KR20240035821A - 단일 사슬 가변 단편(scFv) 변형 지질 나노입자 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

단일 사슬 가변 단편(scFv) 변형 지질 나노입자 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 결합할 수 있어, 유리하게는 해당 수용체를 발현하는 세포 또는 조직만을 표적으로 하는 LNP 조성물을 제공할 수 있다.

Description

단일 사슬 가변 단편(scFv) 변형 지질 나노입자 조성물 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2021년 7월 13일자 출원된 미국 임시출원 제63/221,290호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
이온화 가능한 지질 나노입자(LNP)는 RNA 치료제의 전신 전달에 널리 사용되어 왔다. C12-200, cKK-E12 및 DLin-MC3-DMA와 같은 LNP 제형에 대한 다양한 유형의 이온화 가능한 지질 물질이 이전에 보고되었으며, 1 kg당 0.002 mg siRNA의 투여 수준으로 간에서 효율적인 유전자 침묵을 나타내는 것으로 입증되었다(문헌[Dong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 3955―3960 (2014)]). 표적화 리간드를 포함시키면 mRNA―LNP의 전달과 치료 효율이 증강되는 것으로 나타났지만, 표적화 모이어티를 부착시키는 것은 LNP 시스템의 제조 공정에 복잡성, 비용 및 규제 문제를 부가할 수 있는 것으로 인식되었다(문헌[Cheng et al., Science. 2012 Nov 16; 338(6109):903-10]). 또한, 지질 나노입자가 생물학적 유체에 노출되는 경우에는, 배지 내 단백질과 상호작용하여 결과적으로 단백질 코로나가 형성됨에 따라 일부 표적화 리간드의 표적화 특이성이 사라질 수 있다고 입증되었다(문헌[Salvati et al., Nat Nanotechnol. 2013 Feb; 8(2):137-43]). 따라서, 목적하는 RNA―LNP 제조의 가능한 임상적 이점과 복잡성 및 비용 사이에는 상충되는 점이 있다.
항체는 병든 세포의 표면에서만 발현되거나, 건강한 세포에 비해 병든 세포에서 과도하게 과발현되는 특정 항원을 표적화하는 방식으로 기능한다. 이러한 항원은 표적 병든 세포의 표면에만 존재하거나 표면에 풍부하게 존재하기 때문에, 항체는 개념적으로 신체를 통해 나노입자와 이의 카고(예를 들어, 치료제)를 운반하고 선택적 전달/표적화를 가능하게 하는 데 활용될 수 있다. 이러한 접근법은 1980년대에 처음 연구되었지만, 항체가 부착된 나노입자를 생성하고 평가하는 방법이 불충분한 것 등의 상당한 한계가 있어, 해당 분야에서 유의한 진전이 이루어지지 못했다. 지난 수십 년에 걸친 항체 발현 기술과 나노입자 설계의 발전으로 인해 나노입자―항체 접합체에 대한 보다 철저한 연구가 가능해졌으며, 그 결과 해당 분야가 신속하게 확장되었다. 초기 개발은 주로 생성 및 변형에 대한 이용 가능한 풍부한 정보로 인해, 표적화 리간드로서 전장 항체를 사용하는 데 거의 전적으로 초점이 맞추어졌다. 하지만, 면역원성, 신속한 제거, 불량한 안정성 및 예상보다 낮은 효능과 같은 전장 항체 리간드를 사용하는 것과 관련된 몇 가지 문제가 나타났다.
구조적 및 기능적 측면에서의 항체의 모듈식 특성은, 분자 클로닝, 항체 조작 및 심지어 효소 방법을 통해 항원 결합 단편(Fab), 단일 사슬 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체 및 결정화 가능한 단편(Fc) 도메인과 같은 더 작은 항원 결합 단편의 생성을 가능하게 한다. 항체의 항원 결합 단편은 고형 종양으로의 침투 불량과 면역계의 Fc 매개 방관자 활성화와 같은 종래 mAb의 단점을 극복할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있다. 항체 단편은 이중특이적, 다중특이적, 다량체성 또는 다관능성 분자에 대한 수많은 가능성을 생성하고, 다양한 생물학적 효과를 달성하기 위해 그 자체로 또는 다른 분자와 연결되어 사용될 수 있다. 항체 단편은 종래 항체 사용에 비해 몇 가지 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이는 일반적으로 미생물 발현 시스템을 사용하여 용이하게 생산될 수 있기 때문에, 더 빠른 배양, 더 높은 수율 및 더 낮은 생산 비용을 가능하게 한다(문헌[Fernandes JC, Drug Discov Today. 2018 Dec; 23(12):1996-2002]). 이의 작은 크기는 도전적인 잠재적 에피토프에 대한 접근과 종양 침투를 가능하게 하며, Fc의 결여는 면역계의 방관자 활성화를 제한한다(문헌[Kholodenko et al. Curr Med Chem. 2019; 26(3):396-426]). 한편, 이의 작은 크기는 더 빠른 신장 배설을 유도하기 때문에, 생체내에서 더 높은 용량 및/또는 더 빈번한 투여 요법이 필요할 수 있다.
LNP가 생체내 전달에 유리한 것으로 확인되었지만, 간의 간세포 이외의 RNA 치료제의 전신 전달은 여전히 고도로 어려운 과제로 남아있다. 이러한 LNP의 상대적으로 큰 크기는 다음과 같은 몇 가지 메커니즘에 의해 간 적응증에 대한 치료 지수를 감소시킨다: (1) 더 큰 LNP는 간 시누소이드(sinusoid)를 정렬하는 내피 세포의 창을 효율적으로 우회할 수 없어, 표적 세포(간세포)에 대한 접근을 방해할 수 있음; (2) 더 큰 LNP는 몇 가지 상이한 수용체(예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR), 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체)와 함께 클라트린 매개 세포내이입을 통해 간세포에 의해 효율적으로 내재화될 수 없음; 및 (3) 특정 크기 임계값을 초과하는 LNP는 용량 제한 면역반응을 유발할 수 있는 망상내피계 세포에 의해 우선적으로 흡수되는 경향이 있음. 이러한 이점에도 불구하고, 더 크고 강성인(rigid) 폴리뉴클레오타이드 카고(예를 들어, 이중가닥 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 폐쇄형 이중가닥 DNA(ceDNA))의 LNP 매개 전달은 더 작고/작거나 가요성인(flexible) 카고(예를 들어, siRNA)에 비해 추가적인 문제를 나타낸다. 이러한 문제 중 하나는 크고 강성인 카고가 캡슐화될 때 생성되는 LNP의 크기와 관련이 있다.
LNP 표적화 핵산 치료제의 잠재력을 완전히 실현시키기 위해서는, 효율적인 생체내 전달 시스템이 필요하다.
본 개시내용은 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포(예를 들어, 종양 세포)의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 LNP 조성물은 유리하게는 입자 크기와 안정성에 최소한의 영향을 미치면서 효율적인 공유결합 접합을 제공한다. 본 개시내용의 발견은, LNP에 대한 scFv의 말레이미드 접합이 다른 티올 기반 가교 방법과 함께 LNP에 대해 강력한 접합을 제공하며, 중요하게는, LNP 크기와 온전성이 유지된다는 점이다.
첫 번째 양태에 따르면, 본 개시내용은 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, scFv는 LNP에 공유결합으로 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, scFv는 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 일부 실시형태에서, scFv는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단 가능하지 않은 링커는 말레이미드 함유 링커이다. 일부 실시형태에서, scFv는 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 피리딜디설파이드(PDS) 함유 링커이다. 일부 실시형태에서, scFv는 트랜스글루타미나아제 매개 접합을 통해 LNP에 연결되어 있다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 항원은 종양 관련 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)이다. 추가의 실시형태에서, 항원은 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2)이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv는 2가이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, LNP는 세포에 내재화될 수 있다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, 비(non)양이온성 지질, 및 적어도 하나의 PEG화 지질로 이루어지는 군에서 선택되는 지질을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, TNA는 LNP에 캡슐화되어 있다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, TNA는 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형(ceDNA), 미니스트링(ministring), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비(non)바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, TNA는 ceDNA이다. 일부 실시형태에서, ceDNA는 선형 이중체 DNA이다. 일부 실시형태에서, TNA는 mRNA이다. 일부 실시형태에서, TNA는 siRNA이다. 일부 실시형태에서, TNA는 플라스미드이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물이 대상에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상은 TNA가 캡슐화된 LNP를 이용한 치료를 필요로 하는 인간 환자이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 scFv가 지시되는 세포 표면 항원을 발현하는 세포를 표적으로 한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 종양 세포를 표적으로 한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 간 세포를 표적으로 한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 간의 간세포를 표적으로 한다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (I)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는, 각각 독립적으로, -CRa, -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고;
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 C1-3 알킬이거나;
또는 대안적으로, R4가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R4'가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, 수소, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6과 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m과 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (II)]
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R2는 (C2-C20)알킬임].
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 지질은 화학식 (V) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (V)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
Ra와 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 (XV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XV)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
X1과 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 (XX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XX)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 표 2, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 8의 임의의 지질에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 지질이다:
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 스테롤 또는 이의 유도체는 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민(DSPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질은 PEG-디라우릴옥시프로필; PEG-디미리스틸옥시프로필; PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필; 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG); PEG-디라우릴글리세롤; PEG-디팔미토일글리세롤; PEG-디스테릴글리세롤; PEG-디라우릴글리카미드; PEG-디미리스틸글리카미드; PEG-디팔미토일글리카미드; PEG-디스테릴글리카미드; 1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜)(PEG-콜레스테롤); 3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜) 에테르(PEG-DMB); 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-히드록실(DSPE-PEG-OH)로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질은 DMG-PEG, DSPE-PEG, DSPE-PEG-OH, 또는 이들의 조합이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEG화 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-OH, DMG-PEG5000, DSPE-PEG5000, DSPE-PEG5000-OH, 또는 이들의 조합이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv는 LNP의 PEG화 지질에 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되어 PEG화 지질 접합체를 형성한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질은 DSPE-PEG이다. 일부 실시형태에서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질은 DSPE-PEG2000이다. 일부 실시형태에서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질은 DSPE-PEG5000이다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 약 30% 내지 약 80%의 몰 백분율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 약 2% 내지 약 20%의 몰 백분율로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEG화 지질은 약 2.1% 내지 약 10%의 몰 백분율로 존재한다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, scFv는 약 0.02 μg/μg의 TNA 내지 약 0.1 μg/μg의 TNA의 총량으로 존재한다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 덱사메타손 팔미테이트(dexamethasone palmitate)를 추가로 포함한다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, LNP의 총 지질 대 TNA 비는 약 10:1 내지 약 40:1이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, LNP의 직경은 약 40 nm 내지 약 120 nm 범위이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 약 100 nm 미만이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 나노입자의 직경은 약 60 nm 내지 약 80 nm이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트에는 2개의 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 ITR은 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위 바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 또는 파르보바이러스 유래의 야생형 ITR이다. 일부 실시형태에서, 상기 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어지는 군에서 선택된다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV ITR이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나는 변형된 또는 돌연변이 ITR이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 5' ITR과 3' ITR은 대칭이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 5' ITR과 3' ITR은 비대칭이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 스페이서 서열의 길이는 적어도 5개 염기쌍이다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는다.
상기 양태 및 실시형태 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, ceDNA는 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원의 양태 및 실시형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상의 종양으로 치료용 핵산(TNA)을 전달하거나 대상의 종양에 TNA의 농도를 증가시키는 방법으로서, 본원의 양태 및 실시형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상의 간으로 치료용 핵산(TNA)을 전달하거나 대상의 간에 TNA의 농도를 증가시키는 방법으로서, 본원의 양태 및 실시형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에 따르면, LNP는 세포에 내재화된다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, LNP는 양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, 비양이온성 지질 또는 PEG화 지질을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, TNA는 지질에 캡슐화되어 있다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, TNA는 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형(ceDNA), 미니스트링, doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, TNA는 ceDNA이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 선형 이중체 DNA이다. 일부 실시형태에 따르면, TNA는 mRNA이다. 일부 실시형태에 따르면, TNA는 siRNA이다. 일부 실시형태에 따르면, TNA는 플라스미드이다.
일부 실시형태에 따르면, LNP는 PEG화 지질을 포함하며, 여기서 PEG화 지질은 scFv(scFv 폴리펩타이드)를 인코딩하는 아미노산 서열에 연결되어 있다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 약제학적 조성물이 대상에게 투여된다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 대상은 TNA가 캡슐화된 LNP를 이용한 치료를 필요로 하는 인간 환자이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 LNP 내 scFv의 항원 표적에의 결합을 통해 표적 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적으로 한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 종양 세포를 표적으로 한다. 일부 실시형태에 따르면, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시형태에 따르면, 종양은 혈액학적 종양이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 간 세포를 표적으로 한다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (I)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는, 각각 독립적으로, -CRa, -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고;
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 C1-3 알킬이거나;
또는 대안적으로, R4가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R4'가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, 수소, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6과 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m과 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (II)]
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R2는 (C2-C20)알킬임].
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 지질은 화학식 (V) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (V)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
Ra와 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 (XV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XV)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
X1과 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 (XX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XX)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 표 2, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 8의 임의의 지질에서 선택된다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 지질이다:
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 스테롤 또는 이의 유도체는 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이다. 일부 실시형태에 따르면, 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민(DSPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, PEG화 지질은 PEG-디라우릴옥시프로필; PEG-디미리스틸옥시프로필; PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필; 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG); PEG-디라우릴글리세롤; PEG-디팔미토일글리세롤; PEG-디스테릴글리세롤; PEG-디라우릴글리카미드; PEG-디미리스틸글리카미드; PEG-디팔미토일글리카미드; PEG-디스테릴글리카미드; 1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜)(PEG-콜레스테롤); 3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜) 에테르(PEG-DMB); 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-히드록실(DSPE-PEG-OH)로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, PEG화 지질은 DMG-PEG, DSPE-PEG, DSPE-PEG-OH, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 PEG화 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-OH, 또는 이들의 조합이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, scFv는 LNP의 PEG화 지질에 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되어 PEG화 지질 접합체를 형성한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질은 DSPE-PEG이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, scFv는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, 절단 가능하지 않은 링커는 말레이미드 함유 링커이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, scFv는 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, scFv는 피리딜디설파이드(PDS) 함유 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 약 30% 내지 약 80%의 몰 백분율로 존재한다. 일부 실시형태에 따르면, 스테롤은 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 비양이온성 지질은 약 2% 내지 약 20%의 몰 백분율로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 PEG화 지질은 약 2.1% 내지 약 10%의 몰 백분율로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, scFv 폴리펩타이드는 약 0.02 μg/μg의 TNA 내지 약 0.1 μg/μg의 TNA의 총량으로 존재한다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 약제학적 조성물은 덱사메타손 팔미테이트를 추가로 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, LNP의 총 지질 대 TNA 비는 약 10:1 내지 약 40:1이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, LNP의 직경은 약 40 nm 내지 약 120 nm 범위이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 나노입자의 직경은 약 100 nm 미만이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 나노입자의 직경은 약 60 nm 내지 약 80 nm이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR)을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트에는 2개의 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 ITR은 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위 바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 또는 파르보바이러스 유래의 야생형 ITR이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택된다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV ITR이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나는 변형된 또는 돌연변이 ITR이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 5' ITR과 3' ITR은 대칭이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 5' ITR과 3' ITR은 비대칭이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 적어도 5개 염기쌍이다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 닉 또는 갭을 갖는다. 상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은, 예를 들어 치료 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상의 종양으로 치료용 핵산(TNA)을 전달하거나 대상의 종양에 TNA의 농도를 증가시키는 방법으로서, 본원의 양태 및 실시형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기에 간략하게 개략되어 있고 하기에 보다 상세하게 논의되는 본 개시내용의 실시형태는, 첨부된 도면에 도시된 본 개시내용의 예시적인 실시형태를 참조로 이해될 수 있다. 하지만, 첨부된 도면은 본 개시내용의 단지 전형적인 실시형태를 예시하는 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 개시내용은 다른 동등하게 효과적인 실시형태를 허용할 수 있다.
도 1a 내지 도 1f는, 트라스투주맙(trastuzumab) 유래 α-HER2 scFv가 시험관내에서 명확한 HER2 특이적 막 표적화와 내재화를 나타냈음을 보여준다. Alexa-fluor 488(AF488) 표지된 항-HER2 scFv를 사용한 경우 SkBR3 Her2 발현(HER2+) 세포주(도 1a)와 SkOV3 Her2 발현(HER2+) 세포주(도 1b)에서는 HER2 수용체 결합을 나타냈지만, Her2 수용체를 발현하지 않는(HER2-) MCF7 세포(도 1c)에서는 결합을 나타내지 않았음을 보여준다. 두 번째 면역형광 표지(pHrhodo)를 사용하여 리간드 내재화를 입증하였다. 도 1d 내지 도 1f에 제시된 바와 같이, HER2 수용체를 발현하는 SkBR3 세포와 SkOV3 세포는 리간드 내재화를 나타냈지만(도 1d와 도 1e), MCF7 HER2- 세포주는 내재화를 나타내지 않았다(도 1f).
도 2a와 도 2b는, 티올 기반 가교를 사용한 예시적인 주요 접합 경로의 개략도를 보여준다.
도 3a와 도 3b는, scFv-LNP 접합 과정이 탁월한 접합 수율과 LNP 입자 안정성을 입증했음을 보여준다. 초기 TCEP 환원, 새로운 MAL-LNP(말레이미드 접합된 LNP) 제제, 0.5% MAL-PEG2K, scFv:Mal의 몰 당량 0.5, 0.25, 0.1 및 0.05를 포함하는 접합 과정의 결과가 도 3a에 제시되어 있다. 다음으로, PEG 사슬 길이를 PEG5K까지 증가시키고, 입자 크기와 안정성을 손상시키지 않으면서 미반응 scFv를 제거하기 위해 투석 단계를 전개하였다. 결과는 도 3b에 제시되어 있다.
도 4a와 도 4b는, 접합 과정을 통한 scFv 접합 후 LNP 크기와 캡슐화 효율이 유지되었음(±10 nm)을 보여주는 그래프이다.
도 5는, 말레이미드 접합 과정이 강력한 접합을 생성했음을 보여준다.
도 6a와 도 6b는 HER2 결합이 Tras-scFv 접합된 LNP(도 6a)에서만 나타났고, 0.5% DSPE 대조군 LNP(도 6b)에서는 나타나지 않았음을 보여주는 그래프로서, 이는 LNP에 대한 리간드 기능을 확인시켜 준다.
도 7은, 말레이미드 접합된 LNP(MAL-LNP)가 Her2 특이적인 증강된 세포 흡수를 나타냈음을 보여주며, 특히 접합된 Tras-scFv 지질 A LNP의 흡수(mCherry)가 HER2에 의해 매개되었음을 입증한다.
