KR20240042457A - 표적외 효과가 감소된 변형된 소간섭 rna 분자 - Google Patents

표적외 효과가 감소된 변형된 소간섭 rna 분자 Download PDF

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KR20240042457A
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이충 창
치판 양
후이위 첸
치아춘 양
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마이크로바이오 (상하이) 컴퍼니 리미티드
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Abstract

표적외 효과를 감소시키기 위한 안티센스 가닥에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 변형된 소간섭 RNA (siRNA) 분자 및 이의 방법 및 용도. 높은 특이성과 침묵 효율을 갖는 저산소증 유발 인자 1 서브유닛 알파 (HIF1α)를 표적으로 하는 siRNA.

Description

표적외 효과가 감소된 변형된 소간섭 RNA 분자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 7월 22일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2021/107862의 출원일의 이익을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
RNA 간섭 (RNAi)은 소간섭 RNA (siRNA)에 의해 매개되는 서열 특이적 전사 후 유전자 침묵의 과정이다. 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 표적 유전자의 발현을 특이적으로 침묵시키기 위해 RNAi에 영향을 미치는 능력에 상당한 주의가 기울여지고 있다.
siRNA 치료제가 직면한 과제는 매우 중요하다. 이는 다가음이온성, 뉴클레아제 절단에 대한 취약성과 같은 siRNA의 고유한 특성으로 인해 세포 흡수가 불량하고 제거 속도가 빨라 임상 적용이 어렵기 때문이다. 또한, 유해한 단백질 결합이나 mRNA의 잘못된 표적화로 인해 발생하는 표적외 효과로 인해 siRNA 요법이 더욱 제한될 수 있다.
따라서, 표적외 효과를 크게 감소시킨 강력한 siRNA를 개발할 필요성이 커지고 있다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 감소된 표적외 효과를 나타내는 변형된 소간섭 RNA (siRNA) 분자의 개발에 기초한다. 따라서, 표적외 효과가 감소된 변형된 siRNA 및 표적 유전자, 예를 들어 질환 또는 장애와 관련된 유전자를 침묵시키기 위한 이의 용도가 본원에서 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 변형된 소간섭 RNA (siRNA) 분자를 제공한다. 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다. 변형된 siRNA는 위치 5와 6의 뉴클레오티드 및 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결이 없는 siRNA 대응물과 비교하여 표적외 효과가 감소했다. 일부 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 표적화 모이어티와 연관될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 위치 1과 2의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 2와 3의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 추가로 3' 말단의 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이 및/또는 3' 말단의 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 19-25개 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 변형된 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이이다. 이 경우, 변형된 siRNA 분자의 안티센스 가닥은 위치 19와 20의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 20과 21의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 선택적으로 박테리아 유전자, 바이러스 유전자 또는 진균 유전자인 병원성 유전자의 발현을 침묵시킨다. 다른 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 질환 유전자의 발현을 침묵시킨다. 예시적인 질환 유전자는 암, 섬유증, 대사 질환, 심혈관 질환, 면역 질환 또는 유전 질환과 관련된 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 질환 유전자가 암과 관련될 수 있다. 구체적인 예는 HIF1A, HIF2, IGF1R, VEGF, EREG, KRAS, ALK, BRAF, NRAS, STAT3, CDH2, KIFL1, PIK3CA, Src, RAS, RAF, 및 TP53을 포함한다. 일부 예에서, 질환 유전자는 섬유증과 관련될 수 있다. 구체적인 예는 HIF1A, HIF1B, HIF2, TGF-β1, 및 CTGF를 포함한다. 일부 예에서, 질환 유전자는 대사 질환 또는 심혈관 질환과 관련될 수 있다. 구체적인 예는 AGT, ApoC-III, 및 apoB를 포함한다. 일부 예에서, 질환 유전자는 면역 질환과 관련될 수 있다. 구체적인 예는 GATA-3, CCR3, TGF-α1, IL-6, TNF-α, IFN-β, IL-1β, CCL2, 및 CCL10을 포함한다. 다른 예에서, 질환 유전자는 유전 질환과 관련될 수 있다. 구체적인 예는 apoB 및 PCSK9을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다.
또한, 변형된 siRNA 분자 또는 변형된 siRNA 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 표적 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 유전자를 침묵시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 변형된 siRNA 분자 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 인간 저산소증 유발 인자 1 서브유닛 알파 (HIF1α) (항-HIF1a 간섭 RNA)를 표적으로 하는 간섭 RNA가 본원에 제공된다. 간섭 RNA는 HIF1α mRNA의 표적 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 표적 부위는 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
(a) AGGCCACAUUCACGUAUAU (서열 번호 1);
(b) UGAGGAAGUACCAUUAUAU (서열 번호 2);
(c) CCGGUUGAAUCUUCAGAUA (서열 번호 3);
(d) GCGCAAGUCCUCAAAGCAC (서열 번호 4);
(e) AGGCCACAUUCACGUAUA (서열 번호 5); 또는
(f) UGAGGAAGUACCAUUAUA (서열 번호 6).
일부 구현예에서, HIF1 α mRNA의 표적 부위는 AGGCCACAUUCACGUAUA (서열 번호 5)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, HIF1 α mRNA의 표적 부위는 UGAGGAAGUACCAUUAUA (서열 번호 6)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-HIF1a 간섭 RNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA이다. 일부 경우에는, 안티센스 가닥은 19-25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각, 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 5'-AGGCCACAUUCACGUAUAA-3' (서열 번호 7) 및 5'-UUAUACGUGAAUGUGGCCUGU-3' (서열 번호 8). 다른 예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각, 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 5'-UGAGGAAGUACCAUUAUAA-3' (서열 번호 (9) 및 5'-UUAUAAUGGUACUUCCUC AAU-3' (서열 번호 10).
일부 구현예에서, 항-HIF1a siRNA의 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 이러한 변형된 siRNA는 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이와 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결이 없는 siRNA 대응물과 비교하여 감소된 표적외 효과를 갖는다. 일부 경우에는, 안티센스 가닥은 위치 1과 2의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 2와 3의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 안티센스 가닥은 3' 말단에서 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이 및/또는 3' 말단의 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-HIF1a 간섭 RNA는 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 인간 HIF1α의 발현을 억제하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 유효량의 본원에 개시된 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA를 인간 HIF1α를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유효량의 간섭 RNA 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 대상체는 HIF1α와 관련된 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자이다. HIF1α와 관련된 예시적인 질환은 암 (예를 들어, 고형 종양), 심장 질환 (예를 들어, 허혈성 심장 질환 또는 울혈성 심부전), 폐 질환 (예를 들어, 폐고혈압, 폐섬유증, 또는 만성 폐쇄성 폐질환), 간 질환 (예를 들어, 급성 간부전, 간 섬유증 또는 간경변증), 신장 질환 (예를 들어, 급성 신장 손상 또는 만성 신장 질환), 비만, 또는 당뇨병을 포함한다.
또한, 본 개시내용의 범위에는 본원에 개시된 바와 같은 표적 질환을 치료하기 위한 임의의 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA를 포함하는 약학 조성물뿐만 아니라, 표적 질환의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA의 용도도 포함된다.
본 개시내용의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 아래 설명에 기재되어 있다. 본 개시내용의 다른 특징 또는 이점은 다음의 도면 및 여러 구현예의 상세한 설명, 그리고 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 은 게놈 전체 RNA 시퀀싱(genome-wide RNA sequencing에 의해 평가된 HIF1A siRNA에 의해 유발된 표적외 사건을 예시하는 그래프이다. 시험된 siRNA는 별표 ('*')로 표시된 바와 같이 다양한 위치에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 갖는다. 왼쪽의 숫자는 하향 사건을 나타낸다; 오른쪽의 숫자는 상승 사건을 나타낸다.
도 2 는 표시된 바와 같이 다양한 위치에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 갖는 HIF1A siRNA의 녹다운 효율을 예시하는 그래프이다.
도 3a 및 3b 는 예시적인 항-HIF1A siRNA의 생체 내 효과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 3a : 인간 HepG2 이종이식 마우스에서 HIF1A 발현의 녹다운. 도 3b : 이종이식 마우스에서 종양 성장의 억제.
RNA 간섭 또는 "RNAi"는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 숙주 세포에 도입될 때 유전자 발현을 차단하는 과정이다. (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811). RNAi 치료법의 장애물 중 하나는 표적외 효과이다 (Seok et al (2018), Cell Mol. Life Sci. 75, 797-814). 짧은 간섭 RNA 분자 (siRNA)는 일반적으로 RNAi에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 사용된다.
siRNA는 이중 가닥 RNA, 안티-센스 가닥 및 센스 가닥이며, 이는 상보적인 서열을 함유하고 이중 가닥 구조를 형성한다. 안티-센스 가닥의 적어도 일부는 RNAi를 통해 mRNA의 발현을 차단하기 위한 표적 mRNA 내의 영역에 상보적이다. siRNA 분자의 각 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 경우에는, 각 가닥이 인산화된 5' 말단과 수산화된 3' 말단을 가질 수 있다. 일부 경우에는, 안티-센스 가닥은 한 쌍의 돌출된 뉴클레오티드 (예를 들어, 1 또는 2)를 가질 수 있다. siRNA가 세포에 형질감염되면, 코어 단백질 아르고노트 (AGO)를 포함하는, RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 통합된다. 후속적으로, siRNA는 단일 가닥 RNA로 풀린다. 그 후, 안티센스 가닥은 AGO와 연관된 상태로 남아 활성 RISC를 형성하는 반면, 센스 가닥은 분해된다. 안티센스 가닥은 표적 전사체 (mRNA)와 염기 쌍을 형성하고, AGO는 표적을 절단하여 그 기능 (유전자 발현)을 침묵시킨다).
