KR20240041299A

KR20240041299A - Bi-1 길항제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20240041299A
Application number: KR1020240038520A
Authority: KR
Inventors: 채한정; 김형룡; 김현경; 이금화
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2024-03-20
Publication date: 2024-03-29
Also published as: KR20240042380A; WO2022014975A1

Abstract

본 발명은 2E-1-2-아미노페닐-3-3니트로페닐-2-프로펜-1-온 (2E-1-2-Aminophenyl-3-3-nitrophenyl-2-propen-1-one; BIA) 또는 그의 유사체의 BI-1과 관련된 질병의 예방, 치료 및 개선의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용건에서 제시한 BIA 및 그 유사체들은 BI-1 (TMBIM6)유전자의 칼슘 유리 기능을 억제하고, 이로 인하여 mTORC2와의 결합을 감소시키며, 또한 mTORC1 및 mTORC2 활성을 감소시키고 리보솜의 모집(recruitment)를 감소시키며 궁극적으로 AKT를 억제하게 되어서, 암의 성장을 저해하는 효과를 가진다.

Description

BI-1 길항제 및 그의 용도 {BI-1 antagonists and the use thereof}

본 발명은 BI-1 (Bax inhibitor-1; TMBIM6 라고도 함) 길항제, 특히 2E-1-2-아미노페닐-3-3-니트로페닐-2-프로펜-1-온 및 그의 유사체 화합물의 의약 용도에 관한 것이다.

종양은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비상식적으로 비제어적인 무질서한 세포 증식의 산물로서, 파괴적인 증식성, 침입 및 전이성을 가지게 되면 악성종양으로 분리된다. 악성종양을 치료하는 방법으로 주로 3가지 치료법 즉, 방사선 치료, 외과적인 수술 및 화학요법을 이용하고 있으며, 이 중 한 가지 또는 이들의 조합을 통해 암을 치료하고 있다. 암 치료 용법 중에서 화학요법은 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 암을 치료하는데 이용되고 있는데, 아직까지는 진정한 치료제로서의 항암제는 개발되지 않은 상태이며, 더구나 항암제에 의하여 유도되는 부작용 또는 항암제 내성으로 인해 항암제의 실효성이 매우 낮으므로, 보조 치료제 내지는 당기간의 생명연장을 돕는 정도에 불과한 실정이다.

세포 성장 및 대사를 조절하는 신호의 중심 조절자로서 라파마이신 메커니즘 표적 (mTOR; mechanistic target of rapamycin)이 알려져 있고, 이는 암 및 당뇨병 환자에서 과발현되는 것으로 보고되었다 (Zoncu R. et al., 'mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing' Nat Rev Mol Cell Biol (2011) Vol.12(1), 21-35).

mTOR 시그널링의 저해제로 라파마이신이 처음으로 확인되어 암치료제로 개발되었다. 그러나, 라파마이신은 mTOR를 부분적으로만 저해한다는 것이 밝혀졌으며, 이에 따라 라파로그, 시롤리무스 등이 mTOR 저해제의 1세대 약물로서 개발되었다. 그러나 mTOR는 변이가 잘되어, 1세대 약물에 대한 저항성이 문제가 되었으며, 이를 극복하기 위하여 2세대 및 3세대 약물이 개발되었다. 그러나, mTOR의 빠른 변이로 mTOR를 타겟으로 하는 약물의 개발에는 한계가 있다. 따라서, 이를 극복할 수 있는 새로운 약물의 개발이 필요한 실정이다.

본 개시에서 해결하고자 하는 과제는 mTOR 시그널링 경로의 상위 요소 (upstream component) 및 그의 시그널링 경로를 규명하고, 그의 길항제를 제공하는 것이다.

본원에서 사용되는 하기 용어는 달리 특정하지 않는 한 다음과 같은 의미를 가진다:

정의

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이 단수형 "일", "하나" 및 "상기"는 문맥에 따라 명확하게 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다.

단독 또는 다른 치환기의 일부로서 "알킬"은 달리 특정되지 않는 한, 지정된 탄소수를 갖는 직쇄형 또는 분지형 사슬인 완전히 포화된 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들어, "C₁-C₁₀ 알킬"은 부모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형의 탄화수소 라디칼을 지칭한다.

본 발명의 문맥에서, 달리 특정하지 않는 한, 용어 "알킬"은 "C₁-C₁₀알킬", 바람직하게는 "C₁-C₅ 알킬"을 의미한다.

단독 또는 다른 치환기의 일부로서 "알케닐"은 지정된 탄소수를 갖는 단일 불포화 또는 다중불포화일 수 있는 직쇄형 또는 분지형 사슬을 의미한다. 예를 들어, "C₂-C₈ 알케닐"은 부모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 원자를 갖는 알케닐 라디칼을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 특정하지 않는 한, 용어 "알케닐"은 "C₂-C₁₀ 알케닐", 바람직하게는 "C₂-C₅ 알케닐"을 의미한다

단독 또는 다른 치환기의 일부로서 "알키닐"은 지정된 탄소수를 갖는 단일 불포화 또는 다중불포화일 수 있는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들어, "C₂-C₈알키닐"은 부모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 특정하지 않는 한, 용어 "알키닐"은 "C₂-C₁₀ 알키닐", 바람직하게는 "C₂-C₅ 알키닐"을 의미한다.

"치환"은 탄소(들) 또는 수소(들)에 대한 하나 이상의 결합이 비-수소 및 비-탄소 원자 "치환기"에 대한 결합에 의해 대체되기를 지칭한다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 하기 화학식 1로 나타내어지는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다:

[화학식 1]

여기서

상기 A는 하기의 화학식 1-1, 1-2, 또는 1-3이고,

(상기 화학식 1-1- 내지 1-3의 *는 화학식 1의 페닐기에 연결된다)

상기 B 및 C는 각각 C, 또는 N이며,

상기 R₁ 내지 R₁₀은 각각 H; NH₂; NO2; OH; OR(R은 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); 할로겐 원자; CN; C₁ 내지 C₃의 할로겐화알킬; C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 기; -NH-C(O)-ORa (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -C(O)-NH-Ra (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -NH₂HCl; -C(O)OH; 및 옥심기를 갖는 치환기;로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,

상기 B 또는 C가 N인 경우 R₈ 및 R₉는 수소이며,

상기 B 또는 C가 C인 경우 R₈ 및 R₉는 서로 연결되어 페닐환을 형성할 수 있고,

상기 옥심기를 갖는 치환기는 하기 화학식 1-4로 나타낸다.

(상기 화학식 1-4의 *는 상기 화학식 1의 치환기 R₁ 내지 R₁₀이 치환되는 곳이다)

본 발명의 일 특정 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 1의 상기 B 및 C가 각각 C이고, A가 화학식 1-1, 화학식 1-2 또는 화학식 1-3일 수 있다.

본 발명의 일 특정 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 1의 상기 B 및 C가 각각 C이고, A가 화학식 1-1이며, 치환기 R₈ 및 R₉가 결합하여 페닐기를 형성한 것일 수 있다.

본 발명의 일 특정 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 1의 상기 B 또는 C가 N이고, A가 화학식 1-1일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

(1) 2E-1-2-Aminophenyl-3-3-nitrophenyl-2-propen-1-one (BIA);

(2) 2-(5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)isoxazol-3-yl)aniline (GM-90340);

(3) 2-(5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)isoxazol-3-yl)aniline (GM-90339);

(4) (Z)-3-((E)-3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)-N'-hydroxybenzimidamide (GM-90338);

(5) 3-(3-(2-aminophenyl)isoxazol-5-yl)benzonitrile (GM-90337);

(6) (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-bromo-5-hydroxyphenyl)prop-

2-en-1-one (GM-90321);

(7) (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-

en-1-one (GM-90320);

(8) (E)-3-(3-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzonitrile (GM-90319);

(9) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90318);

(10)(E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-chlorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90317);

(11) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3,5-difluoro-4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90316);

(12) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-aminophenyl)prop-2-en-1-one hydrochloride (GM-90315);

(13) (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)-N-methylbenzamide (GM-90300);(14) tert-butyl (E)-(3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl) carbamate (GM-90299);

(15) (E)-1-(2-amino-5-fluorophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90298);

(16) (E)-1-(2-amino-4-methoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90297);

(17) (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoic acid (GM-90296);

(18) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90295);

(19) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (GM-90285);

(20) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(m-tolyl)prop-2-en-1-one (GM-90284);

(21) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-en-1-one (GM-90283);

(22) (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzonitrile (GM-90282);

(23) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromo-5-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90281);

(24) (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90256);

(25) (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90255);

(26) (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90254);

(27) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(4-(tert-butyl)phenyl)prop-2-en-1-one (GM-90243);

(28) 1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-5-nitrophenyl)-3-hydroxypropan-1-one (GM-90230);

(29) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-5-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90229);

(30) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(pyridin-4-yl)prop-2-en-1-one (GM-90228);

(31) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(p-tolyl)prop-2-en-1-one (GM-90227);

(32) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-en-1-one (GM-90226);

(33) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(naphthalen-2-yl)prop-2-en-1-one (GM-90225);

(34) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90224);

(35) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(2,4-difluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90223);

(36) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)prop-2-en-1-one (GM-90222);

(37) (E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90135);

(38) (E)-1-(2-methoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90134);

(39) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90133);

(40) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90132);

(41) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90131);

(42) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one (GM-90130);

(43) (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90129); 및

(44) (E)-3-(3-nitrophenyl)-1-phenylprop-2-en-1-one (GM-90128);

본 발명의 일 특정 구현예에서, 상기 화학식 1을 갖는 화합물은 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 또는 부분입체 이성질체의 혼합물 형태이다.

본 발명의 일 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 화학식 1은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적 으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 상기 화학식 1 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 상기 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로서 포함하는 BI-1 (TMBIM6) 관련 질환의 예방, 치료, 개선을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로서 포함하는 mTORC2 관련 질환의 예방, 치료, 개선을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로서 포함하는 AKT 관련 질환의 예방, 치료, 개선을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효성분으로서 치료가 필요한 개체에 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

상기 질환은 BI-1 관련 질환, mTORC2 관련 질환, AKT 관련 질환일 수 있다. 상기 질환은 암, 천식 또는 코로나바이러스 감염증일 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다

상기 화학식 1의 화합물은 BI-1 (TMBIM6)의 길항제일 수 있다.

또한, 상기 화학식 1은 mTOR의 활성을 저해하거나; 또는 AKT 또는 S6K의 인산화를 감소시키는 것; 을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 일 양태에서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 일 양태에서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 사용하여 BI-1, mTORC2 또는 AKT를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 일 양태에서, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 포함하는 BI-1, mTORC2 또는 AKT 억제용 조성물 및 이 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 BI-1, mTORC2 또는 AKT의 억제는 시험관 내에서 실시될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물은 BI-1에 의한 칼슘 유리를 억제하고, BI-1과 mTORC2와의 결합을 감소시켜 mTORC2 활성을 감소시키고, 이는 AKT의 활성을 감소시킨다.

따라서, 본 개시의 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물은 BI-1, mTORC2, AKT과 관련된 질환이나 장애의 예방, 치료, 개선, 증상 완화 효과를 가진다. 예를 들어, 암의 성장 및 전이, 감염성 질환, 천식, 코로나바이러스의 침투 및 감염악화 등을 저해하는 효과가 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