도 8a와 도 8b는, LNP 표면 상의 리간드 제시가 생물학적 활성에 유의하게 영향을 미쳤음을 보여준다. 도 8a의 그래프는, PEG 사슬 길이가 2000 Da(PEG2K) 또는 5000 Da(PEG5K)인 말레이미드 접합된 LNP에서, 세포 생존능에 대해 정규화된 LNP 흡수(mCherry)를 비교한 것이다. 도 8a에 제시된 바와 같이, LNP의 세포 흡수로 평가 시, PEG5K를 갖는 말레이미드 접합된 LNP가 더 큰 생물학적 활성을 나타냈다. 도 8b의 그래프는, 말레이미드(PEG5K에 접합된 상태) 농도가 0.5%에서 1.25%로 증가됨에 따라, LNP 흡수(mCherry)의 용량 의존적 감소가 관찰되었음을 보여준다.
본 개시내용은 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포(예를 들어, 종양 세포)의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 것인 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 유리한 특징은, 임의의 scFv가 LNP에 연결될 수 있으며, scFv가 지시되는 항원을 발현하는 임의의 세포 또는 조직을 표적화하는 데 유리하다는 점이다. 본원에 기재된 LNP 조성물은 유리하게는 입자 크기와 안정성에 최소한의 영향을 미치면서 효율적인 공유결합 접합을 제공한다.
하나의 양태에 따르면, 본 개시내용은 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 발견은, LNP에 대한 scFv의 말레이미드 접합이 LNP에 대해 강력한 접합을 제공하며, 중요하게는, LNP 크기와 온전성이 유지된다는 점이다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 LNP에 공유결합으로 연결되어 있다. 본원에 사용된 "공유결합"이라는 용어는, 원자 사이의 전자쌍 공유를 포함하는 화학적 결합을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 접합 화학 또는 시스템을 언급할 때 본원에 사용된 "접합"이라는 용어는, p 오비탈이 다수의 원자로부터의 비편자화된 전자와 중첩되는 시스템을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, 절단 가능하지 않은 링커는 말레이미드 함유 링커이다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, 절단 가능한 링커는 피리딜디설파이드(PDS) 함유 링커이다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 트랜스글루타미나아제 매개 접합을 통해 LNP에 연결되어 있다. 본원에 사용된 "트랜스글루타미나아제 매개 접합"은, 미생물 트랜스글루타미나아제(MTGase)에 의해 매개되는 본원에 정의된 바와 같은 접합을 나타낸다. MTGase는 링커 내 1차 아민과, 항체 또는 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 특정 글루타민 잔기의 측쇄, 예를 들어 탈글리코실화된 키메라, 인간화 및 인간 IgG1 내 295번 글루타민 사이의 부위 특이적 변형(즉, 펩타이드 전이(transpeptidation))을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[Anami Y., Tsuchikama K. (2020) Transglutaminase-Mediated Conjugations. In: Tumey L. (eds) Antibody-Drug Conjugates. Methods in Molecular Biology, vol 2078. Humana, New York, NY.](상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조). 이러한 방법은 297번 아스파라긴의 돌연변이, 글루타민 함유 펩타이드 태그의 삽입, 및 분지형 링커의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 접합 과정을 용이하게 하고, 접합 부위와 약물 대 항체 비(DAR)를 조정하는 데 유연성을 제공한다(문헌[Yasuaki Anami and Kyoji Tsuchikama "Transglutaminase-Mediated Conjugations" in Methods in Molecular Biology, Antibody Drug Conjugates (2020)](상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)). 일부 실시형태에서, 접합은 글루타민 함유 펩타이드 태그의 삽입 및/또는 분지형 링커의 사용에 의해 증강될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 글루타민 함유 펩타이드 태그는 LLQGA(Leu-Leu-Gln-Glu-Ala 또는 서열번호 4)이다. 일부 실시형태에서, 글루타민 함유 펩타이드 태그는 서열번호 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글루타민 함유 태그는 서열번호 4로 이루어져 있다.
추가 이점으로서, 본원에 기재된 LNP는 치료용 핵산의 더 효율적인 전달, 더 나은 내약성 및 개선된 안전성 프로파일을 제공한다. 본원에 기재된 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 바이러스 캡시드 내 공간에 의해 부가되는 패키징 제약이 없기 때문에, 이론상, 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 유일한 크기 제한은 숙주세포의 DNA 복제 효율에 있다. 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 일부 실시형태에 따르면, 치료용 핵산은 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA)와 같은 치료용 핵산(TNA)이다. 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 일부 실시형태에 따르면, 치료용 핵산은 ceDNA이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에 따르면, 치료용 핵산은 mRNA이다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 업계의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학 및 분자생물학에서의 상용 용어 정의는, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013)]; 문헌[Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)]; 문헌[Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005] 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI), John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)](상기 문헌들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다.
"e.g."라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "e.g."라는 약어는, "예를 들어"라는 용어와 동의어이다.
대안의 사용(예를 들어, "또는")은 대안들 중 하나, 둘, 또는 이들의 임의의 조합을 의미한다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는, 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 나타낼 때, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 보다 더욱 바람직하게는 ±1%, 및 더 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 차이를 포함하는 것으로 여겨지는데, 이러한 차이가 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다.
본원에 사용된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "포함하다", "포함하는" 및 "~으로 구성된"은, "포함되다", "포함하여" 또는 "함유하다", "함유하는"과 동의어인 것으로 여겨지며, 다음에 오는 것, 예를 들어 구성요소의 존재를 명시하는 포괄적이거나 개방적인 용어이며, 당업계에 알려진 또는 본원에 개시된 추가의 인용되지 않은 구성요소, 특징, 요소, 구성원, 단계의 존재를 배제하거나 제외시키지 않는다.
"~로 이루어진"이라는 용어는, 실시형태의 설명에 인용되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 공정 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.
본원에 사용된 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 용어는, 소정의 실시형태에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 본 개시내용의 실시형태의 기본적인 및 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본원에 사용된 "예컨대", "예를 들어" 등과 같은 용어는, 예시적인 실시형태를 나타내기 위해 의도된 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재된다.
본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 핵산, 특히 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.
본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 본원의 다른 곳에 추가로 기재되어 있는 바와 같이, 임의의 자연 발생, 재조합, 변형 또는 조작된 면역글로불린 또는 면역글로불린 유사 구조, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 부분, 또는 이의 유도체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 나타내며, 이에는, 예를 들어 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이적 항체가 포함된다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에는 중쇄만 포함할 수 있는 낙타류의 자연 발생 항체와 같이 더 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원에서만 유도될 수 있거나, 항체의 상이한 부분이 2가지 상이한 항체에서 유도될 수 있는 "키메라"일 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마로 생산될 수 있다. 본원에 사용된 항체라는 용어는, 각각, 단클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때때로 "항체 모방체"로도 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(때때로 "항체 접합체"로도 지칭됨)를 포함한다.
본원에 사용된 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은, 항원(예를 들어, TGFβ1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타내는 것으로 여겨진다. 항원 결합 부분에는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 입수 가능한, 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질이 포함된다. 일부 실시형태에서, 항체의 항원 결합 부분은, 예를 들어 항체 가변 도메인과 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작과 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기술, 또는 단백질분해 소화와 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전장 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 항원 결합 부분의 비제한적인 예에는, 하기가 포함된다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 도메인과 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자(예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883] 참조); (vi) dAb 단편(예를 들어, 문헌[Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546] 참조); 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위. 디아바디와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체가 또한 포함된다. 항체의 항원 결합 부분이라는 용어는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커를 포함하는, 다르게는 "scFab"으로도 알려진 "단일 사슬 Fab 단편"을 포함하며, 여기서 상기 항체 도메인과 상기 링커는, N-말단에서 C-말단 방향으로, a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL의 순서 중 하나를 갖고, 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩타이드이다.
본원에 사용된 "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"라는 용어는, 공유결합으로 연결되어 VH::VL 이종이량체를 형성하는 면역글로불린의 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 중쇄(VH)와 경쇄(VL)는 직접 연결되어 있거나, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, VH의 C-말단을 VL의 N-말단과 연결하는 펩타이드 인코딩 링커(예를 들어, 10개, 15개, 20개, 25개 아미노산)에 의해 연결되어 있다. 링커는 통상적으로 가요성을 위해 글리신이 풍부할 뿐 아니라, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 본래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단일 사슬 Fv 폴리펩타이드 항체는 문헌[Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988]에 기재된 바와 같이 VH 인코딩 서열과 VL 인코딩 서열을 포함하는 핵산에서 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호; 및 미국 특허출원 공개공보 제20050196754호 및 제20050196754호 참조. 일부 실시형태에 따르면, Fab에서 유도되는(항체 대신, 예를 들어 Fab 라이브러리에서 수득되는) scFv가 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, scFv는 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2)에 결합한다.
본원에 사용된 "항원"이라는 용어는, 면역반응을 유발하는 분자를 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 면역반응은 항체 생산 또는 특정 면역 적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는, 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA에서 유도될 수 있다. 따라서, 당업자는, 면역반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본원에 사용되는 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 인코딩되어야 하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 나아가, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성으로 생성되거나 생물학적 샘플에서 유도될 수 있다. 이러한 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항원은 종양 관련 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)이다. 하나의 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 하기로 이루어지는 군에서 선택된다: 신경교종 관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식선 자극호르몬, 알파태아단백질(AFP), 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라아제, 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린 B2, CD22, 인슐린 성장인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, HLA-A1 MAGE-A1, HLA-A2, IL-11Rα, IL-13Rα2, KDR, Lambda, Lewis-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체. 일부 실시형태에서, TAA 또는 TSA는 피브로넥틴의 종양태아성 변이체, 테나신 또는 종양의 괴사 영역과 같은 종양의 세포외 기질 내에 존재하는 항원이다. 일부 실시형태에서, TAA 또는 TSA는, 비제한적으로, 인테그린(예를 들어, 인테그린 αvβ3, α5β1), EGF 수용체 패밀리(예를 들어, EGFR2, Erbb2/HER2/neu, Erbb3, Erbb4), 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸), 디시알로강글리오시드(예를 들어, GD2, GD3), B7-H3(소위 CD276), 암 항원 125(CA-125), 상피세포 부착 분자(EpCAM), 혈관내피성장인자 수용체 1 및 2(VEGFR-1, VEGFR-2), CD52, 암배아 항원(CEA), 종양 관련 당단백질(예를 들어, TAG-72), 분화 클러스터 19(CD19), CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD74, CD152, 뮤신 1(MUC1), 종양 괴사인자 수용체(예를 들어, TRAIL-R2), 인슐린 유사 성장인자 수용체, 엽산 수용체 α, 막관통 당단백질 NMB(GPNMB), C-C 케모카인 수용체(예를 들어, CCR4), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), RON(recepteur d′origine nantais) 수용체, 세포독성 T림프구 항원 4(CTLA4), 및 다른 종양 특이적 수용체 또는 항원을 포함하는 종양 세포에서 발현되거나 과발현되는 임의의 막 단백질 또는 바이오마커이다.
하나의 실시형태에서, 항원은 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2)이다.
본원에 사용된 "항-치료용 핵산 면역반응", "항-전달 벡터 면역반응", "치료용 핵산에 대한 면역반응", "전달 벡터에 대한 면역반응" 등의 구절은, 바이러스 또는 비바이러스 기원의 치료용 핵산에 대한 임의의 목적하지 않는 면역반응을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 목적하지 않는 면역반응은 바이러스성 전달 벡터 자체에 대한 항원 특이적 면역반응이다. 일부 실시형태에서, 면역반응은 이중가닥 DNA, 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA일 수 있는 전달 벡터에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 면역반응은 전달 벡터의 서열에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 면역반응은 전달 벡터의 CpG 함량에 특이적이다.
본원에 사용된 "수용액"이라는 용어는, 전체적으로 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "염기"라는 용어는, 퓨린 및 피리미딘(이에는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체가 추가로 포함됨) 및 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체(이에는, 비제한적으로, 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성기가 대체된 변형이 포함됨)를 포함한다.
본원에 사용된 "담체" 및 "부형제"라는 용어는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함하는 것으로 여겨진다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA"라는 용어는, 비바이러스성 유전자 전달, 합성 또는 그 이외의 것을 위한 캡시드 미함유 폐쇄형 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 폐쇄형 선형 이중체(CELiD) CELiD DNA이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 DNA 기반 미니서클이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE: minimalistic immunological-defined gene expression) 벡터이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 미니스트링 DNA이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 doggybone™ DNA이다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 "폐쇄형 DNA 벡터"라는 용어는, 적어도 하나의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖고 벡터의 적어도 일부가 분자내 이중체 구조를 갖는 캡시드 미함유 DNA 벡터를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 말단 회문구조를 포함하는 폐쇄형 DNA 벡터를 나타낸다. 일부 실시형태에서, ceDNA는 2개의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 포함한다.
본원에 사용된 "ceDNA-박미드(bacmid)"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균(E. coli)에서 증식할 수 있고, 이에 따라 바큘로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작동할 수 있는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큘로바이러스 게놈을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큘로바이러스"라는 용어는, 바큘로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큘로바이러스를 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큘로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큘로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복(ITR) 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타내는 것으로 여겨진다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.
본원에 사용된 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 비(non)코딩 서열(예를 들어, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위 지정 변형 폴리펩타이드 또는 Cas9/Csn1 폴리펩타이드)을 제공하고/하거나 이의 전사를 조절하고/하거나, 인코딩된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 단백질 분해 신호 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "말단반복서열" 또는 "TR"이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스성 또는 비바이러스성 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS" 또는 Rep-결합 요소(RBE)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위("TRS")는 함께 AAV에 대한 "최소 필수 복제 기점"을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 소정의 스트레치 내에서 서로 역 보체인 TR은, 전형적으로 각각 "역말단반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 입자 및 DNA 패키징, DNA 통합, 및 게놈 및 프로바이러스 구제를 매개하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 전체 길이에 걸쳐 역 보체(회문구조)가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전형적인 기능을 수행할 수 있기 때문에, ITR이라는 용어는 숙주세포의 복제를 매개할 수 있는 바이러스성 또는 비바이러스성 AAV 벡터의 TR을 나타내는 데 사용된다. 당업자는, 복잡한 AAV 벡터 구성에서, 2개 초과의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"ITR"은 하나 이상의 바람직한 기능성 서열(예를 들어, 회문구조 서열, RBS)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다. ITR 서열은 AAV ITR, 인공적 비(non)AAV ITR, 또는 바이러스성 AAV ITR에서 물리적으로 유도된 ITR(예를 들어, 바이러스 게놈에서 제거된 ITR 단편)일 수 있다. 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)를 포함하는 파르보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파르보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노연관바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 전형적으로, ITR 서열은 야생형, "개뼈형(doggy bone)" 및 "덤벨형", 대칭형 또는 심지어 비대칭형 ITR 배향 구성으로, AAV뿐 아니라, 파르보바이러스, 렌티바이러스, 거위 바이러스, B19에서 유도될 수 있다. ITR은 전형적으로 AAV 벡터의 5' 말단과 3' 말단 모두에 존재하지만, ITR은 선형 벡터의 말단 중 하나에만 존재할 수 있다. 예를 들어, ITR은 5' 말단에만 존재할 수 있다. 일부 다른 경우, ITR은 합성 AAV 벡터에서 3' 말단에만 존재할 수 있다. 본원에서 편의를 위해, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 5'("업스트림")에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, 벡터 또는 합성 AAV 내 발현 카세트의 3'("다운스트림")에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는, AAV 게놈 또는 다른 데펜도바이러스 내 자연 발생 ITR 서열의 서열을 나타낸다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 합성 AAV 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 자연 발생 기본형 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖더라도, 변화가 서열의 물리적 및 기능적 특성과, 전체 3차원 구조(2차 및 3차 구조)에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오타이드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"이라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C' 영역, B 영역, B' 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 "비대칭인 ITR"이라는 용어(이는 "비대칭인 ITR 쌍"으로도 지칭됨)는, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 합성 AAV 게놈 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭인 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 이의 동족 ITR과 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 달리 말하면, 비대칭 ITR 쌍은 전체적인 기하 구조가 상이하며, 즉, 이들은 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 상이하다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 부가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 비대칭 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에 정의된 바와 같이 변형된 ITR(예를 들어, 비야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 비대칭 ITR 쌍 중 어느 ITR도 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상을 갖는(즉, 전체 기하 구조가 상이한) 변형된 ITR이다. 일부 실시형태에서, 비대칭 ITR 쌍 중 하나의 mod-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 동족 비대칭 mod-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖도록 상이한 변형(예를 들어, 단일 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "대칭인 ITR"이라는 용어는, 야생형 또는 돌연변이된(예를 들어, 야생형에 비해 변형된) 데펜도바이러스 ITR 서열이고 전체 길이에 걸쳐 역 보체인, 단일가닥 AAV 게놈 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예에서, 두 개의 ITR은 모두 AAV2 유래의 야생형 ITR 서열이다. 또 다른 예에서, ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오타이드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 5'(업스트림)에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 3'(다운스트림)에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 변형된 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 합성 AAV 내 변형된 ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오타이드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 실시형태에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형의 동족 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 실시형태에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 실시형태에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 기본 설정의 BLASTN과 같은 당업계에 널리 알려진 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 mod-ITR. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
본원에 사용된 활성제 또는 치료제, 예컨대 치료용 핵산의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 구절은, 목적하는 효과, 예를 들어 치료용 핵산의 부재 하에서 검출된 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현 저해를 생성하는 데 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하는 데 적합한 검정에는, 예를 들어 도트 블롯(dot blot), 노던 블롯(northern blot), 제자리 혼성화, ELISA, 면역침강, 효소 기능과 같은 당업자에게 알려진 기술뿐 아니라, 당업자에게 알려진 표현형 검정을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사가 포함된다.
본원에 사용된 "발현"이라는 용어는, 적용 가능한 경우, 비제한적으로, 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하는, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 나타내는 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 "발현 산물"이라는 구절에는, 유전자에서 전사된 RNA(예를 들어, 전이유전자), 및 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩타이드가 포함된다.
본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 벡터를 나타내는 것으로 여겨진다. 발현된 서열은 종종, 반드시는 아니지만, 숙주세포에 대해 이종성일 수 있다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있기 때문에, 2가지 유기체에서, 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해, 원핵 숙주에서 클로닝과 증폭을 위해 유지될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 "플랭킹(flanking)"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타내는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A와 C에 의해 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다.
본원에 사용된 "스페이서 영역"이라는 용어는, 벡터 또는 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 실시형태에서, 스페이서 영역은 벡터 또는 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 실시형태에서, 스페이서 영역은 클로닝 부위를 위한 편리한 위치 및 염기쌍의 디자인 번호의 갭을 제공하여 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다.
본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "발현 유닛"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, DNA 벡터, 예를 들어 합성 AAV 벡터의 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 프로모터 또는 다른 DNA 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 나타내는 것으로 여겨진다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 "유전 질환" 또는 "유전적 장애"라는 구절은, 부분적으로 또는 완전히, 직접적으로 또는 간접적으로, 게놈 내 하나 이상의 비정상에 의해 유발된 질환으로, 특히 출생 시부터 존재한 병태를 포함하는 질환을 나타내는 것으로 여겨진다. 비정상은 유전자에서의 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 "폴리펩타이드"라는 용어는, 반복되는 아미노산 서열을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 지방산의 에스테르를 포함하고, 물에서는 불용성이지만, 다수의 유기 용매에서는 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 나타내는 것으로 여겨진다. 이는 통상적으로 적어도 3가지 부류로 분류된다: (1) 지방 및 오일뿐 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도된 지질".
