른 종에서의 상동 단백질에 대한 에피토프가 종종 다르고 다른 단백질과의 교차-반응에 대한 가능성도 다르다는 것이다. 결과적으로, 치료되는 특정 종에서의 특정 표적에 대한 항체를 만들고 테스트하고 개발해야 한다. 서로 다른 종에서 상동 표적 간의 항체 결합은 예측할 수 없고 효능에 대한 테스트와 평가가 필요하다.
항체는 항체 분자의 가변 영역과의 상호작용에 의해 항원 상의 특정 에피토프의 그 결합을 통해 항원을 표적화한다. 더욱이, 항체는 다양한 생물학적 활성을 매개, 억제(본 발명의 길항적 항-TGFβ 항체의 경우에서와 같음) 및/또는 개시하는 능력을 갖는다. 치료적 항체에는 광범위한 기능이 있으며, 예를 들어 항체는 효능제 또는 길항제로서 수용체-리간드 상호작용을 조절할 수 있다. 항체 결합은 세포 성장, 사이토카인 생산 또는 세포자멸사를 자극하기 위해 세포내 시그널링을 개시할 수 있다. 항체는 Fc 영역에 결합된 작용제를 특정 부위로 전달할 수 있다. 항체는 또한 ADCC, CDC 등을 도출하는 세포에서 각 분자에 항체의 Fc 영역의 결합을 통해 항체-매개된 세포독성(ADCC), 보체-매개된 세포독성(CDC) 및 식세포작용을 도출한다. ADCC, CDC, C1q 결합 및 식세포작용 기능이 제거된 곳에서 변경된 항체가 또한 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항체의 효과기 기능을 변경시키는 상기 항체의 Fc 영역에서의 변경을 포함하는 항체를 제공한다. 본 발명은 발명의 항체를 발현하는 세포 및 세포주를 추가로 제공한다. 대표적인 숙주 세포에는 박테리아, 효모, 포유동물 및 인간 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 및 COS 세포가 포함된다. 이종 작제물을 숙주 세포 안으로 형질전환시킨 후 안정한 세포주를 생성하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 비-포유동물 숙주 세포에는 곤충 세포가 포함된다(Potter 등 (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112). 항체는 또한 형질전환 동물(Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) 및 형질전환 식물(Schillberg 등 (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45)에서 생산될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 예를 들어 항체, 예를 들어 불변 영역의 다른 부분을 결실, 추가 또는 대체함에 의해 변형된 단클론, 키메라, 종 특이적 및 새로운 종으로 분화된 항체도 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 항체는 다음과 같이 변형될 수 있다: (i) 불변 영역을 결실함에 의해; (ii) 불변 영역을 또 다른 불변 영역, 예를 들어 항체의 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키기 위한 불변 영역, 또는 다른 종 또는 항체 클래스로부터의 불변 영역으로 대체함에 의해; 또는 (iii) 예를 들어 글리코실화 부위의 수, 효과기 세포 기능, Fc 수용체(FcR) 결합, 보체 고정화 등을 변경하기 위해 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산을 변형함에 의함. 본 발명의 일 실시형태에서, 발명의 항체는 항체의 효과기 기능을 변경시키는 변경된 Fc 영역을 포함한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서 발명의 항체의 Fc 영역은 대체, 변형 또는 제거되었다.
항체 불변 영역을 변경하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 변경된 기능, 예를 들어 세포 상의 FcR과 같은 효과기 리간드 또는 보체의 C1 성분에 대한 변경된 친화도를 갖는 항체는 항체의 불변 부분에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 대체함에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, EP388151 A1, 미국 특허 번호 5,624,821 및 미국 특허 번호 5,648,260을 참조하며, 그 내용은 모두 본 명세서에 참조로 포함됨).
예를 들어, 특정 잔기(들)를 그 측쇄 상에 적절한 기능성을 갖는 잔기(들)로 대체함에 의해, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트와 같은 하전된 작용기를 도입하거나, 혹은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌과 같은 방향족 비-극성 잔기를 도입함에 의해 FcR(예를 들어 Fc.감마 R1) 또는 C1q 결합에 대한 항체의 Fc 영역의 친화도를 변경하는 것이 가능하다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821 참조). 항체 또는 이의 결합 단편은 세포독소, 치료제 또는 방사성 금속 이온과 접합될 수 있다. 일 실시형태에서, 접합되는 단백질은 항체 또는 이의 단편이다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다. 비-제한적인 예에는 칼리케아미신, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제에는 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈 및 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP), 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신) 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 모이어티를 단백질에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
조성물, 유래된 조성물, 및 조성물을 제조하는 방법
본 발명은 항체(본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "항원 결합 단백질", "항체 단편", "길항제 항체" 등), 폴리펩티드 및 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 포괄한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 조성물은 하나 이상의 TGFβ 단백질에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드, 및/또는 하나 이상의 TGFβ 단백질에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 널리 공지된 완충액을 포함하는 약학적/수의학적으로 허용가능한 부형제와 같은 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 발명은 또한 단리된 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 실시형태를 포괄한다. 발명은 또한 실질적으로 순수한 항체, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 실시형태를 포괄한다.