도 1은 NCBI의 GEO (Gene Expression Omnibus)에서 제공하는 여러 종양 샘플에 대한 BI-1 (TMBIM6)의 mRNA 발현 프로파일링 데이터를 나타낸다. 섬유육종(GSE2719; 정상 n=3; 종양 n=7), 자궁경부(GSE63678; 자궁경부 정상 n=5; 종양 n=5; 자궁내막 정상 n=5; 종양 n=7; 외음부 정상 n= 7; 종양 n=6), 유방(GSE31448; 정상 n=31; 기저 n=98; 관강(luminal) A n=89; 관광 B n=49; ERBB2 n=25), 폐 (GSE19804; 정상 n=60; 종양 n=60), and 전립선(GSE69223; 정상 n=15; 종양 n=15). 박스의 중앙선은 중앙값(median); 박스 바운드(bounds)는 25th and 75th 백분율; 수염(whiskers)는 최소값 및 최대값을 나타낸다.
도 2는 도 1의 샘플과 동일한 암 조직에서 BI-1 (TMBIM6)의 발현 수준을 비교한 조직 마이크로 어레이 결과이다. 방법을 밸리데이션하기 위하여 TMBIM6 (즉 BI-1) WT 및 녹아웃 HT1080 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 2의 우측은 BI-1 (TMBIM6)의 발현을 정량화한 것이다. 섬유육종(정상 n=9; 종양 n=8); 자궁경부(정상 n=20, 종양 n=80); 유방(정상 n=6, 종양 n=97); 폐(정상 n=15; 종양 n=75); 전립선(정상 n=32; 종양 n=160). 스케일바는 100μm이다. (밤색: 양성 항체 염색, 푸른색: 해마톡실린 핵염색). 데이터는 평균±SD로 나타내었다. ****p<0.0001, two-tailed unpaired t-test 실시.
도 3 내지 도 5는 TCGA와 GTEx 프로젝트의 소스를 이용한 GEPIA2 및 OncoLnc를 사용하여 BI-1 (TMBIM6)의 낮은 발현 및 높은 발현과 전체 생존 (OS) 간의 상관관계를 분석한 결과를 보여주는 Kaplan-Meier curves이다.
BRCA:유방 침윤성 암종, CESC:자궁경부편평세포 암종 및 자궁경부선암, SARC: 육종, LUAD: 폐선암, PAAD: 췌장 선암, ESCA:식도 암종, SKCM: 피부 흑색종, HNSC:두경부 편평세포 암종, LGG:뇌 하급 신경교종
도 6은 CRISPR/Cas9 게놈 편집기술을 사용한 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 세포의 제조를 보여준다.
도 7의 A는 WT(WT) 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃(KO) HT1080 세포, HeLa 세포 및 MEFs의 증식을 나타낸다 (n=3, 독립적으로 실험). 도 7의 B는 BI-1이 복원(rescue)된 BI-1 녹아웃 HT1080 및 HeLa 세포의 증식을 나타낸다(n=3, 독립적으로 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈으며, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test를 실시.
도 8은 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 세포 및 WT 세포에서 세포 이동(A) 및 세포 침윤(B) 실험의 결과의 이미지 및 이를 정량화한 그래프이다. 정량화한 데이터는 녹아웃 세포로 정규화 (normalize)한 WT 세포의 백분율(이동 실험 n=6 for migration, 침윤 실험 n=5, 각 독립적으로 실험)을 나타낸다. 스케일바는 100μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD이다. ****p<0.0001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test를 실시하였다.
도 9의 A는 BI-1 (TMBIM6) WT(WT) 및 녹아웃(KO) HT1080 세포를 면역 손상 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 피하 주사한 사진이다. 도 9의 B~D는 6 주령된 누드마우스 (nude mouse) (그룹당 n=6)의 측면에 주사된 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 또는 WT HT1080 세포로부터 얻어진 종양의 부피, 무게, 크기를 보여준다. 데이터는 평균±SD로 나타냈으며, *p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 9B에서는 Bonferroni's post hoc test, 9C에서는 two-tailed unpaired t-test를 실시하였다.
도 10은 Ki67-양성 증식세포의 면역조직화학 염색 결과이다. 오른쪽은 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 및 WT HT1080 세포로부터 유래한 이종이식 종양에서 Ki-67 양성 세포를 정량화한 것이다. 그룹당 n=6 마우스, 스케일바는 100μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD. ****p<0.0001, two-tailed unpaired t-test 실시.
도 11은 6주령의 누드 마우스(그룹당 n=6 마우스)의 측면에 주사된 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 및 WT HeLa 세포로부터 유래된 종양의 부피, 무게 및 크기를 보여준다. 데이터는 평균±SD로 나타내었다. ***p<0.001; ****p<0.0001, 종양 부피 분석에는 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test, 종양의 무게 분석에는 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test를 실시하였다.
도 12는 Ki67-양성 증식세포의 면역조직화학 염색 결과이다. 오른쪽은 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 및 WT HeLa 세포로부터 유래한 이종이식 종양에서 Ki-67 양성 세포를 정량화한 것이다. 그룹당 n=6 마우스, 스케일바는 100μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD. ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 13은 꼬리 정맥을 통하여 TMBIM6-표적 SAMiRNA, 대조군 SAMiRNA 또는 식염수가 주입된 누드 마우스(그룹 당 n=5 마우스)에서 HT1080으로부터 유래된 종양의 부피, 무게크기를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test (B), 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 14의 A는 TMBIM6 siRNA 처리를 한 HT1080 세포로부터 유리된 종양에서 TMBIM6의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 측정한 결과이다. 그룹당 n=5 마우스. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ****p<0.0001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test. 도 14B는 꼬리 정맥을 통하여 TMBIM6-표적 SAMiRNA, 대조군 SAMiRNA 또는 식염수가 주입된 누드 마우스에서 HT1080 세포로부터 유래된 종양의 Ki-67에 대한 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역조직화학염색 결과이다. 사진은 유사한 결과를 얻은 5 마리의 이종이식 마우스 중 하나로부터 얻은 것이다.
도 15는 WT 및 BI-1 녹아웃 HT1080 세포에서, 프로테옴 프로파일 인간 포스포키나아제 어레이 (Proteome Profile Human Phospho-Kinase Array)를 사용하여 43개 단백질의 발현 및 인산화를 측정한 것이다. 사진은 유사한 결과를 얻은 두 개의 실험결과 중 하나를 나타내었다. 오른쪽은 표시된 단백질의 상대적인 인산화를 Image J로 정량화한 것이다.
도 16은 웨스턴 블롯으로 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 pAKT, pTSC2 및 pNDRG1을 분석한 결과이며(왼쪽), 오른쪽은 WT 세포의 총 단백질로 정규화(normaslize)한 결과이다 (n=5, 독립적으로 실험). 데이터는 평균 means±SD으로 나타냈다. ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 17은 TMBIM6-HA를 안정적으로 발현하거나 발현하지 않는 TMBIM6 녹아웃 세포에서 웨스턴블롯팅, RT-PCR 및 유전자 정량분석을 실시한 결과이다(n=3, 독립적으로 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, **p<0.01, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 18은 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 및 WT HT1080 세포를 혈청 고갈(starvation) 후 인슐린 (100 ng/ml), IGF1 (100 ng/ml), 또는 EGF (100ng/ml)로 12시간 동안 자극하고, 지시된 항체로 웨스턴블로팅을 실시한 결과이다.
도 19는 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 및 WT MEFs의 추출물에 대한 겔여과분석(gel filtration assay)의 결과이다. 붉은선은 사이즈마커를 나타낸다.
도 20은 TMBIM6 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 표시된 단백질들 간의 PLA 결과이다(붉은 점). PLA를 위하여 리보솜 단백질 S6 키나아제 베타-1 (S6K1)을 음성 대조군으로 하였다. 스케일바는 15μm를 나타낸다. 오른쪽은 붉은 점을 정량화한 것이다(n=5, 독립적으로 실험). 데이터는 평균±SD로 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 21은 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포의 항-RPL19 면역침전(IP) 및 전세포용해물(whole cell lysate; WCL)에 대한 웨스턴블롯팅 분석 결과이다.
도 22는 HT1080, HeLa 및 MEFs 세포에서 표시된 단백질들의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 23은 pAKT의 면역형광 이미지이다. 오른쪽은 WT 세포로 정규화된 녹아웃 세포의 평균 pAKT 강도이다 (n=10, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ****p<0.0001, two-tailed unpaired t-test 실시.
도 24는 HA-TMBIM6으로 형질감염된 HeLa 세포에서 표시된 단백질들의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 25는 TMBIM6-HA로 형질감염된 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 MEFs 세포를 혈청 기아 후 12시간 동안 인슐린(100ng/ml)으로 자극하거나 자극하지 않고, 표시된 항체를 사용하여 웨스턴블롯팅을 실시한 결과이다.
도 26은 다양한 농도의 독시사이클린으로 24시간 동안 처리된 TMBIM6 T-Rex 293 세포에서 표시된 단백질들에 대한 웨스턴블롯팅을 실시한 결과이다.
도 27은 BI-1 녹아웃 및 WT HeLa 세포에서 표시된 단백질들 간의 PLA 결과이다(붉은 점). 리보솜 단백질 S6 키나아제를 음성 대조군으로 사용하였다. 스케일바는 15μm을 나타낸다. 하단은 붉은 점을 정량화한 것이다(n=5, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD으로 나타내었다. **p<0.01, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 28은 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 qRT-PCR로 결정한 표시된 단백질들의 mRNA 수준을 나타낸다(n=3, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test가 사용되었다.
도 29는 BI-1 녹아웃 및 WT MEFs의 항-RICTOR IP 및 전세포 용해물(WCL)의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 30은 슈크로스 구배 분획으로 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 폴리솜 프로파일링을 실시한 결과이다. (P)는 폴리솜 분획, (M)은 리보솜 분획.
도 31의 A는 도 30으로부터의 분획을 표시된 항체를 사용하여 웨스턴블롯을 실시한 결과이다. 도 31의 B는 공벡터 및 BI-1 구제(rescue)된 녹아웃 HT1080 세포로부터의 분획을 표시된 항체를 사용하여 웨스턴블롯을 실시한 결과이다. 도 31의 C는 올리고(dT) 풀-다운에 의하여 BI-1을 안정적으로 발현하는 HT1080 세포로부터의 정제된 폴리(A) mRNA-결합 리보솜에서 표시된 항체를 사용하여 웨스턴블롯을 실시한 결과이다. 결합 분획 및 상청액이 표시되었다. A, B, C 모두 유사한 결과를 얻은 2번의 실험 중 하나를 나타낸 것이다.
도 32는 간접적 면역형광으로 PDI (소포체 마커) 및 mTORC2 성분에 대하여 세포를 염색하고(위쪽), co-localization을 정량화(n=15 세포)(아래쪽) 한 결과이다. 스케일바는 10 및 5μm, 아래쪽은 WT 세포로 정규화된 BI-1 녹아웃 세포에서 점(dot)의 강도를 정량화한 것이다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 33의 A는 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 qRT-PCR에 의하여 결정된 해당(glycolysis)- 및 PPP-관련 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다. 정량화 데이터는 WT 세포에 비교하여 녹아웃 세포에서의 유전자의 발현 수준을 나타낸다(n=3, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ****p<0.0001, 이원(two-way) ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시. 도 33B 및 도 33C는 각각 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 글루코스 소비 및 젖산 생산을 나타낸다(n=3, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01; ***p<0.001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 34는 BI-1 (TMBIM6) 과발현 HeLa 세포에서 qRT-PCR에 의하여 결정된 해당(glycolysis)- 및 PPP-관련 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다. 정량화 데이터는 β-액틴의 수준에 정규화된 후에 정규화된 공벡터(EV) 세포를 나타낸다(n=2, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p< 0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 35는 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서의 대사 분석 결과이다 (n=2, 독립적 실험).
도 36은 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 qRT-PCR에 의하여 결정된 GSH 생합성 유전자 및 de novo lipid biosynthesis 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다. 정량화 데이터는 WT 세포에 비교하여 녹아웃 세포에서의 유전자의 발현 수준(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 37은 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 단백질 생합성의 면역형광 이미지이다. 오른쪽의 정량화 데이터는 WT (wild-type) 세포와 비교한 발현 강도를 나타낸다(n=3, 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, two-tailed unpaired t-test. 스케일바는 15μm.
도 38의 A는 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 마이크로어레이에 의한 글리코실화 관련 유전자 목록을 나타낸 것이다. 도 38B는 BI-1 녹아웃 및 WT HT1080 세포에서 글리코실화된 단백질 수준을 나타낸다(n=3, 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, two-tailed unpaired t-test 실시.
도 39의 A는 TMBIM6-HA를 일시적으로 과발현하는 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포 용해물(lysates)의 겔 여과 분석 결과이다. 도 39의 B는 TMBIM6-HA를 일시적으로 과발현하는 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포의 풀링된 분획의 항-RICTOR 면역침전(IP) 결과이다. 웨스턴블롯팅으로 분석하였다.
도 40의 A는 TMBIM6-HA를 과발현하는 HeLa 세포의 항-HA IP 및 전세포용해물(WCL)의 웨스턴블롯 분석결과이다. 도 40의 B는 BI-1 (TMBIM6)을 안정적으로 과발현하는 HT1080 세포에서 TMBIM6-HA 및 mTORC2 성분(붉은 점들) 간의 PLA 결과이다. 아래 그래프는 붉은 점들을 정량화한 것이다 (n=5, 독립적으로 실험), 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원(two-way) ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 41의 A는 GST-BI-1과 myc-RICTOR 간의 GST pull-down 분석 결과이다. 도 41의 B는 HA-TMBIM6와 RPL19간의 GST pull-down 분석결과이다.
도 42의 A는 BI-1 (TMBIM6)을 안정적으로 발현하고 scrambled, mTOR, RICTOR, 또는 SIN1 siRNA로 형질감염되고 항-HA 항체로 면역침전된 HT1080 세포의 전세포용해물(WCL)의 웨스턴블롯 분석 결과이다. 도 42의 B는 BI-1 (TMBIM6) 및 BI-1 변이 구축물(construct)로 일시적으로 감염된(transfected) HT1080 세포의 항-RICTOR 항체와의 면역침전물 및 WCL의 웨스턴블롯 분석 결과이다. 도 42의 C는 BI-1 (TMBIM6) 및 BI-1 변이 구축물(construct)을 transfection한 HT1080 세포의 항-HA 항체와의 면역침전물 및 input의 웨스턴블롯 분석 결과이다.
도 43의 A는 TMpred, TMHMM 및 BsYetJ에 따른 BI-1의 토폴로지에 대한 생물정보학적 예측 결과이다. 박스 및 숫자는 각각 막통과 도메인 및 아미노산을 나타낸다. 도 43의 B는 상기 설명을 기초로 BI-1 (TMBIM6) 및 BsYetJ 간의 아미노산 서열 정렬 결과이다. 박스 및 선은 각각 A의 동일 또는 대체 예측 서열을 나타낸다.
도 44는 디기토닌 또는 트리톤 X-100에 의한 투과화(permeabilization) 후에 N-말단 (HA-TMBIM6) 및 C-말단 (TMBIM6-HA) HA 태그로 태그된 BI-1 (TMBIM6)를 과발현하는 세포를 사용한 면역형광 결과이다. 사진은 유사한 결과를 얻은 5번의 실험들 중의 하나를 나타낸다.
도 45는 BI-1과 상호작용을 하는 단백질을 확인한 결과이다.
- (A) 플레이트 방법에 의한 T4 파아지 디스플레이 스크리닝을 위한 프로토콜의 개략도이다. (B) 확인된 단백질의 아미노산 서열
도 46의 A는 BAPTA-AM (10μM), BAPTA (10μM), 및 EGTA-AM (10μM)으로 처리된 HT1080 세포에서 표시된 단백질들(붉은 점들) 간의 PLA 결과이다. 스케일바는 15μm를 나타낸다. 오른쪽 그래프는 붉은 점들을 정량화한 것이다 (n=3, 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01; ****p<0.0001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 46의 B는 BI-1 (TMBIM6)의 C-말단에 직접적으로 융합된 유전적으로 인코드된 Ca2+ 인디케이터 (GCaMP3)에 의한 TMBIM6-GCaMP3을 그림으로 나타낸 것이다.
도 47의 A는 BI-1 (TMBIM6) 및 D213A의 발현이 rescue된 녹아웃 세포를 calnexin (CANX, ER marker)으로 염색한 결과이다. 도 47의 B는 BI-1-누출 Ca2+, 그리고 mTORC2 및 리보솜 복합체와의 상호작용을 그림으로 나타낸 것이다.
도 48은 10ㅅM BAPTA-AM의 있을때와 없을 때 TMBIM6-GCaMP3 및 TMBIM6 D213A-GCaMP3의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 형광 강도(오른쪽)을 나타낸다(n=5 독립적 실험). 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ***p<0.001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 49는 공백터(empty vector), BI-1 (TMBIM6) 또는 D213A-transfection된 HT108 세포에서 Rictor 및 mTOR 사이 또는 Rictor 및 RPL19 사이의 PLA 결과이다(붉은 점들). (n=3 독립적 실험). 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타내었다. ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 50은 항-HA 항체와 표시된 항체를 가지는 세포 용해물의 input의 면역침전물의 웨스턴블롯 분석결과를 나타낸다.
도 51의 A는 공벡터, BI-1 (TMBIM6) WT 및 TMBIM6 D213A로 transfection된 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 AKT 인산화의 웨스턴블롯팅 및 정량화 그래프이다(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ***p<0.001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 51의 B는 AKT 인산화의 면역형광 이미지 및 정량화 그래프이다. (n=3 독립적 실험, 9개 이미지의 합). 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ****p<0.0001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 52는 공벡터, BI-1 및 TMBIM6 D213A-발현 HT1080 세포의 증식 분석 결과이다(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 53의 A는 qRT-PCR에 의한 공벡터, BI-1 및 TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 해당(glycolysis)-관련 및 PPP-관련 유전자의 mRNA 수준의 정량화 분석 결과이다. 정량화 데이터는 정규화된 WT HT10880 세포의 유전자 발현 수준과 비교한 유전자의 발현 수준을 나타낸다(붉은 선, n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 53의 B, C는 공벡터, BI-1 (TMBIM6) 및 TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 글루코스 소비 및 젖산 생산을 나타낸다(n=3 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, **p<0.01, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 53의 D는 공벡터, BI-1 (TMBIM6) 및 TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서의 대사산물(metabolite) 분석 결과이다. 정량화 데이터는 공벡터-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포의 대사산물 수준과 비교한 대사산물의 수준을 나타낸다(n=2 독립적 실험).
도 54의 A는 공벡터, BI-1 (TMBIM6), TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 BI-1-HA의 웨스턴블롯팅 결과이다.
도 54의 B, C는 qRT-PCR에 의해 결정된, 공벡터, BI-1 (TMBIM6), TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 GSH 생합성 유전자(B) 및 de novo 지질 생합성 유전자(C)의 mRNA 수준을 나타낸다. 정량화 데이터는 정규화된 WT HT1080 세포의 유전자 발현 수준과 비교한 유전자의 발현 수준을 나타낸다(붉은 선, n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 55는 공벡터, BI-1 (TMBIM6), TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서의 대사산물 분석의 결과를 나타낸다. 정량화 데이터는 공벡터-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포의 대사산물 수준과 비교한 대사산물의 수준을 나타낸다(n=2 독립적 실험).
도 56은 Sucrose 구배 분획화에 의하여 공벡터, BI-1 (TMBIM6), TMBIM6 D213A-rescued BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 수행된 폴리솜 프로파일링 결과를 나타낸다.
도 57은 BIA를 처리한 BI-1 (TMBIM6) WT HT1080 세포, BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080, MCF7, MDA-MB-231 및 SKBR3 세포의 증식을 관찰한 결과이다(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다.
도 58은 1.0μM BIA로 처리된 HT1080 세포의 겔 여과 분석 결과이다. 붉은 선은 사이즈 마커를 나타낸다.
도 59의 A는 일시적으로 TMBIM6-HA를 과발현하며 BIA로 처리된 HT1080 세포의 항-HA 면역침전(IP) 및 전세포용해물(WCL)의 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 59의 B는 표시된 세포주에 BIA를 처리한 후 p-AKT, AKT 및 액틴에 대한 웨스턴블롯팅을 실시한 결과를 나타낸다.
도 59의 C는 BIA를 처리하거나 처리하지 않은 BI-1 (TMBIM6)을 안정적으로 과발현하는 HT1080 세포에서 TMBIM6-HA와 mTORC2 구성요소들(components) 사이 또는 TMBIM6-HA와 RPL19 사이의 PLA 결과를 나타낸다(붉은 점들). 아래 그래프는 붉은 점들을 정량화한 것이다(n=5 독립적 실험). 스케일바는 20μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 60은 TMBIM6-GCaMP3 (A) 및 G-CEPIAer (B)을 안정적으로 과발현하는 HT1080 세포에 BIA를 처리한 후 실시간 lapse 이미지를 나타낸다. 오른쪽은 BIA가 처리되지 않은 세포로 정규화한 모든 세포의 평균 녹색 강도이다 (n=5 독립적 실험, TMBIM6-GCaMP3에 대하여 총 20 cells; G-CEPIAer에 대하여 총 16 cells). 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다.
도 61의 A는 다양한 암세포에서 BI-1 (TMBIM6)의 mRNA 수준을 나타낸다. 각 세포의 mRNA 수준은 β-액틴의 수준으로 정규화되었다(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001, 일원 ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 61의 B는 3일 동안 표시된 농도의 BIA로 처리된 암세포에서 세포 생존도를 측정한 결과를 나타낸다(n=3 독립적 실험).
도 62의 A는 안정적으로 BI-1을 발현하는 세포 및 공벡터를 BIA를 표시된 농도로 처리 후 1일 후에 세포 증식을 분석한 결과를 나타낸다(n=3 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 62의 B는 10μM의 BIA를 처리한 HT1080 세포에서 RICTOR 및 다음 단백질들 mTOR, RPL19 및 RPS 16 간의 PLA를 실시한 결과이다. 스케일바는 20μm를 나타낸다. 오른쪽 그래프는 붉은 점들을 정량화한 것이다(n=5 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 63의 A는 AKT 인산화의 웨스턴블롯팅 결과를 나타낸다.
도 63의 B는 세포 생존도(cell viability) 분석결과를 나타낸다.
도 64의 A는 이동된 세포의 이미지이다. 오른쪽 그래프는 표시된 농도의 BIA로 처리된 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 이동된 세포의 정량화 분석을 실시한 결과를 나타낸다. BI-1 (TMBIM6) 처리된 세포의 세포 생존도 및 이동된 세포는 대조군 세포에 대하여 정규화되었다. (n=3 독립적 실험).
도 64의 B는 2μM BIA로 처리한 HT1080 세포로 Wound healing assay를 실시한 결과를 나타낸다. 이미지 (A) 및 정량화 그래프 (B) (n=3 독립적 실험).
도 65의 A는 2.0μM BIA로 처리된 HT1080, MCF7, MDA-MB-231, 및 SKBR3 세포에서 migration된 세포의 이미지이다. 오른쪽 그래프는 대조군 세포로 정규화된 BIA 처리된 세포에서 migration된 세포를 정량화한 것이다(n=3 독립적 실험. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ***p<0.001, two-tailed unpaired t-test 실시. 스케일바는 15μm를 나타낸다.
도 65의 B는 2.0μM BIA로 처리된 HT1080 및 MDA-MB-231 세포에서 침입 세포(invasive cell)의 이미지이다. 오른쪽 그래프는 대조군 세포로 정규화된 BIA 처리된 세포에서 침입 세포를 정량화한 것이다(n=3 독립적 실험). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, ***p<0.001, two-tailed unpaired t-test 실시. 스케일바는 15μm를 나타낸다.
도 66의 A는 3D 배양 후 7일 후의 표시된 세포주의 DiI 형광 이미지이다. 오른쪽은 대조군 세포로 정규화된 BIA-처리 세포의 형광 강도를 정량화한 것이다(n=3 독립적 실험). 스케일바는 15μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ***p<0.001, ****p<0.0001, two-tailed unpaired t-test 실시.
도 66의 B는 표시된 세포주를 배아(embryos)로 주사한 후의 대조군 및 BIA-처리된 지브라피쉬의 이미지이다. 흰색 및 붉은색 원은 각각 세포 주사부위 및 이동 부위를 나타낸다. 이미지는 유사한 결과를 얻은 9개의 실험 중 하나를 나타낸다. 스케일바는 100μm를 나타낸다.
도 67의 A, B는 vehicle 또는 1mg/kg BIA로 처리된 누드 마우스에 주사된 HT1080 세포로부터 유도된 종양의 부피 및 중량을 나타낸다(비히클 vehicle; n=9, BIA; n=11 마우스). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test (A) 또는 two-tailed unpaired t-test (B) 실시.
도 67의 C, D는 vehicle 또는 1mg/kg BIA로 처리된 누드 마우스에 주사된 MDA-MB-231 세포로부터 유도된 종양의 부피 및 중량을 나타낸다. (각 그룹당 n=5 마우스). 데이터는 평균±SD로 나타냈다. ***p<0.001, ****p<0.0001, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test (C) 또는 two-tailed unpaired t-test (B) 실시.
도 68은 HT1080, PANC-1, Capan-1 및 MIA PaCa-2에 10μM BIA 및 mTOR 저해제를 처리한 후의 Crystal Violet 염색 이미지이다. 오른쪽 그래프는 대조군 세포로 정규화한 세포 생존도(cell viability)를 정량화한 것이다(n=3 독립적 실험).
도 69는 (B) BIA 또는 mTOR 억제제들로 처리된 PANC-1 세포에서 표시된 단백질들 간의 PLA 결과를 나타낸다(붉은 점들). 오른쪽 그래프는 붉은 점들을 정량화한 것이다(n=5 독립적 실험). 스케일바는 20μm를 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. **p<0.01, 이원 ANOVA 후 Bonferroni's post hoc test 실시.
도 70은 BIA 또는 그 유사체 화합물 10uM을 HT1080 섬유육종 세포주 및 DU145 전립선암 세포주에 처리하고 세포 생존도를 측정한 결과이다(n=3 독립적인 실험). 데이터는 평균±SD로 나타내었다. 일원(one-way) ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 71은 BIA 및 그 유사체 화합물 10 uM을 HT1080 섬유육종 세포주 에 처리하여 AKT serine 인산화 (S473)정도를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정한 결과이다. 이는 암세포성장에 핵심적인 AKT신호전달로써 BIA 및 그 유사체가 이를 억제하는 경향을 보여주고 있다. 대표적 실험결과만 제시하였다. 데이터는 평균±SD로 나타내었다. 일원(one-way) ANOVA 후 Tukey's post hoc test 실시.
도 72는 BIA 및 그 유사체화합물 각 10uM을 HT1080 섬유육종 세포주에 처리하여 암세포의 특징인 세포 migration을 보기 위하여 8.0μm 기공이 있는 Transwell 삽입물 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 폴리카보네이트 막을 활용하여서 확인하였다. 세포를 트립신 처리하고 DMEM에서 혈청 및 2 × 104 세포를 상부 챔버에 추가하고 12시간 동안 transwell을 통하여 하부 챔버로 이동된 세포를 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 migration 분석을 수행하였다.
도 73은 BIA 및 그의 유사체들 HT1080 fibrosarcoma 세포에 처리한 후에 암세포의 특징인 세포 침입(invasion)을 측정한 결과이다. 8.0μm 기공이 있는 BD BioCoat Matrigel 침입 챔버를 활용하여 24 well 세포 배양 삽입물의 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막 (BD Biosciences)을 통하여 세포를 12시간 동안 이동시킨 다음 고정, 크리스탈 바이올렛염색을 수행하여 invasion 정도를 측정하였다.
도 74의 A는 TMBIM6-GCaMP3을 발현하도록 형질 감염된 HT1080 세포에 BIA 10μM을 처리하고, 시간에 따른 TMBIM6를 통하여 나오는 칼슘의 양을 측정한 결과이다. 도 74의 B는 HT1080세포에 BIA 10μM을 처리하고, ER내부의 칼슘농도를 측정하도록 제작된 G-CEPIAer의 형광 강도를 관찰한 결과이다.
도 75는 TMBIM6-GCaMP3의 형광이 발현되는 대조군 (DMSO 처리) 조건의 세포와 비교하여, BIA를 비롯한 유사체 10μM을 처리하였을 때 그 형광의 변화를 관찰하여 BI-1(TMBIM6)을 통하여 나오는 칼슘 이미지를 확인한 결과이다.
도 76의 A는 WT 마우스 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 마우스의 천식 유발군의 기관지 폐포 세척액 (BAL) 샘플 (1ml)을 각 마우스로부터 수득하고 적혈구 (Zap-Oglobin II; Beckman-Coulter)를 용해한 후 입자 계수기 (Model Z1; Beckman-Coulter, Miami, FL, USA)를 사용하여 총 세포 수를 결정하기 위해 세포 펠릿을 풀링했다. 슬라이드에 세포를 넣고 원심 분리(700g x 3분)하고 Diff-Quick (Baxter, Detroit, MI, USA)으로 염색하여 염증세포수를 검출한 결과를 나타낸다.
도 76의 B는 WT 마우스 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 마우스의 천식 유발군의 BAL 샘플 10uL를 0.4% trypanblue 10uL와 혼합한 후 세포수 측정기 (Countess Automated Cell Counter, Invitrogen, USA)를 사용하여 trypan blue에 염색된 죽은 세포를 제외한 살아있는 총 세포수와 림프구 및 호중구의 수를 측정한 결과를 나타낸다. WT에 비하여 녹아웃조건에서 이들 총세포수와 각각의 세포의 수가 억제되어있는 것을 관찰하였다.
도 77의 A는 Methacholine test로 WT 마우스 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 마우스에서 마지막 챌린지 3일 후 의식이 있는 마우스를 기압계 용적 측정 챔버 (All Medicus Co.,서울, 한국), 평균 3분. 에어로졸화 된 메타콜린농도 증가(2.5~50mg/ml)는 3분 동안 메인 챔버의 입구를 통해 분무하였으며 일시 중지 후 3분 동안 판독하여 그 값을 결정하였다. Penh, (만료시간/이완 시간 - 1) × (최고 호기 흐름/최고흡기 흐름)은 제조업체의 프로토콜에 따라 최대 흡기 상자 압력 신호에 대한 최대 호기 비율의 기능을 나타내었다. Penh는 메타 콜린에 대한 기도 반응이다. 결과는 다음 Penh의 백분율 증가로 표시하였다. 도 77의 B는 WT 마우스 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 마우스의 천식 유발군의 BALF에서 ELISA 키트 (Endogen Inc., Woburn, Massachusetts, USA)를 사용하여 인터루킨 (IL)-4 및 IL-13의 농도를 측정한 결과를 나타낸다. Standard 설정에서 Assay의 감수성 최저값은 5pg/ml이었다.
도 78의 A는 WT 마우스 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 마우스의 천식 유발군의 IL-17 mRNA의 발현 수준을 각조직에서 RNA을 분리한 후 역전사반응을 통해 cDNA를 만든 후 IL-17의 프라이머를 사용하여 관찰한 결과이다. 도 78의 B 및 C는 조직을 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀을 주입하여 블록을 만든 후 4μm 두께로 잘라서 완충액에 반응 및 헤마톡실린-에오신염색 및 PAS 염색을 하여 관찰한 결과이다.
도 79는 아스파라질러스 감염에 의한 천식유발 마우스에 BIA, IC87114를 처리하고 BAL 샘플 10uL를 0.4% trypanblue 10uL와 혼합한 후 세포수 측정기 (Countess Automated Cell Counter, Invitrogen, USA)를 사용하여 trypan blue에 염색된 죽은 세포를 제외한 살아있는 BAL의 전체 염증세포를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 80은 아스파라질러스 감염에 의한 천식유발 마우스에 BIA, IC87114를 처리하고, 조직을 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀을 주입하여 블록을 만든 후, 4μm 두께로 잘라서 완충액에 반응 및 헤마톡실린-에오신염색을 수행하여 관찰한 결과 (A) 및 PAS 염색을 시행하여 관찰한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 81은 아스파라질러스에 감염된 천식 마우스 모델에 IC87114 (PI3K억제제), 덱사메타손, BIA 또는 유사체를 처리한 후에 BAL 샘플 10uL를 0.4% trypanblue 10uL와 혼합한 후 세포수 측정기 (Countess Automated Cell Counter, Invitrogen, USA)를 사용하여 trypan blue에 염색된 죽은 세포를 제외한 살아있는 BAL fluid의 전체 세포수를 개수하여 정량화한 결과를 나타낸다.
도 82는 SARS-CoV2 바이러스가 감염된 Vero E6 세포주에 BIA 또는 그 유사체들을 처리하였을 때의 세포 생존도를 MTT 분석으로 확인한 결과이다. 데이터는 평균±SD로 나타내었다. 그룹간의 비교는 Dunnett's test with post-test를 사용하였다(*, SARS-CoV2-DMSO 처리군(DMSO-S)과 비교하여 P < 0.05, ^#, 대조군 DMSO 군(DMSO)과 비교하여 P < 0.05).
도 83은 본 발명의 화학식 1 중에서 신규화합물인 GM-90223의 NMR data이다.