인지질의 대표적인 예에는, 비제한적으로, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 및 디리놀레오일포스파티딜콜린이 포함된다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤 및 β-아실옥시산과 같은 인이 결여된 다른 화합물도, 양친매성 지질로 지정된 군에 속한다. 또한, 상기 기재된 양친매성 지질은 트리글리세리드와 스테롤을 포함하는 다른 지질과 혼합될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 지질 조성물은 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에 사용된 "지질 접합체"라는 용어는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하는 접합된 지질을 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG화 지질, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, 국제 특허출원 공개공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 실시형태에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 "지질 캡슐화(된)"라는 용어는, 핵산(예를 들어, ceDNA)과 같은 활성제 또는 치료제가 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두가 되도록 하는 지질 입자를 나타내는 것으로 여겨진다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 지질 입자에 완전히 캡슐화되어 있다(예를 들어, 핵산 함유 지질 입자를 형성함).
본원에 사용된 "지질 입자" 또는 "지질 나노입자"라는 용어는, 핵산 치료제와 같은 치료제를 관심 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)로 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 나타내는 것으로 여겨진다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 입자는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 치료용 핵산과 같은 치료제는 입자의 지질 부분에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자는 핵산(예를 들어, ceDNA)과, 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함하는 지질을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 지질 입자의 크기는 전형적으로 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 75 nm, 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 25 nm 내지 약 75 nm, 약 25 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 75 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 35 nm 내지 약 75 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 75 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 45 nm 내지 약 75 nm, 약 50 nm 내지 약 75 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 75 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 65 nm 내지 약 75 nm, 약 65 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 51 nm, 약 52 nm, 약 53 nm, 약 54 nm, 약 55 nm, 약 56 nm, 약 57 nm, 약 58 nm, 약 59 nm 약 60 nm, 약 61 nm, 약 62 nm, 약 63 nm, 약 64 nm, 약 65 nm, 약 66 nm, 약 67 nm, 약 68 nm, 약 69 nm, 약 70 nm, 약 71 nm, 약 72 nm, 약 73 nm, 약 74 nm 또는 약 75 nm(± 3 nm)이다.
일반적으로, 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 의도된 치료 효과를 제공하도록 선택된 평균 직경을 갖는다.
일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 지질 입자의 크기는 전형적으로 평균 직경이 약 75 nm 미만, 약 70 nm 미만, 약 65 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만이다.
본원에 사용된 "양이온성 지질"이라는 용어는, 생리학적 pH에서 양으로 하전되는 임의의 지질을 나타낸다. 지질 입자 내 양이온성 지질은, 예를 들어 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), "SS-절단 가능한 지질", 또는 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 지질, 즉, 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 본원에 기재된 모든 양이온성 지질의 상응하는 4차 지질(즉, 양이온성 모이어티 내 질소 원자가 양성자화되고, 4개의 치환기를 가짐)은 본 개시내용의 범위 내에서 고려된다. 본원에 기재된 임의의 양이온성 지질은, 예를 들어 아세토니트릴(CH3CN) 및 클로로포름(CHCl3) 중 클로로메탄(CH3Cl)으로의 처리에 의해 상응하는 4차 지질로 전환될 수 있다.
본원에 사용된 "음이온성 지질"이라는 용어는, 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 나타낸다. 이러한 지질에는, 비제한적으로, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀(cardiolipin), 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 기타 음이온성 변형기가 포함된다.
본원에 사용된 "소수성 지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로시클릭 기(들)로 선택적으로 치환된 이러한 기를 포함하는 비(non)극성기를 갖는 화합물을 나타낸다. 적합한 예에는, 비제한적으로, 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N,N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판이 포함된다.
본원에 사용된 "이온화 가능한 지질"이라는 용어는, 지질이 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4) 이하의 pH에서는 양으로 하전되고, 제2 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서는 중성이 되도록, 적어도 하나의 양성자화 가능한 또는 탈양성자화 가능한 기를 갖는 지질, 예를 들어 양이온성 지질을 나타내는 것으로 여겨진다. 당업자는, pH의 함수로서 양성자의 부가 또는 제거가 평형 과정이고, 하전된 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 나타내며, 모든 지질이 하전된 또는 중성 형태로 존재할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질의 양성자화 가능한 기의 pKa는 약 4 내지 약 7 범위이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "중성 지질"이라는 용어는, 선택된 pH에서 하전되지 않은 또는 중성의 쯔비터이온(zwitterionic) 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 나타내는 것으로 여겨진다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질에는, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤이 포함된다.
본원에 사용된 "비양이온성 지질"이라는 용어는, 임의의 양친매성 지질뿐 아니라, 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"이라는 용어는, 디설파이드 결합 절단 가능한 단위를 포함하는 지질을 나타낸다. 절단 가능한 지질은 pH 민감성 3차 아민과 자가 분해 가능한 페닐 에스테르를 포함하는, 절단 가능한 디설파이드 결합("ss") 함유 지질 유사 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, SS-절단 가능한 지질은 ss-OP 지질(COATSOME® SS-OP), ss-M 지질(COATSOME® SS-M), ss-E 지질(COATSOME® SS-E), ss-EC 지질(COATSOME® SS-EC), ss-LC 지질(COATSOME® SS-LC), ss-OC 지질(COATSOME® SS-OC) 및 ss-PalmE 지질(예를 들어, 화학식 I 내지 화학식 IV 참조), 또는 문헌[Togashi et al., (2018) Journal of Controlled Release "A hepatic pDNA delivery system based on an intracellular environment sensitive vitamin E -scaffold lipid-like material with the aid of an anti-inflammatory drug" 279:262-270]에 기재된 지질일 수 있다. 절단 가능한 지질의 추가 예는 미국 특허 제9,708,628호와 미국 특허 제10,385,030호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 모든 내용은 본원에 참조로 인용된다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 막 불안정화를 위해 산성 구획, 예를 들어 엔도솜 또는 리소좀에 반응하는 3차 아민과, 세포질과 같은 환원 환경에서 절단될 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 양이온성 지질이다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 절단 가능한 지질은 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 사용된 "유기 지질 용액"이라는 용어는, 지질을 갖는 유기 용매를, 전체적으로 또는 부분적으로, 포함하는 조성물을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "리포솜"이라는 용어는, 수성 외부와 분리된 내부 수성 용적을 캡슐화하는 구형 구성으로 어셈블링된 지질 분자를 나타내는 것으로 여겨진다. 리포솜은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포솜은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학적 성분을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포솜 조성물은 전형적으로 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되어 있지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "국소 전달"이라는 용어는, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제를 유기체 내 표적 부위에 직접 전달하는 것을 나타내는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 작용제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사하는 방식으로 국소적으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는 중합체(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)를 나타내는 것으로 여겨지며, 이에는 DNA, RNA 및 이의 혼성체가 포함된다. DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), doggybone™ DNA, 덤벨형 DNA, 최소한의 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA), 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 알려진 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.
본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, DOGGYBONE™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기, 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 수중유 또는 유중수 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤화제와 같은 표준 약제학적 담체 중 임의의 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에 열거된 작용제 중 임의의 것뿐 아니라, 대상에게 유의한 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 사용된 "갭"이라는 용어는, 다르게는 이중가닥 ceDNA에서 단일가닥 DNA 부분의 스트레치를 형성하는, 본 개시내용의 합성 DNA 벡터의 중단된 부분을 나타내는 것으로 여겨진다. 갭은 이중체 DNA의 하나의 가닥에서 1개 염기쌍 내지 100개 염기쌍 길이일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 설계되고 형성된 전형적인 갭, 및 이러한 방법에 의해 생성된 합성 벡터는, 예를 들어 길이가 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp 또는 60 bp일 수 있다. 본 개시내용에 예시된 갭은 길이가 1 bp 내지 10 bp, 1 bp 내지 20 bp, 1 bp 내지 30 bp일 수 있다.
본원에 사용된 "닉"이라는 용어는, 전형적으로 손상 또는 효소 작용을 통해 하나의 가닥의 인접한 뉴클레오타이드들 사이에 포스포디에스테르 결합이 없는 이중가닥 DNA 분자 내 불연속 부분을 나타낸다. 하나 이상의 닉은 DNA 복제 동안 가닥 내 비틀림의 해제를 가능하게 하고, 닉은 또한 전사 기구의 결합을 용이하게 하는 역할을 하는 것으로 여겨진다.
"수용체"란, 하나 이상의 리간드에 선택적으로 결합하는 세포막에 존재하는 폴리펩타이드 또는 이의 부분을 의미한다. 본원에 사용된 "수용체"라는 용어는, 전체 수용체 또는 이의 리간드 결합 부분을 포함하는 것으로 의도된다. 수용체의 이러한 부분은 특히 리간드의 특이적 결합이 일어나기에 충분한 영역을 포함한다.
본원에 사용된 "암"이라는 용어는, 전형적으로 조절되지 않은 세포 증식과 악성종양을 특징으로 하는 다세포 진핵생물의 생리학적 병태를 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 광범위하게 고형 종양, 혈액암(예를 들어, 백혈병)뿐 아니라, 골수섬유증과 다발성 골수종을 포함한다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 개시내용에 따른 치료용 핵산으로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타내는 것으로 여겨진다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이, 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 갯과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 실시형태에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성(수컷) 또는 여성(암컷)일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 임상 환경에 있는 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 배아, 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 아동, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 실시형태에서, 대상은 동물 배아, 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간 배아이다.
본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상"이라는 구절은, 이러한 구절의 맥락 및 용법이 달리 지시되지 않는 한, (i) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는ceDNA 지질 입자를 포함하는 약제학적 조성물)를 투여받게 되는 대상, (ii) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는 ceDNA 지질 입자를 포함하는 약제학적 조성물)를 투여받고 있는 대상; 또는 (iii) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는 ceDNA 지질 입자를 포함하는 약제학적 조성물)를 투여받은 적이 있는 대상을 나타낸다.
본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "전신 전달"이라는 용어는, 유기체 내 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제의 광범위한 생체분포를 유도하는 지질 입자의 전달을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 투여 기술은 특정 작용제의 전신 전달로 이어질 수 있지만, 다른 것들은 그렇지 않다. 전신 전달은, 작용제의 유용한, 바람직하게는 치료적 양이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 광범위한 생체분포를 달성하기 위해서는, 일반적으로 작용제가 투여 부위에서 먼 질환 부위에 도달하기 전에 (예컨대, 일차 통과 기관(간, 폐 등)에 의해 또는 신속하고 비특이적인 세포 결합에 의해) 신속하게 분해되거나 제거되지 않도록 하는 혈액 수명을 필요로 한다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은, 예를 들어 정맥내, 피하 및 복강내를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 수단을 통해 이루어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은 정맥내 전달로 이루어진다.
본원에 사용된 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 지질 입자)의 "치료량", "치료적 유효량", "유효량" 또는 "약제학적 유효량"이라는 용어는, 치료의 의도된 유익을 제공하는 데 충분한 양을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 하지만, 투여량 수준은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 활성제를 포함하는 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 의사가 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 또한, "치료량", "치료적 유효량" 및 "약제학적 유효량"이라는 용어는, 상기 기재된 개시내용의 조성물의 예방적 또는 예방용 양을 포함한다. 상기 기재된 개시내용의 예방적 또는 예방용 적용에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 다르게는 이의 위험이 있는 환자에게, 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. "용량" 및 "투여량"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 알려진 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.
약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것이 포함된다.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것이 포함된다.
본원에 사용된 "병용요법"이라는 용어는, 2종 이상의 치료제를 포함하는 임상 적응증을 위한 치료 요법을 나타낸다. 따라서, 상기 용어는, 동일하거나 중첩되는 질환 또는 임상 적응증을 치료하기 위해 의도된 제1 조성물(예를 들어, 활성 성분)을 포함하는 제1 요법을 제2 조성물(예를 들어, 활성 성분)을 포함하는 제2 요법과 함께 환자에게 투여하는 투여 요법을 나타낸다. 제1 조성물과 제2 조성물은 모두 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적에 작용할 수 있다. 병용요법의 맥락에서 "함께"라는 어구는, 제1 요법의 치료 효과가 병용요법을 받는 대상에서 제2 요법의 치료 효과와 일시적으로 및/또는 공간적으로 중첩되는 것을 의미한다. 따라서, 병용요법은 동시 투여를 위한 단일 제형으로 제형화되거나, 순차적 투여 요법을 위한 별도의 제형으로 제형화될 수 있다.
본원에 사용된 "알킬"이라는 용어는, 탄소수 1 내지 20의 포화된 1가 탄화수소 라디칼(즉, C1-20 알킬)을 나타낸다. "1가"는, 알킬이 분자의 나머지 부분에 대해 하나의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 알킬은 1개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C1-12 알킬) 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C1-10 알킬)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 알킬은 1개 내지 8개의 탄소 원자(즉, C1-8 알킬), 1개 내지 7개의 탄소 원자(즉, C1-7 알킬), 1개 내지 6개의 탄소 원자(즉, C1-6 알킬), 1개 내지 4개의 탄소 원자(즉, C1-4 알킬), 또는 1개 내지 3개의 탄소 원자(즉, C1-3 알킬)를 갖는다. 이의 예에는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 3,3-디메틸-2-부틸, 1-헵틸, 1-옥틸 등이 포함된다. "선형 또는 분지형 C1-6 알킬", "선형 또는 분지형 C1-4 알킬" 또는 "선형 또는 분지형 C1-3 알킬"과 같은 선형 또는 분지형 알킬은, 포화된 1가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다. 지방족 탄화수소 사슬을 언급할 때 본원에 사용된 "선형"이라는 용어는, 사슬이 비분지형임을 의미한다.
본원에 사용된 "알킬렌"이라는 용어는, 탄소수 1 내지 20의 포화된 2가 탄화수소 라디칼(즉, C1-20 알킬렌)을 나타내며, 이의 예에는, 비제한적으로, 상기 예시된 바와 같은 알킬기의 동일한 코어 구조를 갖는 것들이 포함된다. "2가"는, 알킬렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 알킬렌은 1개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C1-12 알킬렌) 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C1-10 알킬렌)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 알킬렌은 1개 내지 8개의 탄소 원자(즉, C1-8 알킬렌), 1개 내지 7개의 탄소 원자(즉, C1-7 알킬렌), 1개 내지 6개의 탄소 원자(즉, C1-6 알킬렌), 1개 내지 4개의 탄소 원자(즉, C1-4 알킬렌), 1개 내지 3개의 탄소 원자(즉, C1-3 알킬렌), 에틸렌, 또는 메틸렌을 갖는다. "선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌", "선형 또는 분지형 C1-4 알킬렌" 또는 "선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌"과 같은 선형 또는 분지형 알킬렌은, 포화된 2가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다.
"알케닐"이라는 용어는, 하나 이상(예를 들어, 1개 또는 2개)의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 지방족 탄화수소 라디칼을 나타내며, 여기서 알케닐 라디칼은 "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적인 명명법에 따라 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다.
본원에 사용된 "알케닐렌"은, 1개 또는 2개의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 탄소수 2 내지 20의 지방족 2가 탄화수소 라디칼(즉, C2-20 알케닐렌)을 나타내며, 여기서 알케닐렌 라디칼에는 "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적인 명명법에 따라, "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼이 포함된다. "2가"는, 알케닐렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 알케닐렌은 2개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C2-16 알케닐렌), 2개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C2-10 알케닐렌)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, 알케닐렌은 2개 내지 4개의 탄소 원자(C2-4)를 갖는다. 이의 예에는, 비제한적으로, 에틸레닐렌 또는 비닐렌(-CH=CH-), 알릴(-CH2CH=CH-) 등이 포함된다. "선형 또는 분지형 C2-6 알케닐렌", "선형 또는 분지형 C2-4 알케닐렌" 또는 "선형 또는 분지형 C2-3 알케닐렌"과 같은 선형 또는 분지형 알케닐렌은, 불포화된 2가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "시클로알킬렌"은, 모노시클릭 고리로서 탄소수 3 내지 12, 또는 바이시클릭 고리로서 탄소수 7 내지 12의 2가 포화된 카르보시클릭 고리 라디칼을 나타낸다. "2가"는, 시클로알킬렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 시클로알킬렌은 3원 내지 7원 모노시클릭 또는 3원 내지 6원 모노시클릭이다. 모노시클릭 시클로알킬기의 예에는, 비제한적으로, 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 시클로헵틸렌, 시클로옥틸렌, 시클로노닐렌, 시클로데실렌, 시클로운데실렌, 시클로도데실렌 등이 포함된다. 하나의 실시형태에서, 시클로알킬렌은 시클로프로필렌이다.
"헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릭" 및 "헤테로시클릭 고리"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 N 원자를 함유하고, 헤테로원자 및 선택적으로 N 및 S에서 선택되는 1개 내지 3개의 추가의 헤테로원자를 갖고, 비(non)방향족인(즉, 부분적으로 또는 완전히 포화된) 시클릭기를 나타낸다. 이는 모노시클릭 또는 바이시클릭(브릿지형 또는 융합형)일 수 있다. 헤테로시클릭 고리의 예에는, 비제한적으로, 아지리디닐, 디아지리디닐, 티아지리디닐, 아제티디닐, 디아제티디닐, 트리아제티디닐, 티아디아제티디닐, 티아제티디닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이소티아졸리디닐, 티아졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 헥사히드로피리미디닐, 아제파닐, 아조카닐 등이 포함된다. 헤테로사이클은 N 및 S에서 선택되는 동일하거나 상이할 수 있는 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 하나의 실시형태에서, 헤테로사이클은 1개 내지 3개의 N 원자를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 헤테로사이클은 1개 또는 2개의 N 원자를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 헤테로사이클은 1개의 N 원자를 함유한다. "4원 내지 8원 헤테로시클릴"은, 모노시클릭 고리로 배열된 4개 내지 8개의 원자(N 및 S에서 선택되는 1개 내지 4개의 헤테로원자, 또는 1개 내지 3개의 N 원자, 또는 1개 또는 2개의 N 원자, 또는 1개의 N 원자를 포함함)를 갖는 라디칼을 의미한다. "5원 또는 6원 헤테로시클릴"은, 모노시클릭 고리로 배열된 5개 또는 6개의 원자(N 및 S에서 선택되는 1개 내지 4개의 헤테로원자, 또는 1개 내지 3개의 N 원자, 또는 1개 또는 2개의 N 원자, 또는 1개의 N 원자를 포함함)를 갖는 라디칼을 의미한다. "헤테로사이클"이라는 용어는, 모든 가능한 이성질체 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W. A. Benjamin, New York, 1968)], 특히 챕터 1, 3, 4, 6, 7 및 9; 문헌[The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs (John Wiley & Sons, New York, 1950에서 현재)], 특히 13권, 14권, 16권, 19권 및 28권; 및 문헌[ J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. 헤테로시클릴기는, 가능한 경우, 분자의 나머지에 부착된 탄소(탄소 결합) 또는 질소(질소 결합)일 수 있다.
특정 기가 "선택적으로 치환된" 것으로 기재되는 경우, 해당 기는 (1) 치환되지 않거나, (2) 치환될 수 있다. 특정 기의 탄소가 치환기의 목록 중 하나 이상으로 선택적으로 치환된 것으로 기재되는 경우, 탄소 상의 수소 원자 중 하나 이상(존재하는 정도까지)은 별도로 및/또는 함께 독립적으로 선택된 선택적 치환기로 대체될 수 있다.