표적외 효과는 siRNA 치료제와 관련된 잠재적인 문제 중 하나이다. 따라서, 표적외 효과가 감소된 siRNA를 개발하는 것은 매우 강력하고 안전한 RNAi 치료법을 위해 매우 바람직하다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 안티센스 가닥 내의 특정 뉴클레오티드 위치의 공통 포스포디에스테르 백본 연결이 포스포로티오에이트 (PS) 연결 ('PS 결합'으로도 지칭됨)로 대체되는, 변형된 siRNA 분자의 개발에 기초한다. 이 치환에서는, 비-가교 인산염 산소 원자가 황 원자로 치환되어 뉴클레오티드 사이에 PS 연결이 생성된다. 구체적으로, PS 변형은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 시드 영역에 도입된다. 예를 들어, PS 변형은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 위치 5 내지 8 중 하나 이상의 뉴클레오티드 사이에 도입될 수 있다. 본원에 개시된 변형된 siRNA는 실질적으로 감소된 표적외 효과를 가지며 또한 정의된 위치에 PS 결합이 없는 대응 핵산 (동일한 뉴클레오티드 서열을 가짐)과 비교하여 뉴클레아제에 대해 더 저항성이 있을 것으로 예상된다.
달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 공개된 핵산 사슬 내 뉴클레오티드의 위치는 해당 핵산 사슬의 5' 말단으로부터의 위치, 즉 5' 말단 뉴클레오티드가 위치 1을 지칭한다.
I. 감소된 표적외 효과를 갖는 변형된 siRNA 분자
일부 양태에서, 본 개시내용은 상응하는 변형을 갖지 않는 동일한 siRNA 분자에 비해 표적외 효과가 감소된 소간섭 핵산 분자 (siRNA)에 관한 것이다.
(A) siRNA 분자:
본 개시내용은 표적 유전자 전사체에 대해 RNAi 경로를 통해 유전자 침묵을 유도할 수 있고 또한 (비-표적 유전자 전사체에 대해) 표적외 효과를 감소시킬 수 있는 이중 가닥 RNA인, 변형된 siRNA 분자에 관한 것이다.
변형된 siRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 시드 영역 (위치 5-8)에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결 ('PS 그룹' 또는 'PS 결합'으로도 지칭됨)을 포함한다. 변형된 siRNA 분자는 각각의 뉴클레오티드 위치에 PS 연결이 없는 siRNA 대응물과 비교하여 예를 들어, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 그 이상 감소된 표적외 효과를 갖는다. 표적외 효과의 감소는 일상적인 실시를 통해 또는 본원에 개시된 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 7과 8의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및 위치 7과 8의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이 및 위치 7과 8의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 5' 말단 영역에서 예를 들어, 위치 1과 2의 뉴클레오티드 사이, 및/또는 위치 2와 3 사이, 하나 이상의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 3; 말단 영역에서, 예를 들어, 3' 말단의 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이 및/또는 3' 말단의 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 하나 이상의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 가닥이 21개 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 3; 말단 영역에서 PS 뉴클레오티드 간 연결은 위치 19와 20의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 20과 21의 뉴클레오티드 사이에 있을 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 시드 영역 내에, 예를 들어, 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이, 및 5' 말단 (예를 들어, 1 또는 2) 및/또는 3' 말단 (예를 들어, 1 또는 2)에서 PS 뉴클레오티드 간 연결을 함유할 수 있다. 한 구체적인 예에서, 안티센스 가닥은 (a) 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결; (b), 5' 말단에 2개의 PS 뉴클레오티드 간 결합; 및 (c) 3' 말단에 2개의 PS 뉴클레오티드 간 결합을 함유한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 시드 영역 내에, 예를 들어, 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이, 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이, 및 위치 7과 8의 뉴클레오티드 사이, 및 5' 말단 (예를 들어, 1 또는 2) 및/또는 3' 말단 (예를 들어, 1 또는 2)에서 PS 뉴클레오티드 간 연결을 함유할 수 있다. 한 구체적인 예에서, 안티센스 가닥은 (a) 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이, 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이, 및 위치 7과 8의 뉴클레오티드 사이 PS 뉴클레오티드 간 연결; (b), 5' 말단에 2개의 PS 뉴클레오티드 간 결합; 및 (c) 3' 말단에 있는 2개의 PS 뉴클레오티드 간 결합을 함유한다.
본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA 분자에서, 안티센스 가닥은 15-30개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 18-25 또는 19-23 nt 길이를 함유할 수 있다. 한 예에서, 안티센스 가닥은 21 nt 길이를 포함한다. 또 다른 예에서, 안티센스 가닥은 23 nt 길이를 포함한다. 센스 가닥 또는 이의 일부는 안티센스 가닥 또는 이의 일부에 (완전히 또는 부분적으로) 상보적이다. 일부 경우에는, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 동일한 길이를 갖는다. 다른 경우에, 센스 가닥은 안티센스 가닥보다 (예를 들어, 1-5 nt 예를 들어 1nt, 2nt, 3nt, 4nt, 또는 5 nt만큼) 짧다. 이 경우, 안티센스 가닥은 5' 말단 및/또는 3' 말단에 돌출부 (예를 들어, 1-5nt)를 가질 수 있다.
한 구체적인 예에서, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 21 nt 길이이고 변형된 siRNA의 센스 가닥은 16 nt 길이이다. 안티센스 가닥의 5-nt 돌출부는 3' 말단에 위치할 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥은 21 nt 길이이고 변형된 siRNA의 센스 가닥은 19 nt 길이이다. 안티센스 가닥의 2-nt 돌출부는 3' 말단에 위치할 수 있다.
표 1은 시드 영역, 및 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 예시적인 PS 뉴클레오티드 간 연결을 갖는 예시적인 siRNA가 나열되어 있다. 표 1에 나열된 예시적인 siRNA에 표시된 위치에서 PS 뉴클레오티드 간 연결을 갖는 siRNA는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
(B) 다른 변형
본원에 개시된 바와 같은 변형된 siRNA의 안티센스 가닥의 PS 뉴클레오티드 간 연결 변형에 더하여, 변형된 siRNA의 안티센스 가닥, 센스 가닥, 또는 둘 다는 당 변형, 핵염기 변형, 백본 변형, 또는 이들의 조합과 같은 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 개선된 친화도, 증가된 생체 내 안정성, 생체 내 안정성 향상 (예를 들어, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성), 및/또는 면역원성 감소를 부여할 수 있다.
한 예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA (예를 들어, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서)는 인 원자를 보유하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676; 및 5,625,050 참조) 및 인 원자를 갖지 않는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 및 5,792,608 참조)을 포함하여, PS 뉴클레오티드 간 결합과 다른 위치에서 변형된 백본을 가질 수 있다. 인 함유 변형된 백본의 예는 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 백본은 반전된 극성, 즉 3'에서 3', 5'에서 5' 또는 2'에서 2' 연결을 갖는 백본을 포함한다. 인 원자를 포함하지 않는 변형된 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결, 혼합 헤테로원자와 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드 간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 간 연결에 의해 형성된다. 이러한 백본은 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 백본; 실록산 백본; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 N, O, S 및 CH2 구성 요소가 혼합된 기타를 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA는 본원에 개시된 PS 뉴클레오티드 간 결합을 제외하고는 어떠한 백본 변형도 포함하지 않는다.
또 다른 예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA (예를 들어, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서)는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함한다. 이러한 치환된 당 모이어티는 2' 위치에 다음 그룹 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-알킬, S-알킬, N-알킬, O-알케닐, S-알케닐, N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐, N-알키닐, 및 O-알킬-O-알킬. 이들 그룹에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 이는 또한, 2' 위치에 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학을 개선하기 위한 그룹을 포함할 수 있다. 바람직한 치환된 당 모이어티는 2'-메톡시에톡시, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시를 갖는 것들을 포함한다. Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504 참조.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 변형된 siRNA (예를 들어, 센스 및/또는 안티센스 가닥에서)는 하나 이상의 변형된 천연 핵염기 (즉, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실)를 포함한다. 변형된 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, CRC Press, 1993에 기술된 것을 포함한다. 특정의 핵염기는 간섭 RNA 분자의 표적화 부위에 대한 결합 친화도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 이는 5-치환 피리미딘, 6- 아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (예를 들어, 2-아미노프로필-아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신)을 포함한다. Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) 참조.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 변형된 siRNA (예를 들어, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에서)는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA)을 포함할 수 있다. 종종 접근 불가능한 RNA라고도 불리는 LNA는 변형된 RNA 뉴클레오티드로, 리보스 모이어티가 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 추가 가교로 변형된다. 이 가교는 A형 이중체에서 흔히 발견되는 3'-엔도 (노스) 형태의 리보스를 "잠금"한다. LNA 뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 간섭 RNA의 뉴클레오티드 중 최대 50% (예를 들어, 40%, 30%, 20%, 또는 10%)가 LNA이다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 변형된 siRNA 분자는 리간드 (표적화 모이어티)에 접합되거나 변형된 siRNA의 원하는 세포/조직으로의 전달을 촉진하고/하거나 세포 흡수를 촉진할 수 있는 소포로 캡슐화될 수 있다. 적합한 리간드는 탄수화물, 펩티드, 항체, 중합체, 소분자, 콜레스테롤 및 압타머를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 GalNAc 모이어티 (예를 들어, 트리-GalNAc 모이어티)는 변형된 siRNA를 간 세포에 전달하기 위한 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다.