BI-1 (Bax inhibitor-1)은 TMBIM6 (transmembrane Bax inhibitor-1-containing motif family [6]) 로도 불린다. 본 출원에서는 이를 BI-1, Bax inhibitor-1, TMBIM6, BI-1 (TMBIM6) 라는 명칭으로 혼용하여 사용한다.

본 출원의 발명자들은 BI-1가 소포체 (endoplasmic reticulum)에서 칼슘을 유리시키는 특성을 통하여 분자 및 세포 신호 전달 캐스케이드를 유도하는 mTORC2를 활성화시키고 AKT의 인산화에 관여한다는 것을 밝혔다. 나아가, BI-1의 칼슘 유리현상을 억제하면, mTORC와 BI-1의 결합이 억제되고 동시에 mTORC2의 활성화가 저해되며, 이는 AKT의 인산화의 저해를 가져와 암세포의 성장이 억제된다는 것을 밝혔으며, 나아가 BI-1의 활성에 길항작용을 하는 화합물들을 찾아내었다.

본 발명자들은 소포체 (ER)에 조절된 mTORC2 활성화, 특히 BI-1가 ER관련 mTORC2 활성화에 중요한 구성요소임을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 BI-1의 억제하면, mTORC2 활성화가 저해되어 암의 성장이 억제되는 것을 알았다. 발명자들은 BI-1를 억제하는 화합물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 소포체 (ER)에 조절된 mTORC2 활성화, 특히 BI-1가 ER 관련 mTORC2 활성화에 중요한 구성요소임을 확인하였고, 암세포에서 그 발현이 증가하는 것을 알아내었다. 특히 ER에서의 칼슘유리되는 성격을 기반하여 mTORC2 및 리보솜(ribosome)이 모집(recruit)되는 것을 확인하였으며 이것이 mTORC2의 활성화를 유도하였음을 보여주었다.

또한, 발명자들은 BI-1에 의한 ER 관련 mTORC2 활성화가 당분해 (glycolysis), 오탄당 포스페이트 경로 및 암 진행을 유도하는 지질 합성 유전자의 발현을 증가시키는 것을 발견하였다. 이에 발명자들은 상기 BI-1 (TMBIM6)유전자를 억제하면, mTORC2 활성화가 저해되어 암의 성장이 억제되는 것을 밝히게 되었다.

발명자들은 BI-1의 새로운 억제제인 2E-1-2-아미노페닐-3-3니트로페닐-2-프로펜-1-온(2E-1-2-Aminophenyl-3- 3-nitrophenyl-2-propen-1-one)을 발견하였고 이를 BIA라 명명하였다. 실제로 각종 암세포에 BIA를 처리한 결과, BIA는 BI-1를 억제하고, mTORC2와의 결합을 감소시키며, 최종적으로 mTORC1 및 mTORC2 활성을 감소시키는 것을 알아내었다. 또한, 암이 유도된 지브라피쉬 및 누드마우스에 BIA 처리한 결과 암의 크기 및 중량이 감소한다는 것을 알아냈다. 또한, 하기에서 제시하는 상기 화합물(BIA)의 유사체 43개 역시 세포모델에서 암의 성장, 세포 이동(migration) 및 침입(invasion) 그리고 AKT의 인산화 등을 억제하였다.

따라서 본 발명에서 제공하는 BIA 및 BIA의 유사체 43개의 BI-1 길항제(antagonist)는 BI-1와 관련된 질환뿐만 아니라 mTORC, 바람직하게는 mTORC2 관련 질환, AKT 인산화와 관련된 질환의 예방, 치료, 개선을 위하여 사용될 수 있다.

BI-1은 간 허혈 재관류 손상, 만성 간염, 사염화탄소-유도 간 손상과 같은 간 질환과 관련이 있으며 BI-1 결핍은 간의 재생(regeneration)을 촉진한다고 보고되었다. 또한, BI-1은 종양형성(tumorigenesis), 전립선암, 폐선암(pulmonary adenocarcinoma), 유방암, 비인두암(Nasopharyngeal carcinoma), 급성골수성백혈병(Acute myeloid leukemia) 등과 같은 암, 자가면역질환, 신경질환, 인슐린 저항성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Li B. et al., The characteristics of Bax ihibitor-1 and its related diseases, Current Molecular Medicine 2014, 14, 603-615).

mTORC2는 생존 키나아제인 AKT를 활성화함으로써 세포 대사 및 세포 생존을 조절한다. 또한, mTORC2는 자가포식현상(autophagy)의 조절에 관련이 있다. mTORC2는 대사 조절에서 중요한 역할을 하므로, 이와 관련된 많은 질환과 연관이 되어 있다. 예를 들어 제2형 당뇨병과 같은 대사 질환과 관련이 있다. 또한, mTORC2는 여러 유형의 암에서 과활성화된다는 것이 보고되었다. mTORC2-매개된 지질형성(lipogenesis)가 간세포 암을 촉진한다고 알려져 있다. mTORC2 경로는 폐섬유증(lung fibrosis)의 발생에 중요한 역할을 하며, mTORC2 저해제가 섬유성 폐질환의 치료 가능성이 시사되었다 (Chang W et al. "A critical role for the mTORC2 pathway in lung fibrosis". (2014) PLOS ONE. 9 (8): e106155). 만성 mTORC2 활성은 리보솜의 기능을 손상시켜 전신 홍반성 루프스에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, mTORC2는 Th9 세포의 분극 및 알레르기성 기도 염증 조절에 관여하므로 알레르기성 질환의 치료제로서 제안되었다 (Chen H, et al., "mTORC2 controls Th9 polarization and allergic airway inflammation", Allergy (2017) 72(10):1510-1520). mTORC1 및 mTORC2 시그널링은 바이러스의 감염과도 관련이 있다고 알려져 있다 (Kuss-Duerkop SK et al., "Influenza virus differentially activates mTORC1 and mTORC2 signaling to maximize late stage replication."PLoS Pathog. 2017 Sep 27;13(9):e1006635).

AKT (단백질 키나아제 B (PKB)로도 알려져 있음)는 세포 증식, 생존 및 대사의 조절에 관련한다. AKT의 기능에 문제가 생기면 암, 당뇨병, 심혈관 질환 등과 같은 많은 질병이 발생한다 (Hers I. et al., Akt signalling in health and disease, Cellular Signalling (2011) Volume 23, Issue 10, 1515-1527).

AKT의 활성화는 염증 촉진에도 중요한 역할을 한다. 예를 들어 난치성 천식에서도 중요한 역할을 한다. 본 발명에서는 BI-1의 발현이 천식 조건에서 억제되었으며 BI-1 녹아웃 마우스에서 심한 천식 모델에서 천식 증상과 염증성 사이토카인 증가현상이 많이 억제되어 있음을 제시하였으며, Type II 사이토카인 IL-4, IL-5와 IL-13이 녹아웃조건에서 억제되어 있음을 규명하였다. 천식을 심하게 유도한 모델에서 앞서 본 발명에서 제시하는 BIA 및 그 유사체들을 적용시에 천식과 관련 염증 사이토카인유리등 현상이 억제되는 것을 확인하였다.

또한, 이러한 AKT의 활성은 코비드-19가 세포내 감염 경로인 ACE2에 결합하여 세포내이입 (endocytosis)되는 과정에 관련되어 있으므로, 코비드-19과 같은 코로나바이러스의 침투에 중요한 신호전달이다 (Reis CR t al, Crosstalk between Akt/GSK3β signaling and dynamin-1 regulates clathrin-mediated endocytosis, EMBO J. 2015 Aug 13;34(16):2132-46. doi: 10.15252/embj.201591518.). 본 발명에서 BI-1 길항제인 BIA 및 BIA의 유사체(43개 화합물)들을 투여시 코로나바이러스감염을 막을 수 있음을 보여주고 있다.

본 발명은 일 양태로서, 하기 화학식 1로 나타내어지는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물이 제공된다:

[화학식 1]

여기서

상기 A는 하기의 화학식 1-1, 1-2, 또는 1-3이고,

상기 B 및 C는 각각 C, 또는 N이며,

상기 B 또는 C가 N인 경우 R₈ 및 R₉는 수소이며,

상기 옥심기를 갖는 치환기는 하기 화학식 1-4로 나타낸다.

상기 화학식 1의 화합물은 BI-1의 억제제(길항제)일 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 BI-1의 칼슘유리 등을 억제하거나, mTOR의 활성을 저해하거나; 또는 AKT 또는 S6K의 인산화를 감소시키는 것;을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물을 포함하는 BI-1 관련 질환의 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물을 포함하는 BI-1의 길항작용에 의하여 제어되는 질환의 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 BI-1 관련 질환 또는 BI-1의 길항작용에 의하여 제어되는 질환으로는 예를 들어, 간 허혈 재관류 손상, 만성 간염, 사염화탄소-유도 간 손상과 같은 간 질환, 종양형성(tumorigenesis), 전립선암, 폐선암(pulmonary adenocarcinoma), 유방암, 비인두암(Nasopharyngeal carcinoma), 급성골수성백혈병(Acute myeloid leukemia) 등과 같은 암, 자가면역질환, 신경질환, 인슐린 저항성, 천식, COVID감염 등을 들 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물은 간의 재생(regeneration) 및 기타 다른 장기의 재생을 촉진하기 위한 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물을 포함하는 mTORC2 관련 질환의 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

mTORC2 관련 질환으로는 예를 들어 제2형 당뇨병과 같은 대사 질환, 암, 폐섬유증(lung fibrosis), 천식 및 COPD등을 포함하는 호흡기질환, 바이러스감염증, 전신 홍반성 루프스를 들 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 일 양태로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물을 포함하는 AKT 관련 질환의 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 AKT 관련 질환으로는 예를 들어 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환, 천식 및 COPD 를 포함하는 호흡기질환 코로나바이러스 감염증 등 바이러스 감염증을 들 수 있으며 이로 제한되지 않는다.

상기 암은 폐암, 폐선암, 췌장암, 대장암, 결장직장암, 골수성 백혈병, 갑상선암, 골수형 성이상증후군(MDS), 방광 암종, 표피 암종, 흑색종, 유방암, 전립선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 위암, 후두암, 식도암, 방광암, 구강암, 비인두암, 간엽 기원의 암, 섬유육종, 기형암종, 신경모세포종, 신장 암종, 간암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 및 갑상선 미분화암으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 섬유육종 또는 유방암일 수 있다.

상기 천식은 일반 알러지성 천식을 포함하여 스테로이드저항성 천식등 현재까지 호발해 온 천식을 모두 포함할 수 있다.

상기 코로나바이러스감염증은 COVID19을 포함하여 지역별 나라별 mutant를 포함하며 메르스등 유사 코로나바이러스감염증을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 및 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.1mg/kg 내지 10mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암의 예방 및 치료, 천식의 치료 및 예방, 코로나바이러스의 감염 예방, 개선, 증상 완화 또는 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1의 화합물은 BI-1의 억제제일 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 mTOR의 활성을 저해하거나; 또는 AKT 또는 S6K의 인산화를 감소시키는 것; 을 특징으로 할 수 있다.

상기 암은 폐암, 폐선암, 췌장암, 대장암, 결장직장암, 골수성 백혈병, 갑상선암, 골수형 성이상증후군(MDS), 방광 암종, 표피 암종, 흑색종, 유방암, 전립선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 위암, 후두암, 식도암, 방광암, 구강암, 비인두암, 간엽 기원의 암, 섬유육종, 기형암종, 신경모세포종, 신장 암종, 간암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 및 갑상선 미분화암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 섬유육종 또는 유방암일 수 있다.

상기 천식은 일반 알러지성 천식을 포함하여 스테로이드저항성 천식 등 현재까지 호발해 온 천식을 모두 포함할 수 있다.

상기 코로나바이러스 감염증은 COVID19을 포함하여 지역별 나라별 mutant를 포함하며 메르스 등 유사 코로나바이러스 감염증을 모두 포함할 수 있다.

상기 건강식품조성물은 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나, 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에도 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 내지 0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 적용되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

하기 실시예들에서 실시된 실험 방법은 아래와 같았다.

세포배양

HT1080 MDA-MB-231, SKBR3 및 MCF7 세포주를 DMEM에 10% Fetal Bovine Serum, 1% penicillin 및 streptomycin (100 U)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

겔 여과 분석

HA-BI-1 (TMBIM6)플라스미드를 사용하여 BI-1를 녹아웃시킨 HT1080 세포 (각 샘플마다 10cm 크기의 세포배양 접시 8개 사용)를 일시적으로 형질전환 시켰다. BI-1를 녹아웃시킨 HT1080 세포에 10μM의 2E-1-2-Aminophenyl-3-3-nitrophenyl-2-propen-1-one (BIA)를 처리하였다. 24 시간 후, 단백질 분해효소 억제제 혼합액 (protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor cocktail)를 함유한 CHAPS 완충액 (pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 0.3 % CHAPS에서의 25mM HEPES) 1.0㎖에서 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 0.45㎛ 주사기 필터로 여과하였다. CHAPS 완충액을 사용하여 총 단백질 농도를 5mg/ml로 조정하고 500㎕의 용해물을 Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼 (GE Lifesciences 카탈로그 번호 28-9909-44)에 넣었고, AKTA-FPLC (GE Lifesciences Cat. No.18-1900-26) 장비를 이용하였다. 용출 속도 0.3ml/min으로 600μL로 분획하였다. 각 분획의 50μL를 SDS-PAGE로 전기영동한 후에 여러 항체로 검출하였다. 컬럼의 분자량 분리능은 겔 여과 보정 키트 (GE Lifesciences, 28-4038-42)를 사용하여 추정하였다.

면역 블롯팅(immunoblotting)

세포를 회수한 후, 세포 용해 완충액 (10mM Tris-Cl (pH 7.4), 5mM EDTA, 130mM NaCl, 1% Triton X-100)과 단백질 분해효소 억제제 혼합액 단백질 분해효소 억제제 혼합액 (protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor cocktail)을 넣고 4℃에서 30분간 방치하였다. 초음파로 세포를 깬 후 13,000×g로 4℃에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 취하였고, 단백질 정량 kit (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 농도를 정량하였다. 얻어진 단백질의 20ug을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)로 전기영동을 실시한 후에 PVDF 멤브레인(MEMBRANE) (Bio-rad)으로 전기이동을 실시하였다. 상기 멤브레인을 5% 스킴밀크가 함유된 TBS-T 용액(20mM Tris (pH 7.5), 137mM NaCl, 0.05% Triton X-100)으로 상온에서 1시간 블로킹(blocking)하였다. 그리고 일차항체가 함유된 용액으로 바꾼 후 4℃에서 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인을 TBS-T 용액으로 3번 세척 한 후 이차항체와 반응시킨 후 ECL kit를 이용하여 발광시키고, autoradiography를 실시하였다.

종양 세포의 침입 실험

세포 침입(invasion) 실험은 Invasion Assay Kit (corning, 3458)의 방법에 따라 수행하였다. 24-well 세포배양 플레이트에 세포배양 인서트(cell culture insert)를 넣고, 인서트 밖에는 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지를 넣고 인서트 안에는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지와 HT1080 및 MDA-MB-231에 2.0μM의 BIA를 넣어 37℃에서 12~24시간 동안 배양하였다. 24-well 배양 플레이트 안의 배지와 인서트 안의 배지를 깨끗이 제거한 뒤, 솜면봉을 이용해 인서트 안의 남은 세포를 깨끗이 제거하였다. 4% 포름알데히드 용액에 인서트를 넣어 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛 용액으로 인서트 바닥을 투과한 세포들을 염색한 뒤, 3차 증류수로 씻어낸 후 상온에서 말리고, 말린 인서트를 현미경 상에서 관찰하였다.