알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클릴에 적합한 치환기는, 이관능성 화합물의 생물학적 활성에 유의하게 부정적인 영향을 미치지 않는 것들이다. 달리 명시되지 않는 한, 이러한 기의 예시적인 치환기에는, 탄소수 1 내지 10의 선형, 분지형 또는 시클릭 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR100, NR101R102, -NO2, -NR101COR102, -SR100, -SOR101로 표시되는 설폭시드, -SO2R101로 표시되는 설폰, 설포네이트 -SO3M, 설페이트 -OSO3M, -SO2NR101R102로 표시되는 설폰아미드, 시아노, 아지도, -COR101, -OCOR101, -OCONR101R102, 및 폴리에틸렌글리콜 단위 (-OCH2CH2)nR101가 포함되며, 여기서, M은 H 또는 양이온(예컨대, Na+ 또는 K+)이고; R101, R102 및 R103은, 각각 독립적으로, H, 탄소수 1 내지 10의 선형, 분지형 또는 시클릭 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 폴리에틸렌글리콜 단위 (-OCH2CH2)n-R104(여기서, n은 1 내지 24의 정수임), 탄소수 6 내지 10의 아릴, 탄소수 3 내지 10의 헤테로시클릭 고리, 및 탄소수 5 내지 10의 헤테로아릴에서 선택되고; R104는 H, 또는 탄소수 1 내지 4의 선형 또는 분지형 알킬이며, 여기서 R100, R101, R102, R103 및 R104로 표시되는 기에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 할로겐, -OH, -CN, -NO2, 및 탄소수 1 내지 4의 미치환된 선형 또는 분지형 알킬에서 독립적으로 선택되는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상)의 치환기로 선택적으로 치환된다. 바람직하게는, 상기 기재된 선택적으로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클릴에 대한 치환기는, 할로겐, -CN, -NR101R102, -CF3, -OR100, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -SR101, -SOR101, -SO2R101 및 -SO3M으로 이루어지는 군에서 선택된다. 대안적으로, 적합한 치환기는 할로겐, -OH, -NO2, -CN, C1-4 알킬, -OR100, NR101R102, -NR101COR102, -SR100, -SO2R101, -SO2NR101R102, -COR101, -OCOR101 및 -OCONR101R102로 이루어지는 군에서 선택되며, 여기서 R100, R101 및 R102는, 각각 독립적으로, -H 또는 C1-4 알킬이다.
본원에 사용된 "할로겐"은, F, Cl, Br, 또는 I를 나타낸다. "시아노"는 -CN이다.
본원에 사용된 "아민" 또는 "아미노"는 상호교환적으로 사용되며, 고립 원자쌍(lone pair)을 갖는 염기성 질소 원자를 함유하는 관능기를 나타낸다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질의 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 염을 나타낸다. 예시적인 염에는, 비제한적으로, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트 "메실레이트", 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌비스(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속(예를 들어, 소듐 및 포타슘) 염, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 염 및 암모늄 염이 포함된다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 다른 반대 이온과 같은 또 다른 분자의 혼입을 포함할 수 있다. 반대 이온은 모(parent) 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 나아가, 약제학적으로 허용 가능한 염은 이의 구조에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용 가능한 염의 일부인 경우에는, 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
본원에 개시된 본 개시내용의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 본원에 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족시킨다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식계열 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에게의 임의의 실질적인 의학적 유익 없이 고통을 야기할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 방법, 및 또한 이러한 방법의 결과로서의 동물에 관한 것이 아니다.
다른 용어는 본 개시내용의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된 바와 같다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(참고 문헌, 등록된 특허, 공개된 특허출원 및 동시 계류중인 특허출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
본 개시내용의 실시형태의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 실시형태 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 소정의 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 실시형태는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절한 경우 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시형태는 조합되어 추가 실시형태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 실시형태를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 실시형태 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 실시형태의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이러한 실시형태의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 실시형태 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
II. 지질 나노입자 조성물
지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시된다. "연결된"이라는 용어는, 화학적 접합, 흡착(물리흡착 및/또는 화학흡착)을 포함한다. "연결된"이라는 용어에 포함된 결합의 유형에는, 공유결합형 상호작용과 비공유결합형 상호작용(예를 들어, 수소 결합, 반데르발스 결합, 이온 결합 및 소수성 결합)이 있다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 공유결합 접합을 통해 LNP에 연결되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 말레이미드 연결을 통해 LNP에 연결되어 있다. 본 개시내용의 발견은, LNP에 대한 scFv의 말레이미드 접합이 PDS 접합과 같은 다른 티올 기반 가교 방법에 비해 LNP에 대해 강력한 접합을 제공하며, 중요하게는, LNP 크기와 온전성이 유지된다는 점이다.
따라서, 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에 따르면, 절단 가능하지 않은 링커는 말레이미드 함유 링커이다.
지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있는 약제학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.
본원에 기재된 LNP는 큰 치료용 핵산 분자를 캡슐화할 수 있는 더 작은 크기를 포함하여 다수의 치료적 이점을 제공한다. 본 개시내용의 유리한 특징은, 본원에 기재된 바와 같은 scFv LNP가, scFv가 지시되는 세포의 표면에 존재하는 항원을 능동적으로 발현하는 임의의 세포 또는 조직을 표적화하는 데 유용하다는 점이다. 일부 실시형태에 따르면, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시형태에 따르면, 세포는 간 세포(간세포)이다.
일부 실시형태에 따르면, 항원은 종양 관련 항원(TAA) 또는 종양 선택적 항원(TSA)이다. "종양 관련 항원" 또는 TAA는 종양에서 발현되는 항원이다. "종양 선택적 항원" 또는 TSA는 종양에서 선택적으로 발현되는 항원이다. 하나의 실시형태에서, 항원은 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2)이다.
하나의 실시형태에서, TAA 발현은 종양 세포 집단에만 제한될 수 있고, 모든 종양 세포에 의해 발현될 수 있으며, 종양 세포 표면에서 발현될 수 있다. 다른 항원은 종양 세포에서 과발현되지만, 정상 세포에서는 더 낮은 발현 수준으로 발견될 수 있기 때문에 종양 선택적 항원(TSA)이다. 또한, 일부 종양 항원은 "승객 돌연변이(passenger mutations)", 즉, DNA 복구에 대한 제어 결함이 있는 종양 세포에 의해 발현되는 비필수 항원으로 발생하기 때문에, 다양한 단백질에 돌연변이를 축적시킨다. 일부 종양 항원은 면역반응, 특히 T세포 매개 면역반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다.
일부 실시형태에 따르면, TAA 또는 TSA는 하기로 이루어지는 군에서 선택된다: 신경교종 관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식선 자극호르몬, 알파태아단백질(AFP), 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라아제, 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제, 에프린 B2, CD22, 인슐린 성장인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린, EphA2, HER2, GD2, 글리피칸-3, 5T4, 8H9, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CA9, CD19, CD20, CD22, 카파 경쇄, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, ERBB3, ERBB4, ErbB3/4, FAP, FAR, FBP, 태아 AchR, 엽산 수용체 α, GD2, GD3, HLA-A1 MAGE-A1, HLA-A2, IL-11Rα, IL-13Rα2, KDR, Lambda, Lewis-Y, MCSP, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSC1, PSMA, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEM1, TEM8, VEGRR2, HMW-MAA, 및 VEGF 수용체. 사용될 수 있는 다른 예시적인 항원은 피브로넥틴의 종양태아성 변이체, 테나신 또는 종양의 괴사 영역과 같은 종양의 세포외 기질 내에 존재하는 항원이다.
사용될 수 있는 추가의 종양 선택적 분자에는, 비제한적으로, 인테그린(예를 들어, 인테그린 αvβ3, α5β1), EGF 수용체 패밀리(예를 들어, EGFR2, Erbb2/HER2/neu, Erbb3, Erbb4), 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸), 디시알로강글리오시드(예를 들어, GD2, GD3), B7-H3(소위 CD276), 암 항원 125(CA-125), 상피세포 부착 분자(EpCAM), 혈관내피성장인자 수용체 1 및 2(VEGFR-1, VEGFR-2), CD52, 암배아 항원(CEA), 종양 관련 당단백질(예를 들어, TAG-72), 분화 클러스터 19(CD19), CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD74, CD152, 뮤신 1(MUC1), 종양 괴사인자 수용체(예를 들어, TRAIL-R2), 인슐린 유사 성장인자 수용체, 엽산 수용체 α, 막관통 당단백질 NMB(GPNMB), C-C 케모카인 수용체(예를 들어, CCR4), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), RON(recepteur d′origine nantais) 수용체, 세포독성 T림프구 항원 4(CTLA4), 및 다른 종양 특이적 수용체 또는 항원을 포함하는 종양 세포에서 발현되거나 과발현되는 임의의 막 단백질 또는 바이오마커가 포함된다.
Cancer Antigenic Peptide Database는 펩타이드 서열과 단백질 서열 내 이의 위치를 포함하는 인간 종양 항원에 대한 정보를 편집한 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스(caped.icp.ucl.ac.be)이다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 Cancer Antigenic Peptide Database에 제시된 종양 관련 항원에 대한 것이다.
일부 실시형태에 따르면, scFv는 혈액학적 악성종양과 관련된 종양 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, scFv는 고형 종양과 관련된 종양 항원에 결합한다.
현재 임상 개발 중인 대부분의 항체 단편은 종양학적 적용을 위한 것이다.
면역요법으로서 매력적인 항체 단편의 유전적 특징, 예를 들어 종래 mAb와 비교하여 우수한 조직 및 종양 침투를 가능하게 하는 작은 크기와, 선천 면역세포의 비특이적 활성화를 감소시키는 Fc 도메인의 결여에 더하여, 특정 형식에 고유한 다수의 작용 메커니즘이 존재한다.
종양학은 항체 단편이 중요한 치료 분자 클래스가 된 주요 영역이지만, 항체 단편이 평가되고 있는 몇몇 다른 질환 영역도 있다.
자가면역 질환은 만성이고 잠재적으로 생명을 위협하며, 항체 요법은 통상적으로 집중적이고 평생에 걸친 치료를 필요로 하기 때문에 상당히 비용이 많이 든다. 작은 크기로 인해 항체 단편의 생산 비용이 낮아지고 잠재적인 면역원성이 감소될 수 있기 때문에, 반감기 연장 모이어티를 갖는 항체 단편을 전장 항체에 대한 이용 가능한 대안으로서 사용할 수 있다. 나아가, 암 면역요법과 마찬가지로, 자가면역 질환의 치료를 위한 항체 단편의 개발은 빠른 속도로 성장해가고 있으며, 이중특이적 표적화에 대해서도 많은 가능성이 있다.
자가면역 질환 적응증을 위해 시판된 최초의 항체 단편 중 하나는, UCB(벨기에)에서 개발되고, 2008년 크론병의 치료를 위해 FDA에서 승인된 TNF를 표적으로 하는 PEG화 Fab인 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol)(CIMZIA®)이다. 이는 이후에 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염에 대해 승인되었다. 임상 시험 중인 2가지 다른 Fab이 존재한다: RA에 대해 II상 연구 중에 있는 CD28에 대한 FR104(OSE/Janssen)와, SLE에 대해 II상 연구 중에 있는 UCB에서 개발된 항-CD40L Fab인 다피롤리주맙(dapirolizumab).
현재 RA의 치료를 위해 임상 시험에서 평가 중인 scFv 형식 중 하나는 Dekavil 또는 F8IL10(Philogen)이다. 이는 사이토카인 인터류킨-10에 융합된 혈관 표적화 scFv 항체 F8로 구성된 전장 인간 융합 단백질이다.
scFv에 융합된 다수의 다른 면역사이토카인이 또한 전임상 개발 중에 있다.
Fab 및 scFv와 같은 항체 단편은 각막을 관통하여 눈으로 전달될 수 있으며, 국소 투여 후 합리적인 기간에 걸쳐 전방에서 임상적으로 유용한 농도를 달성할 수 있는 것으로 나타났다(문헌[Thiel et al. Clin. Exp. Immunol. 2002]). 항체 또는 항체 단편을 이용하여 치료되는 가장 흔한 안구 장애는, 선진국의 50세 이상의 사람들에서 비가역적 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)이다. AMD의 경우, 항체 단편은 유리체내 경로를 통해 눈에 직접 적용된다. 라니비주맙(ranibizumab)(LUCENTIS®)은 베바시주맙(bevacizumab)과 동일한 모 마우스 항체에서 유도된 VEGF-A를 표적으로 하는 혈관형성 억제성 단클론 항체 단편이다. 이는 2006년에 습윤성 AMD에 대해 승인되었고, 이후 2012년과 2015년에, 각각, 당뇨병성 황반부종과 당뇨병성 망막병증에 대해 승인되었다. 브롤루시주맙(brolucizumab)(Alcon/Novartis)은 습윤성 AMD에 대해 III상 연구 중에 있는 VEGF를 표적으로 하는 scFv이다.
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1을 포함한다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열번호 1)
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 1로 이루어져 있다.
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2를 포함한다. 서열번호 2는 말레이미드 접합에 필요한 C-말단 시스테인과 함께 myc(볼드체로 밑줄 그어짐) 태그와 His(이탤릭체) 태그를 함유한다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK EQKLISEEDL HHHHHHC (서열번호 2)
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 2로 이루어져 있다.
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3을 포함한다. 서열번호 3은 서열번호 1과 동일한 scFv 코어 서열을 포함하지만, 트랜스글루타미나아제 매개 접합을 용이하게 하기 위해 N-말단 His(이탤릭체) 태그와 C-말단 LLQGA 폴리펩타이드(볼드체로 밑줄 그어짐)를 갖는다.
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK LLQGA (서열번호 3)
일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, scFv는 서열번호 3으로 이루어져 있다.
일부 실시형태에 따르면, LNP는 양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, 비양이온성 지질 또는 PEG화 지질을 포함한다.
A. 양이온성 지질
일부 실시형태에서, 평균 직경이 20 nm 내지 약 74 nm인 지질 나노입자는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은, 예를 들어 비융합원성(non-fusogenic) 양이온성 지질이다. "비융합원성 양이온성 지질"이란, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 없거나 거의 없는 양이온성 지질을 의미한다.
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 하기 표 1에 열거된 국제 및 미국 특허출원 공개공보에 기재되어 있으며, 예를 들어 막 불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 본원의 실시예 섹션에 기재된 검정으로 측정 시 비융합원성인 것으로 결정된다. 모든 이러한 특허 문헌, 즉, 하기 표 1에 열거된 국제 및 미국 특허출원 공개공보의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
[표 1]
Figure pct00019
일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC); 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(14:1), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]벤즈아미드(MVL5); 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS); 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); Saint 지질(예를 들어, SAINT-2, N-메틸-4-(디올레일)메틸피리디늄); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); 1,2-디올레오일-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE); 1,2-디올레오일옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 클로라이드(DORI); 이중알킬화 아미노산(DILA2)(예를 들어, C18:1-norArg-C16); 디올레일디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(POEPC); 및 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(MOEPC)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 변형에서, 응축제, 예를 들어 양이온성 지질은, 예를 들어 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODAP), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), 모르폴리노콜레스테롤(Mo-CHOL), (R)-5-(디메틸아미노)펜탄-1,2-디일 디올레에이트 히드로클로라이드(DODAPen-Cl), (R)-5-구아니디노펜탄-1,2-디일 디올레에이트 히드로클로라이드(DOPen-G), (R)-N,N,N-트리메틸-4,5-비스(올레오일옥시)펜탄-1-아미늄 클로라이드(DOTAPen)와 같은 지질이다.
일부 실시형태에서, 응축성 지질은 DOTAP이다.
이온화 가능한 지질
일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질과 비바이러스성 벡터와 같은 치료용 핵산(예를 들어, ceDNA)을 포함하는 LNP를 함유하는 약제학적 조성물이 또한 본원에 제공된다. 이러한 LNP는, 예를 들어 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 scFv에 연결된 LNP를 포함함)을 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)로 전달하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 특허출원 공개공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 및 WO2013/086354, 및 미국 특허출원 공개공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/074085에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 WO2012/040184에 기재된 바와 같은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/199952에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
화학식 (I)
일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (I)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, C1-3 알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌 또는 C3-6 시클로알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-6 시클로알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3이 C1-6 알킬인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3'가 C1-6 알킬인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는, 각각 독립적으로, -CH, -CH2CH 또는 -(CH2)2CH이고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, 수소, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6과 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m과 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R2와 R2'는, 각각 독립적으로, C1-3 알킬렌이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R1 또는 R1'로 표시되는 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌, R2 또는 R2'로 표시되는 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌, 및 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬은, 각각 하나 이상의 할로기 및 시아노기로 선택적으로 치환된다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R1과 R2는 함께 취해져 C1-3 알킬렌이고, R1'와 R2'는 함께 취해져 C1-3 알킬렌, 예를 들어 에틸렌이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R3과 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-3 알킬, 예를 들어 메틸이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R4와 R4'는 각각 -CH이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R2는 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌이고; R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴을 형성한다. 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R2'는 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌이고; R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴, 예컨대 피롤리디닐 또는 피페리디닐을 형성한다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R4는 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고, Ra는 C1-3 알킬이고; R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴을 형성한다. 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R4'는 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고, Ra는 C1-3 알킬이고; R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴, 예컨대 피롤리디닐 또는 피페리디닐을 형성한다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R5와 R5'는, 각각 독립적으로, C1-10 알킬렌 또는 C2-10 알케닐렌이다. 하나의 실시형태에서, R5와 R5'는, 각각 독립적으로, C1-8 알킬렌 또는 C1-6 알킬렌이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, R6과 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-10 알킬렌, C3-10 시클로알킬렌 또는 C2-10 알케닐렌이다. 하나의 실시형태에서, C1-6 알킬렌, C3-6 시클로알킬렌 또는 C2-6 알케닐렌. 하나의 실시형태에서, C3-10 시클로알킬렌 또는 C3-6 시클로알킬렌은 시클로프로필렌이다. 본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, m 및 n은 각각 3이다.
본원의 임의의 양태 또는 실시형태의 일부 실시형태에 따르면, 양이온성 지질은 표 2의 지질 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 선택된다.
[표 2]
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
화학식 (II)
일부 양태에서, 양이온성 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
(XII)
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고(예를 들어, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임);
b는 2 내지 10 범위의 정수이고(예를 들어, b는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R2는 (C2-C20)알킬임].
제2 화학적 실시형태에서, 화학식 (II)의 양이온성 지질은 화학식 (XIII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
(III)
[식 중, c와 d는, 각각 독립적으로, 1 내지 8 범위의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이고, 나머지 변수는 화학식 (XII)에 대해 기재된 바와 같음].
제3 화학적 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 양이온성 지질에서 c와 d는, 각각 독립적으로, 2 내지 8, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 8, 5 내지 7, 또는 6 내지 8 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (XII)에 대해 기재된 바와 같다.