(C) 표적 유전자
본원에 개시된 바와 같은 변형된 siRNA는 변형된 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하는 전사체 (mRNA)를 포함하는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용하기 위한 것이다. 따라서, 안티센스 및 센스 가닥의 서열은 표적 유전자의 mRNA 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 일부 경우에는, 안티센스 가닥은 표적 유전자의 mRNA 내의 표적 영역에 완전히 상보적일 수 있다. 다른 경우에, 안티센스 가닥은 상보성 수준이 표적 영역과의 염기쌍 형성에 충분한 한 표적 유전자의 mRNA 내의 표적 영역에 부분적으로 상보적일 수 있고 (예를 들어, 하나 이상의 불일치 또는 갭을 함유함), 이는 당업자의 지식 내에 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 변형된 siRNA의 표적 유전자는 병원성 유전자이다. 예를 들어, 표적 유전자는 병원체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균의 유전자일 수 있다. 다른 예에서, 표적 유전자는 질환 또는 장애, 예를 들어, 암, 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 질환), 대사 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환 및 기타 유전성 장애 또는 질환에 관여한다.
일부 예에서, 변형된 siRNA는 암에 관여하는 표적 유전자의 발현을 억제한다. 예시적인 암 관련 표적 유전자는 HIF1A, HIF2, IGF1R, VEGF, EREG, KRAS, ALK, BRAF, NRAS, STAT3, CDH2, KIFL1, PIK3CA, Src, RAS, RAF, 및 TP53을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 변형된 siRNA는 섬유증에 관여하는 표적 유전자의 발현을 침묵시킨다. 예시적인 섬유증 관련 표적 유전자는 HIF1A, HIF1B, HIF2, TGF-β1, 및 CTGF를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 변형된 siRNA는 대사 질환에 관여하는 표적 유전자의 발현을 침묵시킨다. 예시적인 대사 관련 표적 유전자는 AGT, ApoC-III, 및 apoB를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 변형된 siRNA는 면역 질환 (예를 들어, 자가면역 질환)에 관여하는 표적 유전자의 발현을 침묵시킨다. 예시적인 면역 질환 관련 표적 유전자는 GATA-3, CCR3, TGF-β1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, CCL2, 및 CCL10을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
II. 인간 저산소증 유발 인자 1 서브유닛 알파 (HIF1a)를 표적으로 하는 간섭 RNA
저산소증 유발 인자-1A (HIF-1A)는 저산소증에 대한 세포 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자이다. Lyer et al., Genes Dev 1998, 12, 149-162. 정상 산소 조건에서, HIF-1a 서브유닛은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system)에 의해 지속적으로 합성되고 분해된다. 저산소증 조건에서, HIF-1A는 다양한 암에서 과도하게 발현되며 종양 성장, 혈관 신생, 화학 요법 내성, 침습 및 전이에 관여하는 다양한 유전자를 조절한다. Favaro et alGenome Med. 2011, 3:1-12; 및 Gonzalez et al., Nat. Rev. Endocrinol. 2018, 15, 21-32. HIF-1A는 간세포 암종에서 상향 조절되었으며, 간 피막 침윤 및 문맥 전이와 관련이 있었다. Feng et al., Cell Mol. Biol. Lett. 2018, 23, 26; 및 Yang et al., J Clin Oncol. 2014, 44(2):159-67. 이는 또한 방광요로상피암종, 유방침습성결장선암종, 간세포암종, 폐선암종, 췌장선암종, 직장선암종, 위선암종, 갑상선암종을 포함하는 다양한 고형 종양에서 과도하게 발현된다. Chen et al., Cell Oncol. 2020, 43:877-88.
많은 보고에 따르면 HIF-1A가 대사 질환을 활성화하거나 억제하는 것으로 나타났다. Gonzalez et al., Nat. Rev. Endocrinol. 2018, 15, 21-32; 및 Halberg et al., Mol Cell Biol. 2009, 16:4467-83. 비만은 지방 조직과 소장에서 만성 저산소 상태를 유발하여 HIF-1A 신호 전달을 촉진하여 인슐린 저항성과 간 섬유증을 동반한 비알코올성 지방간 질환을 비롯한 대사 장애를 초래한다. Norouzirad et al., Oxid Med Cell Longev. 2017, 2017:5350267. 폰 히펠-린다우 단백질, E3 유비퀴틴 리가제의 과발현, 또는 HIF-1A 침묵을 통한 저산소증 신호 전달의 억제는 CCl4 및 담관 결찰 모두에 의해 유발된 간 섬유증을 유의하게 감소시킬 수 있다. Wang et al., Sci Rep. 2017, 7:41038.
인간 HIF1a의 mRNA를 표적으로 하는 간섭 RNA 분자 (항-HIF1a 간섭 RNA)가 본원에 기재되어 있다. 이러한 항-HIF1a 간섭 RNA는 RNA 간섭 과정을 통해 HIF1a 발현을 억제하여, HIF1a와 관련된 질환, 예를 들어 본원에 논의된 질환의 치료에 도움이 될 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "간섭 RNA"는 RNA 간섭에 직접적으로 관여하는 성숙한 RNA 분자 (예를 들어, 본원에 개시된 21-23nt dsRNA) 또는 성숙한 RNA 분자를 생산하는 전구체 분자 모두를 포함하는, 표적 유전자를 억제하는 데 사용될 수 있는 임의의 RNA 분자를 지칭한다.
항-HIF1a 간섭 RNA는 HIF1a mRNA 내의 표적 부위에 상보적인 (완전히 또는 부분적으로) 단편을 포함한다. 단편은 표적 부위에 100% 상보적일 수 있다. 대안적으로, 단편은 부분적으로 상보적일 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 불일치 또는 갭을 포함하지만 RNA 간섭을 매개하기 위해 표적 부위에서 이중 가닥을 형성하기에 충분할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 간섭 RNA는 다음 뉴클레오티드 서열 중 하나를 갖는 HIF1a mRNA 부위를 표적으로 한다:
(1) AUGAAGUGUACCCUAACUA (서열 번호 11);
(2) AAGUCUGCAACAUGGAAGGUA (서열 번호 12);
(3) AGGCCACAUUCACGUAUAU (서열 번호 1);
(4) GGCCACAUUCACGUAUAUG (서열 번호 13);
(5) UGAGGAAGUACCAUUAUAU (서열 번호 2);
(6) AAGUUCACCUGAGCCUAAUAG (서열 번호 14);
(7) ACUUUCUUGGAAACGUGUAA (서열 번호 15);
(8) CCGGUUGAAUCUUCAGAUA (서열 번호 3);
(9) GCGCAAGUCCUCAAAGCAC (서열 번호 4);
(10) GUCGGACAGCCUCACCAAA (서열 번호 16); 및
(11) AGCGCAAGUCCUCAAAGCAC (서열 번호 17).
일부 예에서, 본원에 개시된 항-HIF1a 간섭 RNA는 AGGCCACAUUCACGUAUAU (서열 번호 1)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HIF1a mRNA 부위를 표적으로 한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 항-HIF1a 간섭 RNA는 UGAGGAAGUACCAUUAUAU (서열 번호 2)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HIF1a mRNA 부위를 표적으로 한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 항-HIF1a 간섭 RNA는 CCGGUUGAAUCUUCAGAUA (서열 번호 3)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HIF1a mRNA 부위를 표적으로 한다. 예시적인 항-HIF1a 간섭 RNA가 하기 표 3 및 4에 제공된다.
일부 구현예에서 본원에 개시된 간섭 RNA는 siRNA, 즉, 2개의 별개의 상보적 RNA 사슬을 함유하는 이중 가닥 RNA (dsRNA)일 수 있다. 이러한 siRNA는 표적 HIF1a mRNA 부위에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 센스 사슬 및 센스 사슬 (및 표적 부위)에 상보적인 안티센스 사슬을 포함할 수 있다. 센스 사슬 및/또는 안티센스 사슬이 표적 부위와 완전히 동일하거나 상보적일 필요는 없다는 것이 당업자에게 알려졌었을 것이다. siRNA가 RNA 간섭 과정을 매개하기 위해 염기쌍을 통해 mRNA 부위를 여전히 표적으로 삼을 수 있는 한 하나 이상의 불일치가 허용된다. 일부 경우에는, 센스 사슬 및/또는 안티센스 사슬 (이의 전체 또는 일부)은 표적 부위와 완전히 동일하거나 상보적이다. HIF1a를 표적으로 하는 예시적인 siRNA는 하기 표 3 및 4에서 확인할 수 있다.
다른 예에서, 본원에 개시된 간섭 RNA는 단단한 헤어핀(tight hairpin) 구조를 형성하는 RNA 분자인 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA (shRNA)일 수 있다. siRNA 및 shRNA 둘 다 본원에 개시된 바와 같이 HIF1a의 표적 mRNA 부위의 서열에 기초하여 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-HIF1a 간섭 RNA는 siRNA 분자, 예를 들어, 하기 표 3 및 표 4에 나열된 것들일 수 있다. 구체적인 예에서, siRNA는 표 4에 나열된 것 중 하나, 예를 들어, AI3-UM4 및 AT9-UM4이다.