3차원 세포배양

3차원 세포배양은 Cellrix 3D Culture System (㈜메디팹)의 방법에 따라 수행하였다. 세포를 in vitro에서 2g/mL의 DiI로 표지한 후 Cellrix Bio-Gel에 1Х106 cells/mL로 현탁하였다. casting gel에서 casting mold를 제거한 후, 세포가 현탁된 Cellrix Bio-Gel을 조심스럽게 분주하였다. 아이스에서 15분간 정치하여 분주된 Bio-Gel을 젤화(gelation)하였다. 젤화된 Cellrix Bio-Gel 3D 배양체를 멸균된 핀셋으로 살짝 밀어 꺼낸 후 약물이 담긴 96-well plate에 넣었다. 약물은 3일마다 바꾸어 주었다. 일주일 후 형광 현미경 (Ni녹아웃n Eclipse C1)을 사용하여 세포배양을 관찰하였다.

지브라 피쉬 종양 모델에서 BIA의 처리

제브라 피쉬 수정란을 28℃의 Danieau 용액에서 배양하고 표준 실험실 조건 하에서 키웠다. 수정 후 48시간에, 제브라 피쉬 배아를 0.04 mg/ml의 tricaine (MS-222, Sigma)으로 마취시켰다. 마취된 배아를 미세주입용 아가로스 겔로 옮겼다. 주입 전에 종양 세포를 in vitro에서 2g/mL의 DiI로 표지하였다. 약 100-500 종양 세포를 무혈청 DMEM에 재현탁하고 5nL의 종양 세포 용액을 마이크로 인젝터를 사용하여 각 배아의 perivitelline cavity에 주사하였다. 비필라멘트형 실리케이트 유리 모세관 바늘을 마이크로 인젝션에 연결하여 사용하였다. 주입된 배아는 28℃를 유지하는 물로 즉시 옮겨졌다. 다음날 형광 현미경 (Ni녹아웃n Eclipse C1)을 사용하여 형광을 띠는 배야만 선별한 후 대조군과 실험군으로 무작위적으로 나눴다. 대조군은 0.01% DMSO, 실험군은 2uM BIA을 첨가한 후, 종양 성장 및 침습을 모니터링하였다.

누드 마우스에서의 BIA의 처리

마우스는 20-25g의 BALBc/Nude를 구입하여 실험실 환경적응을 위하여 1주간 예비 사육 후 실험을 실시하였다. 본 실험은 전북대학교 동물실험윤리위원회의 승인(CBNU 2015-064, CBNU 2016-56)하에 표준작업 지침서에 따라 수행되었으며, 사육실 조건은 온도와 상대습도가 일정하게 유지되고 12시간의 명암주기를 유지하고 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물은 HT1080 세포주와 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 마우스 당 5 X 10⁶ cell 씩 피하로 이식 후, 7-10일 후 종양 크기가 100mm³의 크기를 형성하는 마우스를 무작위적으로 대조군과 실험군으로 나눈다. 대조군은 생리식염수 (10% DMSO 포함)를, 실험군은 1mg/kg (10% DMSO)을 복부에 주사한다. 일주일에 5일간 약물 투여를 하고, 4주를 반복한다. 28일 후, 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 무게와 크기를 특정하였다. 종양의 크기는 캘리퍼 (caliper)로 측정하였고, 다음 공식을 사용하여 계산하였다.

종양 체적 (mm³) = {(최단직경) x 2 x (가장 긴 직경)}/2

역전사 정량 실시간 (qRT-) PCR

TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 암세포에서 Total RNA를 추출하고, 제조사의 프로토콜에 따라 SuperScript III First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen)로 cDNA를 생성하기 위해 3μg을 사용했다. 본 연구에 사용된 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다.

Name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
TMBIM6	AGCAGCACCTGAAGAAGGTC	TCAATATCAGGGAGCCCAAG
LDHA	GAGATTCCAGTGTGCCTGT	GTCCAATAGCCCAGGATGTG
HK2	CAAAGTGACAGTGGGTGTGG	CCAGGTCCTTCACTGTCTC
PDK1	GAAGCAGTTCCTGGACTTCG	ACCAATTGAACGGATGGTGT
ENO1	GCCGGCTTTACGTTCACCTC	GTTGAAGCACCACTGGGCAC
GLUT1	CTTCACTGTCGTGTCGCTGT	CCAGGACCCACTTCAAAGAA
G6PD	AAGAACGTGAAGCTCCCTGA	AATATAGGGGATGGGCTTGG
PGD	GGTGCACAACGGGATAGAGT	CCATCGGTGTCTTGGAACTT
RPE	TGGAAAGGATCTGGGAAGTG	CCTGGGGTCAAGATCCATA
RPIA	CTGGATCGACACCCAGAGAT	CGATCACGATGAAGCGACTA
MYC	TGAGGAGACACCGCCCAC	CAACATCGATTTCTTCCTCATCTTC
PFKP	CTACCAGCGACTTGCCATCA	ATCATAGATGGCGAGCATCC
ACACA	GAGGGCTAGGTCTTTCTGGAAG	CCACAGTGAAATCTCGTTGAGA
ACACB	GCCAGAAGCCCCCAAGAAAC	CGACATGCTCGGCCTCATAG
GPAT	ACTCCTTGGGCCTTTGCTG	TTCTGGAACAGGACCACTGAAGT
DGAT1	CGTGAGCTACCCGGACAATC	AAAGTTGAGCTCGTAGCACAAGG
PPARG	GAACAGATCCAGTGGTTGCAG	GGCATTATGAGACATCCCCAC
SREBF1	GGAGAACCTAAGTCTGCGCACT	TCCCTCCACTGCCACAGG
FASN	TATGCTTCTTCGTGCAGCAGTT	GCTGCCACACGCTCCTCTAG
RICTOR	GCCAAACAGCTCACGGTTGTAG	CCAGATGAAGCATTGAGCCACTG
RPL19	ATGCCAGAGAAGGTCACATG	ACACATTCCCCTTCACCTTC
RPS16	GCTCGCTACCAGAAATCCTAC	CATCCAATACCAACACATAAGGC
ACTB	CTGGAACGGTGAAGGTGACA	AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA
GAPDH	GTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGA	CTGTTGAAGTCAGAGGAGACCAC

mTOR의 경우 P2220810, SIN1의 경우 P130485, GβL의 경우 P257029는 바이오니어 (한국 대전)에서 구입했다.

qRT-PCR은 ABI PRISM 7700 시퀀스 검출 시스템 (Applied Biosystems)에서 SYBR Green Reagent Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 다음 조건에서 수행하였다 : 95℃에서 5분 동안, 그 후 40주기 10초의 경우 94℃, 10초의 경우 51~55℃, 30초의 경우 72℃.

반응은 각 샘플에 대해 3중 실행으로 수행되었으며, 액틴 (ACTB) 또는 글리세르알데히드3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) 수준으로 정규화(normalize)되었다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의한 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포의 생성

CRISPR/Cas9 게놈 편집 방법을 사용하여 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포주를 생성했다. 인간 BI-1을 표적으로하는 서열을 포함하는 플라스미드는 ToolGen (서울, 한국)에 의해 pRGEN_BI-1 발현 벡터로부터 설계 및 구축되었다. 인간 BI-1의 엑손 3을 표적으로 하는 가이드 서열은 5'-TGCAGGGGCCTATGTCCATATGG-3 '이었다.

음성 대조군으로서 pRGEN_Scramble 벡터는 Origene (# GE100003, pCas-Scramble Vector)로부터 정보를 받은 스크램블 시퀀스 (5'-GCACTACCAGAGGCTAACTCA-3 ')를 사용하여 구축되었다. pRGEN_BI-1 벡터 또는 pRGEN_Scramble을 pRGEN_Cas9-CMV와 혼합하고 리포펙타민 3000을 사용하여 HT1080 및 HeLa 세포로 공동 형질 감염했다. 48 시간 후, 세포를 트립신 처리하고 제한 희석 방법으로 개별 클론을 분리하기 위해 96 웰 플레이트에 깔았다. 세포는 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM에서 1주 이상 배양했다. 단일 클론을 확장하고 게놈 DNA를 클론에서 정제하고 다음 3개의 프라이머를 사용하여 PCR 기반 스크리닝을 위한 주형으로 사용하였다:

F1, 5'-CGTTGCTGTGTGGTTATTGG-3 ';

R1, 5'-TCAATCCTGCCTCTCCTGAT-3 '; 및

Ftarget, 5'-TGCAGGGGCCTATGTCCATATGG-3 '.

녹아웃 클론은 하나의 PCR 산물만을 생산한 반면, 일반 클론은 2개를 생산했다. 녹아웃 클론의 PCR 산물은 JETsorb DNA Extraction Kit (Genomed, Leinfelden-Echterdingen, Germany)를 사용하여 정제하였으며, 결실은 서열 분석으로 확인하였다.

GST 풀다운 분석

GST 풀다운 분석은 제조업체의 지침에 따라 상용 키트 (21516; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, GST-RPL19는 대장균에서 발현되고 GSH bead를 사용하여 정제되었다. 정제된 단백질은 GSH 세파로스 컬럼에 결합되었다. BI-1-HA 또는 공벡터로 형질 감염된 HeLa 세포의 가용성 용해물 (500μg)을 GST-RPL19가 결합된 컬럼에 주입하고 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 샘플을 세척 완충액으로 3 회 세척한 다음 용출 완충액으로 용출하고 SDS-PAGE에 의해 분리한 다음 면역 블롯팅을 수행하였다.

동물에서의 암 연구

종양 이종 이식에는 6-8 주령의 BklNbt:BALB/c/nu/nu 늙은 마우스 (대전 다물)를 사용하였다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12 : 12h 명암주기로 일정한 온도와 습도에서 완전히 기후가 조절되는 실내에 보관되었다(n=5/케이지).

동물 실험은 전북대학교 동물 실험실 동물 관리 및 사용위원회 (한국 전주 실험동물 관리 및 사용 가이드, 승인 번호 CBNU 2015-064, CBNU 2016-56, CBNU 2017-0026, 및 CBNU 2020-033) 및 대학의 관련 윤리 규정을 준수하였다.

배양에서 기하급수적으로 성장하는 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 및 WT HT1080 세포를 트립신 처리하고 트립판 블루 염색유무감별을 통하여 정량화하고, 3-5×10⁶세포를 0.1ml PBS에 재현탁했다. 세포를 각 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. SMAiRNA 또는 BIA 처리를 위해 0.1ml PBS에 5×10⁶개 세포를 주입했다. 종양의 무게가 약 100mg (접종 후 7 ~ 10일)에 도달하면 마우스를 무작위로 할당하여 식염수에 희석된 1mg/kg BI-1 SAMiRNA, DMSO에 희석된 1mg/kg BIA (최종 농도 : 10% v / v) 또는 비히클 (식염수 또는 DMSO, 10% v / v) 투여군으로 나누었다.

SAMiRNA는 3일마다 꼬리 정맥 주사로 투여되었고 BIA는 3주에 걸쳐 주당 5일 복강 주사되었다. 서열이 5'-AAGGCACUGCAUUGAUCUCUU-3 '인 BI-1 SAMiRNA 및 음성 대조군 SAMiRNA는 Bioneer에서 입수했다.

25-28일 후, 마우스를 안락사시키고 고형 종양을 절개하고 종양 부피를 기록했다. 종양 크기는 캘리퍼스로 측정되었다. 종양 부피 (mm³)는 [(가장 짧은 직경) 2 × 가장 긴 직경]/2 공식으로 계산되었다. 마우스는 매주 2회 평가되었고 뒷다리 마비, 및 먹거나 마실 수 없는 것과 같은 말기 질환의 징후를 보이거나, 또는 병에 걸렸을 때 자궁 경부 탈구로 희생되었다.

면역염색

조직 어레이 (BC081120d, PR1921c, CR1001a 및 BC04002b, Biomax, Rockville, MD, USA)의 포르말린으로 고정시키고, 파라핀 포매한 암, 및 정상 조직 샘플을 면역 조직 화학으로 분석했다. 6번의 탈 파라핀화 및 재수화 후, 조직 절편을 1X 표적 회수 용액, pH 6.0 (DAKO, Glostrup, Denmark)에 적용한 다음, 과산화 효소 차단 용액 (DAKO)과 함께 실온에서 10분 동안 배양했다. 그런 다음 1x TBST 완충액 (Scytek Lab, Logan, UT, USA)으로 세척한 다음 단백질 블록 (PBS 중 0.25% 카제인, DAKO)으로 실온(RT)에서 10분 동안 세척하고 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. TBST 완충액으로 헹구어 낸 후 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 섹션을 배양했다. AEC 기질 발색원 (DAKO)을 첨가하고 탈 이온수로 세척했다. Mayer의 헤마톡실린 (Sigma-Aldrich)으로 염색된 슬라이드 카운터를 수돗물로 헹구고 수성 매체 (Scytek Lab, USA)를 사용하여 장착했다. 이종 이식 종양에서 Ki-67 발현을 필드 당 양성세포의 백분율로 결정하고 각 필드의 총 세포 수로 정규화했다.

면역형광염색

세포를 Lab-Tek II 챔버 슬라이드 (Thermo Fisher Scientific)에 주입하고 PBS로 헹구고 얼음처럼 차가운 메탄올에 20분 동안 고정한 다음 PBS에서 두 번 세척했다. 세포를 0.1% BSA (Sigma-Aldrich)로 30분 동안 차단한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 테트라메틸로다민-접합 2차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 시편은 ProLong Gold anti-fade 시약으로 장착하고 4-, 6-diamidino-2-phenylindole (Invitrogen)로 염색했다. LSM 510 공 초점 현미경 (Carl Zeiss)에서 이미지를 얻고 AxioVision 소프트웨어로 분석했다.

폴리솜 프로파일링 및 poly (A) 풀다운 분석

폴리솜(polysome) 프로파일은 세포를 수확하기 전에 최종 농도 100μg/ml의 사이클로헥시미드와 함께 10분 동안 배양했다. 이어서 세포를 PBS 중 100μg/ml의 사이클로헥시미드로 세척하여, 튜브에 수집하고, 폴리좀 용해 완충액 1ml (20mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM MgCl2, 0.4% IGEPAL, 및 10 unit/ml RiboLock RNase 억제제 (EO0381, Thermo Scientific) 및 Xpert protease 억제제 칵테일 (P3100, genDEPOT, Katy, TX, USA)이 포함된 100μg/ml 사이클로헥시미드)에 세포를 푼다.

정제된 용해물을 10-50% (w/v) 자당(sucrose) 구배 (20mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM MgCl2, 100μg/ml 사이클로헥시미드, 10 units/ml RNase 억제제, 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 준비) 형성된 10ml 선형 튜브에 주입한 후, P40ST 스윙 로터 (Hitachi, JAPAN)에서 4℃에서 2시간 동안 36,000rpm에서 원심 분리하여 분리한다. Fluorinert FC-40 (F9755, Sigma-Aldrich)으로 구배-분별하고 분획의 750μl를 ISCO 밀도 구배 분별 시스템을 사용하여 튜브에 수집했다. 폴리 (A) 풀다운 분석의 경우, 세포를 완충액 A (50mM Tris-HCl [pH 7.4], 100mM NaCl, 30mM MgCl2, 0.3% CHAPS, 40U/ml RNase 억제제, 프로테아제 억제제 칵테일, 및 100μg/ml 시클로헥시미드) 로 용해한 후, 상기 용해물을 4℃, 10분 8000 × g에서 정화한 다음 올리고 (dT) 셀룰로오스 (NEB)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 올리고 (dT) 셀룰로오스를 원심 분리로 펠릿화하고 완충액 A로 5회 세척했다. 결합된 분획을 용출 완충액 (100mM Tris [pH 7.4], 500mM NaCl, 10mM EDTA, 1% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 및 5mM DTT)으로 용출한 정제된 리보솜 분획, 및 결합과 비-결합 분획을 Vivaspin 500 (Sartorius Stedim)으로 농축시켰다.

BI-1을 안정적으로 과발현하는 HT1080 세포의 micro-RNA 분석

형질 감염된 사람 세포에서 총 RNA를 추출한 후, 각 RNA 샘플 (30μg)은 SuperScript II 역전사 효소 (Invitrogen)를 사용한 역전사 반응에 의해 cyanine (Cy)3- 또는 Cy5- 접합 dCTP (Amersham, Piscataway, NJ, USA)로 표지하였다. 표지된 cDNA 혼합물을 에탄올 침전으로 농축하고 20μl의 혼성화 용액 (GenoCheck, 대전, 대한민국)에 재현탁한 다음, 혼합하여 OpArray Human Genome 35K 어레이 (OPHSV4; Operon Biotechnologies, GmbH)에 적용하고 MAUI FL로 덮었다. 혼성화 챔버 (Biomicro Systems, Salt Lake City, UT, USA)에서 62℃에서 12시간 동안 배양한 후, 슬라이드를 0.1% SDS와 함께 2x 염화나트륨-시트르산 나트륨 (SSC)으로 2분 동안 세척한 다음, 1x SSC에서 3분 동안, 그리고 0.2x SSC에서 2분 동안 실온에서 세척했다. 슬라이드를 3000rpm에서 20초 동안 원심 분리하여 건조시켰다. 하이브리드 슬라이드는 GenePix 4000B 스캐너 (Axon Instruments, Sunnyvale, CA, USA)로 스캔하고 스캔한 이미지는 GenePix Pro v.5.1 (Axon Instruments) 및 GeneSpring GX v.7.3.1 (Silicon Genetics, Redwood City, CA, USA) 소프트웨어로 처리하였다. 먼지 아티팩트 또는 공간적 결함이 있는 슬라이드를 포함하여 각 슬라이드의 육안 검사에서 표준 이하로 판단된 지점은 추가 분석에서 제외되었다. 신뢰할 수 없는 데이터를 필터링하기 위해 신호 대 잡음비가 10 미만인 스팟도 제외되었다. 데이터는 데이터 안정성을 위해 글로벌, lowess, 인쇄 팁 및 확장된 접근 방식으로 정규화되었다. 폴드 체인지 필터에는 상향 및 하향 조절된 유전자가 각각 대조군의 최소 200% 및 50%에 존재해야 한다는 요건이 포함되었다. 데이터에는 시간 과정 실험에서 유사하게 행동하고 GeneSpring GX v.7.3.1을 사용하여 클러스터링 된 유전자 그룹이 포함되었다. 유사한 패턴을 가진 유전자를 식별하기 위해 Pearson 상관 관계에 기반한 알고리즘을 사용했다.

BI-1 (TMBIM6)녹아웃 및 WT(WT) HT1080 세포의 micro-RNA 분석

BI-1 (TMBIM6)녹아웃 및 WT HT1080 세포의 마이크로 어레이 분석은 Ebiogen (서울, 한국)에서 수행했다. GeneChip Human Gene 2.0 ST 올리고 뉴클레오티드 어레이 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을 수행했다. 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 분리되었다. RNA 품질은 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 평가하고 ND-1000 분광 광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)로 정량화했으며 각 RNA 샘플의 300ng을 입력으로 사용했다.

총 RNA는 이중 가닥 cDNA로 전환되었다. T7 프로모터를 포함하는 랜덤 6량체를 사용하여, 증폭된 cRNA를 시험관 내 전사에 의해 이중 가닥 cDNA 템플릿에서 생성하고 Affymetrix 샘플 정리 모듈로 정제했다. cDNA는 dUTP를 포함하는 dNTP 믹스를 사용하여 무작위 프라이머 역전사를 통해 재생되었다. cDNA는 우라실 DNA 글리코실라제 및 퓨린/피리 미디닉 엔도뉴클레아제 1 제한 엔도뉴클레아제에 의해 단편화되고 말단 트랜스퍼라제 반응에서 비오틴화된 디데옥시뉴클레오타이드로 말단 표지되었다. 조각난 말단 표지된 cDNA는 45℃ 및 60rpm에서 16시간 동안 어레이에 하이브리드화되었다. 혼성화 후, 어레이를 스트렙트아비딘/피코에리쓰린으로 라벨링하고 GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix)에서 세척하고 GeneChip Array scanner 3000 7G (Affymetrix)를 사용하여 스캔했다. 이미지 데이터는 Command Console v.1.1 소프트웨어 (Affymetrix)를 사용하여 스캔된 어레이에서 추출되었다.