제4 화학적 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 양이온성 지질에서 c는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2 또는 제3 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제4 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (XII) 또는 화학식 (XIII)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 c와 d는, 각각 독립적으로, 1, 3, 5 또는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2 또는 제3 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제5 화학적 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 양이온성 지질에서 d는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제4 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 c와 d 중 적어도 하나는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제6 화학적 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 양이온성 지질은 화학식 (IV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
[화학식 (IV)]
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (I)에 대해 기재된 바와 같음].
제7 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 b는 3 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제7 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 b는 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 9, 6 내지 8, 또는 7 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 b는 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제8 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 a는 2 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제8 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 a는 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 18, 3 내지 17, 3 내지 16, 3 내지 15, 3 내지 14, 3 내지 13, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 18, 4 내지 17, 4 내지 16, 4 내지 15, 4 내지 14, 4 내지 13, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 18, 5 내지 17, 5 내지 16, 5 내지 15, 5 내지 14, 5 내지 13, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 25 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 18, 6 내지 17, 6 내지 16, 6 내지 15, 6 내지 14, 6 내지 13, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 7 내지 18, 7 내지 17, 7 내지 16, 7 내지 15, 7 내지 14, 7 내지 13, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 8 내지 18, 8 내지 17, 8 내지 16, 8 내지 15, 8 내지 14, 8 내지 13, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 9 내지 18, 9 내지 17, 9 내지 16, 9 내지 15, 9 내지 14, 9 내지 13, 9 내지 12, 9 내지 11, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 10 내지 14, 10 내지 13, 11 내지 18, 11 내지 17, 11 내지 16, 11 내지 15, 11 내지 14, 11 내지 13, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 12 내지 14, 13 내지 18, 13 내지 17, 13 내지 16, 13 내지 15, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 15 내지 18, 15 내지 17, 또는 16 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질에서 a는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제9 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C15)알케닐, -C(O)O(C4-C18)알킬, 및 (C4-C16)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C15)알케닐, -C(O)O(C4-C16)알킬, 및 (C4-C16)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C12)알케닐, -C(O)O(C4-C12)알킬, 및 (C4-C12)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 실시형태의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C10)알케닐, -C(O)O(C4-C10)알킬, 및 (C4-C10)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제10 화학적 실시형태에서, R1은 C10 알케닐이고, 나머지 변수는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
제11 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1의 C(O)O(C2-C20)알킬, -C(O)O(C4-C18)알킬, -C(O)O(C4-C12)알킬 또는 -C(O)O(C4-C10)알킬 중 알킬은 비분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
하나의 화학적 실시형태에서, R1은 -C(O)O(C9 알킬)이다. 대안적으로, 제11 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1의 -C(O)O(C4-C18)알킬, -C(O)O(C4-C12)알킬 또는 -C(O)O(C4-C10)알킬 중 알킬은 분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같다. 하나의 화학적 실시형태에서, R1은 -C(O)O(C17 알킬)이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
제12 화학적 실시형태에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 하기 표 3에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV) 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다. 본 개시내용은 표 4의 R1 기 중 어느 하나와 표 5의 R2 기 중 어느 하나의 조합을 추가로 고려하며, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV) 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
[표 3]
Figure pct00036
제13 화학적 실시형태에서, 화학식 (II)의 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 R2는 하기 표 4에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 화학적 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
[표 4]
Figure pct00037
특정예가 하기 예시 섹션의 표 5에 제공되어 있으며, 이는 화학식 (II)의 양이온성 지질에 대한 본원의 제14 화학적 실시형태의 일부로 포함된다. 약제학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라, 이온화된 형태와 중성 형태도 포함된다.
[표 5]
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
화학식 (V)
일부 양태에서, 양이온성 지질은 화학식 (V) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
[화학식 (V)]
[식 중,
R1과 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
R2와 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
R3과 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4와 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
R5와 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
Ra와 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
제2 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 양이온성 지질에서 R1과 R1'는, 각각 독립적으로, (C1-C6)알킬렌이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제2 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V)의 양이온성 지질에서 R1과 R1'는, 각각 독립적으로, (C1-C3)알킬렌이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제3 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 양이온성 지질은 화학식 (VI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
[화학식 (VI)]
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제4 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 양이온성 지질은 화학식 (VII) 또는 화학식 (VIII), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00045
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제5 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 양이온성 지질은 화학식 (IX) 또는 화학식 (VI), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00046
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제6 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 양이온성 지질은 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00047
Figure pct00048
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (XV)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제7 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5와 R5' 중 적어도 하나는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐(화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)에 대해 기재된 바와 같은 탄소 원자 수)이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5와 R5' 중 하나는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다.
제8 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C26)알킬 또는 (C6-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (I)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C26)알킬 또는 (C6-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C7-C26)알킬 또는 (C7-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C8-C26)알킬 또는 (C8-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 시클로프로필이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C24)알킬 또는 (C6-C24)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 (C8-C24)알킬 또는 (C8-C24)알케닐이며, 여기서 상기 (C8-C24)알킬에는 -C(O)O- 또는 시클로프로필이 선택적으로 개재되고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 (C8-C10)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 시클로프로필이 개재된 (C14-C16)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -C(O)O-이 개재된 (C10-C24)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제16 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 (C16-C18)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5는 -(CH2)3C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)5C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)7C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)7-C3H6-(CH2)7CH3, -(CH2)7CH3, -(CH2)9CH3, -(CH2)16CH3, -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 또는 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고, 나머지 변수는 화학식 (XV)에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제9 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C15-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C17-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C19-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C17-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C19-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C20-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C22-C24)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, R5'는 -(CH2)5C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)5C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2 또는 -(CH2)7C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
또 다른 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VIII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 양이온성 지질은 하기 표 6의 지질 중 임의의 것 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서 선택될 수 있다.
[표 6]
Figure pct00049
화학식 (XV)
일부 양태에서, 양이온성 지질은 화학식 (XV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
[화학식 (XV)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
X1과 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
제2 실시형태에서, 제1 실시형태에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, X1과 X2는 동일하고; 나머지 모든 변수는 화학식 (V) 또는 제1 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제3 실시형태에서, 제1 또는 제2 실시형태에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, X1과 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이거나; X1과 X2는, 각각 독립적으로, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이거나; 또는 X1과 X2는, 각각 독립적으로, -C(=O)O- 또는 -S-S-이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제4 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XVI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XVI)]
[식 중, n은 1, 2, 3 및 4에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제5 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XVII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XVII)]
[식 중, n은 1, 2 및 3에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제6 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XVIII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XVIII)]
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제7 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐, 또는 C1-C5 알킬 또는 C2-C5 알케닐, 또는 C1-C4 알킬 또는 C2-C4 알케닐, 또는 C6 알킬, 또는 C5 알킬, 또는 C4 알킬, 또는 C3 알킬, 또는 C2 알킬, 또는 C1 알킬, 또는 C6 알케닐, 또는 C5 알케닐, 또는 C4 알케닐, 또는 C3 알케닐, 또는 C2 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제8 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XIX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XIX)]
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제9 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R3은 C1-C9 알킬렌 또는 C2-C9 알케닐렌, C1-C7 알킬렌 또는 C2-C7 알케닐렌, C1-C5 알킬렌 또는 C2-C5 알케닐렌, 또는 C2-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌, 또는 C3-C7 알킬렌 또는 C3-C7 알케닐렌, 또는 C5-C7 알킬렌 또는 C5-C7 알케닐렌이거나; R3은 C12 알킬렌, C11 알킬렌, C10 알킬렌, C9 알킬렌, 또는 C8 알킬렌, 또는 C7 알킬렌, 또는 C6 알킬렌, 또는 C5 알킬렌, 또는 C4 알킬렌, 또는 C3 알킬렌, 또는 C2 알킬렌, 또는 C1 알킬렌, 또는 C12 알케닐렌, C11 알케닐렌, C10 알케닐렌, C9 알케닐렌, 또는 C8 알케닐렌, 또는 C7 알케닐렌, 또는 C6 알케닐렌, 또는 C5 알케닐렌, 또는 C4 알케닐렌, 또는 C3 알케닐렌 또는 C2 알케닐렌이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제10 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C4 알킬렌 또는 C2-C4 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나; 또는 R5는 C8 알킬렌, C7 알킬렌, C6 알킬렌, C5 알킬렌, C4 알킬렌, C3 알킬렌, C2 알킬렌, C1 알킬렌, C8 알케닐렌, C7 알케닐렌, C6 알케닐렌, C5 알케닐렌, C4 알케닐렌, C3 알케닐렌 또는 C2 알케닐렌이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제11 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R4는 C1-C14비분지형 알킬, C2-C14비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C2-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R 4 는 C5-C7 비분지형 알킬 또는 C5-C7 비분지형 알케닐이거나; R4는 C16비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 비분지형 알킬, C1 비분지형 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이거나; R4는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C2-C10 비분지형 알킬 또는 C2-C10 비분지형 알케닐이거나; 또는 R4는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 알킬, C1 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제12 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C6-C14 알킬 또는 C6-C14 알케닐이거나; R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C8-C12 알킬 또는 C8-C12 알케닐이거나; 또는 R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C16 알킬, C15 알킬, C14 알킬, C13 알킬, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C16 알케닐, C15 알케닐, C14 알케닐, C13 알케닐, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제13 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R6a와 R6b는 서로 동일한 수의 탄소 원자를 함유하거나; R6a와 R6b는 동일하거나; 또는 R6a와 R6b는 모두 C16 알킬, C15 알킬, C14 알킬, C13 알킬, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C16 알케닐, C15 알케닐, C14 알케닐, C13 알케닐, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제14 실시형태에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 전술한 실시형태 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 R6a와 R6b는 각각 서로 상이한 수의 탄소 원자를 함유하거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 또는 2개의 탄소 원자만큼 다르거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 탄소 원자만큼 다르거나; 또는 R6a는 C7알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C8알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C13 알킬이거나, R6a는 C13 알킬이고 R6a는 C11 알킬 등이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 화학식 (V) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질, 또는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII) 또는 화학식 (XIX)의 양이온성 지질은, 표 7의 지질에서 선택되는 어느 하나의 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[표 7]
Figure pct00059
Figure pct00060
화학식 (XX)
일부 양태에서, 양이온성 지질은 화학식 (XX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
[화학식 (XX)]
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
제2 실시형태에서, 제1 실시형태에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (I) 또는 제1 실시형태에 대해 기재된 바와 같다.
제3 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XXI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XXI)]
[식 중, n은 1, 2, 3 및 4에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음]. 대안적인 제3 실시형태에서, n은 1, 2 및 3에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제4 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XXII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XXII)]
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제5 실시형태에서, 제1 실시형태에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C2 알킬 또는 C2-C3 알케닐이거나; R', R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C2 알킬이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제6 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XXII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XXIII)]
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제7 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C4 알킬렌 또는 C2-C4 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나; 또는 R5는 C8 알킬렌, C7 알킬렌, C6 알킬렌, C5 알킬렌, C4 알킬렌, C3 알킬렌, C2 알킬렌, C1 알킬렌, C8 알케닐렌, C7 알케닐렌, C6 알케닐렌, C5 알케닐렌, C4 알케닐렌, C3 알케닐렌 또는 C2 알케닐렌이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제8 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질은 화학식 (XXIV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
[화학식 (XXIV)]
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제9 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R4는 C1-C14비분지형 알킬, C2-C14비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C2-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C5-C12 비분지형 알킬 또는 C5-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C16비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 비분지형 알킬, C1 비분지형 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이거나; R4는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C2-C10 비분지형 알킬 또는 C2-C10 비분지형 알케닐이거나; 또는 R4는 이며, 여기서 R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 알킬, C1 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제10 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R3은 C3-C8 알킬렌 또는 C3-C8 알케닐렌, C3-C7 알킬렌 또는 C3-C7 알케닐렌, 또는 C3-C5 알킬렌 또는 C3-C5 알케닐렌이거나; R3은 C8 알킬렌 또는 C7 알킬렌 또는 C6 알킬렌 또는 C5 알킬렌 또는 C4알킬렌 또는 C3 알킬렌 또는 C1 알킬렌 또는 C8 알케닐렌 또는 C7 알케닐렌 또는 C6 알케닐렌 또는 C5 알케닐렌 또는 C4 알케닐렌 또는 C3 알케닐렌이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제11 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C12 알킬 또는 C7-C12 알케닐이거나; R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C8-C10 알킬 또는 C8-C10 알케닐이거나; R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제12 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, R6a와 R6b는 서로 동일한 수의 탄소 원자를 함유하거나; R6a와 R6b는 동일하거나; 또는 R6a와 R6b는 모두 C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제13 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 전술한 실시형태 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 R6a와 R6b는 각각 서로 상이한 수의 탄소 원자를 함유하거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 또는 2개의 탄소 원자만큼 다르거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 탄소 원자만큼 다르거나; 또는 R6a는 C7알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C8알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C10 알킬 등이고; 모든 다른 나머지 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV) 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제14 실시형태에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에서, R'는 존재하지 않고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 실시형태 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 양이온성 지질, 또는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV)의 양이온성 지질은, 표 8의 지질에서 선택되는 어느 하나의 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
[표 8]
Figure pct00070
Figure pct00071
특정예가 하기 예시 섹션에 제공되어 있으며, 이는 본원에 기재된 양이온성 또는 이온화 가능한 지질의 일부로 포함된다. 약제학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라, 중성 형태도 포함된다.
절단 가능한 지질
일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)로 전달하는 데 사용될 수 있는 절단 가능한 지질을 통해 LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "절단 가능한 지질"이라는 용어는, 디설파이드 결합("SS") 절단 가능한 단위를 포함하는 양이온성 지질을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, SS-절단 가능한 지질은 막 불안정화를 위해 산성 구획(예를 들어, 엔도솜 또는 리소좀)에 반응하는 3차 아민과, 환원 환경(예를 들어, 세포질)에서 절단될 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. SS-절단 가능한 지질은 SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질, 예컨대 ss-OP 지질, ssPalm 지질, ss-M 지질, ss-E 지질, ss-EC 지질, ss-LC 지질 및 ss-OC 지질 등을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, SS-절단 가능한 지질은 국제 특허출원 공개공보 WO2019188867에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 LNP의 크기는 평균 직경이 약 20 내지 약 70 nm 범위이며, 예를 들어 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 25 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 45 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 65 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm이다. 일부 실시형태에 따르면, LNP의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 70 nm인데, 이는 유의하게 더 작은 크기이기 때문에, 면역반응을 표적화하고 회피하는 데 유리하다. 나아가, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 60% 초과 내지 약 90%를 캡슐화할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 이중가닥 DNA의 약 90% 초과로 캡슐화할 수 있다.
본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는, 다른 공정에 따라 제조된 LNP, 및 다른 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질과 비교하여 표적 세포/조직으로의 핵산(예를 들어, ceDNA, mRNA)의 전달을 증가시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 당업계에 알려진 공정 및 방법으로 제조된 지질 입자와 비교하여 최대 핵산 전달을 제공하였다. 메커니즘이 아직 결정되지 않았지만, 이론에 구애됨 없이, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 식균작용을 피해 간세포로 이동하여 핵으로 더 효율적으로 트래피킹되는 것으로 여겨진다. 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)의 또 다른 이점은, 다른 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들어 MC3과 비교하여 더 나은 내약성을 나타낸다는 점이다.
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 아민 헤드기, 링커기 및 소수성 테일(들)의 3가지 구성요소를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 하나 이상의 페닐 에스테르 결합, 하나 이상의 3차 아미노기 및 디설파이드 결합을 포함한다. 3차 아민기는 pH 반응성을 제공하고 엔도솜 탈출을 유도하며, 페닐 에스테르 결합은 구조의 분해성(자가 분해성)을 증강시키고, 디설파이드 결합은 환원 환경에서 절단된다.
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-OP 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-OP 지질은 하기 화학식 A에 제시된 구조를 포함한다:
지질 A
하나의 실시형태에서, SS-절단 가능한 지질은 SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질(ssPalm)이다. ssPalm 지질은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Togashi et al., Journal of Controlled Release, 279 (2018) 262-270] 참조(상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용됨). 하나의 실시형태에서, ssPalm은 지질 B의 구조를 포함하는 ssPalmM 지질이다.
지질 B
하나의 실시형태에서, ssPalmE 지질은 지질 C의 구조를 포함하는 ssPalmE-P4-C2 지질이다.
지질 C
하나의 실시형태에서, ssPalmE 지질은 지질 D의 구조를 포함하는 ssPalmE-Paz4-C2 지질이다.
지질 D
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-M 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-M 지질은 하기 지질 E에 제시된 구조를 포함한다:
지질 E
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-E 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-E 지질은 하기 지질 F에 제시된 구조를 포함한다:
지질 F
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-EC 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-EC 지질은 하기 지질 G에 제시된 구조를 포함한다:
지질 G
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-LC 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-LC 지질은 하기 지질 H에 제시된 구조를 포함한다:
지질 H
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 ss-OC 지질이다. 하나의 실시형태에서, ss-OC 지질은 하기 지질 J에 제시된 구조를 포함한다:
지질 J
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP) 제형은 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042에 개시된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이는, 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용은 미국 임시출원 제63/194,620호의 실시예 2에 기재된 바와 같은 공정에 따라 제조된 화학식 I의 지질을 포함하는 ceDNA 지질 입자를 제공한다.
일반적으로, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 약 10:1 내지 60:1의 총 지질 대 ceDNA(질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 실시형태에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 60:1, 약 1:1 내지 약 55:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 45:1, 약 1:1 내지 약 40:1, 약 1:1 내지 약 35:1, 약 1:1 내지 약 30:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 약 6:1 내지 약 9:1; 약 30:1 내지 약 60:1 범위일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 약 60:1의 ceDNA(질량 또는 중량) 대 총 지질 비로 제조된다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 약 30:1의 ceDNA(질량 또는 중량) 대 총 지질 비로 제조된다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화하는 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 본원에서 응축제 또는 캡슐화제로도 지칭된다. 비제한적으로, 핵산을 응축 및/또는 캡슐화하는 당업계에 알려진 임의의 화합물은, 이것이 비융합성인 한, 사용될 수 있다. 다시 말해서, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 거의 없거나 없는 작용제. 이론에 구애됨 없이, 응축제는 ceDNA와 같은 핵산을 응축/캡슐화하지 않을 때 어느 정도 융합 활성을 나타낼 수 있지만, 상기 응축제를 이용하여 형성된 핵산 캡슐화 지질 나노입자는 비융합원성일 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP는, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 90% 초과로 캡슐화할 수 있다.
양이온성 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 융합원성을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 양이온성 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. "비융합원성 양이온성 지질"이란, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 없거나 거의 없는 양이온성 지질을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 양이온성 지질은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질의 몰 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 70%(몰), 30%(몰) 내지 60%(몰), 40%(몰) 내지 60%(몰), 40% 내지 55%(몰), 또는 45%(몰) 내지 55%(몰)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 차지한다.