하나 이상의 실시형태에서, 본 발명은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 단백질에 결합하는 된리된 항체 및 재조합 항체로, 여기서 가변 중쇄는 본 명세서에 기술된 발명의 항체의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 가변 경쇄는 본 명세서에 기술된 발명의 항체를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 및 상기 항체의 가변 경쇄 또는 가변 경쇄 중 임의의 것 내의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 적어도 하나에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 제공한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 일부 실시형태에서 재조합 항체, 단클론 항체, 및 항체 단편과 임상적 투여 및 진단 절차를 비롯한 과학적 절차에서의 이의 용도를 제공한다. 분자생물학의 방법과 재조합 기술의 사용으로, 재조합 수단으로 항체 및 항체-유사 분자를 생산하고 이에 의해 항체의 폴리펩티드 구조에서 발견되는 특정 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 항체는 상기 항체의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 유전자 서열을 클로닝하거나, 합성된 사슬을 조립하여 특정 에피토프 및 항원 결정자에 대한 친화도를 갖는 활성 사량체(H2L2) 구조를 형성함으로 상기 폴리펩티드 사슬의 직접적인 합성에 의해 생산될 수 있다. 이는 상이한 종 및 소스로부터의 중화 항체의 특징적인 서열을 갖는 항체의 용이한 생산을 허용했다.
항체의 소스, 항체가 구성되는 방법 또는 합성되는 방법, 시험관내 또는 생체내, 형질전환 동물을 사용하는 것, 실험실 또는 상업적 크기의 대규모 세포 배양을 사용하는 것, 형질전환 식물을 사용하는 것, 과정의 임의의 단계에서 살아 있는 유기체를 이용하지 않고 직접 화학적 합성에 의한 것에 관계없이, 모든 항체는 전체적으로 유사한 3차원 구조를 가지고 있다. 이 구조는 종종 H2L2로 제공되고 항체가 일반적으로 2개의 경(L) 아미노산 사슬과 2개의 중(H) 아미노산 사슬로 구성된다는 사실을 나타낸다. 두 사슬 모두 구조적으로 상보적인 항원 표적과 상호작용할 수 있는 영역을 가지고 있다. 표적과 상호작용하는 영역은 "가변" 또는 "V" 영역으로 지칭되고 다른 항원 특이성의 항체와 아미노산 서열에서의 차이를 특징으로 한다. H 또는 L 사슬의 가변 영역은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유한다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 영역"은 항원과 상호작용하고 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 항체 결합 영역은 항원-결합 잔기의 적절한 형태를 유지하는데 필요한 '프레임워크' 아미노산 잔기를 포함한다. 항원 결합 영역을 제공하는 H 또는 L 사슬의 가변 영역 내에는 서로 다른 특이성을 갖는 항체 사이의 극도의 가변성으로 인해 "초가변"이라고 불리는 더 작은 서열이 있다. 이러한 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 영역으로도 지칭된다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정 구조에 대한 항체의 기본 특이성을 설명한다.
CDR은 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속적인 스트레치를 나타내지만 종에 관계없이, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내의 이들 중요한 아미노산 서열의 위치 국지화는 가변 사슬의 아미노산 서열 내에서 유사한 국지화를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR 영역을 가지며, 각각은 다른 것과 비-인접성이다. 모든 포유동물 종에서, 항체 펩티드는 불변(즉, 고도로 보존된) 영역과 가변 영역을 함유하고, 후자 내에는 CDR과 CDR 외부이지만 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내의 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이 있다.
본 발명은 상기 기재된 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 특정 아미노산을 인코딩하는데 하나 초과의 코돈이 사용될 수 있다. 유전자 코드를 사용하여 하나 이상의 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 식별할 수 있으며, 그 각각은 아미노산을 인코딩할 수 있다. 실제로 특정 올리고뉴클레오티드가 실제 인코딩 서열을 구성할 확률은 비정상적인 염기 페어링 관계와 특정 코돈이 항-TGFβ 항체 또는 부분을 발현하는 진핵 또는 원핵 세포에서 (특정 아미노산을 인코딩하기 위해) 실제로 사용되는 빈도를 고려하여 추정할 수 있다. 이러한 "코돈 용법 규칙"은 Lathe, 등, 183 J. Molec. Biol. 1-12(1985)에 기술되어 있다. Lathe의 "코돈 용법 규칙"을 사용하여, 항-TGFB 서열을 인코딩할 수 있는 이론상 "가장 가능성 있는" 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열 세트를 식별할 수 있다. 또한 본 발명에 사용하기 위한 항체 코딩 영역은 본 명세서에 기술된 항체 및 펩티드의 변이체(효능제)를 초래하는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 기존 항체 유전자를 변경함에 의해 제공될 수도 있는 것으로 의도된다. 이러한 변이체에는 항-TGFβ 항체 또는 펩티드의 아미노산 서열의 결실, 첨가 및 치환이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
항체 유도체
본 발명의 범주에는 항체 유도체가 포함된다. 항체의 "유도체"에는 일반적으로 단백질의 일부가 아닌 추가 화학적 모이어티가 함유되어 있다. 단백질의 공유 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 변형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 작용제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 항체 또는 단편을 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 기타 거대분자 담체에 가교시키는데 유용하다.