위의 절차에 의해 생성된 원시 CEL 파일은 Expression Console v.1.1 소프트웨어 (Affymetrix)로 분석된 발현 강도 데이터를 산출했다. 유사한 발현 패턴을 가진 공동 발현 유전자 그룹을 분류하기 위해 Multi-Experiment Viewer v.4.4 소프트웨어를 사용하여 수행했다. 주석, 시각화 및 통합 발견을 위한 웹 기반 데이터베이스 도구는 유전자 온톨로지와 유전자 및 게놈 데이터베이스의 교토 백과사전 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)에서 유전자 기능 정보를 기반으로 분류된 DEG의 생물학적 기능을 해석하는 데 사용되었다.

생물 정보학 및 통계 분석

섬유육종 (GSE2719), 자궁 경부암 (GSE63678), 유방암 (GSE31448), 폐암 (GSE19804) 및 전립선 암 (GSE69223)에 대해 공개적으로 사용 가능한 유전자 발현 옴니버스 (GEO) 데이터 세트가 생물 정보학 분석에 사용되었다. GEO2R은 BI-1 (TMBIM6)발현 분석에 사용되었다. 웹 도구 OncoLnc (http://www.oncolnc.org) 및 GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn)를 사용하여 TCGA 데이터 세트에서 암 환자 샘플의 전체 생존 분석을 수행했다.

Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석 (ANOVA), Two-Way ANOVA, Bonferroni 사후 테스트, Student의 unpaired t 테스트는 Prism v.8 소프트웨어 (GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 평균±SD, * p<0.05로 표시된다. ** p<0.01; *** p<0.001, **** p<0.0001일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 각각의 경우에 사용된 통계적 테스트가 표시되고 실험 횟수는 각 그림의 범례에 명시되어 있다.

천식 유발 마우스의 생성

천식 유발 마우스는 7-8주령의 암컷 WT 및 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 C57BL/6 마우스를 사용하여 준비하였다. 마우스는 12시간의 명암주기로 22ㅁ1℃에 수용되었고 공기 여과와 함께 표준 조건 (특정 병원체 없음) 하에서 규칙적인 사료와 물을 자유롭게 먹였다. 식염수 제어 (SAL) 그룹 및 두 군의 OVA/LPS 그룹 (IC87114 또는 BIA 처리)에서, 모든 OVA/LPS 그룹 마우스는 0, 1, 2, 3 및 7일에 75μg의 OVA + 10μg의 LPS로 비강 내로 감작되었고, 14일, 15일, 21일 및 22일에 50μg의 OVA 단독으로 챌린지 되었다.

기관지 폐포 세척액 BAL fluid 샘플분석

기관지 폐포 세척액 (BALF) 샘플 (1ml)을 각 마우스에서 얻었다. 샘플을 원심 분리(600g, 3분)하고 상청액을 사이토카인 분석을 위해 -20℃에 보관했다. 샘플의 세포 펠렛은 적혈구 용해 후 모델 Z1 (미국 플로리다 주 마이애미 소재의 벡맨-쿨터)을 사용하여 총 세포 수를 위해 풀링되었다 (Zap-Oglobin II, Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA).

슬라이드에 세포를 로드하고 원심 분리 (700 x g, 3분)하고 Diff-Quick (Baxter, Detroit, MI, USA)으로 염색했다. 차이는 광학 현미경을 통해 확인하였다.

기도 과민반응의 측정

기도 과민반응은 메타콜린 (MeCh) 에어로졸에 의해 유발된 기류 방해 동안 전신 혈량 측정법에 의해 평가되었다. 각 마우스 그룹은 에어로졸 화된 식염수에 3분 동안 노출된 다음 에어로졸화된 MeCh의 농도 증가에 노출되었다. 상기 노출시킨 12mg/ml, 25mg/ml 및 50mg/ml의 MeCh를 등장성 식염수에 녹여서 사용하였다.

각 용량을 2분 동안 분무하고 기도 반응을 5분 동안 기록했다. 메인 챔버 입구를 통해 각 투여 후 3분 동안 강화된 일시 중지 (Penh)가 기록되었다. 각 3분 시퀀스 동안 측정된 Penh 값은 각 용량에 대해 평균화되었다. Penh 데이터는 MeCh의 용량 당 기준선으로부터의 변화를 나타냈다. 각 농도에서 기준선에 비해 Penh의 백분율 증가는 실험 그룹 간의 기도 반응성을 비교하는 데 사용되었다.

<실시예 1> 종양 시료에서 BI-1 (TMBIM6)발현의 분석

NCBI의 GEO (Gene Expression Omnibus)에서 제공하는 여러 종양 샘플에 대한 BI-1 mRNA 발현 프로파일링 데이터 세트를 분석하여 암 진행에서 BI-1의 발암성 역할을 조사하였다.

섬유육종 (GSE2719), 자궁 경부암 (GSE63678), 유방암 (GSE31448), 폐암 (GSE19804) 및 전립선암 (GSE69223)에 대해 공개적으로 사용 가능한 유전자 발현 옴니버스 (GEO) 데이터 세트가 생물 정보학 분석에 사용되었다.

GEO2R은 BI-1 (TMBIM6)발현 분석에 사용되었다. 웹 도구 OncoLnc (http://www.oncolnc.org) 및 GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn)를 사용하여 TCGA 데이터 세트에서 암 환자 샘플의 전체 생존 분석을 수행하였다.

이러한 분석으로 BI-1이 섬유육종, 자궁 경부암, 자궁내막암 및 외음부암, 유방암, 폐암 및 전립선암에서 유의하게 과발현되었음을 밝혀냈다 (도 1a-e).

다음으로 조직 마이크로 어레이를 사용하여 동일한 암 조직에서 면역조직화학적 염색으로 BI-1의 발현 수준을 비교하여 유사한 결과를 얻었다(도 2).

종양의 BI-1 (TMBIM6)발현 수준이 예후와 관련이 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 TCGA의 GEPIA2와 TCGA33의 GTEx 프로젝트 32 및 OncoLnc를 사용하여 BI-1 (TMBIM6)발현과 전체생존(OS; overall survival) 간의 상관관계를 분석하였다. 분석 결과, BI-1 (TMBIM6)발현이 높은 환자가 유방 침입성 암종 (BRCA), 자궁경부편평세포 암종 및 자궁경부선암(CESC), 육종(SARC) 및 폐선암(LUAD)에서 생존이 좋지 않음을 발견하였다. 이러한 데이터는 BI-1이 여러 암에서 질병 결과에 대한 예측 바이오 마커로서 잠재적인 임상적 가치가 있음을 시사한다. 또한, 췌장 선암(PAAD), 식도 암종(ESCA), 피부 흑색종(SKCM), 두경부 편평세포 암종(HNSC), 뇌 하급 신경 교종(LGG)을 비롯한 여러 암에서 BI-1발현이 높음을 확인하였다 (도 3 내지 5 참조).

<실시예 2> BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포의 제조

CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 HT1080 및 HeLa 세포주를 대상으로 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 (녹아웃) 세포를 만들었다.

인간 BI-1을 표적으로 하는 서열을 포함하는 플라스미드는 ToolGen (서울, 한국)에 의해 pRGEN_BI-1 발현 벡터로부터 설계 및 구축되었다.

인간 BI-1의 엑손 3을 표적으로 하는 가이드 서열은 5'-TGCAGGGGCCTATGTCCATATGG-3 '이었다.

음성 대조군으로서 pRGEN_Scramble 벡터는 Origene (# GE100003, pCas-Scramble Vector)로부터 정보를 받은 스크램블 시퀀스 (5'-GCACTACCAGAGGCTAACTCA-3')를 사용하여 구축되었다.

pRGEN_BI-1 벡터 또는 pRGEN_Scramble을 pRGEN_Cas9-CMV와 혼합하고 리포펙타민 3000을 사용하여 HT1080 및 HeLa 세포로 공동 형질 감염했다. 48시간 후, 세포를 트립신 처리하고 제한 희석 방법으로 개별 클론을 분리하기 위해 96 웰 플레이트에 깔았다. 세포는 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM에서 1주 이상 배양했다. 단일 클론을 확장하고 게놈 DNA를 클론에서 정제하고 다음 3개의 프라이머를 사용하여 PCR 기반 스크리닝을 위한 주형으로 사용하였다:

F1, 5'-CGTTGCTGTGTGGTTATTGG-3';

R1, 5'-TCAATCCTGCCTCTCCTGAT-3'; 및

Ftarget, 5'-TGCAGGGGCCTATGTCCATATGG-3 '.

녹아웃 클론은 하나의 PCR 산물만을 생산한 반면, 일반 클론은 2개를 생산했다. 녹아웃 클론의 PCR 산물은 JETsorb DNA Extraction Kit (Genomed, Leinfelden-Echterdingen, 독일)를 사용하여 정제하였으며, 결실은 서열 분석으로 확인하였다.

도 6은 CRISPR/Cas9 게놈 편집기술을 사용한 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포의 제조를 보여준다. A는 CIRSPR/Cas9 기술로 sgRNA를 사용하여 위치 특이적으로 DNA를 절단하는 게놈 편집을 개략적으로 나타낸 것이다. HT1080 세포 및 HeLa 세포에서 삽입/결실을 포함하는 BI-1의 변이된 대립 유전자 서열을 보여준다.

도 6B 및 도 6C는 각각 WT 및 BI-1이 녹아웃된 HT108 세포 및 HeLa 세포에서의 BI-1의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 검출한 것이다. 유사한 결과를 얻은 두 번의 실험 중의 하나의 결과이다.

<실시예 3> BI-1의 결실(knock-out, deficient)에 의한 암의 종양형성(tumorigenicity) 억제

BI-1의 암의 증식에 미치는 영향을 보기 위하여 세포 증식, 이동 및 침입(invasion) 분석을 수행하였다.

BI-1이 녹아웃된 HT1080, HeLa 세포 및 마우스 배아 섬유 아세포(MEF)는 모두 WT(WT) 세포에 비해 느린 성장을 보이는데 비하여(도 7A 참조), BI-1을 재발현하는 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 성장 속도가 복원되었다(도 7B 참조).

BI-1이 결여된 세포에서는 세포 이동(도 8A 참조)과 침입(invasion)(도 8B 참조)이 억제되었다.

마우스에서 종양 세포의 성장에서 BI-1의 역할을 조사하기 위해, BI-1 (TMBIM6)WT(WT) 및 녹아웃 HT1080 세포를 면역 손상 마우스(immunocompromised mouse)의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 피하 주사하였다. BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포에서 발생하는 종양 형성과 종양의 무게는 WT 세포에 비해 현저하게 감소하였다(도 9 참조).

Ki67-양성 증식세포(Ki67-positive proliferative cell)의 면역조직화학 염색은 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포로부터의 이종이식 종양의 증식이 현저하게 감소됨을 보여주었다(도 10 참조). 일관되게, BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HeLa 세포에서도 WT 세포에서 보다 종양 형성과 무게, Ki-67의 발현이 분명히 감소하였다(도 11 및 도 12 참조).

또한, 종양 형성과 Ki67 발현은 유전자의 효율적인 생체 내 표적화를 위한 안정적인 siRNA silencing 플랫폼인 SAMiRNA (self-assembled micelle inhibitory RNA)를 주입한 BI-1 (TMBIM6)녹다운 조건에서도 감소하였다(도 13 및 도 14 참조).

상기와 같은 시험관 내 및 생체 내 실험결과는 BI-1이 종양 성장을 촉진한다는 것을 시사한다.

<실시예 4> mTORC2-리보솜 축(axis)을 통한 BI-1의 AKR 경로 활성화 작용

WT(WT) 및 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃(KO) HT1080 세포에서 암 진행을 조절하는 신호 단백질 분자를 평가하기 위해 단백질 포스포키나아제(phospho-kinase) 프로파일링 분석을 수행하였다.

결과는 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포에서 AKT (pAKT-S473), PRAS40, mTOR, GSK3-α/β, WNK1의 인산화가 감소했음을 보여주었다 (도 15 참조).

PRAS40, GSK3-α/β, 및 WNK1은 AKT의 알려진 기질이기 때문에, AKT 상위 신호전달자인 mTORC2가 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 변경되는지를 살펴보았다. BI-1의 제거는 mTORC2, AKT 및 NDRG1의 인산화를 감소 시켰고, AKT 기질로서 TSC2를 감소시켰다(도 16 참조).

BI-1을 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포에 재도입하면 AKT (pAKT-S473) 및 NDRG1 (pNDRG1-S939)의 인산화가 회복되었다(도 17 참조).

혈청을 고갈(starvation)시킨 후 인슐린, IGF1 또는 EGF 자극 시, AKT의 인산화는 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서와 비교하여 WT 세포에서 높게 유도되었다(도 18 참조).

mTORC2의 조립(assembly) 및 그의 리보솜과의 연관성은 AKT 인산화와 밀접한 관련이 있으므로, 이를 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 평가하였다. MEF를 사용한 겔 여과 분석(gel filtration assay)은 mTORC2가 BI-1의 결실에 의해 하향 조절되었음을 보여주었다(도 19 참조).

PLA분석(in situ proximity ligation assay)에서 RICTOR와 mTOR, RPL19 및 RPS16 간의 상호 작용은 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080과 HeLa 세포에서 현저하게 감소하였다(도 20 참조).

RPL19를 사용한 면역침전(Co-IP; co-immunoprecipitation) 분석에서, RPL19에 대한 mTOR, RICTOR, SIN1 및 GβL (mLST8로도 알려짐)의 결합은 대부분 녹아웃 세포에서 제거되었다(도 21 참조). 더욱이, 이들 유전자의 단백질 및 mRNA의 발현 수준은 BI-1 (TMBIM6)WT 및 녹아웃 세포에서 동일하였다(도 21 참조).

상기 개시내용의 결과는 BI-1이 AKT 활성을 조절하는 mTORC2 신호 전달의 필수 유전자 중 하나임을 시사한다.

<실시예 5> BI-1의 mTORC2 활성화 조절 작용

AKT의 상위 조절자인 mTORC2가 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 달라지는지 조사하였다. BI-1 (TMBIM6)제거조건에서 mTORC2 기질로서 AKT 및 NDRG1의 인산화를 감소되었고, AKT 기질로서 TSC2의 인산화가 감소되었다(도 22 참조). 면역 형광염색은 BI-1 (TMBIM6)결실에 의해 AKT의 인산화가 감소되었음을 보여주었다(도 23 참조). 위의 결과와 일관되게, HeLa 세포에서 BI-1을 과발현하면 mTORC2 활성이 증가했다(도 24). BI-1-HA 과발현으로 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 MEF 세포(MEF-/-)에서 AKT (pAKT-S473)의 인산화는 혈청 기아 후 인슐린 자극시 증가했다 (도 25 참조).

AKT 인산화가 BI-1에 의존하는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 테트라사이클린 유도성 BI-1 (TMBIM6)발현을 갖는 안정적인 T-Rex-293 세포를 확립했다. BI-1 (TMBIM6)수준은 AKT 인산화의 수반되는 증가와 함께 용량 의존적 방식으로 독시사이클린 처리에 의해 증가되었으며(도 26 참조), 이는 BI-1이 AKT 활성을 조절하는 mTORC2 신호전달의 필수 유전자 중 하나임을 시사하였다.

PLA (in situ proximity ligation assay)에서, RICTOR와 mTOR, RPL19 및 RPS16 간의 상호작용은 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080과 HeLa 세포에서 현저하게 감소했다(도 27 참조). 이들 유전자의 단백질 및 mRNA의 발현 수준은 BI-1 (TMBIM6)WT 및 녹아웃 세포에서 동일하였다(도 28 참조).

mTORC2와 리보솜 사이의 결합이 BI-1에 의존하는지 여부를 확인하기 위해 혈청 기아 후 인슐린 자극에 대한 항-RICTOR 항체로 Co-IP assay를 수행하였다. 항-RICTOR 항체는 WT 세포에서 mTOR, GβL 및 RPS16으로 풀다운되었지만 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서는 다운되지 않았다(도 29 참조).

<실시예 6> BI-1의 mTORC2 및 리보좀의 회합(association) 조절 작용

BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 mTORC2 활성을 감소시키는 것이 리보솜 성숙의 손상과 관련이 있는지 확인하기 위해, 분획을 통하여 80S, 60S 및 40S 리보솜에서 폴리솜을 분리하였다. 리보솜 프로파일링의 패턴은 BI-1 (TMBIM6)WT과 녹아웃 세포 간에 동일했으며, 이는 BI-1이 리보솜 성숙과 관련이 없음을 나타낸다(도 30 참조). 그러나 mTORC2 성분은 WT 세포의 성분과 비교하여 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포의 폴리솜 및 리보솜 분획에서 상대적으로 덜 검출되었다(도 31A 참조). 또한, BI-1은 BI-1 (TMBIM6)구제(rescue) 조건의 세포에서 폴리솜 및 리보솜 분획과 공동 정제되었다(도 31B 참조). mTORC2가 물리적으로 번역 (mRNA 결합)과 상호 작용하고 비 번역 80S 리보솜 29 및 BI-1이 mTORC2에 결합하기 때문에, BI-1이 mRNA 결합 리보솜에서 mTORC2와 공동 정제(co-purification)되는지 여부를 알아보고자 하였다. 올리고(dT) 셀룰로오스와 함께 폴리 (A) mRNA의 풀다운에 의해 정제된 mRNA 결합 리보솜에서, BI-1은 mTOR, RICTOR 및 RPL19와 공동 정제되었다(도 31C 참조). 이러한 결과는 BI-1이 mTORC2 구성 요소의 조립을 조절하고 mTORC2와 리보솜 사이의 물리적 연관성을 촉진함을 시사한다.

<실시예 7> BI-1의 소포체상의 mTORC2 거주(residency) 조절 작용

mTORC2는 소포체(ER) 막에서 ER 결합 리보솜과 상호 작용하는데 이는 키나아제 활성에 필요하다. ER에서 mTORC2의 국재화(localization)가 BI-1 (TMBIM6)WT과 녹아웃 세포 간에 다른지 확인하기 위해 면역 형광 분석을 수행하였다. ER 마커 단백질 PDI (protein disulfide isomerase)와 mTORC2 성분의 공-국재화(co-localization)도 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 감소하였으며(도 32 참조), 이는 BI-1이 ER에서 mTORC2의 거주(residency)를 조절하고 있음을 시사한다.

<실시예 8> BI-1의 AKT-의존성 대사 조절작용

mTORC2는 해당 과정 유전자(glycolytic gene)의 발현, 호기성 해당 과정, 글루타티온(GSH) 생합성, 헥소사민 생합성 경로(HBP) 및 당화(glycosylation)를 조절하여 세포 생물에너지를 조절하는 역할을 한다. BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포는 해당 과정 유전자의 하향 조절을 보여 주었고(도 33A 참조), 또한 포도당 소비와 젖산 생산을 감소시켰다(도 33B, 33C 참조).

5 탄당 포스페이트 경로 (PPP)와 관련된 유전자의 발현은 BI-1 (TMBIM6)녹아웃에서도 감소했으며, 이는 BI-1 (TMBIM6)과발현 HeLa 세포에서 역전되었다(도 33A 및 도 34 참조). MS 분석에 따르면 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 해당 과정, 트리카르복실산 회로 (TCA), PPP 및 HBP의 대사산물 수준이 WT 세포 (도 35 참조)에 비해 감소한 것으로 나타났다. 이는 대사 경로가 BI-1, 여기서는 mTORC2 활성의 억제와 관련이 있음을 말한다.

다음으로 AKT 관련 GSH 생합성, de novo lipogenesis 및 단백질 합성과 관련된 유전자의 발현을 분석했다. BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포는 GCLC, GCLM, GSS 및 GSR의 감소된 발현을 보였으며(도 36A 참조), 콜레스테롤, 지방산, 중성지방, 인지질 합성에 필요한 SREBF1을 포함하는 de novo lipogenesis와 관련된 유전자의 발현도 이들 세포에서 감소했다(도 36B 참조). 전반적으로 단백질 합성은 BI-1의 손실로 인해 현저하게 감소했다(도 37 참조).

당 단백질 폴딩 상태를 조사한 결과, 당화 단백질의 기저 수준이 WT HT1080 세포보다 BI-1 (TMBIM6)녹아웃에서 더 낮았다(도 38A 참조). Microarray 분석 데이터는 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서 ALG5, ALG1, ALG6, ALG8, MGAT2, EOGT, POFUT1 및 POGLUT1을 포함한 글리코실화 관련 유전자의 발현이 감소한 것으로 나타났다(도 38B 참조). 이러한 결과들은 BI-1이 대사에서 신호전달을 변경하여 mTORC2 활성을 조절함을 나타낸다.