하나의 실시형태에서, SS-절단 가능한 지질은 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)가 아니다. DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. D-Lin-MC3-DMA(MC3)의 구조는 하기에 지질 K로 제시되어 있다:
지질 K
하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 지질 ATX-002가 아니다. 지질 ATX-002는 WO2015/074085에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이 아니다. 화합물 32는 WO2012/040184에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 하나의 실시형태에서, 절단 가능한 지질은 화합물 6 또는 화합물 22가 아니다. 화합물 6과 화합물 22는 WO2015/199952에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
양이온성 지질의 비제한적인 예에는, SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-OP(ss-OP; 화학식 I), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-M(SS-M; 화학식 V), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-E(SS-E; 화학식 VI), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-EC(SS-EC; 화학식 VII), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-LC(SS-LC; 화학식 VIII), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-OC(SS-OC; 화학식 IX), 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민(PAMAM) 별모양(starburst) 덴드리머, 리포펙틴(Lipofectin)(DOTMA와 DOPE의 조합물), 리포펙타아제(Lipofectase), LIPOFECTAMINE™(예를 들어, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, 사이토펙틴(Cytofectin)(Gilead Sciences, Foster City, Calif.) 및 유펙틴(Eufectin)(JBL, San Luis Obispo, Calif.)이 포함된다. 예시적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP), 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB)로부터 제조될 수 있다. 핵산(예를 들어, ceDNA 또는 CELiD)은 또한, 예를 들어 폴리(L-리신) 또는 아비딘과 복합체화될 수 있으며, 지질은 이러한 혼합물, 예를 들어 스테릴-폴리(L-리신)에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.
하나의 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 I의ss-OP이다. 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 화학식 II의 SS-PAZ이다.
하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,158,601호 기재된 양이온성 지질, 또는 미국 특허 제8,034,376호 기재된 바와 같은 폴리아민 화합물 또는 지질을 사용하여 전달된다.
B. 비양이온성 지질
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비양이온성 지질은 융합원성을 증가시키고, 또한 형성 동안 LNP의 안정성을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 비양이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합원성을 증강시키는 데 이용된다.
예시적인 비양이온성 지질에는, 비제한적으로, 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 디아실포스파티딜콜린과 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 지질 내 아실기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일에서 유도된 아실기이다.
지질 입자(예를 들어, LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 LNP)에 사용하기에 적합한 비양이온성 지질의 다른 예에는, 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥시화 지방산 아미드, 디옥타데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등과 같은 인을 함유하지 않는 지질이 포함된다.
하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 인지질이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 DSPC이다. 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질은 DOPC이다. 다른 실시형태에서, 비양이온성 지질은 DOPE이다.
일부 실시형태에서, 비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 20%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0.5%(몰) 내지 15%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 12%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 6%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.0%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.5%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 8.0%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 9.0%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 10%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 11%(몰)이다.
예시적인 비양이온성 지질은 국제 특허출원 공개공보 WO2017/099823 및 미국 특허출원 공개공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 지질 입자의 막 온전성과 안정성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자에 사용될 수 있는 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 또는 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는, 5α-콜레스탄올, 5β-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-히드록시)에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르와 같은 극성 유사체이다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHEMS)이다.
예시적인 콜레스테롤 유도체는 국제 특허출원 공개공보 WO2009/127060 및 미국 특허출원 공개공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
하나의 실시형태에서, 스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 20%(몰) 내지 50%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 30%(몰) 내지 40%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 35%(몰) 내지 45%(몰)이다. 일부 실시형태에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 38%(몰) 내지 42%(몰)이다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 실시형태에서, 접합된 지질 분자는 PEG화 지질, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌글리콜)-접합된 지질이다. 일부 다른 실시형태에서, PEG화 지질은 PEG2000-DMG(디미리스토일글리세롤)이다.
예시적인 PEG화 지질에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
하나의 실시형태에서, PEG-DAA PEG화 지질은, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 하나의 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000],
,
,
, 및
로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, PEG화 지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜n)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE-PEGn, 여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임), N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜n)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEGn, 여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임), DSPE-폴리글리세린시클로헥실카르복실산, DSPE-폴리글리세린-2-메틸글루타르카르복실산, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE) 접합된 폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG-OH), 폴리에틸렌글리콜-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 폴리에틸렌글리콜-디스테아로일글리세롤(PEG-DSG), 또는 N-옥타노일스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000]}(C8 PEG2000 세라미드)로 이루어지는 군에서 선택된다. DMPE-PEG n (여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임)의 일부 예에서, PEG-지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE-PEG2000)이다. DSPE-PEG n (여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임)의 일부 예에서, PEG-지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG2000)이다. 일부 실시형태에서, PEG-지질은 DSPE-PEG-OH이다. 일부 바람직한 실시형태에서, PEG-지질은 PEG-DMG이다.
일부 실시형태에서, 접합된 지질, 예를 들어 PEG화 지질은 조직 특이적 표적화 리간드, 예를 들어 제1 또는 제2 표적화 리간드를 포함한다. 예를 들어, GalNAc 리간드와 접합된 PEG-DMG.
하나의 실시형태에서, PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은 국제 특허출원 공개공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282, 미국 특허출원 공개공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453, 및 미국 특허 US5,885,613호, US6,287,591호, US6,320,017호 및 US6,586,559호에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에서, PEG화 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 20%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 0.5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 1%(몰) 내지 5%(몰)이다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 2%(몰) 내지 4%(몰)이다. 일부 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 2%(몰) 내지 3%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 약 2%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 약 2.5%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 약 3%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 약 3.5%(몰)이다. 하나의 실시형태에서, PEG화 지질 함량은 약 4%(몰)이다.
양이온성 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질과, 비양이온성 지질, 스테롤 및 PEG화 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다고 이해된다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 30% 내지 70%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 60%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 30%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화 지질을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 50%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG 또는 접합된 지질을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60% 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 40%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화 지질이다. 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 60% 내지 70%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 25% 내지 35%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10% 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화 지질을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 또한 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 최대 45% 내지 55%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 35% 내지 45%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화 지질을 함유할 수 있다. 상기 제형은 또한, 예를 들어 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 8% 내지 30%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 0% 내지 40%의 콜레스테롤; 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25% 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 10% 내지 35%의 접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 35%의 PEG화 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 20%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 심지어 최대 90%의 양이온성 지질과 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 10%의 비양이온성 지질, 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 심지어 100%의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 입자 제형은 양이온성 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:9:38.5:2.5의 몰비로 포함한다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 양이온성 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:7:40:3의 몰비로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 양이온성 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 포함하며, 여기서 양이온성 지질의 몰비는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 60 몰%임)이고, 비양이온성 지질의 몰%는 0 몰% 내지 30 몰% 범위(여기서, 목표는 0 몰% 내지 15 몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 50 몰%임)이고, PEG화 지질(접합된 지질)의 몰%는 1 몰% 내지 6 몰% 범위(여기서, 목표는 2 몰% 내지 5 몰%임)이다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용되고, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.
지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 크기는 Malvern Zetasize Nano ZS(Malvern, UK)를 사용하여 준탄성 광산란에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 광산란에 의해 측정된 LNP 평균 직경은 약 75 nm 미만 또는 약 70 nm 미만이다. 일부 실시형태에 따르면, 광산란에 의해 측정된 LNP 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 75 nm 또는 약 50 nm 내지 약 70 nm이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 하나의 실시형태에서, 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 술폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. PBS 중에 총 지질 농도 0.4 mM로 양이온성 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5(몰%))을 포함하는 지질 나노입자는, 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 인라인(in-line) 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중에 100 mM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 완충액 2 mL 중에 24 mM 지질로 희석될 수 있으며, 여기서 pH는 2.5 내지 11 범위이다. TNS 용액의 분취액을 첨가하여 최종 농도 1 mM을 제공하고, 볼텍싱 혼합 후, 실온에서 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계로 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 광도를 측정한다. 시그모이드 최적합(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 최대 형광 강도의 절반이 되는 pH로 측정한다.
하나의 실시형태에서, 상대 활성은 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 4시간 후 간에서의 루시퍼라아제 발현을 측정하여 결정할 수 있다. 활성을 0.3 및 1.0 mg ceDNA/kg 용량에서 비교하고, 투여 4시간 후에 측정된 루시퍼라아제 ng/간 g으로 표시한다.
비제한적으로, 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다. 일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터와, 양이온성 지질 또는 이의 염을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 양이온성 지질/비양이온성 지질/스테롤/접합된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다.
III. 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터
본 개시내용의 실시형태는 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산(TNA))를 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체(ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대체물을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
ceDNA 벡터는 바람직하게는 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다. 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 실시형태이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성하지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남아있을 가능성이 있다. 일부 실시형태에서, ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 대상을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법의 측면에서, 또한 ceDNA-플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.
공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 이러한 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자는 2개의 상이한 역말단반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자(예를 들어, 전이유전자, 특히 치료용 전이유전자)를 함유하는 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큘로바이러스 또는 통합된 세포주)로부터의 허용 숙주세포에서 생산될 수 있으며, 여기서 ITR은 서로 상이하다. 일부 실시형태에서, ITR 중 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이며; ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위(trs)와 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이며, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.
하나의 양태에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로 비대칭이며, 즉, 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 실시형태로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 변형된 것이지만, 상이한 서열이거나, 상이한 변형을 갖거나, 또는 동일한 변형된 ITR이 아니며, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 갖는다.
하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록, 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR(예를 들어, mod-ITR)일 수 있다. mod-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 하나의 실시형태에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)일 수 있다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 하나의 실시형태에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.
본원에 제공된 야생형 또는 돌연변이된 또는 달리 변형된 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 작제물(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큘로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다. 따라서, ceDNA-플라스미드 또는 다른 발현 구조체로부터 생산된 ceDNA 벡터에 실제로 함유된 ITR 서열은, 생산 과정 동안 일어나는 자연 발생적인 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로, 본원에 제공된 ITR 서열과 동일할 수도 동일하지 않을 수도 있다.
하나의 실시형태에서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 갖는 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 전이유전자의 발현을 가능하게 하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열을 포함하고, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열은 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열에 의해 플랭킹되어 있으며, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 서로 비대칭이거나 서로 대칭이다.
하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사 후 조절 요소, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함하는 2개의 ITR 사이에 위치한다. 하나의 실시형태에서, 프로모터는 조절 가능하며, 즉 유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 전이유전자의 전사를 용이하게 하는 임의의 서열일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 프로모터는 CAG 프로모터 또는 이의 변이체이다. 전사 후 조절 요소는 전이유전자의 발현을 조절하는 서열, 비제한적인 예로서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자의 발현을 증강시키는 3차 구조를 형성하는 임의의 서열이다.
하나의 실시형태에서, 전사 후 조절 요소는 WPRE를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 폴리아데닐화 및 종결 신호는 BGHpolyA를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 시스 조절 요소 또는 이의 조합, 예를 들어 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서 서열(USE), 또는 비제한적으로, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 다른 전사 후 처리 요소가 추가로 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 5'→3' 방향으로의 발현 카세트 길이는, AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 알려진 최대 길이보다 더 크다. 하나의 실시형태에서, 상기 길이는 4.6 kb 초과, 또는 5 kb 초과, 또는 6 kb 초과, 또는 7 kb 초과이다. 다양한 발현 카세트가 본원에 예시된다.
하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 75,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 길이가 1000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 5,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 숙주로 전달할 수 있다. 하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.
하나의 실시형태에서, 강성 치료용 핵산은 플라스미드일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적을 위해(예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도로) 또는 면역원성 폴리펩타이드를 위해 사용된다.
발현 카세트는 치료용 핵산 서열인 임의의 전이유전자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, ceDNA 벡터는 대상에서의 임의의 관심 유전자를 포함하며, 이러한 관심 유전자에는, 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
하나의 실시형태에서, ceDNA 발현 카세트는, 예를 들어 수용 대상에 존재하지 않거나, 이에서 불활성이거나 불충분한 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열(예를 들어, 오픈리딩프레임), 또는 목적하는 생물학적 또는 치료 효과를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 공여체 서열과 같은 외인성 서열은 결함 유전자 또는 전사체의 발현을 교정하는 기능을 할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 또한 교정 DNA 가닥을 인코딩하고, 폴리펩타이드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 및 이들의 안티센스 대응물(예를 들어, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트는 또한, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 알려진 다른 것들과 같은, 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 존재하지 않거나 감소된 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA를 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 유익을 전달하는 것이 본 개시내용의 범위에 속하는 것으로 간주되는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 뉴클레아제에 의해 제공되는 이중가닥 절단부(또는 닉) 이후에 삽입되게 되는 교정 DNA 가닥으로 사용되는 주형 또는 공여체 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 가이드 RNA 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 제공되는 이중가닥 절단부(또는 닉) 이후에 삽입되게 되는 교정 DNA 가닥으로 사용되는 주형 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
IV. 치료용 핵산
본 개시내용의 양태는 일반적으로 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 scFv를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 scFv를 포함하고, scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 말레이미드 접합을 통해 LNP에 연결되어 있는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 예시적인 치료용 핵산은, 비제한적으로, 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA("미니스트링"), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향조절할 수 있는 siRNA 또는 miRNA가 또한 본 개시내용에서 핵산 치료제로 고려된다. siRNA 또는 miRNA가 숙주세포의 세포질에 도입된 후, 이러한 이중가닥 RNA 작제물은 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체에 의해 제거된다. RISC 복합체는, 상보적 mRNA와 조합될 때, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 mRNA의 특이적 파괴를 유도하여, 상응하는 단백질을 하향조절한다.
단백질로의 mRNA 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 리보자임은 핵산 치료제일 수 있다. 안티센스 작제물의 경우, 이러한 단일가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 가지며, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 mRNA에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 방지하고/하거나 mRNA 전사체의 RNaseH 분해를 촉발시킨다. 그 결과, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 작용의 특이성(즉, 특정 질환 관련 단백질의 하향조절)이 증가되었다.
본원에 제공된 임의의 양태 및 실시형태에서, 치료용 핵산은 치료용 RNA일 수 있다. 상기 치료용 RNA는 mRNA 번역의 저해제, RNA 간섭 작용제(RNAi), 촉매 활성 RNA 분자(리보자임), 전달 RNA(tRNA), 또는 mRNA 전사체에 결합하는 RNA(ASO) 또는 단백질이나 다른 분자 리간드에 결합하는 RNA(압타머)일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, RNAi 작용제는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로-RNA, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
변성된 치료용 핵산
본 개시내용의 양태는 지질 입자와 변성된 치료용 핵산(TNA)(여기서 TNA는 상기 정의된 바와 같음)을 포함하는 약제학적 조성물(예를 들어, 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물))로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
하나의 실시형태에서, 변성된 TNA는 폐쇄형 DNA(ceDNA)이다. "변성된 치료용 핵산"이라는 용어는, 입체형태가 표준 B형 구조로부터 변경된 부분적인 또는 전체적인 TNA를 나타낸다. 입체형태 변화는 2차 구조(즉, 단일 핵산 분자 내 염기쌍 상호작용)의 변화 및/또는 3차 구조(즉, 이중 나선 구조)의 변화를 포함할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 알코올/물 용액 또는 순수한 알코올 용매로 처리된 TNA가, LNP에 의한 캡슐화 효율을 증강시키고 직경 크기가 더 작은(즉, 75 nm 미만, 예를 들어, 직경 평균 크기 약 68 nm 내지 74 nm) LNP 제형을 생성하는 입체형태로 핵산을 변성시킨다고 여겨졌다. 본원에 기재된 모든 LNP 평균 직경 크기와 크기 범위는 변성된 TNA를 함유하는 LNP에 적용된다.
DNA가 수성 환경에 있는 경우, 각각의 완전한 나선형 회전에 10.4개의 염기쌍이 있는 B형 구조를 갖는다. 메탄올과 같은 중간 정도로 덜 극성인 알코올의 첨가에 의해 이러한 수성 환경이 점진적으로 변경되는 경우, 나선의 꼬임이 완화되어, 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해 가시화되는 바와 같이, DNA가 나선형 회전당 10.2개의 염기쌍만을 갖는 형태로 순조롭게 변경된다. 하나의 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물 내 변성된 TNA는 10.2형 구조를 갖는다.
이러한 거동과 대조적으로, 물이 에탄올과 같은 약간 덜 극성인 알코올로 대체되는 경우, 물의 약 65%가 에탄올로 대체될 때까지만, 동일한 유형의 입체형태 변화가 일어날 것이다. 이 시점에서, DNA는, CD에 의해 가시화되는 바와 같이, 나선형 회전당 11개 염기쌍을 함유하는 더 단단하게 꼬인 나선을 갖는 A형 구조로 갑자기 변경된다. 하나의 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물 내 변성된 TNA는 A형 구조를 갖는다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 제공된 약제학적 조성물 내 변성된 TNA는 투과 전자 현미경검사법(TEM)으로 가시화될 때 막대형 구조를 갖는다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 제공된 약제학적 조성물 내 변성된 TNA는 투과 전자 현미경검사법(TEM)으로 가시화될 때 원형 구조를 갖는다. 이에 비해, 변성되지 않은 TNA는 가닥형 구조를 갖는다.
V. ceDNA 벡터의 생산
본 개시내용의 실시형태는 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대체물을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 생산 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996의 섹션 IV에 기재되어 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큘로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다.
하기는 비제한적인 예로 제공된다.
일부 실시형태에 따르면, 합성 ceDNA는 이중가닥 DNA 분자로부터의 절단을 통해 생성된다. ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 구조체를 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 실시형태에서, 이중가닥 DNA 작제물은 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).
일부 실시형태에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 구조체는 전이유전자의 발현을 조절하는 추가 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 조절하는 조절 스위치, 또는 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다.
분자 조절 스위치는 신호에 반응하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 전이유전자의 발현 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 ceDNA 벡터와 유용하게 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 미세조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생물학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA 벡터에서 관심 유전자의 발현을 개시 또는 중단(즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 실시형태에서, 상기 스위치는 스위치가 활성화되면 합성 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포의 프로그래밍된 사멸을 거치도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는, 전이유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 이는 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 보다 충분히 논의되어 있으며, 본원에 기재되어 있다.
다양한 올리고뉴클레오타이드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 11b는, 5' ITR 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법이 PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 실시예 4에 제공되어 있으며, 이는 센스 발현 카세트 서열을 플랭킹하고, 안티센스 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 안티센스 ITR에 공유결합으로 부착된 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일가닥 선형 DNA를 사용하며, 이러한 단일가닥 선형 DNA의 말단을 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에 사용하기 위해 본원에 기재된 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주를 제공한다. 이러한 세포주를 생산하는 방법은 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 예를 들어, Rep 단백질은 약 3의 MOI로 숙주세포에 첨가된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포주는 무척추동물 세포주, 바람직하게는 곤충 Sf9 세포이다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 바람직하게는 293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.
임의의 프로모터가 벡터 폴리뉴클레오타이드의 이종 핵산(예를 들어, 리포터 핵산 또는 치료용 전이유전자)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 카세트는 CAG 프로모터와 같은 합성 조절 요소를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터, 간 특이적(LP1) 프로모터 또는 인간 신장 인자-1 알파(EF1-α) 프로모터를 함유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 카세트에는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)가 포함된다. 대안적으로, 유도성 또는 억제성 프로모터, 전이유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 당업계에 알려진 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 전이유전자는 당업자에게 널리 알려져 있다.