유도체에는 표지된 방사성 표지 단클론 항체도 포함된다. 예를 들어, 방사성 요오드(251,1311), 탄소(4C), 황(35S), 인듐, 삼중수소(H3) 등으로; 비오틴 또는 아비딘과, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코아밀라제, 카르복실산 탈수효소, 아세틸콜린 에스테라제, 리소자임, 말레이트 탈수소효소 또는 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소와 같은 효소와 단클론 항체의 접합체; 및 또한 생물발광제(예컨대 루시퍼라제), 화학발광제(예컨대 아크리딘 에스테르) 또는 형광제(예컨대 피코빌리단백질)와 단클론 항체의 접합체.
본 발명의 또 다른 유도체 이중기능성 항체는 2개의 상이한 항원 그룹을 인식하는 2개의 개별 항체의 부분을 조합함에 의해 생성된 이중특이적 항체이다. 이는 가교 또는 재조합 기술에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 생체내 반감기를 증가시키기 위해 항체 또는 이의 일부에 모이어티를 첨가할 수 있다(예를 들어, 혈류에서 청소되는 시간을 늘림에 의함. 이러한 기술에는 예를 들어 PEG 모이어티를 첨가하는 것(페길화라고도 함)이 포함되고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 20030031671 참조.
항체의 재조합 발현
일부 실시형태에서, 발명의 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 안으로 직접적으로 도입되고, 세포는 인코딩된 항체의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에서 인큐베이션된다. 대상 핵산이 세포 안으로 도입된 후, 세포는 전형적으로 항체 발현을 허용하기 위해 약 1-24시간 동안, 때로는 선택 하에서, 정상적으로 37℃에서 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 항체는 세포가 성장하고 있는 배지의 상등액으로 분비된다. 전통적으로, 단클론 항체는 뮤어라인 하이브리도마 계통에서 천연 분자로 생산되었다. 그 기술에 더하여, 본 발명은 단클론 항체의 재조합 DNA 발현을 제공한다. 이는 선택된 숙주 종에서 상기 항체뿐만 아니라 다양한 항체 유도체 및 융합 단백질의 생산을 허용한다.
DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 이러한 서열이 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있는 경우 폴리펩티드를 "발현할 수 있다"고 언급된다. 작동가능한 연결은 조절 DNA 서열과 발현시키려는 DNA 서열이 회수가능한 양에서 항-TGFβ 항체 또는 항체 단편으로서 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되어 지는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 특성은 유사한 분야에 잘 알려진 바와 같이 유기체마다 다를 수 있다.
따라서 본 발명은 항-TGFβ 항체의 발현, 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 발현을 포괄한다. 적합한 숙주에는 생체내 또는 현장에서 박테리아, 효모, 곤충, 진균, 새 및 포유동물 세포를 포함하는 박테리아 또는 진핵생물 숙주, 또는 포유동물, 곤충, 새 또는 효모 기원의 숙주 세포가 포함된다. 포유동물 세포 또는 조직은 인간, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 소, 돼지, 양, 말, 염소, 도그 또는 캣트 유래일 수 있으나, 임의의 다른 포유동물 세포도 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라, 새로운 종으로 분화된 항체 작제물 또는 항-TGFβ 항체를 담지하는 발현 벡터는 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 인산칼슘-침전, 및 디에틸아미노에틸(DEAE) 덱스트란과 같은 다중양이온으로 적용과 같은 생화학적 수단, 및 전기천공, 직접 미세주입 및 미세발사체 충격과 같은 기계적 수단을 포함한 임의의 다양한 적절한 수단에 의해 적절한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. Johnston et at, 240 Science 1538 (1988) 또는 제한 없이 당업자에게 공지된 다른 기술
재조합 항체의 장기간, 고수율 생산을 위해서는 안정적인 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 면역글로불린 발현 카세트 및 선택가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후 조작된 세포를 농후화된 배지에서 성장시킨 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 재조합 플라스미드에서의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체 안으로 안정적으로 통합하고 성장하여 차례로 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점을 형성하도록 한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물/성분의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
발명의 항체가 생산되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 이에 제한되지 않지만 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체는 세포로부터 배양 배지 안으로 분비되고 배양 배지로부터 수확된다.
약학적 및 수의학 적용
본 명세서에 기재된 바와 같은 발명의 항-TGFβ 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 개 및 고양이에서의 TGFβ 관련된 장애의 치료에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 활성 성분으로서 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 항체는 다양한 비-인간 종을 수용하기 위한 키메라, 이종키메라, 개화된 또는 고양이화된 항체일 수 있다. 온전한 면역글로불린 또는 이의 결합 단편도 구상된다. 본 발명의 항체 및 이의 약학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 피하로, 근육내로 또는 정맥내로 투여에 유용하다.