일부 예에서, siRNA는 5'- AGGCCACAUUCACGUAUAA -3' (서열 번호 7)을 포함하는 센스 사슬 및 5'- UUAUACGUGAAUGUGGCCUGU -3' (서열 번호 8)을 포함하는 안티센스 사슬, 예를 들어, AI3-UM4를 포함할 수 있다. 일부 예에서, siRNA는 5'- UGAGGAAGUACCAUUAUAA -3' (서열 번호 9)을 포함하는 센스 사슬 및 5'- UUAUAAUGGUACUUCCUCAAU -3' (서열 번호 10)을 포함하는 안티센스 사슬, 예를 들어, AT9-UM4를 포함할 수 있다.
일부 경우에는, 본원에 개시된 siRNA는 AI3-UM4 또는 AT9-UM4와 동일한 센스 사슬 및/또는 동일한 안티센스 사슬을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 siRNA는 AI3-UM4의 센스 사슬과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상) 동일한 센스 사슬을 포함할 수 있고/거나 AI3-UM4의 안티센스 사슬과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상) 동일한 안티센스 사슬을 포함한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 siRNA는 AT9-UM4의 안티센스 사슬과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상) 동일한 센스 사슬을 포함할 수 있고/거나 AT9-UM4의 안티센스 사슬과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상) 동일한 안티센스 사슬을 포함한다.
두 핵산의 "동일성 백분율"은 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993에서와 같이 수정된, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이-12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST는 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997에 기재된 바와 같이 활용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 활용하는 경우, 해당 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수를 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 항-HIF1a siRNA는 표 3 또는 표 4 에 나열된 것과 같은 참조 siRNA, 예를 들어, AI3-UM4 또는 AT9-UM4의 센스 사슬 및 안티센스 사슬 (집합적으로 또는 별도로)과 비교하여 최대 6개 (예를 들어, 최대 6, 5, 4, 3, 또는 2개) 뉴클레오티드 변이를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA (예를 들어, AI3-UM4 또는 AT9-UM4와 같은 siRNA)는 비천연 발생 핵염기, 당 또는 공유 뉴클레오시드 간 연결 (백본)을 함유할 수 있다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 특성, 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 개선된 친화도, 증가된 생체 내 안정성, 생체 내 안정성 향상 (예를 들어, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성), 및/또는 면역원성 감소를 부여한다.
한 예에서, 본원에 기술된 항-HIF1a 간섭 RNA (예를 들어, AI3-UM4 또는 AT9-UM4와 같은 siRNA)는 인 원자를 보유하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676; 및 5,625,050 참조) 및 인 원자를 갖지 않는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 및 5,792,608 참조)을 포함하여, 변형된 백본을 갖는다. 인 함유 변형된 백본의 예는 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 백본은 반전된 극성, 즉, 3' 내지 3', 5' 내지 5' 또는 2' 내지 2' 연결을 갖는 백본을 포함한다. 인 원자를 포함하지 않는 변형된 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결, 혼합 헤테로원자와 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 간 연결에 의해 형성된다. 이러한 백본은 모르폴리노 연결(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 백본; 실록산 백본; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 N, O, S 및 CH2 구성 요소가 혼합된 기타를 포함한다.
일부 예에서, 본원에 기술된 항-HIF1a 간섭 RNA (예를 들어, AI3-UM4 또는 AT9-UM4와 같은 siRNA)는 본원에 개시된 위치 (예를 들어, 시드 영역 내 위치 5-8, 예를 들어 5와 6 사이 및/또는 6과 7 사이의 위치)에서 PS 뉴클레오티드 간 연결을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기술된 항-HIF1a 간섭 RNA (예를 들어, AI3-UM4 또는 AT9-UM4와 같은 siRNA)는 또한 본원에 개시된 것을 포함하는, 변형된 당, 변형된 염기, 변형된 뉴클레오티드 등과 같은 하나 이상의 추가 변형을 함유할 수 있다. 항-HIF1a 간섭 RNA는 표적화 모이어티, 예를 들어, 본원에 개시된 것들에 접합될 수 있다. 예를 들어, 항-HIF1a 간섭 RNA는 원하는 세포/조직으로의 siRNA 전달을 촉진하고/하거나 세포 흡수를 촉진할 수 있는 리간드 (표적화 모이어티)에 접합되거나 소포로 캡슐화될 수 있다. 적합한 리간드는 탄수화물, 펩티드, 항체, 중합체, 소분자 및 콜레스테롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 GalNAc 모이어티 (예를 들어, 트리-GalNAc 모이어티)는 항-HIF1a 간섭 RNA를 간 세포에 전달하기 위한 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다.
명시적으로 지적되지 않는 한 (예를 들어, 기호 '*'로 표시된 PS 결합), 본원에 제공된 비변형 뉴클레오티드 서열은 비변형 RNA 분자 및 임의의 적합한 변형을 갖는 RNA 분자 둘 다를 포함하는 의미이다.
본원에 기술된 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA 분자 (뿐만 아니라 변형된 siRNA 분자)는 통상적인 방법, 예를 들어, 화학적 합성 또는 시험관 내 전사에 의해 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 이들의 의도된 생활성은 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것에 의해 검증될 수 있다. 일부 경우에는, 본원에 개시된 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 표적 유전자의 발현을 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 이상 억제할 수 있다.
임의의 항-HIF1a 간섭 RNA를 발현하기 위한 벡터는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 발현 벡터는 항-HIF1a 간섭 RNA를 코딩하기 위한 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 요소 (프로모터/인핸서)를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 서열은 항-HIF1a 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 코딩할 수 있다.
III. 약학 조성물
본원에 개시된 바와 같은 임의의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 적합한 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. 이러한 담체, 부형제 또는 안정화제는 본원에 기술된 조성물 내 활성 성분의 하나 이상의 특성, 예를 들어, 생활성, 안정성, 생체이용률, 및 기타 약동학 및/또는 생활성을 향상시킬 수 있다.
허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올, 벤조에이트, 소르베이트 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 세린, 알라닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM (폴리소르베이트), PLURONICSTM (비이온성 계면활성제), 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 트리클로로모노-플루오로메탄, 디클로로-디플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄, 클로로펜타-플루오로에탄, 모노클로로-디플루오로에탄, 디플루오로에탄, 테트라플루오로에탄, 헵타플루오로프로판, 옥타플루오로-시클로부탄, 정제수, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린, PEG (예를 들어, PEG400, PEG 600, PEG 800 및 PEG 1000), 소르비탄 트리올레에이트, 대두 레시틴, 레시틴, 올레산, 폴리소르베이트 80, 스테아르산 마그네슘 및 라우르황산나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, 염화벤잘코늄, 염화세틸피리디늄, 티몰, 아스코르브산, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, EDTA, 수산화나트륨, 트로메타민, 암모니아, HCl, H2SO4, HNO3, 구연산, CaCl2, CaCO3, 구연산나트륨, 염화나트륨, 이나트륨 EDTA, 사카린, 멘톨, 아스코르브산, 글리신, 라이신, 젤라틴, 포비돈 K25, 이산화규소, 이산화티타늄, 산화아연, 유당, 유당 일수화물, 유당 무수화물, 만니톨 및 포도당을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는 부형제를 포함한다.
다른 예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 지속 방출 형식으로 제형화될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 예를 들어, 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태인 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 7-에틸-글루탐산의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체 예를 들어 LUPRON DEPOTTM (유산-글리콜산 공중합체와 류프로라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체 내 투여에 사용되는 약학 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과를 통해 쉽게 수행된다. 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알 또는 수동으로 접근할 수 있는 밀봉된 용기에 넣는다.
본원에 기술된 약학 조성물은 흡입 또는 통기, 척수강 내, 폐내 또는 뇌내 경로, 경구, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여를 위해 고형제, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제와 같은 단위 투여 형태일 수 있다.
고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약 담체, 예를 들어, 옥수수 전분, 유당, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 인산이칼슘 또는 검과 같은 통상적인 정제 성분, 및 기타 제약 희석제, 예를 들어, 물과 혼합하여 본 개시내용의 화합물, 또는 그의 비독성 약학적으로 허용 가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 예비제형 조성물을 균질하다고 언급할 때, 이는 활성 성분이 조성물 전체에 고르게 분산되어 조성물이 분말 수집제, 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 투여 형태로 쉽게 세분될 수 있음을 의미한다. 이어서, 이러한 고체 예비제형 조성물은 조성물에 적합한 양의 활성 성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다.
적합한 표면활성제에는 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, TWEEN® 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄 (예를 들어, SPAN® 20, 40, 60, 80 또는 85)과 같은 비이온성 제제가 포함된다. 표면활성제가 있는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5% 표면활성제를 포함하며, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 비히클이 첨가될 수 있음이 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 INTRALIPID™, LIPOSYN™, INFONUTROL™, LIPOFUNDIN™ 및 LIPIPHYSAN™과 같은 시판되는 지방 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리 혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질 (예를 들어, 계란 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 물을 혼합하여 형성된 에멀젼에 용해될 수 있다. 에멀젼의 장성을 조절하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가할 수 있음이 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어, 5 내지 20%를 함유할 것이다.