캡시드 미함유 ceDNA 벡터는 또한, 비제한적으로, 우드척 간염바이러스(Woodchuck hepatitis virus) 전사 후 조절 요소(WPRE) 및 BGH polyA, 또는 예를 들어 베타-글로빈 polyA를 포함하는 시스-조절 요소, 또는 시스-조절 요소들의 조합을 추가로 포함하는 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체로부터 생성될 수 있다. 다른 전사 후 처리 요소에는, 예를 들어 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)가 포함된다. 발현 카세트는 당업계에 알려진 임의의 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 소 BGHpA 또는 바이러스 SV40pA에서 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. USE는 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합으로 사용될 수 있다.
상기 세포에서 본원에 기재된 DNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존능, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 세포를 충분한 조건 하에서 성장시키고, 바큘로바이러스 감염 후 DNA 벡터를 생산하기에 충분한 시간이지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 알려진 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 실시형태에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
하나의 실시형태에서, 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 외인성 DNA의 발현 카세트) 및 변형된 AAV ITR을 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형을 포함하는 플라스미드를 포함하거나 이로부터 수득되며, 여기서 상기 주형 핵산 분자에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 주형에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 실시형태에서, 주형 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 핵산 분자에는 기능성 AAV cap 유전자와 AAV rep 유전자 둘 모두가 없다.
하나의 실시형태에서, ceDNA는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR에 대해 돌연변이되었지만, 여전히 작동 가능한 RBE, TRS 및 RBE' 부분을 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다.
ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 ceDNA 벡터의 이후의 생산에 사용되는 플라스미드이다. 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음과 같은 요소를 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성요소로서 제공하기 위해 알려진 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 변형된 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 변형된 3' ITR 서열(여기서, 3' ITR 서열은 5' ITR 서열에 대칭임). 일부 실시형태에서, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 본원에 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' ITR과 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 보체 또는 대칭임).
하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3', 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 알려진 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈, 예를 들어 NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261(Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses, Springer에서 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)에서 유도된다. 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5' 및 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
하나의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin) 등일 수 있다.
VI. 지질 입자의 제조
지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 ceDNA와 지질(들)의 혼합 시 자발적으로 형성될 수 있다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 예를 들어 Lipex 압출기(Northern Lipids, Inc)와 같은 써모배럴(thermobarrel) 압출기를 사용하여 생성된 나노입자 혼합물을 막을 통해 압출할 수 있다(예를 들어, 100 nm 컷오프). 일부 경우에, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거와 동시 완충액 교환은, 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 달성될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 지질 나노입자는 미국 임시출원 제63/194,620호의 실시예 3에 기재된 바와 같이 형성된다.
일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 예를 들어 US2013/0037977, US2010/0015218, US2013/0156845, US2013/0164400, US2012/0225129 및 US2010/0130588에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 문헌들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 일부 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 연속 혼합 방법, 직접 희석 방법, 또는 인라인 희석 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 직접 희석 및 인라인 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 US2007/0042031에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 단계적 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 US2004/0142025에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 DNA 벡터(본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 포함)와 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042에 개시된 바와 같은 공정에 따라 수득된 ceDNA와 같은 치료용 핵산으로 제조되고 로딩된 지질 나노입자 제형(상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 충돌 제트(impinging jet) 방법에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, 알코올(예를 들어, 에탄올)에 용해된 지질을, 완충액, 예를 들어 시트르산염 완충액, 아세트산소듐 완충액, 아세트산소듐과 염화마그네슘 완충액, 말산 완충액, 말산과 염화소듐 완충액, 또는 시트르산소듐과 염화소듐 완충액에 용해된 ceDNA와 혼합하여 입자를 형성한다. 지질 대 ceDNA의 혼합 비는 약 45% 내지 55%의 지질과 약 65% 내지 45%의 ceDNA이다.
지질 용액은 양이온성 지질(예를 들어, 이온화 가능한 양이온성 지질), 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질, 예컨대 DSPC, DOPE 및 DOPC), PEG 또는 PEG 접합된 분자(예를 들어, PEG-지질), 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을, 알코올, 예를 들어 에탄올 중에 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 보다 가능성 있게는 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 가장 가능성 있게는 9 mg/mL 내지 12 mg/mL의 총 지질 농도로 함유할 수 있다. 지질 용액에서, 지질의 몰비는 양이온성 지질의 경우 약 25% 내지 98%, 바람직하게는 약 35% 내지 65%; 비이온성 지질의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 0% 내지 12%; PEG 또는 PEG 접합된 지질 분자의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 1% 내지 6%; 및 스테롤의 경우 약 0% 내지 75%, 바람직하게는 약 30% 내지 50% 범위일 수 있다.
ceDNA 용액은 pH가 3.5 내지 5 범위인 완충 용액 중에 0.3 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 바람직하게는 0.3 mg/mL 내지 0.9 mg/mL 범위의 농도로 ceDNA를 포함할 수 있다.
LNP 형성의 경우, 하나의 예시적인 비제한적인 실시형태에서, 2개의 지질을 약 15℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지40℃ 범위의 온도까지 가열한 후, 예를 들어 충돌 제트 혼합기에서 혼합하여 즉시 LNP를 형성한다. 혼합 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분 범위일 수 있다. 튜브 ID는 0.25 mm 내지 1.0 mm 범위일 수 있고, 총 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분일 수 있다. 유량과 튜브 ID의 조합은 LNP의 입자 크기를 30 nm 내지 200 nm로 제어하는 효과를 나타낼 수 있다. 이어서, 용액을 더 높은 pH에서 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위, 바람직하게는 약 1:2 vol:vol의 혼합비로 완충 용액과 혼합할 수 있다. 필요한 경우, 이러한 완충 용액은 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위의 온도에 있을 수 있다. 이어서, 혼합된 LNP를 음이온 교환 여과 단계에 적용시킬 수 있다. 음이온 교환 전, 혼합된 LNP를 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 동안의 온도는 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다. 인큐베이션 후, 필터, 예컨대 0.8 μm 필터를 통해 용액을 여과한다(음이온 교환 분리 단계 포함). 이러한 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜브 ID와 10 mL/분 내지 2000 mL/분의 유량을 사용할 수 있다.
형성 후, LNP를 농축시키고, 알코올을 제거하고, 완충액을 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4의 최종 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 교환하는 한외여과 공정을 통해 투석여과할 수 있다.
한외여과 공정은 30 kD 내지 500 kD 범위의 막 공칭 분자량 컷오프를 사용하는 접선 유동 여과 형식(TFF)을 사용할 수 있다. 막 형식은 중공 섬유 또는 평판 카세트이다. 적절한 분자량 컷오프를 이용한 TFF 공정은 잔류물에 LNP를 보유할 수 있고, 여과액 또는 투과물에는 알코올; 시트레이트 완충액 및 최종 완충액 폐기물이 함유되어 있다. TFF 공정은 초기 농도에서 1 mg/mL 내지 3 mg/mL의 ceDNA 농도까지의 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 용액을 최종 완충액에 대해 10 부피 내지 20 부피로 투석여과하여 알코올을 제거하고, 완충액 교환을 수행한다. 이어서, 물질을 1배 내지 3배 추가로 농축시킬 수 있다. 농축된 LNP 용액을 멸균여과할 수 있다.
VII. 약제학적 조성물 및 제형
지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 scFv를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 하나의 양태에 따르면, 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 하나의 양태에 따르면, 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 공유결합으로 연결되어 있는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 하나의 양태에 따르면, 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되며, scFv는 LNP에 비공유결합으로 연결되어 있는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에 따르면, TNA(예를 들어, ceDNA)는 지질에 캡슐화되어 있다. 하나의 실시형태에서, TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 치료용 핵산의 완전 캡슐화, 부분 캡슐화를 제공한다. 하나의 실시형태에서, 핵산 치료제는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 완전히 캡슐화되어 핵산 함유 지질 입자를 형성한다. 하나의 실시형태에서, 핵산은 입자의 지질 부분 내에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다.
(예를 들어, 지질 나노입자)의 의도된 용도에 따라, 구성요소의 비율이 달라질 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은, 예를 들어 엔도솜 방출 매개변수(ERP) 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 응집을 방지하기 위해 다른 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG-지질 접합체, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, PCT 공개공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 실시형태에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
하나의 실시형태에서, TNA(예를 들어, ceDNA)는 입자의 지질 부분과 복합체를 형성하거나 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에 캡슐화될 수 있다. 하나의 실시형태에서, TNA는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후, 실질적으로 분해되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA는 상기 입자를 혈청에서 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 또는 36시간 동안 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 치료용 핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 양이온성 지질로 형성될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 비양이온성 지질로 형성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 입자는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 치료용 핵산을 포함하는 양이온성 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다: mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서 기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA").
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 지질 입자는 비양이온성 지질과, 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자 제형은 수용액이다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 1종 이상의 약제학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 입자 제형을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 수크로오스, 트리스(tris), 트레할로오스, 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 목적하는 치료 투여 경로(예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적의 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 멸균 여과하는 방식으로 제조될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 입자는 국소, 전신, 양막내, 척수강내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 척수강내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 기질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 경구, 직장, 비강) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 형질도입이 또한 고려된다.
TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 핵산 내 전이유전자를 수용체의 세포로 전달하여 그 안에서 전이유전자의 치료적 발현을 유도하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 멸균 여과하는 방식으로 제조될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 비(non)이중층 구조, 즉, 비(non)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 비라멜라 형태(즉, 비이중층 구조)는 당업자에게 알려져 있고 당업자에 의해 사용되는 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 기술에는, 비제한적으로, 저온 투과 전자 현미경검사법(Cryo-Transmission Electron Microscopy)("Cryo-TEM"), 시차 주사 열량측정법("DSC"), X-선 회절 등이 포함된다. 예를 들어, 지질 입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
하나의 실시형태에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 전자 밀도가 높다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다. 지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
하나의 실시형태에서, 제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 하나의 실시형태에서, pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 하나의 실시형태에서, 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 술폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 결정될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA(예를 들어, ceDNA)의 캡슐화는, 핵산과 회합될 때 형광이 증강되는 염료를 사용하는 막 불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 Oligreen® 검정 또는 PicoGreen® 검정을 수행하는 방식으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비이온성 세제의 첨가 시 관찰된 형광과 비교하는 방식으로 결정된다. 지질 이중층의 세제 매개 파괴는 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 방출하여, 막 불투과성 염료와의 상호작용을 가능하게 한다. ceDNA의 캡슐화는 다음과 같이 계산될 수 있다: E= (Io - I)/Io(여기서, I와 Io는 세제 첨가 전후의 형광 강도를 나타냄).
일부 실시형태에 따르면, 안과용 전달을 위해, 간섭 RNA-리간드 접합체와 나노입자-리간드 접합체는 수성 멸균 안과용 현탁액 또는 용액을 형성하기 위해 안과적으로 허용 가능한 보존제, 공용매, 계면활성제, 점도 증강제, 흡수 촉진제, 완충제, 염화소듐 또는 물과 조합될 수 있다.
단위 투여량
하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 단위 투여 형태는 척추강내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.
VIII. 치료 방법
지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(예를 들어, 여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 세포에 핵산 서열(예를 들어, TNA)에 도입하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 약제학적 조성물은 진단 방법에 사용될 수 있다.
대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 LNP에 연결된 scFv를 포함하고, scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)의 치료적 유효량을 상기 대상의 치료를 필요로 하는 표적 세포(예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 또는 다른 영향을 받은 세포 유형)에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 종양 세포인 방법이 본원에 제공된다.
따라서, 일부 양태에 따르면, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 방법에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "암"이라는 용어는 주변 조직을 침범하여 새로운 신체 부위로 전이되는 경향이 있는 역형성 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 악성 신생물 중 임의의 것을 나타내며, 또한 이러한 악성 신생물성 성장을 특징으로 하는 병리학적 병태를 나타낸다. 암은 국소화된 것(예를 들어, 고형 종양)일 수도 있고 전신적일 수도 있다. 본 개시내용의 맥락에서, "국소화된"("국소화된 종양"에서와 같이)은, 전신 질환과 대조적으로 해부학적으로 단리되어 있거나 단리 가능한 비정상, 예컨대 고형 악성종양을 나타낸다. 예를 들어, 특정 백혈병(예를 들어, 골수섬유증) 및 다발성 골수종과 같은 특정 암은 질환에 대한 국소화된 구성요소(예를 들어, 골수)와 전신 구성요소(예를 들어, 순환 혈액 세포)가 모두 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액학적 악성종양과 같이 전신적일 수 있다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 암에는, 비제한적으로, 모든 유형의 림프종/백혈병, 암종 및 육종, 예컨대 항문, 방광, 담관, 뼈, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장/직장, 자궁내막, 식도, 눈, 담낭, 두경부, 간, 신장, 후두, 폐, 종격동(가슴), 입, 난소, 췌장, 음경, 전립선, 피부, 소장, 위, 척수, 꼬리뼈, 고환, 갑상선 및 자궁에서 발견되는 암 또는 종양이 포함된다. 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 암종의 유형에는, 비제한적으로, 유두종/암종, 융모막암종, 내배엽동 종양, 기형종, 선종/선암종, 흑색종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 횡문근종, 중피종, 혈관종, 골종, 연골종, 신경교종, 림프종/백혈병, 편평세포 암종, 소세포 암종, 거대세포 미분화 암종, 기저세포 암종 및 부비동 미분화 암종이 포함된다. 육종의 유형에는, 비제한적으로, 연조직 육종, 예컨대 폐포 연부 육종, 혈관육종, 피부섬유육종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소형 원형세포 종양, 골격외 연골육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 림프육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 윤활막 육종, 아스킨 종양(Askin's tumor), 유잉 육종(Ewing's sarcoma)(원시 신경외배엽 종양), 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종 및 연골육종이 포함된다.
TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자는 당업계에 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 표적 세포는 인간 대상에 있다.
LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 진단적 또는 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법으로서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 일정량을, ceDNA 벡터로부터 전이유전자의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안, 이를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에 제공하는 방식으로 LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 진단적 또는 치료적 유효량을 상기 대상에게 제공하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 실시형태에서, 대상은 인간이다.
질환의 하나 이상의 증상 또는 질환 상태를 치료하거나 감소시키기 위해, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)을 사용하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 결함이 있는 유전자가 알려진 다수의 유전 질환이 존재하며, 이는 전형적으로 2개의 부류로 분류된다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질이 관여할 수 있으며, 전형적으로 우성 방식으로 유전되지만, 항상 우성 방식으로 유전되는 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 질환 상태의 경우, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 대체 요법을 위해 정상 유전자를 영향을 받은 조직으로 가져오도록 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있을 뿐 아니라, 일부 실시형태에서는, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 질환 상태는, 질환을 유발하거나 이를 더 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선하는 방식으로 치료된다.
일반적으로, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 개선하기 위해 상기 설명에 따라 임의의 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태에는, 비제한적으로, 낭포성 섬유증(및 다른 폐의 질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 다른 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증, 뇌전증, 및 다른 신경계 장애, 암, 진성 당뇨병, 근디스트로피(예를 들어, 뒤시엔느(Duchenne)형, 베커(Becker)형), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나아제 결핍증, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환(및 다른 눈의 질환), 미토콘드리아병증(예를 들어, 레버 유전성 시신경 위축증(LHON: Leber's hereditary optic neuropathy), 리증후군(Leigh syndrome), 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예를 들어, 안면견갑상완 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 기관(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환 등이 포함된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증)을 앓고 있는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 유전자 또는 유전자 산물의 돌연변이에 의해 유발된 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 개선하고/하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애에는, 비제한적으로, 암 및 종양, 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병(Fabry disease), 고셰병(Gaucher disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐축적질환); 요소회로 질환 또는 장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예를 들어, 이염성 백질디스트로피(MLD), 점액다당류증 II형(MPSII; 헌터증후군(Hunter syndrome))); 간 질환 또는 장애(예를 들어, 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC)); 혈액 질환 또는 장애(예를 들어, 혈우병(A형 및 B형), 지중해빈혈 및 빈혈); 및 유전 질환 또는 장애(예를 들어, 낭포성 섬유증)가 포함된다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 전이유전자 발현(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 호르몬 또는 성장인자를 인코딩하는 전이유전자)의 수준을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오타이드 서열을 전달하는 데 이용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 질환 또는 장애를 유발하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예를 들어, 단백질의 부재 또는 결함)을 교정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 지질 나노입자 내 ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질 수준을 변경시켜, 단백질의 부재 또는 결함에 의해 유발되는 특정 질환 또는 장애로 인해 발생한 증상을 완화 또는 감소시키거나, 이러한 질환 또는 장애에 유익을 부여할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍증의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; PKU의 치료는 페닐알라닌 히드록실라아제 효소의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; 파브리병 또는 고셰병의 치료는, 각각, 기능성 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; MFD 또는 MPSII의 치료는, 각각, 기능성 아릴설파타아제 A 또는 이두로네이트-2-설파타아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 낭포성 섬유증의 치료는 기능성 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 글리코겐 축적질환의 치료는 기능성 G6Pase 효소 기능을 회복시키는 방식으로 달성될 수 있고; PFIC의 치료는 기능성 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성하는 방식으로 달성될 수 있다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 시험관내 또는 생체내 세포에 RNA 기반 치료제를 제공하는 데 사용될 수 있다. RNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. 예를 들어, 하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 시험관내 또는 생체내 세포에 안티센스 핵산을 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 RNAi 분자인 경우, 표적 세포 내 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, 특정 단백질 발현의 감소를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 전이유전자가 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화시키기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)은 시험관내 또는 생체내 세포에 DNA 기반 치료제를 제공하는 데 사용될 수 있다. DNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다.
하나의 실시형태에서, ceDNA와 같은 TNA 벡터에 의해 인코딩되는 예시적인 전이유전자에는, 비제한적으로, 리소좀 효소(예를 들어, 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)과 연관된 헥소사미니다아제 A, 또는 헌터증후군/MPS II와 연관된 이두로네이트 설파타아제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제뿐 아니라, 사이토카인(예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-12, 과립구-대식세포 집락자극인자, 림프독소 등), 펩타이드 성장인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자-1 및 2, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 표피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 신경성장인자(NGF), 신경영양인자-3 및 4, 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 신경교 유래 성장인자(GDNF), 형질전환 성장인자-α 및 -β, 등), 수용체(예를 들어, 종양괴사인자 수용체)가 포함된다. 일부 예시적인 실시형태에서, 전이유전자는 하나 이상의 목적하는 표적에 특이적인 단클론 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 하나 초과의 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 실시형태에서, 전이유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 전이유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나아제, 사이토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제 및 종양괴사인자), 암 치료에 사용되는 약물에 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.
투여
하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 지질 나노입자(LNP)와 치료용 핵산(TNA)을 포함하는 약제학적 조성물은, 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, TNA는 생체외 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다.
일반적으로, 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 임의의 경로를 통해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다. LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 예시적인 투여 방식에는, 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척추강내, 안구내, 경피, 내피내, 자궁내(또는 알내(in ovo)), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내[골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면, 및 경피 투여), 림프내 등뿐 아니라, (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장근, 횡격막근 또는 뇌에의) 직접적인 조직 또는 기관 주사가 포함된다.
LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 투여는, 비제한적으로, 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다.
하나의 실시형태에서, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)의 투여는 종양에(예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처에) 이루어진다.
임의의 소정의 경우에서 가장 적합한 경로는 치료하고/하거나 개선하고/하거나 예방하고자 하는 병태의 특성 및 중증도에 따라, 그리고 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 특정 ceDNA(예를 들어, ceDNA 지질 나노입자)의 특성에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나 초과의 전이유전자를 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)로 투여하는 것을 가능하게 한다.