일부 원하는 실시형태에서, 발명의 항체는 비경구 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여의 경우, 항-TGFβ 항체 또는 단편은 약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 회합하여 용액, 현탁액, 유제 또는 동결건조된 분말로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 비히클은 이에 제한되지는 않지만, 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 트레할로스 또는 수크로스 용액, 또는 혈청 알부민, 글리신 등과 같은 수성 담체와 같은 허용가능한 담체에 용해된 항체 또는 이의 칵테일의 용액일 수 있다. 리포솜 및 비-수성 비히클 예컨대 고정 오일이 또한 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되어 있으며 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들 조성물은 통상적이고 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리적 조건을 근사화하는데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 중 항체의 농도는 예를 들어 중량으로 약 0.5% 미만, 일반적으로 적어도 약 1%에서 최대 15% 또는 20%까지 매우 다양할 수 있으며 주로, 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 기반하여 선택될 것이다. 비히클 또는 동결건조된 분말에는 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충액 및 방부제)을 유지하는 첨가제가 함유될 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기술에 의해 멸균된다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이고, 예를 들어 REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)에 더 자세히 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용 이전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다. 이 기술은 기존의 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있고 이를 보상하기 위해 사용 수준을 조정해야 할 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 본 발명의 항체 조성물은 기존 질환에 대한 재발의 예방 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있는 이의 칵테일을 제공할 수 있다. 적합한 약학적 담체는 당업자에게 잘 알려진 다른 참고문헌 중에서 이 분야의 표준 참고 문헌인 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES의 최신판에 기재되어 있다. 치료 적용에서, 조성물은 이미 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 질환 또는 병태 및 그 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지 또는 완화시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 '치료적으로 유효한 용량' 또는 '치료적으로 유효한 양'으로 정의된다.
투여되는 복용량은 물론 특정 작용제의 약력학적 특성, 그 투여의 방식 및 경로; 수령체의 나이, 건강 및 체중; 증상의 성격 및 정도 동시 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과와 같은 알려진 요인에 따라 달라질 수 있다.
비-제한적인 예로서, 도그와 캣트에서의 TGFβ-관련된 병리학 치료는 필요에 따라 복용량 범위로 제공될 수 있다. 개 또는 고양이 치료적 용도를 위한 항체의 예는 본 발명에 따른 강력한 생체내 항-TGFβ 활성을 갖는 고친화도 항체, 및 이의 단편, 영역 및 유도체이다. 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 수의사가 선택하는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어쨌든, 약학적 제형은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 항체(들)를 제공해야 한다.
진단적 적용
본 발명은 또한 종, 특히 TGFβ 관련된 장애가 있는 것으로 알려져 있거나 의심되는 개 및 고양이에서 TGFβ를 검출하기 위한 진단 방법에 사용하기 위한 상기 항-TGFβ 항체를 제공한다. 본 발명의 항-TGFβ 항체는 샘플에서 하나 이상의 TGFβ 또는 항-TGFβ 항체를 검출하거나 정량화하는 면역검정에 유용하다. TGFβ에 대한 면역검정은 전형적으로 TGFβ에 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 검출가능하게 표지된 높은 친화도(또는 높은 결합력) 항-TGFβ 항체의 존재에서 임상적 또는 생물학적 샘플을 인큐베이션하는 것 및 샘플에서 결합된 표지된 펩티드 또는 항체를 검출하는 것을 포함한다. 다양한 임상 검정 절차가 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 샘플에는 동물 대상체로부터 수집되어 당업자에게 알려진 ELISA 분석을 거친 조직 생검, 혈액, 혈청 및 배설물 샘플, 또는 액체가 포함된다.
"고체상 지지체" 또는 "담체"는 펩티드, 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 지칭한다. 잘-알려진 지지체 또는 담체에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석이 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적에 따라 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 하나 이상의 TGFβ 단백질 또는 항-TGFβ 항체에 결합할 수 있는 한 사실상 임의의 가능한 구조적 형상을 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형상은 비드와 같은 구형이거나 테스트 튜브의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면과 같은 원통형일 수 있다. 대안적으로 표면은 시트, 배양 접시, 테스트 스트립 등과 같이 편평할 수 있다. 예를 들어, 지지체에는 폴리스티렌 비드가 포함될 수 있다. 당업자는 항체, 펩티드 또는 항원을 결합하는데 적합한 다른 많은 담체를 알거나 일상적인 실험에 의해 이를 확인할 수 있다. 잘 알려진 방법 단계는 주어진 로트의 항-TGFβ 펩티드 및/또는 항체의 결합 활성을 결정할 수 있다. 당업자는 일상적인 실험에 의해 작동 및 최적 검정 조건을 결정할 수 있다.