<실시예 9> BI-1의 mTORC2 및 리보좀과의 직접적 상호작용 기능

BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포를 HA-tagged BI-1 (BI-1-HA)으로 형질 감염시킴으로써 BI-1이 mTORC2 성분 및 리보솜과 직접 상호 작용하는지 조사하였다. 항-RICTOR 항체를 사용한 풀링된 샘플의 겔 여과 분석 및 면역 침전을 통해 BI-1이 mTORC2에 직접 결합되는 것임을 증명하였다(도 39 참조).

더욱이, BI-1-HA- 과발현 HeLa 및 HT1080 세포에서 BI-1과 내인성 mTORC2 또는 리보솜 (60S RPL19 및 40S RPS16) 사이의 연관성이 mTORC1 서브 유닛으로서 RAPTOR와는 관계가 없는 것으로 면역 침전 및 PLA 분석에 의해 확인되었다 (도 40 참조).

BI-1이 RPL19 및 RICTOR와 관련된 글루타티온 S- 트랜스퍼라제 (GST) 풀다운 분석에 의해 RICTOR 및 RPL19에 대하여 BI-1이 직접 결합함으로 보여주었다(도 41 참조).

BI-1이 mTORC2와 관련이 있는지 확인하기 위해 항-RICTOR 항체로 면역 침전을 수행한 다음 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)을 사용하여 결합 단백질을 분석했다. 결과는 BI-1이 mTORC2의 결합 파트너 중 하나임을 보여주었다. 또한, BI-1 (TMBIM6) 및 mTORC2 구성 요소 간의 상호 작용을 조사했다. RICTOR는 mTOR의 FKBP12-라파마이신 결합 도메인에 가깝고 SIN1에 의해 결합되는 반면, mTOR 키나제 도메인은 mLST840에 의해 결합된다. siRNA에 의한 RICTOR silencing은 mTORC2와 BI-1-HA 사이의 상호작용을 없앴으며, mTOR 해리(dissociation)가 관찰되지 않았다(도 42의 A 참조).

어떤 BI-1 (TMBIM6)도메인이 RICTOR와 상호 작용하는지 확인하기 위해 N-말단 (ΔN)의 29개 아미노산 (AA) 및 C-말단 (ΔC)의 9AA 삭제, 및 세포질 루프의 모든 잔기의 변경을 포함하는 BI-1 (TMBIM6)돌연변이 구조를 만들었다.

루프 1 (L1) 및 루프 2 (L2)는 모든 6개 또는 7개의 막 횡단 구조에 대한 알라닌 잔기로 연결되어진다. BI-1과 RICTOR 사이의 연관성은 BI-1-ΔN에서 감소했거나 BI-1-L1 및 L2에서 co-IP 분석에 의해 거의 차단되었다(도 42의 B 참조).

어떤 BI-1 (TMBIM6)도메인이 RPL19와 상호 작용하는지 더 연구하기 위해, C-말단(ΔC40)의 40AA가 결실된 BI-1 (TMBIM6)돌연변이를 만들었다. Immunoprecipitation assay는 RPL19와 BI-1-ΔC40결합은 없어진 반면, RICTOR 또는 mTOR와의 상호작용은 그대로 변경되지 않았음을 확인시켜주었다(도 42의 C 참조). AKT (pAKT-S473)의 인산화는 RPL19 또는 RICTOR 비 연관 BI-1 (TMBIM6)돌연변이체에서도 감소했다(도 42의 B, C 참조). 이러한 결과들은 BI-1이 mTORC2 및 리보솜과 상호작용하고, 이러한 상호작용이 mTORC2의 키나제 활성에 중요하다는 것을 나타낸다.

<실시예 10> BI-1의 토폴로지(topology)

BI-1은 대부분 α-나선 구조를 가진 6개 또는 7개의 막 횡단 영역으로 구성되며, BI-1의 C-말단은 TMHMM에 의해 세포질에 존재하거나 박테리아 동족체 BsYetJ41-45에 의해 ER 관내 공간에 존재한다(도 43의 A 참조). BsYetJ는 hBI-1과 관련된 박테리아 단백질이지만 BLASTp에 의한 아미노산 동일성은 23.77%에 불과하다(도 43의 B 참조).

BI-1 (TMBIM6) topology를 이해하기 위해 N-말단 (HA-BI-1) 및 C-말단 (BI-1-HA) HA 태그로 BI-1을 과발현하는 세포를 사용하여 면역 형광염색을 수행하였다. Triton X-100은 모든 막을 투과시키고 내강 및 세포질 에피토프의 염색을 유도하는 반면, digitonin은 항체의 세포질 에피토프에만 접근할 수 있는 특성을 가지고 있다. ER lumen에 유지된 PDI는 음성 대조군으로 사용되었다.

HA-BI-1 및 BI-1-HA의 면역 형광은 모든 조건에서 검출되었지만 PDI 형광은 digitonin의 존재 하에서 검출되지 않았음(도 44 참조)을 볼 때, 본 결과는 BI-1의 N- 및 C-말단이 6-막통과 구조(transmembrane structure) 조건에서 세포질에 노출되어 있음을 시사한다.

<실시예 11> BI-1와 상호작용하는 단백질의 확인

사람 조직의 cDNA 라이브러리와 BI-1의 50개 아미노산 세포질 도메인을 미끼로 사용하여 T4 파지 디스플레이 스크리닝을 수행하였다. 60S RPL19는 BI-1의 리간드 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(도 45 참조). 앞서 말한 결과와 일관되게 BI-1과 RICOTR 또는 리보솜 간의 물리적 상호작용이 mTORC2 활성을 향상시키는 데 필요함을 시사한다.

<실시예 12> BI-1 (TMBIM6)연관 ER Ca ²⁺ 방출에 의한 mTORC2 활성화 조절

mTORC2 활성화에서 Ca2+의 역할을 조사하였다. BAPTA 또는 결합 속도가 느린 Ca2+ 킬레이터(즉, EGTA-AM)가 아닌 BAPTA 아세톡시 메틸에스테르 (BAPTA-AM)에 의한 Ca2+ 고갈은 PLA 분석 결과에서 보이는 것과 같이 mTORC2와 리보솜 사이의 결합을 차단하였다(도 46의 A 참조).

따라서 국소 Ca2+ 농도는 mTORC2 활성화에 영향을 미치게 되는 것을 알 수 있었다.

BI-1에서 방출된 Ca2+가 mTORC2 구성 요소와 리보솜 간의 상호 작용에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 먼저 BI-1-GCaMP3 세포를 사용하여 BI-1의 Ca2+ 누출 특성을 확인하였다. 이 단백질의 칼슘 채널 부위 D213A 돌연변이 세포와 WT(WT) 세포 조건(도 46의 B 참조)이 mTORC2 assembly 및 AKT 인산화에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 HT1080 세포에서 먼저 발현 양상을 확인하였다(도 47의 A 참조).

확인 결과 WT 및 BI-1D213A세포에서 비슷한 수준으로 ER에서 발현 정도와 패턴은 유지되어있음을 알 수 있었다. 따라서 BI-1 (TMBIM6)관련 AKT 활성화는 단백질 상호작용의 특성이 하기와 같이 정리된다. 즉, RICTOR와 BI-1의 결합은 Ca2+ 누출과 무관한 반면, BI-1과 mTOR 또는 리보솜의 상호작용은 BI-을 통한 국소 Ca2+ 누출에 의존하고 있음을 알 수 있다(도 47의 B 참조).

<실시예 13> BI-1-유도 Ca2+ 누출에 의한 mTORC2 조합체(assembly) 및 mTORC2와 리보솜의 회합에 대한 영향

BI-1에서 방출된 Ca2+가 mTORC2 구성요소와 리보솜 간의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 먼저 BI-1-GCaMP3를 사용하여 BI-1의 Ca2+ 누출 특성을 확인했다. 형광 강도로 보여지는 BI-1 (TMBIM6)관련 Ca2+ 방출은 WT BI-1-GCaMP3를 발현하고 있는 HT1080 세포에서 검출되었지만 Ca2+ 채널 돌연변이체 BI-1 (BI-1D213A)-GCaMP3 세포에서는 검출되지 않았다(도 48 참조).

다음으로 PLA 분석은 RICTOR와 mTOR; 또는 RICTOR와 RPL119 사이;의 상호작용이 BI-1D213A 세포가 아닌 BI-1 (TMBIM6)WT을 발현하는 HT1080 세포에서 증가되어 있음을 보여주었다(도 49 참조).

co-IP 분석에서 BI-1와 RICTOR 결합은 WT와 BI-1D213A를 발현하는 세포간에 별로 차이가 없었다. 그러나, BI-1에 대한 mTOR 결합은 BI-1D213A 세포에서 약간 감소하였다. 흥미로운 점은 BI-1에 대한 RPL19 및 RPS16 결합은 D213A 돌연변이 세포에서 현저하게 감소했다는 점이다(도 50 참조). 또한, 면역 블롯 및 면역 형광 분석을 통해 BI-1D213A 세포에서 AKT의 인산화가 감소한 것으로 나타났다(도 51 참조).

BI-1을 통한 Ca2+ 누출의 중요성을 조사하기 위해 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포에서 WT(WT) 또는 BI-1 (TMBIM6)D213A의 발현을 안정적으로 발현하게 한 후 세포 대사에 대한 영향을 확인하고자 하였다. 세포 증식은 BI-1 (TMBIM6)발현 정도와는 상관없이 녹아웃 세포에 BI-1 (TMBIM6)재발현 조건에서 회복되었으며 D213A 재발현 녹아웃 세포에서는 세포증식에 별 영향을 주지 못하였다 (도 52 참조).

또한, 해당 과정 및 PPP와 관련된 유전자의 발현이 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에 BI-1을 재발현시킨 세포에서 포도당 소비와 젖산 생산의 회복을 나타내었다(도 53 참조). 질량 분석법에 의해 해당 과정, TCA, PPP, 및 HBP의 대사 산물 수준은 BI-1D213A 세포와 비교하여 BI-1 (TMBIM6)구조 세포에서 회복되었다(도 53의 D 참조). 이 결과는 BI-1이 "Ca2+ 누출 관련 mTORC2 활성화" 특성을 통해 대사 경로를 조절함을 시사한다.

<실시예 14> BI-1에 의한 mTORC2-의존성 대사 조절 기능

GSH 생합성 및 de novo lipogenesis와 관련된 유전자의 발현은 BI-1 (TMBIM6)재발현한 녹아웃 세포에서 회복되었고 D213A 세포에서는 영향이 없었다(도 54 참조).

질량 분석법에 의해 해당 과정, TCA, PPP 및 HBP의 대사산물 수준은 BI-1D213A 세포와 비교하여 BI-1 (TMBIM6)구조 세포에서 회복됨을 알 수 있었다(도 55 참조).

또한, 리보솜 프로파일링의 패턴은 모든 세포에서 동일했으며(도 56 참조), 이는 BI-1이 리보솜 성숙과는 무관함을 나타낸다.

이러한 결과는 BI-1이 "Ca2+ 누출 관련 mTORC2 활성화" 특성을 통해 대사 경로를 조절함을 시사한다.

<실시예 15> BI-1 (TMBIM6)길항제 화합물의 제조

BI-1 (TMBIM6)길항제(antagonist) 화합물을 찾기 위하여 다량의 화합물을 도 62에서 언급한 BI-1 (TMBIM6)로 인한 ER로부터의 칼슘유리를 detection하는 tool인 ER-TMBIM6-GCaMP3L1형광측정 assay 및 ER내의 칼슘양을 측정하는 ER-Cepia assay 방법으로 스크리닝하여, 잠재적인 BI-1 (TMBIM6)길항제로서 다음과 같은 칼콘 스캐폴드(chalcone scaffold)를 도출하였다.

다양한 치환체로 R1 및 R2 위치의 최적화를 통하여 여러 화합물을 합성하였다.

2E-1-2-아미노페닐-3-3-니트로페닐-2-프로펜-1-온 (2E-1-2-Aminophenyl-3-3-nitrophenyl-2-propen-1-one)이 BI-1에 대한 길항효과가 우수함을 확인하고, 이를 BIA (BI Antagonist)라고 명명하였다. 또한, BIA의 유사체를 합성하였으며, 합성한 화합물을 아래 표에 나타낸 바와 같이 명명하였다.

각 화합물은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1을 갖는 본 발명의 유도체 화합물은 하기의 반응식 I의 대표 실시예와 같이 제조하였으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

하기 반응식 I과 같이 제조된 화학식 1의 화합물 중 GM-90222, GM- 90223, GM-90224, GM-90229, GM-90230, GM-90243, GM-90254, GM-90255, GM-902599, GM-90230, GM-90315, GM-90316, GM-90319, GM-90320, GM-90321, GM-90337, GM-90338, GM-90339, 및 GM-90340은 새로이 합성한 신규 화합물이다. 상기 신규 화합물 중 대표적으로 GM-90223에 대하여 NMR data를 기재하였다.

<대표 실시예>

치환된 아세토페논 (1.25mmol) 및 수산화나트륨 (0.251mmol)을 에탄올 (5mL)에 용해시키고 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음 치환된 벤즈알데히드 (1.272mmol)를 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 용매 시스템으로서 25% 에틸아세테이트/핵산을 사용하여 TLC로 모니터링하였다. 용매를 증발시켜 제거하고 잔류물을 물 (40mL)로 처리하고 에틸아세테이트 (30mL×3)로 추출하였다. 추출하여 모은 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 농축하고 EA와 Hexane의 혼합물을 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 상응하는 α,β-불포화 케톤을 얻었다.

<반응식 I>

제조예 1. ( E )-3-(3-nitrophenyl)-1-phenylprop-2-en-1-one (GM-90128)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 아세토페논 (120mg, 1.00mmol) 및 3- 니트로 벤즈알데히드 (154mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 76% 수율 (192mg, 0.76mmol)

제조예 2. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90129)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1- (2- 아미노 페닐) 에탄 -1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 3- 니트로 벤즈알데히드 (154mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 74% 수율 (199mg, 0.74mmol)

제조예 3. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one (GM-90130)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노 페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 벤즈알데히드 (108mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 78% 수율 (174mg, 0.78mmol)

제조예 4. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90131)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1 -온 (135mg, 1.00mmol) 및 3-메톡시 벤즈알데히드 (139mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 71% 수율 (180mg, 0.71mmol)

제조예 5. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90132)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 3-브로모 벤즈알데히드 (189mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 82% 수율 (248mg, 0.82mmol)

제조예 6. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90133)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 4-니트로 벤즈알데히드 (154mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 80% 수율 (215mg, 0.80mmol)

제조예 7. ( E )-1-(2-methoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90134)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-메톡시페닐)에탄 -1-온 (150mg, 1.00mmol) 및 3-니트로 벤즈알데히드 (154mg, 1.02mmol)로 부터 제조되었다. 80% 수율 (227mg, 0.80mmol)

제조예 8. ( E )-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90135)

디클로로메탄 중의 상기 GM-90134 (57mg, 0.20mmol) 용액에 1M BCl₃ (디클로로메탄 내, 0.3mL)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 3 시간 동안 교반 하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 물 (3mL)로 처리하고 디클로로메탄 (5mL×3)으로 추출하였다. 유기층을 합하여 무수 황산나트륨상에서 건조 및 농축하고, EA 및 헥산의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 GM-90135를 90% 수율 (48mg, 0.18mmol)로 수득 하였다.

제조예 9. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)prop-2-en-1

-one (GM-90222)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 4-(트리플루오로메톡시)벤즈알데히드 (194mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 84% 수율 (258mg, 0.84mmol)

제조예 10. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(2,4-difluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90223)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 2,4-디플루오르벤즈알데히드 (145mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 83% 수율 (215mg, 0.83mmol)

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (dd, J = 8.4, 1.5 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.60 (td, J = 8.5, 6.4 Hz, 1H), 7.28 (ddd, J = 8.5, 7.2, 1.5 Hz, 1H), 6.94-6.89 (m, 1H), 6.87 (ddd, J = 11.1, 8.8, 2.5 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.67 (dt, J = 5.4, 3.3 Hz, 1H).

제조예 11. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-4-fluorophenyl)prop-2-en-1- one (GM-90224)

표제 화합물은 일반적인 절차에 따라 1- (2- 아미노 페닐) 에탄 -1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 2,4- 에톡시-4-플루오로 벤즈알데히드 (172mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 70 % 수율 (200mg, 0.70mmol)

제조예 12. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(naphthalen-2-yl)prop-2-en-1-one

(GM-90225)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 2-나프탈알데히드 (159mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 79% 수율 (216mg, 0.79mmol)

제조예 13. ( E )-1-(2-aminophenyl)inophenyl)-3-(4-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-en-1-one (GM-90226)

표제 화합물을 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 4-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드 (178mg, 1.02 mmol)로부터 제조하였다. 85% 수율 (253mg, 0.85mmol)

제조예 14. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-( p -tolyl)prop-2-en-1-one (GM-90227)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 4-메틸벤즈알데히드 (123mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 77% 수율 (183mg, 0.77mmol)

제조예 15. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(pyridin-4-yl)prop-2-en-1-one (GM-90228)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 이소니코틴알데히드 (109mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 69% 수율 (155mg, 0.69mmol)

제조예 16. (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-5-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90229)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 2-에톡시-5-니트로벤즈알데히드 (199mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 52% 수율 (162mg, 0.52mmol)

제조예 17. 1-(2-aminophenyl)-3-(2-ethoxy-5-nitrophenyl)-3-hydroxypropan-1-one (GM-90230)

표제 화합물을 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 2-에톡시-5-니트로벤즈알데히드 (199mg, 1.02 mmol)로부터 제조하였다. 34% 수율 (112mg, 0.34mmol)

제조예 18. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(4-( tert -butyl)phenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90243)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 4-(tert-부틸)벤즈알데히드 (165mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 81% 수율 (226mg, 0.81mmol)

제조예 19. ( E )-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90254)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시 페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-니트로벤즈알데하이드 (154mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 84% 수율 (276mg, 0.84mmol)

제조예 20. ( E )-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-

en-1-one (GM-90255)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시 페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-브로모벤즈알데하이드 (188mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 80% 수율 (290mg, 0.80mmol)

제조예 21. ( E )-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90256)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시 페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-메톡시벤즈알데하이드 (139mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 70% 수율 (219mg, 0.70mmol)

제조예 22. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromo-5-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90281)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-브로모-5-히드록시벤즈알데히드 (205mg, 1.02mmol)로 부터 제조되었다. 61% 수율 (194mg, 0.61mmol)

제조예 23. ( E )-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzonitrile (GM-90282)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 3-포밀벤조니트릴 (134mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 77% 수율 (191mg, 0.77mmol)

제조예 24. (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)prop-2-en-

1-one (GM-90283)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-(트리플루오로메틸)벤즈알데하이드 (178mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 77% 수율 (224mg, 0.77mmol)

제조예 25. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-( m -tolyl)prop-2-en-1-one (GM-90284)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-메틸벤즈알데히드 (123mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 68% 수율 (161mg, 0.68mmol)

제조예 26. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (GM-90285)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.00mmol) 및 니코틴알데히드 (109mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 70% 수율 (157mg, 0.70mmol)

제조예 27. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90295)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-에톡시벤즈알데히드 (153mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 71% 수율 (190mg, 0.71mmol)

제조예 28. ( E )-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoic acid

(GM-90296)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-포밀벤조산 (123mg, 1.02mmol)으로부터 제조하였다. 67% 수율 (179mg, 0.67mmol)

제조예 29. ( E )-1-(2-amino-4-methoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en- 1-one (GM-90297)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4-메톡시 페닐)에탄-1-온 (165mg, 1.00mmol) 및 3-니트로벤즈알데히드 (154mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 85% 수율 (254mg, 0.85mmol)

제조예 30. ( E )-1-(2-amino-5-fluorophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90298)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-5-플루오로 페닐)에탄-1-온 (153mg, 1.0mmol) 및 3-니트로벤즈알데히드 (154mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 82% 수율 (235mg, 0.82mmol)

제조예 31. tert -butyl ( E )-(3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl) carbamate (GM-90299)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1-

온 (135mg, 1.0 mmol) 및 tert-부틸 (3-포밀페닐)카바메이트 (226mg, 1.02 mmol)로부터 제조되었다. 73% 수율 (247mg, 0.73mmol)

제조예 32. ( E )-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)- N -methylbenz amide (GM-90300)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4-메톡시 페닐)에탄-1-온 (165mg, 1.00mmol) 및 3-포밀-N-메틸벤즈아미드 (166mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 83% 수율 (233mg, 0.83mmol)

제조예 33. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-aminophenyl)prop-2-en-1-one hydrochloride (GM-90315)

건조 디옥산 (0.5mL) 중 GM-90299 (68mg, 0.20mmol)의 용액에 4M HCl (디옥산 중, 2mL)을 첨가했다. 반응을 실온에서 3시간 동안 교반 하였다. 이어서 이를 농축하고 진공에서 건조시켜 GM-90315를 98% 수율 (54mg, 0.20 mmol)로 얻었다.