흡입 또는 통기용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 설명한 바와 같이 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 10 nm 내지 100 mm 사이의 입자 크기로 구성된다.
바람직하게는 멸균된 약학적으로 허용 가능한 용매 중의 조성물은 가스를 사용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치에서 직접 호흡할 수 있거나 분무 장치를 안면 마스크, 텐트, 기관 내 튜브 및/또는 간헐적 양압 호흡 기계 (인공호흡기)에 부착할 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제제를 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 임의의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 캡슐화되거나 리포솜에 부착될 수 있으며, 이는 Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포솜을 생성한다.
일부 구현예에서, 임의의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 또한 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있다, 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000) 참조.
본원에 개시된 변형된 siRNA 분자를 포함하는 임의의 약학 조성물은 엔도솜 및/또는 리소솜에서 세포질로의 조성물의 수송을 향상시키는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예시는 pH-민감성 제제 (예를 들어, pH-민감성 펩티드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 임의의 약학 조성물은 조성물의 의도된 치료 용도에 기초하여 제2 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 표적 유전자 발현 억제
본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA 분자는 생체 내 또는 시험관 내에서 표적 유전자 (예를 들어, HIF1a)의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 변형된 siRNA 분자를 포함하는 유효량의 본원에 기재된 약학 조성물은 정맥 내 투여와 같은 적합한 경로를 통해, 예를 들어, 근육 내, 복강 내, 뇌척수 내, 피하, 관절 내, 윤활막 내, 척수강 내, 종양 내, 경구, 흡입 또는 국소 경로를 통해 볼루스로 투여하거나 일정 기간에 걸쳐 지속적으로 주입하여 치료가 필요한 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 비롯한 시판되는 액체 제제용 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무할 수 있으며, 동결건조된 분말은 재구성 후 분무할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 대상체에 치료 효과를 부여하는 데 필요한 각 활성제의 양을 지칭한다. 유효량은 당업자가 인식하는 바와 같이, 치료할 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 매개변수, 치료 기간, 동시 치료의 성격 (있는 경우), 특정 투여 경로 및 보건의료인의 지식 및 전문성 내에서 유사한 요인에 따라 다르다. 이러한 요인들은 당업자에게 잘 알려졌으며 일상적인 실험만으로 해결할 수 있다. 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
반감기와 같은 경험적 고려사항은 일반적으로 용량 결정에 영향을 미친다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있으며, 일반적으로 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연을 기반으로 하지만 반드시 그럴 필요는 없다. 대안적으로, 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 알려져 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 임의의 변형된 siRNA 분자 또는 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 일일 투여량은 위에서 언급한 요인에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상 반복 투여하는 경우, 상태에 따라, 원하는 증상 억제가 나타날 때까지 또는 표적 질환이나 장애, 또는 이의 증상을 완화하기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 약 2 mg/kg의 초기 용량을 투여한 후, 약 1 mg/kg의 siRNA를 매주 유지 용량으로 투여하거나, 이어서 약 1 mg/kg의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함한다. 그러나 의사가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일주일에 1-4회 투여하는 것이 고려된다. 일부 구현예에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예를 들어 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여량이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 빈도는 매주 1회, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다; 또는 매월, 2개월마다, 또는 3개월마다 또는 그 이상이다. 이 치료법의 진행은 기존 기술과 분석법을 통해 쉽게 모니터링할 수 있다. 투약 요법은 시간이 지남에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정 투약 요법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특정 개인과 개인의 병력뿐만 아니라 개별 제제의 특성 (제제의 반감기 및 당업계에 잘 알려진 기타 고려사항)에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA 분자의 적절한 투여량은 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA가 예방 또는 치료 목적으로 투여된 질환/장애의 유형 및 중증도, 이전 치료, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 다를 수 있다. 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA를 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 원하는 결과는 종양 부담의 감소, 암세포의 감소, 또는 면역 활성의 증가이다.
복용량이 원하는 결과를 가져왔는지를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 하나 이상의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA의 투여는 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료인지 예방인지 여부, 및 숙련된 실무자에게 공지된 기타 요인에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 예를 들어, 표적 질환 또는 장애가 발생하기 전, 도중 또는 발생 후에 일련의 간격을 둔 용량으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 질환이나 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 치료, 호전, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖고 있는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용하거나 투여하는 것을 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화하는 것에는 질환의 발병이나 진행을 지연시키거나 질환의 중증도를 줄이는 것이 포함된다. 질환을 완화하는 데 반드시 치료 결과가 필요한 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적 질환 또는 장애의 발달을 "지연시키는" 것은 질환의 진행을 지연, 방해, 느리게, 지체, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개인에 따라 기간이 다양할 수 있다. 질환의 발병을 "지연" 또는 완화하거나 질환의 발병을 지연시키는 방법은 해당 방법을 사용하지 않는 것과 비교했을 때 주어진 시간 프레임에서 주어진 기간 내에 질환의 하나 이상의 증상이 나타날 가능성을 줄이고/또는 증상의 정도를 줄이는 방법이다. 이러한 비교는 일반적으로 통계적으로 유의미한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "발달" 또는 "진행"은 질환의 초기 발현 및/또는 후속 진행을 의미한다. 질환의 발달은 당업계에 잘 알려진 표준 임상 기술을 사용하여 검출 가능하고 평가될 수 있다. 그러나 발달은 감지할 수 없는 진행을 의미하기도 한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발달 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발달"은 발생, 재발 및 발병을 포함한다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
의학 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료할 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라 대상체에게 약학 조성물을 투여할 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 통상적인 경로, 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 구강, 질 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 종양 내, 윤활막 내, 흉골 내, 척수강 내, 병변 내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 1개월, 3개월 또는 6개월 데포 주사용 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사용 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 비강 경로, 예를 들어, 비강 내 스프레이, 비강 스프레이 또는 점비제를 통해 투여될 수 있다.
주사 가능한 조성물은 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있다. 정맥 주사의 경우, 변형된 siRNA를 드립 방법으로 투여할 수 있으며, 이에 의해 간섭 RNA 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 약학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용 가능한 부형제는 예를 들어, 5% 포도당, 0.9% 식염수, 링거액 또는 기타 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육 내 제제, 예를 들어, 본원에 개시된 변형된 siRNA의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 주사용수, 0.9% 식염수, 또는 5% 포도당 용액과 같은 약학적 부형제에 용해되어 투여될 수 있다.
한 구현예에서, 변형된 siRNA 분자는 부위 특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위 특이적 또는 표적화된 국소 전달 기술의 예에는 치료 RNA 분자의 다양한 이식 가능한 데포 공급원 또는 주입 카테터, 유치 카테터 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외막 랩, 션트 및 스텐트 또는 기타 이식 가능 장치와 같은 국소 전달 카테터, 부위 특이적 담체, 직접 주입, 또는 직접 적용이 포함된다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568 참조.
폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체 매개 DNA 전달 기술은 예를 들어, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 임의의 변형된 siRNA 분자, 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA, 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 폐 전달 시스템에 의해 투여될 수 있으며, 즉 활성 약제학적 성분은 폐로 투여된다. 폐 전달 시스템은 흡입기 시스템일 수 있다. 일부 구현예에서, 흡입기 시스템은 가압 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 또는 분무기이다. 일부 구현예에서, 흡입기 시스템은 스페이서를 포함한다.
일부 구현예에서, 가압 정량 흡입기는 추진제, 공용매 및/또는 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 추진제는 트리클로로모노-플루오로메탄, 디클로로-디플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄, 클로로펜타-플루오로에탄, 모노클로로-디플루오로에탄, 디플루오로에탄, 테트라플루오로에탄, 헵타플루오로프로판, 옥타플루오로-시클로부탄과 같은 불소화 탄화수소로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 공용매는 정제수, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, PEG400, PEG 600, PEG 800 및 PEG 1000으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 계면활성제 또는 윤활제는 소르비탄 트리올리에이트, 대두 레시틴, 레시틴, 올레산, 폴리소르베이트 80, 스테아르산 마그네슘 및 라우리황산나트륨으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 방부제 또는 항산화제는 메티파라벤, 프로피파라벤, 클로로부탄올, 염화 벤잘코늄, 염화 세틸피리디늄, 티몰, 아스코르브산, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 중황산나트륨, EDTA로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, pH 조정제 또는 등장성 조정제는 산화나트륨, 트로메타민, 암모니아, HCl, H2SO4, HNO3, 구연산, CaCl2, CaCO3로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 건조 분말 흡입기는 분산제를 포함한다. 일부 구현예에서, 분산제 또는 담체 입자는 입자 크기가 약 1-100 μm인 유당, 유당 일수화물, 유당 무수화물, 만니톨, 덱스트로스를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 분무기는 공용매, 계면활성제, 윤활제, 보존제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공용매는 정제수, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, PEG (예를 들어, PEG400, PEG600, PEG800 및/또는 PEG 1000)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 예에서, 계면활성제 또는 윤활제는 소르비탄 트리올레에이트, 대두 레시틴, 레시틴, 올레산, 스테아르산 마그네슘 및 라우리 황산나트륨으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 예에서, 보존제 또는 항산화제는 메티파라벤, 프로피파라벤, 클로로부탄올, 염화벤잘코늄, 염화세틸피리디늄, 티몰, 아스코르브산, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 중황산나트륨, EDTA로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 예에서, 분무기는 산화나트륨, 트로메타민, 암모니아, HCl, H2SO4, HNO3, 구연산, CaCl2, CaCO3 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 pH 조정제 또는 등장성 조정제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항-HIF1a 간섭 RNA를 생성할 수 있는 DNA 분자 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 HIF1a 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있다. 이러한 DNA 분자 (예를 들어, 벡터)를 포함하는 약학 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg 범위의 DNA로 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg 이상의 농도 범위의 DNA가 유전자 치료 프로토콜 동안 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 분야의 실시에 따라 허용 가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ± 20%, 바람직하게는 최대 ± 10%, 보다 바람직하게는 최대 ± 5%, 및 더욱 바람직하게는 최대 ± 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 용어는 값의 규모 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 출원 및 청구범위에 특정 값이 기술된 경우, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며 이러한 맥락에서 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내에 있음을 의미한다.