TGFβ-특이적 펩티드 및/또는 항체를 검출가능하게 표지하는 것은 효소 면역검정(EIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 사용하기 위해 효소에 연결함에 의해 달성될 수 있다. 연결된 효소는 노출된 기질과 반응하여 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 분광광도계, 형광계 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성한다. 본 발명의 TGFβ-특이적 항체를 검출가능하게 표지하는데 사용될 수 있는 효소에는 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타5-스테로이드 이성질화효소, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 삼당 인산 이성질화효소, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-인산 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. TGFβ-특이적 항체를 방사성 표지함에 의해, 방사면역검정(RIA)의 사용을 통해 TGFβ를 검출하는 것이 가능하다. 방사성 동위원소는 감마 계수기나 섬광 계수기의 사용과 같은 수단 또는 자동방사선 촬영법에 의하여 검출될 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소에는 3H, 125I,131I, 35S 및 14C가 포함된다.
TGFβ-특이적 항체를 형광 화합물로 표지하는 것이 또한 가능하다. 형광 표지된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출되면, 형광으로 인해 그 다음 그 존재를 감지할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 형광 표지 화합물 중에는 당업자에게 공지되어 있는 것 중에서 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민이 있다. TGFβ-특이적 항체는 125Eu 또는 기타 란타족 계열과 같은 형광-방출 금속을 사용하여 검출가능하게 표지할 수도 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 사용하여 TGFβ 특이적 항체에 부착될 수 있다.
TGFβ-특이적 항체는 또한 화학발광 화합물과의 커플링에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광으로 표지된 항체의 존재는 그 다음 화학 반응 과정에서 발생하는 발광의 존재를 검출함에 의해 결정된다. 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
마찬가지로, 생물발광 화합물을 사용하여 본 발명의 TGFβ-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드 또는 유도체를 표지할 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함에 의해 결정된다. 라벨링의 목적으로 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제 및 에쿼린이다.
TGFβ-특이적 항체, 부분, 단편, 폴리펩티드 또는 유도체의 검출은, 예를 들어 검출가능한 표지가 방사성 감마 방사체인 경우 섬광 계수기에 의해, 또는 예를 들어 표지가 형광 물질인 경우 형광계에 의해 달성될 수 있다. 효소 표지의 경우, 효소에 대한 기질을 이용하는 비색법에 의해 검출이 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소 반응의 정도를 시각적으로 비교함에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 검정에 의해 검출된 TGFβ는 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. TGFβ를 함유하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 림프, 소변, 대변, 염증성 삼출물, 뇌척수액, 양수, 조직 추출물 또는 균질액 등과 같은 생물학적 유체뿐만 아니라 임의의 생검 관련된 물질이다. 발명은 이들 샘플만을 사용하는 검정에 제한되지 않지만, 본 명세서에 비추어 당업자가 다른 샘플의 사용을 허용하는 적합한 조건을 결정하는 것이 가능하다.
현장 검출은 동물 대상체로부터 조직학적 표본을 제거하고 이러한 표본에 본 발명의 표지된 항체의 조합을 제공함에 의해 달성될 수 있다. 항체(또는 이의 일부)는 표지된 항체(또는 일부)를 생물학적 샘플에 적용하거나 중첩함에 의해 제공될 수 있다. 이러한 절차의 사용을 통해, TGFβ의 존재뿐만 아니라 검사된 조직에서의 TGFβ의 분포를 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 그러한 현장 검출을 달성하기 위해 임의의 다양한 조직학적 방법(예컨대 염색 절차)이 변형될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
본 발명의 항체, 단편 또는 유도체는 "2-부위" 또는 "샌드위치" 검정으로도 알려진 면역측정 검정에서의 활용에 적합할 수 있다. 전형적인 면역측정 검정에서, 표지되지 않은 항체(또는 항체 단편)의 양이 시험되는 유체에서 불용성인 고체 지지체에 결합되고, 검출가능하게 표지된 가용성 항체의 양이 고체상 항체, 항원, 표지된 항체 사이에 형성된 삼원 복합체의 검출 및/또는 정량화를 허용하기 위해 첨가된다.
항체는 샘플에서 하나 이상의 TGFβ 단백질을 정량적으로 또는 정성적으로 검출하거나 하나 이상의 TGFβ 단백질을 발현하는 세포의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이는 형광 현미경검사, 유세포분석 또는 형광측정 검출과 커플링된 형광으로 표지된 항체(아래 참조)를 이용하는 면역형광 기술에 의해 수행될 수 있다. 진단 목적을 위해 항체는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되지 않은 항체는 개 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 같이 항체와 반응성인 다른 표지된 항체(제2 항체)와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로 항체는 직접적으로 표지될 수 있다. 방사성핵종, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히 합텐) 등과 같은 다양한 표지가 이용될 수 있다. 이전에 논의된 것과 같은 다양한 유형의 면역검정이 이용가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 중요하게도, 본 발명의 항체는 개 및 고양이에서 TGFβ 관련된 장애를 진단하는데 도움이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 항체/본 발명의 항체는 반려동물에서 TGFβ의 과발현을 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 중요한 면역조직화학 도구를 제공할 수 있다. 본 발명의 항체는 유전자 발현 프로필을 측정하는데 매우 적합한 항체 어레이 및 당업자에게 잘 알려진 기타 진단 도구에 사용될 수 있다.