제조예 34. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3,5-difluoro-4-hydroxyphenyl)prop-2-

en-1-one (GM-90316)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3,5-디플루오로-4-히드록시벤즈알데히드 (161mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 77% 수율 (212mg, 0.77mmol)

제조예 35. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-chlorophenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90317)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-클로로벤즈알데히드 (143mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 85% 수율 (219mg, 0.85mmol)

제조예 36. ( E )-1-(2-aminophenyl)-3-(3-fluorophenyl)prop-2-en-1-one

(GM-90318)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1- 온 (135mg, 1.0mmol) 및 3-플루오로벤즈알데히드 (127mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 85% 수율 (205mg, 0.85mmol)

제조예 37. ( E )-3-(3-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl) benzonitrile (GM-90319)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시 페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-포밀벤조니트릴 (134mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 80% 수율 (247mg, 0.80mmol)

제조예 38. ( E )-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)

prop- 2-en-1-one (GM-90320)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-(트리플루오로메틸)벤즈알데히드 (178mg, 1.02mmol)로부터 제조하였다. 82% 수율 (288mg, 0.82mmol)

제조예 39. ( E )-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-bromo-5-hydroxyphenyl)

prop-2-en-1-one (GM-90321)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노-4,5-디메톡시 페닐)에탄-1-온 (195mg, 1.0mmol) 및 3-브로모-5-히드록시벤즈알데히드 (205mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 72% 수율 (272mg, 0.72mmol)

제조예 40. 3-(3-(2-aminophenyl)isoxazol-5-yl)benzonitrile (GM-90337)

1.4 mL 메탄올/물(6 : 1)에 녹인 N-하이드록실-4-톨루엔설폰아미드 (281mg, 1.50mmol) 용액에 K₂CO₃ (221mg, 1.60mmol)를 첨가하고, 이어서 0.6ml의 메탄올에 용해된 0.2mmol GM-90282 (50mg)를 첨가한 후, 반응 혼합물을 40℃에서 24시간 동안 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 그 다음 추가 K₂CO₃ (111 mg, 0.80 mmol)를 첨가하고 혼합물을 40℃에서 10시간 동안 교반 하였다. 교반 완료 후, 반응 혼합물을 물 (3mL)로 처리하고 에틸아세테이트 (5mL×3)로 추출하였다. 추출한 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고, 농축하고, EA 및 헥산의 혼합물을 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토 그래피로 정제하여 GM-90337을 68% 수율 (36mg, 0.136 mmol)로 수득하였다.

제조예 41. ( Z )-3-(( E )-3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)- N' -hydroxy

benzimidamide (GM-90338)

표제 화합물은 상기의 대표 실시예에 따라 1-(2-아미노페닐)에탄-1-온 (135mg, 1.0mmol) 및 (Z)-3-포밀-N'-히드록시 벤즈이미드아미드 (167mg, 1.02mmol)로부터 제조되었다. 54% 수율 (152mg, 0.54mmol)

제조예 42. 2-(5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)isoxazol-3-yl)aniline (GM-90339)

N,N-디메틸아세트아미드 (0.5mL)에 녹인 구아니딘 하이드로 클로라이드 (38mg, 0.40mmol) 용액을 나트륨 에톡사이드 (28mg, 0.41mmol)로 처리하고 15분 동안 교반하고 여과하였다. 여액을 N,N-디메틸아세트아미드 (0.5 mL) 중의 GM-90283 (58mg, 0.20 mmol) 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 교반하면서 100℃로 18시간 동안 가열하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 물 (40mL)로 처리하고 에틸아세테이트 (30mL×3)로 추출하였다. 추출 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조, 및 농축하고, EA와 헥산의 혼합물을 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 GM-90339를 54% 수율 (34 mg, 0.108 mmol)로 수득 하였다.

제조예 43. 2-(5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)isoxazol-3-yl)aniline (GM-90340)

1.4 mL 메탄올/물 (6 : 1)에 녹인 N-하이드록실-4-톨루엔설폰아미드 (281mg, 1.50mmol) 용액에 K₂CO₃ (221mg, 1.60mmol)를 첨가했다. 이어서 0.6ml의 메탄올에 용해된 0.2mmol GM-90283 (58mg)을 첨가하고, 반응 혼합물을 40℃에서 24시간 동안 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 그 다음 추가 K₂CO₃ (111mg, 0.80mmol)를 첨가하고 혼합물을 60℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 물 (3mL)로 처리하고 에틸아세테이트 (5m×3)로 추출하였다. 추출 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조, 및 농축 후, EA 및 헥산의 혼합물을 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 GM-90340을 46% 수율 (28mg, 0.092mmol)로 수득 하였다.

제조예 44. 2E-1-2-Aminophenyl-3-3-nitrophenyl-2-propen-1-one (BIA)

Aq. EtOH (10mL) 중의 NaOH 용액 (NaOH 36mg/H2O 0.25mL)을 얼음 욕조에서 10℃ 미만으로 유지하고 1-(2-아미노 페닐)에탄-1-온 (100mg, 0.740mmol)을 첨가했다.

반응 혼합물을 10℃에서 30분 동안 교반 하였다. 이어서 생성된 혼합물에 3-니트로벤즈알데히드 (111.8mg, 0.740mmol)를 첨가하였다. 10 ℃에서 추가 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 실온에서 추가 26시간 동안 교반하였다. EtOH를 진공에서 제거하고 잔류물을 EtOAc에 용해시켰다. 유기층을 3N HCl 및 물로 세척하였다. 상기 유기층을 염수로 세척하고 황산나트륨으로 건조하고 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (E)-1-(2-아미노페닐)-3-(3-니트로페닐)프로프-2-엔-1-온(164mg, 82%)을 얻었다.

<실시예 16> BI-1 (TMBIM6)길항제에 의한 BI-1 연관 암형성 억제.

BI-1 (TMBIM6)WT HT1080 세포, BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080, 인간 유방암 세포주인 MCF7, MDA-MB-231 및 SKBR3에 BIA를 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0μM 처리하고 세포의 증식을 확인하였다. 5μM BIA 처리에 의해 모든 세포주의 증식과 세포 생존력이 억제됨을 확인하였다(도 57 참조).

3일 동안 처리하여서 얻어진 IC50 값은 HT1080의 경우 1.7±0.1μM, MCF 세포의 경우 2.6±0.4μM, MDA-MB-231 세포의 경우 2.6±0.5μM, SKBR3 세포의 경우 2.4±0.4μM이었다. 또한, BI-1 (TMBIM6)녹아웃 세포에서는 BIA의 용량의존적인 세포생존도 저하현상이 나타나지 않음을 볼 수 있었다.

BIA가 BI-1과 mTORC2 사이의 결합을 감소시키는지 확인하기 위해, 24시간 동안 BIA로 처리한 후 BI-1 (TMBIM6) 과발현 HT1080 세포에서 겔 여과 분석을 수행했다. 도 58에 나타난 바와 같이, BIA 처리된 HT1080 세포에서 mTORC2 성분(mTOR 및 RICTOR) 및 리보솜 (RPL19)과의 동시 용출 패턴이 지연되었다. PLA 및 면역 침전 분석은 mTORC2와 리보솜 사이의 내인성 단백질 상호 작용 또는 BI-1과 mTORC2 및 리보솜의 결합이 BIA에 의해 억제되어(도 59 참조) AKT의 인산화가 완전히 감소되었음을 보여준다. 이러한 결과들은 여러 암세포에서 BIA가 mTORC2 및 리보솜으로부터 BI-1의 해리를 유도하여 세포 증식을 감소시켜 세포 사멸을 초래함을 입증한다.

해당 용량에서 BIA에 의한 항증식 효과가 비-표적 효과(off-target effect)인지 확인하기 위해 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포에서 세포 증식을 조사하였다. BI-1 (TMBIM6)녹아웃 HT1080 세포의 세포 증식 속도와 AKT 인산화는 고농도 "20 및 30μM"을 제외하고 BIA의 유무에서 동일하게 나타났다(도 57 참조). BIA는 최대 10μM까지 BI-1에 대한 표적 효과가 있음을 시사한다.

BI-1은 ER Ca2+ 방출을 통해 mTORC2 활성화를 조절하므로, 위의 결과에서 BIA가 BI-1에서 Ca2+ 방출을 억제하는지 여부를 확인하였다. BI-1-GCaMP3 녹색 형광은 BIA 처리된 세포에서 감소하는 패턴을 보였다(도 60의 A 참조). 또한, 10μM BIA를 적용하여 소포체(ER) 내강 칼슘 지표 (G-CEPIAer)를 사용하여 ER 칼슘 상태를 입증했다. 형광 강도는 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 BIA 처리에 의해 증가되었으며(도 60의 B 참조), 이는 BIA가 BI-1에서 Ca2+의 ER 방출을 억제함을 시사하는 것이다.

<실시예 17> BIA의 암세포의 이동 및 침입 저해

세포 이동(migration)과 침입(invasion)은 암 특성에 대한 대표적인 시험관 내 마커이다.

먼저 유방암 세포주에서 BI-1 (TMBIM6)발현을 조사하였다. MCF7 및 MDA-MB-231 세포는 BI-1을 높게 발현하는 반면 SKBR3 세포는 HT1080 세포에 비해 낮은 발현을 나타내었다(도 61의 A 참조). 5μM BIA를 처리하면 모든 세포주의 증식과 세포 생존력이 억제되었다(도 61의 B 참조).

BI-1을 안정적으로 과발현하는 HT1080 세포는 BIA에 대해 높은 감도를 나타냈다(도 62의 A 참조). PLA 분석은 mTORC2와 리보솜 사이의 내인성 단백질 상호 작용 또는 BI-1과 mTORC2 및 리보솜의 결합이 BIA에 의해 억제되어(도 62의 B 참조), AKT의 인산화가 완전히 감소되었음을 보여준다.

해당 용량에서 BIA에 의한 항증식 효과가 비-표적 효과인지 확인하기 위해 BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포에서 세포 증식을 조사했다. BI-1 (TMBIM6) 녹아웃 HT1080 세포의 세포 증식 속도와 AKT 인산화는 고농도 "20 및 30μM"(도 63의 B 참조)을 제외하고 BIA의 처리군과 처리하지 않은 군에서 동일했다(도 63의 A 참조). 이는 BIA가 최대 10μM까지 BI-1에 대한 표적 효과가 있음을 시사하며, BIA 처리가 세포 이동을 감소시켰다(도 64 참조).

<실시예 18> mTORC2로부터 BI-1의 해리에 기인한 BIA에 의한 AKT 활성 및 종양 진행의 억제

세포 이동(migration)과 침입(invasion)은 암 특성에 대한 대표적인 시험관 내 마커이다. BIA 처리는 HT1080, MCF7, MDA-MB-231 및 SKBR3 세포에서 세포 이동을 감소시켰다(도 65의 A 참조). MDA-MB-231 및 HT1080 세포의 세포 침입도 BIA 처리된 세포에서 감소했다(도 65의 B 참조).

또한, 3차원 배양 세포에 의해 스페로이드의 수와 크기가 형성되었으며, BIA에 의해 손상된 다층 구조를 나타내지 않았다(도 66의 A 참조). 수정 후 48시간의 배아에 DiI 염료로 표지된 인간 유방암 세포를 주변 막강에 주입하여 이식한 지브라 피쉬 종양 모델 48-51을 확립했다. 이식 후 3일째에 대조군 종양 세포는 1차 부위에서 멀리 이동한 반면, BIA 치료군의 거의 모든 종양 세포는 주사 부위에 남아 있었다(도 66의 B 참조).

BIA가 생체 내에서 종양 성장을 퇴행하는지 여부를 추가로 확인하기 위해, HT1080 및 MDA-MB-231 세포를 면역 저하 된 마우스에 피하 주사하고, 일주일에 5일 동안 1mg/kg BIA 또는 vehicle (식염수가 포함된 0.1 % DMSO)을 추가로 주사했다. 25일 동안. 이종 이식 결과는 BIA가 종양 성장을 현저하게 손상시켰음을 보여주었다(도 67 참조). 이러한 결과는 BIA에 의한 AKT 활성 및 종양 진행의 억제가 mTORC2로부터 BI-1의 해리(dissociation)에 기인함을 시사한다.

<실시예 19> BIA에 의한 암 세포 생존의 감소

PIK3CA-AKT-mTOR 신호전달 경로는 인간 암에서 자주 활성화되며 경로의 다양한 경로를 표적으로 하는 많은 소분자 화합물이 개발되었으나, mTORC1 억제를 초래하는 유방암에서 mTOR 돌연변이는 수용체 티로신 키나제의 상향 조절을 통해 AKT 활성화를 유도하여 이러한 억제제에 대한 내성을 유발한다.

BIA가 HT1080, mTOR 억제제에 내성이 있는 PANC-1 췌장암 세포 및 Capan-1 및 MIA PaCa-2 세포를 포함한 기타 췌장암 세포에 대해 효과적인지 확인하기 위해, AZD8055, INK128, Omitalisib, OSI와 같은 mTOR 억제제 항암제와 비교했다. BIA 처리군은 OSI-027 및 Voxtalisib 및 다른 mTOR 억제제와 비교하여 매우 유의성 있게 세포 생존도를 감소시켰다. 특히 BIA는 PANC-1 세포에서 살아있는 세포를 거의 제거했다(도 68 참조).

이러한 본 발명의 기재로부터 BIA가 잘 알려진 항암제에 비하여 더 우수한 효과를 보인다는 것을 알 수 있다.

PLA 분석에서 BIA는 RICTOR와 mTOR 사이 또는 RICTOR와 RPL19 사이의 연관성을 감소시켰지만 mTOR 억제제는 PANC-1 세포에서 어떤 연관성에도 영향을 미치지 않았으며(도 69 참조), 이는 BIA가 암세포를 제어하는 효과적인 항암제로서 잠재력이 있음을 시사한다.

<실시예 20> BIA 및 그 유사체들에 대한 세포 생존도 실험

실시예 15에서 제조한 화합물을 5μM, 10μM로 HT1080 섬유육종 세포주에 처리하고 세포 생존도(cell viability)를 측정하였다. 또한, DU145 전립선암 세포주에 실시예 15에서 제조한 화합물을 10μM, 20μM, 30μM로 처리하고 세포 생존도를 측정하였다(표 2, 표 3 참조).

HT1080 세포주의 BIA와 유사체에 대한 세포 생존도

	10 uM		5 uM
	AVERAGE	STDEV	AVERAGE	STDEV
Control	100.00	0.18	99.87	0.03
DMSO	101.13	0.20	101.23	0.16
BIA	7.21	0.46	19.93	0.00
GM-90128	57.83	3.45	101.56	0.37
GM-90129	24.34	1.23	97.92	0.71
GM-90130	31.69	2.12	99.48	0.49
GM-90131	37.42	1.34	100.89	0.17
GM-90132	30.94	1.08	100.10	0.07
GM-90133	54.86	1.55	100.86	0.08
GM-90134	96.62	0.05	99.10	0.09
GM-90135	96.82	2.21	99.92	0.01
GM-90222	92.00	4.44	108.75	1.78
GM-90223	85.95	6.00	93.80	7.67
GM-90224	99.67	6.44	108.14	8.78
GM-90225	43.46	7.13	70.46	8.40
GM-90226	15.38	1.85	83.91	2.53
GM-90227	96.30	4.84	108.46	0.57
GM-90228	22.77	2.10	30.45	0.91
GM-90229	15.73	0.47	64.43	0.16
GM-90230	98.80	1.77	108.35	1.87
GM-90243	39.20	1.34	66.84	3.04
GM-90254	8.59	0.11	14.69	0.33
GM-90255	33.43	3.29	88.06	0.94
GM-90256	46.30	6.71	82.40	0.71
GM-90281	11.13	0.10	11.36	0.04
GM-90282	7.14	0.10	12.23	0.08
GM-90283	11.94	0.25	18.08	0.12
GM-90284	18.81	0.23	86.44	0.85
GM-90285	8.35	0.12	71.54	1.44
GM-90295	82.42	1.19	103.39	0.64
GM-90296	91.62	1.38	107.05	1.86
GM-90297	18.20	1.72	93.28	1.82
GM-90298	18.96	1.87	21.18	2.06
GM-90299	20.10	1.33	93.15	3.17
GM-90300	23.40	1.65	99.48	5.22
GM-90315	11.19	0.38	41.10	5.94
GM-90316	67.82	7.15	100.61	9.08
GM-90317	14.40	2.81	46.75	9.53
GM-90318	11.83	1.40	21.37	1.55
GM-90319	9.94	1.26	46.62	0.78
GM-90320	62.73	7.03	94.54	6.05
GM-90321	21.25	2.94	61.16	0.46
GM-90337	21.42	2.15	83.67	2.12
GM-90338	10.49	1.66	44.67	1.75
GM-90339	97.30	0.98	99.61	4.18
GM-90340	80.21	1.57	88.71	0.06

DU145 세포주의 BIA와 유사체에 대한 세포 생존도

	10 uM		20 uM		50 uM
	AVERAGE	STDEV	AVERAGE	STDEV	AVERAGE	STDEV
Control	100.00	0.18	100.00	0.06	100.00	0.40
DMSO	99.96	0.11	99.66	0.14	99.47	0.33
GM-90128	80.96	0.69	72.24	1.45	62.19	1.39
GM-90129	91.39	0.43	90.18	0.03	61.39	2.05
GM-90130	78.72	2.36	79.36	0.40	48.29	3.23
GM-90131	81.53	1.57	74.04	10.12	33.21	2.96
GM-90132	81.45	1.75	71.19	2.20	19.89	3.63
GM-90133	50.54	9.99	35.23	1.81	26.75	2.38
GM-90134	31.47	1.35	25.37	2.20	22.80	0.07
GM-90135	88.51	0.36	87.33	1.60	64.55	0.16
GM-90222	40.68	0.48	31.27	0.11	28.95	0.35
GM-90223	26.48	1.38	26.34	0.63	21.14	1.49
GM-90224	90.46	0.58	90.00	0.43	75.80	1.44
GM-90225	87.41	0.23	79.44	3.49	71.18	4.27
GM-90226	68.10	0.04	46.76	4.22	11.84	0.57
GM-90227	43.32	2.55	36.08	1.25	28.20	5.05
GM-90228	54.08	3.26	37.77	1.74	15.05	0.38
GM-90229	53.11	1.63	40.51	9.87	21.14	2.75
GM-90230	66.34	12.08	29.14	0.86	29.30	1.20
GM-90243	31.80	1.63	28.19	0.20	14.29	0.40
GM-90254	61.08	2.34	31.52	0.51	8.51	0.16
GM-90255	88.67	0.39	70.18	1.43	66.43	2.46
GM-90256	76.31	0.95	60.23	2.12	54.94	1.85
GM-90281	77.43	1.18	76.39	4.28	67.05	0.79
GM-90282	72.93	0.64	53.36	6.88	9.57	0.17
GM-90283	59.94	1.89	33.06	0.84	22.86	1.98
GM-90284	88.41	2.57	81.00	0.80	79.05	0.23
GM-90285	83.47	0.79	82.84	1.08	78.76	1.05
GM-90295	91.72	0.75	86.74	0.26	84.68	0.65
GM-90296	91.04	0.58	82.30	0.74	76.94	0.24
GM-90297	85.70	2.37	87.18	2.51	83.04	2.50
GM-90298	68.94	0.95	62.31	2.97	48.73	0.46
GM-90299	82.16	0.43	59.03	0.41	17.21	0.30
GM-90300	62.60	0.43	58.51	1.47	54.46	4.43
GM-90315	98.04	0.01	97.94	0.03	88.88	0.03
GM-90316	87.40	1.77	60.00	3.28	38.38	0.39
GM-90317	32.39	0.70	28.11	0.73	11.94	0.16
GM-90318	44.64	1.44	43.09	1.11	13.39	0.17
GM-90319	109.67	3.09	88.14	0.25	85.75	0.63
GM-90320	89.08	0.98	89.08	0.89	82.37	2.14
GM-90321	83.59	1.06	81.80	1.11	84.79	0.88
GM-90337	61.70	0.32	39.06	1.14	41.40	0.78
GM-90338	42.78	3.38	31.89	3.23	11.13	0.12
GM-90339	95.29	1.84	87.82	0.87	74.80	0.43
GM-90340	92.89	0.66	89.29	0.66	76.07	2.20

도 70은 실시예 15에서 제조한 화합물 10uM을 섬유육종 세포(fibrosarcoma cell)과 전립선암 세포(prostate cancer cell) 암세포주에 처리하고 세포 생존도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

<실시예 21> BIA 및 그의 유사체들에 의한 AKT 인산화 억제

BIA를 1 또는 2μM 농도로 처리하였을 때 HT1080 세포에서 AKT serine 인산화 S473을 억제하는 것을 확인하였으며, MDA-MB-231세포와 SKBR3세포에도 동일하게 AKT의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다(도 71 참조).