임의의 변형된 siRNA 분자 또는 항-HIF1a 간섭 RNA로 치료되는 대상체는 변형된 siRNA 분자 (위에 개시된 표적 유전자 참조) 또는 항-HIF1a 간섭 RNA (HIF1a)에 의해 달성될 수 있는 표적 유전자와 관련된 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심될 수 있다. 용어 "대상체," "개체," 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고 치료를 위해 평가되고/되거나 치료되는 포유동물을 지칭한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 또한 다른 포유동물, 특히 인간 질환에 대한 실험실 모델로 유용한 포유동물, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 개, 원숭이 등을 포함한다. 치료가 필요한 인간 대상체는 종양과 같은 표적 질환/장애가 있거나, 위험에 처한 의심되는 인간 환자일 수 있다.
본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA 분자는 표적 유전자와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환은 암, 섬유증, 대사 질환, 심혈관 질환, 면역 질환 또는 유전 질환이 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 바와 같은 임의의 항-HIF1a 간섭 RNA는 HIF1a와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예시는 고형 종양, 암, 허혈성 심장 질환, 울혈성 심부전, 급성 폐 손상, 폐고혈압, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 급성 간부전, 간 섬유증 및 간경변, 급성 신장 손상, 만성 신장 질환, 비만 및 당뇨병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 임의의 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 표적 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 추가 치료제와 병용 요법에 사용될 수 있다. 본원에 사용된, 용어 병용 요법은 이들 제제 (예를 들어, 변형된 siRNA 분자, 항-HIF1a 간섭 RNA 및 추가 치료제)를 순차적 방식으로 투여하는 것을 포함하며, 즉, 각 치료제는 다른 시간에 투여될 뿐만 아니라 이들 치료제 또는 적어도 2개의 치료제를 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 각 제제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내, 종양 내, 피하 경로, 점막 조직을 통한 직접 흡수 및 폐 전달 경로를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 제제는 동일한 경로로 투여되거나 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 제제는 폐 전달 경로로 투여될 수 있고, 제2 제제는 정맥 내로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순차적"은 달리 명시하지 않는 한, 규칙적인 순서 또는 차수를 특징으로 함을 의미하며, 예를 들어, 투여 요법이 조성물 및 항바이러스제의 투여를 포함하는 경우, 순차적 투여 요법은 항바이러스제 투여 전, 동시에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 조성물의 투여가 포함될 수 있지만, 두 약제 모두 규칙적인 순서 또는 차수로 투여된다. 용어 "분리하다"는 달리 명시하지 않는 한 하나를 다른 것으로부터 분리시키는 것을 의미한다. 용어 "동시에"는 달리 명시되지 않는 한, 동시에 발생하거나 행해지는 것을 의미하며, 즉, 본 발명의 제제가 동시에 투여된다. 용어 "실질적으로 동시에"는 제제가 서로 몇 분 이내에 (예를 들어, 서로 10분 이내) 투여되는 것을 의미하며 연속 투여뿐만 아니라 공동 투여도 포괄하도록 의도하지만, 짧은 기간 동안만 시간적으로 분리되는 것은 연속 투여하는 것이다 (예를 들어, 의사가 두 가지 화합물을 별도로 투여하는 데 걸리는 시간). 본원에 사용된, 동시 투여 및 실질적 동시 투여는 상호 교환적으로 사용된다. 순차적 투여는 본원에 기술된 제제의 일시적인 분리 투여를 의미한다.
병용 요법은 또한 다른 생물학적 활성 성분 및 비약물 요법과 추가로 조합하여 본원에 기술된 제제의 투여를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 조성물과 제2 치료제의 임의의 조합은 표적 질환을 치료하기 위한 임의의 순서로 사용될 수 있음이 인식되어야 한다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 임의의 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA는 시험관 내에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법을 수행하기 위해, 변형된 siRNA 또는 항-HIF1a 간섭 RNA (예를 들어, 벡터와 같은 코딩 핵산을 통해)는 예를 들어, 질환 메커니즘 연구 및/또는 약물 후보 검증과 같은 연구 목적으로 시험관 내에서 배양된 세포와 접촉할 수 있다.
V. 키트
본 개시내용은 단독으로 사용될 수 있거나 시험 샘플 및/또는 대상체에 대한 siRNA의 시험관 내 또는 생체 내 도입을 수행하는 데 필요한 시약 중 적어도 하나를 갖는 키트의 구성요소로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 키트의 바람직한 구성요소는 본 개시내용의 변형된 siRNA 분자 및 본원에 기술된 바와 같이 관심 세포 내로 siRNA의 도입을 촉진하는 비히클을 포함한다 (예를 들어, 지질 및 당업계에 공지된 다른 형질감염 방법을 사용하여, 예를 들어 Beigelman et al, 미국 특허 번호 6,395,713 참조).
또한, 키트는 유전자 기능 및/또는 활성 결정, 약물 최적화 및 약물 발견과 같은 표적 검증을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 Usman et al., 미국 일련 번호 60/402,996 참조). 또한, 이러한 키트는 키트 사용자가 개시내용을 실시할 수 있도록 하는 지침도 포함할 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 제2 치료제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 개인이 질환이 있는지 또는 질환에 걸릴 위험이 있는지를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다.
의도된 치료 효과를 달성하기 위한 변형된 siRNA 분자의 사용과 관련된 지침에는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 대한 정보가 포함된다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 하위 단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 제공된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 작성된 지침이지만, 기계 판독 가능한 지침 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크, 또는 QR 코드로 운반된 지침)도 허용된다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 의도된 치료적 유용성을 위해 사용된다는 것을 나타낼 수 있다. 본원에 설명된 방법 중 하나를 실행하기 위한 지침이 제공될 수 있다.
본 개시내용의 키트는 적합한 패키지에 들어 있다. 적합한 패키지는 챔버, 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 흡입기, 분무기, 인공호흡기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지도 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트가 있을 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥 주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥 주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음).
키트는 선택적으로 완충제 및 해석 정보와 같은 추가 구성 요소를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기와 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조품을 제공한다.
일반적인 기술
본 개시내용의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 그러한 기술은 문헌, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)에서 충분하게 설명되어 있다.
추가 설명 없이도, 당업자는 위의 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 따라서 다음의 특정 구현예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며 어떤 방식으로든 개시내용의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적이나 주제에 대해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 변형된 siRNA 분자의 표적외 효과의 조사
표 1에 나열된 7개의 siRNA 후보를 합성하고 전사체 전체의 표적 외 효과를 평가하기 위해 스크리닝했다. 효소 분해에 저항하기 위해 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3' 말단에 PS 연결이 도입된 것 외에도, 표 1에 나타낸 바와 같이 PS 연결도 안티센스 가닥의 시드 영역에 통합되었다.
표 1. 인간 HIF1A mRNA를 표적으로 하는 PS 연결을 갖는 HIF1A siRNA의 서열
인간 간세포 HL-7702 세포를 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양했다. 인간 간세포 암종 (HepG2) 세포를 10% 소 태아 혈청 (Gibco, ThermoFisher Scientific)이 포함된 최소 필수 배지 (Gibco, ThermoFisher Scientific)에서 배양했다.
간략하게, 표 1에 나열된 siRNA 후보를 인간 간세포 암종 HepG2 세포주 또는 인간 간세포 HL-7702 세포주에 형질감염시켜 이들 siRNA에 의해 유발되는 표적외 효과를 비교했다. HepG2 세포를 24-웰 배양 플레이트에 접종하고 24시간 동안 siRNA 후보로 형질감염시켰다. 24시간 형질감염 후, 총 RNA를 siRNA-형질감염된 세포로부터 단리하여 RT-qPCR을 사용하여 HIF1A mRNA의 녹다운 효율을 평가했다.
표적외 분석을 위해, HL-7702 세포를 6웰 배양 플레이트에 접종하고 siRNA로 24시간 동안 형질감염시켰다. 그런 다음 총 RNA를 단리하고 게놈 전체 RNA 시퀀싱을 수행하여 전사체 전체의 표적외 효과를 평가했다.
RNA-seq 실험을 위해, HL-7702 세포를 6-웰 배양 플레이트에 2 Х 105 세포/웰로 접종하고 18시간 동안 배양했다. 그런 다음 각각의 siRNA 후보 (10 nM)를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX (9 ul/웰; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 HL-7702 세포에 형질감염시켰다. 24시간 형질감염 후, 세포를 1X dPBS로 2회 세척하고 TRIzol 시약 (Thermo Fisher Scientific)에 용해시켰다. 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 추출했다. 총 RNA를 를 추출하고 게놈 DNA 오염을 피하기 위해 DNase로 처리했다.