키트
또한 본 발명의 범주에는 대상 방법을 실행하기 위한 키트가 포함된다. 키트는 적어도 하나 이상의 본 발명의 항체, 이를 인코딩하는 핵산, 또는 이를 함유하는 세포를 포함한다. 본 발명의 항체는 일반적으로 동결건조된 형태로 용기에 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 접합되거나 접합되지 않을 수 있는 항체는 전형적으로 트리스, 인산염, 탄산염 등과 같은 완충액, 안정제, 살생물제, 불활성 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민 등과 함께 키트에 포함된다. 일반적으로, 이들 물질은 활성 항체의 양을 기준으로 5중량% 미만으로 존재할 것이고 일반적으로 전체 양에서 다시 항체 농도를 기준으로 적어도 약 0.001중량%로 존재할 것이다. 흔히, 활성 성분을 희석하기 위해 불활성 증량제 또는 부형제를 포함시키는 것이 바람직할 것이며, 여기서 부형제는 전체 조성물의 약 1중량% 내지 99중량%로 존재할 수 있다. 일차 항체에 결합할 수 있는 제2 항체가 검정에 이용되는 경우 이는 일반적으로 별도의 바이알에 존재할 것이다. 제2 항체는 전형적으로 표지에 접합되고 상기 기재된 항체 제형과 유사한 방식으로 제형화된다. 키트에는 일반적으로 사용 지침 세트도 포함된다.
본 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 기술된 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 다양할 수 있지만 당업자에게 잘 알려져 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것이고 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다. 이제 발명은 아래의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되고 뒷받침된다. 그러나, 이들 실시예는 결코 발명의 범주를 더 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 반대로, 당업자는 본 발명의 사상 및/또는 첨부된 청구범위의 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 실시형태, 변형 및 등가물이 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1:
항-TGFβ 1,2,3 항체
항-TGFβ1,2,3 GC1008 항체(VH: 서열번호 74 및 VH: 서열번호 75)는 본 명세서에 기술된 개화 및 고양이화 기술 둘 모두를 사용하여 새로운 종으로 분화되었다.
GC1008 단클론 항체에 대한 6개의 CDR은 다음과 같다:
표 1
재조합 인간의 구축: 고양이 키메라
항체 가변 도메인은 항원 결합을 담당하고 따라서 GC1008 항체의 전체 가변 도메인을 다른 불변 영역, 예를 들어 다른 종으로부터의 불변 영역에 이식하는 것은 고양이 TGFβ 단백질에 결합하는 항체의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않아야 한다. 이와 같이, 발현 벡터는 포유동물 발현 시스템에서 재조합 키메라 항체를 생산하도록 설계되었다. 본 명세서에 기술된 키메라 항체는 다른 종으로부터 IgG 분자의 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 상에 이식된 숙주 종 항체로부터의 가변 서열(CDR 및 프레임워크 둘 모두)로 구성된다. 예를 들어, 인간화된 항체로부터의 가변 영역, 예를 들어 서열번호: 79 및 서열번호 80과 고양이 종으로부터의 중쇄 불변 영역(아미노산 서열번호 75)은, 본 명세서에서 인간: 고양이 키메라로 지칭될 수 있다. 원하는 키메라 항체를 생성하기 위해, 포유동물 세포주로부터 재조합 항체의 발현 및 분비를 촉진하기 위한 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위, Kozak 컨센서스 서열 및 N-말단 분비 리더를 함유하는 선택된 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열에 대해 합성 DNA 서열을 구축했다.
본 명세서에서 felchimGC1008로 지칭되는, 인간: 고양이 GC1008 키메라의 경우, 인간 가변 영역(서열번호: 79 및 80)을 고양이 IgG 중쇄(서열번호: 75) 또는 경쇄 불변 영역(서열번호 83)을 함유하는 포유동물 발현 플라스미드 안으로 클로닝했다. CMV 프로모터의 제어 하에 각각의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드를 표준 방법을 사용하여 HEK 293 세포 안으로 공동-형질감염시켰다(서열번호 1 및 서열번호 2). 발현 6일에 이어서, 단백질 정제를 위한 표준 방법에 따라 MabSelect Sure 단백질 A 수지(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 일시적으로 형질감염된 HEK293FS 세포 상등액 50ml로부터 키메라 mAb를 정제했다. 용리된 분획을 중화시키고, 10,000 공칭 MW 컷오프 Amicon Ultra 원심분리 장치(Millipore Sigma, 매사추세츠주 벌링턴 소재)를 사용하여 ~0.5-1.0mL로 농축하고, 20mM 아세트산 나트륨 pH 5.0, 85g/L 수크로스, +/- 0.05g/L EDTA에서 4℃에서 밤새 투석하고, 추가 사용을 위해 4℃에서 보관했다.