BIA 유사체 10μM을 HT1080 세포와 MCF 세포, MDA-MB-231세포, SKBR3세포를 포함한 유방암세포를 배양하여 처리하였다.

GM-90128을 비롯한 하기 빨간색으로 명기한 화합물에서는 10μM 농도로 처리시에 AKT serine 인산화를 억제하였다. 타화합물에서는 AKT의 완전 저해를 위하여 10μM보다 고농도처리가 요구되나 전체적인 억제 경향을 보였다(도 71 참조).

<실시예 22> BIA 및 그 유사체들에 의한 암세포의 이동 및 침입 억제

BIA 및 그의 유사체들 HT1080 섬유육종 세포에 처리한 후에 암세포의 특징인 세포 이동을 측정하였다. BIA는 암세포의 이동을 강력하게 억제하였으며 다른 화합물도 유의미한 억제현상을 보였다(도 72 참조).

BIA 및 그의 유사체들 HT1080 fibrosarcoma 세포에 처리한 후에 암세포의 특징인 세포 침입(invasion)을 측정하였다. BIA는 측정한 화합물중에서도 매우 뚜렷한 세포 침입 억제 현상을 보였으며 다른 화합물도 유의미한 억제 현상을 보였다(도 73 참조).

<실시예 23> BIA에 의한 소포체에서의 Ca2+의 유리 억제

BIA의 가장 기초적인 특성은 "BI-1 (TMBIM6)단백질의 소포체(ER)에서의 칼슘 유리(leak)를 막는다"는 것이다. 이를 통하여 mTORC2와 리보솜이 모집(recruit)된다는 것이 핵심 기전이다. 이를 확인하기 위하여 먼저 BTMBIM6-GCaMP3 플라스미드를 만들어서 HT1080세포에 형질감염(transfection) 시켜 안정한(stable) 세포를 만들었다. 이 형질감염 세포는 BI-1을 통하여 나오는 칼슘만을 검출하는데 사용할 수 있다.

BIA 10μM을 형질 감염된 세포에 처리하고, 시간에 따른 GCaMP3의 형광 강도를 관찰하였으며, 시간이 경과함에 따라 형광 강도가 떨어지는 것을 확인하였다(도 74의 A 참조).

한편, BIA를 처리 시에는 ER에서 나인는 칼슘을 억제하기 때문에 ER 내부의 칼슘이 증가한다. 이를 ER 내부의 칼슘농도를 측정하는 G-CEPIAer을 발현시켜 CEPIAer 플라스미드를 사용하여 HT1080세포에 형질감염 시켜 안정한 세포를 만들었다. 이 형질감염 세포는 BI-1(TMBIM6)의 칼슘채널-like한 성질을 바탕 (참조문헌: 으로 한 BI-1(TMBIM6)를 통한 ER로 부터의 유리되는 칼슘만을 검출하는 데 사용할 수 있다. 형광도 증가를 확인함으로써 BIA의 특이성(specificity)를 확인할 수 있었다(도 74의 B 참조).

BIA는 정확하게 BI-1의 기초 특성, 소포체로부터의 칼슘 유리를 억제하는 것이 증명되었다.

TMBIM6-GCaMP3의 형광이 발현되는 control (DMSO 처리조건) 조건의 세포와 비교하여 BIA를 비롯한 유사체를 처리하였을 때 그 형광의 변화를 확인함으로써 BI-1을 통하여 나오는 칼슘 이미지를 확인하였다(도 75 참조).

대부분이 어느 정도 칼슘 유리를 억제하였다. 특히 다음 화합물은 더욱 강력한 억제 효과를 나타내었다.

- (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90254),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90295),

- (E)-1-(2-amino-5-fluorophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90298),

- tert-butyl (E)-(3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)carbamate (GM-90299),

- (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoic acid (GM-90296),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90318),

- (Z)-3-((E)-3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)-N'-hydroxybenzimid amide (GM-90338)

<실시예 24> BI-1의 녹아웃에 의한 천식 모델에서의 염증세포 증가 억제

하기 요약 그림과 같이 BI-1 (TMBIM6)WT WT(+/+) 마우스와 녹아웃 KO 마우스 (-/-)에 OVA와 LPS를 처리하여 천식을 유발시켰다.

22일 (OVA로 마지막 기도 챌린지 3시간 후)에 1mg/kg의 IC87114 (PI3K억제제), 0.01mg/kg 또는 0.1mg/kg의 BIA 또는 0.9% NaCl에 희석된 비히클 (0.05% 디메틸설폭사이드)을 30μl의 부피로 기관 내 비수술적 방법으로 투여했다. WT 마우스의 천식 유발 군에서 기관지 폐포 세척액 (BAL)의 염증세포가 매우 증가하였으며 BI-1 (TMBIM6)녹아웃 마우스에서는 억제되었다(도 76의 A 참조).

BAL 세포수와 림프구(lymphocytes) 및 호중구(neutrophil)의 수 역시 WT 마우스의 천식 유발군에서 증가하였으며, BI-1 (TMBIM6)녹아웃 마우스에서는 억제되었다(도 76의 B 참조).

Methacholine test로 기도 과민반응을 측정한 결과, WT 천식 유발 마우스 (+/+군)에서 민감도가 증가하였다(도 77의 A 참조).

전체 BALF에서 인터루킨 (IL)-4 및 IL-13의 농도를 제조업체의 지침 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 따라 개별 효소 결합 면역 흡착 분석 키트를 통해 측정하였다. IL-4 및 IL-13 사이토카인은 WT 천식 유발 마우스에서 많이 증가하였으며 녹아웃 천식 유발 마우스에서는 증가가 억제되었다(도 77의 B 참조).

IL-17 mRNA의 발현 수준에 있어서도 차이가 있었으며 녹아웃 천식 유발 마우스에서 억제되어 있다는 것을 보여주었다(도 78의 A 참조).

헤마톡실린-에오신염색을 수행하여 관찰한 결과, 기도가 넉아웃 조건에서 정상으로 회복되었음을 보여주었다(도 78의 B 참조). PAS 염색을 하여 관찰한 결과, WT 조건에서 천식 유발 시에 폐의 섬유화가 일어난 것이 관찰되었으며, KO조건에서는 섬유화가 억제되었다(도 78의 C 참조).

<실시예 25> BIA에 의한 AKT의 활성화로 인한 염증 억제

7-8 주령의 암컷 C57BL / 6 마우스는 한국 성남 오리엔트 바이오 (Orient Bio Inc.)에서 구입하여 마우스는 12시간의 명암주기로 22±1℃에 수용되었고 공기 여과와 함께 표준 조건 (특정 병원체 없음) 하에서 규칙적인 사료와 물을 자유롭게 급식하였다. A. fumigatus- 유도된 알레르기성 폐염증 모델을 확립하기 위해, 마우스에 진균 물질이 비활성화되고 동결건조된 A. fumigatus 조 항원 추출물 (Greer Laboratories, Cat # XPM3D3A4, Lenoir, NC, USA) 10μg을 처리했다. 0.2ml의 불완전한 Freund 's adjuvant (Sigma-Aldrich, Cat # F5506-6X)를 일반 식염수에 용해하여 혼합하였으며 이 제제의 절반은 복막강에 침착되었고 나머지는 피하로 전달되었다. 2 주 후, 마우스에 비강 내 경로를 통해 정상 식염수에 용해된 20μg의 A. fumigatus 항원을, 비강 내 공격 후 4 일 후에, 기관 내 경로를 통해 정상 식염수에 용해된 20μg의 A. fumigatus 항원을 처리하였다. 대조군 마우스는 동일한 시점에 동일한 경로를 통해 생리 식염수만을 투여하고 동일한 수의 분생포자를 처리하였다. 기관지 폐포 세척 (BAL)은 A. fumigatus로 마지막 챌린지 48 시간 후 수행하였다

BIA의 0.1mg/kg, 및 0.01mg/kg, 1mg/kg IC87114 (PI3K억제제)를 기관 내(intratracheal)로 주입하였다. 대조군 조건에서도 BIA 0.01mg/kg을 처리하였다. 천식유발 군에서 전체 BAL의 염증세포가 BIA, 1mg/kg IC87114 처리군에서 모두 억제되었다(도 79의 A, B 참조).

헤마톡실린-에오신염색을 수행하여 관찰한 결과, 기도가 약물처리군에서 정상으로 회복되었음을 보여주었다 (도 80의 A 참조). PAS염색을 시행하여 관찰한 결과, 섬유화 등이 약물처리군에서 약화되어짐을 확인하였다(도 80의 B 참조).

이러한 결과는 AKT (PI3K 하위단계 인산화효소)를 활성화하여 염증이 심해진 조건에서 mTORC2-AKT 활성화로 증명되어진 BI-1의 활성을 억제하는 BIA를 처리하여 억제한 것과 PI3K 억제제 IC87114를 처리한 것과 동일하다는 것을 보여주는 것이다. 이는 앞서서 언급한 BIA의 동일 기전을 보여주는 결과이다.

아스파라질러스에 감염된 천식 마우스 모델에 IC87114 (PI3K억제제) 1mg/kg, 덱사메타손 (1mg/kg body weight/day, Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA), BIA 0.1mg/kg 또는 하기 화합물의 BIA 유사체를 처리한 후에 BAL fluid의 전체 세포수를 개수하여 정량화하였다(도 81 참조).

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one (GM-90130),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90132),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90133),

- (E)-1-(2-methoxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90134),

- (E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90135),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(2,4-difluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90223),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(naphthalen-2-yl)prop-2-en-1-one (GM-90225),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(pyridin-4-yl)prop-2-en-1-one (GM-90228),

- (E)-1-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-(3-bromophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90255),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-bromo-5-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90281),

- (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzonitrile (GM-90282),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (GM-90295),

- (E)-3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzoic acid (GM-90296),

- (E)-1-(2-amino-5-fluorophenyl)-3-(3-nitrophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90298),

- tert-butyl (E)-(3-(3-(2-aminophenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)carbamate (GM-90299),

- (E)-1-(2-aminophenyl)-3-(3-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (GM-90318),

- (E)-3-(3-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzonitrile (GM-90319)

아스파라질러스에 감염된 마우스에 비히클을 처리한 경우와 비교하여, 상기 약물들을 처리하였을 때 모두 BALF의 세포수 증가가 억제되었다.

PI3K는 AKT의 상위인자로써 PI3K 억제제는 AKT를 억제하게 되므로, 이는 BI-1의 신호전달 결과인 AKT 활성화를 억제한다는 것과 동일한 의미를 시사한다. BIA는 AKT 활성화를 억제하여 천식의 악화를 막을 수 있었다.

<실시예 26> BIA 및 그 유사체에 의한 항 SARS-CoV2 바이러스 효과

원숭이 신장 세포 주인 Vero E6 세포를 96 well plate에 well 당 1×10⁴ cells/well로 분주 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. Vero E6 세포를 감염시킬 SARS-CoV2로는 국가병원체 자원은행에서 분양된 SARS-CoV 43326을 사용하였으며, 0.1 MOI가 감염되도록 DMEM(2% FBS, 1% antibiotic-antimycotic) 배지를 이용하여 100μL/well 씩 분주하였다. 1시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 감염 후 바이러스를 제거하였다.

다음, BIA 또는 유사체 화합물이 마지막에 500nM이 되도록 조제한 시료를 배양액을 포함하여 100μL/well 씩 분주 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 처리하였다. 동일한 방법으로 2μM, 5μM 또는 10μM의 렘데시비르 (Rem)를 처리한 군을 양성 대조군으로 하였다.

세포의 상태를 확인하고, 0.5mg/ml MTT 용액을 100μL/well 씩 가하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 반응 후, 메디아를 wash-out(제거)한후에 세포에 DMSO를 100μL/well씩 가하여 충분히 용해 후 plate reader기로 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존도를 상대평가하였다.

BIA 및 그의 유사체 화합물들의 바이러스 예방 및 치료 효과의 가능성을 확인해 보기 위하여, 바이러스 감염과 동시에 BIA 아날로그를 500nM 처리한 다음 24시간 이후 바이러스 감염에 대한 세포의 생존력 향상 여부를 MTT assay를 통해 확인한 결과를 도 82의 그래프로 나타내었다.

도 82의 그래프로부터 정상군(SARS-CoV2 바이러스를 처리하지 않은 군; Con, DMSO)과 대조군을 비교한 결과, 대조군인 SARS-CoV2 바이러스 감염군(DMSO-S, DMSO-S)의 세포생존율 수치가 감소하는 것을 알 수 있다.

양성대조군인 렘데시비르(remdesivir) 처리군에서는 대조군인 SARS-CoV2 바이러스 감염군(DMSO-S, DMSO-S)과 비교하였을 때, 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

대조군 (DMSO-S) (세포생존율 66.52±2.28%)과 비교해 보았을 때, 약물처리 후 24시간에서 GM90129 (77.68±3.6 %), GM90228 (74.31±3.43 %) 또는 BIA처리군 (77.94±5.51%)에서 세포생존율 수치가 증가하였다. 데이터는 평균±SD로 나타냈다. 그룹 간의 비교는 Dunnett's test with post-test를 사용하였다(*, SARS-CoV2-DMSO 처리군 (DMSO-S)과 비교하여 P < 0.05, ^#, 대조군 DMSO 군 (DMSO)과 비교하여 P < 0.05).

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 포함하는 BI-1 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
[화학식 1]

여기서
상기 A는 하기의 화학식 1-3이고,

(상기 화학식 1-3의 *는 화학식 1의 페닐기에 연결된다)
상기 B 및 C는 각각 C, 또는 N이며,
상기 R₁ 내지 R₁₀은 각각 H; NH₂; NO2; OH; OR (R은 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); 할로겐 원자; CN; C₁ 내지 C₃의 할로겐화알킬; C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 기; -NH-C(O)-ORa (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -C(O)-NH-Ra (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -NH₂HCl; -C(O)OH; 및 옥심기를 갖는 치환기;로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
상기 B 또는 C가 N인 경우 R₈ 및 R₉는 수소이며,
상기 B 또는 C가 C인 경우 R₈ 및 R₉는 서로 연결되어 페닐환을 형성할 수 있고,
상기 옥심기를 갖는 치환기는 하기 화학식 1-4로 나타낸다.

(상기 화학식 1-4의 *는 상기 화학식 1의 치환기 R₁ 내지 R₁₀이 치환되는 곳이다)
하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 포함하는 mTORC2 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
[화학식 1]

여기서
상기 A는 하기의 화학식 1-3이고,

(상기 화학식 1-3의 *는 화학식 1의 페닐기에 연결된다)
상기 B 및 C는 각각 C, 또는 N이며,
상기 R₁ 내지 R₁₀은 각각 H; NH₂; NO2; OH; OR (R은 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); 할로겐 원자; CN; C₁ 내지 C₃의 할로겐화알킬; C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 기; -NH-C(O)-ORa (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -C(O)-NH-Ra (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -NH₂HCl; -C(O)OH; 및 옥심기를 갖는 치환기;로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
상기 B 또는 C가 N인 경우 R₈ 및 R₉는 수소이며,
상기 B 또는 C가 C인 경우 R₈ 및 R₉는 서로 연결되어 페닐환을 형성할 수 있고,
상기 옥심기를 갖는 치환기는 하기 화학식 1-4로 나타낸다.

(상기 화학식 1-4의 *는 상기 화학식 1의 치환기 R₁ 내지 R₁₀이 치환되는 곳이다)
하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물을 포함하는 AKT 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
[화학식 1]

여기서
상기 A는 하기의 화학식 1-3이고,

(상기 화학식 1-3의 *는 화학식 1의 페닐기에 연결된다)
상기 B 및 C는 각각 C, 또는 N이며,
상기 R₁ 내지 R₁₀은 각각 H; NH₂; NO2; OH; OR (R은 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); 할로겐 원자; CN; C₁ 내지 C₃의 할로겐화알킬; C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 기; -NH-C(O)-ORa (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -C(O)-NH-Ra (Ra는 C₁ 내지 C₁₀의 선형, 분지형의 알킬, 알켄닐, 또는 알키닐 임); -NH₂HCl; -C(O)OH; 및 옥심기를 갖는 치환기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
상기 B 또는 C가 N인 경우 R₈ 및 R₉는 수소이며,
상기 B 또는 C가 C인 경우 R₈ 및 R₉는 서로 연결되어 페닐환을 형성할 수 있고,
상기 옥심기를 갖는 치환기는 하기 화학식 1-4로 나타낸다.

(상기 화학식 1-4의 *는 상기 화학식 1의 치환기 R₁ 내지 R₁₀이 치환되는 곳이다)
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 B 및 C가 각각 C이고, A가 화학식 1-3 인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화합물이 2-(5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)isoxazol-3-yl)aniline (GM-90340) 또는 3-(3-(2-aminophenyl)isoxazol-5-yl)benzonitrile (GM-90337)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물이 라세미체, 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 BI-1 관련 질환은 간 허혈 재관류 손상, 만성 간염, 사염화탄소-유도 간 손상과 같은 간 질환, 종양형성, 암, 천식 및 COPD질환을 동반하는 호흡기질환, 바이러스질환, 자가면역질환, 신경질환, 인슐린 저항성으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 암이, 폐암, 폐선암, 췌장암, 대장암, 결장직장암, 골수성 백혈병, 갑상선암, 골수형 성이상증후군(MDS), 방광 암종, 표피 암종, 흑색종, 유방암, 전립선암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 위암, 후두암, 식도암, 방광암, 구강암, 비인두암, 간엽 기원의 암, 섬유육종, 기형암종, 신경모세포종, 신장 암종, 간암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 및 갑상선 미분화암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 mTORC2 관련 질환은 제2형 당뇨병과 같은 대사 질환, 암 종양, 폐섬유증(lung fibrosis), 천식, 바이러스감염증, COPD등을 포함하는 호흡기질환, 전신 홍반성 루프스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 AKT 관련 질환은 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환, 천식, 바이러스 감염증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 천식은 일반 알러지성 천식 또는 스테로이드저항성 천식인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 바이러스 감염증은 COVID19, COVID 19 변이체, 또는 메르스바이러스 감염증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
BI-1의 길항작용에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 BI-1의 길항작용은 mTOR의 활성을 저해하거나; 또는 AKT 또는 S6K의 인산화를 감소시키는 것인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물
제1항에 기재된 화학식 1의 화합물, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 포함하는 BI 관련 질환, mTORC2, 또는 AKT 관련 질환을 예방, 개선 또는 증상을 완화시키기 위한 건강기능식품 조성물.
제15항에 있어서, 관련 질환이 암, 천식, 및 코로나바이러스감염증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제1항에 기재된 화학식 1의 화합물, 이의 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 사용하여 시험관 내에서 BI-1, mTORC2, 또는 AKT를 억제하는 방법.