하나의 실시형태에서, 골격근에의 ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))의 투여는, 비제한적으로, 사지(예를 들어, 상완(upper arm), 하완(lower arm), 상각(upper leg) 및/또는 하각(lower leg)), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음, 및/또는 손(발)가락의 골격근에의 투여를 포함한다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어 문헌[Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자)는 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류에 의해(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해) 대상(예를 들어, DMD와 같은 근디스트로피를 앓고 있는 대상)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 "유체역학적" 기술을 이용하지 않고 투여될 수 있다.
심장근에의 ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))의 투여는, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격으로의 투여를 포함한다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 정맥내 투여, 동맥내 투여(예컨대, 대동맥내 투여), 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실), 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장근에 전달될 수 있다. 횡격막근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 하나의 실시형태에서, 투여는 평활근에, 근처에 및/또는 위에 존재하는 내피세포에 이루어질 수 있다.
하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 근디스트로피 또는 심장질환(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 예방하기 위해 골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에 투여된다.
ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과체), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌, 및 하구(inferior colliculus)에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 (예를 들어, 요추천자에 의해) 뇌척수액에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 나아가 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내 투여될 수 있다.
하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는, 비제한적으로, 척추강내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강내, 이내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon's region)) 전달뿐 아니라, 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하는, 당업계에 알려진 임의의 경로를 통해 CNS의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 직접 주사(예를 들어, 정위주사)를 통해 액체 제형으로 CNS 내 목적하는 영역 또는 구획에 투여된다. 다른 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함)))는 목적하는 영역에의 국소 적용 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여를 통해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 액적의 국소 적용을 통해 이루어질 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조). 하나의 실시형태에서, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 운동 뉴런과 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 근위축측삭경화증(ALS), 척수근위축증(SMA) 등)를 치료하고/하거나 개선하고/하거나 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터(예를 들어, LNP와 TNA를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 LNP는 본원에 기재된 바와 같이 LNP에 연결된 scFv(여기서 scFv는 세포 표면에 존재하는 항원에 대해 지시됨)를 포함함))는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직에 전달될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 치료제의 반복 투여는 적절한 발현 수준이 달성될 때까지 이루어질 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 치료용 핵산은 다회 투여 및 재투여될 수 있다. 예를 들어, 치료용 핵산은 0일차에 투여될 수 있다. 0일차의 초기 치료 후, 두 번째 투여(재투여)는, 치료용 핵산을 이용한 초기 치료 후, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 또는 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 약 20년, 약 21년, 약 22년, 약 23년, 약 24년, 약 25년, 약 26년, 약 27년, 약 28년, 약 29년, 약 30년, 약 31년, 약 32년, 약 33년, 약 34년, 약 35년, 약 36년, 약 37년, 약 38년, 약 39년, 약 40년, 약 41년, 약 42년, 약 43년, 약 44년, 약 45년, 약 46년, 약 47년, 약 48년, 약 49년, 또는 약 50년 내에 수행될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 1종 이상의 추가 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이러한 화합물은 별도로 투여될 수 있거나, 추가 화합물은 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 ceDNA 이외의 다른 화합물, 또는 적어도 제1 ceDNA와 상이한 제2 ceDNA를 함유할 수 있다. 비제한적으로, 다른 추가 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩타이드, 단백질, 펩타이드 유사체 및 유도체, 펩타이드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 1종 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 따라서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다.
예를 들어, 하나의 실시형태에서, LNP 내 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화 암치료(비제한적으로, 소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체 포함)일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 추가 화합물은 체크포인트 저해제이다.
하나의 실시형태에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 하나의 실시형태에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상이한 단백질 또는 상이한 화합물, 예컨대 치료제를 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 입자의 상이한 칵테일이, 본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 추가 화합물은 면역조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 실시형태에서, 추가 화합물은 면역자극제이다.
참고문헌
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(참고 문헌, 등록된 특허, 공개된 특허출원 및 동시 계류중인 특허출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
본 개시내용의 실시형태의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 실시형태 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 소정의 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 실시형태는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절한 경우 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시형태는 조합되어 추가 실시형태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 실시형태를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 실시형태 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 실시형태의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이러한 실시형태의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 실시형태 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예 1: 표적화 리간드의 검증
개념 증명으로서, 시험관내 세포 기반 검정으로 HER2 scFv 결합과 내재화를 수행하였다. 도 1a 내지 도 1f는, 트라스투주맙 유래 α-HER2 scFv가 시험관내에서 명확한 HER2 특이적 막 표적화와 내재화를 나타냈음을 보여준다. Alexa-fluor 488 표지된 항-HER2 scFv를 사용한 경우 Sk-BR3 HER2 발현(HER2+) 세포주와 Sk-OV3 HER2 발현(HER2+) 세포주(도 1a와 도 1b)에서는 HER2 수용체 결합을 나타냈지만, Her2 수용체를 발현하지 않는(HER2-) MCF7 세포(도 1c)에서는 결합을 나타내지 않았음을 보여준다. 두 번째 면역형광 표지(pHrhodo)를 사용하여 리간드 내재화를 입증하였다. 도 1d 및 도 1e에 제시된 바와 같이, HER2 수용체를 발현하는 Sk-BR3 세포와 Sk-OV3 세포는 리간드 내재화를 나타냈지만, MCF7 HER2- 세포주는 내재화를 나타내지 않았다(도 1f).
실시예 2: α-HER2 scFv를 갖는 LNP의 제형화
본 실시예는, 표면에 α-HER2 scFv(서열번호 1)를 제시하는 LNP의 제조를 설명한다. 본원에 기재된 바와 같이, 말레이미드 화학으로 제조된 HER2 scFv LNP를 이용한 경우 증강된 흡수가 입증되었다. HER2 표적화를 위한 scFv 서열은 하기 제시되는 바와 같다:
서열번호 1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열번호 1)
서열번호 2는 말레이미드 접합에 필요한 C-말단 시스테인과 함께 myc(볼드체로 밑줄 그어짐) 태그와 His(이탤릭체) 태그를 함유한다. 이러한 서열을 PDS 접합을 위해 scFv에 사용하였다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK EQKLISEEDL HHHHHHC (서열번호 2)
서열번호 3은 트랜스글루타미나아제 매개 접합에 사용하였으며, 서열번호 1과 동일한 scFv 코어 서열을 포함하지만, 트랜스글루타미나아제 매개 접합을 용이하게 하기 위한 N-말단 His(이탤릭체) 태그와 C-말단 LLQGA 폴리펩타이드(볼드체로 밑줄 그어짐)를 갖는다.
EHHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSADFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK LLQGA (서열번호 3)
scFv-LNP에 대한 말레이미드 화학 평가
티올 기반 가교를 사용하는 예시적인 주요 접합 경로가 도 2a와 도 2b에 제시되어 있다. 말레이미드(절단 가능하지 않음) 연결이 도 2a에 제시되어 있다. 피리딜디설파이드 또는 PDS(절단 가능함) 연결이 도 2b에 제시되어 있다.
PDS 화학에 대한 접합 프로토콜은 하기와 같이 수행하였다. scFv를 50 몰 과량의 TCEP를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 환원시켰다. 환원 후, G-25 스핀 컬럼을 사용하여 scFv에서 TCEP를 제거하였다(237 μg scFv/컬럼). 이어서, scFv를 상이한 몰 백분율(0.1%, 0.5%)과 PEG 길이(2K, 5K)를 갖는 DSPE-PEG-OPSS(Nanosoft Polymers, Winston-Salem, NC, USA)와 지질 A로 제형화된 LNP와 함께 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. scFv/PDS의 비는 0.05였다. 반응 후, 300 kD MWCO 막에서 투석을 통해 미반응 scFv를 밤새 제거하였다. scFv가 LNP에 접합되었는지를 결정하기 위해, SDS-PAGE를 수행하고, HER2 scFv에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다.
말레이미드 화학에 대한 접합 프로토콜은 하기와 같이 수행하였다. scFv를 50 몰 과량의 TCEP를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 환원시켰다. 환원 후, G-25 스핀 컬럼을 사용하여 scFv에서 TCEP를 제거하였다(237 μg scFv/컬럼). 이어서, scFv를 상이한 몰 백분율(0.1%, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25%)과 PEG 길이(2K, 5K)를 갖는 DSPE-PEG-말레이미드와 지질 A로 제형화된 LNP와 함께 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. scFv/말레이미드의 비는 0.05였다. 반응 후, 300 kD MWCO 막에서 투석을 통해 미반응 scFv를 밤새 제거하였다. scFv가 LNP에 접합되었는지를 결정하기 위해, SDS-PAGE를 수행하고, HER2 scFv에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다.scFv-LNP 접합 과정이 탁월한 접합 수율과 LNP 입자 안정성을 입증한 것으로 나타났다. 예를 들어, 초기 TCEP 환원, 새로운 말레이미드 접합된 LNP 제제, 0.5% MAL-PEG2K, 및 0.5:1, 0.25:1, 0.1:1 및 0.05:1로 감소하는 scFv:Mal의 몰 당량을 포함하는 접합 과정의 결과가 도 3a에 제시되어 있다. 다음으로, PEG 사슬 길이를 증가시키고, 입자 크기와 안정성을 손상시키지 않으면서 미반응 scFv를 제거하기 위해 투석 단계를 사용하였다. 결과는 도 3b에 제시되어 있다.
도 4a와 도 4b는, 캡슐화 효율(EE)로 측정 시, scFv 접합 후 LNP 크기와 온전성이 유지되었음(±10 nm)을 보여준다. 도 5는, 말레이미드 접합 과정이 강력한 접합을 생성했지만, PDS 접합 과정은 동등하거나 약간 더 약한 접합을 생성했음을 보여준다. 말레이미드는 일반적으로 LNP에 대한 폴리펩타이드의 접합 효율에 영향을 미칠 수 있는 수성 환경, 특히 높은 pH 값에서 가수분해되기 쉽지만, PDS 화학은 전형적으로 이러한 문제를 나타내지 않기 때문에, 이는 놀랍고도 예상치 못한 결과였다.
다음으로, LNP에 대한 리간드 기능의 확인을 수행하였다. 도 6a는, 도 6b의 DSPE 대조군 LNP와 비교하여 Tras-scFv 접합된 LNP만 HER2 결합을 나타냈음을 보여주며, 이는 LNP에 대한 리간드 기능을 확인시켜 준다. 도 7은, 말레이미드 접합된 LNP가 HER2 특이적인 증강된 세포 흡수를 나타냈음을 보여준다. 구체적으로, 도 7은 접합된 Tras-scFv 지질 A LNP의 흡수(mCherry)가 HER2에 의해 매개되었음을 입증한다. 최종적으로, 도 8a와 도 8b는, LNP 표면 상의 리간드 제시가 생물학적 활성에 유의하게 영향을 미쳤음을 보여준다. 도 8a의 그래프는, PEG 사슬 길이가 2000 Da(PEG2K) 또는 5000 Da(PEG5K)인 말레이미드 접합된 LNP에서, 세포 생존능에 대해 정규화된 LNP 흡수(mCherry)를 비교한 것이다. 도 8a에 제시된 바와 같이, LNP의 세포 흡수로 평가 시, PEG5K를 갖는 말레이미드 접합된 LNP가 더 큰 생물학적 활성을 나타냈다. 도 8b의 그래프는, 말레이미드(PEG5K에 접합된 상태) 농도가 0.5%에서 1.25%로 증가됨에 따라, LNP 흡수(mCherry)의 용량 의존적 감소가 관찰되었음을 보여준다.
본원에 제시된 결과는 scFv-LNP의 시험관내 결합과 내재화를 입증하고, LNP 입자 크기와 안정성에 최소한의 영향을 미치는 최적의 효율적인 말레이미드 공유결합 접합을 설명하고, LNP에 대한 리간드 기능을 확인시켜 주었으며, TNA 카고의 수용체 특이적 세포 내재화와 전달을 입증하였다. 이러한 결과는, 본원에 기재된 scFv-LNP가 전신 투여 후 표적외 조직(예를 들어, 간, 비장)에의 흡수를 최소화하면서 생체내 표적화된 종양에 흡수되는 효과를 강력하게 시사한다.

Claims (76)

  1. 지질 나노입자(LNP), 치료용 핵산(TNA) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 LNP는 LNP에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하고, scFv는 세포의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 것인 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, scFv가 LNP에 공유결합으로 연결되어 있는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, scFv가 LNP에 화학적으로 접합되어 있는, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, scFv가 절단 가능하지 않은 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있는, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 절단 가능하지 않은 링커가 말레이미드 함유 링커인, 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, scFv가 절단 가능한 링커를 통해 LNP에 화학적으로 접합되어 있는, 약제학적 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 절단 가능한 링커가 피리딜디설파이드(PDS) 함유 링커인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, scFv가 트랜스글루타미나아제 매개 접합을 통해 LNP에 연결되어 있는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 관련 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원(TSA)이며, 선택적으로 항원이 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2)인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 2가인, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 세포에 내재화될 수 있는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, 비(non)양이온성 지질, 및 PEG화 지질로 이루어지는 군에서 선택되는 지질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TNA가 LNP에 캡슐화되어 있는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, TNA가 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형(ceDNA), 미니스트링(ministring), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비(non)바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, TNA가 ceDNA인, 약제학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, ceDNA가 선형 이중체 DNA인, 약제학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서, TNA가 mRNA인, 약제학적 조성물.
  20. 제16항에 있어서, TNA가 siRNA인, 약제학적 조성물.
  21. 제16항에 있어서, TNA가 플라스미드인, 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 투여되는 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 대상이 TNA가 캡슐화된 LNP를 이용한 치료를 필요로 하는 인간 환자인, 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 지시되는 세포 표면 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포를 표적으로 하는 약제학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 간 세포를 표적으로 하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 간의 간세포를 표적으로 하는 약제학적 조성물.
  28. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약제학적 조성물:
    [화학식 (I)]

    [식 중,
    R1과 R1'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌이고;
    R2와 R2'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌이고;
    R3과 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나;
    또는 대안적으로, R2가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
    또는 대안적으로, R2'가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R4와 R4'는, 각각 독립적으로, -CRa, -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고;
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 C1-3 알킬이거나;
    또는 대안적으로, R4가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
    또는 대안적으로, R4'가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R5와 R5'는, 각각 독립적으로, 수소, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
    R6과 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
    m과 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
  29. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (II) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약제학적 조성물:
    [화학식 (II)]

    [식 중,
    a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
    b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
    R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
    R2는 (C2-C20)알킬임].
  30. 제14항에 있어서, 지질이 화학식 (V) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약제학적 조성물:
    [화학식 (V)]

    [식 중,
    R1과 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
    R2와 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
    R3과 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
    또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R4와 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
    R5와 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
    Ra와 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
  31. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (XV) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약제학적 조성물:
    [화학식 (XV)]

    [식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
    R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
    R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
    R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
    R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
    R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
    R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며, 단, 조합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
    X1과 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
  32. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (XX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약제학적 조성물:
    [화학식 (XX)]

    [식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며, 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
    R1과 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
    R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
    R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는 이며, 여기서
    R4a와 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
    R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
    R6a와 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
    X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며, 여기서
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
  33. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 표 2, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 8의 임의의 지질에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  34. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 구조를 갖는 지질인, 약제학적 조성물:

    또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  35. 제14항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)인, 약제학적 조성물:

    또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤 또는 이의 유도체가 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤인, 약제학적 조성물.
  37. 제14항에 있어서, 비양이온성 지질이 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민(DSPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  39. 제14항에 있어서, PEG화 지질이 PEG-디라우릴옥시프로필; PEG-디미리스틸옥시프로필; PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필; 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG); PEG-디라우릴글리세롤; PEG-디팔미토일글리세롤; PEG-디스테릴글리세롤; PEG-디라우릴글리카미드; PEG-디미리스틸글리카미드; PEG-디팔미토일글리카미드; PEG-디스테릴글리카미드; 1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜)(PEG-콜레스테롤); 3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌글리콜) 에테르(PEG-DMB); 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-히드록실(DSPE-PEG-OH)로 이루어지는 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, PEG화 지질이 DMG-PEG, DSPE-PEG, DSPE-PEG-OH, 또는 이들의 조합인, 약제학적 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 적어도 하나의 PEG화 지질이 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-OH, DMG-PEG5000, DSPE-PEG5000, DSPE-PEG5000-OH, 또는 이들의 조합인, 약제학적 조성물.
  42. 제14항 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 LNP의 PEG화 지질에 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되어 PEG화 지질 접합체를 형성하는, 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질이 DSPE-PEG인, 약제학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질이 DSPE-PEG2000인, 약제학적 조성물.
  45. 제43항에 있어서, scFv가 화학적으로 접합되거나 공유결합으로 연결되는 PEG화 지질이 DSPE-PEG5000인, 약제학적 조성물.
  46. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질이 약 30% 내지 약 80%의 몰 백분율로 존재하는, 약제학적 조성물.
  47. 제36항에 있어서, 스테롤이 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, 약제학적 조성물.
  48. 제37항 또는 제38항에 있어서, 비양이온성 지질이 약 2% 내지 약 20%의 몰 백분율로 존재하는, 약제학적 조성물.
  49. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PEG화 지질이 약 2.1% 내지 약 10%의 몰 백분율로 존재하는, 약제학적 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 약 0.02 μg/μg의 TNA 내지 약 0.1 μg/μg의 TNA의 총량으로 존재하는, 약제학적 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손 팔미테이트(dexamethasone palmitate)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 총 지질 대 TNA 비가 약 10:1 내지 약 40:1인, 약제학적 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 직경이 약 40 nm 내지 약 120 nm 범위인, 약제학적 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 직경이 약 100 nm 미만인, 약제학적 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 직경이 약 60 nm 내지 약 80 nm인, 약제학적 조성물.
  56. 제16항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는, 약제학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 발현 카세트가 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  58. 제16항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR)을 포함하는, 약제학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 발현 카세트에 2개의 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함하는, 약제학적 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 발현 카세트가 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있는, 약제학적 조성물.
  61. 제58항 또는 제60항에 있어서, 발현 카세트가 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있는, 약제학적 조성물.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ITR이 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위 바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 또는 파르보바이러스 유래의 야생형 ITR인, 약제학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 AAV 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어지는 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나가 야생형 AAV ITR인, 약제학적 조성물.
  65. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR과 3' ITR 중 적어도 하나가 변형된 또는 돌연변이 ITR인, 약제학적 조성물.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR과 3' ITR이 대칭인, 약제학적 조성물.
  67. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR과 3' ITR이 비대칭인, 약제학적 조성물.
  68. 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 스페이서 서열의 길이가 적어도 5개 염기쌍인, 약제학적 조성물.
  71. 제16항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는, 약제학적 조성물.
  72. 제16항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA인, 약제학적 조성물.
  73. 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 대상이 인간인, 방법.
  75. 대상의 종양으로 치료용 핵산(TNA)을 전달하거나 대상의 종양에 TNA의 농도를 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 대상의 간으로 치료용 핵산(TNA)을 전달하거나 대상의 간에 TNA의 농도를 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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