항체 GC1008의 개화
항-약물 항체(ADA)의 생성은 단클론 항체를 포함한 임의의 생체치료 단백질의 효능의 상실과 연관되어 있다. 면역원성 완전 인간 mAb 및 비-면역원성 키메라 mAb의 예가 발견될 수 있지만, 단클론 항체의 새로운 종으로 분화는 mAb가 면역원성으로 되는 경향을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 제공된 GC1008 단클론 항체에 대한 ADA 형성과 연관된 위험을 완화하는데 도움을 주기 위해, 개화 전략이 이용되었다. 이 개화 전략은 CDR 이식에 가장 적합한 개 생식계열 항체 서열을 식별하는데 기반을 두고 있다. 가변 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대해 이용가능한 개 생식계열 서열의 광범위한 분석에 이어서, 생식계열 후보는 GC1008 항체 가변 영역의 프레임워크 영역에 대한 그 상동성을 기준으로 선택되었고, CDR(VH 서열번호 23, 33 및 39 및 VL 서열번호 3,4,5)을 사용하여 천연 개 CDR을 대체하였다. 목표는 생체내 면역원성의 가능성을 최소화하기 위해 개 항체 프레임워크를 사용하여 높은 친화도와 세포-기반 활성을 유지하는 것이었다.
개화된 GC1008 항체에 대한 개화된 가변 중쇄 및 경쇄를 나타내는 합성 뉴클레오티드 작제물을 제조하였다. 초기에 4개의 개 가변 중쇄(VH2, 3, 4 및 6)와 4개의 개 카파 경쇄(VL1-4)를 나타내는 합성 뉴클레오티드 작제물에 초점을 맞춘 GC1008 항체를 이용한 개화 노력이 초기 개화를 위해 선택되었다. 각각의 개 중쇄(서열번호: 77) 또는 카파(서열번호: 81) 불변 영역을 함유하는 플라스미드 안으로 각 가변 사슬의 서브클로닝에 이어서 플라스미드를 HEK 293 세포에서의 항체 발현을 위해 가능한 모든 조합으로 공동-형질감염시켜 수많은 개화된 항체 작제물을 만들었다. 개화된 작제물 중 2개를 제외한 모두가 일시적인 HEK293 발현 시스템에서 발현되었다. 발현 후, 3가지 TGFβ 이소형 모두에 대한 결합이 평가되었다. 아래를 참조한다. 놀랍게도 시험관내 결합이나 기능적 활성은 관찰되지 않았다. CDR 및 프레임워크 영역에서의 아미노산이 돌연변이, 삽입 또는 결실되어 표적 이소형에 대한 mAb 결합 계면을 미세 조정했다. 개 프레임워크 상에 접종된 사전-결정된 표준 인간 상보성-결정 영역은 표적 이소형에 대한 친화도를 유의하게 감소시켰으므로, 전체 종 주형 mAb의 표적에 대한 비슷한 친화도를 회복하려면 추가 조작이 필요했다. 재-조작된 VH 및 VL은 아래 표 2에서 *로 표시된다.
표 2
GC1008의 고양이화
GC1008 항체의 개화와 마찬가지로, 고양이화된 항체는 개화에 사용된 것과 동일한 CDR 영역 서열을 취하고 이를 고양이 가변 프레임워크 서열과 통합함에 의해 생성되었다. 조사할 고양이 생식계열을 식별하기 위해 키메라 및/또는 개화된 항체와 유사한 프레임워크를 찾기 위해 고양이 데이터베이스를 검색했다. 처음에, 2개의 중쇄 프레임워크와 4개의 경쇄 프레임워크를 선택하여, 다음의 고양이화된 가변 영역의 생성을 초래했다:
각각의 고양이 중쇄(서열번호: 75) 또는 카파(서열번호: 83) 불변 영역을 함유하는 플라스미드 안으로 각 가변 사슬의 서브클로닝에 이어서 플라스미드를 HEK 293 세포에서의 항체 발현을 위해 공동-형질감염시켰다. 공동-형질감염을 수행하여 중쇄와 경쇄의 조합을 제공했다. 개화된 및 고양이화된 버전의 원래 VH 및 VL에 대해 결합 및 기능 검정(아래 기술됨)을 수행했다. 놀랍게도 시험관내 결합이나 기능적 활성은 관찰되지 않았다. CDR 및 프레임워크 영역에서의 아미노산이 돌연변이, 삽입 또는 결실되어 표적 이소형에 대한 mAb 결합 계면을 미세 조정했다. 고양이 프레임워크 상에 접종된 사전-결정된 표준 인간 상보성-결정 영역은 표적 이소형에 대한 친화도를 유의하게 감소시켰으므로, 전체 종 주형 mAb의 표적에 대한 비슷한 친화도를 회복하려면 추가 조작이 필요했다. 재-조작된 VH 및 VL은 아래 표 3에서 *로 표시된다.