추출된 RNA의 순도 (A260/A280 및 A260/A230 비율) 및 품질 (RIN ≥8.0)을 NanoDrop 2000 분광광도계 (Thermo Scientific) 및 Agilent 생물분석기 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 결정했다. 추출된 모든 RNA 샘플의 품질은 A260/A280 ≥ 1.9, A260/A230 ≥ 2, 및 RIN=10.0이었다. RNA-seq 라이브러리는 Truseq Stranded Total RNA Library Prep Gold (Illumina)를 사용하여 제조하고 제조사의 지침에 따라 NovaSeq 6000 서열분석기 (Illumina)에서 시퀀싱되었다. 2Х150-bp 쌍 말단 시퀀싱으로 샘플당 평균 8,450만 개의 판독을 얻었다. 원시 RNA 판독은 SeqPrep 및 Sickle을 사용하여 최소 평균 품질 점수 20으로 필터링되었다. 필터링된 판독은 HISAT2를 사용하여 인간 게놈 (GRCh.38.p13)에 정렬한 다음 StringTie를 사용하여 조립되었다. 유전자 발현 수준은 RSEM에 의해 검증되었으며 백만 매핑된 판독당 킬로베이스당 단편 (FPKM)으로 정규화되었다. 차등 유전자 발현 분석은 DEGseq에 의해 수행되었다. 허위 발견율 (FDR) ≤0.001 및 배수 변화 ≥2인 유전자는 차별적으로 발현된 유전자 (DEG)로 확인되었다.
HIF1A siRNA-처리된 세포와 비-siRNA-처리된 (처리되지 않은) 세포를 비교하는 게놈 전체 RNA 시퀀싱을 수행하여 siRNA 안티센스 가닥의 위치 5-8에 있는 PS 연결이 표적외 사건에 주요 영향을 미치는지 여부를 확인했다.
도 1 에 나타낸 바와 같이, 처리된 세포와 처리되지 않은 세포 사이에서 34~74개의 하향 조절된 유전자가 관찰되었다. AI3-A-PS6 (34개 유전자)에 의해 하향 조절된 유전자의 수는 AI3-A-PS1 (64개 유전자)에 비해 47% 감소했는데, 안티센스 가닥의 위치 5-8에서 PS 연결을 함유하지 않았다.
실시예 2: RT-qPCR에 의한 표적 유전자 녹다운 효율 조사
표 1에 나열된 siRNA 후보의 녹다운 효율은 RT-qPCR로 결정했다. 간략하게, HepG2 세포를 24-웰 배양 플레이트에 5 Х 105 세포/웰로 접종했다. 그런 다음 각각의 siRNA 후보 (10 nM) 리포펙타민 RNAiMAX (3 ul/웰)를 사용하여 HepG2 세포로 형질감염시켰다. 24시간 형질감염 후, 총 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 단리했다.
HIF1A mRNA 수준을 LightCycler 480 (Roche Diagnostics)에서 수행된 iTaq Universal Probes 1단계 키트 (Bio-Rad)를 사용하는 1단계 실시간 정량 PCR을 사용하여 정량화했다. HIF1A에 대한 프라이머 및 프로브는 미리 설계된 PrimeTime qPCR 검정 (Integrated DNA Technologies)에서 나왔다. 평균 임계값 주기 (Ct) 값을 결정하기 위해 각 샘플을 3회 분석했다. 유전자 발현 배수 변화를 Ct 방법을 사용하여 계산했다. 도 2 에 도시된 바와 같이, 구성적으로 발현된 GAPDH mRNA로 HIF1A mRNA를 정규화했다 .
도 2 에 나타낸 바와 같이, siRNA AI3-A-PS2에서 siRNA AI3-A-PS7의 녹다운 효율은 siRNA AI3-A-PS1-처리 세포로 정규화한 후 유사했다. siRNA 안티센스 가닥의 위치 5-8에서 PS 연결은 siRNA의 녹다운 효율에 영향을 미치지 않는다.
실시예 3: 녹다운 효율이 높은 항-HIF1A siRNA의 개발
이 실시예는 HIF1A 발현을 방해하는 데 높은 효율을 보이는 항-HIF1A siRNA의 식별을 보고한다.
후보 항-HIF1A siRNA의 설계
인간 HIF1A mRNA 서열 (GenBank 번호 NM_001530.4) (항-HIF1A siRNA)을 표적으로 하는 siRNA 후보를 설계한 후 다음 사항을 기반으로 표적 이탈 가능성이 낮은 후보를 선택했다: (1) 인간 mRNA 데이터베이스에 대한 낮은 교차 반응성; 및 (2) siRNA 후보의 표적이 될 것으로 예측되는 필수 유전자의 수가 적음. 첫 번째 세트의 siRNA가 합성되어 하기 표 3에 나타낸 것처럼 이중체로 형성되었다. HIF1A siRNA의 첫 번째 세트 (하기 표 3)를 HepG2 세포에서 HIF1A mRNA 억제에 대해 스크리닝했다. HepG2 세포를 이들 siRNA로 24시간 동안 형질감염시켰다. 그런 다음 HIF1A 발현을 실시간 qPCR을 사용하여 측정하였다.
HepG2 세포의 배양
인간 간세포 암종 (HepG2) 세포주를 5%CO2가 있는 37℃에서 10% 소 태아 혈청 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA), 200 단위/mL 페니실린 + 200 단위/ mL 스트렙토마이신을 함유하는 최소 필수 배지 (Gibco, ThermoFisher Scientific, USA)에서 배양했다.
siRNA 형질감염
HepG2 세포를 24-웰 배양 플레이트에5Х 105 세포/웰로 접종했다. 18시간 배양 후, 배지를 500 ul의 신선한 성장 배지로 교체했다. 각 웰에 대한 siRNA 및 RNAiMax의 복합 조성물은 다음과 같이 제조되었다: (1) 1 ul의 siRNA를 50 ul의 Opti-MEM에 첨가한다; (2) 1.5 ul의 RNAiMax를 50 ul의 Opti-MEM에 첨가한다; (3) (1)과 (2)를 가볍게 섞어 실온에서 10분간 배양한다. 각 웰에 100ul의 siRNA/RNAiMax 복합체를 첨가하여 형질감염을 수행했다. 그런 다음 세포를 RNA 정제 전에 24시간 동안 배양했다.
RT-qPCR
총 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 단리했다. HIF1A mRNA 수준을 LightCycler 480 (Roche Diagnostics)에서 수행된 iTaq Universal Probes 1단계 키트 (Bio-Rad)를 사용하는 1단계 실시간 정량 PCR을 사용하여 정량화했다. RT-qPCR을 384-웰 플레이트에서 10 ul의 총 부피의 50 ng의 총 RNA, 500 nM의 정방향, 역방향 프라이머 및 프로브 각각, 0.25 ul의 역전사효소, 및 2ХiTaq 마스터 믹스를 사용하여 3회 수행하였다. HIF1A 및 GAPDH에 대한 프라이머 및 프로브 (표 2)는 Integrated DNA Technologies에서 합성되었다. 주기 조건은 제조업체가 권장하는 주기 매개변수에 따랐다: 10분 동안 50℃, 2분 동안 95℃, 및 95℃에서 15초, 60℃에서 1분의 40주기. 유전자 발현 배수 변화를 △△Ct 방법을 사용하여 계산했다. HIF1A mRNA를 구성적으로 발현된 GAPDH mRNA로 정규화하였다.
표 2. RT-qPCR에 사용된 프라이머 및 프로브
결과
1차 스크리닝에서, HepG2 세포를 30 nM HIF1A siRNA로 처리했다. 결과를 표 3에 나타낸다. siRNA로 처리된 HepG2 세포에서 HIF1A mRNA의 상대적 발현율은 RNAiMax 단독 및 siRNA 없음으로 처리된 대조군에 대한 % HIF1A mRNA로 표현된다.
표 3. siRNA로 처리한 인간 간암 세포에서 HIF1A mRNA의 상대적 발현율
이중체 번호 3, 7 및 10은 표 4에 나열된 대로 추가로 변형되었다. 1 nM siRNA로 처리된 HepG2 세포에서 두 번째 스크리닝을 수행했다. siRNA 형질감염 및 RT-qPCR은 이전에 설명한 대로 수행되었다. 각 siRNA 이중체에 의한 HIF1A 발현 수준은 표 4에 제시되어 있다.
표 4. 변형된 siRNA 후보물질로 처리된 인간 간암 세포에서 HIF1A mRNA의 상대적 발현율
실시예 4: 인간 HepG2 이종이식 마우스에서 항-siRNA의 효과
이종이식 마우스에서 예시적인 항-HIF1A siRNA (AI3-UM4, 일명, AI3)의 녹다운 효과를 다음과 같이 조사하였다. HepG2 세포를 4주령 암컷 M-NSG 마우스에 피하 접종했다. 종양이 평균 부피 50 mm3에 도달했을 때, 마우스를 종양 크기에 따라 무작위로 두 그룹으로 나누고 (각 그룹에서 n=3) 그런 다음 1일, 3일, 7일, 및 14일에 PBS (비히클) 또는 HIF1A siRNA (10 mg/Kg)를 피하 주사했다. 본 연구에서는 AI3-UM4 (AI3)를 예로 사용했다.