표 3
시험관내 결합 및 기능 검정
felchimGC1008 및 모든 개화된 및 고양이화된 항체04H09 및 chi04H09의 친화도 및 세포-기반 효력을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 평가했다. 후보 단클론 항체(mAb)가 TGFβ1, 2 및 3에 결합하는 친화도를 특징화하기 위해, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 Biacore T200 시스템(Biocore Life Sciences(GE Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)을 사용하여 평가했다. 항체를 표면에 고정화할 때 발생할 수 있는 차별적인 표면 준비와 연관된 친화도 차이를 피하기 위해 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3(R&D Systems)을 개별 표면에 직접적으로 접합했다. N-하이드록시숙신이미드(NHS)/1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 화학물질을 사용하여 아민 커플링 5μg/mL에 의해 고정화를 얻었다. 칩을 에탄올아민으로 켄칭하고, 모든 후보 mAb가 고정화된 TGFβ에 대해 결합된 친화도를 평가했다. 모든 곡선은 1:1 모델로 핏팅되었다. 친화도 <10-11은 기기에 대한 검출의 정량 하한 이하이다.
표 4: 개화된 mAb VH/VL 조합 시험관내 결합
도 5: 고양이화된 mAb VH/VL 조합 시험관내 결합
개 승모판 간질 세포(CMVIC)에서 TGFβ1-유도된 SMAD3 인산화의 억제를 측정하는 일차 세포-기반 검정의 효력에 대해 검정하기 위함. 이 검정을 위해, TGFβ1, 2 또는 3을 항체 유무에 관계없이 세포에 첨가하고 SMAD3 시그널링을 AlphaLISA 검출 키트를 통해 결정했다. TGFβ1, 2 및 3 표면에 대한 모든 mAb의 친화도와 각 항체의 효력은 표 6 및 7(아래)에 나타나 있다(각각 KD 데이터 및 CMVIC 데이터).
표 6: 개화된 mAb VH/VL 조합 기능 억제 검정
표 7: 고양이된 mAb VH/VL 시험관내 조합 기능 억제 검정
실시예 2
ZTS-122 및 ZTS-207의 약동학
개화된 ZTS-122(VH3.1 및 VL2[각각 서열번호 49 및 서열번호 68]) 및 ZTS-207(VH4.5 - VL2[각각 서열번호 48 및 각각 서열번호 68])의 피하 약동학을 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 각 분자는 0 및 28일차에 1mg/kg 피하 투여로 4마리의 도그에게 주어졌다. 혈장 샘플은 용량-전, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 29, 31, 35, 38, 43, 49 및 56일차에 동물로부터 수집되었다. 혈장에서의 각 단클론 항체의 노출은 리간드 결합 방법을 사용하여 평가되었다. 이의 약동학적 특성은 기간 1(0일차에서의 용량)과 기간 2(28일에서의 용량)에 대한 비구획 분석을 사용하여 평가되었다. 표 8(아래)을 참조한다.
표 8

Claims (28)

  1. 서열번호 23; 서열번호 33 및 서열번호 39를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 개 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 개화된 항체 및 이의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 77과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 개 IgGB 불변 영역을 추가로 포함하는, 개화된 항체.
  3. 서열번호 42-54로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 67-70으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 개 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 개화된 항체.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 서열번호 68을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 개화된 항체.
  5. 제3항에 있어서, 서열번호 49를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 서열번호 68을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 개화된 항체.
  6. 제3항에 있어서, 서열번호 48을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 서열번호 68을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 개화된 항체.
  7. 제3항에 있어서, 서열번호 49를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고; 서열번호 68을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 개화된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβ-관련된 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 TGFβ-관련된 장애는 섬유증 장애, 결합 조직 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 TGFβ-관련된 장애는 섬유증 장애를 포함하는, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 섬유증 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환; 폐 섬유증; 간경변; 신경교 흉터; 및 전신 경화증/경피증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 TGFβ 관련된 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환인, 항체.
  13. 치료적으로 유효한 양의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제8항의 약학적 조성물의 치료적 양을 개에게 투여함에 의해 TGFβ 관련된 장애에 대해 개를 치료하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, TGFβ 관련된 장애는 섬유증 장애, 결합 조직 장애, 뼈 장애 및 세포 증식 장애로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, TGFβ 관련된 장애는 섬유증 장애를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 섬유증 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환; 폐 섬유증; 간경변; 신경교 흉터; 및 전신 경화증/경피증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, TGFβ 장애는 신장 섬유증/만성 신장 질환인, 방법.
  19. 제8항의 약학적 조성물을 투여함에 의해 개에서 TGFβ1, 2 및 3 활성을 억제하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는, 단리된 핵산 서열.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 서열로서, 상기 서열은 서열번호 55-66과 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 71-74와 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 단리된 핵산 서열.
  22. 제21항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 62와 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 72와 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 단리된 핵산 서열.
  23. 제21항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 61과 95% 서열 동일성을 갖는 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 72와 95% 서열 동일성을 갖는 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 보존적 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 이의 임의의 변이체를 포함하는, 단리된 핵산 서열.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  25. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
  26. 제24항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  27. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는, 숙주 세포.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 항체의 생산을 초래하는 조건 하에서 배양하고 숙주 세포 또는 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법.
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