21일 후, 마우스를 희생시키고 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 종양 이종이식편으로부터 총 RNA를 추출했다. HIF1A mRNA의 상대적 발현은 이전에 설명한 대로 RT-qPCR로 정량화되었다. 인간 HepG2 종양 이종 이식편의 HIF1A 발현 수준은 도 3a에 제시되어 있다. 대조군 (비히클 처리)으로 정규화한 후, HIF1A siRNA (10 mg/Kg AI3)로 처리된 HIF1A mRNA 수준은 인간 간세포 암종 세포에서 52% 감소했다.
추가로, 예시적인 항-HIF1A siRNA의 항종양 성장 효과를 이종이식 마우스 모델에서 조사하였다. HepG2 종양 (~50mm3)을 보유하는 암컷 M-NSG 마우스를 준비하고 이전에 설명한 대로 두 그룹으로 나누었다. 비히클 및 HIF1A siRNA를 1일, 3일, 7일 및 14일에 마우스에 피하 주사하였다. 각 마우스의 종양 길이와 폭을 3주 동안 매주 2회 측정했다. 종양 부피는 LХ W2Х0.5로 계산되었다. 상대 종양 부피 (%)는 각 마우스의 초기 종양 부피 (투여 초기 시점)에 대한 각 시점의 종양 부피의 백분율로 정의된다. 도 3b에 나타낸, HIF1A siRNA (10mg/Kg AI3)의 투여는 인간 간세포 암종 세포에서 종양 부피를 49%까지 유의하게 감소시켰다.
다른 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대체 특징으로 대체될 수 있다. 따라서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 기능은 등가 또는 유사한 기능의 일반적인 시리즈의 예일뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 쉽게 확인할 수 있고, 그 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도와 조건에 적응시키기 위해 다양한 변화와 수정을 가할 수 있다. 따라서, 다른 구현예도 청구범위 내에 있다.
등가물
여러 가지 본 발명의 구현예가 본원에 기술되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/하거나 설명된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 수 있을 것이고, 본원에 설명되어 있으며, 이러한 변형 및/또는 수정 각각은 본원에 설명된 본 발명의 실시예의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것으로 의미되며 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성은 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 분야에 따라 달라질 것이라는 점을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 특정 발명의 실시예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러므로 전술한 구현예는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 그 균등물의 범위 내에서, 본 발명의 구현예는 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 독창적인 구현예는 본원에 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우, 두 개 이상의 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 달리 명확하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 문구 "및/또는"은 결합된 요소들 즉, 어떤 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소들 중 "둘 중 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식으로 해석되어야 한다, 즉, 요소의 "하나 이상"이 결합된 것이다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든, 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우 "A 및/또는 B"에 대한 참조는 한 구현예에서, A만을 참조할 수 있고 (선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 구현예에서, B만을 참조할 수 있고 (선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, A와 B 모두를 참조할 수 있다 (선택적으로 다른 요소 포함); 등.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 같이, "또는"은 위에서 정의한 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 즉, 요소의 수 또는 목록 중 적어도 하나는 물론 하나 이상, 선택적으로 추가 미등록 항목도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 반대로 명확하게 표시된 용어만, 예를 들어 "중 하나만" 또는 "중 정확히 하나," 또는, 청구범위에서 사용되는 경우, "로 이루어지는"은 요소의 수 또는 목록의 정확히 하나를 포함하는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "둘 중 하나," "중 하나," "중 하나만," 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 앞에 올 경우 배타적인 대안 (즉 "둘 중 하나지만 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에 사용된 "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 나열된 각 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없으며 요소 목록에서 요소의 임의의 조합을 제외하지도 않는다. 이 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소들과 관련이 있든 없든, 문구 "적어도 하나"가 참조하는 요소들의 목록 내에서 특별히 식별된 요소들 외에 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나," 또는, 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 구현예에서, 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는 적어도 하나, B가 존재하지 않는 A (및 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 구현예에서, 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는 적어도 하나, A가 존재하지 않는 B (및 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는 적어도 하나, A, 및 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는 적어도 하나, B (및 선택적으로 다른 요소를 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
또한, 명확하게 반대로 나타내지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급되는 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.

Claims (32)

  1. 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 변형된 소간섭 RNA (siRNA) 분자로서, 상기 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 포함하며, 여기서 변형된 siRNA는 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 갖지 않는 siRNA 대응물과 비교하여 감소된 표적외 효과를 갖는 변형된 소간섭 RNA (siRNA) 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 위치 1과 2의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 2와 3의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함하는 변형된 siRNA 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 19-25개 뉴클레오티드 길이인 변형된 siRNA 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 3' 말단의 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이 및/또는 3' 말단의 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함하는 변형된 siRNA 분자.
  5. 제3항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오티드 길이인 변형된 siRNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 위치 19와 20의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 20과 21의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함하는 변형된 siRNA 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 siRNA 분자는 선택적으로 박테리아 유전자, 바이러스 유전자 또는 진균 유전자인 병원성 유전자의 발현을 침묵시키는 변형된 siRNA 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 siRNA 분자는 질환 유전자의 발현을 침묵시키는 변형된 siRNA 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 질환 유전자가 암, 섬유증, 대사 질환, 심혈관 질환, 면역 질환 또는 유전 질환에 관여하는 변형된 siRNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 질환 유전자가 암에 관여하고, 선택적으로 질환 유전자가 HIF1A, HIF2, IGF1R, VEGF, EREG, KRAS, ALK, BRAF, NRAS, STAT3, CDH2, KIFL1, PIK3CA, Src, RAS, RAF, 및 TP53로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변형된 siRNA 분자.
  11. 제9항에 있어서, 상기 질환 유전자가 섬유증에 관여하고, 선택적으로 질환 유전자가 HIF1A, HIF1B, HIF2, TGF-β1, 및 CTGF로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변형된 siRNA 분자.
  12. 제9항에 있어서, 상기 질환 유전자가 대사 질환 또는 심혈관 질환에 관여하고, 선택적으로 질환 유전자가 AGT, ApoC-III, 및 apoB로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변형된 siRNA 분자.
  13. 제9항에 있어서, 상기 질환 유전자가 면역 질환에 관여하고, 선택적으로 질환 유전자가 GATA-3, CCR3, TGF-β1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, CCL2, 및 CCL10으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변형된 siRNA 분자.
  14. 제9항에 있어서, 상기 질환 유전자가 유전 질환에 관여하고, 선택적으로 질환 유전자가 apoB 또는 PCSK9인 변형된 siRNA 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 siRNA 분자가 표적화 모이어티와 연관되는 변형된 siRNA 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 변형된 siRNA 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  17. 표적 유전자를 침묵시키는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 변형된 siRNA 분자 또는 제16항의 약학 조성물을 표적 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 접촉 단계가 변형된 siRNA 분자 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 수행되는 방법.
  19. 인간 저산소증 유발 인자 1 서브유닛 알파 (HIF1α)를 표적으로 하는 간섭 RNA로서, 상기 간섭 RNA는 HIF1α mRNA의 표적 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 HIF1α mRNA의 표적 부위는 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 간섭 RNA:
    (a) AGGCCACAUUCACGUAUAU (서열 번호 1);
    (b) UGAGGAAGUACCAUUAUAU (서열 번호 2);
    (c) CCGGUUGAAUCUUCAGAUA (서열 번호 3);
    (d) GCGCAAGUCCUCAAAGCAC (서열 번호 4);
    (e) AGGCCACAUUCACGUAUA (서열 번호 5);또는
    (f) UGAGGAAGUACCAUUAUA (서열 번호 6).
  20. 제19항에 있어서, 상기 간섭 RNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 소간섭 RNA (siRNA)인 간섭 RNA.
  21. 제19항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 19-25개 뉴클레오티드 길이인 간섭 RNA.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각, 다음의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 간섭 RNA:
    (a) 5'-AGGCCACAUUCACGUAUAA-3' (서열 번호 7) 및
    5'-UUAUACGUGAAUGUGGCCUGU-3' (서열 번호 8); 또는
    (b) 5'-UGAGGAAGUACCAUUAUAA-3' (서열 번호 9) 및
    5'-UUAUAAUGGUACUUCCUCAAU-3' (서열 번호 10).
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드 간 연결을 포함하고, 여기서 변형된 siRNA는 위치 5와 6의 뉴클레오티드 사이와 위치 6과 7의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결이 없는 siRNA 대응물과 비교하여 감소된 표적외 효과를 갖는 간섭 RNA.
  24. 제23항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 위치 1과 2의 뉴클레오티드 사이 및/또는 위치 2와 3의 뉴클레오티드 사이에 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함하는 간섭 RNA.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 3' 말단의 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이 및/또는 3' 말단의 제2 뉴클레오티드와 제3 뉴클레오티드 사이의 PS 뉴클레오티드 간 연결을 추가로 포함하는 간섭 RNA.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간섭 RNA가 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 간섭 RNA.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드가 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 또는 이들의 조합을 포함하는 간섭 RNA.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 제시된 인간 HIF1α를 표적으로 하는 간섭 RNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  29. 인간 HIF1α의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 제시된 유효량의 간섭 RNA를 인간 HIF1α를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 접촉 단계가 유효량의 간섭 RNA 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 대상체는 HIF1α와 연관된 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 인간 환자인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 HIF1α와 연관된 질환은 암, 심장 질환, 폐 질환, 간 질환, 신장 질환, 비만 또는 당뇨병인 방법.
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